МОДУЛИРОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В РАСТЕНИИ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/82 C12N9/10 A01H5/12 A01H6/82 A24B15/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В настоящем изобретении раскрыты полинуклеотидные последовательности генов, кодирующие аспартатаминотрансферазу (AAT) из Nicotiana tabacum и их варианты, гомологи и фрагменты. Также раскрыты кодируемые ими полипептидные последовательности и их варианты, гомологи и фрагменты. Также раскрыта модуляция экспрессии одного или более генов NtAAT или функции или активности кодируемого(кодируемых) ими полипептида(полипептидов) NtAAT, для модулирования уровней одной или более свободных аминокислот, таких как аспартат, и метаболитов или побочных продуктов, полученных из них, таких как аммиак, в растении или его части.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Акриламид представляет собой химическое соединение формулы C₃H₅NO (название согласно ИЮПАК - проп-2-енамид), и были высказаны опасения относительно его потенциальной токсичности. Источником акриламида в аэрозоле курительных изделий, содержащих табак, могут являться, по меньшей мере частично, аминокислоты, которые присутствуют в табачном материале, используемом для производства курительных изделий. В культивируемых типах табака наблюдается повышение общего количества свободных аминокислот во время сушки, в частности в типах табака воздушной сушки и типах табака солнечной сушки. Изменение содержания аминокислот в табачном материале, подвергнутом сушке, зависит от времени сушки при температуре окружающей среды (воздушная сушка), которая в отличие от дымовой сушки (которая является быстрым процессом высушивания) позволяет ферментативным реакциям оставаться активными в течение 10-15 дней после сбора. Дополнительно табачный материал воздушной сушки характеризуется более высоким содержанием воды, чем табак, подвергнутый другим видам сушки, что замедляет процесс высушивания при температуре окружающей среды, поэтому считается вторым фактором, позволяющим некоторым ферментативным реакциям оставаться активными на более поздней стадии фазы сушки. Необходимо снизить уровни аминокислот и метаболитов и побочных продуктов, получаемых из них в растениях, в частности, в растительном материале, подвергнутом сушке, и дыме и аэрозоле, полученном из них. Поскольку аммиак, вероятно, будет являться побочным продуктом аминокислот, вырабатываемым во время сушки, уровень аммиака в листьях, подвергнутых сушке, дыме и аэрозоле также может быть пониженным. Также необходимо снизить уровень образования нежелательных запахов в аэрозоле или дыме при нагревании или горении табака.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой потребности в данной области техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описан ряд полинуклеотидных последовательностей, кодирующих AAT из Nicotiana tabacum, которые вовлечены в биосинтез аминокислот во время ранней сушки. Изменения в генах NtATT, которые не характеризуются сверхэкспрессией во время сушки, не будут способствовать модулированию уровней аминокислот и получаемых из них метаболитов. Однако данные гены, вероятно, будут участвовать в других метаболических путях, и изменения их экспрессии могут в результате привести к формированию фенотипа, который является неблагоприятным с агрономической точки зрения (например, медленный рост). Знание того, какие гены NtAAT сверхэкспрессируются во время сушки, преимущественно позволяет отобрать растения с изменениями только в соответствующих генах и уменьшает потенциальные негативные эффекты в отношении других метаболических процессов.

AAT катализирует обратимый перенос α-аминогруппы между аспартатом и глутаматом, являясь, следовательно, ключевым ферментом в метаболизме аминокислот за счет образования потока азота из глутамата и аспартата. Синтез аспартата является важным для синтеза других аминокислот, таких как аспарагин, треонин, изолейцин, цистеин и метионин. Во время процесса сушки аспартат преобразуется в аспарагин посредством аспарагинсинтетазы. Аспарагин и глутамин являются ключевыми соединениями для ремобилизации N в стареющих листьях, аспарагин представляет собой основную аминокислоту, образующуюся в листьях Берлей, подвергнутых сушке. Известно, что при нагревании табачного листа аспарагин в результате приводит к образованию акриламида. Аспартат также играет ключевую роль в биосинтезе других аминокислот, таких как треонин, метионин и цистеин, наличие некоторых из которых при нагревании в результате приводит к появлению запаха серы. Путем модулирования экспрессии и/или активности раскрытой AAT теперь можно корректировать химический состав частей растения, таких как листья, и дыма или аэрозолей, получаемых из них. Интересно, что некоторые гены AAT табака могут все еще экспрессироваться по меньшей мере в течение 8 дней с начала процесса воздушной сушки, как описано в данном документе. Например, количество одной или более аминокислот, таких как аспартат, и метаболитов, таких как аммиак, получаемых из них во время и после сушки, можно модулировать и, следовательно, образование акриламида, образующегося в ходе нагревания табака, можно модулировать, предпочтительно уменьшать. В качестве дополнительного примера образование других аминокислот, которые могут в результате приводить к появлению запаха серы при нагревании табака, также можно модулировать, предпочтительно уменьшать. В данном документе описано несколько геномных полинуклеотидных последовательностей AAT из Nicotiana tabacum, включая NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15). Также приведены соответствующие предсказанные полипептидные последовательности для NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16). Показано, что NtAAT2-S и NtAAT2-T, и в меньшей степени NtAAT1-S, NtAAT1-T, играют особую роль в биосинтезе аспартата во время сушки. Напротив, уровни транскриптов NtAAT4-S и NtAAT4-T понижаются в основном в течение первых двух дней сушки листьев, хотя NtAAT4-T остается экспрессируемым после восьми дней воздушной сушки, поэтому участие белка NtAAT4-T при сушке не может быть исключено. Экспрессия NtAAT3-S остается низкой во время сушки листьев и не модулируется во время фазы пожелтения. NtAAT3-T иногда является слегка индуцированным во время сушки, однако уровень экспрессии остается сравнительно низким.

НЕКОТОРЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА

Преимущественно полинуклеотидные последовательности NtAAT могут характеризоваться высоким уровнем экспрессии во время сушки, в частности с начала сушки. Модулирование экспрессии одной или более полинуклеотидных последовательностей NtAAT может в результате приводить к модулированным уровням акриламида в аэрозоле, поскольку уровень аспартата может модулироваться на протяжении всего процесса сушки. В частности, понижение экспрессии одной или более полинуклеотидных последовательностей NtAAT может в результате приводить к понижению уровней акриламида в аэрозоле.

Поскольку аспартат является ключевым в биосинтезе других аминокислот, таких как треонин, метионин и цистеин, наличие некоторых из которых в результате приводит к появлению запаха серы при нагревании, модулирование экспрессии полинуклеотидных последовательностей NtAAT может обеспечить модулирование этого нежелательного запаха. Дополнительно, зная, что аммиак, вероятно, является побочным продуктом аминокислот, образующимся во время сушки, понижение экспрессии полинуклеотидных последовательностей NtAAT и/или активности кодируемого ими белка может обеспечить понижение уровня аммиака в растительном материале, подвергнутом сушке, и дыме и аэрозоле, получаемых из него. Повышение содержания аминокислот происходит в табаке воздушной сушки и табаке солнечной сушки, так как эти способы сушки приводят к повышенному содержанию аминокислот в табачном материале, подвергнутом сушке, по сравнению с табачным материалом трубоогневой сушки. Таким образом, настоящее изобретение особенно применимо к табачному материалу воздушной сушки и трубоогневой сушки.

Преимущественно имеется ограниченное влияние на уровни никотина в модифицированных растениях, описанных в данном документе, что является необходимым, если предполагается, что модифицированные растения будут применять для получения растений табака и потребляемых табачных продуктов.

Преимущественно могут быть созданы генетически не модифицированные растения, которые могут быть более приемлемыми для потребителей.

Преимущественно настоящее изобретение не ограничено применением растений, полученных с помощью EMS-мутагенеза. Растение, полученное с помощью EMS-мутагенеза, может характеризоваться меньшим потенциалом передачи улучшенных свойств сельскохозяйственной культуре после селекции. После начала селекции необходимая характеристика(характеристики) растения, полученного с помощью EMS-мутагенеза, по разным причинам может быть утрачена. Например, может потребоваться несколько мутаций, мутация может являться доминантной или рецессивной, и идентификация точечной мутации в гене-мишени может являться труднодостижимой. Напротив, в настоящем изобретении вводится применение полинуклеотидов NtAAT, которыми можно в частности манипулировать для получения растений с необходимым фенотипом. Настоящее изобретение можно применять к различным разновидностям растений или сельскохозяйственных культур.

В одном аспекте описана клетка растения, содержащая: (i) полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; (ii) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, указанным в (i); (iii) полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8, по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID No: 12, или по меньшей мере 94% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16; или (iv) конструкцию, вектор или вектор экспрессии, содержащие выделенный полинуклеотид, указанный в (i), где указанная клетка растения содержит по меньшей мере одну модификацию, которая обеспечивает модулирование экспрессии или активности полинуклеотида или полипептида по сравнению с таковыми в клетке контрольного растения, в которой экспрессия или активность полинуклеотида или полипептида не была модифицирована.

В другом аспекте раскрыта клетка растения, содержащая: (i) полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; (ii) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, указанным в (i); (iii) полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8, по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID No: 12, или по меньшей мере 94% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 16; или (iv) конструкцию, вектор или вектор экспрессии, содержащие выделенный полинуклеотид, указанный в (i), где указанная клетка растения содержит по меньшей мере одну модификацию, которая обеспечивает модулирование экспрессии или активности полинуклеотида или полипептида по сравнению с таковыми в клетке контрольного растения, в которой экспрессия или активность полинуклеотида или полипептида не была модифицирована. Предпочтительно указанная клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, предпочтительно, где клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно указанная клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности c SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8 или по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID No: 4 предпочтительно, где клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID No: 4.

Предпочтительно, указанная клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности c SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8, или по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, или по меньшей мере 94% идентичностью последовательности с SEQ ID No: 4 предпочтительно, где клетка растения содержит полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или по меньшей мере 94% идентичностью последовательности с SEQ ID No: 4. Предпочтительно, экспрессия и/или активность одной или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4) модулируется, тогда как экспрессия и/или активность одной или более из NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16) не модулируется.

Предпочтительно, по меньшей мере одна модификация представляет собой модификацию генома клетки растения, или модификацию конструкции, вектора или вектора экспрессии, или трансгенную модификацию.

Предпочтительно, модификация генома клетки растения или модификация конструкции, вектора или вектора экспрессии представляет собой мутацию или редактирование.

Предпочтительно, такая модификация обеспечивает понижение экспрессии или активности полинуклеотида или полипептида по сравнению с таковыми в клетке контрольного растения.

Предпочтительно, клетка растения содержит полинуклеотид для обеспечения интерференции, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна по меньшей мере 19 нуклеотидам РНК, транскрибируемой с полинуклеотида в соответствии с пунктом формулы изобретения 1(i).

Предпочтительно, модулированная экспрессия или активность полинуклеотида или полипептида обеспечивают модулирование уровня аминокислот в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из клетки растения, по сравнению с уровнем аминокислот в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из контрольного растения, предпочтительно, где аминокислота представляет собой аспартат или метаболит, полученный из него.

Предпочтительно, уровень никотина в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из клетки растения, является практически таким же, как и уровень никотина в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из клетки контрольного растения; и/или где уровень акриламида в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из клетки растения, является пониженным по сравнению с уровнем акриламида в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из контрольного растения, и/или при этом уровень аммиака в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из клетки растения, является пониженным по сравнению с уровнем аминокислот в листе, подвергнутом сушке, или высушенном листе, полученных из контрольного растения.

В дополнительном аспекте описано растение или его часть, содержащая клетку растения, описанную в данном документе. В дополнительном аспекте описано растение или его часть, описанные в данном документе, где количество аспартата или метаболита, получаемого из него, является модифицированным в по меньшей мере части растения по сравнению с таковыми в контрольном растении или его части.

В дополнительном аспекте описан растительный материал, растительный материал, подвергнутый сушке, или гомогенизированный растительный материал, полученные из растения или его части, как описано в данном документе, предпочтительно, где растительный материал, подвергнутый сушке, представляет собой растительный материал воздушной сушки, растительный материал солнечной сушки или растительный материал трубоогневой сушки.

В дополнительном аспекте описан растительный материал, описанный в данном документе, включающий биомассу, семя, стебель, цветы или листья растения или его части, как описано в данном документе.

В дополнительном аспекте описано табачный продукт, содержащий клетку растения, описанную в данном документе, часть растения, описанную в данном документе, или растительный материал, описанный в данном документе.

В дополнительном аспекте описан способ получения растения, описанного в данном документе, включающий следующие стадии: (a) получение клетки растения, содержащей полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полинуклеотида, содержащего, состоящего или по существу состоящего из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15; (b) модификация клетки растения для обеспечения модулирования экспрессии указанного полинуклеотида по сравнению с таковой в клетке контрольного растения; и (c) размножение клетки растения с получением растения.

Предпочтительно, стадия (c) включает культивирование растения из побега или саженца, содержащих клетку растения.

Предпочтительно, стадия модификации клетки растения включает модификацию генома клетки с помощью методов редактирования генома или геномной инженерии.

Предпочтительно, методы редактирования генома или геномной инженерии выбраны из технологии CRISPR/Cas, мутагенеза, опосредованного нуклеазой с «цинковыми пальцами», химического или радиационного мутагенеза, гомологичной рекомбинации, олигонуклеотид-направленного мутагенеза и мутагенеза, опосредованного мегануклеазой.

Предпочтительно, стадия модификации клетки растения включает трансфекцию клетки конструкцией, содержащей полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15, функционально связанной с конститутивным промотором.

Предпочтительно, стадия модификации клетки растения включает введение в клетку полинуклеотида для обеспечения интерференции, содержащего последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна РНК, транскрибируемой с полинуклеотида в соответствии с пунктом формулы изобретения 1(i).

Предпочтительно, клетку растения трансфицируют конструкцией, экспрессирующей полинуклеотид для обеспечения интерференции, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна по меньшей мере 19 нуклеотидам РНК, транскрибируемым с полинуклеотида в соответствии с пунктом формулы изобретения 1(i).

В дополнительном аспекте описан способ получения растительного материала, подвергнутого сушке, со скорректированным количеством аспартата или метаболита, получаемого из него, по сравнению с таковыми в контрольном растительном материале, включающий следующие стадии: (a) получение растения или его части или растительного материала, описанных в данном документе; (b) необязательно сбор растительного материала с таковых; и (c) сушка растительного материала.

Предпочтительно, растительный материал включает подвергнутые сушке листья, подвергнутые сушке стебли или подвергнутые сушке цветки или их смесь.

Предпочтительно, способ сушки выбран из группы, состоящей из воздушной сушки, огневой сушки, дымовой сушки и трубоогневой сушки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 представляет собой график, на котором показано содержание общих свободных аминокислот после сбора (в зрелом состоянии), через два дня после сушки (48 ч.) и в конце сушки в культивируемом табаке Вирджиния, Берлей и восточного типа.

Фигура 2 представляет собой график, на котором показаны количества аспартата (asp) и аспарагина (asn) после сбора в образцах листа швейцарского табака Берлей, выращенного в поле (три повторности листа навалом). Содержание свободных аминокислот измеряли в образцах листа (расположенных в средней области стебля), которые собирали через определенные промежутки времени в амбаре для воздушной обработки до завершения 50 дней сушки.

Фигура 3 представляет собой график, на котором показано содержание никотина в листьях, расположенных в средней области стебля, растений NtAAT2-S/T RNAi T0 (E324) и соответствующих контрольных растений (CTE324).

Фигура 4 представляет собой график, на котором показано содержание аспарагина в листьях, расположенных в средней области стебля, растений NtAAT2-S/T RNAi T0 (E324) и соответствующих контрольных растений (CTE324).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Заголовки разделов, используемые в настоящем раскрытии, служат для организационных целей и не предусматриваются как ограничивающие.

Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает специалист средней квалификации в данной области техники. В случае противоречий данный документ, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть применены при осуществлении настоящего изобретения на практике или его тестировании. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются лишь иллюстративными и не предусматриваются как ограничивающие.

Подразумевается, что термины «включают(включает)», «включают(включает) в себя», «характеризуются», «имеет», «может», «содержат(содержит)» и их варианты, используемые в данном документе, являются открытыми переходными фразами, терминами или словами, которые не исключают возможность наличия дополнительных действий или структур.

Формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Термин «и/или» означает (а) или (b) или как (а), так и (b).

Настоящим изобретением предусмотрены другие варианты осуществления, «содержащие», «состоящие из» и «по существу состоящие из» вариантов осуществления или элементов, представленных в данном документе, независимо от того, указано это явно или нет.

В случае изложения в данном документе числовых диапазонов, каждое промежуточное число в них предусматривается в явной форме с той же степенью точности. Например, в случае диапазона 6-9 в дополнение к 6 и 9 предусматриваются числа 7 и 8, а в случае диапазона 6,0-7,0 в явной форме предусматриваются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.

Следующие термины, используемые во всем данном описании и формуле изобретения, имеют следующие значения.

Термины «кодирующая последовательность» или «полинуклеотид, кодирующий» означают нуклеотиды (молекулы РНК или ДНК), которые составляют полинуклеотид, который кодирует полипептид. Кодирующая последовательность может дополнительно содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, в том числе c промотором и сигналом полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках индивидуума или млекопитающего, которому вводят полинуклеотид. Кодирующая последовательность может быть кодон-оптимизированной.

Выражения «комплементарная последовательность» или «комплементарный» могут означать спаривание оснований по Уотсону-Крику (например, A-T/U и C-G) или Хугстину между нуклеотидами или аналогами нуклеотидов. «Комплементарность» относится к свойству, присущему совместно двум полинуклеотидам, заключающемуся в том, что при их антипараллельном выравнивании друг относительно друга нуклеотидные основания в каждом положении комплементарны друг другу.

Термин «конструкция» относится к двунитевому фрагменту рекомбинантного полинуклеотида, предусматривающему один или более полинуклеотидов. Конструкция содержит «матричную нить», основания которой спарены с комплементарной «смысловой или кодирующей нитью». Указанная конструкция может быть вставлена в вектор в двух возможных ориентациях: либо в той же (или смысловой) ориентации, либо в противоположной (или антисмысловой) ориентации по отношению к ориентации промотора, расположенного в векторе, таком как вектор экспрессии.

Термин «контроль» в контексте контрольного растения или контрольных клеток растения означает растение или клетки растения, в которых экспрессия, функция или активность одного или более генов или полипептидов не была модифицирована (например, повышена или понижена), и поэтому они могут обеспечивать возможность сравнения с растением, в котором экспрессия, функция или активность одного или более таких же генов или полипептидов была модифицирована. Используемое в данном документе выражение «контрольное растение» означает растение, которое является практически эквивалентным тестируемому растению или модифицированному растению по всем параметрам, за исключением тестируемых параметров. Например, если речь идет о растении, в которое был введен полинуклеотид, контрольным растением является эквивалентное растение, в которое такой полинуклеотид не был введен. Контрольным растением может являться эквивалентное растение, в которое был введен контрольный полинуклеотид. В таких случаях контрольный полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, для которого обуславливаемый им фенотипический эффект в отношении растения, как предполагается, является незначительным или отсутствует. Контрольное растение может содержать пустой вектор. Контрольное растение может соответствовать растению дикого типа. Контрольное растение может быть ноль-сегрегантом, при этом сегрегант T1 больше не содержит трансгена.

Термины «донорная ДНК» или «донорная матрица» относятся к фрагменту или молекуле двунитевой ДНК, которые содержат по меньшей мере часть гена, представляющего интерес. Донорная ДНК может кодировать полностью функциональный полипептид или частично функциональный полипептид.

Термин «эндогенный ген или полипептид» относится к гену или полипептиду, которые происходят из генома организма и не претерпели изменения, такого как потеря, приобретение или замена генетического материала. Эндогенный ген подвергается нормальному переносу гена и экспрессии гена. Эндогенный полипептид подвергается нормальной экспрессии.

Термин «энхансерные последовательности» относится к последовательностям, которые могут обеспечивать повышение экспрессии гена. Эти последовательности могут быть расположены выше, в пределах интронов или ниже транскрибируемого участка. Транскрибируемый участок состоит из экзонов и расположенных между ними интронов, от промотора до участка терминации транскрипции. Усиление экспрессии гена может происходить посредством различных механизмов, включая повышение эффективности транскрипции, стабилизацию зрелой мРНК и усиление трансляции.

Термин «экспрессия» относится к выработке функционального продукта. Например, экспрессия фрагмента полинуклеотида может относиться к транскрипции фрагмента полинуклеотида (например, транскрипции, приводящей к получению мРНК или функциональной РНК) и/или трансляции мРНК с получением полипептида-предшественника или зрелого полипептида. «Сверхэкспрессия» относится к выработке продукта гена в трансгенных организмах на уровнях, которые превышают уровни выработки в ноль-сегрегантном (или нетрансгенном) организме из того же эксперимента.

Термины «функциональный» и «полностью функциональный» описывают полипептид, который обладает биологической функцией или активностью. Термин «функциональный ген» относится к гену, транскрибируемому с образованием мРНК, которая транслируется с образованием функционального или активного полипептида.

Термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат полинуклеотид, который кодирует полипептид. Кодирующая последовательность может содержать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, в том числе c промотором и сигналом полиаденилирования, способными управлять экспрессией.

Термин «редактирование генома» относится к такому изменению эндогенного гена, который кодирует эндогенный полипептид, при котором достигают экспрессии полипептида, представляющего собой усеченный эндогенный полипептид или эндогенный полипептид, имеющий аминокислотную замену. Редактирование генома может включать замещение участка эндогенного гена, подлежащего нацеливанию, или замещение всего эндогенного гена копией гена, которая характеризуется наличием усечения или аминокислотной замены, с помощью механизма репарации, такого как HDR. Редактирование генома также может включать создание аминокислотной замены в эндогенном гене посредством создания двунитевого разрыва в эндогенном гене, который затем репарируют с применением NHEJ. С помощью NHEJ можно осуществлять добавление или делецию по меньшей мере одной пары оснований в ходе репарации, вследствие чего можно получить аминокислотную замену. Редактирование генома также может включать удаление сегмента гена с помощью одновременного действия двух нуклеаз на одну и ту же нить ДНК для осуществления усечения между двумя сайтами-мишенями нуклеаз, и репарацию разрыва ДНК с помощью NHEJ.

Термин «гетерологичный» в отношении последовательности означает последовательность, которая происходит из чужеродного вида или, в случае, если она происходит из того же вида, является существенно модифицированной по сравнению со своей нативной формой по составу и/или геномному локусу вследствие преднамеренного вмешательства человека.

Термины «репарация путем гомологичной рекомбинации» или «HDR» относятся к механизму репарации двунитевых повреждений ДНК в клетках, если гомологичный фрагмент ДНК присутствует в ядре, главным образом в G2- и S-фазе клеточного цикла. В ходе HDR применяют донорную ДНК или донорную матрицу для направления репарации, и ее можно применять для создания конкретных изменений последовательностей в геноме, в том числе для нацеленного добавления целых генов. Если донорная матрица предоставляется вместе с сайт-специфичной нуклеазой, то клеточный аппарат будет репарировать разрыв с помощью гомологичной рекомбинации, которая усиливается по величине на несколько порядков при наличии расщепления ДНК. Если гомологичный фрагмент ДНК отсутствует, то вместо этого может происходить NHEJ.

Термины «гомология» или «сходство» относятся к степени сходства последовательностей двух полипептидов или двух молекул полинуклеотида, сравниваемых путем выравнивания последовательностей. Степень гомологии между двумя отдельными сравниваемым полинуклеотидами является функцией числа идентичных или совпадающих нуклеотидов в сопоставляемых положениях.

Термины «идентичный» или «идентичность» в контексте двух или более полинуклеотидов или полипептидов означают, что последовательности характеризуются наличием определенной процентной доли остатков, которые являются одинаковыми в пределах определенного участка. Процентную долю можно рассчитать путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в пределах определенного участка, определения числа положений, в которых в обеих последовательностях находятся идентичные остатки, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в определенном участке и умножения результата на 100 с получением процентной доли идентичности последовательностей. В тех случаях, когда эти две последовательности имеют разную длину или при выравнивании создается один или более несимметрично расположенных концов, и определенный участок сравнения включает только одну последовательность, то при расчете остатки одиночной последовательности включаются в знаменатель, а не в числитель. При сравнении ДНК и РНК тимин (Т) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентичность можно определять самостоятельно или с помощью компьютерного алгоритма для работы с последовательностями, такого как ClustalW, ClustalX, BLAST, FASTA или алгоритм Смита-Уотермана. Популярная программа множественного выравнивания ClustalW (Nucleic Acids Research (1994) 22, 4673-4680; Nucleic Acids Research (1997), 24, 4876-4882) представляет собой подходящий способ получения множественных выравниваний полипептидов или полинуклеотидов. Подходящие параметры для ClustalW могут являться следующими. Для выравниваний полинуклеотидов: штраф за открытие гэпа=15,0, штраф за продолжение гэпа=6,66 и матрица=идентичность. Для выравниваний полипептидов: штраф за открытие гэпа=10,0, штраф за продолжение гэпа=0,2 и матрица=Gonnet. Для выравниваний ДНК и белка: ENDGAP = -1 и GAPDIST=4. Специалистам в данной области будет понятно, что может быть необходимым изменять эти и другие параметры для оптимального выравнивания последовательностей. Предпочтительно, затем проводят расчет процентной доли идентичностей на основании такого выравнивания в виде (N/T), где N представляет собой число положений, в которых в последовательностях присутствует идентичный остаток, и T представляет собой общее число сравниваемых положений, включая гэпы, но за исключением выступов.

Термины «повышение» или «повышенный» относятся к повышению, составляющему от приблизительно 10% до приблизительно 99%, или повышению, составляющему по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 200%, или больше, количества, или функции, или активности, такой как без ограничения функция или активность полипептида, транскрипционная функция или активность и/или экспрессия белка. Термин «повышенный» или фраза «повышенное количество» может относиться к количеству, или функции, или активности модифицированного растения или продукта, полученного из модифицированного растения, которое является большим, чем можно обнаружить в растении или продукте из той же разновидности растения, обработанного таким же образом, которое не было модифицировано. Таким образом, в некоторых случаях растение дикого типа той же разновидности, которое было переработано таким же образом, используется в качестве контроля, с помощью которого измеряют, достигнуто ли повышение количества.

Термин «понижение» или «пониженный», используемый в данном документе, относится к уменьшению, составляющему от приблизительно 10% до приблизительно 99%, или уменьшению, составляющему по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100%, или по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 200%, или больше, количества или функции, такой как функция полипептида, транскрипционная функция или экспрессия полипептида. Термин «повышенный» или фраза «повышенное количество» может относиться к количеству или функции в модифицированном растении или продукте, полученном из модифицированного растения, которое является меньшим, чем можно обнаружить в растении или продукте из той же разновидности растения, обработанного таким же образом, которое не было модифицировано. Таким образом, в некоторых случаях растение дикого типа той же разновидности, которое было переработано таким же образом, используется в качестве контроля, с помощью которого измеряют, достигнуто ли уменьшение количества.

Термин «ингибировать» или «ингибированный» относится к уменьшению, составляющему от приблизительно 98% до приблизительно 100%, или уменьшению, составляющему по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% и, в частности, 100%, количества, или функции, или активности, как, например, без ограничения, функции или активности полипептида, транскрипционной функции или активности и/или экспрессии полипептида.

Термин «введенный» означает доставку полинуклеотида (например, конструкции) или полипептида в клетку. Выражение «введенный» включает ссылку на встраивание полинуклеотида в эукариотическую клетку, где полинуклеотид может быть встроен в геном клетки, а также включает ссылку на транзиентное внедрение полинуклеотида или полипептида в клетку. Выражение «введенный» включает ссылки на способы стабильной или транзиентной трансформации, а также на скрещивание половым путем. Таким образом, выражение «введенный» применительно к вставке полинуклеотида (например, рекомбинантной конструкции/экспрессионной конструкции) в клетку означает «трансфекцию», или «трансформацию», или «трансдукцию» и включает ссылку на встраивание полинуклеотида в эукариотическую клетку, где полинуклеотид может быть встроен в геном клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), преобразован в автономный репликон или экспрессироваться транзиентно (например, трансфицированная мРНК).

Термины «выделенный» или «очищенный» относятся к материалу, который практически или по существу не содержит компоненты, которые обычно сопутствуют ему, как встречается в его нативном состоянии. Как правило, чистоту и однородность определяют с помощью методик аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Полипептид, который является преобладающей молекулой, присутствующей в препарате, является практически очищенным. В частности, выделенный полинуклеотид отделяют от открытых рамок считывания, которые фланкируют требуемый ген и кодируют полипептиды, отличные от необходимого полипептида. Термин «очищенный», применяемый в данном документе, обозначает, что полинуклеотид или полипептид дают по существу одну полосу в электрофорезном геле. В частности, это означает, что полинуклеотид или полипептид являются на по меньшей мере 85% чистыми, более предпочтительно на по меньшей мере 95% чистыми и наиболее предпочтительно на по меньшей мере 99% чистыми. Выделенные полинуклеотиды могут быть очищены из клетки-хозяина, в которой они встречаются в природе. Для получения выделенных полинуклеотидов можно применять общепринятые способы очистки нуклеиновых кислот, известные специалистам в данной области техники. Данный термин также охватывает рекомбинантные полинуклеотиды и химически синтезируемые полинуклеотиды.

Термины «модулировать» или «модулирование» относятся к обеспечению или облегчению качественного или количественного изменения, корректировки или модификации способа, пути, функции или активности, представляющих интерес. Без ограничения такое изменение, корректировка или модификация может представлять собой повышение или понижение уровня соответствующего процесса, пути, функции или активности, представляющих интерес. Например, можно модулировать экспрессию гена или экспрессию полипептида или функцию или активность полипептида. Как правило, относительное изменение, корректировку или модификацию определяют посредством сравнения с контролем.

Термин «путь негомологичного соединения концов (NHEJ)», используемый в данном документе, относится к пути, посредством которого происходит репарация двунитевых разрывов в ДНК путем прямого лигирования концов разрывов без необходимости в гомологичной матрице. Независимое от матрицы повторное лигирование концов ДНК посредством NHEJ является стохастическим, подверженным ошибкам процессом репарации, в ходе которого в точку разрыва ДНК вводятся случайные микровставки и микроделеции (вставки/делеции). Данный способ можно применять для преднамеренного разрушения, делеции или корректировки рамки считывания в последовательностях генов-мишеней. Как правило, в ходе NHEJ используются короткие гомологичные ДНК-последовательности, называемые микрогомологами, для направления репарации. Эти микрогомологи часто присутствуют в однонитевых выступах на концах двунитевых разрывов. Если выступы полностью совместимы, то в ходе NHEJ обычно происходит точная репарация разрыва, хотя может иметь место также неточная репарация, приводящая к потере нуклеотидов, однако гораздо более распространены случаи, когда выступы несовместимы.

Термин «не встречающийся в природе» описывает объект, такой как полинуклеотид, генетическую мутацию, полипептид, растение, клетку растения и растительный материал, который не образован естественным путем или не существует в природе. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты можно создать, синтезировать, осуществить их инициацию, модифицировать, подвергнуть вмешательству или манипуляции способами, описанными в данном документе, или которые известны в данной области техники. Такие не встречающиеся в природе объекты или искусственные объекты могут быть созданы, синтезированы, инициированы, модифицированы, подвергнуты вмешательству или манипуляции человеком. Таким образом, в качестве примера, не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе клетку растения или не встречающийся в природе растительный материал можно создать с применением традиционных методик селекции растений, таких как обратное скрещивание, или с помощью технологий манипуляции с генами, например, с применением антисмысловой РНК, интерферирующей РНК, мегануклеазы и т. п. В качестве дополнительного примера, не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе клетку растения или не встречающийся в природе растительный материал можно создать посредством интрогрессии или путем переноса одной или более генетических мутаций (например, одного или более полиморфизмов) от первого растения или клетки растения ко второму растению или клетке растения (которые сами по себе могут быть встречающимися в природе), таким образом, что полученное растение, клетка растения или растительный материал или их потомство содержит генетическую структуру (например, геном, хромосому или ее сегмент), которая не образуется естественным путем, или которая не существует в природе. Полученное растение, клетка растения или растительный материал, таким образом, являются искусственными или не встречающимися в природе. Соответственно, искусственные или не встречающиеся в природе растение или клетку растения можно создать путем модификации генетической последовательности в первом встречающемся в природе растении или клетке растения, даже если полученная генетическая последовательность встречается в природе во втором растении или клетке растения, которые содержат генетический фон, отличный от такового у первого растения или клетки растения. В определенных вариантах осуществления мутация не является встречающейся в природе мутацией, которая существует в природе в полинуклеотиде или полипептиде, таких как ген или полипептид. Различия в генетическом фоне можно выявить по фенотипическим различиям или с помощью методик молекулярной биологии, известных из уровня техники, таких как секвенирование полинуклеотида, определение наличия или отсутствия генетических маркеров (например, маркеров, представляющих собой микросателлитные РНК).

Термины «олигонуклеотид» или «полинуклеотид» означают по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе. Описание отдельной нити также определяет последовательность комплементарной нити. Таким образом, полинуклеотид также охватывает нить, комплементарную описанной отдельной нити. Многие варианты полинуклеотида могут использоваться для той же цели, что и указанный полинуклеотид. Таким образом, полинуклеотид также охватывает практически идентичные полинуклеотиды и комплементарные им последовательности. Отдельная нить представляет собой зонд, который может гибридизироваться с данной последовательностью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, полинуклеотид также охватывает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации. Полинуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми или могут содержать части как двунитевой, так и однонитевой последовательности. Полинуклеотид может представлять собой ДНК, как геномную, так и кДНК, РНК или гибридную молекулу, где полинуклеотид может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, а также комбинации оснований, в том числе урацила, аденина, тимина, цитозина, гуанина, инозина, ксантина, гипоксантина, изоцитозина и изогуанина. Полинуклеотиды можно получать с помощью способов химического синтеза или с помощью рекомбинантных способов.

Специфичность однонитевой ДНК в отношении гибридизации с комплементарными фрагментами определяется «жесткостью» условий реакции (Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)). Жесткость гибридизации повышается по мере понижения склонности к образованию ДНК-дуплексов. При реакциях гибридизации полинуклеотидов жесткость можно выбирать таким образом, чтобы содействовать реакциям гибридизации, характеризующимся специфичностью (высокая жесткость), которые можно применять для идентификации, например, клонов полной длины из библиотеки. Реакции гибридизации, характеризующиеся меньшей специфичностью (низкая жесткость), можно применять для идентификации родственных, но не точно соответствующих (гомологичных, но не идентичных) молекул или сегментов ДНК. ДНК-дуплексы стабилизируют посредством (1) определенного числа комплементарных пар оснований; (2) определенного типа пар оснований; (3) концентрации солей (ионной силы) в реакционной смеси; (4) температуры реакции и (5) присутствия определенных органических растворителей, таких как формамид, которые понижают стабильность ДНК-дуплекса. Обычно чем длиннее зонд, тем выше температура, необходимая для надлежащего отжига. Общепринятый подход заключается в изменении температуры; более высокие относительные температуры приводят к более жестким условиям реакции. Для гибридизации в «жестких условиях» описаны протоколы гибридизации, в которых полинуклеотиды, на по меньшей мере 60% гомологичные друг другу, остаются гибридизированными. Обычно жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных значениях ионной силы и рН. Tm представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы, рН и концентрации полинуклеотида), при которой 50% зондов комплементарно данной последовательности, гибридизируются с данной последовательностью в равновесном состоянии. Поскольку данные последовательности обычно присутствуют в избытке, то при Tm 50% зондов заняты в равновесном состоянии.

«Жесткие условия гибридизации» представляют собой условия, которые позволяют зонду, праймеру или олигонуклеотиду гибридизироваться только со своей конкретной последовательностью. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различаться. Жесткие условия как правило включают: (1) низкую ионную силу и промывки при высокой температуре, например 15 мМ хлорида натрия, 1,5 мМ цитрата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) присутствие денатурирующего средства во время гибридизации, например 50% (об./об.) формамида, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатного буфера (750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия; pH 6,5) при 42°C или (3) присутствие 50% формамида. Как правило, промывки также предусматривают 5 x SSC (0,75 M NaCl, 75 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5 x раствор Денхардта, ДНК из молок лососевых рыб, подвергнутую ультразвуковой обработке (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C с промывкой при 42°C в 0,2 x SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C и последующей промывкой в условиях высокой жесткости, предусматривающей 0,1 x SSC, содержащий EDTA, при 55°C. Предпочтительно, условия являются такими, что последовательности, гомологичные друг другу на по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, обычно остаются гибридизированными друг с другом.

При «условиях умеренной жесткости» используют растворы для промывки и условия гибридизации, которые являются менее жесткими, такими, что полинуклеотид гибридизируется со всем рассматриваемым полинуклеотидом, его фрагментами, производными или аналогами. Один пример предусматривает гибридизацию в 6 x SSC, 5 x растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых рыб при 55°C с последующими одной или более промывками в 1 × SSC, 0,1% SDS при 37°C. Температуру, ионную силу и т. д. можно регулировать для обеспечения соответствия экспериментальным факторам, таким как длина зонда. Были описаны другие условия умеренной жесткости (см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, N.Y. (1990); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1988)).

При «условиях низкой жесткости» используют растворы для промывки и условия гибридизации, которые являются менее жесткими, чем таковые в случае умеренной жесткости, такие, что полинуклеотид гибридизируется со всем рассматриваемым полинуклеотидом, его фрагментами, производными или аналогами. Неограничивающий пример условий гибридизации низкой жесткости предусматривает гибридизацию в 35% формамиде, 5 x SSC, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 5 мМ EDTA, 0,02% PVP, 0,02% фиколле, 0,2% BSA, 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых рыб, 10% (вес/об.) сульфате декстрана при 40°C с последующими одной или более промывками в 2 x SSC, 25 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 5 мМ EDTA и 0,1% SDS при 50°C. Хорошо описаны другие условия низкой жесткости, такие как условия для вариантов межвидовой гибридизации (см. Ausubel et al., 1993; Kriegler, 1990).

Термин «функционально связанный» означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно соединен. Промотор может быть расположен в 5'-направлении (выше) или 3'-направлении (ниже) от гена, который находится под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть примерно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует, в гене, из которого получен промотор. Как известно из уровня техники, изменение этого расстояния можно согласованно осуществлять без потери функции промотора. Термин «функционально связанный» относится к ассоциации фрагментов полинуклеотида в одном фрагменте таким образом, что функция одного регулируется другим. Например, промотор функционально связан с фрагментом полинуклеотида, если он способен регулировать транскрипцию данного фрагмента полинуклеотида.

Термин «растение» относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития и его потомкам. В одном варианте осуществления растение представляет собой растение табака, которое относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana. Термин включает ссылку на целые растения, органы растения, ткани растения, ростки растения, семена растения и клетки растения и их потомство. Клетки растения включают без ограничения клетки из семян, суспензионных культур, зародышей, меристематических участков, каллюсной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор. Подходящие виды, сорта, гибриды и разновидности растений табака описаны в данном документе.

Термины «полинуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» или «полинуклеотидный фрагмент» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру из РНК или ДНК, который является одно- или двунитевым и необязательно содержит синтетические, неприродные или скорректированные нуклеотидные основания. Нуклеотиды (обычно находящиеся в форме их 5'-монофосфата) обозначают с помощью их однобуквенных обозначений следующим образом: «А» для аденилата или дезоксиаденилата (соответственно для РНК или ДНК), «C» для цитидилата или дезоксицитидилата, «G» для гуанилата или дезоксигуанилата, «U» для уридилата, «T» для дезокситимидилата, «R» для пуринов (A или G), «Y» для пиримидинов (C или T), «K» для G или T, «H» для A, или С, или Т, «I» для инозина и «N» для любого нуклеотида. Полинуклеотид может представлять собой без ограничения геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловую РНК или их фрагмент(фрагменты). Кроме того, полинуклеотид может быть однонитевым или двунитевым, смесью однонитевых и двунитевых участков, гибридной молекулой, содержащей ДНК и РНК, или гибридной молекулой со смесью однонитевых и двунитевых участков или их фрагмента(фрагментов). Дополнительно полинуклеотид может быть составлен из трехнитевых участков, содержащих ДНК, РНК или обе, или их фрагмент(фрагменты). Полинуклеотид может содержать одно или более модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может представлять собой пептидную нуклеиновую кислоту (PNA). Как правило, полинуклеотиды могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или отдельных нуклеотидов или комбинации вышеперечисленного. Хотя полинуклеотиды, описанные в данном документе, представлены в виде ДНК-последовательностей, полинуклеотиды включают их соответствующие РНК-последовательности и их комплементарные (например, полностью комплементарные) ДНК- или РНК-последовательности, в том числе цепи, обратно комплементарные им. Полинуклеотиды по настоящему изобретению представлены в прилагаемом перечне последовательностей.

Термины «полипептид» или «полипептидная последовательность» относятся к полимеру из аминокислот, в котором один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе полимерам из аминокислот. Термины также подразумевают модификации, в том числе без ограничения гликозилирование, присоединение липидов, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Полипептиды по настоящему изобретению представлены в прилагаемом перечне последовательностей.

Термин «промотор» означает синтетическую или полученную природным способом молекулу, которая способна обеспечивать, активировать или усиливать экспрессию полинуклеотида в клетке. Термин относится к элементу/последовательности полинуклеотида, расположенным, как правило, выше по последовательности и функционально связанным с фрагментом двунитевого полинуклеотида. Промоторы могут быть получены целиком из участков вблизи нативного гена, представляющего интерес, или могут состоять из разных элементов, полученных из разных нативных промоторов или сегментов синтетического полинуклеотида. Промотор может содержать одну или более специфических последовательностей, регулирующих транскрипцию, для дополнительного усиления экспрессии и/или корректировки экспрессии пространственно и/или по времени. Промотор может также содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть расположены на расстоянии до несколько тысяч пар оснований от сайта начала транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включающих вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию компонента гена конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в которых происходит экспрессия, или по отношению к стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы, такие как физиологические нагрузки, патогены, ионы металлов или индуцирующие средства.

Выражения «тканеспецифичный промотор» и «промотор, предпочтительный для определенной ткани», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к промотору, который экспрессируется преимущественно, но не обязательно исключительно, в одном органе или ткани, но может экспрессироваться также в одной конкретной клетке. Выражение «промотор, регулируемый в процессе развития» относится к промотору, функция которого определяется событиями, связанными с развитием. Выражение «конститутивный промотор» относится к промотору, который вызывает экспрессию гена в большинстве типов клеток в большинстве случаев. «Индуцируемый промотор» обеспечивает избирательную экспрессию функционально связанной ДНК-последовательности в ответ на присутствие эндогенных или экзогенных стимулов, например, с помощью химических соединений (химических индукторов) или в ответ на сигналы окружающей среды, гормональные, химические сигналы и/или сигналы, связанные с развитием. Примеры индуцируемых или регулируемых промоторов включают промоторы, регулируемые светом, теплом, стрессом, наводнением или засухой, патогенами, фитогормонами, ранениями или химическими веществами, такими как этанол, жасмонат, салициловая кислота или антидоты.

Термин «рекомбинантный», используемый в данном документе, относится к искусственной комбинации из двух в иных обстоятельствах разделенных сегментов последовательности, полученной, например, посредством химического синтеза или посредством манипуляции с выделенными сегментами полинуклеотидов с помощью методик генной инженерии. Термин также включает ссылку на клетку или вектор, которые были модифицированы путем введения гетерологичного полинуклеотида, или клетку, полученную из модифицированной таким образом клетки, но не охватывает корректировку клетки или вектора в результате встречающихся в природе событий (например, в результате спонтанной мутации, естественной трансформации, или трансдукции, или транспозиции), таких как те, которые происходят без преднамеренного вмешательства человека.

Выражение «рекомбинантная конструкция» относится к комбинации полинуклеотидов, которые обычно не встречаются в природе вместе. Соответственно, рекомбинантная конструкция может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из одного и того же источника, но расположенные иначе, чем это обычно встречается в природе. Рекомбинантная конструкция может представлять собой рекомбинантную ДНК-конструкцию.

Выражения «регуляторные последовательности» и «регуляторные элементы», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полинуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, которые влияют на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или на трансляцию связанной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают промоторы, лидерные последовательности, регулирующие трансляцию, интроны и распознаваемые последовательности полиаденилирования. Термины «регуляторная последовательность» и «регуляторный элемент» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Выражение «сайт-специфичная нуклеаза» относится к ферменту, способному к специфичному распознаванию и расщеплению ДНК-последовательностей. Сайт-специфичная нуклеаза может быть сконструированной. Примеры сконструированных сайт-специфичных нуклеаз включают нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN), TAL-эффекторные нуклеазы (TALEN), системы на основе CRISPR/Cas9 и мегануклеазы.

Термин «табак» используют в собирательном смысле для обозначения табачных культур (например, множества растений табака, выращиваемых в поле, и табака, выращиваемого не методом гидропоники), растений табака и их частей, в том числе без ограничения корней, стеблей, листьев, цветов и семян, подготовленных и/или полученных, как описано в данном документе. Понятно, что термин «табак» относится к растениям Nicotiana tabacum и продуктам из них.

Термин «табачные продукты» относится к потребительским табачным продуктам, в том числе, без ограничения, к курительным материалам (например, сигаретам, сигарам и трубочному табаку), нюхательному табаку, жевательному табаку, жевательной резинке и леденцам, а также компонентам, материалам и ингредиентам для производства потребительских табачных продуктов. Предпочтительно, данные табачные продукты производят из листьев и стеблей табака, собранных с табака и нарезанных, высушенных, подвергнутых сушке и/или ферментированных в соответствии с общепринятыми методиками получения табака.

Выражения «терминатор транскрипции», «последовательности терминации» или «терминатор» относятся к ДНК-последовательностям, расположенным ниже кодирующей последовательности, включающим распознаваемые последовательности полиаденилирования и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные воздействовать на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется осуществлением добавления трактов полиадениловой кислоты на 3'-конец предшественника мРНК.

Термин «трансгенный» относится к любой клетке, линии клеток, каллюсу, ткани, части растения или растению, геном которых был скорректирован в результате присутствия гетерологичного полинуклеотида, такого как рекомбинантная конструкция, в том числе к исходным трансгенным объектам, а также полученным с помощью процедур полового скрещивания или бесполого размножения из исходного трансгенного объекта. Термин не охватывает корректировку генома (хромосомную или внехромосомную) с помощью общепринятых способов селекции растений или в результате встречающихся в природе событий, таких как случайное перекрестное опыление, инфекция, вызванная нерекомбинантным вирусом, трансформация нерекомбинантными бактериями, нерекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация.

Выражение «трансгенное растение» относится к растению, которое содержит в своем геноме один или более гетерологичных полинуклеотидов, т. е. растение, которое содержит рекомбинантный генетический материал, обычно не обнаруживаемый в нем, и который был введен в рассматриваемое растение (или в предков растения) посредством манипуляции, осуществляемой человеком. Например, гетерологичный полинуклеотид может быть стабильно интегрирован в геном таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетерологичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном отдельно или в виде части рекомбинантной конструкции. Коммерческая разработка генетически улучшенной идиоплазмы также продвинулась к стадии введения в культурные растения нескольких признаков, что часто называют подходом на основе пирамидирования генов. В этом подходе в растение можно ввести несколько генов, придающих разные характеристики, представляющие интерес. Пирамидирование генов можно осуществлять многими способами, в том числе без ограничения путем котрансформации, повторной трансформации и скрещивания линий с разными трансгенами. Таким образом, растение, выращиваемое из клетки растения, в которую рекомбинантную ДНК вводят с помощью трансформации, является трансгенным растением, равно как и все потомство данного растения, которое содержит введенный трансген (полученное как половым, так и бесполым путем). Понятно, что термин «трансгенное растение» охватывает все растение или дерево и части растения или дерева, например зерна, семена, цветы, листья, корни, плоды, пыльцу, стебли и т. п. Каждый гетерологичный полинуклеотид может придавать трансгенному растению отдельный признак.

Термин «эффектор, подобный активаторам транскрипции» или «TALE» относится к полипептидной структуре, которая распознает определенную ДНК-последовательность и связывается с ней. Выражение «ДНК-связывающий домен TALE» относится к ДНК-связывающему домену, который содержит массив тандемных повторов из 33-35 аминокислот, также известных как RVD-модули, каждый из которых специфично распознает одну пару оснований ДНК. RVD-модули могут располагаться в любом порядке, собираясь в массив, который распознает определенную последовательность. Специфичность связывания ДНК-связывающего домена TALE определяется массивом RVD, за которым расположен один усеченный повтор из 20 аминокислот. ДНК-связывающий домен TALE может иметь от 12 до 27 RVD-модулей, каждый из которых содержит RVD и распознает одну пару оснований ДНК. Были идентифицированы специфичные RVD, которые распознают каждый из четырех возможных нуклеотидов ДНК (А, Т, С и G). Поскольку ДНК-связывающие домены TALE являются модульными, то повторы, которые распознают четыре разных нуклеотида ДНК, можно соединить друг с другом для распознавания любой конкретной ДНК-последовательности. Эти нацеленные ДНК-связывающие домены можно впоследствии объединить с каталитическими доменами для создания функциональных ферментов, в том числе искусственных факторов транскрипции, метилтрансфераз, интеграз, нуклеаз и рекомбиназ.

Термины «эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции» или «TALEN», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к сконструированным слитым полипептидам на основе каталитического домена нуклеазы, такой как эндонуклеаза FokI, и разработанного ДНК-связывающего домена TALE, который может быть нацелен на специально синтезированную ДНК-последовательность.

Выражение «мономер TALEN» относится к сконструированному слитому полипептиду с каталитическим доменом нуклеазы и разработанным ДНК-связывающим доменом TALE. Два мономера TALEN могут быть разработаны таким образом, чтобы они нацеливались на участок, являющийся мишенью для TALEN, и расщепляли его.

Термин «трансген» относится к гену или генетическому материалу, содержащему последовательность гена, которые были выделены из одного организма и введены в другой организм. Этот ненативный сегмент ДНК может сохранять способность к обеспечению выработки РНК или полипептида в трансгенном организме или он может обеспечивать корректировку нормальной функции генетического кода трансгенного организма. Введение трансгена имеет потенциал к изменению фенотипа организма.

Термин «вариант» по отношению к полинуклеотиду означает: (i) часть или фрагмент полинуклеотида; (ii) последовательность, комплементарную полинуклеотиду или его части; (iii) полинуклеотид, практически идентичный упоминаемому полинуклеотиду или комплементарной ему последовательности; или (iv) полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях с упоминаемым полинуклеотидом, комплементарной ему последовательностью или практически идентичным ей полинуклеотидом.

Термин «вариант» по отношению к пептиду или полипептиду означает пептид или полипептид, которые отличаются по последовательности за счет вставки, делеции или консервативной замены аминокислот, но сохраняют по меньшей мере одну биологическую функцию или активность. Вариант также может означать полипептид, который сохраняет по меньшей мере одну биологическую функцию или активность. Консервативную замену аминокислоты, т. е. замещение аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, степенью гидрофильности и распределением заряженных участков), понимают в данной области техники как обычно включающую незначительное изменение.

Термин «разновидность» относится к популяции растений, которые обладают постоянными характеристиками, отделяющими их от других растений того же вида. Хотя разновидность обладает одним или более отличительными признаками, она дополнительно характеризуется очень небольшим общим варьированием между особями в пределах этой разновидности. Разновидность часто продается на коммерческой основе.

Термин «вектор» относится к полинуклеотидному средству доставки, которое содержит комбинацию компонентов полинуклеотида для обеспечения транспорта полинуклеотидов, полинуклеотидных конструкций и полинуклеотидных конъюгатов и т. п. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, искусственную хромосому бактерий или искусственную хромосому дрожжей. Вектор может представлять собой ДНК- или РНК-вектор. Подходящие векторы включают эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двунитевой нуклеотидной последовательности; линеаризованные плазмиды из двунитевой нуклеотидной последовательности и другие векторы любого происхождения. «Вектор экспрессии», как используется в данном документе, представляет собой полинуклеотидное средство доставки, которое содержит комбинацию компонентов полинуклеотида для обеспечения экспрессии полинуклеотида(полинуклеотидов), полинуклеотидных конструкций и полинуклеотидных конъюгатов и т.п. Подходящие векторы экспрессии включают эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды из двунитевой нуклеотидной последовательности; линеаризованные плазмиды из двунитевой нуклеотидной последовательности и другие функционально эквивалентные векторы экспрессии любого происхождения. Вектор экспрессии содержит по меньшей мере промотор, расположенный выше по последовательности и функционально связанный с полинуклеотидом, полинуклеотидными конструкциями или полинуклеотидным конъюгатом, как определено ниже.

Термин «цинковый палец» относится к структуре полипептида, которая распознает ДНК-последовательности и связывается с ними. Домен с «цинковыми пальцами» является наиболее распространенным ДНК-связывающим мотивом в протеоме человека. Один домен с «цинковыми пальцами» содержит примерно 30 аминокислот и обычно функционирует путем связывания с 3 последовательными парами оснований ДНК посредством взаимодействий боковой цепи одной аминокислоты с каждой парой оснований.

Термин «нуклеаза с «цинковыми пальцами»» или «ZFN» относится к химерной молекуле полипептида, содержащей по меньшей мере один ДНК-связывающий домен с «цинковыми пальцами», эффективно связанный с по меньшей мере одной нуклеазой или частью нуклеазы, способной в полностью собранном виде расщеплять ДНК.

Если в данном документе не определено иное, то научные и технические термины, используемые в связи с настоящим раскрытием, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам средней квалификации в данной области техники. Например, любые системы номенклатуры и методики, используемые в связи с культурами клеток или тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией полипептида и полинуклеотида, а также гибридизацией, которые описаны в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области техники. Значение и объем терминов должны быть ясны, однако в случае какой-либо скрытой двусмысленности определения, приведенные в данном документе, имеют преимущественную силу по сравнению с любым словарным или не относящимся к данному документу определением. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать множественное число, и термины во множественном числе будут включать единственное число.

Полинуклеотиды

В одном варианте осуществления представлен выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с любой из последовательностей, описанных в данном документе, включая любой из полинуклеотидов, показанных в перечне последовательностей. Предпочтительно, выделенный полинуклеотид содержит, состоит или по существу состоит из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с ними. Предпочтительно, полинуклеотид(полинуклеотиды), описанный(описанные) в данном документе, кодирует(кодируют) активный полипептид AAT, который характеризуется уровнем функции или активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или больше от таковых полипептида(полипептидов), показанного(показанных) в перечне последовательностей.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полинуклеотида, характеризующегося по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

В определенных вариантах осуществления представлен выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно, выделенный полинуклеотид(полинуклеотиды) содержит, состоит или по существу состоит из последовательности, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

Предпочтительно, выделенный полинуклеотид(полинуклеотиды) содержит, состоит из или по существу состоит из последовательности, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

Предпочтительно, выделенный полинуклеотид(полинуклеотиды) содержит, состоит из или по существу состоит из последовательности, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, содержащие, состоящие или по существу состоящие из полинуклеотидов с существенной степенью гомологии (т. е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, содержащие, состоящие или по существу состоящие из полинуклеотидов с существенной степенью гомологии (т. е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, содержащие, состоящие или по существу состоящие из полинуклеотидов с существенной степенью гомологии (т.е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления предусмотрены фрагменты SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15 с существенной степенью гомологии (т.е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с ними, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с соответствующими фрагментами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления представлены фрагменты SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7 с существенной степенью гомологии (т. е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с ними, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с соответствующими фрагментами SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

В другом варианте осуществления представлены фрагменты SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 с существенной степенью гомологии (т.е. сходством последовательности) или существенной степенью идентичности с ними, характеризующиеся по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с соответствующими фрагментами SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, предусматривающие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, которые кодируют полипептид, который выполняет функцию AAT.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, предусматривающие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, которые кодируют полипептид, который выполняет функцию AAT.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, предусматривающие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15, которые кодируют полипептид, который функционирует как AAT.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, предусматривающие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, которые кодируют полипептид, который выполняет функцию AAT.

В другом варианте осуществления представлены полинуклеотиды, предусматривающие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, которые кодируют полипептид, который выполняет функцию AAT.

В другом варианте осуществления представлен полимер, представляющий собой полинуклеотид, который содержит, состоит или по существу состоит из полинуклеотида, обозначенного в данном документе как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления представлен полимер, представляющий собой полинуклеотид, который содержит, состоит или по существу состоит из полинуклеотида, обозначенного в данном документе как SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

В другом варианте осуществления представлен полимер, представляющий собой полинуклеотид, который содержит, состоит или по существу состоит из полинуклеотида, обозначенного в данном документе как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно, полинуклеотиды, описанные в данном документе, кодируют полипептид AAT.

Как описано в данном документе, NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) являются генами, экспрессируемыми на наиболее высоком уровне, после 48 часов сушки по сравнению с зелеными табачными листьями. Уровень экспрессии может быть в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 раз большим, чем у зеленых табачных листьев. Применение NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) является предпочтительным в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения. Полинуклеотид может включать полимер из нуклеотидов, который может представлять собой немодифицированную или модифицированную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). Соответственно, полинуклеотид может представлять собой без ограничения геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК, или антисмысловую РНК, или их фрагмент(фрагменты). Кроме того, полинуклеотид может представлять собой однонитевую или двунитевую ДНК, ДНК, которая является смесью однонитевых и двунитевых участков, гибридную молекулу, содержащую ДНК и РНК, или гибридную молекулу со смесью однонитевых и двунитевых участков или их фрагмента(фрагментов). Дополнительно полинуклеотид может быть составлен из трехнитевых участков, содержащих ДНК, РНК или обе, или их фрагмент(фрагменты). Полинуклеотид может содержать одно или более модифицированных оснований, таких как фосфоротиоаты, и может представлять собой пептидную нуклеиновую кислоту. Как правило, полинуклеотиды могут быть собраны из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или отдельных нуклеотидов или комбинации вышеперечисленного. Хотя полинуклеотиды, описанные в данном документе, представлены в виде ДНК-последовательностей, они включают их соответствующие РНК-последовательности и их комплементарные (например, полностью комплементарные) ДНК- или РНК-последовательности, в том числе обратно комплементарные им последовательности.

Полинуклеотид обычно содержит фосфодиэфирные связи, хотя в некоторых случаях включены полинуклеотидные аналоги, которые могут иметь альтернативные остовы, содержащие, например, фосфороамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные или О-метилфосфороамидитные связи; и пептидные остовы полинуклеотидов и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают полинуклеотиды с положительно заряженными остовами, неионогенными остовами и безрибозными остовами. Модификации рибозофосфатного остова можно осуществлять по целому ряду причин, например, для повышения стабильности и периода полужизни таких молекул в физиологических средах или в качестве зондов на биочипе. Можно получать смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и аналогов; в качестве альтернативы, можно получать смеси разных аналогов полинуклеотидов и смеси природных полинуклеотидов и аналогов.

Известно множество аналогов полинуклеотидов, в том числе, например, таковые с фосфороамидатными, фосфоротиоатными, фосфородитиоатными или О-метилфосфороамидитными связями и пептидными остовами полинуклеотидов и связями. Другие аналоги полинуклеотидов включают таковые с положительно заряженными остовами, неионогенными остовами и безрибозными остовами. Полинуклеотиды, содержащие один или более карбоциклических сахаров, также включены.

Другие аналоги включают пептидные полинуклеотиды, которые представляют собой таковые на основе пептидных аналогов полинуклеотидов. Эти остовы являются практически неионогенными в нейтральных условиях в отличие от высокозаряженного фосфодиэфирного остова встречающихся в природе полинуклеотидов. Это может давать преимущества. Во-первых, пептидный остов полинуклеотида может характеризоваться улучшенной кинетикой гибридизации. Пептидные полинуклеотиды характеризуются более значительными изменениями температуры плавления в случае наличия несовпадающих пар оснований по сравнению с идеально совпадающими парами оснований. ДНК и РНК, как правило, характеризуются понижением температуры плавления на 2-4 C при наличии внутреннего несовпадения. В случае неионогенного пептидного остова полинуклеотида падение находится ближе к 7-9C. Сходным образом, из-за их неионогенной природы, гибридизация оснований, присоединенных к этим остовам, является относительно нечувствительной к концентрации солей. Дополнительно пептидные полинуклеотиды могут не разрушаться или разрушаться в меньшей степени клеточными ферментами, и, таким образом, могут быть более стабильными.

В числе применений раскрытых полинуклеотидов и их фрагментов находится применение фрагментов в качестве зондов в анализах на основе гибридизации или в качестве праймеров для применения в анализах на основе амплификации. Такие фрагменты обычно содержат по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или больше смежных нуклеотидов из ДНК-последовательности. В других вариантах осуществления фрагмент ДНК содержит по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50 или 60 или больше смежных нуклеотидов из ДНК-последовательности. Таким образом, согласно одному аспекту также предусмотрен способ выявления полинуклеотида, включающий применение зондов или праймеров, или того и другого. Иллюстративные праймеры описаны в данном документе.

Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий описаны в Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Используя данные о генетическом коде в комбинации с полипептидными последовательностями, описанными в данном документе, можно получить наборы вырожденных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды применимы в качестве праймеров, например, в полимеразных цепных реакциях (ПЦР), с помощью которых выделяют и амплифицируют фрагменты ДНК. В определенных вариантах осуществления вырожденные праймеры можно применять в качестве зондов для генетических библиотек. Такие библиотеки включают библиотеки кДНК, геномные библиотеки и даже электронные библиотеки меток экспрессируемых последовательностей или ДНК. Гомологичные последовательности, идентифицированные этим способом, будут затем использованы в качестве зондов для идентификации гомологов последовательностей, указанных в данном документе.

Также, потенциально применимыми являются полинуклеотиды и олигонуклеотиды (например, праймеры или зонды), которые гибридизируются в условиях пониженной жесткости, как правило, в условиях средней жесткости и, обычно, в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом(полинуклеотидами), описанным(описанными) в данном документе. Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство для разработки подходящих условий изложены в Sambrook J., E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) и могут быть легко определены специалистами средней квалификации в данной области техники на основе, например, длины или композиции оснований полинуклеотида.

В данном документе определен один способ достижения условий умеренной и высокой жесткости. Следует понимать, что температуру промывки и концентрацию солей при промывке при потребности можно регулировать для достижения необходимой степени жесткости посредством применения основных принципов, которые управляют реакциями гибридизации и стабильностью дуплексов, как это известно специалистам в данной области техники и дополнительно описано ниже (см., например, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). При гибридизации полинуклеотида с полинуклеотидом с неизвестной последовательностью предполагается, что длина гибрида будет такой как у гибридизирующегося полинуклеотида. Когда гибридизируют полинуклеотиды с известными последовательностями, длина гибрида может быть определена путем выравнивания последовательностей полинуклеотидов и идентификации участка или участков с оптимальной комплементарностью последовательности. Температура гибридизации для гибридов, длина которых предположительно составят менее 50 пар оснований, должна быть на 5-10 C меньше, чем температура плавления гибрида, где температуру плавления определяют в соответствии со следующими уравнениями. Для гибридов, длина которых составляет менее 18 пар оснований, температура плавления (°С) = 2(число оснований А+Т)+4(число оснований G+C). Для гибридов, длина которых составляет более 18 пар оснований, температура плавления (°C) = 81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), где N представляет собой число оснований в гибриде, и [Na+] представляет собой концентрацию ионов натрия в буфере для гибридизации ([Na+] для 1x стандартного цитрата натрия=0,165 M). Как правило, каждый такой гибридизирующийся полинуклеотид имеет длину, которая составляет по меньшей мере 25% (обычно по меньшей мере 50%, 60% или 70% и наиболее часто по меньшей мере 80%) от длины полинуклеотида, с которым он гибридизируется, и характеризуется по меньшей мере 60% идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) с полинуклеотидом, с которым он гибридизируется.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, линейная ДНК имеет две возможные ориентации: направление 5'-3' и направление 3'-5'. Например, если первая последовательность расположена в направлении 5'-3', и если вторая последовательность расположена в направлении 5'-3' в одной и той же полинуклеотидной молекуле/нити, то первая последовательность и вторая последовательность ориентированы в одном направлении или имеют одинаковую ориентацию. Как правило, последовательность промотора и представляющий интерес ген, находящийся под контролем данного промотора, расположены в одинаковой ориентации. Однако если по отношению к первой последовательности, расположенной в направлении 5'-3', вторая последовательность расположена в направлении 3'-5' в одной и той же полинуклеотидной молекуле/нити, тогда первая последовательность и вторая последовательность ориентированы в антисмысловом направлении или имеют антисмысловую ориентацию. Две последовательности, имеющие антисмысловые ориентации по отношению друг к другу, могут быть альтернативно описаны как имеющие одинаковую ориентацию, если первая последовательность (направление 5'-3') и последовательность, обратно комплементарная первой последовательности (первой последовательности, расположенной в 5'-3'), расположены в пределах одной полинуклеотидной молекулы/нити. Последовательности, изложенные в данном документе, показаны в направлении 5'-3'.

По меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5) и NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), при этом один или более из NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15) не включают модификацию(модификации) (например, мутацию(мутации)).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), при этом NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15) ) не включают модификацию(модификации) (например, мутацию(мутации)).

Полипептиды

В другом аспекте представлен выделенный полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60% идентичностью последовательности с любым из полипептидов, описанных в данном документе, включая любой из полипептидов, показанных в перечне последовательностей. Предпочтительно выделенный полипептид содержит, состоит или по существу состоит из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с ними.

В одном варианте осуществления представлен полипептид, кодируемый любым из полинуклеотидов, описанных в данном документе, включая полинуклеотид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No: 4, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID No: 12.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID No: 4.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8.

В другом варианте осуществления представлен выделенный полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8; по меньшей мере 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID No: 4; или по меньшей мере 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или 100% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16.

Полипептид может содержать последовательности, имеющие достаточную или значительную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: SEQ ID NO: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No: 4, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID No: 12, функционирующие в качестве AAT. Полипептид может содержать последовательности, имеющие достаточную или значительную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8, функционирующие в качестве AAT. Полипептид может содержать последовательности, имеющие достаточную или значительную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID No: 4, функционирующие в качестве AAT. Фрагменты полипептида(полипептидов) как правило сохраняют некоторые или все функции AAT или активность полноразмерной последовательности.

Как описано в данном документе, NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) являются генами, экспрессируемыми на наиболее высоком уровне, после 48 часов сушки по сравнению с зелеными табачными листьями. Уровень экспрессии может быть в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 раз большим, чем у зеленых табачных листьев. Применение NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) является предпочтительным в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения. Как обсуждалось в данном документе, полипептиды также включают мутантные варианты, полученных путем введения любого типа корректировок (например, вставки, делеции или замены аминокислот; изменения состояния гликозилирования; изменения, которые влияют на рефолдинг или изомеризацию, трехмерные структуры или состояния самоассоциации), которые могут быть намеренно сконструированы или выделены естественным образом при условии, что они по прежнему сохраняют некоторую или всю свою функциональность или активность. Предпочтительно, данную функцию или активность модулируют.

Делеция относится к удалению одной или более аминокислот из полипептида. Вставка относится к одному или более аминокислотным остаткам, вводимым в заранее определенное место в полипептиде. Вставки могут предусматривать вставки внутрь последовательности одной или нескольких аминокислот. Замена относится к замещению аминокислот полипептида другими аминокислотами, имеющими сходные свойства (такие как сходная гидрофобность, гидрофильность, антигенность, склонность к образованию или разрыву α-спиральных структур или β-складчатых структур). Аминокислотные замены, как правило, предусматривают один остаток, но могут быть сгруппированы в зависимости от функциональных ограничений, накладываемых на полипептид, и могут предусматривать диапазон от приблизительно 1 до приблизительно 10 аминокислот. Аминокислотные замены являются предпочтительно консервативными аминокислотными заменами, как описано ниже. Аминокислотные замены, делеции и/или вставки можно выполнить с применением методик пептидного синтеза, таких как твердофазный пептидный синтез, или с помощью манипулирования с рекомбинантной ДНК. Способы манипулирования ДНК-последовательностями с получением вариантов полипептида с заменой, вставкой или делецией хорошо известны в данной области техники. Вариант может характеризоваться наличием корректировок, которые вызывают возникновение «молчащего» изменения и в результате приводят к образованию функционально эквивалентного полипептида. Преднамеренные аминокислотные замены можно осуществлять исходя из сходства остатков в отношении полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и амфипатической природы, при условии, что сохраняется связывание, обуславливающее вторичную структуру вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин, и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, характеризующиеся сходными значениями гидрофильности, включают лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Консервативные замены можно осуществлять, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце можно заменять одна на другую:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ Неполярные Gly Ala Pro Ile Leu Val Полярные - незаряженные Cys Ser Thr Met Asn Gly Полярные - заряженные Asp Glu Lys Arg АРОМАТИЧЕСКИЕ His Phe Trp Tyr

Полипептид может представлять собой зрелый полипептид, или незрелый полипептид, или полипептид, полученный из незрелого полипептида. Полипептиды могут находиться в линейной форме или являться циклизированными с применением известных способов. Полипептиды, как правило, содержат по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40 смежных аминокислот.

По меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6) и NtAAT1-T T (SEQ ID NO: 8).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), при этом один или более из NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16) не включают модификации (например, мутацию(мутации)).

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна модификация (например, мутация) может быть включена в один или более из NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4), при этом NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16) не включают модификаций (например, мутацию(мутации)).

Модификация растений

Трансформация

Рекомбинантные конструкции можно применять для трансформации растений или клеток растения для того, чтобы модулировать экспрессию, функцию или активность полипептида. Рекомбинантная полинуклеотидная конструкция может содержать полинуклеотид, кодирующий один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, функционально связанных с регуляторным участком, подходящим для экспрессии полипептида. Таким образом, полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность, которая кодирует полипептид, описанный в данном документе. Растения или клетки растений, в которых модулируют экспрессию, функцию или активность полипептида, могут включать мутантные, не встречающиеся в природе, трансгенные, созданные человеком или полученные с помощью методик генной инженерии растения или клетки растения. Предпочтительно, трансгенное растение или клетка растения содержит геном, который был скорректирован путем стабильной интеграции рекомбинантной ДНК. Рекомбинантная ДНК содержит ДНК, полученную с помощью методик генной инженерии и сконструированную вне клетки, и содержит ДНК, содержащую встречающуюся в природе ДНК, или кДНК, или синтетическую ДНК. Трансгенное растение может включать растение, регенерированное из первоначально трансформированной клетки растения, и трансгенные растения, являющиеся потомством более поздних поколений или гибридов трансформированного растения. Предпочтительно, трансгенная модификация обеспечивает корректировку экспрессии, или функции, или активности полинуклеотида или полипептида, описанных в данном документе, по сравнению с таковыми в контрольном растении.

Полипептид, кодируемый рекомбинантным полинуклеотидом, может являться нативным полипептидом или может являться гетерологичным по отношению к клетке. В некоторых случаях рекомбинантная конструкция содержит полинуклеотид, который обеспечивает модулирование экспрессии, функционально связанный с регуляторным участком. Примеры подходящих регуляторных участков описаны в данном документе.

Также представлены векторы, содержащие рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, такие как описанные в данном документе. Подходящие основы для векторов включают, например, те, которые обычно используют в данной области техники, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, искусственные хромосомы бактерий, искусственные хромосомы дрожжей или искусственные хромосомы бактериофагов. Подходящие векторы экспрессии включают без ограничения плазмиды и вирусные векторы, полученные из, например, бактериофага, бакуловирусов и ретровирусов. Многочисленные векторы и системы экспрессии являются коммерчески доступными.

Векторы могут содержать, например, точки начала репликации, участки связывания с ядерным матриксом или маркеры. Маркерный ген может придавать клетке растения селектируемый фенотип. Например, маркер может придавать устойчивость к биоцидным средствам, такую как устойчивость к антибиотику (например, к канамицину, G418, блеомицину или гигромицину) или к гербициду (например, к глифосату, хлорсульфурону или фосфинотрицину). Дополнительно вектор экспрессии может содержать последовательность метки, предназначенной для облегчения манипуляций или выявления (например, очистки или локализации) экспрессируемого полипептида. Последовательности меток, такие как последовательности люциферазы, бета-глюкуронидазы, зеленого флуоресцентного полипептида, глутатион-S-трансферазы, полигистидина, c-myc или гемагглютинина, как правило, экспрессируются в виде фрагмента, слитого с кодируемым полипептидом. Такие метки могут быть вставлены в любом месте в пределах полипептида, в том числе на карбоксильном или амино-конце.

Растение или клетку растения можно трансформировать путем интегрирования рекомбинантного полинуклеотида в их геном с обеспечением их стабильной трансформации. Растение или клетка растения, описанные в данном документе, могут являться стабильно трансформированными. Стабильно трансформированные клетки, как правило, сохраняют введенный полинуклеотид с каждым клеточным делением. Растение или клетка растения также могут являться транзиентно трансформированными, так что рекомбинантный полинуклеотид не интегрируется в их геном. Транзиентно трансформированные клетки, как правило, теряют весь введенный рекомбинантный полинуклеотид или некоторую его часть с каждым клеточным делением, так что введенный рекомбинантный полинуклеотид нельзя выявить в дочерних клетках после достаточного числа клеточных делений.

Из уровня техники доступен ряд способов для трансформации клетки растения, включающий биолистику; методики с применением генной пушки; трансформацию, опосредованную Agrobacterium; трансформацию, опосредованную вирусным вектором; способ на основе замораживания-оттаивания; бомбардировку микрочастицами; прямое поглощение ДНК; ультразвуковую обработку; микроинъекцию; перенос, опосредованный вирусом растения; и электропорацию. Система на основе Agrobacterium для интеграции чужеродной ДНК в хромосомы растений в широких масштабах изучалась, модифицировалась и использовалась для генной инженерии растений. Молекулы депротеинизированной рекомбинантной ДНК, содержащие ДНК-последовательности, соответствующие исследуемому очищенному полипептиду, функционально связанные в смысловой или антисмысловой ориентации с регуляторными последовательностями, соединяют с соответствующими последовательностями Т-ДНК с помощью общепринятых способов. Их вводят в протопласты с помощью методики с применением полиэтиленгликоля или методики с применением электропорации, обе из которых являются стандартными. В качестве альтернативы, такие векторы, содержащие молекулы рекомбинантной ДНК, кодирующие исследуемый очищенный полипептид, вводят в живые клетки Agrobacterium, которые затем переносят ДНК в клетки растения. Трансформацию с помощью депротеинизированной ДНК без сопутствующих последовательностей вектора на основе Т-ДНК можно выполнять посредством слияния протопластов с ДНК-содержащими липосомами или посредством электропорации. Депротеинизированную ДНК без сопутствующих последовательностей вектора на основе Т-ДНК также можно применять для трансформации клеток с помощью инертных, высокоскоростных микрочастиц.

Если клетку или культивируемую ткань применяют в качестве реципиентной ткани для трансформации, при необходимости растения можно регенерировать из трансформированных культур с помощью методов, известных специалистам в данной области техники.

Выбор регуляторных участков, подлежащих включению в рекомбинантную конструкцию, зависит от нескольких факторов, в том числе без ограничения от эффективности, селектируемости, индуцируемости, необходимого уровня экспрессии и предпочтительной экспрессии в определенных клетках или тканях. Обычной задачей для специалиста в данной области техники является модулирование экспрессии кодирующей последовательности посредством правильного выбора регуляторных участков и их размещения по отношению к кодирующей последовательности. Транскрипцию полинуклеотида можно модулировать сходным образом. Некоторые подходящие регуляторные участки инициируют транскрипцию исключительно или преимущественно в определенных типах клеток. Способы идентификации и установления характеристик регуляторных участков в геномной ДНК растений хорошо известны в данной области техники.

Подходящие промоторы включают тканеспецифичные промоторы, распознаваемые тканеспецифичными факторами, присутствующими в разных тканях или типах клеток (например, специфичные для корня промоторы, специфичные для побега промоторы, специфичные для ксилемы промоторы), или присутствующими на различных стадиях развития, или присутствующими в ответ на разные условия окружающей среды. Подходящие промоторы включают конститутивные промоторы, которые могут быть активированы в большинстве типов клеток, не требуя специфических индукторов. Примеры подходящих промоторов для управления выработкой RNAi-полинуклеотида включают промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos или промоторы гена убиквитина или гена фазеолина. Специалисты в данной области техники могут создавать множество вариантов рекомбинантных промоторов.

Тканеспецифичные промоторы представляют собой элементы управления транскрипцией, которые активны только в определенных клетках или тканях в определенные моменты времени в ходе развития растений, например в вегетативных тканях или репродуктивных тканях. Тканеспецифичная экспрессия может быть преимущественной, например, если предпочтительной является экспрессия полинуклеотидов в определенных тканях. Примеры тканеспецифичных промоторов, находящихся под контролем в ходе развития, включают промоторы, которые могут инициировать транскрипцию только (или в основном только) в определенных тканях, таких как вегетативные ткани, например корни или листья, или репродуктивные ткани, такие как плоды, семяпочки, семена, пыльца, тычинки, цветки или любая эмбриональная ткань. Промоторы, специфичные для репродуктивных тканей, могут являться, например, специфичными для пыльника, специфичными для семяпочки, специфичными для зародыша, специфичными для эндосперма, специфичными для интегумента, специфичными для семени и кожуры семени, специфичными для пыльцы, специфичными для лепестка, специфичными для чашелистика или для комбинаций таковых.

Подходящие специфичные для листа промоторы включают промотор гена пируватортофосфатдикиназы (PPDK) из C4-растения (кукурузы), промотор cab-m1Ca+2 из кукурузы, промотор родственных myb генов из Arabidopsis thaliana (Atmyb5), промоторы рибулозобифосфаткарбоксилазы (RBCS) (например, генов томата RBCS 1, RBCS2 и RBCS3A, экспрессируемых в листьях и выращенных на свету саженцах, RBCS1 и RBCS2, экспрессируемых в развивающихся плодах томата, или промотор гена рибулозобифосфаткарбоксилазы, экспрессируемый на высоких уровнях почти исключительно в мезофильных клетках листовых пластинок и листовых пазух).

Подходящие специфичные для стареющих тканей промоторы включают промотор из томата, активный во время созревания плодов, старения и опадения листьев, промотор гена, кодирующего цистеиновую протеазу маиса, промотор 82E4 и промотор генов SAG. Можно применять подходящие специфичные для пыльника промоторы. Можно выбрать подходящие предпочтительные для корней промоторы, известные специалистам в данной области техники. Подходящие промоторы для экспрессии предпочтительно в семенах включают как специфичные для семян промоторы (промоторы, активные в процессе развития семян, такие как промоторы запасных полипептидов семян), так и промоторы прорастающих семян (промоторы, активные во время прорастания семян). Такие предпочтительные для семян промоторы включают Cim1 (цитокинин-индуцированный сигнал); cZ19B1 (19 кДa зеин кукурузы); milps (миоинозитол-1-фосфатсинтаза); mZE40-2, также известный как Zm-40; nuclc; и celA (целлюлозосинтаза). Промотор гена гамма-зеина представляет собой специфичный для эндосперма промотор. Промотор гена Glob-1 представляет собой специфичный для зародыша промотор. Для двудольных растений специфичные для семян промоторы включают промотор гена бета-фазеолина фасоли, гена напина, генаβ-конглицинина, гена лектина сои, гена круциферина и т. п. Для однодольных растений специфичные для семян промоторы включают промотор гена зеина кукурузы с молекулярной массой 15 кДа, промотор гена зеина с молекулярной массой 22 кДа, промотор гена зеина с молекулярной массой 27 кДа, промотор гена g-зеина, промотор гена гамма-зеина с молекулярной массой 27 кДа (такой как промотор gzw64A, см. номер доступа S78780 в Genbank), промотор гена waxy, промотор гена shrunken 1, промотор гена shrunken 2, промотор гена глобулина 1 (см. номер доступа L22344 в Genbank), промотор гена Itp2, промотор гена cim1, промоторы генов end1 и end2 кукурузы, промотор гена nuc1, промотор гена Zm40, промотор гена eep1 и eep2; промотор гена lec1, промотор гена тиоредоксина H; промотор гена mlip15, промотор гена PCNA2 и промотор гена shrunken-2.

Примеры индуцируемых промоторов включают промоторы, реагирующие на воздействие патогенов, анаэробные условия, повышенную температуру, свет, засуху, низкую температуру или высокую концентрацию солей. Патоген-индуцируемые промоторы включают промоторы связанных с патогенезом полипептидов (PR-полипептидов), индуцирование которых происходит после инфицирования патогеном (например, PR-полипептиды, SAR-полипептиды, бета-1,3-глюканаза, хитиназа).

Дополнительно к промоторам растений другие подходящие промоторы могут иметь бактериальное происхождение, например промотор гена октопинсинтазы, промотор гена нопалинсинтазы и другие промоторы, полученные из Ti-плазмид, или они могут быть получены из вирусных промоторов (например, промоторов 35S и 19S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), конститутивных промоторов вируса табачной мозаики, промоторов 19S и 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) или промотора 35S вируса мозаики норичника).

Подходящие способы введения полинуклеотидов в клетки растения и последующей вставки в геном растения включают микроинъекцию (Crossway et al., Biotechniques 4:320-334 (1986)), электропорацию (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), трансформацию, опосредованную Agrobacterium (патент США №№ 5981840 и 5563055), прямой перенос генов (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)) и баллистическое ускорение частиц (см., например, патенты США №№ 4945050; 5879918; 5886244; 5932782; Tomes et al., в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin) (1995), а также McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)).

Мутация

Раскрыты растение или клетка растения, содержащие мутацию в одном или более полинуклеотидах или полипептидах, описанных в данном документе, где указанная мутация в результате приводит к модуляции функции или активности AAT. Помимо описанных мутаций, мутантное растение или клетки растения могут характеризоваться наличием одной или более дополнительных мутаций либо в тех же полинуклеотидах или полипептидах, которые описаны в данном документе, либо в одном или более других полинуклеотидах или полипептидах в геноме.

Также предусмотрен способ модулирования уровня полипептида AAT, описанного в данном документе, в (подвергнутом сушке) растении или в (подвергнутом сушке) растительном материале, при этом указанный способ включает введение в геном указанного растения одной или более мутаций, которые модулируют экспрессию по меньшей мере одного гена, где указанный по меньшей мере один ген выбран из последовательностей в соответствии с настоящим изобретением.

Также предусмотрен способ идентификации растения с модулированными уровнями AAT, при этом указанный способ включает скрининг образца полинуклеотида из представляющего интерес растения в отношении наличия одной или более мутаций в последовательностях в соответствии с настоящим изобретением, и необязательно соотнесение идентифицированной мутации(мутаций) с мутацией(мутациями), которая(которые), как известно, модулирует уровни одного или AAT.

Также раскрыты растение или клетка, которые являются гетерозиготными или гомозиготными в отношении одной или более мутаций в гене в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанная мутация в результате приводит к модулированной экспрессии гена или функции или активности полипептида, кодируемого таковым.

Для комбинирования мутаций в одном растении можно применять целый ряд подходов, в том числе половое скрещивание. Растение, характеризующееся наличием одной или более благоприятных мутаций в гетерозиготном или гомозиготном состоянии в гене в соответствии с настоящим изобретением, которые модулируют экспрессию гена или функцию или активность полипептида, кодируемого таковым, можно скрещивать с растением, характеризующимся наличием одной или более благоприятных мутаций в гетерозиготном или гомозиготном состоянии в одном или более генах, которые модулируют их экспрессию или функцию или активность полипептида, кодируемого таковыми. В одном варианте осуществления скрещивания проводят для введения одной или более благоприятных мутаций в гетерозиготном или гомозиготном состоянии в ген в соответствии с настоящим изобретением в одном и том же растении.

Функция или активность одного или более полипептидов по настоящему изобретению в растении являются повышенными или пониженными, если функция или активность являются более низкими или более высокими, чем функция или активность того же полипептида(полипептидов) в растении, которое не было модифицировано для подавления функции или активности этого полипептида, и которое культивировали, собирали и подвергали сушке с применением тех же протоколов.

В некоторых вариантах осуществления мутацию(мутации) вводят в растение или клетку растения с применением подхода с обеспечением мутагенеза, и введенную мутацию идентифицируют или подвергают отбору с применением способов, известных специалистам в данной области техники, таких как анализ методом Саузерн-блоттинга, секвенирование ДНК, ПЦР-анализ или фенотипический анализ. Мутации, которые влияют на экспрессию гена или которые нарушают функцию кодируемого полипептида, можно определять с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Инсерционные мутации в экзонах гена, как правило, в результате приводят к образованию нефункциональных мутантных вариантов. Мутации по консервативным остаткам могут быть особенно эффективными для подавления метаболической функции кодируемого полипептида. Например, понятно, что мутация в одном или более высококонсервативных участках будет, очевидно, обеспечивать корректировку функции полипептида, в то время как мутация вне этих высококонсервативных участков будет, очевидно, оказывать незначительное влияния на функцию полипептида или не будет влиять на него. Дополнительно мутация в одном нуклеотиде может приводить к возникновению стоп-кодона, наличие которого в результате приведет к получению усеченного полипептида и, в зависимости от степени усечения, потере функции.

Также раскрыты способы получения мутантных полинуклеотидов и полипептидов. Любое представляющее интерес растение, в том числе клетку растения или растительный материал, можно генетически модифицировать различными способами, с помощью которых, как известно, индуцируют мутагенез, в том числе сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, индуцируемый химическими соединениями мутагенез, индуцируемый ионизирующим излучением мутагенез, мутагенез с применением модифицированных оснований, мутагенез с применением ДНК-дуплекса с гэпом, мутагенез с двунитевыми разрывами, мутагенез с применением линий-хозяев с нарушенной репарацией, мутагенез посредством синтеза полного гена, перетасовка ДНК и другие эквивалентные способы.

Также раскрыты фрагменты полинуклеотидов и полипептидов. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты полипептида, которые сохраняют биологическую функцию нативного полипептида и, следовательно, задействованы в сети транспортировки метаболитов в растении. В качестве альтернативы, фрагменты полинуклеотида, которые являются применимыми в качестве зондов для гибридизации или ПЦР-праймеров, как правило, не кодируют фрагментов полипептида, сохраняющих биологическую функцию. Кроме того, фрагменты раскрытых полинуклеотидов включают такие фрагменты, которые могут быть собраны в рекомбинантные конструкции, как обсуждалось в данном документе. Фрагменты полинуклеотида могут находиться в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 25 нуклеотидов, приблизительно 50 нуклеотидов, приблизительно 75 нуклеотидов, приблизительно 100 нуклеотидов, приблизительно 150 нуклеотидов, приблизительно 200 нуклеотидов, приблизительно 250 нуклеотидов, приблизительно 300 нуклеотидов, приблизительно 400 нуклеотидов, приблизительно 500 нуклеотидов, приблизительно 600 нуклеотидов, приблизительно 700 нуклеотидов, приблизительно 800 нуклеотидов, приблизительно 900 нуклеотидов, приблизительно 1000 нуклеотидов, приблизительно 1100 нуклеотидов, приблизительно 1200 нуклеотидов, приблизительно 1300 нуклеотидов или приблизительно 1400 нуклеотидов и до полноразмерного полинуклеотида, кодирующего полипептиды, описанные в данном документе. Фрагменты полипептида могут находиться в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 75 аминокислот, приблизительно 100 аминокислот, приблизительно 150 аминокислот, приблизительно 200 аминокислот, приблизительно 250 аминокислот, приблизительно 300 аминокислот, приблизительно 400 аминокислот, приблизительно 500 аминокислот и до полноразмерного полипептида, описанного в данном документе. Мутантные варианты полипептида можно применять для создания мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений (например, мутантных, не встречающихся в природе, трансгенных, созданных человеком или полученных с помощью методик генной инженерии растений) или клеток растения, содержащих один или более мутантных вариантов полипептида. Предпочтительно, мутантные варианты полипептида сохраняют функцию полипептида, не подвергнутого мутированию. Функция мутантного варианта полипептида может быть выше, ниже или приблизительно такой же, как у полипептида, не подвергнутого мутированию.

Мутации в полинуклеотидах и полипептидах, описанных в данном документе, могут включать внесенные человеком мутации, или искусственные мутации, или мутации, созданные с помощью генной инженерии. Мутации в полинуклеотидах и полипептидах, описанных в данном документе, могут представлять собой мутации, которые получены или которые можно получить посредством способа, который включает стадию манипуляции in vitro или in vivo. Мутации в полинуклеотидах и полипептидах, описанных в данном документе, могут представлять собой мутации, которые получены или которые можно получить посредством способа, который предусматривает вмешательство человека.

Способы, с помощью которых вводят мутацию случайным образом в полинуклеотид, могут включать химический мутагенез и радиационный мутагенез. Химический мутагенез предусматривает применение экзогенно добавляемых химических веществ, таких как мутагенные, тератогенные или канцерогенные органические соединения, для индуцирования мутаций. Для создания мутаций можно применять мутагены, которые создают главным образом точечные мутации и короткие делеции, вставки, миссенс-мутации, простые повторяющиеся последовательности, трансверсии и/или транзиции, в том числе химические мутагены и излучение. Мутагены включают этилметансульфонат, метилметансульфонат, N-этил-N-нитрозомочевину, триэтилмеламин, N-метил-N-нитрозомочевину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, акриламидный мономер, мельфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, N-метил-N'-нитро-нитрозогуанидин, нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметил-бенз(a)антрацен, этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан, диэпоксибутан и т. п.), 2-метокси-6-хлор-9[3-(этил-2-хлорэтил)аминопропиламино]акридина дигидрохлорид и формальдегид.

Также предусмотрены спонтанные мутации в локусе, которые могут не быть непосредственно вызванными мутагеном, при условии, что они приводят к возникновению необходимого фенотипа. Подходящие мутагенные средства могут также включать, например, ионизирующее излучение, такое как рентгеновское излучение, гамма-излучение, излучение быстрых нейтронов и ультрафиолетовое излучение. Дозу мутагенного химического вещества или излучения определяют экспериментально для каждого типа ткани растения таким образом, чтобы получить частоту мутаций, которая ниже порогового уровня, характеризующегося летальностью или репродуктивной стерильностью. Любой способ получения полинуклеотида растения, известный специалистам в данной области техники, можно применять для получения полинуклеотида растения для скрининга в отношении мутаций.

Способ мутации может включать одну или более стадий скрещивания растений.

После внесения мутации можно провести скрининг для идентификации мутаций, которые обеспечивают возникновение генов с преждевременными стоп-кодонами или иным образом нефункциональных генов. После внесения мутации можно провести скрининг для идентификации мутаций, которые обеспечивают возникновение функциональных генов, которые способны экспрессироваться на повышенных или пониженных уровнях. Скрининг в отношении мутантных вариантов можно выполнять с помощью секвенирования, или путем применения одного или более зондов или праймеров, специфичных для данного гена или полипептида. В полинуклеотидах можно также обеспечивать возникновение конкретных мутаций, которые могут в результате приводить к модулированию экспрессии гена, модулированию стабильности мРНК или модулированию стабильности полипептида. В данном документе такие растения называются «не встречающимися в природе» или «мутантными» растениями. Как правило, мутантные или не встречающиеся в природе растения содержат по меньшей мере часть чужеродного, или синтетического, или созданного человеком нуклеотида (например, ДНК или РНК), которая не присутствовала в растении до проведения с ним манипуляций. Чужеродный нуклеотид может представлять собой один нуклеотид, два или более нуклеотидов, два или более смежных нуклеотидов или два или более несмежных нуклеотидов, как, например, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 или больше смежных или несмежных нуклеотидов.

Трансгеника и редактирование

Помимо мутагенеза, композиции, которые могут модулировать экспрессию, или функцию, или активность одного или более полинуклеотидов или полипептидов, описанных в данном документе, включают специфичные в отношении последовательности полинуклеотиды, которые могут нарушать транскрипцию одного или более эндогенных генов; специфичные в отношении последовательности полинуклеотиды, которые могут нарушать трансляцию РНК-транскриптов (например, двунитевые РНК, siRNA, рибозимы); специфичные в отношении последовательности полинуклеотиды, которые могут нарушать стабильность одного или более полипептидов; специфичные в отношении последовательности полинуклеотиды, которые могут нарушать ферментативную функцию одного или более полипептидов или функцию связывания одного или более полипептидов в отношении субстратов или регуляторных полипептидов; антитела, которые проявляют специфичность в отношении одного или более полипептидов; низкомолекулярные соединения, которые могут нарушать стабильность одного или более полипептидов, или ферментативную функцию одного или более полипептидов, или функцию связывания одного или более полипептидов; полипептиды с «цинковыми пальцами», которые связывают один или более полинуклеотидов; и мегануклеазы, которые обладают функцией в отношении одного или более полинуклеотидов. Технологии редактирования гена, генетические технологии редактирования и технологии редактирование генома хорошо известны в данной области техники.

Нуклеазы с «цинковыми пальцами»

Полипептиды с «цинковыми пальцами» можно применять для модулирования экспрессии, или функции, или активности одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе. В различных вариантах осуществления последовательность геномной ДНК, содержащую часть или всю кодирующую последовательность полинуклеотида, модифицируют путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой с «цинковыми пальцами». В последовательности геномной ДНК осуществляют поиск уникального сайта для связывания полипептида с «цинковыми пальцами». В качестве альтернативы, в последовательности геномной ДНК осуществляют поиск двух уникальных сайтов для связывания полипептида с «цинковыми пальцами», при этом оба сайта находятся на противоположных нитях и близко друг к другу, например на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пар оснований друг от друга. Соответственно, предусмотрены полипептиды с «цинковыми пальцами», которые связываются с полинуклеотидами.

Полипептид с «цинковыми пальцами» можно сконструировать для распознавания выбранного сайта-мишени в гене. Полипептид с «цинковыми пальцами» может содержать любую комбинацию мотивов, полученных из природных ДНК-связывающих доменов с «цинковыми пальцами» и неприродных ДНК-связывающих доменов с «цинковыми пальцами» посредством усечения, или удлинения, или способа сайт-направленного мутагенеза в сочетании со способом отбора, таким как без ограничения отбор с помощью фагового дисплея, отбор с помощью бактериальной двугибридной системы или отбор с помощью бактериальной одногибридной системы. Термин «неприродный ДНК-связывающий домен с «цинковыми пальцами»» относится к ДНК-связывающему домену с «цинковыми пальцами», который связывает последовательность из трех пар оснований в полинуклеотиде-мишени и который не встречается в клетке или организме, содержащих полинуклеотид, который подлежит модификации. Способы разработки полипептида с «цинковыми пальцами», который связывает специфические полинуклеотиды, которые являются уникальными для целевого гена, известны из уровня техники.

В других вариантах осуществления может быть выбран полипептид с «цинковыми пальцами» для связывания с регуляторной последовательностью полинуклеотида. Более конкретно, регуляторная последовательность может содержать сайт инициации транскрипции, стартовый кодон, участок экзона, границу раздела экзон-интрон, терминатор или стоп-кодон. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растение или клетки растения, полученные с помощью мутагенеза, опосредованного нуклеазой с «цинковыми пальцами», осуществленного вблизи или в пределах одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, и способы получения таких растения или клетки растения с помощью мутагенеза, опосредованного нуклеазой с «цинковыми пальцами». Способы доставки полипептида с «цинковыми пальцами» и нуклеазы с «цинковыми пальцами» в растение подобны способам, описанным ниже для доставки мегануклеазы.

Мегануклеазы

В другом аспекте описаны способы получения мутантных, не встречающихся в природе, или трансгенных, или иным образом генетически модифицированных растений с применением мегануклеаз, таких как I-CreI. Встречающиеся в природе мегануклеазы, а также рекомбинантные мегануклеазы можно применять, в частности, для осуществления двунитевого разрыва в одном сайте или в относительно небольшом количестве сайтов в геномной ДНК растения с обеспечением разрушения одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе. Мегануклеаза может представлять собой сконструированную мегануклеазу со скорректированными свойствами распознавания ДНК. Полипептиды мегануклеаз можно доставлять в клетки растения с помощью ряда разных механизмов, известных из уровня техники.

Настоящее изобретение охватывает применение мегануклеаз для инактивации полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе), в клетке растения или растении. В частности, настоящее изобретение предусматривает способ инактивации полинуклеотида в растении с применением мегануклеазы, включающий: (a) получение клетки растения, содержащей полинуклеотид, описанный в данном документе; (b) введение мегануклеазы или конструкции, кодирующей мегануклеазу, в указанную клетку растения и (c) обеспечение существенной степени инактивации полинуклеотида(полинуклеотидов) мегануклеазой.

Мегануклеазы можно применять для расщепления по сайтам распознавания мегануклеазами в пределах кодирующих участков полинуклеотида. Такое расщепление часто приводит в результате к делеции ДНК в сайте распознавания мегануклеазой с последующей репарацией мутагенной ДНК путем соединения негомологичных концов. Такие мутации в кодирующей последовательности гена являются, как правило, достаточными для инактивации гена. Этот способ модификации клетки растения включает, во-первых, доставку кассеты экспрессии мегануклеазы в клетку растения с применением подходящего способа трансформации. Для достижения максимальной эффективности необходимо связать кассету экспрессии мегануклеазы с селектируемым маркером и отобрать успешно трансформированные клетки в присутствии селективного средства. Этот подход в результате приведет к интеграции кассеты экспрессии мегануклеазы в геном, что, однако, может быть нежелательным, если для растения возможно будет требоваться официальное разрешение. В таких случаях кассету экспрессии мегануклеазы (и связанный селектируемый маркерный ген) можно сегрегировать в последующих поколениях растения с применением общепринятых методик селекции.

После доставки кассеты экспрессии мегануклеазы клетки растения выращивают, изначально, в условиях, которые являются типичными для конкретной процедуры трансформации, которую применяли. Это может означать выращивание трансформированных клеток на среде при температуре ниже 26°C, зачастую в темноте. Такие стандартные условия можно применять в течение некоторого периода времени, предпочтительно 1-4 дней, для обеспечения восстановления клетки растения после процесса трансформации. В любой момент после этого начального периода восстановления температуру роста можно повысить, чтобы стимулировать функцию сконструированной мегануклеазы с осуществлением расщепления и мутирования по сайту распознавания мегануклеазой.

TALEN

Один способ редактирования гена включает применение эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN), которые индуцируют образование двунитевых разрывов, на которые клетка может отвечать посредством механизмов репарации. NHEJ возобновляет связь ДНК с обеих сторон двунитевого разрыва, где участок перекрывания последовательностей является очень маленьким или вовсе отсутствует, для обеспечения отжига. Этот механизм репарации индуцирует ошибки в геноме посредством вставки, или делеции, или хромосомной перестройки. Любые такие ошибки могут сделать продукты гена, закодированные в этом месте, не функциональными. Для определенных видов применения может быть необходимым точное удаление полинуклеотида из генома растения. Такие применения возможны с применением пары сконструированных мегануклеаз, каждая из которых расщепляет сайт распознавания мегануклеазой по обе стороны от предполагаемой делеции. Также можно применять TALEN, которые способны распознавать ген и связываться с ним и вносить двунитевой разрыв в геном. Таким образом, в другом аспекте предусмотрены способы получения мутантных, не встречающихся в природе, или трансгенных, или иным образом генетически модифицированных растений, описанных в данном документе, с применением эффекторных нуклеаз TAL.

CRISPR/Cas

Другой способ редактирования гена включает применение бактериальной системы CRISPR/Cas. Бактерии и архебактерии характеризуются наличием хромосомных элементов, называемых короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), которые являются частью адаптивной иммунной системы, защищающей от проникновения вирусной и плазмидной ДНК. В случае систем CRISPR типа II, CRISPR-РНК (crRNA) функционируют с трансактивирующей crRNA (tracrRNA) и CRISPR-ассоциированными (Cas) полипептидами с обеспечением внесения двунитевых разрывов в ДНК-мишень. Расщепление мишени с помощью Cas9 требует спаривания оснований crRNA и tracrRNA, а также спаривания оснований crRNA и ДНК-мишени. Распознавание мишени облегчается при наличии короткого мотива, называемого прилегающим к протоспейсеру мотивом (PAM), который соответствует последовательности NGG. Данную систему можно применять для редактирования генома. Cas9 обычно программируется двойной РНК, состоящей из crRNA и tracrRNA. Тем не менее, коровые компоненты этих РНК могут быть объединены в единую гибридную «направляющую РНК» для нацеливания Cas9. Использование некодирующей направляющей РНК для нацеливания на ДНК с целью сайт-специфического расщепления обещает быть значительно более простым, чем существующие технологии, такие как TALEN. При применении стратегии CRISPR/Cas перенацеливание нуклеазного комплекса требует только введения новой последовательности РНК, и нет необходимости в реконструировании специфичности факторов транскрипции на основе полипептида. Технологию CRISPR/Cas осуществили в растениях в способе по международной заявке на патент WO 2015/189693, в которой раскрыта платформа для опосредованного вирусом редактирования генома, которая является широко применимой для видов растений. Геном RNA2 вируса погремковости табака (TRV) был сконструирован для переноса и доставки направляющей РНК в растения Nicotiana benthamiana со сверхэкспрессией эндонуклеазы Cas9. В контексте настоящего изобретения направляющая РНК может быть получена из любой из последовательностей, раскрытых в данном документе, и идей из WO 2015/189693, применяемых для редактирования генома клетки растения и получения необходимого мутантного растения. Высокий темп развития технологии обеспечил появление большого разнообразия протоколов с широкими возможностями применения в растениях, которые были хорошо классифицированы в ряде недавних научных обзоров (например, Plant Methods (2016) 12:8; и Front Plant Sci. (2016) 7:506). Обзор систем CRISPR/Cas с особым акцентом на их применении описан в Biotechnology Advances (2015) 33, 1, 41-52). Более недавние разработки в отношении применения CRISPR/Cas для манипулирования геномами растений описаны в Acta Pharmaceutica Sinica B (2017) 7, 3, 292-302 и Curr. Op. in Plant Biol. (2017) 36, 1-8. Плазмиды на основе CRISPR/Cas9 для применения в растениях перечислены в «addgene», некоммерческом хранилище плазмид (addgene.org), и плазмиды на основе CRISPR/Cas являются коммерчески доступными.

Антисмысловая модификация

Технология применения антисмысловых олигонуклеотидов представляет собой другой хорошо известный способ, который можно применять для модулирования экспрессии полипептида. Полинуклеотид гена, подлежащего репрессии, клонируют и функционально связывают с регуляторным участком и последовательностью терминации транскрипции, так что транскрибируется антисмысловая нить РНК. Затем рекомбинантной конструкцией трансформируют клетку растения и получают антисмысловую нить РНК. Полинуклеотид не обязательно является полной последовательностью гена, подлежащего репрессии, но, как правило, является практически комплементарным по меньшей мере части смысловой нити гена, подлежащего репрессии.

Полинуклеотид может быть транскрибирован в рибозим или каталитическую РНК, которая влияет на экспрессию мРНК. Рибозимы можно разрабатывать таким образом, чтобы они специфически спаривались практически с любой целевой РНК и расщепляли фосфодиэфирный остов в определенном месте, тем самым функционально инактивируя целевую РНК. Гетерологичные полинуклеотиды могут кодировать рибозимы, разработанные таким образом, чтобы они расщепляли конкретные транскрипты мРНК, предотвращая таким образом экспрессию полипептида. Рибозимы типа hammerhead являются применимыми для разрушения конкретных мРНК, хотя можно применять различные рибозимы, которые расщепляют мРНК в последовательностях сайт-специфического распознавания. Рибозимы типа hammerhead расщепляют мРНК в местах, определяемых фланкирующими участками, которые образуют комплементарные пары оснований с мРНК-мишени. Единственным требованием является то, что РНК-мишень должна содержать полинуклеотид 5'-UG-3'. Конструирование и получение рибозимов типа hammerhead известно в данной области техники. Последовательности рибозимов типа hammerhead можно встраивать в стабильную РНК, такую как транспортная РНК (tRNA) для повышения эффективности расщепления in vivo.

В одном варианте осуществления специфичный в отношении последовательности полинуклеотид, который может нарушать трансляцию транскрипта(транскриптов) РНК, представляет собой интерферирующую РНК. РНК-интерференция или РНК-сайленсинг представляют собой эволюционно консервативный процесс, с помощью которого конкретные мРНК могут быть нацелены для ферментативного разрушения. Двунитевую РНК (двунитевую РНК) вводят в клетку или получают в клетке (например, вирус с двунитевой РНК или полинуклеотиды, представляющие собой интерферирующую РНК) для инициации пути интерферирующей РНК. Двунитевую РНК можно преобразовывать в несколько дуплексов малых интерферирующих РНК (siRNA) длиной 21-24 п. о. с помощью РНКаз III, которые представляют собой эндонуклеазы, специфичные к двунитевой РНК. В последствии, siRNA могут распознаваться индуцируемыми РНК комплексами сайленсинга, которые способствуют раскручиванию siRNA с помощью АТФ-зависимого процесса. Раскрученная антисмысловая нить siRNA направляет активированные РНК-индуцированные комплексы сайленсинга к мРНК, в отношении которой осуществлено нацеливание, которая содержит последовательность, комплементарную антисмысловой нити siRNA. мРНК, в отношении которой осуществлено нацеливание, и антисмысловая нить могут образовывать А-форму спирали, и большая бороздка А-формы спирали может распознаться активированными РНК-индуцированными комплексами сайленсинга. мРНК-мишень может расщепляться с помощью активированных РНК-индуцированных комплексов сайленсинга в одном сайте, определенном сайтом связывания 5'-конца нити siRNA. Активированные РНК-индуцированные комплексы сайленсинга могут повторно использоваться для катализа еще одного события расщепления.

Векторы экспрессии на основе интерферирующей РНК могут содержать конструкции интерферирующей РНК, кодирующие полинуклеотиды интерферирующей РНК, которые осуществляют РНК-интерференцию путем понижения уровня экспрессии мРНК, пре-мРНК или родственных вариантов РНК. Векторы экспрессии могут содержать промотор, расположенный выше по последовательности и функционально связанный с конструкцией интерферирующей РНК, как дополнительно описано в данном документе. Векторы экспрессии на основе интерферирующей РНК могут содержать подходящий минимальный коровый промотор, представляющую интерес конструкцию интерферирующей РНК, расположенный выше по последовательности (5') регуляторный участок, расположенный ниже по последовательности (3') регуляторный участок, в том числе сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования, и другие последовательности, известные специалистам в данной области техники, такие как различные селективные маркеры.

Молекулы двунитевой РНК могут включать молекулы siRNA, собранные из отдельного олигонуклеотида в структуре стебель-петля, где самокомплементарные смысловую и антисмысловую участки молекулы siRNA соединены с помощью основанного на полинуклеотидах или не основанного на полинуклеотидах линкера(линкеров), а также кольцевую однонитевую РНК с двумя или более петлевыми структурами и стеблем, содержащую самокомплементарные смысловую и антисмысловую нити, где кольцевую РНК можно процессировать либо in vivo, либо in vitro с образованием активной молекулы siRNA, способной опосредовать интерферирующую РНК.

Также предусмотрено использование молекул малой шпилечной РНК. Они содержат специфичную антисмысловую последовательность в дополнение к обратно комплементарной (смысловой) последовательности, как правило, отделенной спейсером или последовательностью петли. Расщепление спейсера или петли обеспечивает образование молекулы однонитевой РНК и ее обратно комплементарной нити, так что их можно отжечь с образованием двунитевой молекулы РНК (необязательно с дополнительными стадиями обработки, которые могут в результате привести в результате к добавлению или удалению одного, двух, трех или более нуклеотидов с 3'-конца или 5'-конца одной или обеих нитей). Спейсер может иметь достаточную длину для обеспечения отжига антисмысловой и смысловой последовательностей и образования двунитевой структуры (или стебля) до расщепления спейсера (и необязательно последующих стадий обработки, которые могут в результате привести в результате к добавлению или удалению одного, двух, трех, четырех или более нуклеотидов с 3'-конца или с 5'-конца одной или обеих нитей). Спейсерная последовательность как правило представляет собой неродственный полинуклеотид, который находится между двумя комплементарными участками полинуклеотидов, которые после отжига с получением двунитевого полинуклеотида образуют малую шпилечную РНК. Спейсерная последовательность обычно содержит от приблизительно 3 до приблизительно 100 нуклеотидов.

Любой представляющий интерес РНК-полинуклеотид можно получить путем подбора подходящей композиции последовательности, размера петли и длины стебля для получения шпилечного дуплекса. При осуществлении разработки подходящий диапазон длины стебля шпилечного дуплекса включает длины стебля, составляющие по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, как, например, приблизительно 14-30 нуклеотидов, приблизительно 30-50 нуклеотидов, приблизительно 50-100 нуклеотидов, приблизительно 100-150 нуклеотидов, приблизительно 150-200 нуклеотидов, приблизительно 200-300 нуклеотидов, приблизительно 300-400 нуклеотидов, приблизительно 400-500 нуклеотидов, приблизительно 500-600 нуклеотидов и приблизительно 600-700 нуклеотидов. При осуществлении разработки подходящий диапазон длин петли шпилечного дуплекса включает длину петли, составляющую приблизительно 4-25 нуклеотидов, приблизительно 25-50 нуклеотидов или больше, если длина стебля шпилечного дуплекса является значительной. В определенных вариантах осуществления длина молекулы двунитевой РНК или ssRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 40 нуклеотидов. В другом варианте осуществления молекула siRNA представляет собой молекулу двунитевой РНК или ssRNA длиной от приблизительно 15 до приблизительно 35 нуклеотидов. В другом варианте осуществления молекула siRNA представляет собой молекулу двунитевой РНК или ssRNA длиной от приблизительно 17 до приблизительно 30 нуклеотидов. В другом варианте осуществления молекула siRNA представляет собой молекулу двунитевой РНК или ssRNA длиной от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов. В другом варианте осуществления молекула siRNA представляет собой молекулу двунитевой РНК или ssRNA длиной от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления шпилечные структуры с участками в виде дуплекса длиннее 21 нуклеотида могут способствовать эффективному сайленсингу, управляемому siRNA, вне зависимости от последовательности и длины петли. Иллюстративные последовательности для осуществления РНК-интерференции описаны в данном документе.

Длина последовательности мРНК-мишени составляет, как правило, от приблизительно 14 до приблизительно 50 нуклеотидов. Следовательно, мРНК-мишень можно проверить на наличие участков длиной от приблизительно 14 до приблизительно 50 нуклеотидов, которые предпочтительно соответствуют одному или более из следующих критериев: соотношение A+T/G+С составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2; наличие динуклеотида AA или динуклеотида СA на 5'-конце; наличие последовательности из по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов, являющихся уникальными для мРНК-мишени (то есть, последовательность не присутствует в других последовательностях мРНК из этого же растения); и отсутствие «рядов» из более чем трех последовательных нуклеотидов, представляющих собой гуанин (G), или более чем трех последовательных нуклеотидов, представляющих собой цитозин (C). Оценку в отношении данных критериев можно осуществлять с помощью различных методик, известных в данной области техники, например, компьютерные программы, такие как BLAST, можно применять для поиска по общедоступным базам данных, чтобы определить, является ли выбранная последовательность уникальной для мРНК-мишени. В качестве альтернативы, последовательность можно отобрать (и разработать последовательность siRNA) с помощью коммерчески доступного компьютерного программного обеспечения (например, OligoEngine, Target Finder и Design Tool для siRNA, которые являются коммерчески доступными).

В одном варианте осуществления отбирают последовательности мРНК-мишени, длина которых составляет от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, которые соответствуют одному или более критериям, указанным выше. В другом варианте осуществления отбирают последовательности, длина которых составляет от приблизительно 16 до приблизительно 30 нуклеотидов, которые соответствуют одному или более критериям, указанным выше. В дополнительном варианте осуществления отбирают последовательности, длина которых составляет от приблизительно 19 до приблизительно 30 нуклеотидов, которые соответствуют одному или более критериям, указанным выше. В другом варианте осуществления отбирают последовательности, длина которых составляет от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов, которые соответствуют одному или более критериям, указанным выше.

В иллюстративном варианте осуществления молекулы siRNA содержат специфическую антисмысловую последовательность, которая комплементарна по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более смежным нуклеотидам из любого из полинуклеотидов, описанных в данном документе.

Специфическая антисмысловая последовательность, содержащаяся в молекуле siRNA, может быть идентичной или практически идентичной комплементарной последовательности. В одном варианте осуществления специфическая антисмысловая последовательность, содержащаяся в молекуле siRNA, является на по меньшей мере приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, комплементарной последовательности мРНК-мишени. Способы определения идентичности последовательности известны в данной области техники, и ее можно определить, например, с помощью программы BLASTN из программного обеспечения Computer Group (GCG) Университета штата Висконсин, или предоставленной на веб-сайте NCBI.

Один способ индукции сайленсинга двунитевой РНК у растений представляет собой трансформацию с помощью генной конструкции, продуцирующей шпилечную РНК (см. Nature (2000) 407, 319-320). Такие конструкции содержат инвертированные участки последовательности целевого гена, отделенные соответствующим спейсером. Вставка функционального интронного участка растения в качестве спейсерного фрагмента дополнительно повышает эффективность индукции сайленсинга гена благодаря выработке шпилечной РНК на основе сплайсинга интрона (Plant J. (2001), 27, 581-590). Предпочтительно длина стебля составляет от приблизительно 50 нуклеотидов до приблизительно 1 тысячи нуклеотидов в длину. Способы получения шпилечной РНК на основе сплайсинга интрона хорошо описаны в данной области техники (см., например, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617).

Молекулы интерферирующей РНК, имеющие структуру в виде дуплекса или двунитевую структуру, например двунитевая РНК или малая шпилечная РНК, могут иметь тупые концы, или могут иметь 3'- или 5'-выступы. Используемый в данном документе термин «выступ» относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают из структуры в виде дуплекса, если 3'-конец одной нити РНК выходит за пределы 5'-конца другой нити (3'-выступ), или наоборот (5'-выступ). Нуклеотиды, составляющие выступы, могут быть рибонуклеотидами, дезоксирибонуклеотидами или их модифицированными версиями. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна нить молекулы интерферирующей РНК имеет 3'-выступ длиной от приблизительно 1 до приблизительно 6 нуклеотидов. В других вариантах осуществления длина 3'-выступа составляет от приблизительно 1 до приблизительно 5 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 3 нуклеотидов и от приблизительно 2 до приблизительно 4 нуклеотидов.

Если молекула интерферирующей РНК содержит 3'-выступ на одном конце молекулы, другой конец может быть с тупым концом, или также иметь выступ (5' или 3'). Если молекула интерферирующей РНК содержит выступ с обоих концов молекулы, длина выступов может быть одинаковой или разной. В одном варианте осуществления молекула интерферирующей РНК содержит 3'-выступы, состоящие из от приблизительно 1 до приблизительно 3 нуклеотидов, на обоих концах молекулы. В дополнительном варианте осуществления молекула интерферирующей РНК представляет собой двунитевую РНК, имеющую 3'-выступ из 2 нуклеотидов с обоих концов молекулы. В еще одном варианте осуществления нуклеотиды, составляющие выступ интерферирующей РНК, являются динуклеотидами TT или динуклеотидами UU.

Молекулы интерферирующей РНК могут содержать одну или более 5'- или 3'-кэп-структур. Термин «кэп-структура» относится к химической модификации, включенной с любого конца олигонуклеотида, которая защищает молекулу от разрушения эндонуклеазами и может также облегчать доставку или локализацию внутри клетки.

Другой модификацией, применяемой к молекулам интерферирующей РНК, является химическое связывание с молекулой интерферирующей РНК одного или более фрагментов или конъюгатов, которые усиливают функцию, клеточное распределение, клеточный захват, биодоступность или стабильность молекулы интерферирующей РНК. Полинуклеотиды можно синтезировать или модифицировать с помощью способов, общепринятых в данной области техники. Химические модификации включают 2'-модификации, введение неприродных оснований, ковалентное присоединение лиганда и замещение фосфатных связей тиофосфатными связями. В данном варианте осуществления прочность структуры в виде дуплекса укрепляют с помощью по меньшей мере одной и, как правило, двух химических связей.

Нуклеотиды одной или обеих из двух одинарных нитей можно модифицировать для модулирования активации клеточных ферментов, таких как, например, без ограничения определенные нуклеазы. Методики для понижения уровня или ингибирования активации клеточных ферментов известны в данной области техники и включают без ограничения 2'-аминомодификации, 2'-фтормодификации, 2'-алкилмодификации, модификации незаряженного каркаса, морфолиновые модификации, 2'-О-метилмодификации и фосфорамидат.

Молекулу интерферирующей РНК можно конъюгировать с лигандами, например, для усиления ее абсорбции клеткой. В определенных вариантах осуществления гидрофобный лиганд конъюгируют с молекулой для облегчения прямого проникновения через клеточную мембрану. В определенных случаях конъюгация катионного лиганда с олигонуклеотидами часто в результате приводит к улучшению устойчивости к нуклеазам.

«Нацеленные индуцированные локальные повреждения в геноме» (TILLING) представляет собой еще одну технологию мутагенеза, которую можно применять для создания и/или идентификации полинуклеотидов, кодирующих полипептиды с модифицированной экспрессией, функцией и/или активностью. TILLING также обеспечивает возможность отбора растений, несущих такие мутантные варианты. В TILLING комбинируют мутагенез высокой плотности со способами высокопроизводительного скрининга. Способы осуществления TILLING хорошо известны из уровня техники (см. McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457 и Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Различные варианты осуществления направлены на векторы экспрессии, содержащие один или более полинуклеотидов или одну или более конструкций интерферирующей РНК, которые содержат один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе.

Различные варианты осуществления направлены на векторы экспрессии, содержащие один или более полинуклеотидов или одну или более конструкций интерферирующей РНК, описанных в данном документе.

Различные варианты осуществления направлены на векторы экспрессии, содержащие один или более полинуклеотидов или одну или более конструкций интерферирующей РНК, кодирующих один или более полинуклеотидов интерферирующей РНК, описанных в данном документе, которые способны к самоотжигу с образованием шпилечной структуры, где конструкция содержит: (a) один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе; (b) вторую последовательность, кодирующую спейсерный элемент, который образует петлю шпилечной структуры; и (c) третью последовательность, содержащую последовательность, обратно комплементарную первой последовательности, расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность, где вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью, и третья последовательность функционально связана с первой последовательностью и третьей последовательностью.

Раскрытые последовательности можно применять для конструирования различных полинуклеотидов, которые не образуют шпилечных структур. Например, двунитевая РНК может быть образована посредством (1) транскрибирования первой цепи ДНК путем функционального связывания с первым промотором и (2) транскрибирования последовательности, обратно комплементарной фрагменту ДНК первой цепи путем функционального связывания со вторым промотором. Каждую цепь полинуклеотида можно транскрибировать из одного вектора экспрессии, или из разных векторов экспрессии. РНК-дуплекс, обладающий свойствами РНК-интерференции, можно ферментативно преобразовать в siRNA для модулирования уровней РНК.

Таким образом, различные варианты осуществления направлены на векторы экспрессии, содержащие один или более полинуклеотидов или конструкций интерферирующей РНК, описанных в данном документе, кодирующих полинуклеотиды интерферирующей РНК, способные к самоотжигу, в которых конструкция содержит: (a) один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе; и (b) вторую последовательность, содержащую последовательность, комплементарную (например, обратно комплементарную) первой последовательности, расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность.

Предусмотрены различные композиции и способы для модулирования уровней эндогенной экспрессии одного или более полипептидов, описанных в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе) путем стимулирования косупрессии экспрессии генов.

Различные композиции и способы предусмотрены для модулирования уровня экспрессии эндогенного гена путем модулирования трансляции мРНК. Клетку растения-хозяина (табака) можно трансформировать вектором экспрессии, содержащим промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, расположенным в антисмысловой ориентации по отношению к промотору, для обеспечения экспрессии РНК-полинуклеотидов, имеющих последовательность, комплементарную части мРНК.

Различные векторы экспрессии для модулирования трансляции мРНК могут содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, где последовательность расположена в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Длина полинуклеотидов антисмысловой РНК может варьировать и может составлять приблизительно 15-20 нуклеотидов, приблизительно 20-30 нуклеотидов, приблизительно 30-50 нуклеотидов, приблизительно 50-75 нуклеотидов, приблизительно 75-100 нуклеотидов, приблизительно 100-150 нуклеотидов, приблизительно 150-200 нуклеотидов и приблизительно 200-300 нуклеотидов.

Мобильные генетические элементы

В качестве альтернативы, нацеливание для инактивации в отношении генов можно осуществлять путем введения транспозонов (например, IS-элементов) в геномы представляющих интерес растений. Данные мобильные генетические элементы можно ввести с помощью полового перекрестного опыления и мутантов со вставками можно подвергнуть скринингу в отношении потери функции полипептида. Разрушенный ген родительского растения можно ввести в другие растения путем скрещивания родительского растения с растением, не подвергнутым индуцированному транспозоном мутагенезу, например, путем полового перекрестного опыления. Можно применять любые стандартные методики селекции, известные специалистам в данной области техники. В одном варианте осуществления один или более генов можно инактивировать путем вставки одного или более транспозонов. Мутации могут привести к гомозиготному разрушению одного или более генов, к гетерозиготному разрушению одного или более генов, или к комбинации гомозиготных и гетерозиготных разрушений, если разрушен более чем один ген. Подходящие мобильные элементы включают ретротранспозоны, ретропозоны и SINE-подобные элементы. Такие способы известны специалистам в данной области техники.

Рибозимы

В качестве альтернативы, нацеливание для инактивации в отношении генов можно осуществлять путем введения рибозимов, полученных из ряда малых кольцевых РНК, которые способны к саморасщеплению и репликации в растениях. Данные РНК могут реплицироваться либо самостоятельно (РНК вироида), либо с участием вируса-помощника (сателлитные РНК). Примеры подходящих РНК включают полученные из вироида солнечной пятнистости авокадо и сателлитные РНК, полученные из вируса кольцевой пятнистости табака, вируса временной полосатости люцерны, вируса бархатной пятнистости табака, вируса пятнистости Solanum nodiflorum и вируса пятнистости клевера подземного. Различные специфичные к целевой РНК рибозимы известны специалистам в данной области техники.

Мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь любую комбинацию одной или более мутаций в одном или более генах, которая приводит в результате к модулированию экспрессии, или функции, или активности этих генов или их продуктов. Например, мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь одну мутацию в одном гене; несколько мутаций в одном гене; одну мутацию в двух или более, или трех или более, или четырех или более генах; или несколько мутаций в двух или более, или трех или более, или четырех или более генах. Примеры таких мутаций описаны в данном документе. В качестве дополнительного примера, мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь одну или более мутаций в конкретной части гена(генов), например, в участке гена, который кодирует активный сайт полипептида или его часть. В качестве дополнительного примера, мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь одну или более мутаций в участке вне одного или более гена(генов), как, например, участок выше или ниже по последовательности от гена, который он регулирует, при условии, что они модулируют функцию или экспрессию гена(генов). Элементы, расположенные выше по последовательности, могут включать промоторы, энхансеры или факторы транскрипции. Некоторые элементы, такие как энхансеры, могут располагаться выше по последовательности или ниже по последовательности от гена, который они регулируют. Элемент(элементы) не обязательно расположен рядом с геном, который он регулирует, так как было обнаружено, что некоторые элементы расположены на расстоянии в несколько тысяч пар оснований выше по последовательности или ниже по последовательности от гена, который они регулируют. Мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь одну или более мутаций, расположенных в первых 100 нуклеотидах от гена(генов), в первых 200 нуклеотидах от гена(генов), в первых 300 нуклеотидах от гена(генов), в первых 400 нуклеотидах от гена(генов), в первых 500 нуклеотидах от гена(генов), в первых 600 нуклеотидах от гена(генов), в первых 700 нуклеотидах от гена(генов), в первых 800 нуклеотидах от гена(генов), в первых 900 нуклеотидах от гена(генов), в первой 1000 нуклеотидов от гена(генов), в первых 1100 нуклеотидах от гена(генов), в первых 1200 нуклеотидах от гена(генов), в первых 1300 нуклеотидах от гена(генов), в первых 1400 нуклеотидах от гена(генов) или в первых 1500 нуклеотидах от гена(генов). Мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения могут иметь одну или более мутаций, расположенных в первом, втором, третьем, четвертом, пятом, шестом, седьмом, восьмом, девятом, десятом, одиннадцатом, двенадцатом, тринадцатом, четырнадцатом или пятнадцатом наборе из 100 нуклеотидов гена(генов) или их комбинации. Раскрыты мутантные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения (например, мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения или клетки растения и т. п., как описано в данном документе), содержащие варианты мутантного полипептида.

В одном варианте осуществления семена растений подвергают мутагенезу и затем выращивают из них мутантные растения первого поколения. Затем растениям первого поколения дают самоопылиться и из семян от растений первого поколения выращивают растения второго поколения, которые затем проверяют на наличие мутаций в их локусах. Не смотря на то, что подвергнутый мутации растительный материал можно подвергнуть скринингу на наличие мутаций, преимуществом скрининга растений второго поколения является то, что все соматические мутации соответствуют мутациям в зародышевых линиях. Специалисту в данной области техники будет понятно, что различный растительный материал, в том числе без ограничения семена, пыльцу, ткань растения или клетки растения, можно подвергнуть мутагенезу для создания мутантных растений. Однако тип растительного материала, подвергнутого мутагенезу, может иметь значение, когда полинуклеотид растения подвергают скринингу на наличие мутаций. Например, если пыльцу подвергают мутагенезу до опыления не подвергнутого мутагенезу растения, из семян, полученных при этом опылении, выращивают растения первого поколения. Каждая клетка растений первого поколения будет содержать мутации, возникшие в пыльце; таким образом, эти растения первого поколения можно затем подвергнуть скринингу на наличие мутаций вместо того, чтобы ждать появления второго поколения.

Получение модифицированных растений, скрининг и скрещивание

Полинуклеотид, полученный из отдельных растений, клеток растения или растительного материала, можно необязательно объединить, чтобы ускорить скрининг в отношении мутаций в популяции растений, происходящих из подвергнутых мутагенезу ткани, клеток растения или растительного материала. Можно проверить одно или более следующих поколений растений, клеток растения или растительного материала. Размер необязательно объединенной группы зависит от чувствительности применяемого способа скрининга.

После необязательного объединения образцов, их можно подвергнуть анализу с помощью методик полинуклеотид-специфичной амплификации, таких как ПЦР. Любой один или более праймеров или зондов, специфичных в отношении гена или последовательностей, непосредственно примыкающих к гену, можно применять для амплификации последовательностей в пределах необязательно объединенного образца. Предпочтительно для амплификации участков локуса, в которых с наибольшей вероятностью возникают полезные мутации, разрабатывают один или более праймеров или зондов. Наиболее предпочтительно праймер разрабатывают для выявления мутаций в участках полинуклеотида. Дополнительно, предпочтительным для праймера(праймеров) и зонда(зондов) было бы обеспечить избегание известных полиморфных сайтов для облегчения скрининга точечных мутаций. Для облегчения выявления продуктов амплификации один или более праймеров или зондов можно метить с применением любого общепринятого способа введения метки. Праймер(праймеры) или зонд(зонды) можно разрабатывать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с помощью способов, которые хорошо известны в данной области техники.

Для облегчения выявления продуктов амплификации праймер(праймеры) или зонд(зонды) можно метить с применением любого общепринятого способа внесения метки. Их можно разрабатывать на основе последовательностей, описанных в данном документе, с помощью способов, которые хорошо известны в данной области техники.

Полиморфизмы можно идентифицировать с помощью средств, известных в данной области техники, и некоторых из описанных в литературе.

В некоторых вариантах осуществления растение можно регенерировать или вырастить из растения, ткани растения или клетки растения. Можно применять любые подходящие способы регенерации или выращивания растения из клетки растения или ткани растения, такие как без ограничения культивирование тканей или регенерация из протопластов. Предпочтительно растения можно регенерировать путем выращивания трансформированных клеток растения на среде для индукции образования каллюса, среде для индукции образования побегов и/или среде для индукции образования корней. См., например, Plant Cell Reports (1986) 5:81-84. Затем данные растения можно выращивать и либо опылять их с помощью той же трансформированной линии, либо других линий и идентифицировать получаемый в результате гибрид, характеризующийся экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Можно выращивать два или более поколений, чтобы убедиться, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, и затем собирать семена, чтобы убедиться, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики была достигнута. Таким образом, выражение «трансформированные семена», используемое в данном документе, относится к семенам, которые содержат нуклеотидную конструкцию, стабильно интегрированную в геном растения.

Соответственно, в дополнительном аспекте предусмотрен способ получения мутантного растения. Способ включает получение по меньшей мере одной клетки растения, содержащей ген, кодирующий функциональный полинуклеотид, описанный в данном документе (или любую их комбинацию, описанную в данном документе). Далее эту по меньшей мере одну клетку растения обрабатывают в условиях, эффективных для модулирования функции полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного в данном документе. По меньшей мере одну мутантную клетку растения затем подвергают размножению с получением мутантного растение, где мутантное растение характеризуется модулированным уровнем описанного полипептида(полипептидов) (или любой их комбинации, описанной в данном документе) по сравнению с уровнем у контрольного растения. В одном варианте осуществления данного способа получения мутантного растения стадия обработки включает воздействие на по меньшей мере одну клетку химическим мутагенным средством, описанным выше, и в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной клетки растения. В другом варианте осуществления данного способа стадия обработки включает подвергание по меньшей мере одной клетки воздействию источника ионизирующего излучения в условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной клетки растения. Термин «мутантное растение» включает мутантные растения, у которых генотип является модифицированным по сравнению с генотипом у контрольного растения, предпочтительно с помощью способов, отличных от способов генной инженерии и генетической модификации.

В определенных вариантах осуществления мутантное растение, клетка мутантного растения или мутантный растительный материал может содержать одну или более мутаций, которые встречаются в природе в другом растении, клетке растения или растительном материале и обеспечивают требуемый признак. Эту мутацию можно встроить (например, путем интрогрессии) в другое растение, клетку растения или растительный материал (например, растение, клетку растения или растительный материал с генетическим фоном, отличающимся от такового у растения, из которого происходит мутация) для обеспечения у них данного признака. Таким образом, в качестве примера, мутацию, которая встречается в природе в первом растении, можно ввести во второе растение, такое как второе растение с генетическим фоном, отличающимся от такового у первого растения. Таким образом, специалист в данной области техники может осуществлять поиск и идентифицировать растение, несущее в естественных условиях в своем геноме один или более мутантных аллелей генов, описанных в данном документе, которые обеспечивают желаемый признак. Мутантный аллель(аллели), который встречается в природе, можно перенести во второе растение различными способами, включая селекцию, обратное скрещивание и интрогрессию с получением линий, разновидностей или гибридов, которые имеют одну или более мутаций в генах, описанных в данном документе. Та же методика также может быть применена для интрогрессии одной или более не встречающихся в природе мутации(мутаций) из первого растения во второе растение. Растения, демонстрирующие желаемый признак, можно отобрать из пула мутантных растений. Предпочтительно, отбор осуществляют с применением данных о полинуклеотиде, описанном в данном документе. Следовательно, можно осуществлять отбор по генетическому признаку по сравнению с контролем. Такой скрининговый подход может включать применение общепринятых методик амплификации и/или гибридизации, как обсуждалось в данном документе. Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации мутантного растения, включающему следующие стадии: (a) получение образца, содержащего полинуклеотид, из растения; и (b) определение последовательности полинуклеотида, где отличие в последовательности полинуклеотида по сравнению с полинуклеотидом контрольного растения указывает на то, что указанное растение представляет собой мутантное растение. В другом аспекте предусмотрен способ идентификации мутантного растения, которое накапливает одну или более аминокислот на повышенном или пониженном уровне по сравнению с контрольным растением, включающий следующие стадии: (a) получение образца из растения, подлежащего скринингу; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций в одном или более полинуклеотидах, описанных в данном документе; и (c) определение уровня по меньшей мере одной аминокислоты в указанном растении. В другом аспекте предусмотрен способ получения мутантного растения, которое характеризуется повышенными или пониженными уровнями по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с контрольным растением, включающий следующие стадии: (a) получение образца из первого растения; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций в одном или более из полинуклеотидов, описанных в данном документе, которые в результате приводят к модулированию уровней по меньшей мере одной аминокислоты, и (c) перенос одной или более мутаций во второе растение. Мутацию(мутации) можно перенести во второе растение с помощью различных способов, которые известны в данной области техники, например с помощью генной инженерии, манипуляции с генами, интрогрессии, селекции растений, обратного скрещивания и т. п. В одном варианте осуществления первое растение является встречающимся в природе растением. В одном варианте осуществления второе растение характеризуется генетическим фоном, отличающимся от такового у первого растения. В другом аспекте предусмотрен способ получения мутантного растения, которое характеризуется повышенными или пониженными уровнями по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с контрольным растением, включающий следующие стадии: (a) получение образца из первого растения; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или более мутаций в одном или более из полинуклеотидов, описанных в данном документе, которые в результате приводят к модулированию уровней по меньшей мере одной аминокислоты; и (c) интрогрессия одной или более мутаций из первого растения во второе растение. В одном варианте осуществления стадия интрогрессии включает селекцию растений, необязательно включая обратное скрещивание и т. п. В одном варианте осуществления первое растение является встречающимся в природе растением. В одном варианте осуществления второе растение характеризуется генетическим фоном, отличающимся от такового у первого растения. В одном варианте осуществления первое растение не является сортом или элитным сортом. В одном варианте осуществления второе растение представляет собой сорт или элитный сорт. Дополнительный аспект относится к мутантному растению (включая мутантное растение, являющееся сортом или элитным сортом), полученному или получаемому с помощью способов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления «мутантные растения» могут иметь одну или более мутаций, локализованных только в конкретном участке растения, например, в последовательности одного или более полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе. Согласно данному варианту осуществления остальная геномная последовательность мутантного растения будет такой же или практически такой же, как у растения до мутагенеза.

В некоторых вариантах осуществления мутантные растения могут иметь одну или более мутаций, локализованных в более чем одном участке генома растения, таком как в последовательности одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, и в одном или более дополнительных участках генома. Согласно данному варианту осуществления остальная геномная последовательность мутантного растения не будет такой же или не будет практически такой же, как у растения до мутагенеза. В определенных вариантах осуществления мутантные растения могут не иметь одну или более мутаций в одном или более, двух или более, трех или более, четырех или более или пяти или более экзонах полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в одном или более, двух или более, трех или более, четырех или более или пяти или более интронах полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в промоторе полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в 3'-нетранслируемом участке полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в 5'-нетранслируемом участке полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в кодирующем участке полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанных) в данном документе; или могут не иметь одну или более мутаций в некодирующем участке полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного(описанного) в данном документе; или любую комбинацию двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более, или шести или более из их частей.

В дополнительном аспекте предусмотрен способ идентификации растения, клетки растения или растительного материала, содержащих мутацию в гене, кодирующем полинуклеотид, описанный в данном документе, включающий: (a) осуществление мутагенеза в отношении растения, клетки растения или растительного материала; (b) получение образца из указанного растения, клетки растения или растительного материала или их потомков; и (c) определение полинуклеотидной последовательности гена, или его варианта, или фрагмента, где отличие в указанной последовательности свидетельствует о наличии одной или более мутаций в ней. Этот способ также обеспечивает отбор растений, имеющих мутацию(мутации), которая(которые) встречается(встречаются) в участках генома, которые влияют на экспрессию гена в клетке растения, таких как сайт инициации транскрипции, стартовый кодон, участок интрона, граница раздела экзон-интрон, терминатор или стоп-кодон.

Семейства растений, виды, разновидности, семена и культура тканей

Растения, подходящие для применения в их отношении генетической модификации, включают однодольные и двудольные растения и системы клеток растений, в том числе виды из одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.

Подходящие виды могут включать представителей рода Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.

Подходящие виды могут включать Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (бородач Жерара), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (двукисточник тростниковидны), Cynodon dactylon (свинорой пальчатый), Festuca arundinacea (овсяница тростниковая), Spartina pectinata (спартина гребешковая), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale (тритикале), бамбук, Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор красильный), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (масличная пальма), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Beta vulgaris (сахарная свекла), Manihot esculenta (маниок), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca sativa (латук), Musyclise alca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (земляника), Theobroma cacao (какао), Coffeycliseca (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium cepa (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква гигантская), Cucurbita moschata (тыква мускатная), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (бамия), Solanum melongena (баклажан), Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), Petunia spp. (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансеттия), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевица (Agrostis spp.), Populus tremuloides (тополь осинообразный), Pinus spp. (сосна), Abies spp. (пихта), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка), Panicum virgatum (просо), Sorghuycliseor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопчатник), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (просо жемчужное).

Различные варианты осуществления направлены на мутантный табак, не встречающийся в природе табак или трансгенные растения или клетки растения табака, модифицированные для модулирования уровней экспрессии гена, в результате чего получают растения или клетки растения, например растение или клетку растения табака, в которых уровень экспрессии полипептида модулирован в тканях, представляющих интерес, по сравнению с контролем. Раскрытые композиции и способы можно применять в отношении любого вида рода Nicotiana, включая N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae.Предпочтительно, растение табака представляет собой N. tabacum.

Применение сортов табака и элитных сортов табака также предусмотрено в данном документе. Трансгенное, не встречающееся в природе или мутантное растение, следовательно, может представлять собой разновидность табака или элитный сорт табака, которые содержат один или более трансгенов или одну или более генетических мутаций или их комбинацию. Генетическая мутация(мутации) (например, один или более полиморфизмов) могут представлять собой мутации, которые не существуют в природе в отдельной разновидности табака или сорте табака (например, элитном сорте табака), или может представлять собой генетическую мутацию(мутации), которая(которые) существует(существуют) в природе при условии, что мутация не существует в природе в отдельной разновидности табака или сорте табака (например, в элитном сорте табака).

Особенно применимые разновидности Nicotiana tabacum включают табак типа Берлей, табак темного типа, табак трубоогневой сушки и табак восточного типа. Неограничивающими примерами разновидностей или сортов являются: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC табак Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, гибрид 403LC, гибрид 404LC, гибрид 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, табак «Перик», PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B13P, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC номер 2 гибрид 49, Burley 21, KY8959, KY9, MD 609, PG01, PG04, PO1, PO2, PO3, RG11, RG 8, VA509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Также предусмотрены подразновидности вышеуказанного с низким уровнем превращения никотина в норникотин, даже если они специально не указаны в данном документе.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы для получения мутантных растений, не встречающихся в природе растений, гибридных растений и трансгенных растений, которые были модифицированы для модулирования экспрессии или функции полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе). Преимущественно, полученные мутантные растения, не встречающиеся в природе растения, гибридные растения или трансгенные растения могут быть сходными по общему внешнему виду с контрольными растениями или практически такими же. Различные фенотипические характеристики, такие как степень зрелости, количество листьев на растении, высоту стебля, угол врастания листьев, размер листа (ширина и длина), расстояние междоузлия и соотношение листовая пластина-главная жилка можно оценить путем полевых наблюдений.

Один аспект относится к семени мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения, описанного в данном документе. Предпочтительно, семя представляют собой семя табака. Дополнительный аспект относится к пыльце или семяпочке мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения, описанного в данном документе. Кроме того, предусмотрено мутантное растение, не встречающееся в природе растение, гибридное растение или трансгенное растение, описанное в данном документе, которое дополнительно содержит полинуклеотид, обеспечивающий развитие мужской стерильности.

Также представлена культура тканей из регенерируемых клеток мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения или его части, как описано в данном документе, при этом из культуры регенерируют растения, способные экспрессировать все морфологические и физиологические характеристики родителя. Регенерируемые клетки включают клетки из листьев, пыльцы, зародышей, семядолей, гипокотилей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков и их части, семяпочек, побегов, стеблей, черешков, сердцевины и семенных коробочек, или каллюса, или протопластов, полученных из них. Растительный материал, описанный в данном документе, может представлять собой табачный материал, подвергнутый сушке, такой как табачный материал воздушной сушки или солнечной сушки. Примерами разновидностей табака воздушной и солнечной сушки являются таковые типа Берлей и темного типа. Растительный материал, описанный в данном документе, может представлять собой табачный материал трубоогневой сушки, как, например, таковой типа Вирджиния.

Рекомендация CORESTA в отношении сушки табака описана в справочнике CORESTA №17, апрель 2016 г., Sustainability in Leaf Tobacco Production (Принципы устойчивого развития в производстве листового табака).

Одним объектом является получение мутантных, трансгенных или не встречающихся в природе растений или их частей, которые проявляют модулированные уровни NtAAT, что в результате приводит к модулированию уровней по меньшей мере одной аминокислоты, такой как аспартат, в растительном материале, например в листьях, подвергнутых сушке. Поскольку известно, что при нагревании табачного листа аспартат в результате приводит к получению акриламида, модулирование уровней аспартата также может в результате приводить к модуляции уровней акриламида. Синтез аспартата также является важным для синтеза других аминокислот, таких как аспарагин, треонин, изолейцин, цистеин и метионин. Соответственно, уровни одной или более из данных других аминокислот могут модулироваться, если модулируются уровни аспартата. Наличие некоторых аминокислот, таких как треонин, метионин и цистеин, может в результате привести к появлению запаха серы в дыме или аэрозолях, которые получают при нагревании. Следовательно, модулирование уровней данных аминокислот также обеспечивает модуляцию данного запаха серы.

В некоторых вариантах осуществления активность и/или экспрессия одного или более из NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S, NtAAT2-T, NtAAT3-S, NtAAT3-T, NtAAT4-S и NtAAT4-T являются модулированными.

В некоторых вариантах осуществления активность и/или экспрессия одного или более из NtAAT1-S и NtAAT1-T являются модулированными.

В некоторых вариантах осуществления активность и/или экспрессия одного или более из NtAAT2-S и NtAAT2-T являются модулированными.

В некоторых вариантах осуществления активность и/или экспрессия одного или более из NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S и NtAAT2-T являются модулированными.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия и/или активность одного или более из NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S и NtAAT2-T являются модулированными, при этом экспрессия и/или активность одного или более из NtAAT3-S, NtAAT3-T, NtAAT4-S и NtAAT4-T не являются модулированными.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия и/или активность одного или более из NtAAT1-S, NtAAT1-T, NtAAT2-S и NtAAT2-T являются модулированными, при этом экспрессия и/или активность NtAAT3-S NtAAT3-T, NtAAT4-S и NtAAT4-T не являются модулированными.

Предпочтительно, мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части имеют по существу тот же внешний вид, что и контрольное растение.

Соответственно, в данном документе описаны мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части или клетки растения, которые характеризуются модулированными уровнями по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с таковыми в контрольных клетках или контрольных растениях. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или клетки растения были модифицированы для модулирования синтеза или функции одного или более полипептидов, описанных в данном документе, путем модулирования экспрессии одного или более соответствующих полинуклеотидов, описанных в данном документе. Предпочтительно, модулированные уровни по меньшей мере одной аминокислоты наблюдаются по меньшей мере в зеленых листьях, предпочтительно в листьях, подвергнутых сушке.

Дополнительный аспект относится к мутантному, не встречающемуся в природе или трансгенному растению или клетке, где экспрессия или функция одного или более полипептидов AAT, описанных в данном документе, являются модулированными (например, пониженными), и часть растения (например, зеленые листья, предпочтительно листья, подвергнутые сушке, или табак, подвергнутый сушке) характеризуется модулированными (например, пониженными) уровнями по меньшей мере одной аминокислоты, на по меньшей мере 5% по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или функция указанного полипептида(полипептидов) не была модулирована (например, понижена). В некоторых вариантах осуществления уровень по меньшей мере одной аминокислоты в растении, например в зеленых листьях, предпочтительно в листьях, подвергнутых сушке, или табаке, подвергнутом сушке, может быть модулирован (например, понижен), например повышен, на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100%, или по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 200%, по количеству или функции. Уровень по меньшей мере одной аминокислоты может быть понижен до невыявляемых количеств.

Еще один дополнительный аспект относится к растительному материалу, подвергнутому сушке, такому как лист, подвергнутый сушке, или табак, подвергнутый сушке, полученному или получаемому из мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения или клетки, где экспрессия одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе, или функция полипептида, кодируемого ими, является модулированной (например, пониженной), и где уровень по меньшей мере одной аминокислоты является модулированным (например, пониженным) на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 100%, или по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 200% по сравнению с контрольным растением.

Предпочтительно, внешний вид указанного растения или его части (например, листа) является практически таким же, как у контрольного растения. Предпочтительно, растение представляет собой растение табака или кофейное растение.

Варианты осуществления также направлены на композиции и способы для получения мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений или клеток растения, которые были модифицированы для модулирования экспрессии или функции одного или более полинуклеотидов или полипептидов, описанных в данном документе, которая может в результате приводить к получению растений, или компонентов растения (например, листьев, таких как зеленые листья или сушеные листья, или табака), или клеток растения с модулированным содержанием по меньшей мере одной аминокислоты.

Мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения по внешнему виду могут быть сходными с контрольными растениями или по существу такими же. В одном варианте осуществления вес листьев у мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения является практически таким же, как у контрольного растения. В одном варианте осуществления количество листьев у мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения является практически таким же, как у контрольного растения. В одном варианте осуществления вес листьев и количество листьев у мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения является практически таким же, как у контрольного растения. В одном варианте осуществления высота стебля у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений является практически такой же, как у контрольных растений, через, например, один, два или три или более месяцев после пересадки в поле или через 10, 20, 30 или 36 или более дней после обрезания верхушек. Например, высота стебля у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений не меньше, чем высота стебля у контрольных растений. В другом варианте осуществления содержание хлорофилла у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений является практически таким же, как у контрольных растений. В другом варианте осуществления высота стебля у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений является практически такой же, как у контрольных растений, и содержание хлорофилла у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений является практически таким же, как у контрольных растений. В других вариантах осуществления размер или форма или количество или окраска листьев у мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений являются практически такими же, как у контрольных растений. Предпочтительно, растение представляет собой растение табака или кофейное растение.

В другом аспекте предусмотрен способ модулирования количества по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере части растения (например, в листьях, таких как листья, подвергнутые сушке, или в табаке), включающий следующие стадии: (i) модулирование экспрессии или функции одного или более полипептидов, описанных в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе), предпочтительно, где полипептид(полипептиды) кодируются соответствующими полинуклеотидами, описанными в данном документе; (ii) измерение уровня по меньшей мере одной аминокислоты в по меньшей мере части (например, в листьях, таких как листья, подвергнутые сушке, или в табаке, или в дыме) мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения, полученного на стадии (i); и (iii) идентификация мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения, в котором уровень по меньшей мере одной аминокислоты был модулирован по сравнению с контрольным растением. Предпочтительно внешний вид указанного мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения является практически таким же, как у контрольного растения. Предпочтительно растение представляет собой растение табака.

В другом аспекте предусмотрен способ модулирования количества по меньшей мере одной аминокислоты по меньшей мере в части растительного материала, подвергнутого сушке, такого как, листья, подвергнутые сушке, включающий следующие стадии: (i) модулирование экспрессии или функции одного или более полипептидов (или любой их комбинации, как описано в данном документе), предпочтительно, где полипептид(полипептиды) кодируются соответствующими полинуклеотидами, описанными в данном документе; (ii) сбор растительного материала, такого как один или более листьев, и сушки в течение определенного периода времени; (iii) измерение уровня по меньшей мере одной аминокислоты по меньшей мере в части растительного материала, подвергнутого сушке, полученного на стадии (ii) или во время стадии (ii); и (iv) идентификация растительного материала, подвергнутого сушке, в котором уровень по меньшей мере одной аминокислоты был модулирован по сравнению с контрольным растением.

Повышение уровня экспрессии по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или повышение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% или более, как например, 200%, 300%, 500%, 1000% или более, что включает повышение транскрипционной функции, или уровня экспрессии полинуклеотида, или уровня экспрессии полипептида, или их комбинации.

Повышение функции или активности по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или повышение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% или более, как, например, 200%, 300%, 500%, 1000% или более.

Понижение уровня экспрессии по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или понижение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100%, что включает понижение транскрипционной функции, или уровня экспрессии полинуклеотида, или уровня экспрессии полипептида, или их комбинации. Предпочтительно, экспрессия является пониженной.

Понижение функции или активности по сравнению с контролем может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100%, или понижение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100%. Предпочтительно, функция или активность являются пониженными.

Полинуклеотиды и рекомбинантные конструкции, описанные в данном документе, можно применять для модулирования экспрессии, или функции, или активности полинуклеотидов или полипептидов, описанных в данном документе, в представляющем интерес виде растений, предпочтительно в табаке.

Целый ряд способов на основе полинуклеотидов можно применять для повышения уровня экспрессии генов в растениях и клетках растений. В качестве примера, можно получать конструкцию, вектор или вектор экспрессии, совместимые с подлежащим трансформации растением, которые содержат представляющий интерес ген вместе с расположенным выше по последовательности промотором, способным к обеспечению сверхэкспрессии гена в растении или клетке растения. Иллюстративные промоторы описаны в данном документе. После трансформации и при выращивании в подходящих условиях промотор может запускать экспрессию для модулирования уровней данного фермента в растении или в его конкретной ткани. В одном иллюстративном варианте осуществления создают вектор, несущий один или более полинуклеотидов, описанных в данном документе (или любую их комбинацию, как описано в данном документе), для обеспечения сверхэкспрессии гена в растении или клетке растения. Вектор несет подходящий промотор, такой как промотор 35S вируса мозаики цветной капусты CaMV, расположенный выше по последовательности от трансгена, который запускает его конститутивную экспрессию во всех тканях растения. Вектор также несет ген устойчивости к антибиотику с целью обеспечения возможности отбора трансформированных каллюсов и линий клеток.

Экспрессию последовательностей с промоторов можно усилить посредством включения последовательностей, обеспечивающих контроль экспрессии, в том числе энхансеров, активирующих хроматин элементов, элементов, чувствительных к факторам транскрипции и т. п. Такие последовательности, обеспечивающие контроль, могут быть конститутивными и повышать уровень транскрипции универсальным образом; или они могут быть факультативными и повышать уровень транскрипции в ответ на конкретные сигналы. Отдельно следует указать сигналы, связанные со старением, и сигналы, которые активны во время процедуры сушки.

Различные варианты осуществления, таким образом, направлены на способы модулирования уровня экспрессии одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе), путем интеграции нескольких копий полинуклеотида в геном растения, при этом данные способы включают трансформацию клетки растения-хозяина вектором экспрессии, который содержит промотор, функционально связанный с одним или более полинуклеотидами, описанными в данном документе. Полипептид, кодируемый рекомбинантным полинуклеотидом, может являться нативным полипептидом или может являться гетерологичным по отношению к клетке.

В одном варианте осуществления растение, используемое в настоящем изобретении, представляет собой растение, подвергнутое воздушной сушке, поскольку такие растения характеризуются высоким содержанием аминокислот (при выращивании в поле содержание свободных аминокислот составляет более чем приблизительно 27,4 мг/г в пересчете на сухой вес) и высоким содержанием аммиака (при выращивании в поле, более чем приблизительно 0,18% в пересчете на сухой вес) в конце сушки. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, подвергнутые воздушной сушке, могут характеризоваться содержанием аминокислот, которое соответствует содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 27,4 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, например содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 20 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 15 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 10 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, высушенные на воздухе, могут характеризоваться содержанием аммиака, которое при выращивании в поле составляет приблизительно 0,18% в пересчете на сухой вес в конце сушки, или менее чем приблизительно 0,15% в пересчете на сухой вес при выращивании в поле в конце сушки, или менее чем приблизительно 0,10% в пересчете на сухой вес при выращивании в поле в конце сушки, или менее чем приблизительно 0,05% в пересчете на сухой вес при выращивании в поле в конце сушки.

В другом варианте осуществления растение, используемое в настоящем изобретении, представляет собой растение, подвергнутое солнечной сушке, поскольку такие растения характеризуются высоким содержанием аминокислот (при выращивании в поле содержание свободных аминокислот составляет более чем приблизительно 26,5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки) и высоким содержанием аммиака (при выращивании в поле, более чем приблизительно 0,14% в пересчете на сухой вес в конце сушки). Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, подвергнутые солнечной сушке, могут характеризоваться содержанием аминокислот, которое соответствует содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 26,5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, например содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему приблизительно 20 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 20 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 15 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 10 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, подвергнутые солнечной сушке, могут характеризоваться содержанием аммиака, которое при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,14% в пересчете на сухой вес в конце сушки, или при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,10% в пересчете на сухой вес в конце сушки, или при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,05% в пересчете на сухой вес в конце сушки.

В другом варианте осуществления растение, используемое в настоящем изобретении, представляет собой растение, которое подвергнуто трубоогневой сушке. Такие растения характеризуются содержанием аминокислот, которое соответствует содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему более чем приблизительно 3 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, и содержанием аммиака, которое при выращивании в поле составляет более чем приблизительно 0,02% в пересчете на сухой вес в конце сушки. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, подвергнутые трубоогневой сушке, могут характеризоваться содержанием аминокислот, которое соответствует содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 3 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, например содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему приблизительно 2,5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 2,0 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 1,5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 1,0 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки, или содержанию свободных аминокислот при выращивании в поле, составляющему менее чем приблизительно 0,5 мг/г в пересчете на сухой вес в конце сушки. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или их части, подвергнутые солнечной сушке, могут характеризоваться содержанием аммиака, которое при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,02% в пересчете на сухой вес в конце сушки, или при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,10% в пересчете на сухой вес в конце сушки, или при выращивании в поле составляет менее чем приблизительно 0,05% в пересчете на сухой вес в конце сушки.

В некоторых вариантах осуществления применение растений, которые подверглись воздушной сушке или солнечной сушке, является предпочтительным.

Содержание аминокислот можно измерять с помощью различных способов, известных из уровня техники. Одним из таких способов является способ MP 1471 rev 5 2011, Resana, Italy: Chelab Silliker S.r.l, NutriSciences Company. Для выявления аминокислот в листьях растения, подвергнутых сушке, после удаления средней жилки пластинки, подвергнутые сушке, при необходимости сушат при 40°C в течение 2-3 дней. Затем табачный материал измельчают в тонкодисперсный порошок (~100 мкM) перед анализом на содержание аминокислот. Другой способ измерения содержания аминокислот в растительном материале описан в UNI EN ISO 13903:2005. В одном варианте осуществления способ, применяемый для измерения содержания аминокислот в растительном материале описано в UNI EN ISO 13903:2005.

Содержание аммиака может быть определено по Skalar: MT24- Nitrate, Total Alkaloids, Ammonia, Chloride, TKN. Для выявления аммиака в листьях растения, подвергнутых сушке, после удаления средней жилки пластинки, подвергнутые сушке, при необходимости сушат при 40°C в течение 2-3 дней. Затем табачный материал измельчают в тонкодисперсный порошок (~100 мкM) перед анализом на содержание аммиака. Другие способы измерения содержания аммиака известны в данной области техники и включают способы, описанные в Health Canada (1999) Determination of ammonia in whole tobacco. Tobacco Control Programme. Health Canada Official Способ T-302; и Tobacco Manufacturers Organization (2002) UK smoke constituent study. Annex A Part 5 Method: determination of ammonia yields in mainstream cigarette smoke using the Dionex DX-500 ion chromatograph, Report Nr GC15/M24/02.

Растение, несущее мутантный аллель одного или более полинуклеотидов, описанных в данном документе (или любой их комбинации, как описано в данном документе), можно применять в программе селекции растений для создания применимых линий, разновидностей и гибридов. В частности, мутантный аллель интрогрессируют в коммерчески важные разновидности, описанные выше. Таким образом, предложены способы селекции растений, которые предусматривают скрещивание мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения, как описано в данном документе, с растением, характеризующимся иными генетическими особенностями. Способ может дополнительно включать скрещивание растения-потомка с другим растением и необязательно повторение скрещивания до тех пор, пока не будет получено потомка с необходимыми генетическими признаками или генетическим фоном. Одной из целей, для которой подходят такие способы селекции, является введение желаемого генетического признака в другие разновидности, селекционные линии, гибриды или сорта, особенно те, которые представляют коммерческий интерес. Другой целью является облегчение накопления генетических модификаций различных генов в отдельных разновидностях, линиях, гибридах или сортах растений. Предусмотрены внутривидовые, а также межвидовые скрещивания. Растения-потомки, которые возникают в результате таких скрещиваний, также называемые селекционными линиями, являются примерами не встречающихся в природе растений по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления предусмотрен способ получения не встречающегося в природе растения, включающий: (a) скрещивание мутантного или трансгенного растения со вторым растением с получением семени растения табака-потомка; (b) выращивание семени растения табака-потомка в пригодных для роста растений условиях с получением не встречающегося в природе растения. Способ может дополнительно включать: (c) скрещивание предыдущего поколения не встречающегося в природе растения с самим собою или с другим растением с получением семени растения табака-потомка; (d) выращивание семени растения табака-потомка из стадии (c) в пригодных для роста растений условиях с получением дополнительных не встречающихся в природе растений; и (e) повторение стадий скрещивания и выращивания (c) и (d) несколько раз с получением следующих поколений не встречающихся в природе растений. Способ может необязательно предусматривать перед стадией (a) стадию получения родительского растения, которое содержит охарактеризованные генетические особенности и которое не идентично мутантному или трансгенному растению. В некоторых вариантах осуществления в зависимости от программы селекции стадии скрещивания и выращивания повторяют от 0 до 2 раз, от 0 до 3 раз, от 0 до 4 раз, от 0 до 5 раз, от 0 до 6 раз, от 0 до 7 раз, от 0 до 8 раз, от 0 до 9 раз или от 0 до 10 раз для получения поколений не встречающихся в природе растений. Обратное скрещивание является примером такого способа, в котором потомка скрещивают с одним из его родителей или с другим растением, генетически сходным с его родителем, для получения растения-потомка в следующем поколении, которое имеет генетические особенности, более близкие к одному из родителей. Методики селекции растений, в частности селекции растений, хорошо известны и могут применяться в способах по настоящему изобретению. В настоящем изобретении дополнительно предложены не встречающиеся в природе растения, полученные с помощью данных способов. Определенные варианты осуществления исключают стадию отбора растения.

В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в данном документе, линии, полученные в результате селекции и скрининга на наличие вариантных генов, оценивают в поле с применением стандартных полевых процедур. Предусмотрены контрольные генотипы, в том числе генотип исходного не подвергнутого мутагенезу родителя, и места посадки растений расположены в поле согласно рандомизированному полноблочному плану или согласно другому соответствующему планированию поля. Для табака используют стандартные агрономические методики, например, табак собирают, взвешивают и отбирают образцы для химического и другого общепринятого тестирования до и во время сушки. Статистический анализ данных выполняют для подтверждения сходства отобранных линий с родительской линией. Цитогенетические анализы отобранных растений необязательно выполняют для подтверждения взаимосвязей набора хромосом и конъюгации хромосом.

ДНК-фингерпринтинг, однонуклеотидный полиморфизм, микросателлитные маркеры или подобные технологии можно применять в программе селекции с отбором с помощью маркера (MAS) для переноса или разведения мутантных аллелей гена в других растениях табака, как описано в данном документе. Например, селекционер может создать расщепляющиеся популяции при гибридизации генотипа, содержащего мутантный аллель, с необходимым с агрономической точки зрения генотипом. Растения из F2 или поколений, полученных в результате обратного скрещивания, можно подвергнуть скринингу с применением маркера, полученного из геномной последовательности или ее фрагмента, с применением одной из методик, перечисленных в данном документе. Растения, идентифицированные как обладающие мутантным аллелем, можно подвергнуть обратному скрещиванию или самоопылению для создания второй популяции, подлежащей скринингу. В зависимости от предполагаемого способа наследования или применяемой технологии MAS для отобранных растений может быть необходимым самоопыление перед каждым циклом обратного скрещивания для облегчения обнаружения необходимых отдельных растений. Обратное скрещивание или другую процедуру селекции можно повторять до тех пор, пока необходимый фенотип рекуррентного родителя не восстановится.

Согласно настоящему изобретению в программе селекции успешные скрещивания дают растения F1, которые являются фертильными. Отобранные растения F1 можно скрещивать с одним из родителей, и для растений первого поколения, полученного в результате обратного скрещивания, можно обеспечивать самоопыление с получением популяции, которую снова подвергают скринингу в отношении экспрессии вариантного гена (например, нулевой версии гена). Процесс обратного скрещивания, самоопыления и скрининга повторяют, например, по меньшей мере 4 раза до тех пор, пока при окончательном скрининге не получат растение, которое является фертильным и в достаточной степени подобным рекуррентному родителю. Это растение, при необходимости, самоопыляют и затем потомство снова подвергают скринингу, чтобы подтвердить, что растение демонстрирует экспрессию вариантного гена. В некоторых вариантах осуществления популяцию растений в поколении F2 подвергают скринингу на наличие экспрессии вариантного гена, например растение, которое не экспрессирует полипептид из-за отсутствия гена, идентифицируют согласно стандартным способам, например с помощью методики ПЦР с применением праймеров, созданных на основе информации о последовательности полинуклеотидов для полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе).

Разновидности гибридного табака можно получить путем предотвращения самоопыления женских родительских растений (то есть родительских форм) первой разновидности, позволяя пыльце с мужских родительских растений второй разновидности оплодотворить женские родительские растения и обеспечивая образование гибридных семян F1 на женских растениях. Самоопыление женских растений можно предотвратить путем кастрации цветков на ранней стадии развития цветка. В качестве альтернативы, образование пыльцы на женских родительских растениях можно предотвратить, используя какую-либо форму мужской стерильности. Например, мужскую стерильность можно обеспечить посредством цитоплазматической мужской стерильности (CMS) или трансгенной мужской стерильности, где трансген подавляет микроспорогенез и/или образование пыльцы или вызывает самонесовместимость. Женские родительские растения, содержащие CMS, являются особенно применимы. В вариантах осуществления, в которых женские родительские растения характеризуются CMS, пыльцу собирают с мужских фертильных растений и наносят вручную на рыльца женских родительских растений с CMS и собирают полученные семена F1.

Разновидности и линии, описанные в данном документе, можно применять для образования простых гибридов F1 табака. В таких вариантах осуществления растения родительских разновидностей можно выращивать в виде практически однородных смежных популяций для облегчения естественного перекрестного опыления женских родительских растений мужскими родительскими растениями. Семена F1, образовавшиеся на женских родительских растениях, выборочно собирают с помощью обычных средств. Можно также вырастить две разновидности родительского растения в массе и собрать смесь гибридных F1 семян, образовавшихся на женской особи, и семян, образовавшихся на мужской особи в результате самоопыления. В качестве альтернативы, можно осуществить трехлинейное скрещивание, где простой гибрид F1 используют в качестве женской особи и скрещивают с другой мужской особью. В качестве другой альтернативы, можно создать гибриды двойного скрещивания, где потомство F1 двух разных простых гибридов скрещивают само с собой.

Популяцию мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений можно подвергнуть скринингу или отбору в отношении тех представителей популяции, которые имеют необходимый признак или фенотип. Например, популяцию из потомства линии с одной трансформацией можно подвергнуть скринингу в отношении тех растений, которые имеют необходимый уровень экспрессии или функции полипептида(полипептидов), кодируемого с ее помощью. Физические и биохимические способы можно применять для выявления уровней экспрессии или активности. Они включают анализ по Саузерну или ПЦР-амплификацию для выявления полинуклеотида; нозерн-блоттинг, анализ с защитой от РНКазы S1, анализ методом удлинения праймера или RT-PCR-амплификацию для выявления РНК-транскриптов; ферментные анализы для выявления ферментативной или рибозимной функции полипептидов и полинуклеотидов; и гель-электрофорез полипептида, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммуноферментные анализы для выявления полипептидов. Другие методики, такие как гибридизация in situ, ферментативное окрашивание и иммуноокрашивание, и ферментативный анализ также можно применять для выявления присутствия, или экспрессии, или функции, или активности полипептидов или полинуклеотидов.

В данном документе описаны мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные клетки растения и растения, содержащие один или более рекомбинантных полинуклеотидов, одну или более полинуклеотидных конструкций, одну или более двунитевых РНК, один или более конъюгатов или один или более векторов/векторов экспрессии.

Без ограничения растения и их части, описанные в данном документе, можно модифицировать либо до, либо после модулирования экспрессии, функции или активности одного или более полинуклеотидов и/или полипептидов в соответствии с настоящим изобретением.

Одна или более следующих дополнительных генетических модификаций могут присутствовать в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях или их частях.

Один или более генов, которые вовлечены в превращение промежуточных продуктов азотного обмена могут быть модифицированы, что в результате приводит к более низким уровням по меньшей мере одного специфичного для табака нитрозамина (TSNA). Неограничивающие примеры таких генов включают гены, кодирующие никотин-деметилазу, такие как CYP82E4, CYP82E5 и CYP82E10, описанные в WO2006/091194, WO2008/070274, WO2009/064771 и WO2011/088180, и нитратредуктазу, как описано в WO2016046288.

Один или более генов, которые принимают участие в поглощении тяжелых металлов или транспорте тяжелых металлов, могут быть модифицированы, что в результате приводит к более низкому содержанию тяжелых металлов. Неограничивающие примеры включают семейства полипептидов, ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью, семейства посредников диффузии катионов (CDF), семейство Zrt-, Irt-подобных полипептидов (ZIP), семейство катионообменников (CAX), семейство транспортеров меди (COPT), семейство АТФаз тяжелых металлов (например, HMA, как описано в WO2009/074325 и WO2017/129739), семейство гомологов полипептидов макрофагов, ассоциированных с естественной устойчивостью (NRAMP), и другие члены семейства транспортеров с АТФ-связывающей кассетой (ABC) (например, MRP), как описано в WO2012/028309, которые участвуют в транспорте тяжелых металлов, таких как кадмий.

Другие иллюстративные модификации могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией изопропилмалатсинтазы, что в результате приводит к изменению композиции сложного эфира сахарозы, которая может использоваться для изменения ароматического профиля (см. WO2013/029799).

Другие иллюстративные модификации могут приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией треонинсинтазы, при этом можно модулировать уровни метионала (см. WO2013/029800).

Другие иллюстративные модификации могут в результате приводить к получению растений с модулированной экспрессией или функцией одной или более из неоксантинсинтазы, ликопен-бета-циклазы и 9-цис-эпоксикаротиноиддиоксигеназы для модулирования содержания бета-дамасценона для изменения ароматического профиля (см. WO2013/064499).

Другие иллюстративные модификации могут приводить к получению растений с модулированными экспрессией или функцией членов семейства CLC хлоридных каналов для модулирования в них уровней нитратов (см. WO2014/096283 и WO2015/197727).

Другие иллюстративные модификации могут приводить к получению растений с модулированными экспрессией или функцией одного или более AAT для модулирования уровней одной или более аминокислот, таких как аспартат, в листе и модулирования уровней акриламида в аэрозоле, получаемом при нагревании или горении листа (см. WO2017042162).

Примеры других модификаций включают модуляцию переносимости гербицида, например, глифосат является активным ингредиентом множества гербицидов широкого спектра действия. Устойчивые к глифосату трансгенные растения были разработаны путем переноса гена aroA (глифосат-EPSP-синтетаза из Salmonella typhimurium и E.coli). Устойчивые к сульфонилмочевине растения были получены путем трансформации мутантного гена ALS (ацетолактатсинтетаза) из Arabidopsis. Полипептид OB фотосистемы II из мутантного Amaranthus hybridus был перенесен в растения с получением атразин-устойчивых трансгенных растений; и бромоксинил-устойчивые трансгенные растения были получены путем встраивания гена bxn из бактерии Klebsiella pneumoniae.

Другие примеры модификаций приводят в результате к получению растений, которые устойчивы к насекомым. Токсины Bacillus thuringiensis(Bt) могут обеспечить эффективный путь отсрочки появления Bt-устойчивых вредителей, как недавно показано на брокколи, где гены Bt cry1Ac и cry1C в составе «пирамиды» обеспечивали контроль капустной моли, устойчивой к любому отдельному полипептиду, и существенно задерживали эволюционное развитие устойчивых насекомых.

Другая иллюстративная модификация в результате приводит к получению растений, которые устойчивы к заболеваниям, вызванным патогенами (например, вирусами, бактериями, грибами). Были разработаны растения, экспрессирующие ген Xa21 (устойчивость к бактериальному некрозу), с растениями, экспрессирующими как ген слияния Bt, так и ген хитиназы (устойчивость к желтой огневке-травянке и выносливость в отношении ризоктониоза).

Другая иллюстративная модификация в результате приводит к корректированию репродуктивной способности, например к мужской стерильности.

Другая иллюстративная модификация приводит в результате к получению растений, которые выносливы в отношении абиотического стресса (например, засухе, изменению температуры, засоленности), и выносливые трансгенные растения были получены путем переноса фермента ацилглицерол-фосфат-ацилтрансферазы из Arabidopsis; гены, кодирующие маннитол-дегидрогеназу и сорбитолдегидрогеназу, которые принимают участие в синтезе маннита и сорбита, улучшают устойчивость к засухе.

Другая иллюстративная модификация в результате приводит к получению растений, в которых активность одной или более эндогенных гликозилтрансфераз, таких как N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, β(1,2)-ксилозилтрансфераза и a(1,3)-фукозилтрансфераза, является модулированной (см. WO/2011/117249).

Другая иллюстративная модификация в результате приводит к получению растений, в которых активность одной или более никотин-N-деметилаз модулируют таким образом, что могут модулироваться уровни норникотина и метаболитов норникотина, которые образуются во время сушки (см. WO2015169927).

Другие иллюстративные модификации могут приводить к получению растений с улучшенными запасными полипептидами и маслами, растений с повышенной эффективностью фотосинтеза, растений с длительным сроком хранения, растений с повышенным содержанием углеводов и растений, устойчивых к грибам. Так же предусмотрены трансгенные растения, в которых была модулирована экспрессия S-аденозил-L-метионина (SAM) и/или цистатионин-гамма-синтазы (CGS).

Один или более генов, которые вовлечены в путь синтеза никотина, можно модифицировать с получением растений или частей растений, которые при сушке вырабатывают модулированные уровни никотина. Гены синтеза никотина могут быть выбраны из группы, состоящей из: A622, BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MPO1, MPO2, MYC2a, MYC2b, NBB1, nic1, nic2, NUP1, NUP2, PMT1, PMT2, PMT3, PMT4 и QPT или комбинации одного или более из них.

Один или более генов, которые вовлечены в регулирование количества одного или более алкалоидов, можно модифицировать с получением растений или частей растений, которые при сушке вырабатывают модулированные уровни алкалоида. Гены, обеспечивающие контроль уровня алкалоидов, могут быть выбраны из группы, состоящей из BBLa, BBLb, JRE5L1, JRE5L2, MATE1, MATE 2, MYC2a, MYC2b, nic1, nic2, NUP1 и NUP2 или комбинации двух или более из них.

Один или более таких признаков можно интрогрессировать в мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения другого сорта или можно непосредственно трансформировать в них.

В различных вариантах осуществления предусмотрены мутантные растения, не встречающиеся в природе растения или трансгенные растения, а также биомасса, в которых уровень экспрессии одного или более полинуклеотидов в соответствии с настоящим изобретением являются модулированными для модулирования таким образом уровня полипептида(полипептидов), кодируемого ими.

Части растений, описанных в данном документе, в частности листовую пластинку и среднюю жилку данных растений, можно включить в изготовление или применять в изготовлении различных продуктов потребления, включая без ограничения материалы, образующие аэрозоль, устройства, образующие аэрозоль, курительные изделия, изделия для курения, бездымные продукты, медицинские или косметические продукты, препараты для внутривенного введения, таблетки, порошки и табачные продукты. Примеры материалов, образующих аэрозоль, включают табачные композиции, виды табака, табачный экстракт, резаный табак, резаный наполнитель, сушеный табак, взорванный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и виды трубочного табака. Курительные изделия и изделия для курения являются, как правило, устройствами, образующими аэрозоль. Примеры курительных изделий или изделий для курения включают сигареты, сигариллы и сигары. Примеры бездымных продуктов включают жевательный табак и нюхательный табак. В определенных устройствах, образующих аэрозоль, вместо сгорания, табачная композиция или другой материал, образующий аэрозоль, нагревают с помощью одного или более электрических нагревательных элементов с получением аэрозоля. В другом типе нагреваемого устройства, образующего аэрозоль, аэрозоль получают путем перемещения тепла от горючего топливного элемента или источника тепла к физически отделенному материалу, образующему аэрозоль, который может быть расположен внутри, вокруг или ниже по потоку относительно источника тепла. Бездымные табачные продукты и различные табак-содержащие материалы, образующие аэрозоль, могут содержать табак в любом виде, в том числе в виде высушенных частиц, кусков, гранул, порошков или суспензии, нанесенной на, смешанной с, окруженной или иным образом комбинированной с другими ингредиентами в любом формате, таком как хлопья, пленки, таблетки, пены или шарики. Используемый в данном документе термин «дым» используют для описания типа аэрозоля, который получен с помощью курительных изделий, таких как сигареты, или при сжигании материала, образующего аэрозоль.

В одном варианте осуществления также предусмотрен растительный материал, подвергнутый сушке, из мутантных, трансгенных и не встречающихся в природе растений, описанных в данном документе. Способы сушки зеленых табачных листьев известны специалистам в данной области и включают без ограничения воздушную сушку, огневую сушку, трубоогневую сушку и солнечную сушку, как описано в данном документе.

В другом варианте осуществления описаны табачные продукты, в том числе табаксодержащие материалы, образующие аэрозоль, содержащие растительный материал, такой как листья, предпочтительно листья, подвергнутые сушке, из мутантных растений табака, трансгенных растений табака или не встречающихся в природе растений табака, описанных в данном документе. Табачные продукты, описанные в данном документе, могут быть смешанными табачными изделиями, которые могут дополнительно содержать немодифицированный табак.

Продукты и способы для управления сельскохозяйственными культурами и для сельского хозяйства.

Для мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений могут существовать другие варианты применения в, например, сельском хозяйстве. Например, мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения, описанные в данном документе, можно применять для изготовления корма для животных и продуктов питания для человека.

В настоящем изобретении также предусмотрены способы получения семян, включающие культивирование мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения, описанных в данном документе, и сбор семян культивируемых растений. Семена растений, описанных в данном документе, можно кондиционировать и упаковать в упаковочный материал с помощью средств, известных в данной области техники, с получением промышленного изделия. Упаковочный материал, такой как бумага или ткань, хорошо известен в данной области техники. Упаковка семян может иметь этикетку, например маркировку или этикетку, прикрепленную к упаковочному материалу, этикетку, напечатанную на упаковке, которая описывает происхождение содержащихся в ней семян.

Композиции, способы и наборы для генотипирования растений для идентификации, отбора или селекции могут включать средства для обнаружения присутствия полинуклеотида (или любой их комбинации, как описано в данном документе) в образце полинуклеотида. Соответственно, описана композиция, содержащая один или более праймеров для специфической амплификации по меньшей мере части одного или более полинуклеотидов, и необязательно один или более зондов, и необязательно один или более реагентов для проведения амплификации или выявления.

Соответственно, раскрыты специфичные в отношении гена олигонуклеотидные праймеры или зонды, содержащие приблизительно 10 или более смежных полинуклеотидов, соответствующих полинуклеотиду(полинуклеотидам), описанному в данном документе. Указанные праймеры или зонды могут содержать или состоять из приблизительно 15, 20, 25, 30, 40, 45 или 50 или более смежных нуклеотидов, которые гибридизируются (например, специфически гибридизируются) с полинуклеотидом(полинуклеотидами), описанным в данном документе. В некоторых вариантах осуществления праймеры или зонды могут содержать или состоять из приблизительно 10-50 смежных нуклеотидов, приблизительно 10-40 смежных нуклеотидов, приблизительно 10-30 смежных нуклеотидов или приблизительно 15-30 смежных нуклеотидов, которые можно применять в зависимых от последовательности способах идентификации гена (например, Саузерн-гибридизация) или выделения (например, гибридизация in situ бактериальных колоний или бляшек бактериофага) или обнаружения гена (например, в виде одного или более праймеров амплификации при амплификации и обнаружении нуклеиновой кислоты). Один или более специфических праймеров или зондов можно разработать и применять для амплификации и обнаружения части или всего полинуклеотида(полинуклеотидов). В качестве конкретного примера, два праймера можно применять в протоколе ПЦР для амплификации полинуклеотидного фрагмента. ПЦР можно также проводить с применением одного праймера, который получен из последовательности полинуклеотида, и второго праймера, который гибридизируется с последовательностью выше или ниже последовательности полинуклеотида, такой как последовательность промотора, 3'-конец мРНК-предшественника или последовательность, полученная из вектора. Примеры термических и изотермических методик, применимых для амплификации полинуклеотидов in vitro, хорошо известны из уровня техники. Образец может происходить или его можно получить из растения, клетки растения, или растительного материала, или табачного продукта, изготовленных из растения, клетки растения или растительного материала, как описано в данном документе.

В дополнительном аспекте также предусмотрен способ выявления полинуклеотида(полинуклеотидов), описанного в данном документе (или любой их комбинации, описанной в данном документе) в образце, включающий следующие стадии: (a) получение образца, содержащего или предположительно содержащего полинуклеотид; (b) приведение указанного образца в контакт с одним или более праймерами или одним или более зондами для специфического выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов); и (c) выявление присутствия продукта амплификации, где присутствие продукта амплификации свидетельствует о присутствии полинуклеотида(полинуклеотидов) в образце. В дополнительном аспекте также предусмотрено применение одного или более праймеров или зондов для специфического выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов). Также предусмотрены наборы для выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов), которые содержат один или более праймеров или зондов для специфического выявления по меньшей мере части полинуклеотида(полинуклеотидов). Набор может содержать реагенты для амплификации полинуклеотида, например реагенты для ПЦР, или реагенты для технологии обнаружения с применением гибридизационного зонда, такой как Саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in situ или микрочип. Набор может содержать реагенты для технологии обнаружения связывания антител, такой как вестерн-блоттинг, ELISA, SELDI-масс-спектрометрия или тест-полоски. Набор может содержать реагенты для секвенирования ДНК. Набор может содержать реагенты и инструкции по применению набора.

В некоторых вариантах осуществления набор может содержать инструкции для одного или более описанных способов. Описанные наборы могут быть применимы для определения генетической идентичности, филогенетических исследований, генотипирования, гаплотипирования, анализа родословной или селекции растений, в частности, с количественной оценкой кодоминантных признаков.

В настоящем изобретении также предусмотрен способ генотипирования растения, клетки растения или растительного материала, содержащих полинуклеотид, описанный в данном документе. Генотипирование обеспечивает средства различения гомологов пары хромосом и может быть использовано для различения сегрегантов в популяции растений. Способы на основе применения молекулярных маркеров можно применять для филогенетических исследований, характеризующих генетические связи между разновидностями сельскохозяйственных культур, выявления гибридов или соматических гибридов, локализации хромосомных сегментов, влияющих на моногенные признаки, клонирования на основе генетических карт и изучения количественного наследования. В определенном способе генотипирования может использоваться любое количество аналитических методик с молекулярным маркером, включая такие на основе полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP). AFLP является результатом аллельных различий между амплифицированными фрагментами, вызванных изменчивостью полинуклеотида. Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно предложены способы отслеживания сегрегации одного или более генов или полинуклеотидов, а также хромосомных последовательностей, генетически связанных с этими генами или полинуклеотидами, с применением таких методик, как анализ AFLP.

Настоящее изобретение дополнительно описано в примерах ниже, которые представлены для более подробного описания настоящего изобретения. Эти примеры, в которых изложен предпочтительный режим, предусмотренный в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначены для иллюстрации, а не для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Идентификация основных генов, активация которых коррелирует с уровнем аминокислот после сушки, в табачном листе Берлей, Вирджиния и восточного типа

Для выявления ключевых функций, вносящих вклад в изменения уровня свободных аминокислот в течение начального времени сушки табачного листа Берлей, Вирджиния и восточного типа, проводили анализ преобладания функций генов, активируемых в листьях, подвергнутых сушке, после сушки в течение 48 ч, по сравнению со зрелыми листьями при сборе урожая (изменение кратное log2>2, скорректированное p-значение <0,05) в табаке Берлей, Вирджиния и восточного типа. Идентифицировали гены, участвующие в выработке свободных аминокислот, которые являются активными после 48 ч. сушки независимо от типов сушки и разновидностей табака. Исследовали гены табака, влияющие на выработку аспартата в течение ранней сушки и принадлежащие к семейству AAT.

В геноме табака идентифицировали полный набор полинуклеотидов NtAAT, которые представляют собой NtAAT1-S (SEQ ID NO: 5), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3), NtAAT3-S (SEQ ID NO: 9), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 11), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 13) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 15), и предсказанные полипептидные последовательности которых представляют собой NtAAT1-S (SEQ ID NO: 6), NtAAT1-T (SEQ ID NO: 8), NtAAT2-S (SEQ ID NO: 2), NtAAT2-T (SEQ ID NO: 4, NtAAT3-S (SEQ ID NO: 10), NtAAT3-T (SEQ ID NO: 12), NtAAT4-S (SEQ ID NO: 14) и NtAAT4-T (SEQ ID NO: 16).

Анализы экспрессии гена показали, что NtAAT2-S (SEQ ID NO: 1) и NtAAT2-T (SEQ ID NO: 3) являются генами, экспрессируемыми на наиболее высоком уровне (>11x) после 48 ч. сушки, в табаке Берлей, Вирджиния и восточного типа по сравнению с зелеными табачными листьями (см. таблицу 1). Интересно, что NtAAT1-T (SEQ ID NO: 7) также был активирован после 48 ч. сушки, но в меньшей степени (>2,5). В зрелых листьях изначально активированы только NtAAT2-S и NtAAT2-T, что свидетельствует о том, что эти гены являются основными пусковыми элементами, обеспечивающими выработку аспартата для синтеза аспарагина.

Гены NtAAT2-S и NtAAT2-T характеризуются высоким уровнем экспрессии не только во время ранней сушки листьев, когда происходит разрушение хлорофилла, но также в лепестках (см. таблицу 2). Их экспрессия является очень низкой в корнях и листьях (см. таблицу 2) и других тканях, что свидетельствует о том, что функция NtAAT2-S и NtAAT2-T связана с локализацией в надземных органах, не содержащих хлорофилла. То же наблюдение, по-видимому, справедливо и для NtAAT1-S и NtAAT1-T, но в меньшей степени. Следовательно, авторы настоящего изобретения не могут исключить, что NtAAT1-S и NtAAT1-T также способствуют синтезу аспартата в листьях, подвергнутых сушке. Напротив, NtAAT3-S/NtAAT3-T и NtAAT4-S/NtAAT4-T, по-видимому, более конститутивно экспрессируются во всех тканях растений (см. таблицу 2).

Анализ коэкспрессии подтвердил, что NtAAT2-S, NtAAT2-T, NtASN1-S и NtASN1-T совместно регулируются во время фазы ранней сушки. Для этого использовалась база данных транскриптомов, полученных при сушке табака Берлей, состоящая из транскриптомов 34 не подвергнутых сушке и подвергнутых ранней сушке образцов табака Берлей. Обнаружено, что 168 генов коэкспрессируются с NtASN1-S и NtASN1-T и 12 генов с NtAAT2-S и NtAAT2-T (пороговое значение >0,9). Из этого набора транскриптомов все транскрипты NtAAT2-S, и NtAAT2-T, и NtASN1-S, и NtASN1-T присутствовали в двух наборах последовательностей РНК (9 общих последовательностей), связанных с 5 другими транскриптами. Такая коэкспрессия, ассоциированная с экспериментом по определению зависимости от времени во время сушки (см. фигуру 2), и коэкспрессия в лепестках и листьях, подвергнутых ранней сушке (см. таблицу 2 и WO2017/042162), свидетельствует о том, что все, NtAAT2-S, и NtAAT2-T, и NtASN1-S, и NtASN1-T, согласованно способствуют ассимиляции нитратов в аминокислоты и аспарагин.

Сайленсинг NtAAT2-S и NtAAT2-T в растениях табака Берлей исследовали для определения того, способствуют ли оба гена понижению уровня аспартата в листьях табака Берлей, подвергнутых сушке. Специфический фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 17) в пределах кодирующей последовательности как NtAAT2-S, так и NtAAT2-T клонировали с помощью сильного промотора вируса мозаики мирабилис (MMV) в векторе GATEWAY. Указанный фрагмент гена NtAAT2-S и NtAAT2-T фланкировали между MMV и последовательностью 3'-nos-терминатора гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens. Линию табака Берлей TN90e4e5e10 (Zyvert) трансформировали с применением стандартных протоколов трансформации, опосредованной Agrobacterium. TN90e4e5e10 (Zyvert) представляет выборку из популяции Берлей, подвергнутой мутагенезу посредством этилметансульфоната (EMS), которая содержит нокаут-мутации в CYP82E4, CYP82E5v2 и CYP82E10 (см. Phytochemistry (2010) 71: 17-18) для предотвращения выработки норникотина. Применение такой исходной линии может позволить избежать возможных трудностей при интерпретации данных по TSNA, которые будут получены в будущем.

Для обеспечения отбора растений с низким уровнем аспартата, листья 16 отдельных растений T0 (E324) и 4 соответствующие контрольные линии (CTE324) анализировали после 60 ч. сушки для определения влияния на никотин, в качестве контроля (см. фигуру 3) и аспартата (см. фигуру 4). Значительного различия в содержании никотина между листьями растений T0 (E324) и контрольными линиями (CTE324) не наблюдали. Наилучшими линиями T0, демонстрирующими наиболее низкий уровень аспартата, являлись линии 3, 8, 13, 16, 17 и 20, в которых количество аспартата либо обнаружили при очень низких уровнях (75 мкг/г), либо при не подлежащих выявлению. Семена собирали из этих наилучших линий T0, демонстрирующих наиболее низкий уровень аспартата. Потомство T1 анализировали методом qPCR для определения эффективности событий сайленсинга NtAAT2-S и NtAAT2-T в отношении содержания как аспартата, так и аспарагина.

Поскольку аспартат играет ключевую роль в синтезе других аминокислот, таких как аспарагин, треонин, изолейцин, цистеин и метионин, манипулирование генами NtAAT (например, с помощью конститутивного промотора или промотора , специфичного для старения, такого как SAG12 или E4) может изменить химический состав листьев табака, подвергнутых сушке. Сходным образом нокаут генов NtAAT с применением стратегии редактирования гена, такой как CRISPR-Cas, или отбор мутантов, может обеспечить изменение химического аминокислотного состава листьев, а также химического состава дыма и аэрозолей основных разновидностей коммерческого табака.

Любая публикация, цитируемая или описанная в данном документе, предоставляет соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Заявления, сделанные в данном документе, не должны истолковываться как признание того, что авторы настоящего изобретения не имеют оснований для его противопоставления как более ранним таким раскрытиям. Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ с помощью ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области без отступления от объема и сути настоящего изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение, как заявлено, не должно быть неправомерно ограничено такими конкретными вариантами осуществления. В действительности различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в клеточной, молекулярной биологии и биологии растений или в смежных областях, предназначены находиться в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

ТАБЛИЦА 1

Экспрессия NtAAT (FPKM) во время ранней сушки в табаке Берлей (BU), Вирджиния (FC) и табаке восточного типа (OR)

BU FC OR Зеленые Зрелые 48 ч. сушки Зеленые Зрелые 48 ч. сушки Зеленые Зрелые 48 ч. сушки NtAAT1-S 7,8 6,7 9,2 11,4 8,1 15,8 12,9 12,9 13,0 NtAAT1-T 10,5 13,4 28,5 11,0 5,5 28,1 12,4 10,0 38,9 NtAAT2-S 9,8 21,9 234,1 1,9 6,0 65,1 18,5 49,3 665,6 NtAAT2-T 2,7 9,4 105,8 1,1 2,3 12,0 5,1 11,7 80,4 NtAAT3-S 14,5 10,7 17,7 21,2 13,2 11,1 24,5 18,1 22,6 NtAAT3-T 14,7 13,0 21,0 18,2 16,6 9,7 29,4 29,0 22,7 NtAAT4-S 44,5 39,8 29,0 45,6 41,7 28,9 6,4 7,0 3,2 NtAAT4-T 60,7 47,0 21,6 57,3 55,9 19,2 44,9 47,3 25,8

ТАБЛИЦА 2

Экспрессия генов NtAAT в листьях, лепестках и корнях растений табака Берлей (BU) и Вирджиния (FC), выращенных в поле

Лист Лепесток Корень BU FC BU FC BU FC NtAAT1-S 5,2 9,8 17,3 27,6 15,0 11,1 NtAAT1-T 6,6 6,9 52,4 33,5 3,8 4,2 NtAAT2-S 7,6 4,1 152,7 213,0 7,1 6,1 NtAAT2-T 2,1 1,0 68,2 128,7 3,4 4,5 NtAAT3-S 20,5 19,5 25,4 26,0 30,9 18,9 NtAAT3-T 20,9 19,9 37,4 36,9 31,3 24,4 NtAAT4-S 69,0 44,8 42,3 49,8 29,1 24,9 NtAAT4-T 81,5 49,1 43,2 46,9 18,2 18,8

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Филип Моррис Продактс С.А.

<120> МОДУЛИРОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОКИСЛОТ В РАСТЕНИИ

<130> P10499EP

<140> EP18164766.0

<141> 2018-03-28

<160> 17

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 6933

<212> ДНКДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgaacatgt cacaacaatc accgtcaccg tccgctgacc ggaggttgag tgttctggcg 60

agacaccttg aactgtcgtc ctccgccacc gtcgaatcct ctatcgtcgc tgctcctacc 120

tctggaaatg ctggaaccaa ctctgtcttc tctcacatcg ttcgcgctcc cgaagatcct 180

attctcggcg taactctctc tctctctctc tctctctctc ttcatccaca cacacacgca 240

ctcactcaca taacatatta agtatatgcg tgctcaaatg ttctgtatgt attcatttgt 300

tccgtatcaa atgttctctt gttataagct gaattttaga ggaattgtag tgctatttgc 360

taatcgaaag agcttgatac tcattctctt cctattgaat taaatattcc ttttttctta 420

tggatgatga atttaagact tttttttagt ccgatcacta cgaaatttcg atttcaagtt 480

gatagaagtg aaaaatgatg gggttaacat atcaattgag cgaataaaaa gagaaattcg 540

tgtgttgata tcttcaaaag tgtatttaaa tgtagagata tattgtgatt tagtttctgt 600

tattatcttt gtcttttttc tattgaaatt tgaatattat ttgttgaagt cttcgtgaca 660

tatcttggtg ttatgttttg gttattaggt cactattgct tacaataaag atagtagccc 720

catgaagttg aatttgggag ttggtgcata tcgcacagag gtgatcatcc tttttggatt 780

ttgtatttgc gctattatgg tcaatggagc actattatca gttgctggat aatcatcctt 840

tttgatattt ccttgattga aatctaaaaa cacgaataaa aagatattta ctgatggatc 900

tgtgttttgg tttcttcaga ttgacgcatt tctgttaatt gaaaagaatt gtgattgttt 960

tggtgattgt ggtgttattt tagcttcata cagttaatcc gacgccgtag tgtactagtg 1020

tttggctgat gtgctgccaa gagataatgt ttaagattat ggtttgccat aattgataaa 1080

atttaatatt aaaagtactt ggctggatgt tctgcgtttg cataacttgt aatgcatatg 1140

aaaaagttac ctttgatttt cataattagt gagaaaactc aagtagcttc cgcattcctg 1200

tcattgcact atcaaacaca ttaaacggtt tccgacatat ctacctagtt tggaacttca 1260

tgatttctat ttttcacacc ttgtaataaa tgataattct tggatctgtg gtgtctttgt 1320

tcaaaagatc acagagaaga ttgcatttat tttttgtagt ctagttggct cagagtctgt 1380

caaacacaac ttgttacatc gcattttacc tgttagttaa gaaacttggg tcatcaacaa 1440

atttgtcatg aggtggttat ttcttggggc tttgtgaatt gctctcagca atctgctagc 1500

tttcttatgt ggactcaaaa caatgaagct cttgagttga tgtgttgatt tttcaatcag 1560

agtaaaacaa gttctatatt tggctgtgag agtaaagtgg gagctattaa aattcctagc 1620

tgaatttatg tttcttaata tcttaaatcc ttaaaggtag agggagagga aggaggttta 1680

ttgatgaagg gctagtagtt gtgtatactt agttcttttt caaatttcat aagtatctct 1740

tgatggtttt tctcgctgac tgttgaatat ggggctccac agtttgtgtt gctatattga 1800

aatgtttcag ctaataaaac taacgtgttt ctttttcttt ctcccttttt tggggttatc 1860

aggaaggaaa acctcttgtt ttgaatgttg taagacaagc agagcagcta ctagtaaatg 1920

acaggtactt gcattgccat ttcatggagt atgaataaaa tgtttcctta attctatgtg 1980

attaaacttc aagatttctg caggtctcgc gttaaagagt acctatctat tacgggactg 2040

gcagacttca ataaattgag tgctaagctg atacttggcg ccgacaggta taaaagttcc 2100

tgttctctgt atagtgttgc cgataagata tgcagggaga taaagcatgt attttcctgt 2160

tgcataggat gatatcttca gataataagg ctccattcca agtgtttgat ggcttggtag 2220

atctttgtga agcatctatt aacatttggt cacatttttt taaaaccaac ttcccatccc 2280

atccatgcca ttccacgtgt cagttattca tgaaaatgct gttcacttgc atacatgtta 2340

ctgccgttgt gttgatttcc tcaactctac tcataatttc tctgtgtggt cgcattctgg 2400

tgatctgatt tatctgataa tatctgtaca tgttttgaaa tttgggtagt gtctctttga 2460

ttagcgtgta aagcaagcaa ctcttgatgc gtgtgatcaa gtgtattgct gtctagagct 2520

gacagatgtt aaatttatct tatgcgtttc caagatcttc cagatgttct atgtaatctt 2580

tttaggccag cttaaacttt gacttgcttc atatacattt atgttaaagg agagttgtta 2640

atatacttca atttttcaca tttttaattc ctctttttac ctgtggtcct cacgagctct 2700

tactttcttt gcttggtaca gccccgctat tcaagagaac agagtaacaa ctgtgcagtg 2760

cttgtctggc acaggctcat tgagggttgg agctgaattt ttggctcgac attatcatca 2820

agtaaactgc tacatcttcc taacctacct ttcattttcc ttcgttttct tagccttcgt 2880

gggtaaacaa tcttcaaagt tgaattaacc ttgatgtaac cattcctgca gcgcacaatt 2940

tatattcccc aaccaacatg gggaaaccac ccaaaagttt tcactttagc tggattatcg 3000

gtaaagagtt accgctacta tgatccagca actcgtggac tcaattttca aggtatgaaa 3060

cacttcccta caatataatg atgtaacagg atattgtccc attagatatc tatggctatg 3120

ctgtttacta ttactctctt ccaggatgat ggatgttctt ttagtcttat tctggtattt 3180

gattacaaat tatcacaagt ctgaatcaag ttgtggatgg atggtttcac ttgtttgatt 3240

gcattgtaat ccagcaaact tgtaaagtca tcgtcatcta tgctttttct ttataccttt 3300

ttctgcgagg aaataagcga agagagatgg agatataact tgataataat ggaatgcaac 3360

aaacgcctaa tttaacatat tagggaccaa ctaacgtcta catttgacat tagctcttaa 3420

cattttgact ttttaatacc ttaccaaaaa taaaaaagat tgacattcta atgtcgcacg 3480

gaaccaaagg tgggaatagc tgataacata gaaaagtaac caaacaagtc ctggaatctt 3540

gtcaaaaaag aaattcagtt gtcgaaatgt tcttgaaaaa agttactgca accgcaatgg 3600

tcggaagaat aggaggaaga aattcaataa tgcgggtcaa atagaggagg tgccactaaa 3660

aggccattgg agaggggccg ggaaacacca tctgaaagag gtacagtggt accagaagga 3720

ttatcgaatg ctgatgcata gaaacgagtc agagattgaa acagtcactg gaaagaggtt 3780

tgatgttgtg acagcagtca caataaagaa aagtggtgca atcagaatga tcactggaaa 3840

ggctagaatt gtagaactat cataagaaag tgaattgtgg agggaaatct ctgtgaaaag 3900

acaaaatcta tttaggtcca caagatcata gaggctctaa tgccatgtga gaaactgaga 3960

gagtggacgg aaataaatag attacttgat aaaatacaat ccatacgttt aaatccgaat 4020

gactaacttt aattttaaca caacttttac atctaaaagt atgacacgtg acattctaac 4080

ctttcgtgct tgtgttcaca actttgcata tcgccgactt gtttacaaga actttctttt 4140

tcgtacatga caggtttgtt ggaagacctt ggatctgctc catcgggagc ggtagtgcta 4200

cttcacgctt gtgcccataa ccccactggt gttgatccaa ccattgatca gtgggagcaa 4260

attaggagat tgatgagatc aagaggattg ttgcccttct ttgatagtgc atatcaggta 4320

agagatcatc aacagatgtg cagagcactt tggctgttgg agttgttgct gtgtgagcat 4380

ttaaaagtga tgtggtttgt tcagtatatg tcaattaacc ttgatattca aactttgata 4440

ttctagggct ttgccagtgg aagcctagat acagatgcac agtctgttcg catgtttgtg 4500

gcagatggag gtgaagtact tgttgctcaa agttatgcaa agaatatggg gctttatggt 4560

gaacgtgttg gagctctaag cattgtacgt cttaaaggac aatggacaac tgtgccttat 4620

ttctgaaaat ttatatctcc agttggtcat ttgttgcatt acctttattt ttctcagatt 4680

gattctcatg atgcataaac tgtcttactg ttttcatagt ggccttcttt tgtgatgtta 4740

aaatttggta gttatgaact gtttaaagct tatatagctt acttccaaat aaataactgt 4800

gagccttgga catcacatat aaattatttt atatcacgga ttcgagccgt ggaaacaacc 4860

tcttgcagaa atgtagggta aggttgcgta taatagaccc ttgtcatccg gcccttcccc 4920

ggacccctgc gcatagcggg agcttagtgc aacgggttgc ctttttttca tcctgaggca 4980

taaaaagttt gtaatttctc aagaatgaat aaagagcctg ttataacagg caatttgcat 5040

atcatatggt gttgtttgtc gcacagtgat gacatattta tcacacaaat gaaagaaaaa 5100

tgaaggatat agttctgaac cctcagttaa actctgctga cagttataat tcttcaaatt 5160

ttctcaaatc tgtaggtctg caggaatgct gatgtggcga gcagagttga gagccagctg 5220

aagttggtga ttaggccaat gtattccaat ccgcccatcc atggtgcgtc aatagttgcc 5280

acaatcctta aagacaggta atatatcaac catcaggaaa ttgcttcttg ggaccctaaa 5340

aagccatttc ctttctttct atatgataga atccagtgta tgttcaaaaa ttatgtttag 5400

tcattgttct gcaaaataaa tcactaattt tctgcagaaa catgtaccgt gaatggaccc 5460

ttgagctgaa agcaatggct gatagaatca tcagaatgcg tcagcaatta tttgatgctt 5520

tacgtgctag aggtaaattt gctgcattat tttcacgtat gtgtgctctt attacatgtt 5580

tcttgttgca tcgacttcgg atatttttct catttttgat aatttcggtt caagtgtcat 5640

tataaatgct acatgttcgt ggcatatact tctacccata aaatatgctg caacttgttc 5700

cagctcattt gtctagataa tttatcaaaa ggaccaatct tcaccagctg actctcctga 5760

atgaaagctt aatttaggaa aaagattaag caaacaaaac atggaattcg acaaattcaa 5820

acatttctcc aaatcttaat agatctcgat cctccttagt gctttcatca acttcttagg 5880

taattcacct cttaactttg gctctgactg ggttctctac ctttggaaaa ccatccccaa 5940

agatgtccct tgcacgatcc ttttggggac atgaactgtt ggatcaggca agaaactatc 6000

ccccaataaa gaaaaattgt tggatcagat tttttcctga taggttgcat tctttcagca 6060

ttccccttaa agtttgtgat ttggacgttg tcctcatttt ggtataaaaa atgtcattgg 6120

aaactttcca ttttggcaca tcaggtgtta gaatcatcat gtcttcataa attggctata 6180

gacaaagtct catgtcgtca gctcctttct tcagtatcag gcattcttta atcaatgtaa 6240

gtgtcgagca ttgcatgagt aggatactta tttctattta catgaattga tgggcaagtc 6300

gggcattttt tagtcgactt aaaggtcaag cattgcatgt ataagatatc tatttctgtt 6360

gaattcaatt gattggcagg tacacctggt gactggagtc acattatcaa gcagattgga 6420

atgtttactt tcacgggact taactcagag caagttgcct tcatgaccaa agagtaccac 6480

atctacatga catcagatgg gtaatatgtc atttctcagc aaaaagtact gtatatcata 6540

tcagactacc atgtctcctc cacatctgat atgtgatttt attacctcgt aagaatttct 6600

accctcggat ggtaaaacag aaagagggaa gggagttaaa atcttttcag ccatcagtta 6660

gttcttttct tgcagtattc ttgctacctt agctttgatg aacgctaaga gaaatgtggc 6720

tgtattaatg aacatttcta gagcatggtt ctttctaagt ttgtatttaa ttgtggcaac 6780

ttcaattaag cttgggatat cagataatcc caaagccttt gacatacatc acatatttca 6840

ttttgcagac gcatcagtat ggcaggtctg agctccagga cagttccaca tctagcagat 6900

gccatacatg ctgctgtcgc tcgggctcgt tga 6933

<210> 2

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Met Asn Met Ser Gln Gln Ser Pro Ser Pro Ser Ala Asp Arg Arg Leu

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Arg His Leu Glu Leu Ser Ser Ser Ala Thr Val Glu

20 25 30

Ser Ser Ile Val Ala Ala Pro Thr Ser Gly Asn Ala Gly Thr Asn Ser

35 40 45

Val Phe Ser His Ile Val Arg Ala Pro Glu Asp Pro Ile Leu Gly Val

50 55 60

Thr Ile Ala Tyr Asn Lys Asp Ser Ser Pro Met Lys Leu Asn Leu Gly

65 70 75 80

Val Gly Ala Tyr Arg Thr Glu Glu Gly Lys Pro Leu Val Leu Asn Val

85 90 95

Val Arg Gln Ala Glu Gln Leu Leu Val Asn Asp Arg Ser Arg Val Lys

100 105 110

Glu Tyr Leu Ser Ile Thr Gly Leu Ala Asp Phe Asn Lys Leu Ser Ala

115 120 125

Lys Leu Ile Leu Gly Ala Asp Ser Pro Ala Ile Gln Glu Asn Arg Val

130 135 140

Thr Thr Val Gln Cys Leu Ser Gly Thr Gly Ser Leu Arg Val Gly Ala

145 150 155 160

Glu Phe Leu Ala Arg His Tyr His Gln Arg Thr Ile Tyr Ile Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Trp Gly Asn His Pro Lys Val Phe Thr Leu Ala Gly Leu Ser

180 185 190

Val Lys Ser Tyr Arg Tyr Tyr Asp Pro Ala Thr Arg Gly Leu Asn Phe

195 200 205

Gln Gly Leu Leu Glu Asp Leu Gly Ser Ala Pro Ser Gly Ala Val Val

210 215 220

Leu Leu His Ala Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Thr Ile

225 230 235 240

Asp Gln Trp Glu Gln Ile Arg Arg Leu Met Arg Ser Arg Gly Leu Leu

245 250 255

Pro Phe Phe Asp Ser Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Ser Leu Asp

260 265 270

Thr Asp Ala Gln Ser Val Arg Met Phe Val Ala Asp Gly Gly Glu Val

275 280 285

Leu Val Ala Gln Ser Tyr Ala Lys Asn Met Gly Leu Tyr Gly Glu Arg

290 295 300

Val Gly Ala Leu Ser Ile Val Cys Arg Asn Ala Asp Val Ala Ser Arg

305 310 315 320

Val Glu Ser Gln Leu Lys Leu Val Ile Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro

325 330 335

Pro Ile His Gly Ala Ser Ile Val Ala Thr Ile Leu Lys Asp Arg Asn

340 345 350

Met Tyr Arg Glu Trp Thr Leu Glu Leu Lys Ala Met Ala Asp Arg Ile

355 360 365

Ile Arg Met Arg Gln Gln Leu Phe Asp Ala Leu Arg Ala Arg Gly Thr

370 375 380

Pro Gly Asp Trp Ser His Ile Ile Lys Gln Ile Gly Met Phe Thr Phe

385 390 395 400

Thr Gly Leu Asn Ser Glu Gln Val Ala Phe Met Thr Lys Glu Tyr His

405 410 415

Ile Tyr Met Thr Ser Asp Gly Arg Ile Ser Met Ala Gly Leu Ser Ser

420 425 430

Arg Thr Val Pro His Leu Ala Asp Ala Ile His Ala Ala Val Ala Arg

435 440 445

Ala Arg

450

<210> 3

<211> 6935

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

atgaacatgt cacaacaatc accgtccgct gaccggaggt tgagtgtttt ggcgaggcac 60

cttgaaccgt cgtcctccgc caccgtcgaa acctccatcg tcgctgctcc tacctctgga 120

aatgctggaa ccaactctgt cttctctcac atcgttcgtg ctcccgaaga tcctattctc 180

ggggtaactt tctctctctc tctctctctc tctcttcatc cacacgcact cactcacata 240

acatatgtat aagtatttaa gtatatgcgt gctcaaatgt tctgtatata ttcatttgtt 300

ccgtatcaaa tgttctcttg ttataagctg aattttagag gaattgtagt gttatttgct 360

aatcgcaaga gcttgcatac tcattctctt cgtattgaat taaatattcc ttttttctta 420

tggatgacga atttaagcag ttttttgagt ccgatcacta cgaaatttcg atttcaagtt 480

gatagaagtg aaaaatgatg gtgtttacat attaattgag cgaataaaaa gagaaattcg 540

agtgttgata tcttcaaaaa tgttgttaaa tgtagagata tactgtgatt tagtttctgt 600

tataatcttt gccttttttc ttttgaaatt tgaatattgt ttgttgaagt cttcgtgaca 660

tattggtgtt atgttttggt tattaggtta ctattgcata caataaagat agcagcccca 720

tgaagttgaa tttgggagtt ggtgcatatc gcacagaggt gatcatcctt tttggctttt 780

gtatttgcgc tattatcgtc gatggagcac tattatcagt agctggataa tcatcctttt 840

tgatatttcc ttgattgaaa tccaaaaaca cgaataaaaa gaaatttact gatggatctg 900

tgttttggtt tcttcagatt tacgcatttc tgttaattga aaaaatatta tgattgtctt 960

ggtgattgtg gtgttgtttt ggcttcatat agttaatccg acgccgtagt gtactaatgt 1020

ttggctgatg tgctgccaag agaaatgttt aagattatgg tctgccataa ctgataaaat 1080

ttaatattaa aagtacttgg ctggatgttc tgcgtttgca taacttgtaa cgcatatgaa 1140

aaaattacct ttgattttca taattagtga gaaaattaag tagcttccgc attcctgtca 1200

ttgcactatc aaacacatac ggtttatgat atatctacct agtttggaac tttgtgattt 1260

ctatttttca caccttgtaa taaatgataa ttcttggatc tgtggtgtct ttgttcaaaa 1320

gatcacagag aagattgcac ttatgttttg tagtctagtt ggctcagact ctgtcaaaca 1380

caacttgtta catcgcattt tacctgttag ttaagaaact tgggtcatca acaaatttgt 1440

catgaggtgg ttatttcttg gggttttgtg aattgctctc agcaatctgc tagctttctt 1500

atgtggactc aaaacaatga atctcttgag ttgatgtgtt gatttttcaa tcgagtaaaa 1560

caagttctat atttggctgt gagagtaaag tgggagctat taaaattcct agctgaattt 1620

atgtttctta atatcttaaa tccttaaagg tagagggaga ggaaggaggc ttattgatga 1680

aggactagta gttgtgtata cttagttctt tctcaaattt cataagaatc tcttgagggt 1740

ttttctcgct gactgttgaa tatggggctc cacagtttgt gttgctatat tgaaatgttt 1800

cagctaataa tactaacgtg tttctttttc tttctccctt ttgtggggtt atcaggaagg 1860

aaaaccgctt gttttgaatg ttgtaagaca agcagagcag ctactagtaa atgacaggta 1920

cttgtgttgc catttcatgg agtatgaata aaatgtttcc ttaattctat gtgattaaac 1980

ttcaagattt ctgcaggtct cgcgttaaag agtacctatc tattactgga ctggcagact 2040

tcaataaatt gagtgctaag ctgatacttg gtgccgacag gtatacaagt tcctgttctc 2100

tgtatagtgt tgctgataag atatgcaggg agataaagca tgtattttcc tgttgcatag 2160

gatgatatct tccgataata aggctccgtt ccaagtgttt gatggcttgg tagatctttg 2220

tgaagcatct attaacattt gctcacgttt ttttaaaacc aacttcccat cccatccatg 2280

ccattccacg tgtcagttat tcatgaaaat gctgttcact tgcatacatg ttactgccgt 2340

agtgttggtt tctctcaact ctactcataa tttctgtgtg gtcgcattct ggtgatctga 2400

tttatgtgat aatatctgta catgttgttt tgaaatttgg gtagtgtctc tttgattagc 2460

gtgtaaagca ggcaactctt gatgcatgtg gtgaagtgta tgattgctgt ctagagctgt 2520

cagatgttaa atttatctta tgcgtttgca agatcttcca gatgttctat gtaatctttt 2580

taggccagct taaactttga cttgcttcat atacatttat gttaaaggag agttgttaat 2640

atacttcaat tttcacattt ttaattcctc ttttacctgt ggtccttacg agctcttact 2700

ttctttgctt ggtacagccc tgctattcaa gagaacagag taacaactgt gcagtgcttg 2760

tctggcacag gctcattgag ggttggagct gaatttttgg ctcgacatta tcatcaagta 2820

aactgctacg tcttcttaac ctacctttca ctctccttcg ttttcttagc cttcgtgggt 2880

aaacaatctt caaagttgaa ttgaccttga tgtaaccatt cctgcagcgc actatttata 2940

ttccccaacc aacatgggga aaccacccaa aagttttcac tttagctggg ttatcagtaa 3000

agagttaccg ctactatgat ccagcaactc gtggactcaa ttttcaaggt atgaaacact 3060

tcccttcaat ataatgatgt aacgggatat tgtcccatta gatatctatg gccatgctgt 3120

ttcctattac tctcttccag gatgatggat gttcttttag tcttattctg gtatttgatt 3180

acaaattatc acaagtctga atcaagttgt ggatagatgg tttcacttga ttgattgcat 3240

tgtaatccag caaacttgta aatccgtcat catctatgct ttttctttat accttttttc 3300

tgcgaggaaa taagagcaga gagatggaga tataacttga taataatgga atgcaacaaa 3360

cgcctaattt aacatattag ggaccaacta acatcagcat ttgacattag ctcttaacat 3420

tttgactttt taacacctta tcaaaaaaaa gaaggaaaaa gattgacatt ctaatgtcgc 3480

acggaaccaa aggtgggaat agctgataac atagaaaagt aaccaaacaa gtcctggaat 3540

cttgtcaaaa aaaaattcag ttgccaaaat gttcttggaa aaaattactg caaccacaat 3600

ggtcggaaga ataggaggaa gaaattcaat aatgcgggtc aaatagagga ggtgccacta 3660

aaaggccatt ggagaggggc cgggaaacac catctgaaag aggcacagtg gtaccagaag 3720

gattatcgaa tgctgatgca tagaaacgag tcagagattg aaacagtcac tggaaagaag 3780

gcttgatgtt gtgacagcag tcagtcagaa taaagagaag tggtgccatc agaatggtca 3840

ctggaaaggc tcgaattgta gaactatcat aagaaagtga attgtggctg ggagactctt 3900

tgaaagacaa aatctattta ggtctccaca agatcatgga tgctctaatg ctatgtgaga 3960

aactaagaga gtggacgaaa ataaatggat tacttgataa aatacaatcc atacgtttaa 4020

atccgaatga ctaactttaa ttttaacaca acttttacat ctaaaagtat gacacgtgac 4080

acttaacctt tcatgcttgt gttcacaact tcgcatgtcg ccgacttgtt tacaagaact 4140

ttatttttca tacatgacag gtttgttgga agaccttgga tctgctccat cgggagcgat 4200

agtgctactt catgcttgtg cccataaccc cactggtgtt gatccaacca ttgatcagtg 4260

ggagcaaatt aggagattga tgagatcaag aggattgttg cccttctttg atagtgcata 4320

tcaggtaaga aatcatcaac agatgttcag agcactttgg ctgttggagt tgttgctgta 4380

tgagcattta aaagtgaggc ggtttattca gtatatgtca attaaccttg atattcaaac 4440

tttgatattc tagggctttg ccagtggaag cctagataca gatgcacagt ctgttcgcat 4500

gtttgtcgca gatggaggtg aagtacttgt tgctcaaagt tatgcaaaga atatggggct 4560

ttatggtgaa cgtgtcggag ctctaagcat cgtatgtctc aaaggacaaa ggacaactgt 4620

gccttgtttc tgaaaattta tatctccagt tgttcatttg ttgcattacc tttatttttc 4680

tcagattgat tctcatgatg catgaactgt cttactgttt tcatagtgtt cttttgtgat 4740

cttaaaattt ggtagttatg aactgttaaa gcttatatag cttacttcca aatatataac 4800

tgtgagcctt ggacatcaca tataaattat tttatatcac ggggtcgaga tgtggaaaca 4860

acctcttgca gaaatgtagg gtaaggttgc gtacaataga cccttgtggt ccggcccttc 4920

ctcggacccc tgcacatagc gggagcttag tgcactgggt tgcccttgtt ttcatcctga 4980

ggcataaaaa gtttttaatt tctcaagaat gaataaagag cctgttataa caggcacttt 5040

gcatgtcata tggtgttgtt tgtcacacag ttatgcatat agtgtagttt atcacacaaa 5100

tgaaaaaaat tgaaggatat agttctgaac cctcagttaa actctgctga cagatataat 5160

tcttcaaaat tttctcgaat ctgtaggtct gcagaaatgc tgatgtggcg agcagagttg 5220

agagccagct gaagttggtg attaggccaa tgtattccaa tccgcccatc catggtgcgt 5280

caatagttgc cacaatcctt aaagacaggt aatatatcaa ccatcaggaa attgcttctt 5340

gggaccccaa aaaagccatt tcctttcttt ctatatgata gaatccagtg tatgatcaaa 5400

aattatgttt agtcattgtt ctgcaaaata aatcactaaa tttctgcaga aacatgtacc 5460

atgaatggac ccttgagctg aaagcaatgg ctgatagaat catcagaatg cgtcagcaat 5520

tatttgatgc tttacgtgct agaggtaaat ttgctgcatt attttcacgt atgcgtgctc 5580

ttattacatg tttcttgctg catcgacttc ggatattttt ctcatttttg ataatttcgg 5640

ttcaagtgtc attataaatg ctacatgttc gtggcgtata cttctacata taaaatatgc 5700

tgcaactcgt tccagctcat ttgtctagat aattgatgaa aaggaccaat cttcacagct 5760

gactctcctg aatgaaagct taacgaagga aaaagattaa gcaaacaaaa catggaattc 5820

gacaaattca aacatttctc caaatcttaa tacatctcga tccttcttag tgctttcatc 5880

aacttcttag gtaattcacc tcttaacttt ggctctgact ggattctcta cctttggaaa 5940

accatcccca aagatgtccc ttgcacgatc cttttgggga catgaactgt tggatcaggc 6000

aagaaactat cccccaataa agaaaaattg ttggatcaga ttttttcctg ataggttgca 6060

ttctttcagc attcccctta aagtttgtga tttggacgtt gtcctcattg tgttacaaaa 6120

aaatgtcatt ggaaacttcc attttggcac atcaggtgtt agaatcatca tgtcttcata 6180

aattggcaat agacaaagtc tcatgtcgtc aactcctttc ttcagtgtca ggcattcttt 6240

aatcaatgca agtgtcgagc attgcatgaa taggatacct attactattt acatgaattg 6300

atgggcaagt cgggcatttt ttagtcggct taaaggtcaa gcattgcatg aacaagatat 6360

ctatttctat tgacttcaat tgattggcag gtacacctgg tgactggagt cacattatca 6420

agcagattgg aatgtttact ttcacgggac ttaactcaga gcaagttgcc ttcatgacca 6480

aagagtacca catctacatg acatcagatg ggtaatgtgt catttcttag cacaaagttc 6540

tgtatatgtc atatcagact accatgtccc ccctacatct gatatgtgat tttattacct 6600

cgtaagctcg gatggtaaaa cagaaagagg gaagggattt aaaatcttat cagccgtcag 6660

tttgttcttt tcttgtagta ttcttgctac cttagctttg atgttcgcta agagaaatgt 6720

ggcggtacta atgaacattt ctagagcatg gttctttcta agtttgtatt taattgtggc 6780

aacttcaatt aagcttagga tatcagataa tccaaagcct ttgacataca tcacatattt 6840

cattttgcag acgcatcagt atggcaggtc tgagctccag gacagttcca catctagcag 6900

atgccataca tgctgctgtt gctcgagctc gttga 6935

<210> 4

<211> 448

<212> БЕЛОКБЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 4

Met Asn Met Ser Gln Gln Ser Pro Ser Ala Asp Arg Arg Leu Ser Val

1 5 10 15

Leu Ala Arg His Leu Glu Pro Ser Ser Ser Ala Thr Val Glu Thr Ser

20 25 30

Ile Val Ala Ala Pro Thr Ser Gly Asn Ala Gly Thr Asn Ser Val Phe

35 40 45

Ser His Ile Val Arg Ala Pro Glu Asp Pro Ile Leu Gly Val Thr Ile

50 55 60

Ala Tyr Asn Lys Asp Ser Ser Pro Met Lys Leu Asn Leu Gly Val Gly

65 70 75 80

Ala Tyr Arg Thr Glu Glu Gly Lys Pro Leu Val Leu Asn Val Val Arg

85 90 95

Gln Ala Glu Gln Leu Leu Val Asn Asp Arg Ser Arg Val Lys Glu Tyr

100 105 110

Leu Ser Ile Thr Gly Leu Ala Asp Phe Asn Lys Leu Ser Ala Lys Leu

115 120 125

Ile Leu Gly Ala Asp Ser Pro Ala Ile Gln Glu Asn Arg Val Thr Thr

130 135 140

Val Gln Cys Leu Ser Gly Thr Gly Ser Leu Arg Val Gly Ala Glu Phe

145 150 155 160

Leu Ala Arg His Tyr His Gln Arg Thr Ile Tyr Ile Pro Gln Pro Thr

165 170 175

Trp Gly Asn His Pro Lys Val Phe Thr Leu Ala Gly Leu Ser Val Lys

180 185 190

Ser Tyr Arg Tyr Tyr Asp Pro Ala Thr Arg Gly Leu Asn Phe Gln Gly

195 200 205

Leu Leu Glu Asp Leu Gly Ser Ala Pro Ser Gly Ala Ile Val Leu Leu

210 215 220

His Ala Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Thr Ile Asp Gln

225 230 235 240

Trp Glu Gln Ile Arg Arg Leu Met Arg Ser Arg Gly Leu Leu Pro Phe

245 250 255

Phe Asp Ser Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp

260 265 270

Ala Gln Ser Val Arg Met Phe Val Ala Asp Gly Gly Glu Val Leu Val

275 280 285

Ala Gln Ser Tyr Ala Lys Asn Met Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Val Gly

290 295 300

Ala Leu Ser Ile Val Cys Arg Asn Ala Asp Val Ala Ser Arg Val Glu

305 310 315 320

Ser Gln Leu Lys Leu Val Ile Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Ile

325 330 335

His Gly Ala Ser Ile Val Ala Thr Ile Leu Lys Asp Arg Asn Met Tyr

340 345 350

His Glu Trp Thr Leu Glu Leu Lys Ala Met Ala Asp Arg Ile Ile Arg

355 360 365

Met Arg Gln Gln Leu Phe Asp Ala Leu Arg Ala Arg Gly Thr Pro Gly

370 375 380

Asp Trp Ser His Ile Ile Lys Gln Ile Gly Met Phe Thr Phe Thr Gly

385 390 395 400

Leu Asn Ser Glu Gln Val Ala Phe Met Thr Lys Glu Tyr His Ile Tyr

405 410 415

Met Thr Ser Asp Gly Arg Ile Ser Met Ala Gly Leu Ser Ser Arg Thr

420 425 430

Val Pro His Leu Ala Asp Ala Ile His Ala Ala Val Ala Arg Ala Arg

435 440 445

<210> 5

<211> 6388

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 5

atggcgatcc gagccgcgat ttccggtcgt cccctcaagt ttagctcgtc ggtcggagcg 60

cgatctttgt cgtcgttgtg gcgaaacgtc gagccggctc ctaaagatcc tatcctcggc 120

gttaccgaag ctttcctcgc cgatcctact cctcataaag tcaatgttgg tgttgtaagt 180

ttttttttct ctttgctttg tttgattttc cacttcattt cgtgtaagct aggatttagc 240

ttacttgacc atttcgctat tcttcatagg ccatagctgt aaaaatggtt ttactgtgac 300

gaatcttcga cgatctcaat cgctttggga ttgggagaga gtttattgat ttaatttttg 360

tatgcattcc acttttttca acttgatcta tttaagaaaa aaattgaaaa agatttgacc 420

ttttttctta aattatttct tttaaatttt ttatttttgt gattattata tagggagctt 480

acagagacaa caatggaaaa cccgtggtac tggagtgtgt tagagaagca gagcggagga 540

tcgctggcag tttcaacatg tgagtgctct cctgatttat tcaagttttt ctgttatttt 600

atttgtaatt aattacgatt acgttaactt tgatctatta gaaaatagaa acttcagcca 660

gtaagattac tttttttctt cgaggagtgt gagatgtaaa cccaggtcgg atgcactgga 720

attcttcact agtttgtgca aatatattct taatattttt caaaaacttc ctgtgtacac 780

acacacatac atgtaattaa ttaagtaatt acctactgat ctaggatttt taggtagttc 840

ggaaaaatat attttcaata tcgtttaaga attttctggg tatgcgtagt ttgagtatga 900

taaaatgggt gcatgtgcac cactgcttac gctagggaac agcctctaat tagctgttgg 960

tgagtctggt gagtggtgac tgttctttat tttcagttac ttcgcacatt gttggttttt 1020

gattaagtat aaataaacga atgttttagt gagtgcttat ttctatgaag catctttttt 1080

aggtctacag aaatgggtgg tacgatattt tccagccgtc agctccacta accagtttga 1140

ttctttggga ctttttcttt gtattctcac gtttacttct agtggatggt gcagatggat 1200

ttctttacta attctttctt ctgcgtttgc agagctttct cccaagataa attattaata 1260

tcaaattgac ctttcgatag ttcaatggtg tttaactttt tcaaatattg cccattttat 1320

attatgaagt ttgaaagttt aactagacat gttgtaataa attttatttg acttgtgtat 1380

tttattcatt gtggttggag aaagtattaa aataacaagt gaaaagtctg ttttacgtca 1440

agtttgaatt tgaatttttg aattgatttg cttctttaag tttatgaaac catctatgag 1500

aatattattg gcactccatt gtctcatttt atgtgaaggc atttgacgtt gcacaaaatt 1560

taaaaatata aagaaactta tgacgtgtaa gttagatata tgcagagtac catagttatc 1620

cttttaagta agtgatagtg agagtttcac atttcttttt gttctctctt cttataaaag 1680

aatgaatttt tgtatcccaa caagtcatat cattaatgtt aacacgggga tactaagatt 1740

aactaatgtc taaaaagaga aagatttcat tcttcttgga cgggctaaaa aggaaagtat 1800

gtcacataaa atgagacaga gatatgttag gatttgtcct gaatttctaa tcaattagga 1860

ctctctttct tgaaggaatg gaaaaagact cctaaaagga ttaaatctcc ttaatatgtc 1920

ttatcctttt cttggaagac aagttttgca catctataaa ttaaggatct ctgcttttca 1980

caagaacaca aaaaaaaaat atccacaatg tagttattaa agagtttgtt tagggggaga 2040

tttttctctc gatagttttt cttcttttat attagtttta tcatatgtag atcaattgac 2100

caaatcatta taaactatta tgcttagttt aatatatttt tcttttgttg tctgatttat 2160

cgtccatcaa gttttgtatt gttagttttc gcatgcacca tgttatttcg aacccaacaa 2220

gtggtatcag agccaatggt tcagagtcaa cggttgaacg aggttgaaga aagattcaat 2280

gcgtgtttag atcaagacga taatgaagat ttattcaaca tgctacatgt ggagataaat 2340

ttacaattac aattgtattc aacacgcctg ctgttgcatc tttattggaa taaaaactct 2400

ttctaaccca tattttggcc actttaaacc aatgccaatt ttaagtcatg cctacttgca 2460

acacatgagt tccagtgcca gttttaactc acgcttcttt ttaatgcatg agcttctttt 2520

atcccatgtt tattcttaac acgcgggctc cttttaaccc atacttggtt tttttttaac 2580

caataccaag attttcaatt tttaatcatg gcaagcagca gtgatgaaga ttatgtgaag 2640

aaggtgaatc aactttgtca agaaaattca ggccaagggg agattgttag gatttgtcct 2700

gaatttctaa tcaattagga ctctctttct tgaaggaatg gaaaaagact cctaaaagga 2760

ttaaatctct ttactatgtc ttatcatttt cttggaagac aagttttgca catctataaa 2820

ttaaggatct ctgcttctca caagagcaca aaaaaaaaaa tatccacaat gtagttatta 2880

aagagttttg tttaggggga gatttttctt tcaatagttt ttcttctttt atattagttt 2940

tatcatatgc agatcaattg accaaactat tatgcttagt ttaatatttt ttttttttgt 3000

cgtctgattt atcgtccacc aagttttgta ttgttagttt ccgcatgcac catgttattt 3060

cgaaccctcg tataagtttg tcaaacattt tgtgacttcc taaactagaa agtgtcttgg 3120

gatgggggag aactacgcta tctgatctca aaaaaagtgt gcatcatgtg atactatgtg 3180

gatagtttag ttcacatgtt gacaattcat catttatcag ggaatatctt cctatgggag 3240

gtagtgtcaa catgatcgag gagtcactga agttagccta tggggagaac tcagacttga 3300

taaaagataa gcgcattgca gcaattcaag ctttatccgg gactggagca tgccgaattt 3360

ttgcagactt ccaaaggcgc ttttgtcctg attcacagat ttatattcct gttcctacat 3420

ggtctaagta agtgtattct tctgcttctc ggcatctcta cagcatccta attgatcttc 3480

ctcaattggt ttttgcactt taaaacatga gtatgcaaat accttcaaaa ttttctaatt 3540

tcctgtcatt actaatataa agttcttggc agtcatcata acatttggag agatgctcat 3600

gtccctcaga aaatgtatca ttattatcat cctgaaacaa aggggttgga cttcgctgca 3660

ctgatggatg atataaaggt aagaaaacat atatttgagg ttgtttgcca tgatggttgg 3720

ttctcctgtt tgatgatata gtgtccctcc tcaagtggca attatgtgtt ctatcctgac 3780

gtatttcaat tttcattgac atagaatgcc ccaaatggat cattctttct gcttcatgct 3840

tgcgctcaca atcctactgg ggtggatcct acagaggaac aatggaggga gatctcacac 3900

cagttcaagg taatgatttg tatgttttgt ctctcccttt tcttgtcata agtcatatta 3960

aatttattac actggttcca ggtgaaggga cattttgctt tctttgacat ggcctatcaa 4020

ggatttgcta gtgggaatcc agagaaggat gctaaggcta tcaggatatt tcttgaagat 4080

ggtcatccga taggatgtgc ccaatcatat gcaaaaaata tgggactata tggccagaga 4140

gttggttgcc taaggtaaac tactactccc accatcatat cttatttgcc ctagttacaa 4200

tctggagagt caaacaaact ttttattaga ccatagttgg tctatttttc aaatgatcta 4260

attccaaaag cagttactac tatttcatgc aaattctaga ttaattaacc ttttgctata 4320

cctcattatc ttcatttagt aggcagtagc taattttacc atatatcata tttttcatat 4380

aatcaatatg tagagttatt tatttattta tatattttaa atttatttag gataaatttt 4440

gttctttccg gtaatttcag ttcatttcca cctaaaagtc caactcgaag agaaaaacag 4500

aattttgcta gtcaaaactt agatccaatg aaaagcacca aaattttggt tttaaattat 4560

aaaacatgtc tactctaggt ttttttccta ggcaagcgat gtgattttac aatcttacaa 4620

taaggcatca atcaatccca aactagtttg gttcaacaat ataaatcttt gttcctattt 4680

catggcattg ggcccattgc attccaataa tggtaaataa gacaaattag aggttatcta 4740

agattagaga ttccttatta aaatctcata cttatatcta cattgtcacg caagtctctg 4800

accttaaaag aagacttcta gcagacacca gacttaacgt aagtgtaaca acaacaacta 4860

agttttaatc caaactagtt agtatcgctt atatgaatcc cttgcttcca ttgtgtagca 4920

ctaaacaaca acaacaacat accgagtata atctcacata gtggggtctg gggagggtag 4980

tgtgtacgca gactttaccc ctgccttgtg gagaaagaga ggctatttcc aatagaccct 5040

cggctcaaaa ccattgtgta gcaatggagg catgaaatag aaaacttgtc ttctgattaa 5100

aatctgttat taaattaatg aggagaaaaa attggattac ttgttggtaa atcttatttg 5160

ttgttttaaa cacacacaaa gccgaaagac ctctgatact tttcctgaga tgcttccgca 5220

attcactgca gtgtggtttg tgaggatgaa aaacaagcag tggcagtgaa aagtcagttg 5280

cagcagcttg ctaggcccat gtatagtaat ccacctgttc atggcgcgct cgttgtttct 5340

accatccttg gagatccaaa cttgaaaaag ctatggcttg gggaagtgaa ggtaatatgg 5400

ttagaacaag aaaagattta tgattatata actatcattg gtattttgac aaaaggtagg 5460

aactaggaac cttgctatta aagatatttt cttcccttta ttttggaaaa aaaggtattt 5520

tcttgctttc ttcaaatgtt tgagatttgg atagagccgt tacatggaaa tgctgtgcaa 5580

ttttctgcta ctcacatgga aaagatcttt ttcttttgct gatctgttta agcacctatt 5640

tgctaaagcc tactatgtca gtatgttgtt caatcttttc agccacagaa acaggtctaa 5700

accagttcca aactttaaat aatcttacca tggtagtttc agcaaagata aattggtccg 5760

tgcagccatt aactgttttc tttgtcgggc ttcttaaact tgttttctcc aaggtctagt 5820

tgttggtgct gtggctgctt tttagctttg tgctcattat cagagcatca tatgtttaag 5880

tgtaaaggtt caatgactaa gttctttttc cagggcatgg ctgatcgcat tatcgggatg 5940

agaactgctt taagagaaaa ccttgagaag ttggggtcac ctctatcctg ggagcacata 6000

accaatcagg tattgaaatc aacaacttct gttgttttct atgctactag tatataacta 6060

ttaagaaaat tactgtggtt cacctactgc gccattaata ctcgatacca ccaacagatt 6120

ggcatgttct gttatagtgg gatgacaccc gaacaagtcg accgtttgac aaaagagtat 6180

cacatctaca tgactcgtaa tggtcgtatc aggtataatc attaggtcac caatttctgc 6240

ttaatgctcc ggtgttcttg tacagagtta tatctcatta ttttttccac tatgttgtgt 6300

gttttgtacg tgcagtatgg caggagttac tactggaaat gttggttact tggcaaatgc 6360

tattcatgag gccaccaaat cagcttaa 6388

<210> 6

<211> 424

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 6

Met Ala Ile Arg Ala Ala Ile Ser Gly Arg Pro Leu Lys Phe Ser Ser

1 5 10 15

Ser Val Gly Ala Arg Ser Leu Ser Ser Leu Trp Arg Asn Val Glu Pro

20 25 30

Ala Pro Lys Asp Pro Ile Leu Gly Val Thr Glu Ala Phe Leu Ala Asp

35 40 45

Pro Thr Pro His Lys Val Asn Val Gly Val Gly Ala Tyr Arg Asp Asn

50 55 60

Asn Gly Lys Pro Val Val Leu Glu Cys Val Arg Glu Ala Glu Arg Arg

65 70 75 80

Ile Ala Gly Ser Phe Asn Met Glu Tyr Leu Pro Met Gly Gly Ser Val

85 90 95

Asn Met Ile Glu Glu Ser Leu Lys Leu Ala Tyr Gly Glu Asn Ser Asp

100 105 110

Leu Ile Lys Asp Lys Arg Ile Ala Ala Ile Gln Ala Leu Ser Gly Thr

115 120 125

Gly Ala Cys Arg Ile Phe Ala Asp Phe Gln Arg Arg Phe Cys Pro Asp

130 135 140

Ser Gln Ile Tyr Ile Pro Val Pro Thr Trp Ser Asn His His Asn Ile

145 150 155 160

Trp Arg Asp Ala His Val Pro Gln Lys Met Tyr His Tyr Tyr His Pro

165 170 175

Glu Thr Lys Gly Leu Asp Phe Ala Ala Leu Met Asp Asp Ile Lys Asn

180 185 190

Ala Pro Asn Gly Ser Phe Phe Leu Leu His Ala Cys Ala His Asn Pro

195 200 205

Thr Gly Val Asp Pro Thr Glu Glu Gln Trp Arg Glu Ile Ser His Gln

210 215 220

Phe Lys Val Lys Gly His Phe Ala Phe Phe Asp Met Ala Tyr Gln Gly

225 230 235 240

Phe Ala Ser Gly Asn Pro Glu Lys Asp Ala Lys Ala Ile Arg Ile Phe

245 250 255

Leu Glu Asp Gly His Pro Ile Gly Cys Ala Gln Ser Tyr Ala Lys Asn

260 265 270

Met Gly Leu Tyr Gly Gln Arg Val Gly Cys Leu Ser Val Val Cys Glu

275 280 285

Asp Glu Lys Gln Ala Val Ala Val Lys Ser Gln Leu Gln Gln Leu Ala

290 295 300

Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Val His Gly Ala Leu Val Val Ser

305 310 315 320

Thr Ile Leu Gly Asp Pro Asn Leu Lys Lys Leu Trp Leu Gly Glu Val

325 330 335

Lys Gly Met Ala Asp Arg Ile Ile Gly Met Arg Thr Ala Leu Arg Glu

340 345 350

Asn Leu Glu Lys Leu Gly Ser Pro Leu Ser Trp Glu His Ile Thr Asn

355 360 365

Gln Ile Gly Met Phe Cys Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Gln Val Asp

370 375 380

Arg Leu Thr Lys Glu Tyr His Ile Tyr Met Thr Arg Asn Gly Arg Ile

385 390 395 400

Ser Met Ala Gly Val Thr Thr Gly Asn Val Gly Tyr Leu Ala Asn Ala

405 410 415

Ile His Glu Ala Thr Lys Ser Ala

420

<210> 7

<211> 4789

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 7

atggcgattc gagccgcgat ttccggtcgt tccctcaagc atattagctc gtcggtcgga 60

gcgcgatctt tgtcgtcgtt gtggcgaaac gtcgagccgg ctcctaaaga tcctatcctt 120

ggcgttaccg aagctttcct cgccgatcct actccccata aagtcaatgt tggcgttgtg 180

agtttttttt tcctctttgt tttgcttcat tttccacctc atttcgtgta tgcaaggatt 240

tagcttactt gaccatttcg ctatacttcc cttggtaggc catagctgta aaaaatagtt 300

ttactgtgac gaatcatcga catatggata cagagtattc taatggagta gtcaacaaca 360

taagtcgatc tcaatcgctt tgggattgag aaagagttta ttgatttaat ttttgtatgc 420

gttccacttt tttcaacttg atctatttaa gaaaaaaatt gaaaaagatt tgaccttttt 480

tcttaaatta tttcttttat aaaatttgct tttgtgatta ttatacaggg agcttacagg 540

gacgacaacg gaaaacccgt ggtactggag tgtgtcagag aagcagagcg gaggatcgct 600

ggcagtttca acatgtgagt gcttctcctg atttattcat ttttttctgt tatttatttg 660

taattaatta cgattacgtt aaatttgatc tattagaaaa tataaacttc agccagtaag 720

attacttttt ttcttcgagg agtttgagat gtaaaaccca ggtcggatgc actgggattc 780

ttaagtagtt tgtacaaata tattcttaat agttttgtaa aatttgctgt atacacacac 840

atgtaattaa ttacctactg atctaggatt tataggtagt tcggaaaaat atattttcaa 900

tatcgtttaa gaatttcctg ggtgtgtata gtttgagtat gagaaaatgg gtgcatgtgc 960

accactgctt acgctaggga tcagcttcta aatagctggt ggtgagtctg gtgagtggtg 1020

actgttcttt attttcagtt actgtagcca caaattgttg gttattgatt aagtataaat 1080

aaacgaatgt attagtgagt gcttatttgt atgaagcatc ttttttaagt ctacagaaat 1140

gggtggtccg atattttcca cccgtcagtt cctctaacta gtttgattct ttgggacttt 1200

ttctttgtat tctcacgttt acgcctagtg gatggtgcag atggatttct ttactaattc 1260

tttcttctgc gcttgcagag ctttctccca agataaatta ttaatatcaa attgaccttt 1320

cgatagttca atggtgttta actttttcaa atattgcccc acatcccatt ttatattatg 1380

aagtttgaaa agtttaacta gacatgttgt aataaatttt tatttgagtt gtgtatttta 1440

ttcattgtgg taggagaaac tagaaagtat taaaataaca agtgaaaagt ctgttttatg 1500

gataaagaat attacgtcaa gtttgaattt gaaattttga attgatttgc ttctttaaat 1560

ttatgaaacc atctatgaga atattattag cactccattt gtctcatttt atgtgaaggc 1620

atctgacttt gcacaaagtt aaaaaatata aagatactta cgacgtgaaa gtttgatata 1680

tgccaagtac cataattatc cttttaagca agtgatagtg agagtttaac atttcttttt 1740

gttctctctt cttataaaag aatgaatttt gtatcaagtg ggtcccaaca agtcattcat 1800

taagggtaaa acggggatgc taagattaac taatttccaa aaagagaaag atttaattct 1860

tctaggacag gctaaaaatg gaaagtgttt cacataaaat gagacataga caatataagt 1920

ttgtcaaaca ttttgtgacg tcctaaaata gaaagtgtcc tgagatggag gagaactacg 1980

ttatctgttc tcaaaaaagt gtgtatcatg tgatactatg tggatagttt agttcacatg 2040

ttaacaattc atcatttatc agggaatatc ttcctatggg aggtagtgtc aacatgatcg 2100

aggagtcact gaagttagcc tatggggaga actcagactt gataaaagat aagcgcattg 2160

cagcaattca agctttatct gggactggag catgccgaat ttttgcagac ttccaaaggc 2220

gcttttgtcc tgattcacag atttatattc ctgttcctac atggtctaag taagtgtatt 2280

cttctgcttc tcggcatctc tacagcatcc taattgatct tcctcaattg gtttttgcac 2340

attaaaacat gagtatgcaa ataccttcaa aattttctaa tttcctgtca ttactaatat 2400

aaaattcttg gcagtcatca taacatttgg agagatgctc atgtccctca gaaaacgtat 2460

cattattatc atcctgaaac aaaggggttg gacttcactg cactgatgga tgatataaag 2520

gtaagaaaac atatatttga ggttgttttc catgatggtt tgttctcctg tttgatgata 2580

tagcgtccct cctcaagtgg caattatgtg ttctatcctg acgtatttca attttcattg 2640

acatagaatg ccccaaatgg atcattcttt ctgcttcatg cttgtgctca caatcctact 2700

ggggtggatc ctacagagga acaatggagg gagatctcgc accacttcaa ggtaatgatt 2760

ttgtatattt tgtctctcct ttttcttgta ccaagtcata ctaaatttat tacactggtt 2820

ccaggtgaag ggacattttg ctttctttga catggcctat caaggatttg ctagtgggaa 2880

tccagagaag gatgctaagg caatcaggat atttcttgaa gatggtcatc cgataggatg 2940

tgcccaatca tatgcaaaaa atatgggact atatggccag agagttggtt gcctaaggta 3000

aactactact cccaccatca tatcttattt gccctagtta caatctggag agtcaaacta 3060

actttttgtt agaccttagt cggtctattt ttcaaatgtt ctaattccaa aagcagttac 3120

tactatttcc tgtaaattct agattaatta actttttatt atacctcatt atcttcattt 3180

agtagctaat tttaccatat atcatatttt tcatattatc aatatgtaga gagaattatt 3240

tatttaaata ttttaagttt atttataaaa aattgagttc tttccgataa cttcagttca 3300

tttccacctc aaagtccaac tcgacgtgaa aagcagaatt ttgctagtca aaacttggat 3360

ccaacaatta tttagaataa attgagttct ttccgataac ttcagttcat ttccacctca 3420

aagtccaact cgacgagaaa aacagaattt tgctagtcaa aacttggatc caatgaaaag 3480

caccaaaatt ttggttttaa attacaaaat aatgtatact ctaggttttt gtcctatgca 3540

agtgatttta cggtcttaaa ataaagcatc aatcaatccc ttaaacacac acaaagccct 3600

ctaatacatt tgctgagatg cttccgcaat tcactgcagt gtggtttgtg aggatgaaaa 3660

gcaagcagtg gcagtgaaaa gtcagttgca gcaacttgct aggcccatgt acagtaatcc 3720

acctgttcat ggtgcgctcg ttgtttctac catccttgga gatccaaact tgaaaaagct 3780

atggcttggg gaagtgaagg taatgtgatt agaacgagat aaagatttat gattgtataa 3840

ctatcattgg tattttgacg acagatagga actaggaacc ttgctattaa agatattttc 3900

ttgccttaat tttgaaaaaa gggaattttc tcgctttttt ggaatgtatg agatttggat 3960

agaactatca catggaaatg ctgtaccatt ttctgctact cacatggaaa agatcctttt 4020

cttttgctga tctgtttaag caccaatttg ccatagcttt gttgtcctat attttcagcc 4080

acagaaataa gtctaaacca gtcccaagct ttaataagct ttcattgcgt ggtagtgtca 4140

gccgcataaa ttggtcagtg cagccattaa ctgttttctt catggggcct gttaaccttg 4200

tatttctcca aggtcaagtt gttggtgttg tggctgcttt ttagctttgt actcattatc 4260

agagcatcat atgttaaacg taaaggttca atgactaaga gttttttttc cagggcatgg 4320

ctgatcgcat catcgggatg agaactgctt taagagaaaa ccttgagaag aagggctcac 4380

ctctatcgtg ggagcacata accaatcagg tattgaaatc aatgacttct gttgcgttct 4440

atactagtat ataactatta gaacactatg gctcacctat tgccccatta atactcgata 4500

ctgcctacag attggcatgt tctgctatag tgggatgaca cccgaacaag ttgaccgttt 4560

gacaaaagag tatcacatct acatgactcg taatggtcgt atcaggtata atcactcatt 4620

cacgaatttc tgcttaatgc tccggtgttc ttgtacgagt taatatctca ttaatttttc 4680

cactatgtta tactgtgtgt tttgtatgtt gtgcagtatg gcaggagtta ctactggaaa 4740

tgttggttac ttggcaaacg ctattcatga ggttaccaaa tcagcttaa 4789

<210> 8

<211> 425

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 8

Met Ala Ile Arg Ala Ala Ile Ser Gly Arg Ser Leu Lys His Ile Ser

1 5 10 15

Ser Ser Val Gly Ala Arg Ser Leu Ser Ser Leu Trp Arg Asn Val Glu

20 25 30

Pro Ala Pro Lys Asp Pro Ile Leu Gly Val Thr Glu Ala Phe Leu Ala

35 40 45

Asp Pro Thr Pro His Lys Val Asn Val Gly Val Gly Ala Tyr Arg Asp

50 55 60

Asp Asn Gly Lys Pro Val Val Leu Glu Cys Val Arg Glu Ala Glu Arg

65 70 75 80

Arg Ile Ala Gly Ser Phe Asn Met Glu Tyr Leu Pro Met Gly Gly Ser

85 90 95

Val Asn Met Ile Glu Glu Ser Leu Lys Leu Ala Tyr Gly Glu Asn Ser

100 105 110

Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Ile Ala Ala Ile Gln Ala Leu Ser Gly

115 120 125

Thr Gly Ala Cys Arg Ile Phe Ala Asp Phe Gln Arg Arg Phe Cys Pro

130 135 140

Asp Ser Gln Ile Tyr Ile Pro Val Pro Thr Trp Ser Asn His His Asn

145 150 155 160

Ile Trp Arg Asp Ala His Val Pro Gln Lys Thr Tyr His Tyr Tyr His

165 170 175

Pro Glu Thr Lys Gly Leu Asp Phe Thr Ala Leu Met Asp Asp Ile Lys

180 185 190

Asn Ala Pro Asn Gly Ser Phe Phe Leu Leu His Ala Cys Ala His Asn

195 200 205

Pro Thr Gly Val Asp Pro Thr Glu Glu Gln Trp Arg Glu Ile Ser His

210 215 220

His Phe Lys Val Lys Gly His Phe Ala Phe Phe Asp Met Ala Tyr Gln

225 230 235 240

Gly Phe Ala Ser Gly Asn Pro Glu Lys Asp Ala Lys Ala Ile Arg Ile

245 250 255

Phe Leu Glu Asp Gly His Pro Ile Gly Cys Ala Gln Ser Tyr Ala Lys

260 265 270

Asn Met Gly Leu Tyr Gly Gln Arg Val Gly Cys Leu Ser Val Val Cys

275 280 285

Glu Asp Glu Lys Gln Ala Val Ala Val Lys Ser Gln Leu Gln Gln Leu

290 295 300

Ala Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Val His Gly Ala Leu Val Val

305 310 315 320

Ser Thr Ile Leu Gly Asp Pro Asn Leu Lys Lys Leu Trp Leu Gly Glu

325 330 335

Val Lys Gly Met Ala Asp Arg Ile Ile Gly Met Arg Thr Ala Leu Arg

340 345 350

Glu Asn Leu Glu Lys Lys Gly Ser Pro Leu Ser Trp Glu His Ile Thr

355 360 365

Asn Gln Ile Gly Met Phe Cys Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Gln Val

370 375 380

Asp Arg Leu Thr Lys Glu Tyr His Ile Tyr Met Thr Arg Asn Gly Arg

385 390 395 400

Ile Ser Met Ala Gly Val Thr Thr Gly Asn Val Gly Tyr Leu Ala Asn

405 410 415

Ala Ile His Glu Val Thr Lys Ser Ala

420 425

<210> 9

<211> 4551

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 9

atggcaaatt cctccaattc tgtttttgcg catgttgttc gtgctcctga agatcccatc 60

ttaggagtac gtccctttcc actctttcta ttttacattt ccactgaata tgtttcttct 120

gtggctcctt taataatctt ccgtaaatat actattagtg gatttgataa gctacttctc 180

tctccctctc tcttttattt tcttattttg ggttagatta aaatgaacat taattaatga 240

tcagatgatt tggttaaaga tgatatctag gagatcggca taaataagtt gattggaatg 300

atcgctatag ggtttcctat tgtatgcatt ggatcatgga tgtgtgcgct aattatttaa 360

tagtacttct ttctttttac tgtgatctgg caattcctta ttttattcct ggtgtagttg 420

atgaaaggtg tagatttgat tctttaactt gctctattga gaaggtaatt tgtgcttctc 480

aagtgtttat taatgttgtt ttcttctgtt gtgttacttc attaaaacag gtcacagttg 540

cttataacaa agataccagc ccagtgaagt tgaatttggg tgttggcgca tatcgcactg 600

aggtctgcca cttctacttt gtctcgttgt tctttattat tattattttt ttattatagc 660

caaaaaaagt tgccccttga atggatttgg tcctgctatg tgttgaatcc ttggttaagt 720

ttttctttaa taggctcctt cacaaggata gaaaattgta gacactgatg cttacacatt 780

agtaatattt tttcccctga tgcataatga agtgaaacca cttgtgcttc taaaaaatca 840

tactttgggg caaggtgaag tacacatttt tataagtggt tgtttttttc ttcaatcttg 900

agttgaatgt tagtgttaag taggagccgc aaacgggcgg gtcgggtcgg atttggttca 960

gatcgaaaat gggtaatgaa aaaacaggta aattatctga ctcgacccat atttaatacg 1020

gataaaaaca ggttaaccgg cggataatat gggtaaccat attattcatg tcttcttgca 1080

tatgatcaat tatgggagaa ttcttagcct caaatgggaa cccccaattt gaggctttac 1140

aaatttaaaa gttagaccca ttggttaacc attttctaaa tggataatat ggttcttatc 1200

catatttgac ccatttttaa aaagttcatt atccaaccca ttttttagtg gataatatgg 1260

gtgtttaact gatttctttt aaccattttg acacccctag tgttaagctt gaaaacgact 1320

aatgcatagt ctgatgacaa cttgcaggaa ggaaagcccc ttgttcttaa tgtggtgaga 1380

cgggctgaac aaatgctcgt caatgacacg taacttgcca aattagaaac tagcttacag 1440

attttctttt gagatatgat cacctgatac caagattgga atctaaggct gctatgatgc 1500

aggtctcggg tgaaggagta tctctcaatt actggactag cggattttaa caaactgagt 1560

gcaaagctta tatttggtgc tgacaggttt ggagattttt tggtgcagtt gctcttgata 1620

aatgcttgag tcaatttttt ttaaaaaaaa tgctcactat ccatgtcgct ctatttaaac 1680

ctatcttgcc aaaccacttg tataaatgaa aatgagccgt cgatattctt ccttccatct 1740

agtttgatat ttgaattaga gattgttgct aaaagggaat gctttatctc tacagcgtag 1800

agtaactgaa tacctgttaa acatgttcct ccgtatttca tcttattatg atgccttgca 1860

tctgaagaaa attgttctag agttaacttt ctctcctctt tgttgtactg attatctgtg 1920

tgtggtgaac gcgatatcag gaaatatgtg tcttctgtca ctattactcc ttgttaagtc 1980

atatgtaatt gacttgttat gatatcaaca gatttactta tgtttagatg tagtttaaat 2040

gctttttgtg ctgttttgtt gcttatacag ccctgccatt caagagaaca gggtgactac 2100

tgttcagtgc ttgtcgggca caggttcttt gagggttggg gctgaatttc tggctaagca 2160

ttatcatgaa gttagtattc cttgctctct ttccctttat atgtctaaat caaatggaca 2220

cttgtataag cttctactgt ttgttttgtt gccagcatac catatatata ccacagccaa 2280

catggggaaa ccatccgaag gttttcactt tagccgggct ttcagtaaaa tattaccgtt 2340

actacgaccc agcaacacga ggcctggatt tccaaggtac tactgtaatc actgttctta 2400

aagttctaca gttgtaagta agagccgatt tctctttttt atggacaagt gaactttctc 2460

ctggtcgtgt ctagaaagat ctatatttta tgtgtagcta gcacaggatc tttatttatt 2520

taattttgta ttctcttggt aaagatataa gcatagttta tctgtggctt ttcctgtatt 2580

tgggtgttgc atatcaaatt taatcatgaa ccctgtagga cttttggatg atcttgctgc 2640

tgcacccgct ggagcaatag ttcttctcca tgcatgtgct cataacccaa ctggcgttga 2700

tccaacaaat gaccagtggg agaaaatcag gcagttgatg aggtccaagg gcctgttgcc 2760

tttctttgac agtgcttacc aggtaaagct tatgatggga ttttgaattc aagtgatact 2820

tcgttaagaa tgattaccaa ataatttgaa gcgccaaact atgtattaat gggctgccca 2880

acggaccctt actataatga atatttttga tattgcaggg ttttgccagt ggcaacctag 2940

atgcagatgc acaatctgtt cgcatgtttg tggctgatgg tggtgaatgt cttgcagctc 3000

agagttatgc caaaaacatg ggactgtatg gggagcgtgt tggtgccctt agcattgtaa 3060

gtccttttgt cggttgtaat tgctttccct ttttagtaag cgataaaatt ggtggctgaa 3120

gaactatcca tggctatatc atgctatcta tgtctaaaga tgattttcct tgaaagcata 3180

attcaggtta tattccctag aaggctaaaa agaagttgtt ctgatggtac aatgaacaca 3240

gtctctagag atattgaaag ccaaattttt gaatatggct tcccctttga ttgtaattgg 3300

aaaacaaaga gaaggacaga gtggaattag taccggattg tatgtttagg aaaaagtgtc 3360

attttgtttg agttttatca gacagacact aaaagctgac taacagtaca ataaaatttt 3420

gtgttgtgtt ataggtttgc aaagacgcag atgttgcaag cagagtcgaa agccagctaa 3480

agctggttat caggccaatg tactctaatc caccaattca tggtgcgtct attgttgcta 3540

ctatactcaa ggacaggttt gtgcaactat ttacaagatt ctgttttgct gttagtagat 3600

gctatacctt ctacattttg atgtggtttc tcatctaatg gtgatagaca aatgtacgat 3660

gaatggacaa ttgagctgaa agcaatggcc gacaggatta ttagcatgcg ccaacaactc 3720

tttgatgcct tgcaagctcg aggtatttga tcttcatatt tgttctttct ggggaagcat 3780

actgtattct gtatgatggg tttgactgct actgcaatag gagctttttc ctgaaaagta 3840

ccatggtgaa acaaccacgg caactaaatc ttttgacttc attgttcagt ttagtgctaa 3900

tgtaagtttt attctgttat gcaggtacga caggtgattg gagtcatatc atcaagcaaa 3960

ttggaatgtt tactttcaca ggattaaata ctgagcaagt ttcattcatg actagagagc 4020

atcacattta catgacatct gatgggtaag gacatctgac tattgatatt ttttttattt 4080

gtttagtttg ttactttggg ttgctttttt ctcagtagaa acttaaataa ttggaactta 4140

gaagtccttc gttgattatt tcggcttgaa ttctttaata aggagaattt cagatttata 4200

gcttcagttt ggagaggaag cataaacaag tctgtcatcc atacttaaaa tttacagaaa 4260

aaagtgcagt tctgttttcc cccctcccag attagactaa ttcccaaaag aacttacctt 4320

caatctatgg aacatttagt attctggtat cagttgaaac atctctttgt tgaagttaag 4380

attttggtta aaaagatctt catctctagt aacattttct acattccatt tttagaagga 4440

atgattttct cctttctcat ttgcaggaga attagcatgg caggccttag ttctcgcaca 4500

attcctcatc ttgccgatgc catacatgct gctgttacca aagcggccta a 4551

<210> 10

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 10

Met Ala Asn Ser Ser Asn Ser Val Phe Ala His Val Val Arg Ala Pro

1 5 10 15

Glu Asp Pro Ile Leu Gly Val Thr Val Ala Tyr Asn Lys Asp Thr Ser

20 25 30

Pro Val Lys Leu Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr Arg Thr Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Pro Leu Val Leu Asn Val Val Arg Arg Ala Glu Gln Met Leu Val

50 55 60

Asn Asp Thr Ser Arg Val Lys Glu Tyr Leu Ser Ile Thr Gly Leu Ala

65 70 75 80

Asp Phe Asn Lys Leu Ser Ala Lys Leu Ile Phe Gly Ala Asp Ser Pro

85 90 95

Ala Ile Gln Glu Asn Arg Val Thr Thr Val Gln Cys Leu Ser Gly Thr

100 105 110

Gly Ser Leu Arg Val Gly Ala Glu Phe Leu Ala Lys His Tyr His Glu

115 120 125

His Thr Ile Tyr Ile Pro Gln Pro Thr Trp Gly Asn His Pro Lys Val

130 135 140

Phe Thr Leu Ala Gly Leu Ser Val Lys Tyr Tyr Arg Tyr Tyr Asp Pro

145 150 155 160

Ala Thr Arg Gly Leu Asp Phe Gln Gly Thr Thr Val Ile Thr Val Leu

165 170 175

Lys Val Leu Gln Leu Tyr Lys His Ser Leu Ser Val Ala Phe Pro Val

180 185 190

Phe Gly Cys Cys Ile Ser Asn Leu Ile Met Asn Pro Val Gly Leu Leu

195 200 205

Asp Asp Leu Ala Ala Ala Pro Ala Gly Ala Ile Val Leu Leu His Ala

210 215 220

Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Thr Asn Asp Gln Trp Glu

225 230 235 240

Lys Ile Arg Gln Leu Met Arg Ser Lys Gly Leu Leu Pro Phe Phe Asp

245 250 255

Ser Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Asn Leu Asp Ala Asp Ala Gln

260 265 270

Ser Val Arg Met Phe Val Ala Asp Gly Gly Glu Cys Leu Ala Ala Gln

275 280 285

Ser Tyr Ala Lys Asn Met Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Val Gly Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Val Cys Lys Asp Ala Asp Val Ala Ser Arg Val Glu Ser Gln

305 310 315 320

Leu Lys Leu Val Ile Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Ile His Gly

325 330 335

Ala Ser Ile Val Ala Thr Ile Leu Lys Asp Arg Gln Met Tyr Asp Glu

340 345 350

Trp Thr Ile Glu Leu Lys Ala Met Ala Asp Arg Ile Ile Ser Met Arg

355 360 365

Gln Gln Leu Phe Asp Ala Leu Gln Ala Arg Gly Thr Thr Gly Asp Trp

370 375 380

Ser His Ile Ile Lys Gln Ile Gly Met Phe Thr Phe Thr Gly Leu Asn

385 390 395 400

Thr Glu Gln Val Ser Phe Met Thr Arg Glu His His Ile Tyr Met Thr

405 410 415

Ser Asp Gly Arg Ile Ser Met Ala Gly Leu Ser Ser Arg Thr Ile Pro

420 425 430

His Leu Ala Asp Ala Ile His Ala Ala Val Thr Lys Ala Ala

435 440 445

<210> 11

<211> 4176

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 11

atggcaaatt cctccaattc tgtttttgcc catgttgttc gtgctcctga agatcccatc 60

ttaggagtac ctccctttcc actctttcta ttttacattt ccactgaata tgtttcttct 120

gtggctcctt taataatctt ccgtaaatat attattagtg gatttgataa gctacttctc 180

tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctt ttattttctt 240

attttgggtt agattagaat gaacattaat taatgatcag atgattaggt taaaaatgat 300

atcttggaga tcggcataaa taagttgatt ggaatgatcg ctatagggtt acctattgta 360

tgcattggat catggatgtg tttactaatt atttaatacc tctttctttt tactgtgatc 420

tggcaattcc ttattttatt cctggtgtgg ttgatggaag ggtgtagatt tgattcttta 480

acttgctcta ttgagaagat aatttgttct tctcaagtgt ttagtaatgg tttttttcct 540

gttgtgctac ttcattaaaa caggtcacag ttgcttataa caaagatacc agcccggtga 600

agttgaattt gggtgttggc gcatatcgca ctgaggtctg ccacttctac tttgtctcgt 660

tattctttat tttttatttt ttattataac caaaataagt tgccccttga atggatttgg 720

tcctgctatg ttttgttgaa tccttggtta agtttttctt taataggctc cttcacaagg 780

atacaaaatt gtagacactg atgcatacac attaatattt tttttccctg atgcataatg 840

aagtgaaacc acttgatttt ataagtggtt gtttttttct tcaatcttga gttggatgtt 900

agtgttaagc ttgaaaatta tgttctacta atgcatagtc cgatgacaac ttgcaggaag 960

gaaagcccct tgttcttaat gtggtgagac gagctgaaca aatgctcgtc aatgacacgt 1020

aacttgccaa attagaaact agcttacaga ttttcttttg agatatgatc acctgatgcc 1080

atgattggaa tctaaggctg atatgatgca ggtctcgggt gaaggagtat ctctcaatta 1140

ctggactagc ggattttaac aaactgagtg caaagcttat atttggatct gacaggtttg 1200

gagaattttt ggtgcagttg ctcttgataa atgcttgaat caaaaatata aaaaaatgct 1260

cactatccat gtcgctccag ttaaacctat cttgccaaac cacttgtata aaagaaaatg 1320

agccttcaat attcttcctt ccatctagtt tgatatttga atgagagatt gttgctaaaa 1380

gggaatgctt tatctctaca aagtagagta actgaatacc tgttaaaaca tattcctccg 1440

tatttcatct tattatgatg ccttgcatca gaagaaaatt gttctagagt taactttctc 1500

tcctctttgt tgtactgact ttctgtgtaa ggtgaacgtg atatcaggaa atatgtgtct 1560

tctatcacta ttactccttg ttaagtcata tgtaagatat cagcagattt acttatcttt 1620

agatgtagtt taaatgcttt ttgtgctgtt ttgttgctga tacagccctg ccattcaaga 1680

gaacagggtg actactgttc agtgcttgtc gggcacaggt tctttgaggg ttggggctga 1740

gtttctggct aagcattatc atgaagttag tattccttgc tctctttccc tttatatgtc 1800

taaatcaaat ggacacttct ataagcttct actgtttgtt ttgttgccag catactatat 1860

atataccaca gccaacatgg ggaaaccatc cgaaggtttt cactttagct gggctttcag 1920

taaaatatta tcgttactac gacccagcaa cacgaggcct ggatttccaa ggtactactg 1980

taatcaatgt tcttaaagtt ctacagttgt aagtaagaac cgatttctct ttttcatgga 2040

caagtgaact tgctcctggt cgtgtctaga aagatctata tattatgtgt agctagcaca 2100

ggatctttat ttatttaatt ttgtattctg ttggtaaaga tataagcata gtttatctgt 2160

ggcttctcct gtatttgggt gttgcgtatc aaatttaatc atgaaccctg taggactttt 2220

ggatgatctt gctgctgcac ccgctggagt aatagttctt ctccatgcat gtgctcataa 2280

cccaactggc gttgatccaa caaatgacca gtgggagaaa atcaggcagt tgatgaggtc 2340

caaggggctg ttacctttct ttgacagtgc ttaccaggta aagcttatga tgggattttg 2400

aattcaagtg atacttcgtt aagaatgatt accaaataat ttgaagcccc aaactatgta 2460

ttaatgggct gctcaatgga cccctactat aatgaatatt tttgatattg cagggttttg 2520

ccactggcaa cctagatgca gatgcacaat ctgttcgcat gtttgtggct gatggtggtg 2580

aatgtcttgc agctcagagt tatgccaaaa acatgggact gtatggggag cgtgttggtg 2640

cccttagcat tgtaagtcct tttgtcggtt gtaattgctt tcccttttta ataagcaata 2700

aaattgcttt ccctttttaa taagcaatat agcatgatat ccatggctat atcatgctat 2760

ttatgtctaa agatgatttt ttctttggaa gcataattca ggttatattc cctaaaaggc 2820

taaaaagagg ttgttctgtt ggtacaatga acacagtctc tagagatatt gaaagccaat 2880

tttttgaaga tggcttccac ttagattgta attggaaaag aaagagaagg acaaagtgga 2940

attagtaccg gattgtatgt ttaggaaaaa gtgtcgtttt ttttgagttt tatcagacag 3000

gtactaaaag ctgactaaca ctacaataaa attttgtgtt gtgttatagg tttgcaaaga 3060

tgcagatgtt gcaagcagag tcgaaagcca gctaaagctg gttatcaggc caatgtactc 3120

taatccacca attcatggtg cgtctattgt tgctactata ctcaaggaca ggtttgtaca 3180

actatataca agattctgtt ttgttgttag tagatgctat accttctaca ttttgatgtg 3240

gttgctcatc taatggtgat agacaaatgt acgatgaatg gacaattgag ctgaaagcaa 3300

tggccgacag gattattagc atgcgccaac aactctttga tgccttgcaa gctcgaggta 3360

tctgatcttc atatttgttc tttctaggga agcatactgt attctgtatg atgggtttga 3420

ctgctactgc aataggaact ttttctggaa aagtgccagg gtgaaagaac cacggcaact 3480

aaatcttctg acttcattgt tcagtttagt gctaatgtaa gttttattct gttatgcagg 3540

tacagcaggt gattggagtc atatcatcaa acaaattggc atgtttactt tcacaggatt 3600

gaatactgag caagtttcat tcatgactag agagcatcac atttacatga catctgatgg 3660

gtaaggacat ctgactgttg atattttttt ttatttgttt agtttgttac tttgggttgc 3720

ttttttctca gtagaaactt aaataattgg aacttagaag cccttatcat tgattatttc 3780

ggcttgaatt ctttaataag gagaatttca gacttatagc ttcagttttg agaggaagca 3840

taaacaagtc cagctctgtc attcatactt aaaatttaca gaagaaagtg cagttctgtt 3900

tttcccccct cccaaattat attgattctc aaaagaactt accttcaatc tatggcacat 3960

ttagtaatct ggtatcagtt gaaacatctc tttgttgaag ttaagatttt ggttaaaaag 4020

atcatcatct ctagtgacat tttctacttt ccatttttag aaggaatgat tttctccttt 4080

ctcatttgca ggagaattag catggcaggc cttagttctc gcacaattcc tcatcttgcc 4140

gatgccatac atgctgctgt taccaaagcg gcctaa 4176

<210> 12

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 12

Met Ala Asn Ser Ser Asn Ser Val Phe Ala His Val Val Arg Ala Pro

1 5 10 15

Glu Asp Pro Ile Leu Gly Val Thr Val Ala Tyr Asn Lys Asp Thr Ser

20 25 30

Pro Val Lys Leu Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr Arg Thr Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Pro Leu Val Leu Asn Val Val Arg Arg Ala Glu Gln Met Leu Val

50 55 60

Asn Asp Thr Ser Arg Val Lys Glu Tyr Leu Ser Ile Thr Gly Leu Ala

65 70 75 80

Asp Phe Asn Lys Leu Ser Ala Lys Leu Ile Phe Gly Ser Asp Ser Pro

85 90 95

Ala Ile Gln Glu Asn Arg Val Thr Thr Val Gln Cys Leu Ser Gly Thr

100 105 110

Gly Ser Leu Arg Val Gly Ala Glu Phe Leu Ala Lys His Tyr His Glu

115 120 125

His Thr Ile Tyr Ile Pro Gln Pro Thr Trp Gly Asn His Pro Lys Val

130 135 140

Phe Thr Leu Ala Gly Leu Ser Val Lys Tyr Tyr Arg Tyr Tyr Asp Pro

145 150 155 160

Ala Thr Arg Gly Leu Asp Phe Gln Gly Thr Thr Val Ile Asn Val Leu

165 170 175

Lys Val Leu Gln Leu Tyr Lys His Ser Leu Ser Val Ala Ser Pro Val

180 185 190

Phe Gly Cys Cys Val Ser Asn Leu Ile Met Asn Pro Val Gly Leu Leu

195 200 205

Asp Asp Leu Ala Ala Ala Pro Ala Gly Val Ile Val Leu Leu His Ala

210 215 220

Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Thr Asn Asp Gln Trp Glu

225 230 235 240

Lys Ile Arg Gln Leu Met Arg Ser Lys Gly Leu Leu Pro Phe Phe Asp

245 250 255

Ser Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Thr Gly Asn Leu Asp Ala Asp Ala Gln

260 265 270

Ser Val Arg Met Phe Val Ala Asp Gly Gly Glu Cys Leu Ala Ala Gln

275 280 285

Ser Tyr Ala Lys Asn Met Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Val Gly Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Val Cys Lys Asp Ala Asp Val Ala Ser Arg Val Glu Ser Gln

305 310 315 320

Leu Lys Leu Val Ile Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Ile His Gly

325 330 335

Ala Ser Ile Val Ala Thr Ile Leu Lys Asp Arg Gln Met Tyr Asp Glu

340 345 350

Trp Thr Ile Glu Leu Lys Ala Met Ala Asp Arg Ile Ile Ser Met Arg

355 360 365

Gln Gln Leu Phe Asp Ala Leu Gln Ala Arg Gly Thr Ala Gly Asp Trp

370 375 380

Ser His Ile Ile Lys Gln Ile Gly Met Phe Thr Phe Thr Gly Leu Asn

385 390 395 400

Thr Glu Gln Val Ser Phe Met Thr Arg Glu His His Ile Tyr Met Thr

405 410 415

Ser Asp Gly Arg Ile Ser Met Ala Gly Leu Ser Ser Arg Thr Ile Pro

420 425 430

His Leu Ala Asp Ala Ile His Ala Ala Val Thr Lys Ala Ala

435 440 445

<210> 13

<211> 4857

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 13

atggtttcca caatgttctc tctagcttct gccactccgt cagcttcatt ttccttgcaa 60

gataatctca aggtaatttc atcgtcaatt acattatttg gaaatttgcc ttatcttaga 120

ctattcctaa tgaggtggat tcatgctgtt gtttgtgttt gaacagtcaa agctaaagct 180

ggggactact agccaaagtg cctttttcgg gaaagacttc gtgaaggcaa aggtaggatt 240

tttgtgttgt ttgtgtacat ttggtgagag gtaatagctc tactgctata gagaaactcc 300

ctgtaggttc tgtcctttag agtatagaag agaaggaaag agtttaattg ggaataatgg 360

tggggatggg atgatttgca tacaattgaa catgtgtttc ttgctttggt atattatgat 420

ataggatgat ccaatcatgc tccgtaaatc aactccagaa cttattattc tttcggcact 480

tactaattat aaaaatcggg ttggagtcct gaaaataagt gattgcctaa ccaacttaca 540

gaactaattt tattatccgt atactcaaat caaaacgaca ttatgccagt actggtttct 600

tgagagggat gatattagtg tagaattatt tataaagttg cagtttaacg tagggtgttt 660

tactaaccag aaaggtgtag atgattccat tcagtttatt agatgctaag aagtataaca 720

gtgaggcctg tgaaacttct ggtagtacca acgattgggg ttttatggcg tttaggaatt 780

tagacattaa ttggcacatt ttagaacgaa aaatatgaca tttaacttac aacagttctt 840

ttctgaataa aatattacta gtaactaatt tgtttgaact ttgccattgc taaaatgtgg 900

ctcaagatct tcttggtact tctatttgta atatcagagt tataggggtc taattctagc 960

tcttgagtcg aaattgttat tagtaaagat aattctttct tgtccccctt cagtgctaac 1020

attctcatct tcacttatgg tattggttta taaaaaattg tgattcagat tataaagtaa 1080

aaaattatgc ctcagtttgt acagcatttt gggttatctg acgttcaatt caacagggtt 1140

ctttaatatc tatttttcta tcttttgtaa tcattgcaac accgagctgt ttaatgtgct 1200

caaaggctat tattagtcct cccactcacc agatccttag aaaaaagccc agaagagaaa 1260

ggcaaagaat acaagcccag accgattgct cgttttataa attttgggaa ttgggatctc 1320

ttttctcata ttcttacttt tttctctttc tttttttcca gtcaaatggc cgtactacta 1380

tgactgttgc tgtgaacgtc tctcgatttg agggaataac tatggctcct cctgacccca 1440

ttcttggagt ttctgaagca ttcaaggctg atacaaatga actgaagctt aaccttggtg 1500

ttggagctta ccgcacggag gagcttcaac catatgtcct caatgttgtt aagaaagtaa 1560

gttcttggtc tcttgtttat gctcaagtag tttgtaaact tttagtcact tggccttgtt 1620

cccatgggtg gatacccttg tccaagggga gtcaatttat tacactctgt aaataggtta 1680

attctttttt aaaatgtatg tatgtatgta tgtatgtatg tatgtataca cacacactat 1740

gttgaatcgc ccctggcttc ttctgtttac ttctatatat tttgtatcca atgggtgaaa 1800

attctggagt gactgcttgt tcctaagcgt tcatcattca ttaactgttt taataacctt 1860

ctataatttt gcatctgaat gatgaggaaa ttgcttttct gtaggcagaa aaccttatgc 1920

tagaaagagg agataacaaa gaggtacttg atttactaaa ttcatctttt ggccttgact 1980

agtgtcactt ggtgccaatt cttacttatt ttttaatcta tggatatata gtatcttcca 2040

atagaaggtt tggctgcatt caacaaagtc acagcagagt tattgtttgg agcagataac 2100

ccagtgattc agcaacaaag ggtaagtatt tttgttttta actcttagga aaatatatcc 2160

tggaacaaac atgtaaattt ggtctctatg gcctttgttg tgaacgacgt tgtacctttc 2220

gtgatcaggt ggctactatt caaggtctgt caggaactgg gtcattgcgt attgctgcag 2280

cactgataga gcgttacttc cctggctcta aggttttaat atcatctcca acctggggta 2340

cgtagatagt gcttttggat taatttggtt gaatctcatg atactgattt ttacagttat 2400

gttttgcagg aaatcataag aacattttca atgatgccag ggtgccttgg tctgaatatc 2460

gatattatga tcccaaaaca gttggcctgg attttgctgg gatgatagaa gatattaagg 2520

ttattatcgt cctcgcattt gtaatctttg tggttgaaat tgtaaagcag cagtgagcac 2580

tgtctttttc ctttctccac aagtcaattg atggtgcctt tgtttgtggc acgtgttttg 2640

actttcagta attgaaggag agatgcgttg ttcattctag aatagcactg tatctcccaa 2700

ttgcattttc tgtttcctgt tcttcctccc tatgtttgca ttgatccatg tctctgctaa 2760

acatggacaa tttgcgccct tggcaatgac atgtgtgttg cttgcttttc ttctctttct 2820

atttcttggt aggagtgact tggttctttc aatgtgagca gtcatatttc tgaaaatgaa 2880

aatcagagga acttgggatg tggaagggat tggcagaaca agtttgataa tgtaattttt 2940

cttgtgagga tggaatatgc aaaaataggc tgcacgcttg ccttttagat ctttggttcc 3000

tatgtcggtt gtgaatgtag atttctattt ttcaacattg tctcgcaagg aaaataggat 3060

tatccagtat tggatgtctt tcctatgttt gatatgtgta tgtgcagtct tgtttgaccg 3120

tcttgctctc ttcccacgtc taaaaagaga gtctgatggg aaagtttttt tccttccagt 3180

tcttgtgcaa gtcattgaca tagtttatgg cattacttgt ttataggctg ctcctgaagg 3240

atcatttatc ttgctccatg gctgtgcgca caacccaact ggtattgatc ccacaattga 3300

acaatgggaa aagattgctg atgtaattca ggagaagaac cacattccat tttttgatgt 3360

cgcctaccag gtaatctgtg ctaaacccaa ttatttcatt tggtgaagct gtaaaatttc 3420

aagtttctta gaagttttga tggttgtgtg tgcgtgtgaa gagaatgaat gatataggaa 3480

ttggttttga aatagtgaaa gatctctcgt atttcatttg ttcttttggt gtgaggagag 3540

tatacattgt tgttttgata gatgggcaaa ttcgatagat gaaggtggtt aagccacgtg 3600

ttactttgta attttttttt gacaccgtca tggtgtttat caataaaatt tactgatttt 3660

tcagtaaagt tattagaaca agataatctg aagtcatttc tattcagaga attgcattga 3720

atagctgtat actataataa tcgagatgcc tcatctgtct acacgctgcc ctacagggat 3780

ttgcaagcgg cagccttgac gaagatgcct catctgtgag attgtttgct gcacgtggca 3840

tggagctttt ggttgctcaa tcatatagta aaaatctggg tctgtatgga gaaaggattg 3900

gagctattaa tgttctttgc tcatccgctg atgcagcgac aaggtacagt cacccgcact 3960

agcaactaca taattgtcct ctgtatagga aaaatgatgc actggaaaac aatggttcca 4020

tatgaaatgc caattacgag atgctgtccc tttgctttga tattgtttac tacaattggt 4080

atctcccatc acctgagcct atggcttgat tggattttat gtgggcgaac caatagaatt 4140

atttgcttaa ttttctcaac taatggatgc atctctgcta actcacaggg tgaaaagcca 4200

gctaaaaagg cttgctcgac caatgtactc aaatccccca attcacggtg ctagaattgt 4260

tgccaatgtc gttggaattc ctgagttctt tgatgaatgg aaacaagaga tggaaatgat 4320

ggcaggaagg ataaagagtg tgagacagaa gctatacgat agcctctcca ccaaggataa 4380

gagtggaaag gactggtcat acattttgaa gcagattgga atgttctcct tcacaggcct 4440

caacaaagct caggtaaatc cccgtgattt aagctattgc ttcatcacaa tatgcttaaa 4500

ttcaatttga tcattcatcg caaagcacat tctgaactca gcacatattt tcattaacac 4560

attctttccg tcctttctga tcaattccat aagtccgata tgcaaaagat agtgcagtga 4620

gagtctctta ctggagtata actagattat cgacaatgca tacatttctt tccctgtacc 4680

tgcacttctg gtgctcatat ttgatctctc ttcttggcca cgcagagcga gaacatgacc 4740

aacaagtggc atgtgtacat gacaaaagac gggaggatat cgttggctgg attatcagct 4800

gctaaatgcg aatatcttgc agatgccata attgactcgt actacaatgt cagctaa 4857

<210> 14

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 14

Met Val Ser Thr Met Phe Ser Leu Ala Ser Ala Thr Pro Ser Ala Ser

1 5 10 15

Phe Ser Leu Gln Asp Asn Leu Lys Ser Lys Leu Lys Leu Gly Thr Thr

20 25 30

Ser Gln Ser Ala Phe Phe Gly Lys Asp Phe Val Lys Ala Lys Ser Asn

35 40 45

Gly Arg Thr Thr Met Thr Val Ala Val Asn Val Ser Arg Phe Glu Gly

50 55 60

Ile Thr Met Ala Pro Pro Asp Pro Ile Leu Gly Val Ser Glu Ala Phe

65 70 75 80

Lys Ala Asp Thr Asn Glu Leu Lys Leu Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr

85 90 95

Arg Thr Glu Glu Leu Gln Pro Tyr Val Leu Asn Val Val Lys Lys Ala

100 105 110

Glu Asn Leu Met Leu Glu Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Leu Pro Ile

115 120 125

Glu Gly Leu Ala Ala Phe Asn Lys Val Thr Ala Glu Leu Leu Phe Gly

130 135 140

Ala Asp Asn Pro Val Ile Gln Gln Gln Arg Val Ala Thr Ile Gln Gly

145 150 155 160

Leu Ser Gly Thr Gly Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ala Leu Ile Glu Arg

165 170 175

Tyr Phe Pro Gly Ser Lys Val Leu Ile Ser Ser Pro Thr Trp Gly Asn

180 185 190

His Lys Asn Ile Phe Asn Asp Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Tyr Arg

195 200 205

Tyr Tyr Asp Pro Lys Thr Val Gly Leu Asp Phe Ala Gly Met Ile Glu

210 215 220

Asp Ile Lys Ala Ala Pro Glu Gly Ser Phe Ile Leu Leu His Gly Cys

225 230 235 240

Ala His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Ile Glu Gln Trp Glu Lys

245 250 255

Ile Ala Asp Val Ile Gln Glu Lys Asn His Ile Pro Phe Phe Asp Val

260 265 270

Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Ser Leu Asp Glu Asp Ala Ser Ser

275 280 285

Val Arg Leu Phe Ala Ala Arg Gly Met Glu Leu Leu Val Ala Gln Ser

290 295 300

Tyr Ser Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Gly Ala Ile Asn

305 310 315 320

Val Leu Cys Ser Ser Ala Asp Ala Ala Thr Arg Val Lys Ser Gln Leu

325 330 335

Lys Arg Leu Ala Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Ile His Gly Ala

340 345 350

Arg Ile Val Ala Asn Val Val Gly Ile Pro Glu Phe Phe Asp Glu Trp

355 360 365

Lys Gln Glu Met Glu Met Met Ala Gly Arg Ile Lys Ser Val Arg Gln

370 375 380

Lys Leu Tyr Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Lys Ser Gly Lys Asp Trp

385 390 395 400

Ser Tyr Ile Leu Lys Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Asn

405 410 415

Lys Ala Gln Ser Glu Asn Met Thr Asn Lys Trp His Val Tyr Met Thr

420 425 430

Lys Asp Gly Arg Ile Ser Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Lys Cys Glu

435 440 445

Tyr Leu Ala Asp Ala Ile Ile Asp Ser Tyr Tyr Asn Val Ser

450 455 460

<210> 15

<211> 5206

<212> ДНК

<213> Nicotiana tabacum

<220>

<221> Другой признак

<222> (4436)..(4436)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 15

atggcttcca caatgttctc tctagcttct gccgctccat cagcttcatt ttccttgcaa 60

gataatctca aggtaatttc attgtgaatt acattatttg gaaatttgcc ctatcttaga 120

ctgttcctaa tgaggtggat tcatgctgtt gtttgtgttt gaacagtcaa agctaaagct 180

ggggactact agccaaagtg cctttttcgg gaaagacttc gcgaaggcaa aggtaggatt 240

tttgtgttgt ttgtgtacat ttggtgagag gtaatagctc tactgatata gagcaactcc 300

ctgtaggttc tgtcctttag agtatagaag agaagagaag agtttaattg ggaataatgg 360

tggggatgga atgatttgca tacaaatgaa catgtgtttc ttgcttttgg tgtatgatat 420

aggatgatcc aatcatgctc cgtaaatcaa ctccagaact tattattctt tcggcacttc 480

taattataaa aatctggttg gagtaatgaa tataagtgat tacctaacca acttacagaa 540

ttgattttat tatccatata ctgaaattca aaaacggcgt tttgccagta ctggtttctt 600

gagagggatg atattaatat agaattattt tataaagttg cagtttaacg tagggtattt 660

tactaactag aaaggtgata gatggttccg ttcagtttat tagaagtata acagtgaggc 720

ctgttaaact tttgctagta tcaatgattg gggttttatg gcgtttagga atttagacat 780

caattggcac attttagaac gaaaaacatg acatttaagt tacatcagtt cttttctgaa 840

taaaatagta ctagtaaata acttgtttga actttgccat ttgctaaaat gtggctcaag 900

atcttcttgg tacttctatt tgtaatatca gagttatagg ggtctaattc taccactgtt 960

ttgagtcaaa atgttattag taaagataat tctttcttgt cccccttcag tgctaacatt 1020

ctcatcttca attatggtat tggtttataa aaaaattgtg cttcagatca ctttataaag 1080

caaaaattat gcctcagttt gtacagcatt ttgggtttta taacattcaa ttcaacaggg 1140

ctctttaata tctatgtttc tactttttgt aatctacatc gagctgttta atgtgctcaa 1200

aggctttaat tagtcctcct actcaccaga tccttagaaa aaagcccaga agagaaaggc 1260

aaagacaacg agctcggaca gattgctcaa tttatattgc aaaaagatcc aaaccctcgg 1320

ggagggagga gcatgaacca aagatgatac attgatatta ttttctaaat ttgggaattg 1380

tgatcttatc ttaaattttt acttttttct ctttttcttt ttttatagtc aaatggtcgg 1440

actactatgg ctgtttctgt gaacgtctct cgatttgagg gaataacaat ggctcctcct 1500

gaccccattc ttggagtttc tgaagcattc aaggctgata caaatgaact gaagcttaac 1560

cttggagttg gagcttaccg cacagaagat cttcaaccct atgtcctcaa tgttgttaaa 1620

aaagtaagtc ctcggtctct tgtttatgct caacgtagtt tgtaaactaa gagtcactta 1680

accttgttcc catgtgttcg tcattaaaca tagtaataac tttctatagt tttgcatctg 1740

aatgatgagg aaattacttt tctgtaggca gaaaacctta tgctagagag aggtgacaac 1800

aaagaggtac ttgatatact aaattcatct tttggcctat tagtgtctct tggtgccatt 1860

tcttacttat tttttgtcca tgaatatata gtatcttcca atagaaggtt tggctgcatt 1920

caacaaagtc acagcagagt tattgtttgg agcagataat ccagtgattc agcaacaaag 1980

ggtaagtatt ttggttttta actcttagca aaaaagtatc ctggaacaaa cttgtagatt 2040

cagtttccac ggattgaatg gcattgtatg tttcttgatc aggtggctac tattcaaggt 2100

ctatcaggaa ctgggtcatt gcgtattgct gcagcactga tagagcgtta cttccctggc 2160

tctaaggttt tgatatcatc tccaacctgg ggtacgtata tagtgctttg gattaatttg 2220

gttgaatctc ataatactga tttttgcagt tatgttttgc aggaaatcat aagaacattt 2280

tcaatgatgc cagggtgcct tggtctgaat atcgatatta tgatcccaaa acagttggtc 2340

tagattttgc tgggatgata gaagatataa aggttattat cttcctcact tttgtaatct 2400

ttgtggttga aattgtaaag cagcagtgag cagtgtcttt ttcctttctc cacaagtcca 2460

ttgatggtgc ctttgcatgt gggacatgct ttgactttca gtcgttgaag gagagatgcg 2520

ttattcattc taggatagca ttgtatctcc caaatgcttt ttctgtttcc tgctcttcct 2580

tcccattttt gcatcgatcc tgtctctgct aaacatggac aatttgcgcc cttggcaaat 2640

ggcaatgact tgtgtgttgc ttttcttctc tttctatttt ttggtaggag tgacttggtt 2700

ctttcagtgt gagcagtcat atttctgaaa atgaaaatca gaggaacttg gtgctcacac 2760

ttagagaaag tttgttatgt tttgggatgt gaaaggaatt gacagaacaa gtttgataat 2820

atattttttc ttgtgaggat ggaatatgct aaaaataggc tgcactcttt ccttttagat 2880

ctttagttcc tatgtcggtt gtgaatgtcg atttctattt tcaacatttt ctcacgaaga 2940

aaataggatt atccagtact ggatgtctct cctatgtctg atatatgtgt atgtgcagtc 3000

ttgtttgccc gccttgctct ctccccacgt ctaaaaacag agtctgatgg aaaaggcttt 3060

ttccttccag cttttgtgta agtcattgac atagtttaat gaaactactt gtttataggc 3120

tgctcctgaa ggatcattca tcttgctcca tggctgtgca cacaacccaa ctggtattga 3180

tcccacaatt gaacaatggg aaaagattgc tgatgtaatt caggagaaga accacattcc 3240

attttttgat gttgcctacc aggtaatctg tgctaaaccc aattattttc atttggtgaa 3300

gttgtagaat tccaagtttc ttagaagttt tgatggctgt gtgtgcgtgt gtgaaaagaa 3360

tgaaagatat aggagatggt ttcaaaatag tgaaagatct ctcgtatttc atttgtcttt 3420

tggtgtgtgg agactataca ttgttgtatt gatagatgag cgaatttgat tgatgttggt 3480

ggttaagcca catgtgttac tttgtccata tttttttaca ccgtcttggt ttttatcaat 3540

gaaatttact gatttttcag tgaaattatt agaacaagat catctgaagt catttctgtt 3600

cagagaattg gattgaatag ctgtatacta taataatcga gatgcctcat ctgtctacac 3660

gctgcactgc agggattcgc aagcggcagc cttgatgaag atgcctcatc tgtgagattg 3720

tttgctgcac gtggcatgga gcttttggtt gctcaatcat atagtaaaaa tctgggtctg 3780

tatggagaaa ggattggagc tattaatgtt ctttgctcat ctgctgatgc agcgacaagg 3840

tacaacggcc agcactaata atctacatat ttctcctctg tattggtaaa atgatgttgc 3900

actgaagatt ttggttaatg tatgatgcca tttatttatg ttatgcatgt gcagttcttt 3960

ccgtgtatga tttgttatac aatatagcaa gatgagatgc tttaatctcc tttggatttt 4020

atgtggttga accaatataa cttttcttct gttaatggat gcatatctac taacttacag 4080

ggtgaaaagc cagctaaaaa ggcttgctcg accaatgtac tcaaatcccc ccattcacgg 4140

tgctagaatt gttgccaatg tcgttggaat tcctgagttc tttgatgaat ggaaacaaga 4200

gatggaaatg atggcaggaa ggataaagag tgtgagacag aagctatatg atagcctctc 4260

cgccaaggat aaaagtggaa aggactggtc atacattctg aagcagattg gaatgttctc 4320

cttcacaggc ctcaacaaag ctcaggtaaa accccgtgaa ttaagttatt gctgttgcgg 4380

aagccaaata tatagagagt gattaaatca caactactat atctaaaggt agctangtaa 4440

atgagacaat aataaaatga acaccagaaa ttaatgaggt tcggcaaaat ttgatttttt 4500

gcctagttct cggacacaat caactcaaat ttatttcact ccaaaaatac aaatgaaata 4560

ctacaagaga gaaagaagat tcaaatgcct taggaaataa gaaggcaagt gagagatgtt 4620

tacaaatgaa caaaatcctt gctatttata gaagagaaat ggccttaata atgtcatgca 4680

tgacatcata ttaagtgtga acatgtaatg taaatgcacg aaaaatgcat ctaccaattt 4740

cttaaggctt caaatgttca cactagttca cattaatctt gtcaaaattc aacaattgct 4800

gcatcacaat atgcttaaat tcaatttgat ttggttgaca actttctagc tttgatcatt 4860

catcacaaag cgcattcttc actcagcacg tatttttatt aagacattct ttccttccat 4920

tctgaccgat ttcataagtt aaatatgcaa aagatagtgc agtgagagtc tccttactgg 4980

attataacta tggactaaag ttaaatgcat acatttcttt ccctgtactt gcacttctcg 5040

tgctcatatt tgatatctct tcttggctac acagagcgag aacatgacca acaagtggca 5100

tgtgtacatg acaaaagacg ggaggatatc gttggctgga ttatctgctg ccaaatgtga 5160

atatcttgca gatgccataa ttgactcata ctacaatgtc agctaa 5206

<210> 16

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Nicotiana tabacum

<400> 16

Met Ala Ser Thr Met Phe Ser Leu Ala Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ser

1 5 10 15

Phe Ser Leu Gln Asp Asn Leu Lys Ser Lys Leu Lys Leu Gly Thr Thr

20 25 30

Ser Gln Ser Ala Phe Phe Gly Lys Asp Phe Ala Lys Ala Lys Ser Asn

35 40 45

Gly Arg Thr Thr Met Ala Val Ser Val Asn Val Ser Arg Phe Glu Gly

50 55 60

Ile Thr Met Ala Pro Pro Asp Pro Ile Leu Gly Val Ser Glu Ala Phe

65 70 75 80

Lys Ala Asp Thr Asn Glu Leu Lys Leu Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr

85 90 95

Arg Thr Glu Asp Leu Gln Pro Tyr Val Leu Asn Val Val Lys Lys Ala

100 105 110

Glu Asn Leu Met Leu Glu Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Leu Pro Ile

115 120 125

Glu Gly Leu Ala Ala Phe Asn Lys Val Thr Ala Glu Leu Leu Phe Gly

130 135 140

Ala Asp Asn Pro Val Ile Gln Gln Gln Arg Val Ala Thr Ile Gln Gly

145 150 155 160

Leu Ser Gly Thr Gly Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ala Leu Ile Glu Arg

165 170 175

Tyr Phe Pro Gly Ser Lys Val Leu Ile Ser Ser Pro Thr Trp Gly Asn

180 185 190

His Lys Asn Ile Phe Asn Asp Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Tyr Arg

195 200 205

Tyr Tyr Asp Pro Lys Thr Val Gly Leu Asp Phe Ala Gly Met Ile Glu

210 215 220

Asp Ile Lys Ala Ala Pro Glu Gly Ser Phe Ile Leu Leu His Gly Cys

225 230 235 240

Ala His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Ile Glu Gln Trp Glu Lys

245 250 255

Ile Ala Asp Val Ile Gln Glu Lys Asn His Ile Pro Phe Phe Asp Val

260 265 270

Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Ser Leu Asp Glu Asp Ala Ser Ser

275 280 285

Val Arg Leu Phe Ala Ala Arg Gly Met Glu Leu Leu Val Ala Gln Ser

290 295 300

Tyr Ser Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Gly Glu Arg Ile Gly Ala Ile Asn

305 310 315 320

Val Leu Cys Ser Ser Ala Asp Ala Ala Thr Arg Val Lys Ser Gln Leu

325 330 335

Lys Arg Leu Ala Arg Pro Met Tyr Ser Asn Pro Pro Ile His Gly Ala

340 345 350

Arg Ile Val Ala Asn Val Val Gly Ile Pro Glu Phe Phe Asp Glu Trp

355 360 365

Lys Gln Glu Met Glu Met Met Ala Gly Arg Ile Lys Ser Val Arg Gln

370 375 380

Lys Leu Tyr Asp Ser Leu Ser Ala Lys Asp Lys Ser Gly Lys Asp Trp

385 390 395 400

Ser Tyr Ile Leu Lys Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Asn

405 410 415

Lys Ala Gln Ser Glu Asn Met Thr Asn Lys Trp His Val Tyr Met Thr

420 425 430

Lys Asp Gly Arg Ile Ser Leu Ala Gly Leu Ser Ala Ala Lys Cys Glu

435 440 445

Tyr Leu Ala Asp Ala Ile Ile Asp Ser Tyr Tyr Asn Val Ser

450 455 460

<210> 17

<211> 101

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность, используемая для генерирования растений с AAT2S/T RNAi

<400> 17

gctattcaag agaacagagt aacaactgtg cagtgcttgt ctggcacagg ctcattgagg 60

gttggagctg aatttttggc tcgacattat catcaacgca c 101

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к подвергнутому сушке растительному материалу из Nicotiana tabacum для применения в табачных продуктах. Также раскрыт табачный продукт, содержащий указанный подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum. Раскрыты способ получения подвергнутого сушке растительного материала из Nicotiana tabacum. Изобретение позволяет эффективно получать подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum для применения в табачных продуктах, содержащий:

(i) полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15;

(ii) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, указанным в (i);

(iii) полипептид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 6 или SEQ ID No: 8, по меньшей мере 93% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2, или по меньшей мере 94% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 16; или

(iv) конструкцию, вектор или вектор экспрессии, содержащие выделенный полинуклеотид, указанный в (i),

где подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum содержит по меньшей мере одну модификацию, модулирующую экспрессию или активность полинуклеотида или полипептида по сравнению с таковыми в контрольном подвергнутом сушке растительном материале без модифицирования экспрессии или активности полинуклеотида или полипептида.

2. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по п. 1, где по меньшей мере одна модификация представляет собой модификацию генома подвергнутого сушке растительного материала из Nicotiana tabacum, или модификацию конструкции, вектора или вектора экспрессии, или трансгенную модификацию; предпочтительно,

где модификация генома подвергнутого сушке растительного материала из Nicotiana tabacum или модификация конструкции, вектора или вектора экспрессии представляет собой мутацию или редактирование.

3. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов, где модификация обеспечивает понижение экспрессии или активности полинуклеотида или полипептида по сравнению с таковыми в контрольном растительном материале; предпочтительно,

где растительный материал содержит полинуклеотид для обеспечения интерференции, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна по меньшей мере 19 нуклеотидам РНК, транскрибируемой с полинуклеотида (i) по п. 1.

4. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов, где подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum представляет собой лист, при этом модулированная экспрессия или активность полинуклеотида или полипептида обеспечивают модулирование уровня аминокислот в листе Nicotiana tabacum, подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum, по сравнению с уровнем аминокислот в контрольном листе Nicotiana tabacum, подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum, предпочтительно, где аминокислота представляет собой аспартат или метаболит, получаемый из него; и/или

где уровень никотина в листе Nicotiana tabacum, подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum, является по существу таким же, как и уровень никотина в контрольном подвергнутом сушке или высушенном листе Nicotiana tabacum; и/или

где уровень акриламида в подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum является пониженным по сравнению с уровнем акриламида в контрольном подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum; и/или

где уровень аммиака в подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum является пониженным по сравнению с уровнем аминокислот в контрольном подвергнутом сушке, или высушенном листе Nicotiana tabacum.

5. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов, предпочтительно, где растительный материал содержит биомассу, семя, стебель, цветки или листья.

6. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов, где растительный материал, подвергнутый сушке, представляет собой растительный материал воздушной сушки, растительный материал солнечной сушки или растительный материал трубоогневой сушки.

7. Подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов, где растительный материал представляет собой гомогенизированный растительный материал.

8. Табачный продукт, содержащий подвергнутый сушке растительный материал из Nicotiana tabacum по любому из предыдущих пунктов.

9. Способ получения подвергнутого сушке растительного материала из Nicotiana tabacum по любому из пп. 1-8, включающий стадии:

(a) получение клетки растения Nicotiana tabacum, содержащей полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полинуклеотида, содержащего, состоящего или по существу состоящего из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15;

(b) модификация клетки растения для обеспечения модулирования экспрессии указанного полинуклеотида по сравнению с таковой в контрольной клетке растения Nicotiana tabacum; и

(c) регенерация клетки растения в растение Nicotiana tabacum;

(d) сбор с него растительного материала; и

(c) сушка растительного материала.

10. Способ по п. 9, где стадия (c) включает культивирование растения из побега или саженца, содержащих клетку растения; и/или

где стадия модификации клетки растения включает модификацию генома клетки с помощью методов редактирования генома или геномной инженерии; предпочтительно,

где методы редактирования генома или геномной инженерии выбраны из технологии CRISPR/Cas, мутагенеза, опосредованного нуклеазой с цинковыми пальцами, химического или радиационного мутагенеза, гомологичной рекомбинации, олигонуклеотид-направленного мутагенеза и мутагенеза, опосредованного мегануклеазой.

11. Способ по п. 9 или 10, где стадия модификации клетки растения включает трансфекцию клетки конструкцией, содержащей полинуклеотид, содержащий, состоящий или по существу состоящий из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15, функционально связанной с конститутивным промотором; и/или

где стадия модификации клетки растения включает введение в клетку полинуклеотида для обеспечения интерференции, содержащего последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна РНК, транскрибируемой с полинуклеотида по п. 1(i); предпочтительно,

где клетку растения трансфицируют конструкцией, экспрессирующей полинуклеотид для обеспечения интерференции, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 80% комплементарна по меньшей мере 19 нуклеотидам РНК, транскрибируемым с полинуклеотида по п. 1(i).

12. Способ по любому из пп. 9-11, в котором растительный материал содержит листья, стебли или цветки.

13. Способ по любому из пп. 9-12, в котором сушку выбирают из воздушной сушки, огневой сушки, трубоогневой сушки и солнечной сушки.