ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61K9/00 A61K31/706 A61K45/00 A61K48/00 A61P27/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет по предварительным заявкам США № 62/683292 и № 62/716554, поданным 11 июня 2018 года и 9 августа 2018 года, соответственно, которые включены в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит Перечень Последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в данный документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 20 мая 2019 года, названа 24978-0488_SL.txt и содержит 17 271 байт.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области офтальмологии и области клеточной биологии. В частности, данное изобретение относится к лечению возрастной макулярной дегенерации (ВМД) и других глазных заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С точки зрения популяции, хронологический возраст, возможно, является наиболее важной биологической особенностью при прогнозировании возрастных рисков заболеваний, умственной и физической работоспособности, и смертности [1]. Однако, использование хронологического возраста при объяснении значительной биологической вариации среди людей одного возраста ограничено. Биологический возраст представляет собой концепцию, которая пытается количественно оценить различные состояния старения под влиянием образа жизни, генетики, заболевания и окружающей среды. Выбор окружающей среды и образа жизни, такой как курение и диета, также имеет четкие последствия в отношении ассоциированных с возрастом заболеваний [2]. В то время как эпидемиологические исследования преуспели в предоставлении количественных оценок их воздействия на продолжительность жизни человека, достижения в области молекулярной биологии теперь дают возможность выйти за рамки демографических вопросов смертности и уточнить конкретные эффекты заболевание и других факторов на старение отдельных организмов.

Была разработана количественная модель старения, основанная на паттернах метилирования ДНК по всему геному с использованием измерений 470000 CpG маркеров из образцов цельной крови большой группы людей, охватывающей широкий возрастной диапазон [3]. Этот способ является очень точным при прогнозировании возраста, а также может различать соответствующие факторы старения, включая пол, генетические варианты и заболевание [3, 4]. Модель работает в многих тканях, предполагая возможность общих молекулярных часов, частично регулируемых изменениями в метиломе. Кроме того, эти паттерны метилирования сильно коррелируют с клеточным увяданием и старением. Наблюдалось, что некоторые гены становятся все более метилированными с увеличением хронологического возраста. Как показала модель старения, ELOVL2 (Elongation Of Very Long Chain Fatty Acids-Like 2), в частности, очень надежно показывает повышение метилирования по мере старения человека [3].

ELOVL2 кодирует трансмембранный белок, участвующий в синтезе длинных (C22 и C24) ω3 и ω6 полиненасыщенных жирных кислот (VLC-PUFA) [5]. В частности, ELOVL2 способен превращать докозапентаеновую кислоту (ДПК) (22:5n-3) в 24:5n-3, которая является предшественником 22:6n-3, докозагексаеновой кислоты (ДГК) [6]. ДГК представляет собой основную полиненасыщенную жирную кислоту (ПНЖК) в сетчатке и мозге. Ее присутствие в фоторецепторах способствует здоровому функционированию сетчатки и защищает от повреждений ярким светом и окислительного стресса. Низкая экспрессия ELOVL2 была связана с низким уровнем ДГК [7], что, в свою очередь, среди множества других дегенеративных заболеваний сетчатки, было связано с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) [8]. В общем, ПНЖК участвуют в ключевых биологических функциях, включая продуцирование энергии, модуляцию воспаления, и поддержание целостности клеточной мембраны. Следовательно, возможно, что метилирование ELOVL2 играет роль в процессе старения через регуляцию различных биологических путей.

ВМД представляет собой дегенеративное заболевание макулы, ведущую причину слепоты среди пожилых людей в развитых странах. Это многофакторное заболевание, связанное с генетическими, экологическими и метаболическими факторами, и на сегодняшний день от него не существует лечения или эффективной профилактики. Ряд генов был идентифицирован как факторы риска, но многие из них до сих пор неизвестны. По мере прогрессирования ВМД, центр зрения становится расплывчатым, и со временем могут образоваться слепые пятна. ВМД встречается в двух формах: влажная ВМД и сухая ВМД. При сухой ВМД, которая поражает около 90% пациентов с ВМД, очаговое отложение бесклеточного полиморфного мусора, называемого друзами, обычно является первыми наблюдаемыми клиническими признаками заболевания. ELOVL4, другая элонгаза жирных кислот, участвующая в синтезе VLC-PUFA (полиненасыщенные жирные кислоты с очень длинной цепью), участвует в макулярной дистрофии Штаргардта, ювенильной форме дегенерации желтого пятна, вызывающей потерю зрения [9, 10].

ВМД была связана с окислительным стрессом в сетчатке [11]. Окислительный стресс может привести к воспалению и способствовать развитию активации макрофагов [12]. Было показано, что окисленные фосфолипиды являются надежными маркерами окислительного стресса, и они инициируют воспаление, связываясь с пигментным эпителием сетчатки (ПЭС) и макрофагами, активируя нижележащие воспалительные каскады [13]. Белки и липиды, модифицированные окислением, также были обнаружены в друзе и мембране Бруха [14]. Фосфатидилхолин, высокообогащенный в сетчатке фосфолипид, содержит фосфохолин головной группы. Окислительный эпитоп фосфохолина может быть распознан естественным антителом к фосфохолину, TEPC-15 [15], и было показано, что он колокализуется с друзами в глазах человека с ВМД [16]. Также обнаружено, что HTRA1, один из основных белков, ассоциированных с ВМД, колокализируется с друзами в глазах с ВМД [17]. Кроме того, несколько компонентов каскада комплемента, включая фрагменты комплемента C3, C5 и комплекс мембранной атаки C5b-9, были обнаружены в составе друз [18].

Необходимы новые способы лечения возрастной макулярной дегенерации.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предлагает способы лечения возрастных глазных заболеваний и патологий. В некоторых вариантах осуществления, способы включают в себя введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества одного или более соединений деметилирующих нуклеиновую кислоту. Данное изобретение предлагает способы лечения возрастных глазных заболеваний.

В вариантах осуществления, данное изобретения предполагает то, что возрастное глазное заболевание или патология представляет собой возрастную макулярную дегенерацию.

В вариантах осуществления, данное изобретения предполагает то, что выбранное деметилирующее соединение из группы, состоящей из 5-азацитидина, децитабина, зебуларина, прокаинамида, прокаина, гидралазина, вальпроевой кислоты и ЭГКГ.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает приготовление композиции для офтальмологического введения.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает парентеральное введения в глаз.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает способы лечения возрастного глазного заболевания или патологии, включающие в себя повышение экспрессии ELOVL2 у пациента, нуждающегося в этом.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает увеличение экспрессии путем деметилирования промотора ELOVL2.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает увеличение экспрессии путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества мРНК ELOVL2 с использованием доставки аденоассоциированным вирусом.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает офтальмологическую фармацевтическую композицию, содержащую соединение, деметилирующее нуклеиновую кислоту, в офтальмологически приемлемом препарате.

В вариантах осуществления, данное изобретения предлагает выбор деметилирующего соединения из группы, состоящей из 5-азацитидина, децитабина, зебуларина, прокаинамида, прокаина и ЭГКГ.

В других вариантах осуществления, способы включают в себя введение эффективного количества мРНК ELOVL2 нуждающемуся субъекту с использованием доставки аденоассоциированным вирусом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1A-1D показывают экспрессию и метилирование ELOVL2 в клетках WI-38. Фиг. 1А показывает экспрессию ELOVL2 с помощью кПЦР в клетках WI-38 при УП35, 45, 55. Более высокий % от вносимого показывает более высокое метилирование ДНК. (**p <0,005 дисперс. анализ, *p<0,05, t-критерий). Фиг. 1B показывает уровень метилирования в промоторной области ELOVL2 в клетках WI-38 путем иммунопреципитации метилированной ДНК с последующей кПЦР. Праймеры амплифицируют область, содержащую маркеры CpG cg16867657, cg24724428 и cg21572722. Фиг. 1С показывает пролиферацию клеток WI-38 с нокдауном и контроля с нокдауном люциферазы, измеренную по площади поверхности, покрытой с течением времени. Фиг. 1D показывает процент старения при окрашивании бета-галактозидазой в клетках WI-38 с нокдауном. (n=3, *p <0,05, **p <0,005, t-критерий).

Фиг. 2A-2C показывают манипулирование метилированием ДНК в клетках УП52 WI-38. Фиг. 2А показывает метилирование промотора ELOVL2, измеренное с помощью MeDIP с последующей кПЦР в необработанных контрольных и обработанных 5-азацитидином клетках WI-38. Фиг. 2B показывает экспрессию ELOVL2 с помощью кПЦР в необработанных контрольных и обработанных 5-азацитидином клетках WI-38. Фиг. 2С показывает процент старения при окрашивании бета-галактозидазой в клетках WI-38, обработанных 2 мкМ 5-азацитидином. (n=3, *p <0,05, t-критерий).

Фиг. 3A-3E показывают ELOVL2 и сетчатку. Фиг. 3А показывает экспрессию ELOVL2 в мышиной сетчатке с помощью кПЦР у мышей разного возраста. Фиг. 3В показывает вестерн-блот ELOVL2 в мышиной сетчатке разного возраста; звездочка - неспецифическая полоса. Фиг. 3С показывает метилирование промотора ELOVL2 в сетчатке мышей разного возраста. Фиг. 3D показывает автофлуоресцентную визуализацию мышей дикого типа в возрасте 2, 6, 12 и 24 месяцев. Репрезентативные следы ответов палочек ЭРГ показаны под изображениями. Фиг. 3E показывает ответ палочек у мышей разного возраста, показанный через амплитуду b-волны ЭРГ (n=4, **p<0,005, дисперс. анализ).

Фиг. 4A-4E показывают фенотипы сетчатки у мутированных мышей ELOVL2. Фиг. 4А показывает CRISPR-Cas9 опосредованную стратегию изменения субстратной специфичности ELOVL2. Фиг. 4A раскрывает SEQ ID NOS 17-20, соответственно, в порядке появления. Фиг. 4В показывает аутофлуоресцентную визуализацию глазного дна мышей дикого типа и гомозиготных мутированных мышей. Ответы ЭРГ палочек показаны в виде графиков под изображениями. Фиг. 4С показывает амплитуду b-волны палочек из ЭРГ у 6-месячных мышей дикого типа и мышей с мутацией сдвига рамки считывания. Фиг. 4D показывает иммуноокрашивание Htra1 и T-15 в мышиной сетчатке ДТ и C217W. Стрелки указывают на друзеноподобные агрегаты. Фиг. 4Е показывает количественное определение друзеноподобных агрегатов, положительных по HTRA1 и T-15. (n=4, *p<0,05, **p<0,005, t-критерий).

Фиг. 5A-5D показывают инъекцию 5-азацитидина в мышиные глаза. Фиг. 5А показывает метилирование ELOVL2 в мышиных сетчатках, после внутриглазной инъекции ФСБ или 5-азацитидина, с помощью MeDIP. Фиг. 5B показывает экспрессию ELOVL2 в сетчатках после внутриглазной инъекции ФСБ или 5-азацитидина, с помощью кПЦР. Фиг. 5C показывает ответ палочек из ЭРГ в мышиных глазах после внутриглазной инъекции ФСБ или 5-азацитидина. Фиг. 5D показывает амплитуду b-волны палочек из ЭРГ. (n=4, *p<0,05, t-критерий).

Фиг. 6A-6E показывают характеристики старения клеток WI-38. Фиг. 6A показывает пролиферацию клеток WI-38, измеренную по площади поверхности, покрытой при удвоении популяции (УП) 35, 45, 55. Фиг. 6B показывает процент старения при окрашивании бета-галактозидазой в клетках WI-38. Фиг. 6С показывает репрезентативные изображения морфологии клеток и окрашивания бета-галактозидазой клеток WI-38. Фиг. 6D показывает иллюстративные изображения морфологии клеток и окрашивания бета-галактозидазой клеток WI38 с нокдауном ELOVL2, по сравнению с контролями нокдауна люциферазы. Фиг. 6E показывает эффективность нокдауна ELOVL2 в клетках WI-38 с помощью кПЦР. (n=3, **p<0,005, t-критерий).

Фиг. 7A-7E показывают характеристики старения клеток IMR-90. Фиг. 7A показывает пролиферацию клеток IMR-90, измеренную покрытием площади поверхности при удвоении популяции (УП) 35, 45, 55. Фиг. 7В показывает процент старения при окрашивании бета-галактозидазой в клетках IMR-90. Фиг. 7C показывает экспрессию ELOVL2 с помощью кПЦР в клетках IMR-90. Фиг. 7D показывает эффективность нокдауна ELOVL2 с помощью кПЦР в клетках IMR-90. Фиг. 7E показывает репрезентативные изображения морфологии нокдауна ELOVL2 с контролем нокдауна люциферазы в клетках IMR90. (n=3, *p<0,05, **p<0,005, t-критерий).

Фиг. 8A-8D показывают характеристики старения мышиных сетчаток ДТ. Фиг. 8A показывает изображения автофлуоресценции мышиных сетчаток ДТ в возрасте 2 месяцев, 6 месяцев, 1 года и 2 лет. Фиг. 8B показывает ответ палочек из ЭРГ у мышей ДТ в возрасте 2 месяцев, 6 месяцев, 1 года и 2 лет. Фиг. 8C показывает колебательные потенциалы ЭРГ у 3-месячных и 2-летних мышей дикого типа. Фиг. 8D показывает фликкер-ответ с частотой 10 Гц из ЭРГ у 3-месячных и 2-летних мышей дикого типа.

Фиг. 9A-9B Фиг. 9A показывает мышиную сетчатку MeDIP мышей Ames. Более высокий % от вносимого показывает более высокое метилирование ДНК. Y=3 месяца мыши ДТ, O=2 года мыши ДТ, AY=3 месяца мыши Ames, AO= 2 года мыши Ames. Фиг. 9B показывает экспрессию ELOVL2 у мышей Ames с помощью кПЦР. (n=3, *p <0,05, **p<0,005, t-критерий).

Фиг. 10A-10E показывают мутированных мышей ELOVL2-ELOVL5. Фиг. 10A показывает сходство аминокислотных последовательностей ELOVL2 и ELOVL5 у человека и мыши. Красные стрелки обозначают направленную мутацию C217W. Фиг. 10A раскрывает SEQ ID NO: 21-24, соответственно, в порядке появления. Фиг. 10B показывает целевой сайт расщепления для CAS9. Фиг. 10C показывает последовательность восстанавливающего олигонуклеотида ELOVL2 (SEQ ID NO: 25). Фиг. 10D показывает выравнивание последовательностей белков ДТ и C217W. Мутации выделены синим цветом. Фиг. 10D раскрывает SEQ ID NOS 26-29, соответственно, в порядке появления. Фиг. 10E показывает нецелевой анализ мышей с мутантом ELOVL2. Фиг. 10E показывает SEQ ID NO: 30, 31, 30 и 32 соответственно в порядке появления.

Фиг. 11A-11D показывают характеристики старения мышиных сетчаток C217W. Фиг. 11A показывает изображения автофлуоресценции мышиных сетчаток ДТ и C217W в возрасте 4 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев и 1 год. Фиг. 11B показывает ответ палочек из ЭРГ у мышей ДТ по сравнению с мышами C217W в возрасте 4, 6 и 8 месяцев. Фиг. 11C показывает колебательные потенциалы ЭРГ у дикого типа и у мышей с мутацией сдвига рамки считывания. Фиг. 11D показывает фликкер-ответ с частотой 10 Гц из ЭРГ у дикого типа и мышей с мутацией сдвига рамки считывания.

Фиг. 12A-12D показывают характеристику друзеноподобных агрегатов. Фиг. 12A показывают иммуноокрашивание Htra1, C3 и C5b-9 в мышиных сетчатках ДТ и C217W. Стрелки указывают на друзеноподобные агрегаты. Фиг. 12B показывает количественные показатели друзеноподобных агрегатов, положительных по C3 и C5b-9. Фиг. 12C показывает иммуноокрашивание C3 и мышиные сетчатки ДТ и C217W. Стрелки указывают на друзеноподобные агрегаты. Фиг. 12D показывает количественные показатели друзеноподобных агрегатов, положительных по C3. (n=4, **p<0,005, t-критерий).

Фиг. 13 показывает ответ палочек из ЭРГ в мышиных глазах которым инъецировали ФСБ и 5-азацитидин.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была конкретно и отдельно указана для включения посредством ссылки.

Согласно данному изобретению, в практике будут использоваться, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Такие методы полностью описаны в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20^th ed., (Lippincott, Williams & Wilkins 2003), и Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22^th ed., (Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy at University of the Sciences 2012).

При представлении элементов данного изобретения или его предпочтительных вариантов осуществления, существительные в единственном числе, множественном числе, и с прилагательным «указанный» применяются для обозначения того, что существует один или большее количество элементов. Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» применяются для включения и означают, что могут быть дополнительные элементы, иные от перечисленных.

Термин «и/или» при использовании в списке из двух или большего количества элементов означает, что любой из перечисленных элементов может использоваться сам по себе или в комбинации с любым одним или большим количеством из перечисленных элементов. Например, выражение «A и/или B» применяется для обозначения одного или обоих из A и B, то есть A отдельно, B отдельно или A и B в комбинации. Выражение «A, B и/или C» применяется для обозначения одного A, одного B, одного C, A и B в комбинации, A и C в комбинации, B и C в комбинации или A, B, и C в комбинации.

Следует понимать, что аспекты и варианты осуществления данного изобретения, описанные в данном документе, включают в себя «состоящие» и/или «состоящие по существу из» аспекты и варианты осуществления.

Следует понимать, что описание в формате диапазона приведено просто для удобства и краткости и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема данного изобретения. Следовательно, следует считать, что описание диапазона конкретно раскрывает все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такого как от 1 до 6, следует рассматривать как специально раскрываемые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и пр., а также отдельные числа в этом диапазоне, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от широты диапазона. Значения или диапазоны также могут быть выражены в данном документе как «около», от «около» одного конкретного значения и/или до «около» другого конкретного значения. Когда такие значения или диапазоны выражены, другие раскрытые варианты осуществления включают в себя указанное специфичное значение, от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогичным образом, когда значения выражаются в виде приближений с использованием предшествующего «около», следует понимать, что конкретное значение образует другой вариант осуществления. Кроме того, следует понимать, что в нем раскрывается ряд значений, и что каждое значение также раскрывается в данном документе как «около» этого конкретного значения в дополнение к самому значению. В вариантах осуществления «около» может использоваться для обозначения, например, в пределах 10% от указанного значения, в пределах 5% от указанного значения или в пределах 2% от указанного значения.

В контексте данного документа, термин «пациент» или «субъект» обозначает субъекта - человека или животное, подлежащего лечению.

В контексте данного документа, термин «фармацевтическая композиция» относится к фармацевтически приемлемым композициям, при этом композиция содержит деметилирующие соединение(я), а в некоторых вариантах осуществления дополнительно включает в себя фармацевтически приемлемый носитель. В вариантах осуществления, фармацевтическая композиция может представлять собой комбинацию.

В контексте данного документа, термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США, другой общепризнанной фармакопее в дополнение к другим препаратам, которые безопасны для использования на животных, в частности на людях и/или млекопитающих, не относящихся к человеку.

В контексте данного документа, термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к эксципиенту, разбавителю, консерванту, солюбилизатору, эмульгатору, адъюванту и/или носителю, с которым вводят деметилирующее соединение(я). Такие носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители. Антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза, также могут быть носителем. Способы получения композиций в комбинации с носителями известны специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления, термин «фармацевтически приемлемый носитель» используется для включения в себя любых и всех растворителей, дисперсионных сред, покрытий, изотонических агентов и агентов, замедляющих абсорбцию, и тому подобное, совместимых с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Смотрите, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20 ed. (Lippincott, Williams & Wilkins 2003). Такое использование в композициях предполагается, за исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным соединением.

В контексте данного документа, «терапевтически эффективный» относится к количеству деметилирующего соединение(й), которое достаточно для лечения или облегчения, или каким-либо образом для ослабления симптомов, связанных с возрастными глазными заболеваниями, такими как, но не ограничиваясь этим, возрастная макулярная дегенерация (ВМД). При использовании со ссылкой на способ, способ достаточно эффективен для лечения или облегчения, или каким-либо образом ослабления симптомов, связанных с возрастными глазными заболеваниями. Например, эффективным количеством в отношении возрастных глазных заболеваний является такое количество, которое достаточно для блокирования или предотвращения начала; или если патология заболевания началась, для смягчения, облегчения, стабилизации, обращения вспять или замедления прогрессирования заболевания или для уменьшения патологических последствий заболевания иным образом. В любом случае эффективное количество можно вводить в виде однократных или разделенных доз.

В контексте данного документа, термин «лечение» охватывает по меньшей мере улучшение симптомов, связанных с возрастными глазными заболеваниями у пациента, где улучшение используется в широком смысле для обозначения по меньшей мере уменьшения величины параметра, например, симптома, связанного с подлежащим лечению заболеванием или патологией. Таким образом, «лечение» также включает в себя ситуации, когда заболевание, нарушение или патологическое состояние, или, по меньшей мере, симптомы, связанные с ним, полностью подавляются (например, предотвращаются) или останавливаются (например, прекращаются), так что пациент больше не страдает от патологии или, по крайней мере, симптомов, характеризующих патологию.

Термин «комбинация» относится либо к фиксированной комбинации в одной стандартной дозированной форме, либо к набору частей для комбинированного введения, где одно или большее количество деметилирующих соединений и партнер по комбинации (например, другое лекарство, как поясняется ниже, также упоминаемое как «терапевтический агент» или «вспомогательный агент») можно вводить независимо в одно и то же время или отдельно в пределах временных интервалов. В некоторых случаях, партнеры по комбинации демонстрируют кооперативный, например, синергетический эффект. В контексте данного документа, термины «совместное введение» или «комбинированное введение» или подобные, применяются для охвата введения выбранного партнера по комбинации одному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предназначены для включения в себя режимов лечения, в которых агенты не обязательно вводятся одним и тем же путем или в одно и то же время. В контексте данного документа, термин «фармацевтическая комбинация» означает продукт, который получается в результате смешивания или объединения более чем одного активного ингредиента, и включает в себя как фиксированные, так и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин «фиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение и партнер по комбинации, вводятся пациенту одновременно в форме одной единицы или дозы. Термин «нефиксированная комбинация» означает, что активные ингредиенты, например, соединение и партнер по комбинации, вводятся пациенту как отдельные единицы либо одновременно, либо одновременно, либо последовательно без каких-либо конкретных временных ограничений, при этом такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также относится к коктейльной терапии, например, к введению трех или большего количества активных ингредиентов.

Макулярная дегенерация представляет собой клинический термин, который используется для описания семейства заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей потерей центрального зрения, связанной с аномалиями мембраны Бруха, сосудистой оболочки, нервной оболочки сетчатки и/или пигментного эпителия сетчатки. В центре сетчатки находится желтое пятно размером около ¹/₃ до ¹/₂ см. в диаметре. Пятно обеспечивает детальное зрение, особенно в центре (ямке), поскольку колбочки имеют более высокую плотность. Кровеносные сосуды, ганглиозные клетки, внутренний ядерный слой и клетки, а также плексиформные слои смещены в одну сторону (а не находятся над ними), тем самым позволяя свету более прямой путь к колбочкам. Под сетчаткой находится сосудистая оболочка, совокупность кровеносных сосудов, встроенных в фиброзную ткань, и пигментный эпителий (ПЭ), который покрывает слой сосудистой оболочки. Хориоидальные кровеносные сосуды обеспечивают питание сетчатки (в частности ее зрительных клеток). Сосудистая оболочка и ПЭ находятся в задней части глаза.

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), наиболее распространенная дегенерация желтого пятна, связана с прогрессирующей потерей остроты зрения в центральной части поля зрения, изменениями цветового зрения и аномальной адаптацией к темноте и чувствительностью. Были описаны два основных клинических проявления ВМД: сухая или атрофическая форма и влажная или экссудативная форма. Сухая форма связана с атрофической гибелью клеток центральной сетчатки или желтого пятна, которые необходимы для хорошего зрения, используемого для таких действий, как чтение, вождение или распознавание лиц. Около 10-20% этих пациентов с сухой ВМД прогрессируют до второй формы ВМД, известной как влажная ВМД.

Влажная (неоваскулярная/экссудативная) ВМД вызывается аномальным ростом кровеносных сосудов за сетчаткой под желтым пятном и утечкой сосудов, что приводит к смещению сетчатки, кровоизлиянию и образованию рубцов. Это приводит к ухудшению зрения в течение периода от месяцев до лет. Однако пациенты могут быстро потерять зрение. Все случаи влажной ВМД возникают из прогрессирующей сухой ВМД. Влажная форма составляет 85% случаев слепоты, возникших вследствии ВМД. При влажной ВМД, в результате того, что кровеносные сосуды пропускают жидкость и кровь, образуется рубцовая ткань, которая разрушает центральную сетчатку.

Глаукома представляет собой основную причину слепоты. Хотя термин «глаукома» применяется к большому количеству различных глазных заболеваний, общим для всех типов глаукомы является феномен, при котором давление внутри глаза повышается, что приводит к разрушению зрительного нерва. При большинстве форм глаукомы, повышение давления не ощущается человеком, например, по боли или снижению остроты зрения, пока не произойдет значительная потеря зрения. В здоровом глазу жидкость (водянистая влага) проходит из передней камеры через подобную фильтру массу ткани (трабекулярная сеть) и оттуда в соединенный ряд вен в склере. В наиболее часто встречающейся форме глаукомы (открытоугольной глаукоме) повышение давления возникает в результате блокировки пути оттока через трабекулярную сеть. Существуют две основные формы лечения глаукомы: медикаментозное лечение и хирургическое вмешательство.

Диабет является четвертой по значимости причиной смерти, поражающей 16 миллионов американцев, в трети из которых он не диагностирован, и обходится более чем в 100 миллиардов долларов в год, что составляет 15% долларов от бюджета на здравоохранение США. Ежегодно обнаруживают около 800 000 новых случаев диабета. К 2030 году их число может достичь 50 миллионов в США и не менее 300 миллионов во всем мире. Сахарный диабет представляет собой основную причину новой слепоты среди людей в возрасте от 20 до 74 лет в Соединенных Штатах. Вскоре после постановки диагноза инсулинозависимый сахарный диабет (ИЗСД), начинает развиваться ретинопатия, а через 15 лет распространенность составляет почти 100%. Один миллион человек в США болеет ИЗСД или диабетом 1-го типа. На сегодняшний день, при инсулиннезависимом сахарном диабете (ИНСД) или диабете 2-го типа, 15 миллионов, около 21% пациентов имеют ретинопатию на момент постановки диагноза и 60% - через 20 лет. Число больных диабетом 2-го типа за последние 30 лет утроилось, и включает в себя половину американцев старше 65 лет. Пролиферативная ретинопатия встречается в 10-20% случаев ИНСД. Brechner R J, et al, JAMA 1993;270:1714-1718.

Макулярная дегенерация, или возрастная макулярная дегенерация (ВМД), поражает центральную часть сетчатки и является основной причиной слепоты у людей старше 65 лет в США, ВМД поражает 13 миллионов человек и вызывает нарушение у около 1,2 миллиона. Около 30% пациентов старше 75 лет имеют ВМД, а у 23% остальных она разовьется в течение пяти лет. Распространенность ВМД увеличивается с возрастом: с 16,8% у пациентов 55-64 лет до 25,6% у пациентов 65-74 лет и до 42% у пациентов старше 75 лет. На сегодняшний день нет известного лекарства от сухой или атрофической ВМД, формы, характеризующейся твердыми или мягкими друзами (отложениями клеточного мусора), изменениями пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) или атрофией фоторецепторов и ПЭС. На эту форму приходится примерно 90% всех случаев. В остальных случаях ВМД наблюдается «влажная» форма, характеризующаяся неоваскуляризацией и экссудацией. Pratt S G, Review of Ophthalmology August 1998:42-50.

Данное изобретение относится к деметилирующим агентам для лечения патологий или заболеваний, связанных с глазами, таких как возрастная макулярная дегенерацией (ВМД), диабетическая ретинопатия, глазной ангиогенез (например, глазная неоваскуляризация, затрагивающая ткань хориоидеи, роговицы или сетчатки) и другие глазные патологии, связанные с метилированием генов, таких как ELOVL2. Лечение ВМД включает в себя как сухую, так и влажную формы ВМД.

Данное изобретение предлагает способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества по меньшей мере одного деметилирующего агента.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент увеличивает экспрессию гена типа 2 удлинения жирных кислот с очень длинной цепью (ELOVL2) и/или увеличивает уровень фермента ELOVL2 и/или увеличивает уровень 22:6(n-3) докозагексаеновой кислоты (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в сетчатке.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент выбирают из 5-азацитидина, децитабина, зебуларина, прокаинамида, прокаина, гидралазина, вальпроевой кислоты и галлата эпигаллокатехина (ЭГКГ).

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент вводится в глаз интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент вводят в виде препарата с медленным высвобождением.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии, включающий в себя повышение уровня фермента ELOVL2 и/или уровня 22:6(n-3) докозагексаеновой (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в глазу путем введения в глаз эффективного количества мРНК, кодирующей ELOVL2; причем мРНК доставляют с использованием вирусного вектора.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что вирусный вектор выбирают из: аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора, вектора вируса осповакцины и ретровирусного вектора.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что мРНК доставляют с использованием невирусного вектора, такого как липосома или микро/наночастица.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что агент вводят в глаз интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания и патологии, включающий в себя повышение уровня фермента ELOVL2 в глазу и/или уровня 22:6(n-3) докозагексаеновой кислоты (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в глазу, путем генной терапии с использованием вектора экспрессии ELOVL2.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что вектор выбирают из: аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора, вектора вируса осповакцины и ретровирусного вектора.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что вектор экспрессии ELOVL2 вводят интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость; и причем возрастное глазное заболевание представляет собой сухую AMD.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ, включающий в себя выбор пациента, нуждающегося в лечении возрастного глазного заболевания, и введение в глаз пациента эффективного количества одного или более деметилирующих агентов и/или мРНК, кодирующей ELOVL2, и/или вектора экспрессии ELOVL2, тем самым излечивая данное возрастное заболевания.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что пациента выбирают путем определения метилирования ELOVL2 и/или экспрессии ELOVL2 в глазу пациента.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент представляет собой децитабин.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость; и причем возрастное глазное заболевание представляет собой сухую AMD.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ, включающий в себя использование мРНК, кодирующей ELOVL2, при лечении возрастного глазного заболевания, при необходимости сухой ВМД.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ, включающий в себя использование вектора экспрессии ELOVL2 при лечении возрастного глазного заболевания, при необходимости сухой ВМД.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен препарат, содержащий указанную концентрацию деметилирующего агента, причем интравитреальное введение от 1 мкл до 100 мкл составляет эффективное количество от 5 нг до 500 нг.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен препарат, содержащий указанную концентрацию деметилирующего агента, причем интравитреальное введение от 1 мкл до 100 мкл составляет эффективное количество от 500 до 1500 нг.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен препарат, содержащий указанную концентрацию деметилирующего агента, причем интравитреальное введение от 1 мкл до 100 мкл составляет эффективное количество от 1500 до 4500 нг.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что препарат является по существу водным. В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что препарат является по существу безводным. В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что препараты являются медленного высвобождение и/или пролонгированного высвобождение.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложено, что деметилирующий агент представляет собой децитабин.

В вариантах осуществления, согласно данному изобретению предложен способ изготовления лекарственного средства для введения.

Если не указано иное, все технические и научные термины и любые аббревиатуры, используемые в данном документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники данного изобретения. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут использоваться на практике согласно данному изобретению, в данном документе описаны иллюстративные способы, устройства и материалы.

В контексте данного документа, если не указано иное, термины «предотвращать», «предотвращение» и «предупреждение» относятся к предотвращению возникновения, рецидива или распространения заболевания или нарушения, или одного или большего количества их симптомов. В некоторых вариантах осуществления, термины относятся к лечению или введению соединения, или дозированной формы, предложеных в данном документе, с одним или большим количеством других дополнительных активных агентов или без них до появления симптомов, особенно у субъектов с риском заболевания или нарушений, предложеных в данном документе. Эти термины охватывают подавление или уменьшение симптома конкретного заболевания. В некоторых вариантах осуществления, субъекты с семейным анамнезом заболевания являются потенциальными кандидатами на профилактические схема лечения. В некоторых вариантах осуществления, субъекты, у которых в анамнезе наблюдались повторяющиеся симптомы, также являются потенциальными кандидатами для профилактики. В этом отношении термин «профилактика» может использоваться взаимозаменяемо с термином «профилактическое лечение».

В контексте данного документа, если не указано иное, «профилактически эффективное количество» соединения представляет собой количество, достаточное для предотвращения заболевания или нарушения, или предотвращения его рецидива. Профилактически эффективное количество соединения означает количество терапевтического агента, отдельно или в комбинации с одним или большим количеством других агентов, которое показывает профилактический эффект при предотвращении заболевания. Термин «профилактически эффективное количество» может включать в себя количество, которое улучшает общую профилактику или усиливает профилактическую эффективность другого профилактического агента. В контексте данного документа, если не указано иное, термин «субъект» определен в данном документе как включающий в себя животных, таких как млекопитающие, включая, но не ограничиваясь лишь этими: приматов (например, людей), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей и тому подобное. В конкретных вариантах осуществления, субъект представляет собой человека. Термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению, например, к субъекту-млекопитающему, такому как человек. В отдельных вариантах осуществления, субъект, страдающий ВМД, представляет собой субъект, у которого ранее была диагностирована возрастная макулярная дегенерация.

В контексте данного документа, и если не указано иное, соединение, описанное в данном документе, применяется для охвата всех возможных стереоизомеров, если не указана конкретная стереохимия. Благодаря низкому энергетическому барьеру соединение может существовать в виде одного таутомера или смеси таутомеров. Это может принимать форму протонной таутомерии; или так называемая валентная таутомерия в соединении, например, которые содержат ароматический фрагмент.

В контексте данного документа, и если не указано иное, аналог, такой как цитидин, упоминаемый в данном документе, применяется для охвата свободного основания аналога цитидина или его соли, сольвата, гидрата, сокристалла, комплекса, предлекарства, предшественника, метаболита и/или производного. В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина, упомянутый в данном документе, охватывает свободное основание аналога цитидина или его соль, сольват, гидрат, сокристалл или комплекс. В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина, упомянутый в данном документе, охватывает свободное основание аналога цитидина или его фармацевтически приемлемую соль, сольват или гидрат.

Отличительными признаками этого изобретения является использование агентов для деметилирования промотора ELOVL2, индукции экспрессии гена и улучшения зрительной функции млекопитающего с использованием определенных соединений, таких как 5-азацитидин, децитабин, зебуларин, прокаинамид, прокаин, прокаин, галлат эпигаллокатехина, вальпроевая кислота, гидралазин и аналогичные соединения и производные. Все вместе они описаны в данном документе как «деметилирующий агент».

В одном варианте осуществления, деметилирующий агент инъецируют внутриглазно, например, путем субконъюнктивальной, интравитреальной, субретинальной или ретробульбарной инъекции. Для субконъюнктивальной инъекции может быть использована концентрация в диапазоне от около 1 нг/мл до около 500 мкг/мл. Для интравитреальной инъекции может быть использована концентрация в диапазоне от около 1 мкг/0,1 мл до около 1000 мкг/0,1 мл; одна концентрация, которую можно использовать, составляет около 50 мкг/0,1 мл. Для субретинальной инъекции может быть использована концентрация в диапазоне от около 1 мкг/0,1 мл до около 100 мкг/0,1 мл. Для ретробульбарной инъекции может быть использована концентрация в диапазоне от около 20 мкг/мл до около 1000 мкг/мл. Деметилирующий агент может быть введен в водном растворе, например, связанном с липосомами, или он может быть растворен в органическом растворителе. В другом альтернативном варианте осуществления, деметилирующий агент также может быть предложен в инертном физиологически приемлемом носителе, таком как микросфера, липосома, капсула или полимерный матрикс, путем инъекции или хирургической имплантации в глаз или на глаз. Водные растворители, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: 0,9% физиологический раствор и 5% декстрозу. Органические растворители, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: диметилсульфоксид (ДМСО) или спирт. Имплант может обеспечивать форму деметилирующего агента с медленным высвобождением для достижения постоянной дозы лекарства. Также раскрывается способ снижения начала или прогрессирования диабетической ретинопатии, возрастной дегенерации желтого пятна и/или пигментного ретинита, путем внутриглазного введения препарата, содержащего деметилирующий агент, отдельно или с другими соединениями, которые связаны с деметилирующим агентом, в качестве активного агента в фармацевтически приемлемом препарате и в эффективном количестве, не вызывая существенной токсичности. Композиция может содержать деметилирующий агент в качестве единственного активного агента, другие агенты являются такими, которые существенно не влияют на основные свойства деметилирующего агента. В альтернативном варианте, помимо деметилирующего агента, композиция может содержать другие активные агенты. Композиция может быть инъецирована путем инъекции или имплантирована в глаз. Данное изобретение охватывает способ лечения пациента путем внутриглазного введения композиции, содержащей деметилирующий агент в качестве активного агента в фармацевтически приемлемом препарате, и в количестве, эффективном для лечения дегенерации желтого пятна, ретинопатии или пигментного ретинита без существенной токсичности для глаз. Композиция вводится путем инъекции или имплантации в глаз, и она может быть введена в форме с медленным высвобождением. Препарат с медленным высвобождением, такой как матрикс, может нести количество деметилирующего агента, которое может быть токсичным, если высвобождается с неконтролируемой скоростью, или превышающим терапевтические дозы количеством, но которое приготовлено для высвобождения нетоксичного терапевтического количества деметилирующего агента в течение определенного периода времени. Например, матрикс может содержать от 1 микрограмма до более 10 микрограммов детализирующего агента и может длительно высвобождать нетоксичную поддерживающую дозу демитилирующего агента. Такой матрикс может представлять собой резервуар с диффузионными стенками и может представлять собой липид, поливиниловый спирт, поливинилацетат, поликапролактон, поли(гликолевую) кислоту и/или поли(молочную) кислоту.

Деметилирующий агент может быть инъецирован внутриглазно с использованием интравитреальной (в стекловидное тело), субконъюнктивальной (в субконъюнктивальной), субретинальной (под сетчаткой) или ретробульбарной (за глазным яблоком) инъекции. Для субконъюнктивальной инъекции, может быть использована концентрация дерметизирующего агента в диапазоне от около 1 нг/мл до около 500 мкг/мл. Для интравитреальной инъекции, может быть использована доза деметилирующего агента в диапазоне от около 10,0 нг/0,1 мл до около 1000 мкг/0,1 мл. Для ретробульбарной инъекции, может быть использована доза деметилирующего агента в диапазоне от около 20 мкг/мл до около 1000 мкг/мл. Для субретинальной инъекции, может быть использована доза деметилирующего агента в диапазоне от около 1 мкг/0,1 мл до около 100 мкг/0,1 мл. Однако эти дозировки относятся к препаратам с немедленным высвобождением, и для препаратов с более длительным высвобождением потребуются более высокие концентрации деметилирующего агента. Деметилирующий агент может быть введен внутриглазно в композиции, в которой он является единственным активным агентом. В альтернативном варианте, деметилирующий агент может быть введен внутриглазно в композиции с родственными соединениями. Родственные соединения могут включать в себя иммунодепрессанты, которые включают в себя, но не ограничиваются лишь этими: такролимус, циклофосфамид, сиролимус, атопозид, тиоэпа, метотрексат, азатиоприн (имуран), интерфероны, инфликсимаб, этанерцепт, микофенолата мофетил, 15-дезоксиспергуалин, талидомид, глатирамер, лефлуномид, винкристин, цитарабин и пр. В одном варианте осуществления, композиция, содержащая деметилирующий агент, вводится в количестве или в дозе, которые не приводят к существенной токсичности для глаз. В контексте данного документа, отсутствие существенной токсичности охватывает как отсутствие каких-либо проявлений токсичности, а также проявлений токсичности, которые специалист в данной области техники счел бы недостаточно вредными для уменьшения или прекращения лечения. Форма внутривенного раствора деметилирующего агента может быть разбавлена для достижения указанной концентрации с использованием 0,9% NaCl или 5% декстрозы или органического растворителя, такого как диметилсульфоксид (ДМСО) или спирт. Внутриглазное введение может осуществляться любым из ранее описанных способов введения и препаратов. Для инъекции можно использовать раствор, эмульсию, суспензию, капсульную композицию из микросфер или липосом и пр. Деметелирующий агент может быть введен хирургическим путем в виде глазного имплантата. В качестве одного примера, резервуар, имеющий диффузную стенку из поливинилового спирта или поливинилацетата и содержащий миллиграммы деметилирующего агента, может быть имплантирован в склеру или на нее. В качестве другого примера, деметилирующий агент в миллиграммах может быть включен в полимерный матрикс, имеющий размеры около 2 мм на 4 мм, и изготовлен из полимера, такого как поликапролактон, поли(гликолевая) кислота, поли(молочная) кислота или полиангидрида, или липида, такого как себациновая кислота, и может быть имплантирован в склеру или в глаз. Обычно это достигается, когда пациенту вводят местную или локальную анестезию и делают небольшой разрез (3-4 мм) позади роговицы. Затем матрикс, содержащий деметилирующий агент, вводится через разрез и пришивается к склере с использованием нейлона 9-0. Деметилирующий агент может содержаться в инертном матриксе для инъекции в глаз. В качестве одного из примеров инертного матрикса, липосомы могут быть получены из дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), такого как яичный фосфатидилхолин (ФХ), липида, имеющего низкую теплопередачу. Липосомы получают с использованием стандартных процедур, известных специалистам в данной области техники. Деметилирующий агент, в количествах от нанограмма до микрограмма до миллиграмма добавляется к раствору яичного ФХ, и липофильное лекарственное средство связывается с липосомами. Система доставки лекарственного средства с медленным высвобождением может быть имплантирована внутриглазно, для обеспечения замедленного высвобождения активного агента в течение определенного периода времени. Имплантируемая структура может быть в форме капсулы из любого из ранее описанных полимеров (например, поликапролактон, поли(гликолевая) кислота, поли(молочная) кислота, полиангидрид) или липидов, которые могут быть приготовлены в виде микросфер. В качестве иллюстративного примера, деметилирующий агент может быть смешан с поливиниловым спиртом (ПВС), смесь затем высушена и покрыта этиленвинилацетатом, а затем снова охлаждена ПВС. В препарате для внутриглазной инъекции, липосомальная капсула расщепляться из-за клеточного переваривания и может быть системой доставки лекарственного средства с медленным высвобождением, что позволяет пациенту постоянно подвергаться воздействию препарата в течение продолжительного периода. В препарате с медленным высвобождением, микросфера, капсула, липосома и пр. могут содержать такую концентрацию деметилирующего агента, которая могла бы быть токсичной, если бы его вводили в виде болюсной дозы. Однако введение с медленным высвобождением приготовлено таким образом, чтобы концентрация, высвобождаемая за любой период времени, не превышала токсического количества. Это достигается, например, с помощью различных препаратов носителя (микросферы с покрытием или без покрытия, капсулы с покрытием или без покрытия, липидные или полимерные компоненты, однослойная или многослойная структура и комбинации вышеперечисленного и пр.). Другие переменные могут включать в себя фармакокинетико-фармакодинамические параметры пациента (например, массу тела, пол, скорость плазменного клиренса, функцию печени и пр.). В зависимости от количества деметилирующего агента, который предложен в препарате, пациенту может быть введена доза в течение нескольких лет с помощью одного имплантата или инъекции. В качестве иллюстративных, но не ограничивающих примеров, капсула может быть загружена 1-2 мг деметилирующим агентом; если капсула приготовлена с расчетом на высвобождение нескольких микрограммов лекарства в день, пациенту можно будет вводить дозу в течение около 1000 дней, или почти трех лет. В качестве другого примера, если в капсуле содержится 5 мг лекарства, пациенту можно будет вводить дозу около пятнадцати лет. Такой препарат предлагает преимущества, которые включают в себя точное дозирование с повышенным удобством для пациента, поскольку вмешательство в некоторых случаях требуется только один или два раза в десятилетие или даже реже. Приготовление и загрузка микросфер, микрокапсул, липосом и пр. и их глазная имплантация представляют собой стандартные методы, известные специалистам в данной области техники, например, использования имплантата с медленным высвобождением ганцикловира для лечения цитомегаловирусного ретинита, описанного в Vitreoretinal Surgical Techniques, Peyman et al., Eds. (Martin Dunitz. London 2001, chapter 45); Handbook of Pharmaceutical Controlled Release Technology, Wise, Ed. (Marcel Dekker, New York 2000), соответствующие разделы которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Деметилирующий агент, отдельно или в комбинации с другими агентами, может быть введен внутриглазно и без существенной токсичности для лечения ретинопатии, такой как у пациентов с диабетом, дегенерации желтого пятна и пигментным ретинитом, с использованием способов и препаратов, описанных ранее.

В данном документе предложены способы лечения глазного заболевания, включая в себя ВМД, с использованием аналога цитидина в виде соли, сольвата, гидрата, предшественника и/или производного. Некоторые из способов, предложеных в данном документе, включают в себя лечение глазного заболевания с использованием комбинации двух или большего количества активных агентов, включая 5-азацитидин.

Аналоги нуклеозидов прошли клинические испытания для лечения некоторых видов рака, но не для лечения глазных болезней. Аналоги нуклеозидов 5-азацитидин (также известный как 4-амино-1-β-D-рибофуранозил-1,3,5-триазин-2(1H)-он; обозначение национального центра обслуживания NSC-102816; регистрационный номер CAS 320-67-2; азацитидин; Aza и AZA; и в настоящее время продается как VIDAZA®) и 2'-дезокси-5-азацитидин (также известный как 5-аза-2'-дезоксицитидин, децитабин, Dae и DAC, и в настоящее время продается как DACOGEN®) - ингибиторы ДНК-метилтрансферазы (DNMT), одобренные Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для лечения миелодиспластических синдромов (МДС). Азацитидин и децитабин представляет собой аналоги цитидина; структурное различие между этими аналогами цитидина и их родственными природными нуклеозидами заключается в наличии азота в положении 5 цитозинового кольца вместо углерода. Азацитидин может быть определен как имеющий молекулярную формулу C8Hi2N4O5, молекулярную массу 244,21 г на моль и структуру, показанную ниже. Децитабин может быть определен как имеющий молекулярную формулу C8Hi2N4O4, и молекулярную массу 228,21 г на моль.

В одном варианте осуществления, способы предложены в данном документе, включают в себя введение или одновременное введение одного или большего количества аналогов цитидина. В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина представляет собой 5-азацитидин (азацитидин). В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина представляет собой 5-аза-2'-дезоксицитидин (децитабин). В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина представляет собой 5- азацитидин (азацитидин) или 5-аза-2'-дезоксицитидин (децитабин). В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина представляет собой, например: 1-β-D-арабинофуранозилцитозин (цитарабин или ara-C); псевдоизо-цитидин (psi ICR); 5-фтор-2'-дезоксицитидин (FCdR); 2'-дезокси-2',2'-дифторцитидин (гемцитабин); 5-аза-2'-дезокси-2', 2'-дифторцитидин; 5-аза-2'-дезокси-2'-фторцитидин; 1-β-D-рибофуранозил-2 (1H) -пиримидинон (зебуларин); 2', 3'-дидезокси-5-фтор-3'-тиацитидин (Emtriva); 2'-циклоцитидин (анцитабин); 1-β-D-арабинофуранозил-5-азацитозин (фазарабин или ara-AC); 6-азацитидин (6-аза-CR); 5,6-дигидро-5-азацитидин (dΗ-аза-CR); N4-пентилоксикарбонил-5'-дезокси-5-фторцитидин (капецитабин); N4-октадецилцитарабин; или цитарабин элаидиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, аналоги цитидина, предложены в данном документе, включают в себя любое соединение, которое структурно связано с цитидином или дезоксицитидином и функционально имитирует и/или противодействует действию цитидина или дезоксицитидина.

Некоторые варианты осуществления данного документа предлагают соли, сокристаллы, сольваты (например, гидраты), комплексы, пролекарства, предшественники, метаболиты и/или другие производные аналогов цитидина, предложеных в данном документе. Например, определенные варианты осуществления предлагают соли, сокристаллы, сольваты (например, гидраты), комплексы, предшественники, метаболиты и/или другие производные 5-азацитидина. Некоторые варианты осуществления данного документа предлагают соли, сокристаллы и/или сольваты (например, гидраты) аналогов цитидина, предложеных в данном документе. Некоторые варианты осуществления данного документа предлагают соли и/или сольваты (например, гидраты) аналогов цитидина, предложеных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предложены аналоги цитидина, которые не являются солями, сокристаллами, сольватами (например, гидратами) или комплексами аналогов цитидина, предложеных в данном документе. Например, в определенных вариантах осуществления предложены 5-азацитидин в неионизированной, несольватированной (например, безводной) некомплексной форме. Некоторые варианты осуществления данного документа предлагают смесь двух или более аналогов цитидина, предложеных в данном документе. Предложены в данном документе аналоги цитидина могут быть приготовлены с использованием способов и процедур синтеза, упомянутых в данном документе или иным образом доступных в литературе. Например, определенные способы синтеза 5-азацитидина раскрыты, например, в патенте США № 7038038 и обсуждаемых в нем источниках, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. Другие аналоги цитидина, предложены в данном документе, могут быть получены, например, с использованием процедур, известных в данной области техники, или могут быть приобретены из коммерческого источника. В одном варианте осуществления, соединение, используемое в способах, предложеных в данном документе, представляет собой свободное основание или его фармацевтически приемлемую соль или сольват. В одном варианте осуществления, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой твердое вещество. В другом варианте осуществления, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой твердое вещество в аморфной форме. В еще другом варианте осуществления, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль или сольват представляет собой твердое вещество в кристаллической форме. Например, в определенных вариантах осуществления предложен 5-азацитидин в твердых формах, который может быть получен, например, способами, описанными в патентах США № 6943249, 6887855 и 7078518, и публикациях патентных заявок США № 2005/027675 2006/247189, и WO2010/093435, каждая из которых в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления, 5-азацитидин в твердых формах можно приготовить с использованием других способов, известных в данной области техники.

В одном варианте осуществления, соединение, используемое в способах, предложеных в данном документе, представляет собой фармацевтически приемлемую соль аналога цитидина, которая включает в себя, но не ограничивается лишь этими: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат (безилат), бисульфат, бутират, цитрат, камфорсульфонат, циклопентанепропионат, диглюконат, додецилсульфат, 1,2-этандисульфонат (эдисилат), этансульфонат (эзилат), формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гликолат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат (мезилат), 2-нафталинсульфонат (напсилат), никотинат, нитрат, оксалат, 3-фенилсульфат, пальмоат, пепропилат фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, тозилат, или соли ундеканоата.

Фармацевтические Композиции: В одном варианте осуществления данного документа, предложены фармацевтические композиции, которые содержат один или большее количество аналогов цитидина или их фармацевтически приемлемую соль или сольват в качестве активного ингредиента в комбинации с одним или большим количеством фармацевтически приемлемого носителя. В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция включает по меньшей мере один эксципиент или носитель, не контролирующий высвобождение. В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один эксципиент или носитель, контролирующий высвобождение, и по меньшей мере один эксципиент или носитель, не контролирующий высвобождение.

В некоторых вариантах осуществления, аналог цитидина, используемый в фармацевтических композициях, предложеных в данном документе, находится в твердой форме. Подходящие твердые формы включают в себя, но не ограничиваются ими, твердые формы, содержащие свободное основание аналога цитидина, и твердые формы, содержащие соли аналога цитидина. В некоторых вариантах осуществления, твердые формы, предложены в данном документе, включают в себя полиморфы, сольваты (включая гидраты) и сокристаллы, содержащие аналог цитидина и/или его соли. В некоторых вариантах осуществления, твердая форма представляет собой кристаллическую форму аналога цитидина или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата.

В одном варианте осуществления, предложены в данном документе фармацевтические композиции могут быть приготовлены в различных дозированных формах для оптического, интравитреального, парентерального и местного введения. Фармацевтические композиции также могут быть приготовлены в виде дозированных форм с модифицированным высвобождением, включая в себя лекарственные формы с отсроченным, пролонгированным, пролонгированным, медленным, импульсным, контролируемым, ускоренным и быстрым, направленным, запрограммированным высвобождением и задержкой в желудке. Эти дозированные формы могут быть приготовлены в соответствии с обычными способами и методами, известными специалистам в данной области техники (см., например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Modified-Release Drug Delivery Technology, Rathbone et al, eds., Drugs and the Pharmaceutical Science, Marcel Dekker, Inc.: New York, NY, 2003; Vol. 126). В одном варианте осуществления, фармацевтические композиции предложены в дозированной форме для внутривитрального введения. В другом варианте осуществления, фармацевтические композиции предложены в дозированной форме для парентерального введения. В еще другом варианте осуществления, фармацевтические композиции предложены в дозированной форме для местного применения.

В одном варианте осуществления фармацевтические композиции, предложены в данном документе, могут быть введены местно в глаз или внутри стекловидного тела в форме вставок, инъекций, имплантатов, паст, порошков, повязок, кремов, пластырей, мазей, растворов, эмульсий, суспензий, гелей, пены или спреев. Эти дозированные формы могут быть изготовлены с использованием обычных процессов, как описано, например, в Remington, The Science and Practice of Pharmacy, выше. Предлагаемые в данном документе фармацевтические композиции для местного применения могут быть приготовлены с немедленным высвобождением или модифицированным высвобождением, включая отсроченное, медленное, импульсное, контролируемое, направленное и запрограммированное высвобождение.

В данное время децитабин разрабатывается как лекарственное средство для лечения хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), миелодиспластического синдрома (МДС), немелкоклеточного рака легкого (НМКЛ), серповидноклеточной анемии и острого миелоцитарного лейкоза (ОМЛ).

Децитабин может включать в себя препарат, содержащий: (а) соединение формулы, показанное на фигуре imgf000003_0001 из WO2013033176, или его фармацевтически приемлемую соль; растворенный в (b) практически безводном растворителе, содержащем от около 45% до около 85% пропиленгликоля; от около 5% до около 45% глицерина; и от 0% до около 30% этанола. В некоторых вариантах осуществления, указанный растворитель содержит от около 65% до около 70% пропиленгликоля; от около 25% до около 30% глицерина и от 0% до около 10% этанола.

Данное изобретение предлагает композицию, содержащую деметилирующий агент, и фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель. Термин «фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель» относится к среде, которая используется для приготовления желаемой дозированной формы соединения. Фармацевтически приемлемый эксципиент или носитель может включать в себя один или большее количество растворителей, разбавителей или других жидких носителей; средства для диспергирования или суспендирования; поверхностно-активные вещества; изотонические агенты; загустители или эмульгаторы; консерванты; твердые связующие; смазочные материалы; и тому подобное. Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) и Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe ed. (American Pharmaceutical Assoc. 2000), раскрывают различные носители, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные методы их приготовления. В одном варианте осуществления, фармацевтически приемлемый эксципиент не является вредным для млекопитающего (например, пациента-человека) при введении в глаз (например, путем внутриглазной инъекции). Для внутриглазного введения, например, но не ограничения, терапевтический агент можно вводить в сбалансированном солевом растворе (ССР) или сбалансированном солевом растворе плюс (ССР плюс) (Alcon Laboratories, Форт-Уэрт, Техас, США). В родственном аспекте, согласно данному изобретению предложен стерильный контейнер, например, флакон, содержащий терапевтически приемлемый деметилирующий агент, необязательно лиофилизированный препарат.

Другой вариант осуществления, согласно данному изобретению относится к введению конструкций нуклеиновых кислот, которые способны воздействовать на ингибирование метилирования с помощью генной терапии.

WO 2001/58494 направлен на лечение или профилактику глазного заболевания, такого как возрастная дегенерация желтого пятна, путем контактирования глазной клетки с вектором экспрессии, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ингибитор ангиогенеза и нейротрофический агент. В конкретных вариантах осуществления, ингибитор ангиогенеза и нейротрофический агент представляют собой одно и то же, например, фактор пигментного эпителия (ФПЭ). WO 2002/13812 относится к использованию инсулин-сенсибилизирующего агента, предпочтительно агонистов рецептора-γ, активируемого пролифератором пероксисом (АППРγ), для лечения воспалительного заболевания, такого как офтальмологическое заболевание. WO 200/52479 касается диагностики, лечения и профилактики друзеноподобных нарушений (любого нарушения, которое включает в себя образование друзы), включая ВМД. В конкретных вариантах осуществления, существуют способы, относящиеся к обеспечению эффективного количества агента, который ингибирует пролиферацию или дифференцировку иммунных клеток, такого как антагонисты TNF-альфа.

В одном аспекте, данное изобретение предлагает методы лечения индивида с ВМД (например, индивидуума, у которого обнаружен полиморфизм или гаплотип, указывающий на повышенный риск развития симптоматической ВМД) или другого заболевания, включающего ген метилирующего варианта ELOVL2. В одном варианте осуществления, способ включает в себя введение пациенту агента, который снижает количество ELOVL2 метилирующего варианта или экспрессию гена, отвечающего за метилирование ELOVL2, в количестве, эффективном для ослабления симптома заболевания у пациента. В родственном варианте осуществления, индивиду вводят терапевтическое количество ингибитора (например, инактиватора) варианта полипептида метилирования ELOVL2.

В одном варианте осуществления, индивиду вводят ингибирующую нуклеиновую кислоту (например, РНК, комплементарную по меньшей мере части нуклеотидной последовательности варианта полипептида метилирования ELOVL2). В одном варианте осуществления, вводят очищенную антисмысловую РНК, комплементарную РНК, кодирующей вариант полипептида метилирования ELOVL2.

В другом варианте осуществления, вводят терапевтическое количество антитела против белка метилирующего ELOVL-2, достаточное для частичной инактивации варианта полипептида метилирования ELOVL2 у индивида.

В одном аспекте, согласно данному изобретению предложены векторы для генной терапии, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид метилирования ELOVL2. Вектор может включать в себя промотор, который управляет экспрессией гена метилирования ELOVL2 в нескольких типах клеток. В альтернативном варианте, вектор может включать в себя промотор, который управляет экспрессией гена метилирования ELOVL2 только в определенных типах клеток, например, в клетках сетчатки. В одном аспекте, предложены фармацевтические композиции, содержащие вектор для генной терапии, кодирующий белок метилирования ELOVL2, и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция не содержит патогенов и подходит для введения пациенту-человеку. В одном варианте осуществления, кодируемый полипептид метилирования ELOVL2 представляет собой защитный вариант.

В одном аспекте, согласно данному изобретению предложена композиция, содержащая рекомбинантный или очищенный полипептид метилирования ELOVL2, где полипептид является защитным вариантом.

В родственном аспекте, согласно данному изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный или очищенный полипептид метилирования ELOVL2 и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция не содержит патогенов и подходит для введения пациенту-человеку. В одном варианте осуществления, кодируемый полипептид метилирования ELOVL2 имеет последовательность дикого типа. В одном варианте осуществления, кодируемый полипептид метилирования ELOVL2 представляет собой защитный вариант.

В одном аспекте, согласно данному изобретению предложены антитела, которые специфически взаимодействуют с вариантом полипептида метилирования ELOVL2, но не с полипептидом метилирования ELOVL2 дикого типа. Эти антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены субтрактивными методами. Этих антител может быть достаточно для инактивации варианта полипептида метилирования ELOVL2. В родственном аспекте, согласно данному изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие антитело против метилирования ELOVL2 и фармацевтически приемлемый эксципиент, где композиция не содержит патогенов и подходит для введения пациенту-человеку.

В одном аспекте, согласно данному изобретению предложены способы идентификации вариантов белков метилирования ELOVL2, связанных с повышенным или пониженным риском развития ВМД. В одном варианте осуществления, согласно данному изобретению предложен способ идентификации защитного белка метилирования ELOVL2 посредством (а) идентификации индивида как имеющего защитный гаплотип и (b) определения аминокислотной последовательности(ей) метилирования ELOVL2, кодируемой в геноме индивида, где защитный белок метилирования ELOVL2 кодируется аллелем, имеющим защитный гаплотип. В одном варианте осуществления, согласно данному изобретению предложен способ идентификации нейтрального белка метилирования ELOVL2 посредством (а) идентификации индивида как имеющего нейтральный гаплотип и (b) определения аминокислотной последовательности(ей) метилирования ELOVL2, кодируемой в геноме индивида, где нейтральный белок метилирования ELOVL2 кодируется аллелем, имеющим нейтральный гаплотип. В родственном варианте осуществления, согласно данному изобретению предложен способ идентификации вариантной формы метилирования ELOVL2, связанной со сниженным риском развития ВМД, включающий в себя (а) идентификацию индивида как имеющего гаплотип или диплотип, связанный со сниженным риском развития ВМД; (б) получение геномной ДНК или РНК от индивида; и (c) определение аминокислотной последовательности(ей) метилирования ELOVL2, кодируемой в геноме индивида, где защитный белок метилирования ELOVL2 кодируется аллелем, имеющим гаплотип, связанный со сниженным риском развития ВМД. В одном из вариантов осуществления, защитные или нейтральные белки метилирования ELOVL2 не имеют аминокислотной последовательности полипептида метилирования ELOVL2 дикого типа.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, векторы для генной терапии содержат необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности (и могут включать в себя, например, промотор, энхансер, другие регуляторные элементы). Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Промоторы могут быть выбраны для нацеливания на преимущественную экспрессию гена в ткани-мишени, такой как ПЭС (последние обзоры см. в Sutanto et al., 2005, “Development and evaluation of the specificity of a cathepsin D proximal promoter in the eye” Curr Eye Res. 30:53-61; Zhang et al., 2004, “Concurrent enhancement of transcriptional activity and specificity of a retinal pigment epithelial cell-preferential promoter” Mol Vis. 10:208-14; Esumi et al., 2004, “Analysis of the VMD2 promoter and implication of E-box binding factors in its regulation” J Biol Chem 279:19064-73; Camacho-Hubner et al., 2000, “The Fugu rubripes tyrosinase gene promoter targets transgene expression to pigment cells in the mouse” Genesis. 28:99-105; and references therein).

Подходящие вирусные векторы включают в себя ДНК-вирусные векторы (такие как аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, лентивирусные векторы и векторы вируса осповакцины) и РНК-вирусные векторы (такие как ретровирусные векторы). В одном варианте осуществления, используется вектор аденоассоциированного вируса (AAВ). Последние обзоры см. в Auricchio et al., 2005, “Adeno-associated viral vectors for retinal gene transfer and treatment of retinal diseases” Curr Gene Ther. 5:339-48; Martin et al., 2004, Gene therapy for optic nerve disease, Eye 18:1049-55; Ali, 2004, “Prospects for gene therapy” Novartis Found Symp. 255:165-72; Hennig et al., 2004, “AAV-mediated intravitreal gene therapy reduces lysosomal storage in the retinal pigmented epithelium and improves retinal function in adult MPS VII mice” Mol Ther. 10:106-16; Smith et al., 2003, “AAV-Mediated gene transfer slows photoreceptor loss in the RCS rat model of retinitis pigmentosa” Mol Ther. 8:188-95; Broderick et al., 2005, “Local administration of an adeno-associated viral vector expressing IL-10 reduces monocyte infiltration and subsequent photoreceptor damage during experimental autoimmune uveitis” Mol Ther. 12:369-73; Cheng et al., 2005, “Efficient gene transfer to retinal pigment epithelium cells with long-term expression. Retina 25:193-201; Rex et al., “Adenovirus-mediated delivery of catalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboring photoreceptors from photo-oxidative stress. Hum Gene Ther. 15: 960-7; и цитируемые там ссылки).

Векторы для генной терапии должны продуцироваться в соответствии с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), что делает продукт пригодным для введения пациентам. Согласно данному изобретению предложены векторы для генной терапии, подходящие для введения пациентам, включающие в себя векторы для генной терапии, которые продуцируются и тестируются в соответствии с требованиями GMP. Векторы для генной терапии, подлежащие одобрению FDA, должны быть проверены на эффективность и идентичность, должны быть стерильными, не содержать посторонних материалов, и все ингредиенты в продукте (т.е. консерванты, разбавители, адъюванты и т.п.) должны соответствовать стандартам чистоты и качества, и не быть вредными для пациента. Например, показано, что препарат нуклеиновой кислоты не содержит микоплазм. См., например, Islam et al., 1997, An academic centre for gene therapy research and clinical grade manufacturing capability, Ann Med 29, 579-583.

Способы введения векторов генной терапии известны. В одном варианте осуществления, векторы экспрессии ELOVL2 вводят системно (например, внутривенно или путем инфузии). В одном варианте осуществления векторы экспрессии ELOVL2 вводят локально (т.е. непосредственно в конкретную ткань или орган, например, глаз. В одном предпочтительном варианте осуществления, векторы экспрессии ELOVL2 вводят непосредственно в глаз (например, путем глазной инъекции). Последние обзоры см., например, Dinculescu et al., 2005, “Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease” Hum Gene Ther. 16:649-63; Rex et al., 2004, “Adenovirus-mediated delivery of catalase to retinal pigment epithelial cells protects neighboring photoreceptors from photo-oxidative stress” Hum Gene Ther. 15:960-7; Bennett, 2004, “Gene therapy for Leber congenital amaurosis” Novartis Found Symp. 255:195-202; Hauswirth et al., “Range of retinal diseases potentially treatable by AAV-vectored gene therapy” Novartis Found Symp. 255:179-188, и цитируемые там ссылки).

Таким образом, в одном аспекте согласно данному изобретению предложен препарат, содержащий вектор генной терапии, кодирующий белок ELOVL2 или полипептид ELOVL2, необязательно вирусный вектор, где вектор генной терапии подходит для введения субъекту-человеку и в наполнителе, подходящем для введения субъекту-человеку (например, продуцирован с использованием методов GLP). При необходимости вектор генной терапии, содержащий промотор, который предпочтительно или специфически экспрессируется в клетках пигментированного эпителия сетчатки.

Способы профилактики и лечения орбитальных нарушений, связанных с глазным старением у млекопитающих, могут включать в себя нанесение композиции для местного применения, содержащей количество, усиливающее проницаемость, одного или большего количества усилителей проникновения и одного или большего количества биологически активных агентов, которые проникают в подлежащие ткани и в сосудистую сеть орбиты. Целью этого способа является предотвращение и лечение глазных заболеваний, таких как дегенерация желтого пятна, а также образование катаракты, глаукома и диабетическая ретинопатия.

Чтобы увеличить проницаемость кожи для фармакологически активного агента, доставке лекарственного средства в глаз может способствовать усилитель проникновения или проницательный усилитель, который увеличивает скорость, с которой лекарство диффундирует через кожу и попадает в ткани и кровоток. Химический усилитель проникновения через кожу увеличивает проницаемость кожи за счет обратимого изменения физико-химической природы рогового слоя, снижая его диффузионное сопротивление.

Известно, что многие химические соединения усиливают проникновение через кожу. Большинство соединений в целом признаны безопасными (GRAS) ингредиентами, которые составители готовой формы часто считают инертными. Osborne D W, Henke J J, Pharmaceutical Technology, Nov. 1997, pp 58-86. Соединения, цитируемые в статье, включены посредством ссылки. Примеры усилителей проникновения включают в себя: спирты, такие как этанол и изопропанол; полиолы, такие как н-алканолы, лимонен, терпены, диоксолан, пропиленгликоль, этиленгликоль, другие гликоли и глицерин; сульфоксиды, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид, метилдодецилсульфоксид, диметилацетамид; сложные эфиры, такие как изопропилмиристат/пальмитат, этилацетат, бутилацетат, метилпропионат и каприновые/каприловые триглицериды; кетоны; амиды, такие как ацетамиды; олеаты, такие как триолеин; различные поверхностно-активные вещества, такие как лаурилсульфат натрия; различные алкановые кислоты, такие как каприловая кислота; соединения лактама, такие как азон; алканолы, такие как олеиловый спирт; диалкиламиноацетаты и смеси.

Ряд патентов раскрывает использование усилителей проникновения для трансдермальной доставки лекарств. Патент США № 5837289 раскрывает использование по меньшей мере двух отдельных усилителей проникновения в креме для доставки обширного списка лекарств. Патент США № 5238933 раскрывает композицию усилителя проникновения через кожу, содержащую низший алифатический эфир низшей алифатической карбоксильной кислоты в комбинации с низшим алканолом для введения активного агента. Патент США № 5229130 раскрывает усилитель проникновения через кожу на основе растительного масла для доставки активных агентов через кожу. Патент США № 4933184 раскрывает трансдермальную композицию, в которой метанол используется для доставки лекарств, либо последовательно, либо одновременно. Патент США № 4342784 раскрывает способ местного введения геля с ДМСО и карбоксиполиметиленовой смолы с нейтрализующим агентом, чтобы кожная соль разрушила гель с высвобождением ДМСО. Патент США № 5482965 раскрывает трансдермальную композицию, содержащую диоксан. Патенты США № 5620980 и № 5807957, раскрывают использование диоксолана и уретана для лечения выпадения волос.

В одном аспекте, трансконъюнктивальному проникновению Деметилирующих Агентов и терапевтических, фармацевтических, биохимических и биологических агентов или соединений могут способствовать усилители, которые могут быть использованы для дальнейшего ускорения проникновения этих агентов в переднюю камеру, трабекулярную сеть, цилиарное тело, сосудистую оболочку и сетчатку. Усилители проникновения не только эффективно проникают через мембрану, но эти усилители также позволяют другим биологически активным агентам более эффективно проходить через определенную мембрану. Усилители проникновения оказывают свое действие различными способами, такими как разрушение клеточных слоев поверхности конъюнктивального мешка, взаимодействующих с внутриклеточными белками и липидами, или улучшение распределения биоактивных агентов при их контакте со слизистыми мембранами.

С помощью этих усилителей, макромолекулы до 10 кДа могут проходить через слои конъюнктивального мешка глаз, достигая места глаукомы, где кровеносные сосуды и сетчатка подвергаются патологическим изменениям. Эти усилители должны быть нетоксичными, фармакологически инертными, неаллергическими веществами. В общем, эти усилители могут включать в себя анионные поверхностно-активные вещества, мочевину, жирные кислоты, жирные спирты, терпены, катионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, цвиттерионные поверхностно-активные вещества, полиолы, амиды, лактам, ацетон, спирты и сахара. В одном аспекте, усилитель проникновения 10, включает в себя диалкилсульфоксиды, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), децилметилсульфоксид, додецилдиметилфосфиноксид, октилметилсульфоксид, нонилметилсульфоксид, ундецилметилсульфоксид, додецилсульфат натрия и фенилпиперазин, или любую комбинацию. В другом аспекте, усилитель проникновения может включать в себя лауриловый спирт, диизопропилсебацинат, олеиловый спирт, диэтилсебацинат, диоктилсебацинат, диоктилазелат, гексиллаурат, этилкапрат, бутилстеарат, дибутилсебацинат, диоктиладипат, пропиленгликоль дипеларгонат, этиллаурат, бутиллаурат, этилмиристат, бутилмиристат, изопропилпальмитат, изопропилизостеарат, 2-этилгексилпеларгонат, бутилбензоат, бензилбензоат, бензилсалицилат, дибутилфталат или любую комбинацию. В одном аспекте, усилитель проницаемости кожи составляет, по меньшей мере, более 1% массы на объем, массы на массу, или мольных процентов.

В другом аспекте, усилитель проницаемости слизистой оболочки может составлять по меньшей мере более 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%. 3,5%. 4,0%. От 4,5% до 50% массы на объем, масссы на массу, или мольных процентов. В одном аспекте, усилитель проницаемости слизистой оболочки представляет собой диметилсульфоксид. В этом аспекте, количество диметилсульфоксида может составлять от 2% до 10%. От 2% до 9,5%. От 3% до 8%. От 3% до 7% или от 4% до 6% масы на объем, массы на массу, в мольных процентах или любое эффективное терапевтическое количество.

Терапевтический препарат также может содержать нетоксичные эмульгирующие, консервирующие, увлажняющие агенты, агенты для тела, такие как, например, полиэтиленгликоли 200, 300, 400 и 600, карбоваксы 1000, 1500, 4000, 6000 и 10000, антибактериальные компоненты, такие как четвертичные аммонийные соединения, соли фенилртути, которые, как известно, обладают свойствами холодной стерилизации и которые не причиняют вреда при использовании, метил- и пропилпарабен, бензиловый спирт, фенилэтанол, буферные ингредиенты, такие как борат натрия, ацетаты натрия, глюконатные буферы и другие обычные ингредиенты, такие как сорбитан монолаурат, триэтаноламин, олеат, полиоксиэтилен сорбитан монопальмитат, диоктилсульфосукцинат натрия, монотиоглицерин, тиосорбит, этилендиамин-тетрацитат. Кроме того, подходящие офтальмологические носители могут быть использованы в качестве носителей для текущей цели, включая обычные фосфатные буферные системы носителей, носители изотонической борной кислоты, носители изотонического хлорида натрия, носители изотонического бората натрия и т.п.

Препарат терапевтических агентов агента деметилирования может также содержать поверхностно-активные вещества, такие как полисорбатные поверхностно-активные вещества, полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества (BASF Cremaphor), фосфонаты, сапонины и полиэтоксилированные касторовые масла и полиэтоксилированные касторовые масла, которые имеются в продаже.

Фармацевтический препарат также может содержать увлажняющие агенты, которые уже используются в офтальмологических растворах, такие как арбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, глицерин, маннит, поливиниловый спирт или гидроксиэтилцеллюлоза, а разбавляющим агентом может быть вода, дистиллированная вода, стерильная вода или искусственные слезы. Увлажняющий агент присутствует в количестве от около 0,001% до около 10%.

Офтальмологический препарат согласно данного изобретения может включать в себя кислоты и основания для регулирования pH; агенты, придающие тоничность, такие как сорбит, глицерин и декстроза; другие агенты, придающие вязкость, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, поливинилпиррдидон, поливиниловый спирт и другие смолы; подходящие усилители абсорбции, такие как поверхностно-активные вещества, желчные кислоты; стабилизирующие агенты, такие как антиоксиданты, такие как бисульфиты и аскорбаты; хелатирующие агенты с металлами, такие как натрий ЭДТА; и усилители растворимости лекарств, такие как полиэтиленгликоли. Эти дополнительные ингредиенты помогают создавать стабильные коммерческие растворы, поэтому их не нужно смешивать по мере необходимости.

Композиции офтальмологических лекарственных средств будут составлены таким образом, чтобы они были совместимы с глазом и/или контактными линзами. Препарат глазных капель должен быть изотоничным с кровью. Поскольку офтальмологические композиции, предназначенные для непосредственного нанесения на глаз, они будут составлены так, чтобы иметь pH и тоничность, совместимые с глазом. Обычно для этого требуется буфер для поддержания pH композиции на уровне или близком к физиологическому (например, 7,4) и может потребоваться агент тоничности для доведения осмоляльности композиции до уровня или около 210-320 миллимолей на килограмм (мОсм/кг).

ПРИМЕРЫ

Клеточные линии WI-38 и IMR-90 ранее были описаны как широко используемые модели для изучения клеточного старения. Было показано, что обе клеточные линии демонстрируют значительные изменения фенотипа с течением времени и числа удвоений популяции (УП) [19, 20]. Скорость их роста, измеренная как конфлюэнтность с помощью программного обеспечения для визуализации, заметно снижается от более низкого УП к более высокому (Фиг. 6A и 7A). Процент положительных по старению клеток, измеренный с помощью окрашивания бета-галактозидазой, ассоциированного со старением (АС-β-Gal), увеличивается по мере увеличения УП (Фиг. 6B и Фиг. 7B), а их морфология изменяется с более вытянутой формы на более широкую, плоскую форму (Фиг. 6С).

Исследования профилей метилирования при старении человека показали, что метилирование промоторной области ELOVL2, безусловно, наиболее существенно коррелирует с возрастом [3]. Для исследования изменений уровня метилирования промотора ELOVL2 в стареющих клетках WI38 и IMR90 использовалась иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP). Были сконструированы праймеры, содержащие определенные CpG, описанные в таблице 1. Используя этот подход, было обнаружено, что метилирование промотора возрастает с увеличением удвоения клеточной популяции (Фиг. 1A). Поскольку ранее было показано, что метилирование промоторной области ингибирует транскрипцию [21], было исследовано, коррелирует ли уровень экспрессии ELOVL2 обратно с метилированием промотора ELOVL2. С помощью кПЦР в реальном времени было обнаружено, что уровень экспрессии гена снижается с увеличением числа УП (Фиг. 1B и Фиг. 7C), что привело к заключению, что экспрессия ELOVL2 подавляется в стареющих клетках, что сопровождается увеличением метилирования промотора ELOVL2 и процентного содержания стареющих клеток в культуре.

Было исследовано, может ли модуляция экспрессии ELOVL2 влиять на клеточное старение. Во-первых, используя лентивирусную кшРНК, экспрессия ELOVL2 в клетках WI-38 и IMR-90 была нокаутирована (Фиг. 6E и Фиг. 8D), и наблюдалось значительное снижение скорости пролиферации (Фиг. 1C), а также увеличение количества стареющих клеток в культуре, обнаруженных с помощью окрашивания АС-β-Gal (Фиг. 1D), и морфологические изменения, соответствующие клеткам с высоким УП (Фиг. 6D). Все наблюдения вместе показали увеличение измеряемого возраста фибробластов.

Было проверено влияние уровня метилирования промотора ELOVL2 на экспрессию ELOVL2. Фибробласты WI-38 были обработаны 5-аза-2’-дезоксицитидином (5-азацитидином), аналогом цитидина, который ингибирует ДНК-метилтрансферазу [22]. Клетки обрабатывали 2 мкМ 5-азацитидином в течение 2 дней, а затем культивировали 5 дней без соединения. В конце эксперимента экспрессия ELOVL2 была измерена с помощью кПЦР в реальном времени. Было обнаружено, что после обработки 5-азацитидином, метилирование промотора ELOVL2 снижается (Фиг. 2A), тогда как экспрессия ELOVL2 повышается (Фиг. 2B). Более того, после обработки 5-азацитидином в культуре наблюдали более низкий процент стареющих клеток (Фиг. 2C). Эти данные предполагают, что уменьшение метилирования промотора ELOVL2 положительно влияет на экспрессию ELOVL2 и измеряемый возраст фибробластов.

Зрение - один из главных предсказателей старения. Показатель контрастной чувствительности зрения входил в пятерку лучших индивидуальных предсказателей возраста относительно 377 оцененных показателей [23]. Белки ELOVL имеют высокий уровень экспрессии в глазах, и некоторые из них причастны к глазным заболеваниям [9, 24]. Однако, в модели метилирования только ELOVL2 содержит метки метилирования, которые сильно коррелируют с возрастом [3]. Поэтому было исследовано, изменяется ли уровень экспрессии ELOVL2 в мышиных сетчатках дикого типа (C57BL/6) с возрастом. С помощью кПЦР и вестерн-блоттинга было обнаружено, что, аналогично данным для стареющих фибробластов человека, уровень экспрессии ELOVL2 обратно коррелирует с возрастом животного (Фиг. 3A и 3B). Наиболее важно, что анализ MeDIP показал, что метилирование промотора ELOVL2 в сетчатке увеличивается с возрастом животного (Фиг. 3C).

Параллельно исследовались уровни метилирования промотора ELOVL2 и экспрессии мРНК в сетчатке, иссеченной из карликовых мышей Ames (Prop1^df), которые живут значительно дольше и проявляют многие симптомы замедленного старения по сравнению с мышами дикого типа [25, 26]. Было показано, более низкое метилирование промотора ELOVL2 и повышенную экспрессию в сетчатках старых карликовых мышей Ames, по сравнению с старыми мышами дикого типа (Фиг. 9). Это предполагает, что экспрессия и метилирование ELOVL2 могут свидетельствовать о здоровье животных.

Было определено, изменяются ли зрительные способности и структура глаз в течение исследуемого возраста животного. Во-первых, были определены структурные изменения с использованием автофлуоресцентной визуализации глазного дна мышей C57BL/6 дикого типа в возрасте 2 месяцев, 6 месяцев, 1 год и 2 года. Было замечено, что аутофлуоресцентные точечные агрегаты начинают появляться на глазном дне в возрасте 1 года и становятся очень выраженными в возрасте 2 лет (Фиг. 3D и Фиг. 8A). Затем для определения зрительной функции стареющих мышей был проведен анализ электроретинограммы (ЭРГ). С возрастом мышей количество и чувствительность палочек уменьшается [27]. Действительно, у более старых мышей наблюдалась уменьшенная амплитуда ответа палочек на ЭРГ (Фиг. 3D и 3E).

Чтобы исследовать, играет ли ELOVL2 роль в старении глаз и зрительных характеристиках, были получены мутантные по ELOVL2 мыши C57BL/6 с использованием CRISPR-Cas9 в паре с гомологичной рекомбинацией. Поскольку у мышей с нокаутом ELOVL2 наблюдалось снижение фертильности [28], вместо них были получены мыши с мутантом ELOVL2, кодирующие замену цистеина на триптофан (C217W), которая, как было показано, изменяет субстратную специфичность ELOVL2 на специфичность ELOVL5, эффективно нарушая уникальная способность ELOVL2 превращать C22 омега-3 ПНЖК докозапентаеновую кислоту (DPA) (22:5n-3) в 24:5n-3 [6]. Были сконструированы две нРНК для нацеливания на ELOVL2 рядом с кодоном 217 и восстанавливающий олинуклеотид-донор с мутацией пары оснований для генерации мутанта C217W, наряду с молчащими мутациями, для нарушения работы направляющей последовательности и последовательности мотива, прилегающего к протоспейсеру, для предотвращения повторного расщепления после редактирования. нРНК, восстанавливающий олигонуклеотид и мРНК Cas9 инъецировали в зиготы мышей C57BL/6N (Фиг. 4A и Фиг. 10A-10D). Был идентифицирован один гомозиготный основатель с правильно внесенной мутацией одной из нРНК. Не было обнаружено никаких нецелевых мутаций (Фиг. 10E). Гомозиготные мыши C217W развивались нормально, не проявляя явных фенотипов.

Затем было исследовано, изменились ли структура глаза и зрительные характеристики у мутанта C217W. Интересно, что у ELOVL2 мутантных мышей аутофлуоресцентные агрегаты появляются на глазном дне всего в возрасте 6 месяцев, намного раньше, чем у мышей дикого типа (Фиг. 4B и Фиг. 3D), показывая, что нормальная активность ELOVL2 имеет решающее значение для поддержания здоровья сетчатки. Этот фенотип постоянно наблюдался у мутантных животных в возрасте 4, 6, 8 и 12 месяцев (Фиг. 11A).

Затем была протестирована функция фоторецепторов этих мутантных мышей с использованием ЭРГ. По сравнению с однопометными животными дикого типа наблюдалось снижение амплитуды ответа палочек у мутантных мышей C217W (Фиг. 4B и 4C). Этот сниженный ответ постоянно воспроизводился в другом возрасте (Фиг. 11В). Хотя наиболее подверженным влиянию сигналом был ответ палочек, другие типы измерений ЭРГ также были затронуты у мутантов ELOVL2, включая осцилляторный потенциал и фликкер-ответ (Фиг. 11C и 11D).

Для выяснения, похожи ли агрегаты, наблюдаемые как точки на аутофлуоресцентном изображении глазного дна, на друзы, которые у людей являются фактором риска развития ВМД, сетчатку мышей C217W и ДТ иммуноокрашивали [14]. Действительно, иммуноокрашивание обнаружило HTRA1, T-15, C3 и C5b-9 положительные агрегаты только в сетчатках C217W (Фиг. 4D, 4E и Фиг. 12). Учитывая известность и раннее развитие друзеноподобных агрегатов у мутантных мышей, они потенциально могут быть моделями ВМД.

В заключение, было исследовано, могут ли характеристики старения в мышиных глазах быть обратимы с помощью деметилирования ДНК, включая промотор ELOVL2. Для этого каждой мыши вводили 1 мкл 2 мкМ 5-азацитидина в один глаз и 1 мкл ФСБ в другой глаз каждые две недели в течение 2 месяцев, начиная с возраста 10 месяцев. С помощью метода MeDIP было обнаружено, что после обработки метилирование промотора ELOVL2 снижалось (Фиг. 5А). Также было обнаружено, что экспрессия ELOVL2 повышалась в обработанных глазах (Фиг. 5B). В заключение, функция фоторецепторов была проверена с помощью ЭРГ, и было обнаружено, что ответ палочек улучшился в инъецированных глазах (Фиг. 5C и Фиг. 13). Эти данные дополнительно подтверждают статус метилирования ELOVL2 как мишени старения и использование ингибиторов ДНК-метилтрансферазы для влияния на характеристики глазного старения.

Пример клинического применения на людях: Введение раз в две недели (20 мкМ) в течение трех месяцев пациенту с сухой ВМД

Женщина 75 лет с двусторонней сухой возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) осматривается в офтальмологической клинике. В остальном она здорова. Она соглашается на экспериментальное исследование сравнивающее терапию деметилированием с контролем. Исходно оба глаза демонстрируют одинаковый уровень ВМД, о чем свидетельствуют клинические оценки остроты зрения, размера географической атрофии, измеренных с помощью автофлуоресценции, оптической когерентной томографии и скотопической реакции на электроретинографии. Пациентке вводят 100 мкл децитабина (20 мкМ) приготовленного в виде стерильного изотонического раствора с забуференным рН, вводимого путем интравитреальной инъекции в ее левый глаз (активное лечение). Ей вводят 100 мкл того же стерильного изотонического раствора с забуференным рН, но без децитабина, путем интравитреальной инъекции в правый глаз (контрольное лечение). Сразу после введения активного и контрольного лечения образец интравитреальной жидкости отбирают из каждого глаза для измерения исходного уровня экспрессии ELOVL2 и уровня метилирования. Наблюдается, что ELOVL2 гиперметилирован в одинаковой степени в обоих глазах. Уровни экспрессии ELOVL2 также схожи, и низкий уровень экспрессии наблюдается в обоих глазах. Как активное, так и контрольное лечение продолжают в левый и правый глаза соответственно с введениями каждые две недели в течение 3 месяцев. Как активное, так и контрольное лечение одинаково хорошо переносятся в течение периода введения. Сразу после последнего введения образцы интравитреальной жидкости берут из обоих глаз для измерения экспрессии и метилирования гена ELOVL2. Те же клинические оценки географической атрофии, которые выполнялись на исходном уровне, повторяются для каждого глаза. Наблюдаются значительные различия между глазами, обработанными децитабином, по сравнению с контролем. В глазах, обработанных децитабином, метилирование ELOVL2 снижено почти на 30%, а экспрессия гена ELOVL2 также увеличена на около 30% по сравнению с исходным уровнем. Кроме того, ответ палочек увеличен на около 30% по сравнению с исходным уровнем. Кроме того, нет прогрессии роста географической атрофии, измеренной по аутофлуоресценции глазного дна по сравнению с исходным уровнем. В отличие от этого, в контрольном глазу не наблюдается заметных изменений любых других параметров. Показатели метилирования генов и экспрессии генов и ответа палочек остаются такими же, как и при исходных значениях. Пациент возвращается в клинику для контрольного посещения через 6 месяцев. Клиническая оценка показывает, что улучшение ответа палочек в глазу, обработанном децитабином, сохраняется, показывая улучшение на около 20-30% по сравнению с исходным уровнем. Ответ палочек в контрольном глазу остается аналогичным исходному показателю.

Пример клинического применения на людях: Введение (15 мкМ) один раз в месяц в течение 12 месяцев пациенту с географической атрофией

65-летний мужчина с сухой возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) с географической атрофией осматривается в офтальмологической клинике. Его зрение, оцениваемое по ответе палочек, ухудшается. Его область географической атрофии, измеренная по аутофлуоресценции глазного дна за последние 2 года, показывает устойчивое прогрессирование. В остальном он здоров. Пациенту вводят 100 мкл децитабина (15 мкМ) приготовленного виде стерильного изотонического раствора с забуференным рН, вводимого путем интравитреальной инъекции. В интравитреальном образце, взятом сразу после введения децитабина, обнаружено гиперметилирование промотора ELOVL2 и низкий уровень экспрессии ELOVL2. Лечение децитабином продолжают в той же дозе, вводимой каждые 5 недель в течение 12 месяцев. Введение препарата переносится хорошо, побочных эффектов не наблюдается. После последнего введения децитабина получают образец стекловидного тела и исследуют его на метилирование гена ELOVL2 и экспрессию гена ELOVL2. Исследования показывают, что метилирование ELOVL2 уменьшилось почти на 60% (от исходного уровня), а экспрессия гена ELOVL2 увеличилась на около 50% (по сравнению с исходным значением). Ответ палочек пациента заметно улучшился и на около 30% выше исходного уровня. По данным аутофлуоресценции глазного дна рост географической атрофии отсутствует.

Пример клинического применения на людях: Генная терапия ELOVL2

70-летний мужчина с сухой возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) с географической атрофией осматривается в офтальмологической клинике. Его зрение, оцениваемое по ответу палочек, неизменно ухудшалось. Его область географической атрофии, измеренная по аутофлуоресценции глазного дна, неизменно прогрессирует. В остальном он здоров и согласен на лечение с использованием генной терапии ELOVL2. За неделю до процедуры генной терапии ему назначили преднизолон перорально (0,5 мг/кг). Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный вектор с кодирующей последовательностью ELOVL2 создается и упаковывается в соответствии с руководящими принципами надлежащей медицинской практики. Его суспендируют в забуференном физиологическом растворе с титром 1,5х10¹¹ геномов в аликвотах 0,3 мл. Через неделю после перорального приема преднизона, проводится стандартная витрэктомия для удаления кортикального слоя стекловидного тела с использованием стандартных витреоретинальных методов под общей анестезией. Затем пациенту вводят 0,3 мл забуференного физиологического раствора, содержащего в целом титр 1,5 x10¹¹ геномов, вводимых в субретинальное пространство с использованием специальной субретинальной канюли сразу за пределами макулы. Проводится воздухообмен и стандартное ушивание ран. Пациент продолжает принимать преднизон перорально (0,5 мг/кг) с медленным снижением до конца через 4 недели после операции. Анализ клеток, полученных из образца стекловидного тела, показывает низкий уровень экспрессии ELOVL2. Последующее наблюдение через 6 месяцев и через год после процедуры генной терапии показывает, что нет значительного прогрессирования в области географической атрофии, измеренной по аутофлуоресценции глазного дна, а зрение, по оценке ответа палочек, улучшилось на около 20-30%.

ОБСУЖДЕНИЕ

Предыдущие исследования выявили очень значимую корреляцию между метилированием промотора ELOVL2 и возрастом у людей [3, 29, 30]. В текущем исследовании было изучено, играет ли метилирование и экспрессия ELOVL2 роль в фенотипах старения фибробластов человека и моделей мышиной сетчатки.

Фибробласты WI-38 были выделены Хейфликом и Мурхедом в 1960-х годах, и было замечено, что они постепенно проявляли признаки старения по мере их деления, сначала замедляясь, а затем останавливаясь при 50+/-10 удвоении популяции, явление, которое позже стало известным как предел Хейфлика [31]. Кроме того, было обнаружено, что клетки стареют in vivo с возрастом [32], и было обнаружено, что первичные клетки разных видов имеют максимальную продолжительность жизни in vitro, коррелирующую с максимальной продолжительностью жизни вида [33]. Было обнаружено, что помимо этих изменений экспрессия ELOVL2 снижается с увеличением числа пассажей в человеческих фибробластах. Поскольку метилирование промотора обычно обратно коррелирует с экспрессией, ожидалось, что метилирование промотора будет увеличиваться с клеточным старением, и оказалось, что это правда. Из-за снижения экспрессии в клетках и увеличения метилирования промоторов с возрастом как в клетках, так и в людях, было высказано предположение, что подавление ELOVL2 приведет к расширенным фенотипам старения. Действительно, клетки, обработанные кшРНК, направленной против ELOVL2, показали снижение экспрессии ELOVL2, снижение пролиферативной способности, повышенное старение и связанные с возрастом изменения морфологии по сравнению с контрольными клетками.

Для дальнейшего изучения фенотипов старения были созданы мутантные мыши ELOVL2. С использованием CRISPR-Cas9 была создана мутация C217W, которая, как было показано ранее, переключает субстратную специфичность каталитического сайта ELOVL2 на эквивалент ELOVL5, эффективно нарушая уникальную способность ELOVL2 преобразовывать C22 омега-3 ПНЖК докозапентаеновую кислоту (ДПК) (22:5n-3) до 24:5n-36. Было обнаружено, что как ELOVL2, так и ELOVL5 удлиняют эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК; 20:5n-3) до докозапентаеновой кислоты (ДПК; 22:5n-3), но только ELOVL2, как известно, дополнительно удлиняет ДПК до 24:5n-3, т.е. предпоследний предшественник ДГК [6]. Поэтому было исследовано здоровье глаз ELOVL2 мутантных мышей.

С помощью автофлуоресцентной визуализации было обнаружено присутствие белковых агрегатов на сетчатке в возрасте 6 месяцев, по сравнению с 1 годом у мышей дикого типа. Срезы сетчатки окрашивали на окисленный фосфохолин (с помощью антителом Т-15), HTRA1, C3 и C5b-9, все белки, обнаруженные в друзе, которые обычно обнаруживаются у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД).

Функцию фоторецепторов оценивали с помощью ЭРГ. ЭРГ измеряет электрические сигналы, производимые сетчаткой в ответ на световой раздражитель, и таким образом может обнаруживать функциональные нарушения фоторецепторов. Поскольку мышиная сетчатка содержит в основном палочковидные фоторецепторы, функциональные различия в их электрических сигналах (ответ палочек) наиболее важны для оценки зрительных характеристик. Помимо ответа палочек, также исследовали ответ колбочок и мерцание 10 Гц. Все эти сигналы, но в первую очередь ответ палочек, уменьшались по амплитуде как с возрастом у мышей дикого типа, так и у мутантных мышей по сравнению с однопометными животными того же возраста. Эти показатели снижения функции фоторецепторов вместе с наличием друзеноподобных агрегатов, являются признаками ВМД. Таким образом, был сделан вывод, что функция ELOVL2 имеет решающее значение для предотвращения раннего появления друзеноподобных агрегатов и поддержания здоровой функции фоторецепторов у мышей. В сочетании с ускоренным появлением друзеноподобных агрегатов потеря функции фоторецепторов у ELOVL2 мутантных мышей показывает, что ELOVL2 представляет собой важную часть поддержания здоровья сетчатки у мышей в пожилом возрасте. Кроме того, было обнаружено, что ELOVL2 играет важную роль во влиянии на фенотип старения в клетках человека и потенциально может влиять на процесс старения на более широком уровне.

Было обнаружено, что у мышей ELOVL2 C217W представлены друзеноподобные агрегаты и снижена чувствительность фоторецепторов на значительно более ранней стадии, чем у любого из контрольных однопометных животных. Был сделан вывод, что мутация ELOVL2 C217W ответственна за фенотип ускоренного старения глаз. В целом, данное исследование показывает доказательства того, что ELOVL2 играет роль в характеристиках старения и, в частности, в глазной функции. Кроме того, уровень метилирования в промоторной области ELOVL2 коррелирует с его экспрессией и может быть изменен, чтобы потенциально влиять на характеристики старения.

СПОСОБЫ

Культура клеток и обработка.

Человеческие фибробласты WI-38 и IMR-90 были культивированы в EMEM (ATCC) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Omega) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco) и хранились в увлажненном инкубаторе при 5% CO2 и 37°C. Конфлюэнтность была рассчитана с помощью программного обеспечения для обработки изображений ImageJ, включая 3 поля зрения на образец (10x). После слияния клетки были разделены и высеяны в соотношении 1:3. Удвоение популяции (УП) было рассчитано по количеству клеток. Лентивирус для нокдауна был создан с использованием кшРНК MISSION (Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. 5-Аза-2’-дезоксицитидин был приобретен в TSZ Chem (кат. № 2353-33-5) и растворен в среде для культивирования клеток в концентрации 2 мкМ. Клетки были обработаны в течение 48 часов. Затем среда была заменена на обычную среду для культивирования клеток, и клетки культивировавись еще 5 дней.

Активность ассоциированной со старением β-галактозидазы (АС-β-gal).

Активность АС-β-gal в культивируемых клетках была определена с использованием Senescence β-Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology) в соответствии с инструкциями производителя. После этого клетки были окрашены ДАПИ, и процент клеток с положительным окрашиванием был рассчитанный с помощью программного обеспечения для визуализации (Keyence), включая 3 поля зрения (10x).

Анализ нуклеиновых кислот.

ДНК и РНК были выделены из фибробластов человека и мышиных тканей мыши с помощью TRIzol (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя. РНК была конвертирована в кДНК с помощью набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). кПЦР была выполнена с использованием SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad).

Иммунопреципитация метилированной ДНК (MeDIP) была выполнена путем фрагментирование 1 мкг ДНК с помощью Bioruptor (Diagenode) в течение 8 циклов с высокой интенсивностью настроек, каждый цикл состоял из 30 секунд включения и 30 секунд выключения. Фрагментированная ДНК была денатурирована с дальнейшим инкубированием с 1 мкг 5мЦ антитела MABE146 (Millipore) в течение 2 часов, затем с гранулами белка G SureBeads (Bio-Rad) в течение 1 часа. После отмывки ДНК была очищена с помощью набора для очистки QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Затем была проведена кПЦР, как указано выше.

Вестерн-блоттинг.

10 мкг общего белка, выделенного с помощью TRIzol (Ambion) из мышиной сетчатки ДТ различных стадий развития, подвергали ДСН-ПААГ. Вестерн-блоттинг был проведен с использованием общепринятого протокола (см. Таблицу 2 для антител, использованных в исследовании). Уровень экспрессии белка ELOVL2 был нормализован до H3.

Конструкция CRISPR-Cas9.

Реагенты CRISPR-Cas9 были получены, как описано ранее [34]. Промотор Т7 был добавлен к клонированной кодирующей последовательности Cas9 с помощью ПЦР-амплификации. Затем продукт T7-Cas9 был очищен на геле и использован в качестве матрицы для транскрипции in vitro (IVT) с использованием набора mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA (Life Technologies). Промотор Т7 и последовательность кшРНК были синтезированы в виде длинного олигонуклеотида (Ultramer, IDT) и амплифицированы с помощью ПЦР. Продукт ПЦР T7-кшРНК был очищен в геле и использован в качестве матрицы для IVT с использованием набора MEGAshortscript T7 (Life Technologies). Матрица репарации, кодирующая вариант C217W, была синтезирована как одноцепочечный олигонуклеотид (Ultramer, IDT) и использовалась без очистки. Возможные нецелевые изменения были определены с помощью Cas-OFFinder35, выбирая цели с наименьшим количеством несовпадений (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Мышь-родоначальник и все мыши F1 были секвенированы на предмет нецелевых изменений.

Инъекции животным и анализ.

Все процедуры с животными проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными Калифорнийского университета в Сан-Диего. Мышиным зиготам C57BL/6N инъецировали конструкции CRISPR-Cas9. Олигонуклеотиды были инъецированы в цитоплазму зигот на стадии пронуклеусов. Мыши содержались на статических стойках в обычном помещении для животных и вволю кормились диетой Teklad Global 2020X. Для исследования инъекции 5-азацитидином, мыши были анестезированы внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (100 мг/кг и 10 мг/кг соответственно) и получали обезболивающее глазные капли пропаракаина (0,5%, Bausch & Lomb). Животным внутриглазно инъецировали 1 мкл ФСБ в один глаз и 1 мкл 2 мкМ 5-азацитидина, растворенного в ФСБ, в контралатеральный глаз, каждые две недели в течение 2 месяцев.

Электроретинограммы (ЭРГ) были выполнены в соответствии с ранее описанным протоколом [36]. В нескольких словах, мыши были адаптированы к темноте в течение 12 часов, анестезированы с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина/ксилазина в зависимости от массы и получали расширяющую каплю тропикамида (1,5%, Alcon), а также каплю пропаракаина (0,5%, Bausch & Ломб) как болеутоляющее. Мыши были исследованы с помощью прибора с камерой Ganzfeld для зрительного поля (Diagnosys LLC), с электродами, размещенными на каждой роговице, с подкожным заземляющим игольчатым электродом, помещенным в хвост, и контрольным электродом во рту (Grass Telefactor, F-E2). Смазывающее вещество (Goniovisc 2,5%, HUB Pharmaceuticals) было использовано для обеспечения контакта электродов с глазами. Усиление (с полосой пропускания 1-1000 Гц, без режекторной фильтрации), представление стимулов и сбор данных программировались и выполнялся с использованием системы UTAS-E 3000 (LKC Technologies). Для ЭРГ палочек, сетчатка была стимулирована ксеноновой лампой при -2 и -0,5 log кд·с/м². Для ЭРГ колбочек, мыши были адаптированы к фоновому освещению 1 log кд·с/м², а световая стимуляция была установлена на уровне 1,5 log кд·с/м². Записи были собраны и усреднены в программном обеспечении производителя (Veris, EDI) и обработаны в Excel.

Анализ мышиной сетчатки.

Сетчатки были собраны сразу после умерщвления мышей, фиксированы в 4% параформальдегиде в течение 1 часа и хранились в ФСБ при 4°C. Для иммуноокрашивания сетчатки были разделенные на срезы, помещены на предметные стекла, затем инкубированы с 5% БСА, 0,1% блокирующим раствором Triton-X ФСБ в течение 1 часа. Первичные антитела (см. Таблицу 2 для антител, использованных в исследовании) были добавлены 1:50 в 5% БСА ФСБ и инкубированы при 4°C в течение 16 часов. После трехкратной промывки ФСБ были добавлены вторичные антитела в соотношении 1:1000 в 5% БСА ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем образцы были промыты 3 раза с ФСБ, окрашены ДАПИ в течение 5 минут при комнатной температуре, монтированы и визуализированы (Keyence BZ-X700).

Таблица 1. Перечень праймеров, использованных в исследовании.

Проверка нецелевых изменений Последовательность (5 '-> 3') ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ нецелевой chr8 F GTAATTCCGTGATCACCGTC SEQ ID NO:1 нецелевой chr8 R CCAATAAATAACAGCAGAAG SEQ ID NO:2 нецелевой chr10 F CAATATGCTCATCATTGTCT SEQ ID NO:3 нецелевой chr10 R CCACACATGTCTACCTTCCT SEQ ID NO:4 Праймеры MeDIP промотор hELOVL2. F CGATTTGCAGGTCCAGCCG SEQ ID NO:5 промотор hELOVL2. R CAGCGGGTGGGTATTCCTG SEQ ID NO:6 промотор hACTB F CTAGGTGTGGACATCTCTTG SEQ ID NO:7 промотор hACTB R TGCAGGAGCGTACAGAA SEQ ID NO:8 промотор mELOVL2 F AGCTCCTCCGCTACTC SEQ ID NO:9 промотор mELOVL2 R CCAGCCCTTGGTCATC SEQ ID NO:10 промотор mACTB F TAGGCCCAGATGTACAGGAA SEQ ID NO:11 промотор mACTB R CCAGAATGCAGGCCTAGTAA SEQ ID NO:12 праймеры кПЦР hELOVL2 F GCGGATCATGGAACATCTAA SEQ ID NO:13 hELOVL2 R CCAGCCATATTGAGAGCAGA SEQ ID NO:14 hACTB F CACCATTGGCAATGAGCGGTTC SEQ ID NO:15 hACTB R AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT SEQ ID NO:16

Таблица 2. Перечень антител, использованных в исследовании.

Иммуноокрашивание Компания, кат. № RRID TEPC 15 Sigma M1421 AB_1163630 HtrA Santa Cruz sc-377050 C3 Santa Cruz sc-58926 AB_1119819 C5-b9 Santa Cruz sc-66190 AB_1119840 MeDIP 5-метилцитозин Millipore MABE146 AB_10863148 Вестерн-блоттинг ELOVL2 Santa Cruz sc-54874 AB_2262364 Гистон H3 Cell Signaling 9715 AB_331563

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Glei, D. A. et al. Predicting Survival from Telomere Length versus Conventional Predictors: A Multinational Population-Based Cohort Study. PloS One 11, e0152486 (2016).

2. Health, C. O. on S. and. Smoking and Tobacco Use; Surgeon General’s Reports; 2004. Smoking and Tobacco Use Available at: http://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/sgr/2004/. (Accessed: 14th November 2014)

3. Hannum, G. et al. Genome-wide Methylation Profiles Reveal Quantitative Views of Human Aging Rates. Mol. Cell 49, 359-367 (2013).

4. Gross, A. M. et al. Methylome-wide Analysis of Chronic HIV Infection Reveals Five-Year Increase in Biological Age and Epigenetic Targeting of HLA. Mol. Cell 62, 157-168 (2016).

5. Leonard, A. E. et al. Identification and expression of mammalian long-chain PUFA elongation enzymes. Lipids 37, 733-740 (2002).

6. Gregory, M. K., Cleland, L. G. & James, M. J. Molecular basis for differential elongation of omega-3 docosapentaenoic acid by the rat ELOVL5 and ELOVL2. J. Lipid Res. 54, 2851-2857 (2013).

7. Tikhonenko, M. et al. Remodeling of Retinal Fatty Acids in an Animal Model of Diabetes: A Decrease in Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Is Associated With a Decrease in Fatty Acid Elongases ELOVL2 and ELOVL4. Diabetes 59, 219-227 (2010).

8. Bazan, N. G., Molina, M. F. & Gordon, W. C. Docosahexaenoic Acid Signalolipidomics in Nutrition: Significance in Aging, Neuroinflammation, Macular Degeneration, Alzheimer’s, and Other Neurodegenerative Diseases. Annu. Rev. Nutr. 31, 321-351 (2011).

9. Agbaga, M.-P. et al. Role of Stargardt-3 macular dystrophy protein (ELOVLL4) in the biosynthesis of very long chain fatty acids. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 12843-12848 (2008).

10. Harkewicz, R. et al. Essential Role of ELOVLL4 Protein in Very Long Chain Fatty Acid Synthesis and Retinal Function. J. Biol. Chem. 287, 11469-11480 (2012).

11. Beatty, S., Koh, H., Phil, M., Henson, D. & Boulton, M. The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Surv. Ophthalmol. 45, 115-134 (2000).

12. Hollyfield, J. G. et al. Oxidative damage-induced inflammation initiates age-related macular degeneration. Nat. Med. 14, 194-198 (2008).

13. Curcio, C. A., Johnson, M., Huang, J.-D. & Rudolf, M. Apolipoprotein B-containing lipoproteins in retinal aging and age-related macular degeneration. J. Lipid Res. 51, 451-467 (2010).

14. Crabb, J. W. et al. Drusen proteome analysis: An approach to the etiology of age-related macular degeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 14682-14687 (2002).

15. Shaw, P. X. et al. Natural antibodies with the T15 idiotype may act in atherosclerosis, apoptotic clearance, and protective immunity. J. Clin. Invest. 105, 1731-1740 (2000).

16. Shaw, P. X. et al. Complement factor H genotypes impact risk of age-related macular degeneration by interaction with oxidized phospholipids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 13757-13762 (2012).

17. Cameron, D. J. et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle Georget. Tex 6, 1122-1125 (2007).

18. Sivaprasad, S. & Chong, N. V. The complement system and age-related macular degeneration. Eye 20, 867 (2006).

19. Pignolo, R. J., Rotenberg, M. O. & Cristofalo, V. J. Alterations in contact and density-dependent arrest state in senescent WI-38 cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 30A, 471-476 (1994).

20. Schäuble, S. et al. Quantitative Model of Cell Cycle Arrest and Cellular Senescence in Primary Human Fibroblasts. PLoS ONE 7, e42150 (2012).

21. Jones, P. L. et al. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat. Genet. 19, 187-191 (1998).

22. Momparler, R. L. Pharmacology of 5-Aza-2’-deoxycytidine (decitabine). Semin. Hematol. 42, S9-16 (2005).

23. Swindell, W. R. et al. Indicators of ‘Healthy Aging’ in older women (65-69 years of age). A data-mining approach based on prediction of long-term survival. BMC Geriatr. 10, 55 (2010).

24. Xue, X. et al. Characterization of the fatty acyl elongase (ELOVL) gene family, and hepatic ELOVL and delta-6 fatty acyl desaturase transcript expression and fatty acid responses to diets containing camelina oil in Atlantic cod (Gadus morhua). Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 175, 9-22 (2014).

25. Bartke, A. & Brown-Borg, H. Life extension in the dwarf mouse. Curr. Top. Dev. Biol. 63, 189-225 (2004).

26. Wang, T. et al. Epigenetic aging signatures in mice livers are slowed by dwarfism, calorie restriction and rapamycin treatment. Genome Biol. 18, 57 (2017).

27. Kolesnikov, A. V., Fan, J., Crouch, R. K. & Kefalov, V. J. Age-Related Deterioration of Rod Vision in Mice. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 30, 11222-11231 (2010).

28. Zadravec, D. et al. ELOVL2 controls the level of n-6 28:5 and 30:5 fatty acids in testis, a prerequisite for male fertility and sperm maturation in mice. J. Lipid Res. 52, 245-255 (2011).

29. Garagnani, P. et al. Methylation of ELOVL2 gene as a new epigenetic marker of age. Aging Cell 11, 1132-1134 (2012).

30. Bacalini, M. G. et al. A meta-analysis on age-associated changes in blood DNA methylation: results from an original analysis pipeline for Infinium 450k data. Aging 7, 97-109 (2015).

31. Hayflick, L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 37, 614-636 (1965).

32. Herbig, U., Ferreira, M., Condel, L., Carey, D. & Sedivy, J. M. Cellular senescence in aging primates. Science 311, 1257 (2006).

33. Röhme, D. Evidence for a relationship between longevity of mammalian species and life spans of normal fibroblasts in vitro and erythrocytes in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 5009-5013 (1981).

34. Wang, H. et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell 153, 910-918 (2013).

35. Bae, S., Park, J. & Kim, J.-S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014).

36. Luo, J. et al. Human retinal progenitor cell transplantation preserves vision. J. Biol. Chem. 289, 6362-6371 (2014).

Группа изоберетний относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии. Способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии включает введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества по меньшей мере одного деметилирующего агента, где деметилирующий агент представляет собой децитабин. Также представлены способы лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания и патологии, включающие повышение уровня фермента ELOVL2 в глазу и/или уровня 22:6(n-3) докозагексаеновой кислоты (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в глазу путем введения в глаз эффективного количества мРНК, кодирующей ELOVL2, или генной терапии с использованием вектора экспрессии ELOVL2. В другом воплощении обеспечивается способ, включающий выбор пациента, нуждающегося в лечении возрастного глазного заболевания, и введение в глаз пациента эффективного количества децитабина и/или мРНК, кодирующей ELOVL2, и/или вектора экспрессии ELOVL2, тем самым излечивая данное возрастное заболевание. Кроме того, раскрываются способы, включающие использование децитабина или мРНК, кодирующей ELOVL2, или вектора экспрессии ELOVL2, в лечении возрастного глазного заболевания. Еще одно воплощение представляет способ лечения возрастных глазных заболеваний, включающий интравитреальное введение препарата, содержащего децитабин. Использование группы изобретений обеспечивает эффективное лечение, облегчение или профилактику возрастного глазного заболевания или патологии. 8 н. и 25 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, эффективного количества по меньшей мере одного деметилирующего агента, где деметилирующий агент представляет собой децитабин.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что деметилирующий агент увеличивает экспрессию гена типа 2 удлинения жирных кислот с очень длинной цепью (ELOVL2) и/или увеличивает уровень фермента ELOVL2 и/или увеличивает уровень 22:6(n-3) докозагексаеновой кислоты (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в сетчатке.

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что деметилирующий агент вводят в глаз.

4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что деметилирующий агент вводят в глаз интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое заболевание глаз, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что ВМД представляет собой сухую или влажную ВМД.

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ВМД представляет собой сухую ВМД.

8. Способ по пп. 1-7, отличающийся тем, что деметилирующий агент вводят в виде препарата с медленным высвобождением.

9. Способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания или патологии, включающий повышение уровня фермента ELOVL2 и/или уровня 22:6(n-3) докозагексаеновой (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в глазу путем введения в глаз эффективного количества мРНК, кодирующей ELOVL2.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что мРНК доставляют с использованием вирусного вектора.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что вирусный вектор выбирают из: аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора, вектора вируса осповакцины и ретровирусного вектора.

12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что мРНК доставляют с использованием невирусного вектора, такого как липосома или микро/наночастица.

13. Способ по пп. 9-12, отличающийся тем, что агент вводят в глаз интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

14. Способ по пп. 9-13, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

16. Способ лечения, облегчения или профилактики возрастного глазного заболевания и патологии, включающий повышение уровня фермента ELOVL2 в глазу и/или уровня 22:6(n-3) докозагексаеновой кислоты (ДГК) и 22:5(n-6) докозапентаеновой кислоты (ДПК) в глазу, путем генной терапии с использованием вектора экспрессии ELOVL2.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что вектор выбирают из: аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора, вектора вируса осповакцины и ретровирусного вектора.

18. Способ по пп. 16, 17, отличающийся тем, что вектор экспрессии ELOVL2 вводят интравитреальным, субретинальным, субконъюнктивальным, субтенонным или задним юкстасклеральным путем.

19. Способ по пп. 16-18, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

21. Способ, включающий выбор пациента, нуждающегося в лечении возрастного глазного заболевания, и введение в глаз пациента эффективного количества децитабина и/или мРНК, кодирующей ELOVL2, и/или вектора экспрессии ELOVL2, тем самым излечивая данное возрастное заболевание.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что пациента выбирают путем определения метилирования ELOVL2 и/или экспрессии ELOVL2 в глазу пациента.

23. Способ по пп. 21, 22, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

25. Способ, включающий использование децитабина в лечении возрастного глазного заболевания.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

27. Способ, включающий использование мРНК, кодирующей ELOVL2, в лечении возрастного глазного заболевания.

28. Способ, включающий использование вектора экспрессии ELOVL2 в лечении возрастного глазного заболевания.

29. Способ лечения возрастных глазных заболеваний, включающий интравитреальное введение препарата, содержащего децитабин.

30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическое глазное заболевание, глаукому, слабое зрение или глазную сухость.

31. Способ по пп. 29, 30, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

32. Способ по п. 27, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.

33. Способ по п. 28, отличающийся тем, что возрастное глазное заболевание представляет собой сухую ВМД.