Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 809 247

(13)

(51)

МПК

C12N9/64(2006-01-01)

C07K14/47(2006-01-01)

C07K14/705(2006-01-01)

A61K48/00(2006-01-01)

A61P43/00(2006-01-01)

A61P27/02(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2021119359, 2019-12-23

(24)

Дата начала отсчета патента

2019-12-23

(22)

дата подачи заявки

2019-12-23

(45)

опубликовано

2023-12-08

(72)

авторы

Драйсман АннаЭллис СкоттДжоэл Джозефин Хезер Люсьен

(73)

патентообладатели

Джайроскоуп Терапьютикс Лимитед

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

DANIEL RICKLIN ET AL: "The renaissance of complement therapeutics", NATURE REVIEWSNEPHROLOGY, volДЛИН В.В., ИГНАТОВА М.СНефропатии, связанные с патологией системы комплемента, РОССИЙСКИЙ ВЕСТНИК ПЕРИНАТОЛОГИИ И ПЕДИАТРИИ, 6, 2016WO 2017053732 A2, 30.03.2017WO 2017072515 A1, 04.05.2017.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I И КОФАКТОР ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I, КОДИРУЮЩИЕ ИХ ВЕКТОРЫ И ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ Российский патент 2023 года по МПК C12N9/64 C07K14/47 C07K14/705 A61K48/00 A61P43/00 A61P27/02

Описание патента на изобретение RU2809247C2

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к средствам для применения в генотерапии. В частности, данное изобретение относится к комбинациям кофакторов фактора комплемента I (CFI) и CFI, таких как фактор комплемента H-подобный белок 1 (FHL1), полинуклеотидов, кодирующих их, и их применению при лечении или профилактике опосредованных комплементом и связанных с комплементом расстройств, включая опосредованные комплементом заболевания глаз, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Желтое пятно представляет собой небольшой участок сетчатки глаза размером от около 3 до около 5 миллиметров, прилегающий к зрительному нерву. Это наиболее чувствительная область сетчатки, содержащая ямку, депрессивную область, которая обеспечивает высокую остроту зрения и содержит плотную концентрацию колбочек, фоторецепторов, отвечающих за цветовое зрение.

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является наиболее частой причиной функциональной слепоты в развитых странах у лиц старше 50 лет (Seddon, J.M., Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T.E., et al., eds. Ryan S.J., ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001: 1039-1050). ВМД связана с неоваскуляризацией, исходящей из сосудистой сети хориоидеи и распространяющейся в субретинальное пространство. Кроме того, ВМД характеризуется прогрессирующей дегенерацией сетчатки, пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и подлежащей сосудистой оболочки (высоко-сосудистая ткань, которая находится под ПЭС, между сетчаткой и склерой).

Множество факторов, включая окислительный стресс, воспаление с возможным аутоиммунным компонентом, генетический фон (например, мутации), а также экологические или поведенческие факторы, такие как курение и диета, могут способствовать патогенезу ВМД.

Клиническое прогрессирование ВМД характеризуется поэтапно в соответствии с изменениями желтого пятна. Отличительным признаком ранней ВМД является появление друзов, которые представляют собой скопления внеклеточного продукта распада под сетчаткой и появляются в виде желтых пятен на сетчатке во время клинического обследования и на изображениях глазного дна. Друзы делятся на маленькие (<63 мкм), средние (63-124 мкм) и большие (> 124 мкм). Они также считаются твердыми или мягкими в зависимости от того, как выглядят их края при офтальмологическом исследовании. В то время как твердые друзы имеют четко очерченные края, мягкие друзы имеют менее выраженные жидкие края. Шкала фотографической тяжести глазного дна, используемая при исследовании возрастных заболеваний глаз (AREDS), является одной из основных систем классификации, используемых для этого состояния.

Промежуточная ВМД диагностируется при наличии крупных друзов и/или любых аномалий пигмента сетчатки. Промежуточная ВМД может вызвать некоторую потерю зрения, но, как и ранняя ВМД, обычно протекает бессимптомно.

Поздняя стадия ВМД подразделяется на «сухую» и «влажную» (экссудативную или неоваскулярную) формы. Сухая ВМД более распространена, чем влажная ВМД, но сухая форма может переходить во влажную форму, и обе возникают одновременно в значительном количестве случаев. Сухая ВМД обычно характеризуется прогрессирующим апоптозом клеток слоя ПЭС и вышележащих фоторецепторных клеток, а также часто нижележащих клеток в слое хориоидальных капилляров. Сливные зоны гибели клеток ПЭС, сопровождающейся атрофией вышележащих фоторецепторов, называются географической атрофией (ГА). Пациенты с этой формой ВМД (сухая форма на поздней стадии) испытывают медленное и прогрессирующее ухудшение центрального зрения.

Влажная ВМД характеризуется кровотечением и/или утечкой жидкости из аномальных сосудов, которые выросли из сосудов сосудистой оболочки (хориокапилляров) под ПЭС и желтым пятном, что может быть причиной внезапной и инвалидизирующей потери зрения. Было подсчитано, что большая часть потери зрения, которую испытывают пациенты, происходит из-за такой хориоидальной неоваскуляризации (CNV) и ее вторичных осложнений. Подтип неоваскулярной ВМД называется ангиоматозной пролиферацией сетчатки (RAP). В данном документе ангиоматозная пролиферация происходит из сетчатки и распространяется кзади в субретинальное пространство, в конечном итоге сообщаясь в некоторых случаях с новыми сосудами хориоидеи.

Система комплемента (CS) участвует в раннем патогенезе ВМД, основываясь на идентификации компонентов CS в друзе глаз пациентов с ВМД. При ВМД идентифицировано по меньшей мере 129 типов белков, депонированных в друзах, включая различные типы аполипопротеинов (E, B или A-l), несколько амилоидных пептидов (P, Aβ или SA-1), TIMP-3, сывороточный альбумин и некоторые белки, связанные с клеточной функцией (например, субъединица β АТФ-синтазы, скавенджер-рецептор B2 и ретинолдегидрогеназа). Друзы, производные от ВМД, также содержат почти все белки комплемента, включая регуляторные белки (CFH, рецептор комплемента 1 (CR1), витронектин и кластерин), продукты активации и деградации CS (C1q, C3, C3a, C3b и C5a), и элементы терминального пути CS, содержащие компоненты MAC (то есть 5, 6, 8 (α, β и γ) и 9) в отдельной и сложной форме. Накопление друзы может активировать CS, вызвать местную продукцию медиаторов воспаления и привлечь лейкоциты, которые, в свою очередь, усиливают местное воспалительное состояние, присутствующее при ВМД.

Текущие варианты лечения ВМД включают фотодинамическую терапию бензопорфирином (Arch Ophthalmol (1999) 117: 1329-1345) и ряд терапий, нацеленных на путь фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Примеры таких нацеленных на VEGF терапий включают антитела, такие как ранибизумаб (продается как Lucentis™, Genentech, Inc.) и бевацизумаб (Avastin™, Genentech, Inc.) и афлиберцепт (Eylea™, Bayer). Однако, хотя эти методы лечения антителами к VEGF были очень эффективными, они одобрены только для лечения влажной или неоваскулярной формы ВМД, которая составляет около 10-15% всех пациентов с ВМД. Терапия антителами проводится ежемесячно в виде инъекций в стекловидное тело в операционной или стерильной комнате, что является обременительным для пациентов, которые обычно являются пожилыми людьми.

В настоящее время нет одобренных методов лечения форм ВМД на ранней стадии или на поздней стадии (сухая форма).

Система комплемента представляет собой хорошо задокументированную мишень для лечения многих воспалительных заболеваний. Сверхактивная или неправильно функционирующая система комплемента вовлечена в патологию многих хронических воспалительных состояний, включая ВМД (Nature Reviews (2015) 14: 857-877). Как следствие, несколько терапевтических средств, нацеленных на комплемент, были предложены или находятся в настоящее время в разработке, которые нацелены на петлю амплификации альтернативного пути/цикла обратной связи C3b как средство уменьшения обратной связи C3b или увеличения распада C3b (Фиг. 1).

Лампализумаб (Genentech/Roche) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое ингибирует фактор комплемента D, вводимое ежемесячной интравитреальной инъекцией для остановки скорости прогрессирования географической атрофии. Лампализумаб показал некоторое снижение скорости увеличения географической атрофии в клинических испытаниях фазы 2. Однако в рандомизированных клинических испытаниях фазы III с участием 906 участников лампализумаб не смог уменьшить увеличение ГА по сравнению с плацебо в течение 48 недель. Результаты показали существенное и последовательное увеличение ГА, в среднем на около 2 мм² в год.

Однако остается потребность в альтернативных методах лечения заболеваний, опосредованных комплементом или связанных с комплементом, в частности заболеваний глаз, таких как ВМД, в частности лечения, которые эффективны в широких популяциях ВМД и не ограничиваются конкретными генотипами, которые могут предрасполагать индивидуума к ВМД и другим расстройствам, связанным с комплементом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявитель идентифицировал терапевтические комбинации кофакторов фактора комплемента I (CFI) и CFI (белков, которые обладают кофакторной активностью в CFI-опосредованном расщеплении C3b, таких как фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1), фактор комплемента H (CFH), рецептор комплемента типа 1 (CR1) и мембранный кофакторный белок (MCP)) для доставки пациенту для восстановления или ребалансировки сверхактивного цикла обратной связи комплемента C3b. Комбинации обеспечивают кофактор CFI и CFI в молярных соотношениях, которые гарантируют, что кофактор предоставляется в стехиометрическом избытке по отношению к CFI с целью гарантировать максимальную активность CFI в расщеплении C3b (и подавление сверхактивной системы комплемента). Это важно для пациентов, у которых может быть генетический дефицит определенных белков системы комплемента, и/или для лечения, которое вводится в ткани или органы, в которых уровни кофакторов могут быть снижены по сравнению с системными уровнями, например, в глазах или почках.

Кроме того, заявитель предоставил бицистронные векторы, которые могут использоваться для доставки и коэкспрессии как CFI, так и кофактора CFI (например, FHL1) пациенту. В частности, заявитель успешно сконструировал функциональные векторы AAV, которые могут быть получены с хорошими титрами и содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие как CFI, так и кофактор, тем самым преодолевая проблемы, связанные с ограниченной возможностью AAV. Бицистронные векторы по данному изобретению также преимущественно обеспечивают хорошую экспрессию как CFI, так и кофактора; и совместная экспрессия CFI и кофактора в соотношениях, которые были определены в данном документе как полезные.

В одном аспекте данное изобретение относится к продукту, содержащему (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

В другом аспекте данное изобретение относится к продукту, содержащему (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента Н (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

В конкретных вариантах реализации продукт используется для лечения расстройств, опосредованных комплементом, в частности хронических воспалительных состояний и даже более конкретно тех, которые связаны с гиперактивностью цикла обратной связи C3b комплемента.

В другом аспекте данное изобретение относится к продукту, содержащему (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства, предпочтительно опосредованного комплементом расстройства глаза.

В некоторых вариантах реализации, кофактор фактора комплемента I (CFI) выбран из группы, состоящей из фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1); фактора комплемента H (CFH); рецептора комплемента 1 (CR1) или его фрагмента; и мембранного кофакторного белка (MCP) или его фрагмента.

В некоторых вариантах реализации, кофактор фактора комплемента I (CFI) представляет собой фактор комплемента H (CFH). В некоторых вариантах реализации, кофактор фактора комплемента I (CFI) представляет собой рецептор комплемента 1 (CR1) или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации, кофактор фактора комплемента I (CFI) представляет собой мембранный кофакторный белок (MCP) или его фрагмент.

В предпочтительных вариантах реализации, кофактор фактора комплемента I (CFI) представляет собой фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1).

В предпочтительных вариантах реализации, продукт содержит (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1); и (ii) фактор комплемента I (CFI), или кодирующие ихнуклеотидные последовательности. В других вариантах реализации, продукт содержит (i) фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI), или кодирующие их нуклеотидные последовательности. В других вариантах реализации, продукт содержит (i) рецептор комплемента 1 (CR1) или его фрагмент; и (ii) фактор комплемента I (CFI), или кодирующие их нуклеотидные последовательности. В других вариантах реализации, продукт содержит (i) мембранный кофакторный белок (MCP) или его фрагмент; и (ii) фактор комплемента I (CFI), или кодирующие их нуклеотидные последовательности.

В некоторых вариантах реализации, расстройство связано с чрезмерной активностью цикла обратной связи комплемента C3b и/или недостаточной активностью цикла распада C3b (см. Фиг. 1).

В некоторых вариантах реализации, расстройство представляет собой хроническое воспалительное состояние глаза, опосредованное комплементом.

В некоторых вариантах реализации, расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию. В других вариантах реализации, расстройство представляет собой глаукому, болезнь Штаргардта, центральную серозную хориоретинопатию или пигментный ретинит.

В предпочтительных вариантах реализации, расстройство представляет собой ВМД. В некоторых вариантах реализации, ВМД представляет собой сухую форму ВМД.

В некоторых вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 3:1, по меньшей мере 4:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 6:1, по меньшей мере 7:1, по меньшей мере 8:1, по меньшей мере 9:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 15:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 25:1, по меньшей мере 30:1, по меньшей мере 40:1, по меньшей мере 50:1 или по меньшей мере 60:1.

В некоторых вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 2:1. В некоторых вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 3:1. В предпочтительных вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 8:1.

В некоторых вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) от 2:1 до 34:1, от 2:1 до 25:1, от 2:1 до 15:1, от 2:1 до 12:1, от 3:1 до 10:1.

В предпочтительных вариантах реализации, продукт предоставляет субъекту (i) и (ii) в молярном соотношении (i):(ii) от 3:1 до 10:1.

Приведенные молярные соотношения могут быть достигнуты, например, путем доставки субъекту белка, полинуклеотида или вектора. Уровень белка может быть легко измерен специалистом с использованием методов, известных в данной области техники, таких как ИФА, например, как описано в данном документе. Аналогичным образом, количества белков, экспрессируемых из полинуклеотидов или кодирующих их векторов, можно измерить с использованием аналогичных подходов.

В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI).

В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI).

В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1); и (ii) фактор комплемента I (CFI). В других вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI). В других вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) рецептор комплемента 1 (CR1) или его фрагмент; и (ii) фактор комплемента I (CFI). В других вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) мембранный кофакторный белок (MCP) или его фрагмент; и (ii) фактор комплемента I (CFI).

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую промотор CMV. Предпочтительно промотор CMV находится выше нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую регуляторный элемент WPRE. Предпочтительно регуляторный элемент WPRE находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал поли-А. Предпочтительно, когда сигнал поли-А находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота. Предпочтительно, когда сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие:

(a) промотор CMV, причем промотор CMV расположен выше нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii); и

(b) сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота, причем сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В других вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие:

(a) промотор CMV, причем промотор CMV расположен выше нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii);

(b) регуляторный элемент WPRE, причем регуляторный элемент WPRE расположен ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii); и

(c) сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота, причем сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

В предпочтительных вариантах реализации, регулирующий элемент WPRE представляет собой регулирующий элемент WPRE3.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая (i), находится выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (ii).

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая (ii), находится выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (i).

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) и (ii), функционально связаны линкером. В некоторых вариантах реализации, линкер представляет собой линкер Furin, GSG, 11aa1D или F2A. В предпочтительных вариантах реализации, линкер содержит последовательность саморасщепляющегося пептида 2А, например, P2A, или последовательность, которая содержит или определяется сайтом расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательностью F2A.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит один или более инвертированных концевых повторов(ITR) аденоассоциированного вируса (AAV). В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит две ITR AAV.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит AAV ITR на своем 5' конце и AAV ITR на своем 3' конце.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, необязательно при этом линкер содержит сайт расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательность F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) сигнал поли-А, предпочтительно сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(g) 3' AAV ITR.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, необязательно при этом линкер содержит сайт расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательность F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) регулирующий элемент WPRE, предпочтительно, в котором регулирующий элемент WPRE является регулирующим элементом WPRE3;

(g) сигнал поли-А, предпочтительно сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(h) 3' AAV ITR.

В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, содержащий сайт расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательность F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) регулирующий элемент WPRE3;

(g) сигнал поли-А, предпочтительно сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(h) 3' AAV ITR.

В некоторых вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8. В предпочтительных вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидные последовательности, кодирующие кофактор фактора комплемента I (CFI), такой как FHL1 или CFH, оптимизированы по кодонам. В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, оптимизирована по кодонам. В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидные последовательности, кодирующие кофактор фактора комплемента I (CFI), такой как FHL1 или CFH, и CFI, оптимизированы по кодонам.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 12.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 10.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, представляет собой SEQ ID NO: 10.

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12 и нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, представляет собой SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична ей.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 23, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична ей.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид имеет размер менее или равный 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8 или 4,7 т.п.н. В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид имеет размер менее или равный 4,7 т.п.н.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается вектор, содержащий полинуклеотид по данному изобретению.

В некоторых вариантах реализации, вектор представляет собой аденоассоциированный вирусный (AAV), ретровирусный, лентивирусный или аденовирусный вектор.

В предпочтительных вариантах реализации, вектор представляет собой вектор AAV.

В некоторых вариантах реализации, вектор находится в форме частицы вирусного вектора.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит капсидные белки AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 и капсидные белки AAV2 (AAV2/2). В других вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV2 и капсидные белки AAV8 (AAV2/8). В других вариантах реализации, векторная частица AAV содержит геном AAV8 и капсидные белки AAV8 (AAV8/8).

В другом аспекте в данном изобретении предлагается клетка, содержащая полинуклеотид по данному изобретению.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается клетка, трансдуцированная вектором по данному изобретению.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

В предпочтительных вариантах реализации, фармацевтическая композиция предназначена для внутриглазного введения.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования в терапии.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике заболевания глаз.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике опосредованного комплементом или связанного с комплементом расстройства.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для применения при лечении или профилактике опосредованного комплементом или связанного с комплементом нарушения функции почек или опосредованного комплементом, или связанного с комплементом расстройства центральной нервной системы (ЦНС).

В другом аспекте в данном изобретении предлагается способ лечения или профилактики опосредованного комплементом или связанного с комплементом расстройства глаза, включающий введение полинуклеотида, вектора или клетки по данному изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается способ предоставления (i) кофактора фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактора комплемента I (CFI) субъекту, включающий доставку полинуклеотида, вектора или клетки по данному изобретению субъекту, предпочтительно в глаз субъекта.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается способ предоставления (i) фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактора комплемента H (CFH); и (ii) фактора комплемента I (CFI) субъекту, включающий доставку полинуклеотида, вектора или клетки по данному изобретению в глаз субъекта.

В некоторых вариантах реализации, расстройство представляет собой хроническое опосредованное комплементом или хроническое воспалительное состояние, связанное с комплементом.

В некоторых вариантах реализации, у субъекта диагностирована ВМД или существует риск развития ВМД.

В некоторых вариантах реализации, применение для лечения или профилактики расстройства у субъекта:

(a) имеющего более низкую, чем обычно, активность или концентрацию фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке, предпочтительно имеющую концентрацию или активность, эквивалентную 0-30, 0-20 или 0-10 мкг/мл в сыворотке; и/или

(b) который является гетерозиготным или гомозиготным по SNP, ассоциированному с возрастной макулярной дегенерации (ВМД), предпочтительно редкому варианту фактора комплемента I.

В некоторых вариантах реализации, применение для лечения или профилактики расстройства у субъекта:

(a) имеющего нормальный уровень активности или концентрации фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке, предпочтительно по меньшей мере 30 мкг/мл, например, 30-40 мкг/мл в сыворотке; и/или

(b) который не несет редкого аллеля варианта фактора комплемента I.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике возрастной макулярной дегенерации (ВМД). В предпочтительных вариантах реализации, ВМД представляет собой сухую форму ВМД.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования при лечении или профилактике диабетической ретинопатии.

В некоторых вариантах реализации предотвращается или уменьшается образование географической атрофии и/или уменьшается степень географической атрофии.

В некоторых вариантах реализации, прогрессирование географической атрофии замедляется.

В некоторых вариантах реализации наблюдается по меньшей мере 10% уменьшение увеличения площади географической атрофии в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период. В других вариантах реализации наблюдается по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% уменьшение увеличения площади географической атрофии в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период.

В некоторых вариантах реализации, введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта или в глазу, например, в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) субъекта, необязательно до уровня, который превышает нормальный уровень для субъекта или его глаза, или ПЭС.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для улучшения или восстановления зрения, или остроты зрения, например, у субъекта, страдающего глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе. В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения потери зрения или остроты зрения, например, потери зрения или остроты зрения, связанных с нарушением зрения, таким как нарушение зрения, описанное в данном документе.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для улучшения или восстановления скорости чтения у субъекта, например, у субъекта, страдающего глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе. В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения снижения скорости чтения у субъекта, например, снижения скорости чтения, связанного с глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе.

В другом аспекте в данном изобретении предлагается полинуклеотид, вектор или клетка по данному изобретению для использования для уменьшения или предотвращения потери фоторецепторов и/или пигментного эпителия сетчатки (ПЭС), например, потери фоторецепторов и/или ПЭС, связанных с глазным заболеванием, таким как глазное заболевание, описанное в данном документе.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят внутриглазно.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной инъекции.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит промотор hAAT. В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит энхансер ApoR. В других вариантах реализации, полинуклеотид или вектор по данному изобретению не содержит двух энхансеров ApoR.

В некоторых вариантах реализации, вектор по данному изобретению не содержит геном AAV2 и капсидный белок AAV8, т.е. вектор по данному изобретению не является вектором AAV2/8.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению не вводят системно. В других вариантах реализации, полинуклеотид, вектор или клетку по данному изобретению не вводят внутривенно.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что приведенные выше описания, касающиеся лечения ВМД, основаны на теории модуляции гиперактивированной системы комплемента (либо в результате сверхактивного цикла обратной связи C3b и/или недостаточно активного цикла разрушения C3b) и, следовательно, (за исключением текста, конкретно относящегося к внутриглазному введению) данное описание в равной степени применимо к другим хроническим воспалительным состояниям, в которые вовлечена система комплемента. Такие расстройства можно лечить путем введения продуктов, белков, векторов, клеток и композиций, описанных в данном документе, путем системного введения (например, путем инфузии в периферические вены), местного введения (например, интратекально) или прямой доставки в ткань-мишень или органы-мишени (например, печень, почки).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1

C3b циклы обратной связи (амплификации) и разрушения (подавления) альтернативного пути комплемента позвоночных («I» = фактор комплемента I; «H» = фактор комплемента H; «B» = фактор комплемента B; и «D» = фактор комплемента D).

Фиг. 2

(A) Анализ кофакторов, основанный на измерении расщепления C3b на iC3b на основе ИФА. Концентрации CFI и C3b были фиксированными, и было проведено титрование CFH или FHL1 в заданных соотношениях.

(B) Анализ отложения ЛПС, основанный на добавлении в нормальную сыворотку фактора комплемента I (FI), фактора комплемента H (FH) или фактора комплемента Н-подобного белка 1 (FHL1).

Фиг. 3

Вестерн-блоттинг супернатантов векторной трансдукции клеток HEK293 (RC001, контрольный вектор, содержащий FHL1 дикого типа; GT005, контрольный вектор, содержащий CFI дикого типа).

Фиг. 4

Анализ ИФА супернатантов векторной трансдукции клеток HEK293 (RC001, контрольный вектор, содержащий FHL1 дикого типа; GT005, контрольный вектор, содержащий CFI дикого типа).

Фиг. 5

Анализ упаковки генома вектора (верхняя панель) в щелочном геле. Сравнение соотношения количества полных-к-пустым вирусных частиц, определенного с помощью кПЦР и капсидна в ИФА (нижняя панель). (RC001, контрольный вектор, содержащий FHL1 дикого типа; GT005, контрольный вектор, содержащий CFI дикого типа).

Фиг. 6

Анализы расщепления C3b с использованием Вестерн-блоттинга (верхняя панель) и ИФА (нижняя панель). (RC001, контрольный вектор, содержащий FHL1 дикого типа; GT005, контрольный вектор, содержащий CFI дикого типа).

Фиг. 7

Сравнение соотношений фактора комплемента I (FI): фактора комплемента H (FH) в плазме крови (n = 80) и стекловидном теле (n = 29).

Фиг. 8

Анализ отложения LPS для измерения отложения C3. FI = фактор комплемента I, sCR1 = растворимый рецептор комплемента 1, FH = фактор комплемента H, FHL1 = фактор Н-подобного белка 1. Число над каждой полоской показывает % уменьшения отложения C3 по сравнению только с сывороткой.

Фиг. 9

Вестерн-блоттинг супернатанта клеток HEK-293, трансдуцированных in vitro. UTC = нетрансдуцированные клетки, GT005 = AAV, экспрессирующие CFI, GT007 = AAV, экспрессирующие CFI и FHL1, RC001 = AAV, экспрессирующие FHL1.

Фиг. 10

C3b Вестерн-блоттинг и iC3b ИФА кофакторного анализа для проверки функциональной активности конструкций. (А) Вестерн-блот анализа кофактора C3b. (B) iC3b ИФА для анализа кофактора C3b. C3b = комплемент C3b, CFI = фактор комплемента I, FHL1 = фактор комплемента Н-подобного белка 1, UTD = нетрансдуцированные клетки.

Фиг. 11

Зона, окрашенная изолектином, на хориоидальных срезах. Данные по окрашенным изолектином областям не имели нормального распределения по оценке с помощью теста Колмогорова-Смирнова, а статистическая значимость наблюдаемых различий определялась с использованием анализа обобщенной линейной модели. * = P <0,05; *** = p <0,0001, **** = P <0,00001. Точки представляют результаты отдельных лазерных ожогов, линия представляет среднее значение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины «содержащий», «включает» и «состоящий из» в контексте данного описания являются синонимами «включая» или «включает»; или «содержащий» или «содержит», и являются включающими или открытыми и не исключают дополнительных, неперечисленных членов, элементов или стадий. Термины «содержащий», «включает» и «состоящий из» также включают термин «состоящий из».

СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА

Система комплемента является неотъемлемой частью гуморальной иммунной системы и участвует в воспалении тканей, опсонизации клеток и цитолизе. Он обеспечивает защиту от микроорганизмов и способствует удалению экзогенного и эндогенных продуктов клеточного распада из тканей хозяина.

Каскад системы комплемента состоит из трех путей активации. Все пути в конечном итоге заканчиваются центральным расщеплением фактора C3 и образованием его активных фрагментов C3a и C3b. C3a представляет собой анафилатоксин, который запускает ряд хемотаксических и провоспалительных реакций, таких как рекрутирование воспалительных клеток и повышенная проницаемость микрососудов, тогда как C3b отвечает за опсонизацию чужеродных поверхностей, ковалентно связанных с C3b. Опсонизация активированными фрагментами C3 (C3b и iC3b) выполняет три основные функции: (i) устранение продуктов клеточного распада фагоцитарными клетками (например, макрофагами или микроглией) и стимуляция адаптивной иммунной системы (B- и T-клетки); (ii) усиление активации комплемента посредством образования связанной с поверхностью C3-конвертазы; и (iii) сборку конвертазы C5.

Сборка конвертазы C5 отвечает за расщепление C5, что приводит к образованию комплекса цитолитической мембранной атаки (MAC), способного генерировать перфорации в клеточной мембране, тем самым способствуя лизису клеток и устранению ненужных клеток. Посредством всех этих действий каскад врожденного комплемента поддерживает и стимулирует функцию нижестоящих механизмов иммунной системы, которые защищают целостность ткани хозяина. В целом активация пути системы комплемента приводит к провоспалительному ответу, включая образование MAC, которая опосредует лизис клеток, высвобождение хемокинов для привлечения воспалительных клеток к месту повреждения и усиление проницаемости капилляров, что способствует экстравазации инфильтрирующих лейкоцитов. В физиологических условиях активация комплемента эффективно контролируется скоординированным действием растворимых и связанных с мембраной регуляторных молекул комплемента (CRM). Растворимые регуляторы комплемента, такие как C1-ингибитор, ингибитор анафилатоксинов, связывающий белок C4b (C4BP), фактор комплемента H (CFH), фактор комплемента I (CFI), кластерин и витронектин, ограничивают действие комплемента в тканях человека на нескольких участках каскадной реакции. Кроме того, каждая отдельная клетка защищена от атаки гомологичного комплемента поверхностными белками, такими как рецептор комплемента 1 (CR1, CD35), мембранный кофакторный белок (CD46) и гликозилфосфатидилинозитол-заякоренные белки, такие как фактор ускорения распада (CD55) или молекула CD59. Следует отметить, что клетки-хозяева и ткани, которые недостаточно защищены от атаки комплемента, могут подвергаться фоновому лизису клеток.

Данное изобретение относится к лечению или профилактике опосредованного комплементом расстройства, например, глаз. Например, расстройство, опосредованное комплементом, может быть расстройством, связанным с дефектом регуляции альтернативного пути, и, в частности, с избыточной активностью цикла обратной связи комплемента C3b и/или недостаточной активностью цикла разрушения C3b.

В некоторых вариантах реализации, до введения продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению субъект имеет низкие уровни (например, более низкие, чем нормальные уровни) активности фактора комплемента I, например, низкие уровни активности фактора комплемента I в глазах и/или низкий уровень в сыворотке активности фактора комплемента I. Субнормальный уровень активности фактора комплемента I может быть следствием субнормальной экспрессии нормально функционирующего фактора комплемента I или по меньшей мере частичной (например, гетерозиготной) экспрессии (на нормальном или субнормальном уровне) не- или субфункционального варианта фактора комплемента I. (Такой субъект может нести одну или более копий связанного с ВМД SNP, например, субъект может быть гомо- или гетерозиготным по одному из редких вариантов фактора комплемента I, обсуждаемых ниже). Таким образом, у субъекта может быть низкая концентрация (например, концентрация ниже нормы) фактора комплемента I в глазу и/или сыворотке. Для человека нормальный уровень активности фактора комплемента I (активность по инактивации C3b и деградации iC3b) может быть эквивалентен уровню, обеспечиваемому 30-40 мкг/мл фактора комплемента I в сыворотке субъекта. Таким образом, у субъекта с низкой активностью фактора комплемента I активность фактора комплемента I в сыворотке может соответствовать менее 30 мкг/мл и более 0 мкг/мл фактора комплемента I, например, 0-20 или 0-10 мкг/мл (это диапазоны концентрации фактора комплемента I в сыворотке, которые могут охватывать субъект, имеющий низкую концентрацию фактора комплемента I).

Таким образом, субъект, который поддается лечению по данному изобретению, может страдать от опосредованного комплементом расстройства глаза, такого как ВМД, в частности сухой формы ВМД (например, характеризующейся географической атрофией), или может иметь риск развития такого расстройства. Например, субъект может быть гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с расстройством, опосредованным комплементом.

В некоторых вариантах реализации, субъект имеет риск развития ВМД. Например, субъект может быть гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с ВМД, например, к редким мутациям фактора комплемента I, связанным с ВМД на поздней стадии, которые обычно приводят к снижению уровней фактора комплемента I в сыворотке (Kavanagh et al. (2015) Hum Mol Genet 24: 3861-3870). В частности, субъект может нести одну или две копии одного или более из следующих редких вариантов фактора комплемента I: rs144082872 (кодирующего P50A); 4:110687847 (кодирующего P64L); rs141853578 (кодирующего G119R); 4:110685721 (кодирующего V152M); 4:110682846 (кодирующего G162D); 4:110682801 (кодирующего N177I); rs146444258 (кодирующего A240G); rs182078921 (кодирующего G287R); rs41278047 (кодирующего K441R); и rs121964913 (кодирующего R474).

Данное изобретение может дополнительно включать определение того, подвержен ли субъект риску развития комплемент-опосредованного расстройства (например, ВМД), например, путем определения, является ли субъект гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более SNP, связанным с комплемент-опосредованным расстройством (например, путем определения, является ли субъект гомозиготным или гетерозиготным, чувствительным к одному или более редким вариантам фактора комплемента I, связанным с ВМД, перечисленным выше).

Альтернативно, субъект может иметь нормальный уровень активности или концентрации эндогенного фактора комплемента I, например, в глазу и/или сыворотке, и/или может не иметь редкого варианта аллеля фактора комплемента I.

В некоторых вариантах реализации, введение продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению, таким образом, увеличивает уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b в глазу субъекта. В других вариантах реализации, введение продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению, таким образом, увеличивает уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b в глазу субъекта до уровня, который превышает нормальный уровень в глазу. Более конкретно, уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b увеличивается в ПЭС глаза.

Следует принимать во внимание, что активность по инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта после предоставления продукта по данному изобретению и/или экспрессия фактора комплемента I и кофактора CFI, такого как фактор комплемента H-подобного белка 1, из полинуклеотида или вектора по данному изобретению может включать C3b-инактивирующую и iC3b-деградационную активность эндогенного фактора комплемента I субъекта (т.е. фактор комплемента I субъекта, не обеспечиваемый продуктом или продуцируемый экспрессией из полинуклеотида или вектора), и активность по инактивации C3b и деградации iC3b, обеспечиваемая продуктом по данному изобретению или продуцируемая экспрессией из полинуклеотида или вектора по данному изобретению, такая что общий уровень активности C3b-инактивации и iC3b-деградации у субъекта превышает нормальный уровень.

В некоторых вариантах реализации, уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, повышен до уровня, который по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20% или 25% превышает нормальный уровень.

В других вариантах реализации, уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, повышается до уровня, который в два раза превышает нормальный уровень или до 80%, 60%, 40% или на 20% выше нормального уровня.

Например, уровень активности по инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта, например, в глазу, может быть повышен до уровня, который составляет 5-100%, 5-80%, 5-60%, 5-40%, 5- 20%, 10-100%, 10-80%, 10-60%, 10-40%, 10-20%, 15-100%, 15-80%, 15-60%, 15-40%, 15-20%, 20-100%, 20-80%, 20-60%, 20-40%, 25-100%, 25-80%, 25-60% или 25-40% выше нормального уровня.

В некоторых вариантах реализации, введение продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению не вызывает заметного повышения уровня активности по инактивации C3b и деградации iC3b в плазме/сыворотке субъекта. В других вариантах реализации, введение продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению не приводит к заметному увеличению уровня активности по инактивации C3b и деградации iC3b в плазме/сыворотке субъекта до уровня, превышающего нормальный уровень.

В предыдущем разделе, за исключением явно неприменимых, ссылка на фактор комплемента I и активность по инактивации C3b и деградации iC3b может быть заменена кофактором CFI, предпочтительно фактором комплемента H или фактору комплемента H-подобного белка 1, и способностью действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b и для увеличения скорости диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы, соответственно. В некоторых вариантах реализации, до введения продукта, полинуклеотида, вектора, клетки или фармацевтической композиции по данному изобретению субъект имеет низкие уровни (например, более низкие, чем нормальные уровни) фактора комплемента H, например, низкие уровни фактора комплемента H в глазу и/или низкие уровни фактора комплемента H в сыворотке. Для человека нормальный уровень фактора комплемента H может составлять около 200-500 мкг/мл в сыворотке субъекта. Таким образом, у субъекта с низким уровнем фактора комплемента H уровни в сыворотке могут быть меньше 200 мкг/мл и больше 0 мкг/мл, например, 0-100 мкг/мл. Альтернативно, субъект может иметь нормальный уровень эндогенного фактора комплемента H, например, в глазу и/или сыворотке.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I (CFI)

Фактор комплемента I (фактор I, CFI), также известный как инактиватор C3b/C4b, представляет собой белок, который у человека кодируется геном CFI.

Фактор комплемента I представляет собой сериновую протеазу, которая циркулирует в состоянии, подобном зимогену (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844) в концентрации ~35 мкг/мл (Nilsson et al. (2011) Mol Immunol 48: 1611-1620). Белок фактора комплемента I представляет собой сильно N-гликозилированный гетеродимер, состоящий из двух полипептидных цепей, связанных одной дисульфидной связью. Тяжелая цепь (50 кДа) включает N-концевую область; домен мембраноатакующего комплекса Fl (FIMAC); CD5-подобный домен или богатый цистеином (SRCR) домен рецептора скавенджера; два домена рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDLr); и С-концевой участок с неизвестной функцией, который является участком изменчивости последовательностей у разных видов (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844). Легкая цепь (38 кДа) содержит домен сериновой протеазы (SP) с консервативными каталитическими остатками (Goldberger et al. (1987) J Biol Chem 262: 10065-10071).

Фактор комплемента I инактивирует C3b, расщепляя его на iC3b, C3d и C3d, g и аналогичным образом C4b на C4c и C4d. Для правильного выполнения своих функций фактор комплемента I требует присутствия кофакторных белков, таких как C4b-связывающий белок (C4BP), фактор комплемента H (CFH), рецептор комплемента 1 (CR1/CD35) и мембранный кофакторный белок (MCP/CD46) (Degn et al. (2011) Am J Hum Genet 88: 689-705).

iC3b неспособен связываться с фактором B и, таким образом, не может поддерживать амплификацию каскада комплемента или активацию через альтернативный путь. Следовательно, как только C3b был расщеплен до iC3b, не происходит ни инициации альтернативного пути, ни активации терминального каскада комплемента.

iC3b способен оказывать провоспалительное действие путем связывания и активации рецептора комплемента 3 (CR3) (CD11b/CD18) на полиморфно-ядерных лейкоцитах (в основном нейтрофилах), NK-клетках и мононуклеарных фагоцитах, таких как макрофаги.

Фактор комплемента I способен преобразовывать iC3b в C3dg посредством протеазной активности, требующей кофактора CR1. C3dg не может связываться с CR3. Поскольку реакция iC3b с рецептором комплемента CR3 является основным механизмом, с помощью которого активация комплемента вызывает воспаление, расщепление iC3b до C3dg имеет важное значение для уменьшения воспаления, вызванного комплементом (Lachmann (2009) Adv. Immunol. 104: 115-149).

Уникальная способность фактора комплемента I как способствовать расщеплению C3b до iC3b, так и ускорять расщепление iC3b - в сочетании с его относительно низкой концентрацией в сыворотке крови человека, что влияет на количество, необходимое для доставки для терапевтической эффективности, - делает его особенно выгодной мишенью.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен расщеплять C3b до неактивного продукта разложения. Например, полипептид фактора комплемента I может быть способен расщеплять C3b на iC3b.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен преобразовывать iC3b в неактивный продукт разложения. Например, полипептид фактора комплемента I может быть способен преобразовывать iC3b в C3dg.

В предпочтительных вариантах реализации, полипептид фактора комплемента I способен расщеплять C3b до iC3b и обрабатывать iC3b до C3dg.

Соответственно, фрагмент или производное фактора комплемента I может сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% активности по инактивации C3b и деградации iC3b нативного фактора комплемента I.

Активность по инактивации C3b и деградации iC3b фактора комплемента I или его фрагмента, или производного может быть определена с использованием любого подходящего метода, известного специалисту в данной области техники. Например, измерение протеолитической активности фактора комплемента I описано в Hsiung et al. (Biochem. J. (1982) 203: 293-298). И гемолитический, и конглютинирующий анализы активности CFI описаны в Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) “Complement Technology” in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17. Более подробное описание, включая протеолитический анализ, дано Harrison RA (1996) in “Weir's Handbook of Experimental Immunology” 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A'Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37. Анализ конглютинации высокочувствителен и может использоваться как для обнаружения первого (двойного) разреза, превращающего фиксированный C3b в iC3b, так и для определения реактивности с конглютинином; и для обнаружения последнего разреза на C3dg, начиная с фиксированного iC3b и поиска потери реактивности с конглютинином. Гемолитический анализ используется для превращения C3b в iC3b, а протеолитический анализ обнаруживает все разрезы.

В некоторых вариантах реализации, фактор комплемента I представляет собой фактор комплемента I человека.

Примером белка фактора комплемента I человека является белок фактора комплемента I человека, имеющий номер доступа UniProtKB P05156. Эта приведенная в качестве примера последовательность имеет длину 583 аминокислоты (раскрыта как SEQ ID NO: 1), из которых аминокислоты с 1 по 18 образуют сигнальную последовательность.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 1.

В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой последовательность, раскрытую в положениях с 19 по 583 SEQ ID NO: 1.

MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADWCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVTQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

(SEQ ID NO: 1)

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 9, которая соответствует номеру доступа NCBI NP_000195. В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента I представляет собой последовательность, раскрытую в положениях с 19 по 583 SEQ ID NO: 9.

MKLLHVFLLFLCFHLRFCKVTYTSQEDLVEKKCLAKKYTHLSCDKVFCQPWQRCIEGTCVCKLPYQCPKNGTAVCATNRRSFPTYCQQKSLECLHPGTKFLNNGTCTAEGKFSVSLKHGNTDSEGIVEVKLVDQDKTMFICKSSWSMREANVACLDLGFQQGADTQRRFKLSDLSINSTECLHVHCRGLETSLAECTFTKRRTMGYQDFADWCYTQKADSPMDDFFQCVNGKYISQMKACDGINDCGDQSDELCCKACQGKGFHCKSGVCIPSQYQCNGEVDCITGEDEVGCAGFASVAQEETEILTADMDAERRRIKSLLPKLSCGVKNRMHIRRKRIVGGKRAQLGDLPWQVAIKDASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLRASKTHRYQIWTTWDWIHPDLKRIVIEYVDRIIFHENYNAGTYQNDIALIEMKKDGNKKDCELPRSIPACVPWSPYLFQPNDTCIVSGWGREKDNERVFSLQWGEVKLISNCSKFYGNRFYEKEMECAGTYDGSIDACKGDSGGPLVCMDANNVTYVWGWSWGENCGKPEFPGVYTKVANYFDWISYHVGRPFISQYNV

(SEQ ID NO: 9)

Примером нуклеотидной последовательности дикого типа, кодирующей фактор комплемента I, является нуклеотидная последовательность, имеющая номер доступа NCBI NM_000204, раскрытая в данном документе как SEQ ID NO: 2.

ATGAAGCTTCTTCATGTTTTCCTGTTATTTCTGTGCTTCCACTTAAGGTTTTGCAAGGTCACTTATACATCTCAAGAGGATCTGGTGGAGAAAAAGTGCTTAGCAAAAAAATATACTCACCTCTCCTGCGATAAAGTCTTCTGCCAGCCATGGCAGAGATGCATTGAGGGCACCTGTGTTTGTAAACTACCGTATCAGTGCCCAAAGAATGGCACTGCAGTGTGTGCAACTAACAGGAGAAGCTTCCCAACATACTGTCAACAAAAGAGTTTGGAATGTCTTCATCCAGGGACAAAGTTTTTAAATAACGGAACATGCACAGCCGAAGGAAAGTTTAGTGTTTCCTTGAAGCATGGAAATACAGATTCAGAGGGAATAGTTGAAGTAAAACTTGTGGACCAAGATAAGACAATGTTCATATGCAAAAGCAGCTGGAGCATGAGGGAAGCCAACGTGGCCTGCCTTGACCTTGGGTTTCAACAAGGTGCTGATACTCAAAGAAGGTTTAAGTTGTCTGATCTCTCTATAAATTCCACTGAATGTCTACATGTGCATTGCCGAGGATTAGAGACCAGTTTGGCTGAATGTACTTTTACTAAGAGAAGAACTATGGGTTACCAGGATTTCGCTGATGTGGTTTGTTATACACAGAAAGCAGATTCTCCAATGGATGACTTCTTTCAGTGTGTGAATGGGAAATACATTTCTCAGATGAAAGCCTGTGATGGTATCAATGATTGTGGAGACCAAAGTGATGAACTGTGTTGTAAAGCATGCCAAGGCAAAGGCTTCCATTGCAAATCGGGTGTTTGCATTCCAAGCCAGTATCAATGCAATGGTGAGGTGGACTGCATTACAGGGGAAGATGAAGTTGGCTGTGCAGGCTTTGCATCTGTGGCTCAAGAAGAAACAGAAATTTTGACTGCTGACATGGATGCAGAAAGAAGACGGATAAAATCATTATTACCTAAACTATCTTGTGGAGTTAAAAACAGAATGCACATTCGAAGGAAACGAATTGTGGGAGGAAAGCGAGCACAACTGGGAGACCTCCCATGGCAGGTGGCAATTAAGGATGCCAGTGGAATCACCTGTGGGGGAATTTATATTGGTGGCTGTTGGATTCTGACTGCTGCACATTGTCTCAGAGCCAGTAAAACTCATCGTTACCAAATATGGACAACAGTAGTAGACTGGATACACCCCGACCTTAAACGTATAGTAATTGAATACGTGGATAGAATTATTTTCCATGAAAACTACAATGCAGGCACTTACCAAAATGACATCGCTTTGATTGAAATGAAAAAAGACGGAAACAAAAAAGATTGTGAGCTGCCTCGTTCCATCCCTGCCTGTGTCCCCTGGTCTCCTTACCTATTCCAACCTAATGATACATGCATCGTTTCTGGCTGGGGACGAGAAAAAGATAACGAAAGAGTCTTTTCACTTCAGTGGGGTGAAGTTAAACTAATAAGCAACTGCTCTAAGTTTTACGGAAATCGTTTCTATGAAAAAGAAATGGAATGTGCAGGTACATATGATGGTTCCATCGATGCCTGTAAAGGGGACTCTGGAGGCCCCTTAGTCTGTATGGATGCCAACAATGTGACTTATGTCTGGGGTGTTGTGAGTTGGGGGGAAAACTGTGGAAAACCAGAGTTCCCAGGTGTTTACACCAAAGTGGCCAATTATTTTGACTGGATTAGCTACCATGTAGGAAGGCCTTTTATTTCTCAGTACAATGTATAA

(SEQ ID NO: 2)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидные последовательности фактора комплемента I, используемые в данном изобретении, оптимизированы по кодонам. Различные клетки различаются использованием конкретных кодонов. Это смещение кодонов соответствует смещению относительного количества определенных тРНК в типе клеток. Изменяя кодоны в последовательности так, чтобы они соответствовали относительной численности соответствующих тРНК, можно увеличить экспрессию. Точно так же можно уменьшить экспрессию, сознательно выбирая кодоны, для которых известно, что соответствующие тРНК редки в конкретном типе клеток. Таким образом, доступна дополнительная степень трансляционного контроля.

Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей фактор комплемента I, является нуклеотидная последовательность, раскрытая как SEQ ID NO: 10.

ATGAAACTGCTGCATGTCTTCCTCCTCTTCCTGTGCTTCCACCTCCGTTTCTGTAAAGTCACCTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAGTATACCCACCTGAGCTGCGACAAAGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAACGCTGCATTGAAGGTACTTGTGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACGGCCGTGTGTGCCACCAACAGGAGGAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAATGCCTCCACCCTGGCACCAAGTTTCTGAACAACGGGACCTGCACAGCCGAGGGGAAATTCAGCGTCTCCCTCAAGCACGGCAATACAGACTCCGAGGGCATTGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAAAGCAGCTGGTCCATGCGGGAGGCCAATGTCGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAGGGCGCTGATACACAGCGCCGCTTTAAACTCAGTGACCTCAGCATCAACAGCACTGAGTGTCTGCACGTGCACTGCCGGGGCCTGGAGACCAGCCTGGCTGAGTGCACCTTCACCAAGCGCAGGACCATGGGCTACCAGGATTTTGCAGATGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCAGACAGCCCCATGGATGACTTCTTCCAGTGTGTCAATGGCAAGTACATTTCCCAGATGAAGGCTTGTGACGGGATCAATGATTGCGGGGATCAGAGCGATGAGCTCTGCTGCAAGGCCTGCCAAGGGAAGGGCTTTCACTGTAAGTCTGGGGTGTGCATCCCTTCTCAGTATCAGTGCAACGGAGAGGTGGACTGCATCACTGGGGAGGACGAGGTGGGCTGTGCTGGCTTCGCCTCTGTGGCCCAGGAGGAGACAGAGATCCTCACAGCTGACATGGATGCAGAGCGGCGGCGCATCAAGAGTCTGCTCCCAAAGCTCTCCTGCGGCGTTAAGAATCGCATGCACATCCGGAGGAAGCGGATCGTTGGAGGCAAACGGGCTCAGCTGGGGGACTTGCCGTGGCAGGTGGCCATCAAAGATGCCTCCGGAATCACCTGTGGTGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATCCTGACCGCCGCCCACTGCCTTCGGGCCAGCAAGACTCACCGCTACCAGATCTGGACCACCGTGGTGGATTGGATTCACCCCGACCTGAAGAGGATTGTCATTGAGTATGTCGACCGCATCATCTTCCATGAAAACTACAATGCCGGGACGTATCAGAACGACATCGCCCTCATCGAGATGAAGAAGGATGGGAACAAGAAGGACTGTGAGCTGCCTCGCTCCATCCCCGCCTGTGTACCATGGTCTCCGTACCTGTTCCAGCCAAATGACACATGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAAGACAACGAGAGGGTCTTCTCCCTGCAGTGGGGTGAAGTCAAGCTGATCAGCAACTGCTCCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTATGACGGCAGCATTGACGCGTGCAAGGGAGACAGTGGGGGCCCCCTGGTCTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGAGTTGTGTCCTGGGGCGAGAACTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCGGGCGTGTACACAAAGGTGGCAAACTATTTTGACTGGATCTCCTATCACGTTGGCAGGCCCTTCATTTCACAGTACAACGTATAA

(SEQ ID NO: 10)

Еще одним примером оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор комплемента I, является SEQ ID NO: 8.

ATGAAGCTGCTGCATGTCTTTCTGCTGTTTCTGTGCTTCCATCTGCGGTTCTGTAAAGTGACCTATACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAGTGTCTGGCCAAGAAGTACACACACCTGAGCTGCGACAAGGTGTTCTGTCAGCCTTGGCAGCGGTGCATCGAGGGCACCTGCGTGTGCAAGCTGCCTTACCAGTGCCCAAAGAACGGCACCGCCGTGTGCGCCACAAATCGGAGATCTTTTCCAACATATTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAGTGTCTGCACCCCGGCACCAAGTTCCTGAACAATGGCACCTGCACAGCCGAGGGCAAGTTTTCTGTGAGCCTGAAGCACGGCAACACAGATAGCGAGGGCATCGTGGAGGTGAAGCTGGTGGACCAGGATAAGACCATGTTCATCTGTAAGAGCTCCTGGTCCATGAGGGAGGCAAACGTGGCATGCCTGGATCTGGGATTCCAGCAGGGAGCAGACACACAGAGGCGCTTTAAGCTGTCCGACCTGTCTATCAATAGCACCGAGTGCCTGCACGTGCACTGTAGGGGCCTGGAGACATCCCTGGCAGAGTGCACCTTCACAAAGCGGAGAACCATGGGCTACCAGGACTTTGCCGACGTGGTGTGCTATACCCAGAAGGCCGATAGCCCCATGGACGATTTCTTTCAGTGCGTGAACGGCAAGTATATCTCCCAGATGAAGGCCTGCGACGGCATCAATGACTGTGGCGATCAGTCTGACGAGCTGTGCTGTAAGGCCTGTCAGGGCAAGGGCTTCCACTGCAAGAGCGGCGTGTGCATCCCTTCCCAGTACCAGTGCAACGGCGAGGTGGATTGTATCACAGGAGAGGACGAAGTGGGATGCGCAGGATTTGCATCTGTGGCACAGGAGGAGACAGAGATCCTGACAGCCGACATGGATGCCGAGAGGCGCCGGATCAAGTCTCTGCTGCCTAAGCTGAGCTGTGGCGTGAAGAATCGGATGCACATCAGAAGGAAGCGCATCGTGGGAGGCAAGAGGGCACAGCTGGGCGATCTGCCATGGCAGGTGGCCATCAAGGACGCCTCTGGCATCACCTGCGGCGGCATCTACATCGGAGGATGTTGGATCCTGACCGCAGCACACTGCCTGAGAGCAAGCAAGACACACAGGTATCAGATCTGGACCACAGTGGTGGATTGGATCCACCCAGACCTGAAGAGAATCGTGATCGAGTACGTGGATAGGATCATCTTTCACGAGAACTACAATGCCGGCACATATCAGAACGACATCGCCCTGATCGAGATGAAGAAGGATGGCAATAAGAAGGACTGTGAGCTGCCCAGATCCATCCCTGCATGCGTGCCATGGAGCCCCTATCTGTTCCAGCCCAACGATACCTGCATCGTGTCCGGATGGGGAAGGGAGAAGGACAATGAGCGGGTGTTTTCTCTGCAGTGGGGCGAGGTGAAGCTGATCTCCAACTGTTCTAAGTTCTACGGCAATAGGTTTTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTACGATGGCAGCATCGACGCCTGTAAGGGCGATTCCGGAGGACCACTGGTGTGCATGGACGCAAACAATGTGACATACGTGTGGGGAGTGGTGTCCTGGGGAGAGAACTGCGGCAAGCCAGAGTTCCCCGGCGTATATACCAAGGTGGCCAATTATTTTGATTGGATTTCCTACCACGTCGGCAGGCCCTTTATTTCCCAGTATAATGTCTAA

(SEQ ID NO: 8)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 10, 8 или 2, предпочтительно SEQ ID NO: 10. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I представляет собой SEQ ID NO: 10, 8 или 2, предпочтительно SEQ ID NO: 10.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 55-1752 SEQ ID NO: 10, 8 или 2, предпочтительно SEQ ID NO: 10. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I находится имеет положения 55-1752 SEQ ID NO: 10, 8 или 2, предпочтительно SEQ ID NO: 10.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 1 или 9. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 9.

В другом варианте реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична положениям 19-583 SEQ ID NO: 1 или 9. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 1 или 9.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента I, кодирует аминокислотную последовательность в положениях 19-583 SEQ ID NO: 1 или 9.

Преимущество данного изобретения состоит в том, что фактор комплемента I особенно трудно получить в форме очищенного белка. Соответственно, изобретатели разработали способ модуляции системы комплемента, например, для обеспечения лечения возрастной макулярной дегенерации (ВМД), путем введения фактора комплемента I в форме вектора AAV, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор комплемента I. Вектор AAV может быть введен в интересующий участок, например, в глаз, чтобы сделать возможной трансляцию in situ полипептида фактора комплемента I.

КОФАКТОР ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I (CFI)

Используемый в данном документе термин «кофактор фактора комплемента I (CFI)» может относиться к белку, который способен действовать как кофактор для CFI-опосредованного расщепления C3b.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА H (CFH)

Фактор комплемента H (фактор H, CFH) представляет собой белок контроля комплемента.

Фактор комплемента H представляет собой крупный (155 кДа) растворимый гликопротеин, который присутствует в плазме человека в типовой концентрации 200-300 мкг/мл (Hakobyan et al. (2008) 49(5): 1983- 90). Основная функция фактора комплемента H - регулировать альтернативный путь системы комплемента.

Фактор комплемента H обеспечивает кофакторную активность для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b. Фактор комплемента H также увеличивает скорость диссоциации комплекса C3bBb (конвертаза C3) и комплекса (C3b) NBb (конвертаза C5), и тем самым снижает активность альтернативного пути комплемента.

Фактор комплемента H состоит из 20 модулей контрольного белка комплемента (CCP) (также называемых короткими консенсусными повторами или суши-доменами), соединенных друг с другом короткими линкерами (от трех до восьми аминокислотных остатков) и расположенных в удлиненном порядке «головка-в-хвост». Каждый из модулей CCP состоит из около 60 аминокислот с четырьмя дисульфидными остатками цистеина, связанными в порядке 1-3 2-4, и гидрофобным ядром, построенным вокруг почти неизменного остатка триптофана. Модули CCP пронумерованы от 1 до 20 (от N-конца белка). CCP 1-4 и CCP 19-20 взаимодействуют с C3b, в то время как CCP 6-8 и CCP 19-20 связываются с GAG и сиаловой кислотой (Schmidt et al. (2008) Journal of Immunology 181: 2610-2619).

Было показано, что генная терапия с использованием фактора комплемента H может облегчить индуцированную ВМД-подобную патологию у мышей (Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243). Мышам совместно вводили субретинально: (i) аденовирусный вектор, экспрессирующий компонент комплемента C3, который, как ранее было показано, воспроизводит многие патологические особенности ВМД человека; и (ii) аденовирусный вектор, экспрессирующий фактор комплемента Н. По сравнению с контрольными животными, получавшими GFP вместо фактора комплемента H, мыши, трансдуцированные фактором комплемента H, показали снижение пролиферации эндотелиальных клеток на 91% и ослабление атрофии ПЭС на 69%. Электроретинография показала улучшение функции сетчатки у мышей, получавших фактор комплемента H, а иммуноцитохимия родопсина и RPE65 соответствовала восстановлению фоторецепторов и ПЭС у таких животных.

В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способен действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b. В некоторых вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способны увеличивать скорость диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы.

В предпочтительных вариантах реализации, полипептид фактора комплемента H или его фрагмент, или производное способен действовать как кофактор для опосредованного фактором комплемента I расщепления C3b и увеличивать скорость диссоциации C3-конвертазы и C5-конвертазы.

В некоторых вариантах реализации фактор комплемента H представляет собой фактор комплемента H.

Примером белка фактора комплемента H человека является белок фактора комплемента H человека, имеющий номер доступа UniProtKB P08603. Эта приведенная в качестве примера последовательность имеет длину 1231 аминокислоты (раскрыта как SEQ ID NO: 3), из которых аминокислоты с 1 по 18 образуют сигнальную последовательность.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента H представляет собой SEQ ID NO: 3. В других вариантах реализации, аминокислотная последовательность фактора комплемента H находится в положениях с 19 по 1231 SEQ ID NO: 3.

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVKTCSKSSIDIENGFISESQYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETSGSITCGKDGWSAQPTCIKSCDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPICYERECELPKIDVHLVPDRKKDQYKVGEVLKFSCKPGFTIVGPNSVQCYHFGLSPDLPICKEQVQSCGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEWEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVCIVEESTCGDIPELEHGWAQLSSPPYYYGDSVEFNCSESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQCVAIDKLKKCKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNCSMAQIQLCPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLCVEKIPCSQPPQIEHGTINSSRSSQESYAHGTKLSYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQCEGLPCKSPPEISHGWAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSCIKTDCLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTCRDTSCVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQCKDSTGKCGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKCLHPCVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKLEYPTCAKR

(SEQ ID NO: 3)

Примером нуклеотидной последовательности, кодирующей фактор комплемента H, является нуклеотидная последовательность, имеющая номер доступа NCBI NM_000186.

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, представляет собой SEQ ID NO: 4.

ATGAGACTTCTAGCAAAGATTATTTGCCTTATGTTATGGGCTATTTGTGTAGCAGAAGATTGCAATGAACTTCCTCCAAGAAGAAATACAGAAATTCTGACAGGTTCCTGGTCTGACCAAACATATCCAGAAGGCACCCAGGCTATCTATAAATGCCGCCCTGGATATAGATCTCTTGGAAATGTAATAATGGTATGCAGGAAGGGAGAATGGGTTGCTCTTAATCCATTAAGGAAATGTCAGAAAAGGCCCTGTGGACATCCTGGAGATACTCCTTTTGGTACTTTTACCCTTACAGGAGGAAATGTGTTTGAATATGGTGTAAAAGCTGTGTATACATGTAATGAGGGGTATCAATTGCTAGGTGAGATTAATTACCGTGAATGTGACACAGATGGATGGACCAATGATATTCCTATATGTGAAGTTGTGAAGTGTTTACCAGTGACAGCACCAGAGAATGGAAAAATTGTCAGTAGTGCAATGGAACCAGATCGGGAATACCATTTTGGACAAGCAGTACGGTTTGTATGTAACTCAGGCTACAAGATTGAAGGAGATGAAGAAATGCATTGTTCAGACGATGGTTTTTGGAGTAAAGAGAAACCAAAGTGTGTGGAAATTTCATGCAAATCCCCAGATGTTATAAATGGATCTCCTATATCTCAGAAGATTATTTATAAGGAGAATGAACGATTTCAATATAAATGTAACATGGGTTATGAATACAGTGAAAGAGGAGATGCTGTATGCACTGAATCTGGATGGCGTCCGTTGCCTTCATGTGAAGAAAAATCATGTGATAATCCTTATATTCCAAATGGTGACTACTCACCTTTAAGGATTAAACACAGAACTGGAGATGAAATCACGTACCAGTGTAGAAATGGTTTTTATCCTGCAACCCGGGGAAATACAGCAAAATGCACAAGTACTGGCTGGATACCTGCTCCGAGATGTACCTTGAAACCTTGTGATTATCCAGACATTAAACATGGAGGTCTATATCATGAGAATATGCGTAGACCATACTTTCCAGTAGCTGTAGGAAAATATTACTCCTATTACTGTGATGAACATTTTGAGACTCCGTCAGGAAGTTACTGGGATCACATTCATTGCACACAAGATGGATGGTCGCCAGCAGTACCATGCCTCAGAAAATGTTATTTTCCTTATTTGGAAAATGGATATAATCAAAATCATGGAAGAAAGTTTGTACAGGGTAAATCTATAGACGTTGCCTGCCATCCTGGCTACGCTCTTCCAAAAGCGCAGACCACAGTTACATGTATGGAGAATGGCTGGTCTCCTACTCCCAGATGCATCCGTGTCAAAACATGTTCCAAATCAAGTATAGATATTGAGAATGGGTTTATTTCTGAATCTCAGTATACATATGCCTTAAAAGAAAAAGCGAAATATCAATGCAAACTAGGATATGTAACAGCAGATGGTGAAACATCAGGATCAATTACATGTGGGAAAGATGGATGGTCAGCTCAACCCACGTGCATTAAATCTTGTGATATCCCAGTATTTATGAATGCCAGAACTAAAAATGACTTCACATGGTTTAAGCTGAATGACACATTGGACTATGAATGCCATGATGGTTATGAAAGCAATACTGGAAGCACCACTGGTTCCATAGTGTGTGGTTACAATGGTTGGTCTGATTTACCCATATGTTATGAAAGAGAATGCGAACTTCCTAAAATAGATGTACACTTAGTTCCTGATCGCAAGAAAGACCAGTATAAAGTTGGAGAGGTGTTGAAATTCTCCTGCAAACCAGGATTTACAATAGTTGGACCTAATTCCGTTCAGTGCTACCACTTTGGATTGTCTCCTGACCTCCCAATATGTAAAGAGCAAGTACAATCATGTGGTCCACCTCCTGAACTCCTCAATGGGAATGTTAAGGAAAAAACGAAAGAAGAATATGGACACAGTGAAGTGGTGGAATATTATTGCAATCCTAGATTTCTAATGAAGGGACCTAATAAAATTCAATGTGTTGATGGAGAGTGGACAACTTTACCAGTGTGTATTGTGGAGGAGAGTACCTGTGGAGATATACCTGAACTTGAACATGGCTGGGCCCAGCTTTCTTCCCCTCCTTATTACTATGGAGATTCAGTGGAATTCAATTGCTCAGAATCATTTACAATGATTGGACACAGATCAATTACGTGTATTCATGGAGTATGGACCCAACTTCCCCAGTGTGTGGCAATAGATAAACTTAAGAAGTGCAAATCATCAAATTTAATTATACTTGAGGAACATTTAAAAAACAAGAAGGAATTCGATCATAATTCTAACATAAGGTACAGATGTAGAGGAAAAGAAGGATGGATACACACAGTCTGCATAAATGGAAGATGGGATCCAGAAGTGAACTGCTCAATGGCACAAATACAATTATGCCCACCTCCACCTCAGATTCCCAATTCTCACAATATGACAACCACACTGAATTATCGGGATGGAGAAAAAGTATCTGTTCTTTGCCAAGAAAATTATCTAATTCAGGAAGGAGAAGAAATTACATGCAAAGATGGAAGATGGCAGTCAATACCACTCTGTGTTGAAAAAATTCCATGTTCACAACCACCTCAGATAGAACACGGAACCATTAATTCATCCAGGTCTTCACAAGAAAGTTATGCACATGGGACTAAATTGAGTTATACTTGTGAGGGTGGTTTCAGGATATCTGAAGAAAATGAAACAACATGCTACATGGGAAAATGGAGTTCTCCACCTCAGTGTGAAGGCCTTCCTTGTAAATCTCCACCTGAGATTTCTCATGGTGTTGTAGCTCACATGTCAGACAGTTATCAGTATGGAGAAGAAGTTACGTACAAATGTTTTGAAGGTTTTGGAATTGATGGGCCTGCAATTGCAAAATGCTTAGGAGAAAAATGGTCTCACCCTCCATCATGCATAAAAACAGATTGTCTCAGTTTACCTAGCTTTGAAAATGCCATACCCATGGGAGAGAAGAAGGATGTGTATAAGGCGGGTGAGCAAGTGACTTACACTTGTGCAACATATTACAAAATGGATGGAGCCAGTAATGTAACATGCATTAATAGCAGATGGACAGGAAGGCCAACATGCAGAGACACCTCCTGTGTGAATCCGCCCACAGTACAAAATGCTTATATAGTGTCGAGACAGATGAGTAAATATCCATCTGGTGAGAGAGTACGTTATCAATGTAGGAGCCCTTATGAAATGTTTGGGGATGAAGAAGTGATGTGTTTAAATGGAAACTGGACGGAACCACCTCAATGCAAAGATTCTACAGGAAAATGTGGGCCCCCTCCACCTATTGACAATGGGGACATTACTTCATTCCCGTTGTCAGTATATGCTCCAGCTTCATCAGTTGAGTACCAATGCCAGAACTTGTATCAACTTGAGGGTAACAAGCGAATAACATGTAGAAATGGACAATGGTCAGAACCACCAAAATGCTTACATCCGTGTGTAATATCCCGAGAAATTATGGAAAATTATAACATAGCATTAAGGTGGACAGCCAAACAGAAGCTTTATTCGAGAACAGGTGAATCAGTTGAATTTGTGTGTAAACGGGGATATCGTCTTTCATCACGTTCTCACACATTGCGAACAACATGTTGGGATGGGAAACTGGAGTATCCAACTTGTGCAAAAAGATAG

(SEQ ID NO: 4)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, при этом белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, представляет собой SEQ ID NO: 4.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 55-3696 SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, при этом белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H находится в положениях 55-3696 SEQ ID NO: 4.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

В другом варианте реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична положениям 19-1231 SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, при этом аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 3.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая фактор комплемента H, кодирует аминокислотную последовательность в положениях 19-1231 SEQ ID NO: 3.

ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА Н-ПОДОБНОГО БЕЛКА 1 (FHL1)

Фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) представляет собой сплайсинговый вариант фактора комплемента H, который содержит первые 7 CCP фактора комплемента H, за которыми следует карбоксиконцевой хвост из четырех аминокислот (Clark, S.J. et al. (2015) J Clin Med 4: 18-31).

В некоторых вариантах реализации, FHL1 представляет собой FHL1 человека.

В некоторых вариантах реализации, аминокислотная последовательность FHL1 представляет собой SEQ ID NO: 11.

MRLLAKIICLMLWAICVAEDCNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNIIMVCRKGEWVALNPLRKCQKRPCGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPICEWKCLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKEKPKCVEISCKSPDVINGSPISQKIIYKENERFQYKCNMGYEYSERGDAVCTESGWRPLPSCEEKSCDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRCTLKPCDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGWSPAVPCLRKCYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRCIRVSFTL

(SEQ ID NO: 11)

Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей FHL1, представляет собой:

(SEQ ID NO: 16)

Нуклеотидные последовательности FHL1, используемые в данном изобретении, предпочтительно оптимизированы по кодонам.

Предпочтительной нуклеотидной последовательностью, кодирующей FHL1, является SEQ ID NO: 12.

ATGCGCCTCCTGGCCAAGATCATCTGCCTCATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCTGAGGACTGCAATGAGCTGCCGCCCAGGAGGAACACAGAGATCCTGACAGGGAGCTGGTCTGACCAGACCTACCCTGAGGGCACCCAGGCGATCTACAAGTGCCGGCCGGGCTACAGGAGCCTGGGGAACATCATCATGGTGTGTAGAAAGGGCGAATGGGTGGCCCTCAACCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGGCCCTGTGGCCACCCCGGGGACACACCCTTCGGGACCTTCACCCTGACCGGCGGCAATGTGTTTGAGTACGGCGTGAAGGCTGTCTACACATGCAACGAGGGGTACCAGCTGCTGGGCGAGATTAACTACCGGGAGTGTGACACCGATGGGTGGACCAACGACATTCCCATCTGTGAGGTGGTCAAGTGTCTCCCCGTGACAGCCCCAGAAAATGGCAAAATCGTGAGCAGCGCCATGGAGCCTGACCGCGAATATCACTTTGGGCAGGCCGTGAGGTTTGTGTGCAACTCGGGCTACAAAATTGAAGGTGATGAGGAGATGCACTGCAGCGATGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAATGTGTGGAGATCTCCTGCAAGTCTCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCAATCAGCCAGAAGATTATTTACAAAGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTATGAGTATTCAGAGAGGGGAGATGCCGTCTGCACTGAGAGCGGCTGGAGACCACTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGTTGTGACAACCCTTACATCCCAAATGGCGACTACTCCCCTCTGCGGATCAAACACCGGACCGGGGATGAAATCACCTATCAGTGCCGCAATGGATTCTACCCGGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAATGCACCAGCACAGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGTACGCTGAAGCCTTGCGACTATCCAGACATCAAGCACGGAGGCCTGTACCACGAAAACATGCGGCGGCCTTATTTCCCTGTGGCAGTGGGGAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCTCTGGCTCCTACTGGGACCACATCCACTGCACACAGGACGGCTGGTCTCCAGCTGTGCCCTGCCTGAGGAAATGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGATACAACCAGAACTATGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCACCCTGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACAACTGTGACCTGCATGGAGAATGGTTGGAGCCCCACCCCGCGCTGCATCCGGGTGTCCTTCACGCTCTGA

(SEQ ID NO: 12)

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 12 или 16, предпочтительно SEQ ID NO: 12. Предпочтительно белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 11.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12 или 16, предпочтительно SEQ ID NO: 12.

РЕЦЕПТОР КОМПЛЕМЕНТА 1 (CR1)

Рецептор комплемента 1 (CR1), также известный как CD35, представляет собой мембраносвязанный гликопротеин I типа, принадлежащий к семейству регуляторов активности комплемента (RCA). CR1 может быть обнаружен на плазматической мембране эритроцитов, эозинофилов, моноцитов, макрофагов, B-лимфоцитов, субпопуляции CD4+ Т-клеток, дендритных клеток, клеток Лангергана в коже и подоцитов.

CR1 представляет собой одноцепочечный гликопротеин массой ~200 кДа, внеклеточная часть которого включает 30 комплемент-контроль-белковых повторов (CCP) или короткие консенсусные повторы. Не связанная с мембраной растворимая форма CR1 (sCR1) обнаруживается в плазме. Он может быть вызван высвобождением из лейкоцитов путем расщепления поверхностной формы CR1. Структура CR1 и sCR1 описана, например, в Liu, D. et al. (2009) Immunopharmacology and Immunotoxicology 31: 524-535.

В некоторых вариантах реализации, CR1 или его фрагмент представляет собой CR1 человека или его фрагмент.

Пример последовательности CR1 представляет собой:

MGASSPRSPEPVGPPAPGLPFCCGGSLLAVWLLALPVAWGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLNYECRPGYSGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKGIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGDTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSWTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEWEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPDVLHAERTQRDKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASMRCTPQGDWSPAAPTCEVKSCDDFMGQLLNGRVLFPVNLQLGAKVDFVCDEGFQLKGSSASYCVLAGMESLWNSSVPVCEQIFCPSPPVIPNGRHTGKPLEVFPFGKTVNYTCDPHPDRGTSFDLIGESTIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCGILGHCQAPDHFLFAKLKTQTNASDFPIGTSLKYECRPEYYGRPFSITCLDNLVWSSPKDVCKRKSCKTPPDPVNGMVHVITDIQVGSRINYSCTTGHRLIGHSSAECILSGNAAHWSTKPPICQRIPCGLPPTIANGDFISTNRENFHYGSWTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEWEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPDVLHAERTQRDKDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASMRCTPQGDWSPAAPTCEVKSCDDFMGQLLNGRVLFPVNLQLGAKVDFVCDEGFQLKGSSASYCVLAGMESLWNSSVPVCEQIFCPSPPVIPNGRHTGKPLEVFPFGKAVNYTCDPHPDRGTSFDLIGESTIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCGILGHCQAPDHFLFAKLKTQTNASDFPIGTSLKYECRPEYYGRPFSITCLDNLVWSSPKDVCKRKSCKTPPDPVNGMVHVITDIQVGSRINYSCTTGHRLIGHSSAECILSGNTAHWSTKPPICQRIPCGLPPTIANGDFISTNRENFHYGSWTYRCNLGSRGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIIPNKCTPPNVENGILVSDNRSLFSLNEWEFRCQPGFVMKGPRRVKCQALNKWEPELPSCSRVCQPPPEILHGEHTPSHQDNFSPGQEVFYSCEPGYDLRGAASLHCTPQGDWSPEAPRCAVKSCDDFLGQLPHGRVLFPLNLQLGAKVSFVCDEGFRLKGSSVSHCVLVGMRSLWNNSVPVCEHIFCPNPPAILNGRHTGTPSGDIPYGKEISYTCDPHPDRGMTFNLIGESTIRCTSDPHGNGVWSSPAPRCELSVRAGHCKTPEQFPFASPTIPINDFEFPVGTSLNYECRPGYFGKMFSISCLENLVWSSVEDNCRRKSCGPPPEPFNGMVHINTDTQFGSTVNYSCNEGFRLIGSPSTTCLVSGNNVTWDKKAPICEIISCEPPPTISNGDFYSNNRTSFHNGTWTYQCHTGPDGEQLFELVGERSIYCTSKDDQVGVWSSPPPRCISTNKCTAPEVENAIRVPGNRSFFTLTEIIRFRCQPGFVMVGSHTVQCQTNGRWGPKLPHCSRVCQPPPEILHGEHTLSHQDNFSPGQEVFYSCEPSYDLRGAASLHCTPQGDWSPEAPRCTVKSCDDFLGQLPHGRVLLPLNLQLGAKVSFVCDEGFRLKGRSASHCVLAGMKALWNSSVPVCEQIFCPNPPAILNGRHTGTPFGDIPYGKEISYACDTHPDRGMTFNLIGESSIRCTSDPQGNGVWSSPAPRCELSVPAACPHPPKIQNGHYIGGHVSLYLPGMTISYICDPGYLLVGKGFIFCTDQGIWSQLDHYCKEVNCSFPLFMNGISKELEMKKVYHYGDYVTLKCEDGYTLEGSPWSQCQADDRWDPPLAKCTSRTHDALIVGTLSGTIFFILLIIFLSWIILKHRKGNNAHENPKEVAIHLH SQGGSSVHPRTLQTNEENSRVLP

(SEQ ID NO: 24)

Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей CR1, представляет собой:

ATGGGGGCCTCTTCTCCAAGAAGCCCGGAGCCTGTCGGGCCGCCGGCGCCCGGTCTCCCCTTCTGCTGCGGAGGATCCCTGCTGGCGGTTGTGGTGCTGCTTGCGCTGCCGGTGGCCTGGGGTCAATGCAATGCCCCAGAATGGCTTCCATTTGCCAGGCCTACCAACCTAACTGATGAATTTGAGTTTCCCATTGGGACATATCTGAACTATGAATGCCGCCCTGGTTATTCCGGAAGACCGTTTTCTATCATCTGCCTAAAAAACTCAGTCTGGACTGGTGCTAAGGACAGGTGCAGACGTAAATCATGTCGTAATCCTCCAGATCCTGTGAATGGCATGGTGCATGTGATCAAAGGCATCCAGTTCGGATCCCAAATTAAATATTCTTGTACTAAAGGATACCGACTCATTGGTTCCTCGTCTGCCACATGCATCATCTCAGGTGATACTGTCATTTGGGATAATGAAACACCTATTTGTGACAGAATTCCTTGTGGGCTACCCCCCACCATCACCAATGGAGATTTCATTAGCACCAACAGAGAGAATTTTCACTATGGATCAGTGGTGACCTACCGCTGCAATCCTGGAAGCGGAGGGAGAAAGGTGTTTGAGCTTGTGGGTGAGCCCTCCATATACTGCACCAGCAATGACGATCAAGTGGGCATCTGGAGCGGCCCCGCCCCTCAGTGCATTATACCTAACAAATGCACGCCTCCAAATGTGGAAAATGGAATATTGGTATCTGACAACAGAAGCTTATTTTCCTTAAATGAAGTTGTGGAGTTTAGGTGTCAGCCTGGCTTTGTCATGAAAGGACCCCGCCGTGTGAAGTGCCAGGCCCTGAACAAATGGGAGCCGGAGCTACCAAGCTGCTCCAGGGTATGTCAGCCACCTCCAGATGTCCTGCATGCTGAGCGTACCCAAAGGGACAAGGACAACTTTTCACCTGGGCAGGAAGTGTTCTACAGCTGTGAGCCCGGCTACGACCTCAGAGGGGCTGCGTCTATGCGCTGCACACCCCAGGGAGACTGGAGCCCTGCAGCCCCCACATGTGAAGTGAAATCCTGTGATGACTTCATGGGCCAACTTCTTAATGGCCGTGTGCTATTTCCAGTAAATCTCCAGCTTGGAGCAAAAGTGGATTTTGTTTGTGATGAAGGATTTCAATTAAAAGGCAGCTCTGCTAGTTACTGTGTCTTGGCTGGAATGGAAAGCCTTTGGAATAGCAGTGTTCCAGTGTGTGAACAAATCTTTTGTCCAAGTCCTCCAGTTATTCCTAATGGGAGACACACAGGAAAACCTCTGGAAGTCTTTCCCTTTGGGAAAACAGTAAATTACACATGCGACCCCCACCCAGACAGAGGGACGAGCTTCGACCTCATTGGAGAGAGCACCATCCGCTGCACAAGTGACCCTCAAGGGAATGGGGTTTGGAGCAGCCCTGCCCCTCGCTGTGGAATTCTGGGTCACTGTCAAGCCCCAGATCATTTTCTGTTTGCCAAGTTGAAAACCCAAACCAATGCATCTGACTTTCCCATTGGGACATCTTTAAAGTACGAATGCCGTCCTGAGTACTACGGGAGGCCATTCTCTATCACATGTCTAGATAACCTGGTCTGGTCAAGTCCCAAAGATGTCTGTAAACGTAAATCATGTAAAACTCCTCCAGATCCAGTGAATGGCATGGTGCATGTGATCACAGACATCCAGGTTGGATCCAGAATCAACTATTCTTGTACTACAGGGCACCGACTCATTGGTCACTCATCTGCTGAATGTATCCTCTCGGGCAATGCTGCCCATTGGAGCACGAAGCCGCCAATTTGTCAACGAATTCCTTGTGGGCTACCCCCCACCATCGCCAATGGAGATTTCATTAGCACCAACAGAGAGAATTTTCACTATGGATCAGTGGTGACCTACCGCTGCAATCCTGGAAGCGGAGGGAGAAAGGTGTTTGAGCTTGTGGGTGAGCCCTCCATATACTGCACCAGCAATGACGATCAAGTGGGCATCTGGAGCGGCCCGGCCCCTCAGTGCATTATACCTAACAAATGCACGCCTCCAAATGTGGAAAATGGAATATTGGTATCTGACAACAGAAGCTTATTTTCCTTAAATGAAGTTGTGGAGTTTAGGTGTCAGCCTGGCTTTGTCATGAAAGGACCCCGCCGTGTGAAGTGCCAGGCCCTGAACAAATGGGAGCCGGAGCTACCAAGCTGCTCCAGGGTATGTCAGCCACCTCCAGATGTCCTGCATGCTGAGCGTACCCAAAGGGACAAGGACAACTTTTCACCCGGGCAGGAAGTGTTCTACAGCTGTGAGCCCGGCTATGACCTCAGAGGGGCTGCGTCTATGCGCTGCACACCCCAGGGAGACTGGAGCCCTGCAGCCCCCACATGTGAAGTGAAATCCTGTGATGACTTCATGGGCCAACTTCTTAATGGCCGTGTGCTATTTCCAGTAAATCTCCAGCTTGGAGCAAAAGTGGATTTTGTTTGTGATGAAGGATTTCAATTAAAAGGCAGCTCTGCTAGTTATTGTGTCTTGGCTGGAATGGAAAGCCTTTGGAATAGCAGTGTTCCAGTGTGTGAACAAATCTTTTGTCCAAGTCCTCCAGTTATTCCTAATGGGAGACACACAGGAAAACCTCTGGAAGTCTTTCCCTTTGGAAAAGCAGTAAATTACACATGCGACCCCCACCCAGACAGAGGGACGAGCTTCGACCTCATTGGAGAGAGCACCATCCGCTGCACAAGTGACCCTCAAGGGAATGGGGTTTGGAGCAGCCCTGCCCCTCGCTGTGGAATTCTGGGTCACTGTCAAGCCCCAGATCATTTTCTGTTTGCCAAGTTGAAAACCCAAACCAATGCATCTGACTTTCCCATTGGGACATCTTTAAAGTACGAATGCCGTCCTGAGTACTACGGGAGGCCATTCTCTATCACATGTCTAGATAACCTGGTCTGGTCAAGTCCCAAAGATGTCTGTAAACGTAAATCATGTAAAACTCCTCCAGATCCAGTGAATGGCATGGTGCATGTGATCACAGACATCCAGGTTGGATCCAGAATCAACTATTCTTGTACTACAGGGCACCGACTCATTGGTCACTCATCTGCTGAATGTATCCTCTCAGGCAATACTGCCCATTGGAGCACGAAGCCGCCAATTTGTCAACGAATTCCTTGTGGGCTACCCCCAACCATCGCCAATGGAGATTTCATTAGCACCAACAGAGAGAATTTTCACTATGGATCAGTGGTGACCTACCGCTGCAATCTTGGAAGCAGAGGGAGAAAGGTGTTTGAGCTTGTGGGTGAGCCCTCCATATACTGCACCAGCAATGACGATCAAGTGGGCATCTGGAGCGGCCCCGCCCCTCAGTGCATTATACCTAACAAATGCACGCCTCCAAATGTGGAAAATGGAATATTGGTATCTGACAACAGAAGCTTATTTTCCTTAAATGAAGTTGTGGAGTTTAGGTGTCAGCCTGGCTTTGTCATGAAAGGACCCCGCCGTGTGAAGTGCCAGGCCCTGAACAAATGGGAGCCAGAGTTACCAAGCTGCTCCAGGGTGTGTCAGCCGCCTCCAGAAATCCTGCATGGTGAGCATACCCCAAGCCATCAGGACAACTTTTCACCTGGGCAGGAAGTGTTCTACAGCTGTGAGCCTGGCTATGACCTCAGAGGGGCTGCGTCTCTGCACTGCACACCCCAGGGAGACTGGAGCCCTGAAGCCCCGAGATGTGCAGTGAAATCCTGTGATGACTTCTTGGGTCAACTCCCTCATGGCCGTGTGCTATTTCCACTTAATCTCCAGCTTGGGGCAAAGGTGTCCTTTGTCTGTGATGAAGGGTTTCGCTTAAAGGGCAGTTCCGTTAGTCATTGTGTCTTGGTTGGAATGAGAAGCCTTTGGAATAACAGTGTTCCTGTGTGTGAACATATCTTTTGTCCAAATCCTCCAGCTATCCTTAATGGGAGACACACAGGAACTCCCTCTGGAGATATTCCCTATGGAAAAGAAATATCTTACACATGTGACCCCCACCCAGACAGAGGGATGACCTTCAACCTCATTGGGGAGAGCACCATCCGCTGCACAAGTGACCCTCATGGGAATGGGGTTTGGAGCAGCCCTGCCCCTCGCTGTGAACTTTCTGTTCGTGCTGGTCACTGTAAAACCCCAGAGCAGTTTCCATTTGCCAGTCCTACGATCCCAATTAATGACTTTGAGTTTCCAGTCGGGACATCTTTGAATTATGAATGCCGTCCTGGGTATTTTGGGAAAATGTTCTCTATCTCCTGCCTAGAAAACTTGGTCTGGTCAAGTGTTGAAGACAACTGTAGACGAAAATCATGTGGACCTCCACCAGAACCCTTCAATGGAATGGTGCATATAAACACAGATACACAGTTTGGATCAACAGTTAATTATTCTTGTAATGAAGGGTTTCGACTCATTGGTTCCCCATCTACTACTTGTCTCGTCTCAGGCAATAATGTCACATGGGATAAGAAGGCACCTATTTGTGAGATCATATCTTGTGAGCCACCTCCAACCATATCCAATGGAGACTTCTACAGCAACAATAGAACATCTTTTCACAATGGAACGGTGGTAACTTACCAGTGCCACACTGGACCAGATGGAGAACAGCTGTTTGAGCTTGTGGGAGAACGGTCAATATATTGCACCAGCAAAGATGATCAAGTTGGTGTTTGGAGCAGCCCTCCCCCTCGGTGTATTTCTACTAATAAATGCACAGCTCCAGAAGTTGAAAATGCAATTAGAGTACCAGGAAACAGGAGTTTCTTTACCCTCACTGAGATCATCAGATTTAGATGTCAGCCCGGGTTTGTCATGGTAGGGTCCCACACTGTGCAGTGCCAGACCAATGGCAGATGGGGGCCCAAGCTGCCACACTGCTCCAGGGTGTGTCAGCCGCCTCCAGAAATCCTGCATGGTGAGCATACCCTAAGCCATCAGGACAACTTTTCACCTGGGCAGGAAGTGTTCTACAGCTGTGAGCCCAGCTATGACCTCAGAGGGGCTGCGTCTCTGCACTGCACGCCCCAGGGAGACTGGAGCCCTGAAGCCCCTAGATGTACAGTGAAATCCTGTGATGACTTCCTGGGCCAACTCCCTCATGGCCGTGTGCTACTTCCACTTAATCTCCAGCTTGGGGCAAAGGTGTCCTTTGTTTGCGATGAAGGGTTCCGATTAAAAGGCAGGTCTGCTAGTCATTGTGTCTTGGCTGGAATGAAAGCCCTTTGGAATAGCAGTGTTCCAGTGTGTGAACAAATCTTTTGTCCAAATCCTCCAGCTATCCTTAATGGGAGACACACAGGAACTCCCTTTGGAGATATTCCCTATGGAAAAGAAATATCTTACGCATGCGACACCCACCCAGACAGAGGGATGACCTTCAACCTCATTGGGGAGAGCTCCATCCGCTGCACAAGTGACCCTCAAGGGAATGGGGTTTGGAGCAGCCCTGCCCCTCGCTGTGAACTTTCTGTTCCTGCTGCCTGCCCACATCCACCCAAGATCCAAAACGGGCATTACATTGGAGGACACGTATCTCTATATCTTCCTGGGATGACAATCAGCTACATTTGTGACCCCGGCTACCTGTTAGTGGGAAAGGGCTTCATTTTCTGTACAGACCAGGGAATCTGGAGCCAATTGGATCATTATTGCAAAGAAGTAAATTGTAGCTTCCCACTGTTTATGAATGGAATCTCGAAGGAGTTAGAAATGAAAAAAGTATATCACTATGGAGATTATGTGACTTTGAAGTGTGAAGATGGGTATACTCTGGAAGGCAGTCCCTGGAGCCAGTGCCAGGCGGATGACAGATGGGACCCTCCTCTGGCCAAATGTACCTCTCGTACACATGATGCTCTCATAGTTGGCACTTTATCTGGTACGATCTTCTTTATTTTACTCATCATTTTCCTCTCTTGGATAATTCTAAAGCACAGAAAAGGCAATAATGCACATGAAAACCCTAAAGAAGTGGCTATCCATTTACATTCTCAAGGAGGCAGCAGCGTTCATCCCCGAACTCTGCAAACAAATGAAGAAAATAGCAGGGTCCTTCCTTGA

(SEQ ID NO: 25)

В некоторых вариантах реализации, CR1 или его фрагмент представляет собой растворимый CR1 (sCR1).

Фрагмент CR1 предпочтительно способен действовать как кофактор для CFI-опосредованного расщепления C3b. Специалист легко сможет определить такую активность CFI с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники, например, описанного в данном документе.

CR1 содержит два известных сайта связывания для C3b (см. Liu, D. et al. (2009) Immunopharmacology and Immunotoxicology 31: 524-535). В предпочтительных вариантах реализации, фрагмент CR1 содержит один или два сайта связывания C3b.

Предпочтительно, фрагмент CR1 представляет собой растворимый фрагмент CR1, например, полученный путем удаления трансмембранного и цитоплазматического доменов из полноразмерного CR1 и/или путем выбора усечений CR1, содержащих или состоящих из определенных CCP.

Примеры фрагментов CR1 известны в данной области техники (см., например, WO2019138137). Например, фрагмент CR1 может содержать или состоять из CCP 8-10 (например, соответствует аминокислотам 491-684 в SEQ ID NO: 24) и/или CCP 15-17 (например, соответствующие аминокислотам 941-1134 в SEQ ID NO: 24).

В некоторых вариантах реализации, фрагмент CR1 содержит CCP 8-10. В некоторых вариантах реализации, фрагмент CR1 содержит CCP 15-17. В некоторых вариантах реализации, фрагмент CR1 содержит CCP 8-10 и CCP 15-17.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 24. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 24.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 491-684 в SEQ ID NO: 24. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 24.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует положения аминокислотной последовательности 491-684 в SEQ ID NO: 24.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична положениям 941-1134 SEQ ID NO: 24. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 24.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая CR1, кодирует положения аминокислотной последовательности 941-1134 в SEQ ID NO: 24.

МЕМБРАННЫЙ КОФАКТОРНЫЙ БЕЛОК (MCP)

Мембранный кофакторный белок (MCP), также известный как CD46, представляет собой мембранный белок типа I, который функционирует как регуляторная часть системы комплемента и действует как кофактор для CFI.

Внеклеточная область MCP содержит четыре коротких консенсусных повтора (SCR).

В некоторых вариантах реализации, MCP или его фрагмент представляет собой MCP человека или его фрагмент.

Пример последовательности MCP представляет собой:

MEPPGRRECPFPSWRFPGLLLAAMVLLLYSFSDACEEPPTFEAMELIGKPKPYYEIGERVDYKCKKGYFYIPPLATHTICDRNHTWLPVSDDACYRETCPYIRDPLNGQAVPANGTYEFGYQMHFICNEGYYLIGEEILYCELKGSVAIWSGKPPICEKVLCTPPPKIKNGKHTFSEVEVFEYLDAVTYSCDPAPGPDPFSLIGESTIYCGDNSVWSRAAPECKWKCRFPWENGKQISGFGKKFYYKATVMFECDKGFYLDGSDTIVCDSNSTWDPPVPKCLKVLPPSSTKPPALSHSVSTSSTTKSPASSASGPRPTYKPPVSNYPGYPKPEEGILDSLDVWVIAVIVIAIWGVAV ICWPYRYLQRRKKKGTYLTDETHREVKFTSL

(SEQ ID NO: 26)

Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей MCP, представляет собой:

ATGGAGCCTCCCGGCCGCCGCGAGTGTCCCTTTCCTTCCTGGCGCTTTCCTGGGTTGCTTCTGGCGGCCATGGTGTTGCTGCTGTACTCCTTCTCCGATGCCTGTGAGGAGCCACCAACATTTGAAGCTATGGAGCTCATTGGTAAACCAAAACCCTACTATGAGATTGGTGAACGAGTAGATTATAAGTGTAAAAAAGGATACTTCTATATACCTCCTCTTGCCACCCATACTATTTGTGATCGGAATCATACATGGCTACCTGTCTCAGATGACGCCTGTTATAGAGAAACATGTCCATATATACGGGATCCTTTAAATGGCCAAGCAGTCCCTGCAAATGGGACTTACGAGTTTGGTTATCAGATGCACTTTATTTGTAATGAGGGTTATTACTTAATTGGTGAAGAAATTCTATATTGTGAACTTAAAGGATCAGTAGCAATTTGGAGCGGTAAGCCCCCAATATGTGAAAAGGTTTTGTGTACACCACCTCCAAAAATAAAAAATGGAAAACACACCTTTAGTGAAGTAGAAGTATTTGAGTATCTTGATGCAGTAACTTATAGTTGTGATCCTGCACCTGGACCAGATCCATTTTCACTTATTGGAGAGAGCACGATTTATTGTGGTGACAATTCAGTGTGGAGTCGTGCTGCTCCAGAGTGTAAAGTGGTCAAATGTCGATTTCCAGTAGTCGAAAATGGAAAACAGATATCAGGATTTGGAAAAAAATTTTACTACAAAGCAACAGTTATGTTTGAATGCGATAAGGGTTTTTACCTCGATGGCAGCGACACAATTGTCTGTGACAGTAACAGTACTTGGGATCCCCCAGTTCCAAAGTGTCTTAAAGTGCTGCCTCCATCTAGTACAAAACCTCCAGCTTTGAGTCATTCAGTGTCGACTTCTTCCACTACAAAATCTCCAGCGTCCAGTGCCTCAGGTCCTAGGCCTACTTACAAGCCTCCAGTCTCAAATTATCCAGGATATCCTAAACCTGAGGAAGGAATACTTGACAGTTTGGATGTTTGGGTCATTGCTGTGATTGTTATTGCCATAGTTGTTGGAGTTGCAGTAATTTGTGTTGTCCCGTACAGATATCTTCAAAGGAGGAAGAAGAAAGGCACATACCTAACTGATGAGACCCACAGAGAAGTAAAATTTACTTCTCTCTGA

(SEQ ID NO: 27)

В некоторых вариантах реализации, MCP или его фрагмент представляет собой растворимый MCP.

Фрагмент MCP предпочтительно способен действовать как кофактор для CFI-опосредованного расщепления C3b. Специалист легко сможет определить такую активность CFI с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники, например, описанного в данном документе.

Предпочтительно, фрагмент MCP представляет собой растворимый фрагмент MCP, например, полученный путем удаления трансмембранного и цитоплазматического доменов из полноразмерного MCP и/или путем выбора усечений MCP, содержащих или состоящих из определенных SCR.

В некоторых вариантах реализации, фрагмент MCP содержит SCR 2 и 3. В некоторых вариантах реализации, фрагмент MCP содержит SCR 2, 3 и 4.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая MCP, кодирует аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 26. Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность по существу сохраняет функциональную активность белка, представленного SEQ ID NO: 26.

В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая MCP, кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.

ЛИНКЕРЫ

В предпочтительных вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая (i), находится выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (ii). В других вариантах реализации, нуклеотидная последовательность, кодирующая (ii), находится выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (i).

В некоторых вариантах реализации, нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) и (ii), функционально связаны линкером. В некоторых вариантах реализации, линкер содержит саморасщепляющуюся пептидную последовательность 2А, такую как последовательность, содержащую или определяемую сайтом расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательностью F2A.

В некоторых вариантах реализации, линкер представляет собой SEQ ID NO: 17.

CGAAGGAAACGAGGAAGCGGAGAAGCCAGACACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC

(SEQ ID NO: 17)

В других вариантах реализации, линкер по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 17. Предпочтительно линкер по существу сохраняет функциональную активность SEQ ID NO: 17.

Под «функционально связанными» следует понимать, что отдельные компоненты связаны друг с другом таким образом, чтобы они могли выполнять свои функции по существу беспрепятственно.

ПРОДУКТ

Продукт по данному изобретению может, например, представлять собой композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или кодирующие их нуклеотидные последовательности в смеси. Альтернативно, продукт может, например, представлять собой набор, содержащий препараты (i) кофактора фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, и, необязательно, инструкции по одновременному, последовательному или раздельному введению препаратов субъекту, нуждающемуся в этом.

Продукт по данному изобретению может, например, представлять собой композицию (например, фармацевтическую композицию), содержащую (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или кодирующие его нуклеотидные последовательности в смеси. Альтернативно, продукт может, например, представлять собой набор, содержащий препараты (i) фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактора комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, и, необязательно, инструкции по одновременному, последовательному или раздельному введению препаратов субъекту, нуждающемуся в этом.

БЕЛКОВАЯ ТРАНСДУКЦИЯ

В качестве альтернативы доставке полинуклеотидов в клетки продукты и агенты по данному изобретению могут быть доставлены в клетки путем белковой трансдукции.

Protein transduction may be via vector delivery (Cai, Y. et al. (2014) Elife 3: e01911; Maetzig, T. et al. (2012) Curr. Gene Ther. 12: 389-409). Доставка вектора включает конструирование вирусных частиц (например, лентивирусных частиц), содержащих белки, которые будут доставлены в клетку. Соответственно, когда сконструированные вирусные частицы входят в клетку как часть их естественного жизненного цикла, белки, содержащиеся в частицах, переносятся в клетку.

Трансдукция белка может осуществляться посредством доставки белка (Gaj, T. et al. (2012) Nat. Methods 9: 805-7). Доставка белка может быть достигнута, например, с использованием носителя (например, липосом) или даже путем введения самого белка непосредственно в клетку.

ПОЛИНУКЛЕОТИД

Полинуклеотиды по данному изобретению могут включать ДНК или РНК, предпочтительно ДНК. Они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Специалисту будет понятно, что множество различных полинуклеотидов могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Кроме того, следует понимать, что квалифицированные специалисты могут, используя стандартные методы, производить замены нуклеотидов, которые не влияют на полипептидную последовательность, кодируемую полинуклеотидами по данному изобретению, чтобы отразить использование кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды данного изобретение должны быть выражены.

Раскрытые в данном документе нуклеотидные последовательности по данному изобретению могут содержать или не содержать стоп-кодоны на своем 3' конце, например, в зависимости от их положения в бицистронном векторе. Таким образом, настоящее раскрытие охватывает SEQ ID NO, раскрытые в данном документе, с присутствующими или отсутствующими стоп-кодонами.

Полинуклеотиды можно модифицировать любым способом, доступным в данной области техники. Такие модификации могут быть выполнены для увеличения активности или продолжительности жизни полинуклеотидов по данному изобретению in vivo.

Полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды ДНК, могут быть получены рекомбинантно, синтетически или любыми способами, доступными специалистам в данной области техники. Они также могут быть клонированы стандартными методами.

Более длинные полинуклеотиды обычно получают с использованием рекомбинантных способов, например, с использованием методов клонирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это будет включать создание пары праймеров (например, около из 15-30 нуклеотидов), фланкирующих последовательность-мишень, которую требуется клонировать, приведение праймеров в контакт с мРНК или кДНК, полученной из клетки животного или человека, выполнение полимеразной цепной реакции в условиях, которые вызывают амплификацию желаемой области, выделение амплифицированного фрагмента (например, путем очистки реакционной смеси с помощью агарозного геля) и извлечение амплифицированной ДНК. Праймеры могут быть сконструированы так, чтобы они содержали подходящие сайты узнавания рестрикционного фермента, чтобы амплифицированную ДНК можно было клонировать в подходящий вектор.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит и состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 22, или нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична ей.

CGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGTACCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTAGTGCCACCATGCGCCTCCTGGCCAAGATCATCTGCCTCATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCTGAGGACTGCAATGAGCTGCCGCCCAGGAGGAACACAGAGATCCTGACAGGGAGCTGGTCTGACCAGACCTACCCTGAGGGCACCCAGGCGATCTACAAGTGCCGGCCGGGCTACAGGAGCCTGGGGAACATCATCATGGTGTGTAGAAAGGGCGAATGGGTGGCCCTCAACCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGGCCCTGTGGCCACCCCGGGGACACACCCTTCGGGACCTTCACCCTGACCGGCGGCAATGTGTTTGAGTACGGCGTGAAGGCTGTCTACACATGCAACGAGGGGTACCAGCTGCTGGGCGAGATTAACTACCGGGAGTGTGACACCGATGGGTGGACCAACGACATTCCCATCTGTGAGGTGGTCAAGTGTCTCCCCGTGACAGCCCCAGAAAATGGCAAAATCGTGAGCAGCGCCATGGAGCCTGACCGCGAATATCACTTTGGGCAGGCCGTGAGGTTTGTGTGCAACTCGGGCTACAAAATTGAAGGTGATGAGGAGATGCACTGCAGCGATGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAATGTGTGGAGATCTCCTGCAAGTCTCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCAATCAGCCAGAAGATTATTTACAAAGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTATGAGTATTCAGAGAGGGGAGATGCCGTCTGCACTGAGAGCGGCTGGAGACCACTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGTTGTGACAACCCTTACATCCCAAATGGCGACTACTCCCCTCTGCGGATCAAACACCGGACCGGGGATGAAATCACCTATCAGTGCCGCAATGGATTCTACCCGGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAATGCACCAGCACAGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGTACGCTGAAGCCTTGCGACTATCCAGACATCAAGCACGGAGGCCTGTACCACGAAAACATGCGGCGGCCTTATTTCCCTGTGGCAGTGGGGAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCTCTGGCTCCTACTGGGACCACATCCACTGCACACAGGACGGCTGGTCTCCAGCTGTGCCCTGCCTGAGGAAATGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGATACAACCAGAACTATGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCACCCTGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACAACTGTGACCTGCATGGAGAATGGTTGGAGCCCCACCCCGCGCTGCATCCGGGTGTCCTTCACGCTCCGAAGGAAACGAGGAAGCGGAGAAGCCAGACACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGAAACTGCTGCATGTCTTCCTCCTCTTCCTGTGCTTCCACCTCCGTTTCTGTAAAGTCACCTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAGTATACCCACCTGAGCTGCGACAAAGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAACGCTGCATTGAAGGTACTTGTGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACGGCCGTGTGTGCCACCAACAGGAGGAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAATGCCTCCACCCTGGCACCAAGTTTCTGAACAACGGGACCTGCACAGCCGAGGGGAAATTCAGCGTCTCCCTCAAGCACGGCAATACAGACTCCGAGGGCATTGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAAAGCAGCTGGTCCATGCGGGAGGCCAATGTCGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAGGGCGCTGATACACAGCGCCGCTTTAAACTCAGTGACCTCAGCATCAACAGCACTGAGTGTCTGCACGTGCACTGCCGGGGCCTGGAGACCAGCCTGGCTGAGTGCACCTTCACCAAGCGCAGGACCATGGGCTACCAGGATTTTGCAGATGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCAGACAGCCCCATGGATGACTTCTTCCAGTGTGTCAATGGCAAGTACATTTCCCAGATGAAGGCTTGTGACGGGATCAATGATTGCGGGGATCAGAGCGATGAGCTCTGCTGCAAGGCCTGCCAAGGGAAGGGCTTTCACTGTAAGTCTGGGGTGTGCATCCCTTCTCAGTATCAGTGCAACGGAGAGGTGGACTGCATCACTGGGGAGGACGAGGTGGGCTGTGCTGGCTTCGCCTCTGTGGCCCAGGAGGAGACAGAGATCCTCACAGCTGACATGGATGCAGAGCGGCGGCGCATCAAGAGTCTGCTCCCAAAGCTCTCCTGCGGCGTTAAGAATCGCATGCACATCCGGAGGAAGCGGATCGTTGGAGGCAAACGGGCTCAGCTGGGGGACTTGCCGTGGCAGGTGGCCATCAAAGATGCCTCCGGAATCACCTGTGGTGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATCCTGACCGCCGCCCACTGCCTTCGGGCCAGCAAGACTCACCGCTACCAGATCTGGACCACCGTGGTGGATTGGATTCACCCCGACCTGAAGAGGATTGTCATTGAGTATGTCGACCGCATCATCTTCCATGAAAACTACAATGCCGGGACGTATCAGAACGACATCGCCCTCATCGAGATGAAGAAGGATGGGAACAAGAAGGACTGTGAGCTGCCTCGCTCCATCCCCGCCTGTGTACCATGGTCTCCGTACCTGTTCCAGCCAAATGACACATGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAAGACAACGAGAGGGTCTTCTCCCTGCAGTGGGGTGAAGTCAAGCTGATCAGCAACTGCTCCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTATGACGGCAGCATTGACGCGTGCAAGGGAGACAGTGGGGGCCCCCTGGTCTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGAGTTGTGTCCTGGGGCGAGAACTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCGGGCGTGTACACAAAGGTGGCAAACTATTTTGACTGGATCTCCTATCACGTTGGCAGGCCCTTCATTTCACAGTACAACGTATAACTCGAGAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG

(SEQ ID NO: 22)

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит и состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23, или нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична ей.

CGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGGCGCGCCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTAGTGCCACCATGCGCCTCCTGGCCAAGATCATCTGCCTCATGCTGTGGGCCATCTGCGTGGCTGAGGACTGCAATGAGCTGCCGCCCAGGAGGAACACAGAGATCCTGACAGGGAGCTGGTCTGACCAGACCTACCCTGAGGGCACCCAGGCGATCTACAAGTGCCGGCCGGGCTACAGGAGCCTGGGGAACATCATCATGGTGTGTAGAAAGGGCGAATGGGTGGCCCTCAACCCCCTGAGGAAGTGCCAGAAGCGGCCCTGTGGCCACCCCGGGGACACACCCTTCGGGACCTTCACCCTGACCGGCGGCAATGTGTTTGAGTACGGCGTGAAGGCTGTCTACACATGCAACGAGGGGTACCAGCTGCTGGGCGAGATTAACTACCGGGAGTGTGACACCGATGGGTGGACCAACGACATTCCCATCTGTGAGGTGGTCAAGTGTCTCCCCGTGACAGCCCCAGAAAATGGCAAAATCGTGAGCAGCGCCATGGAGCCTGACCGCGAATATCACTTTGGGCAGGCCGTGAGGTTTGTGTGCAACTCGGGCTACAAAATTGAAGGTGATGAGGAGATGCACTGCAGCGATGATGGCTTCTGGTCCAAGGAGAAGCCCAAATGTGTGGAGATCTCCTGCAAGTCTCCCGACGTGATCAACGGCAGCCCAATCAGCCAGAAGATTATTTACAAAGAGAACGAGCGCTTCCAGTACAAGTGTAACATGGGCTATGAGTATTCAGAGAGGGGAGATGCCGTCTGCACTGAGAGCGGCTGGAGACCACTGCCTAGCTGCGAGGAAAAGAGTTGTGACAACCCTTACATCCCAAATGGCGACTACTCCCCTCTGCGGATCAAACACCGGACCGGGGATGAAATCACCTATCAGTGCCGCAATGGATTCTACCCGGCCACCCGCGGCAACACCGCCAAATGCACCAGCACAGGCTGGATCCCCGCCCCCCGCTGTACGCTGAAGCCTTGCGACTATCCAGACATCAAGCACGGAGGCCTGTACCACGAAAACATGCGGCGGCCTTATTTCCCTGTGGCAGTGGGGAAGTACTACAGCTACTACTGCGACGAGCACTTCGAGACCCCCTCTGGCTCCTACTGGGACCACATCCACTGCACACAGGACGGCTGGTCTCCAGCTGTGCCCTGCCTGAGGAAATGCTACTTCCCCTACCTGGAGAACGGATACAACCAGAACTATGGCCGCAAGTTCGTGCAGGGCAAGAGCATCGATGTGGCCTGCCACCCTGGCTACGCCCTGCCCAAGGCCCAGACAACTGTGACCTGCATGGAGAATGGTTGGAGCCCCACCCCGCGCTGCATCCGGGTGTCCTTCACGCTCCGAAGGAAACGAGGAAGCGGAGAAGCCAGACACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGAAACTGCTGCATGTCTTCCTCCTCTTCCTGTGCTTCCACCTCCGTTTCTGTAAAGTCACCTACACTAGCCAGGAGGATCTGGTGGAGAAGAAATGCCTGGCCAAGAAGTATACCCACCTGAGCTGCGACAAAGTGTTCTGCCAGCCCTGGCAACGCTGCATTGAAGGTACTTGTGTGTGCAAGCTGCCCTACCAGTGCCCCAAGAACGGCACGGCCGTGTGTGCCACCAACAGGAGGAGCTTCCCCACCTACTGCCAGCAGAAGAGCCTGGAATGCCTCCACCCTGGCACCAAGTTTCTGAACAACGGGACCTGCACAGCCGAGGGGAAATTCAGCGTCTCCCTCAAGCACGGCAATACAGACTCCGAGGGCATTGTGGAAGTGAAGCTGGTGGACCAGGACAAGACCATGTTCATCTGCAAAAGCAGCTGGTCCATGCGGGAGGCCAATGTCGCCTGCCTGGACCTGGGCTTCCAGCAGGGCGCTGATACACAGCGCCGCTTTAAACTCAGTGACCTCAGCATCAACAGCACTGAGTGTCTGCACGTGCACTGCCGGGGCCTGGAGACCAGCCTGGCTGAGTGCACCTTCACCAAGCGCAGGACCATGGGCTACCAGGATTTTGCAGATGTGGTCTGCTACACCCAGAAGGCAGACAGCCCCATGGATGACTTCTTCCAGTGTGTCAATGGCAAGTACATTTCCCAGATGAAGGCTTGTGACGGGATCAATGATTGCGGGGATCAGAGCGATGAGCTCTGCTGCAAGGCCTGCCAAGGGAAGGGCTTTCACTGTAAGTCTGGGGTGTGCATCCCTTCTCAGTATCAGTGCAACGGAGAGGTGGACTGCATCACTGGGGAGGACGAGGTGGGCTGTGCTGGCTTCGCCTCTGTGGCCCAGGAGGAGACAGAGATCCTCACAGCTGACATGGATGCAGAGCGGCGGCGCATCAAGAGTCTGCTCCCAAAGCTCTCCTGCGGCGTTAAGAATCGCATGCACATCCGGAGGAAGCGGATCGTTGGAGGCAAACGGGCTCAGCTGGGGGACTTGCCGTGGCAGGTGGCCATCAAAGATGCCTCCGGAATCACCTGTGGTGGCATCTACATCGGCGGCTGCTGGATCCTGACCGCCGCCCACTGCCTTCGGGCCAGCAAGACTCACCGCTACCAGATCTGGACCACCGTGGTGGATTGGATTCACCCCGACCTGAAGAGGATTGTCATTGAGTATGTCGACCGCATCATCTTCCATGAAAACTACAATGCCGGGACGTATCAGAACGACATCGCCCTCATCGAGATGAAGAAGGATGGGAACAAGAAGGACTGTGAGCTGCCTCGCTCCATCCCCGCCTGTGTACCATGGTCTCCGTACCTGTTCCAGCCAAATGACACATGCATCGTGAGCGGCTGGGGCCGCGAGAAAGACAACGAGAGGGTCTTCTCCCTGCAGTGGGGTGAAGTCAAGCTGATCAGCAACTGCTCCAAGTTCTACGGCAACCGCTTCTATGAGAAGGAGATGGAGTGCGCCGGCACCTATGACGGCAGCATTGACGCGTGCAAGGGAGACAGTGGGGGCCCCCTGGTCTGCATGGACGCCAACAATGTGACCTACGTGTGGGGAGTTGTGTCCTGGGGCGAGAACTGTGGCAAGCCTGAGTTCCCGGGCGTGTACACAAAGGTGGCAAACTATTTTGACTGGATCTCCTATCACGTTGGCAGGCCCTTCATTTCACAGTACAACGTATAACTCGAGAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG

(SEQ ID NO: 23)

СТРОЕНИЕ ГЛАЗА

Описанные в данном документе лекарственные средства могут быть доставлены в глаз млекопитающего, предпочтительно в глаз человека, в связи с лечением или профилактикой заболевания глаз, такого как возрастная макулярная дистрофия (ВМД).

Специалист в области лечения заболеваний глаз будет иметь подробное и полное представление о строении глаза. Однако, далее описано следующее строение, имеющие особое отношение к данному изобретению.

Сетчатка

Сетчатка представляет собой многослойную мембрану, которая выстилает внутреннюю заднюю камеру глаза и воспринимает изображение визуального мира, которое передается в мозг через зрительный нерв. По порядку от внутренней части глаза к внешней, сетчатка состоит из слоев нейросенсорной сетчатки и пигментного эпителия сетчатки, при этом сосудистая оболочка находится вне пигментного эпителия сетчатки.

Нейросенсорная часть сетчатки и фоторецепторы

В нейросенсорной сетчатке находятся фоторецепторные клетки, которые непосредственно воспринимают свет. Он состоит из следующих слоев: внутренняя пограничная мембрана (ВПМ); слой нервных волокон; слой ганглиозных клеток; внутренний плексиформный слой; внутренний ядерный слой; внешний плексиформный слой; внешний ядерный слой (ядра фоторецепторов); внешняя пограничная мембрана (ВПМ); и фоторецепторы (внутренний и внешний сегменты палочек и колбочек).

Специалист в данной области техники будет иметь детальное понимание фоторецепторных клеток. Вкратце, фоторецепторные клетки - это специализированные нейроны, расположенные в сетчатке, которые преобразуют свет в биологические сигналы. Фоторецепторные клетки состоят из палочек и колбочек, которые по-разному распределены по сетчатке.

Клетки-палочки распределены в основном по наружным частям сетчатки. Они очень чувствительны и обеспечивают зрение при слабом освещении. В сетчатке нормального человека содержится в среднем около 125 миллионов палочек.

Колбочки сетчатки находятся на сетчатке, но особенно сильно сконцентрированы в ямке, ямке в нейросенсорной сетчатке, которая отвечает за центральное зрение с высоким разрешением. Колбочки сетчатки менее чувствительны, чем палочки сетчатки. В сетчатке нормального человека содержится в среднем около 6-7 миллионов колбочек.

Пигментный эпителий сетчатки

Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) представляет собой пигментированный слой клеток, расположенный непосредственно за пределами нейросенсорной сетчатки. ПЭС выполняет ряд функций, включая транспортировку питательных и других веществ к фоторецепторным клеткам и поглощение рассеянного света для улучшения зрения.

Сосудистая оболочка

Сосудистая оболочка представляет собой сосудистый слой, расположенный между ПЭС и внешней склерой глаза. Сосудистая сеть сосудистой оболочки обеспечивает снабжение сетчатки кислородом и питательными веществами.

ВОЗРАСТНАЯ МАКУЛЯРНАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ (ВМД)

Клиническое прогрессирование возрастной макулярной дегенерации (ВМД) характеризуется поэтапно в соответствии с изменениями желтого пятна. Отличительным признаком ранней ВМД является появление друзов, которые представляют собой скопления внеклеточного продукта распада под сетчаткой и появляются в виде желтых пятен на сетчатке во время клинического обследования и на изображениях глазного дна. Друзы делятся на маленькие (<63 мкм), средние (63-124 мкм) и большие (> 124 мкм). Они также считаются твердыми или мягкими в зависимости от того, как выглядят их края при офтальмологическом исследовании. В то время как твердые друзы имеют четко очерченные края, мягкие друзы имеют менее выраженные жидкие края. Шкала фотографической тяжести глазного дна, используемая при исследовании возрастных заболеваний глаз (AREDS), является одной из основных систем классификации, используемых для этого состояния.

ВМД подразделяется на «сухую» и «влажную» (экссудативную или неоваскулярную) формы. Сухая ВМД более распространена, чем влажная ВМД, но сухая форма может переходить во влажную форму, и обе возникают одновременно в значительном количестве случаев. Сухая ВМД обычно характеризуется прогрессирующим апоптозом клеток слоя ПЭС и вышележащих фоторецепторных клеток, а также часто нижележащих клеток в слое хориоидальных капилляров. Сливающиеся зоны гибели клеток ПЭС, сопровождающейся атрофией вышележащих фоторецепторов, называются географической атрофией (ГА). Пациенты с этой формой ВМД испытывают медленное и прогрессирующее ухудшение центрального зрения.

Описанное в данном документе лечение или профилактика ВМД может уменьшить или предотвратить появление фенотипа ВМД, описанного выше. Предпочтительно лечение ВМД позволяет поддерживать или улучшать зрительную функцию.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или уменьшению образования географической атрофии. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к замедлению прогрессирования географической атрофии. Например, это приводит к уменьшению по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% уменьшение увеличения площади ГА в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к лечению географической атрофии, например, снижению степени географической атрофии.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или уменьшению образования друз. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению количества существующих друз, например, к уменьшению размера и/или количества существующих друз.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к предотвращению или снижению отложения комплемента. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению существующего отложения комплемента.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к улучшению или восстановлению зрения, или остроты зрения. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД уменьшает потерю зрения или остроты зрения.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к улучшению или восстановлению скорости чтения у субъекта. В других вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД уменьшает снижение скорости чтения у субъекта.

В некоторых вариантах реализации, лечение или профилактика ВМД приводит к уменьшению или предотвращению потери фоторецепторов и/или пигментного эпителия сетчатки (ПЭС).

ДИАБЕТИЧЕСКАЯ РЕТИНОПАТИЯ

Диабетическая ретинопатия представляет собой состояние, характеризующееся повреждением кровеносных сосудов сетчатки, которое вызвано высоким уровнем сахара в крови, связанным с диабетом. При отсутствии лечения диабетическая ретинопатия может вызвать слепоту.

Хотя субъекты с легкой степенью диабетической ретинопатии могут иметь хорошее зрение, некоторые типы диабетической ретинопатии, а именно диабетический макулярный отек (DMO) и пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR), могут угрожать зрению субъекта.

Диабетический макулярный отек характеризуется вытеканием жидкости из поврежденных кровеносных сосудов в задней части глаза. Вытекающая жидкость накапливается в желтом пятне, что приводит к отеку и нечеткости зрения. В конечном итоге это может привести к ухудшению центрального зрения и неспособности читать или управлять автомобилем. Боковое зрение обычно остается нормальным.

Пролиферативная диабетическая ретинопатия характеризуется закрытием кровеносных сосудов сетчатки, что приводит к росту ненормальных, хрупких кровеносных сосудов на поверхности сетчатки. Это может привести к необратимой потере зрения из-за кровотечения в глазу, рубцевания и отслоения сетчатки. Непролиферативная ретинопатия представляет собой раннюю стадию диабетической ретинопатии, которая при отсутствии лечения может привести к пролиферативной ретинопатии. Поэтому предполагается лечение всех стадий и типов диабетической ретинопатии.

ВЕКТОРЫ

Вектор представляет собой инструмент, который позволяет или облегчает перенос объекта из одной среды в другую.

Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы

В одном аспекте в данном изобретении предлагается вектор AAV, содержащий полинуклеотид по данному изобретению.

Предпочтительно вектор AAV находится в форме частицы вектора AAV.

Способы получения и модификации вирусных векторов и вирусных векторных частиц, таких как полученные из AAV, хорошо известны в данной области техники.

Вектор AAV может содержать геном AAV или его фрагмент, или производное.

Известно, что AAV способен упаковывать геномы размером до 5,2 т.п.н. (Dong, J.-Y. et al. (1996) Human Gene Therapy 7: 2101-2112).

Геном AAV представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая может кодировать функции, необходимые для продукции частицы AAV. Эти функции включают те, которые действуют в цикле репликации и упаковки AAV в клетке-хозяине, включая инкапсидацию генома AAV в частицу AAV. Встречающиеся в природе AAV дефицитны по репликации и полагаются на обеспечение вспомогательных функций в транс для завершения цикла репликации и упаковки. Соответственно, геном AAV вектора AAV по данному изобретению обычно является репликационно-дефицитным.

Геном AAV может быть в одноцепочечной форме, с положительным или отрицательным смыслом, или, альтернативно, в двухцепочечной форме. Использование двухцепочечной формы позволяет обойти стадию репликации ДНК в клетке-мишени и, таким образом, может ускорить экспрессию трансгена.

Геном AAV может происходить из любого природного серотипа, изолята или клады AAV. Таким образом, геном AAV может быть полным геномом встречающегося в природе AAV. Как известно специалисту в данной области техники, AAV, встречающиеся в природе, можно классифицировать в соответствии с различными биологическими системами.

Обычно AAV упоминаются в соответствии с их серотипом. Серотип соответствует вариантному подвиду AAV, который благодаря своему профилю экспрессии поверхностных антигенов капсида имеет отличительную реактивность, которая может использоваться для отличия его от других вариантных подвидов. Обычно вирус, имеющий конкретный серотип AAV, не может эффективно перекрестно реагировать с нейтрализующими антителами, специфичными для любого другого серотипа AAV.

Серотипы AAV включают AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11, а также рекомбинантные серотипы, такие как Rec2 и Rec3, недавно идентифицированные из мозга приматов. В данном изобретении может использоваться любой из этих серотипов AAV.

В некоторых вариантах реализации, векторная частица AAV представляет собой векторную частицу AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 или Rec3 AAV.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV2 или AAV8.

В некоторых вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV2. В других вариантах реализации, AAV может быть серотипом AAV8.

Капсидный белок может быть мутантным капсидным белком, таким как описанный в WO 2008/124724, который включен в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации, вектор AAV содержит капсид AAV8 с мутацией Y733F.

Обзоры серотипов AAV можно найти в Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 and Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27. Последовательности геномов AAV или элементов геномов AAV, включая последовательности ITR, гены rep или cap для применения в изобретении, могут быть получены из следующих номеров доступа для последовательностей полных геномов AAV: аденоассоциированный вирус 1 NC_002077, AF063497; аденоассоциированный вирус 2 NC_001401; аденоассоциированный вирус 3 NC_001729; аденоассоциированный вирус 3B NC_001863; аденоассоциированный вирус 4 NC_001829; аденоассоциированный вирус 5 Y18065, AF085716; аденоассоциированный вирус 6 NC_001862; AAV птиц ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; штамм AAV птиц DA-1 NC_006263, AY629583; AAV крупного рогатого скота NC_005889, AY388617.

AAV также может относиться к филогенетической группе или клонам. Это относится к филогенетическим отношениям AAV естественного происхождения и, как правило, к филогенетической группе AAV, которая может быть прослежена до общего предка и включает всех его потомков. Кроме того, AAV может относиться к конкретному изоляту, то есть генетическому изоляту определенного AAV, встречающегося в природе. Термин «генетический изолят» описывает популяцию AAV, которая подверглась ограниченному генетическому смешению с другими встречающимися в природе AAV, тем самым определяя узнаваемую, на генетическом уровне, особую популяцию.

Специалист в области техники может выбрать подходящий серотип, филогенетическую группу, клон или изолят AAV для применения в изобретении на основе своих общих знаний. Например, было показано, что капсид AAV5 эффективно трансдуцирует фоторецепторы колбочек приматов, о чем свидетельствует успешная коррекция унаследованного дефекта цветового зрения (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).

Серотип AAV определяет тканевую специфичность инфекции (или тропизм) AAV. Соответственно, предпочтительными серотипами AAV для применения в AAV, вводимых пациентам в соответствии с изобретением, являются те, которые обладают естественным тропизмом или высокой эффективностью инфицирования клеток-мишеней в глазу. В некоторых вариантах реализации серотипы AAV для применения в изобретении представляют собой серотипы, которые трансдуцируют клетки нейросенсорной сетчатки, пигментного эпителия сетчатки и/или сосудистой оболочки.

Обычно геном AAV естественного серотипа, изолята или филогенетической группы AAV содержит по меньшей мере одну инвертированную концевую повторяющуюся последовательность (ITR). Последовательность ITR действует в цис-системе, обеспечивая функциональную точку начала репликации и позволяя интегрировать и вырезать вектор из генома клетки. В предпочтительных вариантах реализации одна или более последовательностей ITR фланкируют нуклеотидные последовательности, кодирующие фактор комплемента I и/или фактор комплемента H или FHL1. Геном AAV обычно также включает гены упаковки, такие как гены rep и/или cap, которые кодируют функции упаковки для частицы AAV. Ген rep кодирует один или более белков Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40 или их варианты. Ген cap кодирует один или более капсидных белков, таких как VP1, VP2 и VP3 или их варианты. Эти белки составляют капсид частицы AAV. Варианты капсида обсуждаются ниже.

Промотор будет функционально связан с каждым из генов упаковки. Конкретные примеры таких промоторов включают промоторы p5, p19 и p40 (Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). Например, промоторы p5 и p19 обычно используются для экспрессии гена rep, тогда как промотор p40 обычно используется для экспрессии гена cap.

Как обсуждалось выше, геном AAV, используемый в векторе AAV по изобретению, может поэтому быть полным геномом встречающегося в природе AAV. Например, вектор, содержащий полный геном AAV, можно использовать для получения вектора AAV или векторной частицы in vitro. Однако, хотя в принципе такой вектор можно вводить пациентам, на практике это будет происходить редко. Предпочтительно геном AAV будет дериватизирован для введения пациентам. Такая дериватизация является стандартной в данной области техники, и изобретение охватывает использование любых известных производных генома AAV и производных, которые могут быть получены с применением методов, известных в данной области техники. Дериватизация генома AAV и капсида AAV рассмотрены в Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, и в Choi et al. and Wu et al., упомянутых выше.

Производные генома AAV включают любые усеченные или модифицированные формы генома AAV, которые позволяют экспрессию трансгена из вектора AAV по изобретению in vivo. Как правило, можно значительно усечь геном AAV, чтобы включить минимальную вирусную последовательность, но при этом сохранить указанную выше функцию. Это предпочтительно по соображениям безопасности для снижения риска рекомбинации вектора с вирусом дикого типа, а также для предотвращения запуска клеточного иммунного ответа из-за присутствия белков вирусных генов в клетке-мишени.

Обычно производное будет включать по меньшей мере одну инвертированную концевую повторяющуюся последовательность (ITR), предпочтительно более одной ITR, например две ITR или более. Одна или более ITR могут происходить из геномов AAV, имеющих разные серотипы, или могут быть химерными или мутантными ITR. Предпочтительный мутант ITR имеет делецию trs (сайт концевого разрешения). Эта делеция позволяет продолжить репликацию генома для создания одноцепочечного генома, который содержит как кодирующие, так и комплементарные последовательности, то есть самокомплементарный геном AAV. Это позволяет обойти репликацию ДНК в клетке-мишени и, таким образом, обеспечивает ускоренную экспрессию трансгена.

Одна или более ITR предпочтительно будут фланкировать нуклеотидную последовательность, кодирующую фактор комплемента I и/или кофактор CFI (например, фактор комплемента H или FHL1) с любого конца. Включение одной или более ITR предпочтительно для содействия образованию конкатамера вектора по изобретению в ядре клетки-хозяина, например, после преобразования одноцепочечной векторной ДНК в двухцепочечную ДНК под действием ДНК-полимераз клетки-хозяина. Образование таких эписомальных конкатамеров защищает векторную конструкцию в течение жизни клетки-хозяина, тем самым обеспечивая пролонгированную экспрессию трансгена in vivo.

В предпочтительных вариантах реализации элементы ITR будут единственными последовательностями, сохраненными из нативного генома AAV в производном. Таким образом, производное предпочтительно не будет включать гены rep и/или cap нативного генома и любые другие последовательности нативного генома. Это предпочтительно по причинам, описанным выше, а также для уменьшения возможности интеграции вектора в геном клетки-хозяина. Кроме того, уменьшение размера генома AAV обеспечивает повышенную гибкость при включении других элементов последовательности (таких как регуляторные элементы) в вектор в дополнение к трансгену.

Следовательно, в производном по изобретению могут быть удалены следующие части: одна инвертированная концевая повторяющаяся последовательность (ITR), гены репликации (rep) и капсида (cap). Однако в некоторых вариантах реализации производные могут дополнительно включать один или более генов rep и/или cap или другие вирусные последовательности генома AAV. Встречающийся в природе AAV с высокой частотой интегрируется в конкретный участок хромосомы 19 человека и демонстрирует незначительную частоту случайной интеграции, так что сохранение интегративной способности вектора может быть допущено в терапевтических условиях.

Когда производное включает капсидные белки, то есть VP1, VP2 и/или VP3, производное может быть химерным, перетасованным или модифицированным капсидом производным одного или более встречающихся в природе AAV. В частности, изобретение включает предоставление последовательностей капсидных белков из разных серотипов, филогенетических групп, клонов или изолятов AAV в одном и том же векторе (т.е. псевдотипическом векторе).

Производные с химерным, перетасованным или модифицированным капсидом обычно выбирают для обеспечения одной или более желаемых функциональностей для вектора AAV. Таким образом, эти производные могут демонстрировать повышенную эффективность доставки генов, пониженную иммуногенность (гуморальную или клеточную), измененный диапазон тропизма и/или улучшенное нацеливание на конкретный тип клеток по сравнению с вектором AAV, содержащим природный геном AAV, такой как геном AAV2. Повышенная эффективность доставки гена может быть достигнута за счет улучшенного связывания с рецептором или корецептором на поверхности клетки, улучшенной интернализации, улучшенного переноса внутрь клетки и в ядро, улучшенного распаковывания вирусной частицы и улучшенного преобразования одноцепочечного генома в двухцепочечную форму. Повышенная эффективность может также относиться к измененному диапазону тропизма или нацеливанию на конкретную популяцию клеток, так что доза вектора не разбавляется путем введения в ткани, где она не требуется.

Химерные капсидные белки включают те, которые образуются путем рекомбинации между двумя или более последовательностями, кодирующими капсид природных серотипов AAV. Это может быть выполнено, например, с помощью подхода спасения маркера, в котором неинфекционные последовательности капсида одного серотипа котрансфицируют с последовательностями капсида другого серотипа, и направленный отбор используется для отбора последовательностей капсида, обладающих желаемыми свойствами. Последовательности капсида различных серотипов могут быть изменены путем гомологичной рекомбинации внутри клетки для получения новых химерных капсидных белков.

Химерные капсидные белки также включают те, которые генерируются путем конструирования последовательностей капсидных белков для переноса доменов конкретных капсидных белков, поверхностных петель или определенных аминокислотных остатков между двумя или более капсидными белками, например, между двумя или более капсидными белками разных серотипов.

Перетасованные или химерные капсидные белки также могут быть получены перетасовкой ДНК или подверженной ошибкам ПЦР. Гибридные капсидные гены AAV могут быть созданы путем случайного фрагментирования последовательностей родственных генов AAV, например, генов, кодирующих капсидные белки нескольких различных серотипов, а затем последующей повторной сборки фрагментов в реакции самопримирования полимеразы, которая также может вызывать перекрестные переходы в областях гомологии последовательностей. Библиотека гибридных генов AAV, созданная таким образом, путем перетасовки генов капсида нескольких серотипов, может быть подвергнута скринингу для выявления вирусных клонов, обладающих желаемой функциональностью. Аналогичным образом, подверженная ошибкам ПЦР может использоваться для случайной мутации генов капсида AAV для создания разнообразной библиотеки вариантов, которые затем могут быть отобраны по желаемому свойству.

Последовательности генов капсида также могут быть генетически модифицированы для введения специфических делеций, замен или вставок по отношению к нативной последовательности дикого типа. В частности, гены капсида можно модифицировать путем вставки последовательности неродственного белка или пептида в открытую рамку считывания кодирующей последовательности капсида или на N- и/или C-конце кодирующей последовательности капсида.

Неродственный белок или пептид может преимущественно быть таким, который действует как лиганд для определенного типа клеток, тем самым обеспечивая улучшенное связывание с клеткой-мишенью или повышая специфичность нацеливания вектора на конкретную популяцию клеток. Примером может быть использование пептида RGD для блокирования поглощения пигментным эпителием сетчатки и, таким образом, усиления трансдукции окружающих тканей сетчатки (Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). Неродственный белок также может быть белком, который способствует очистке вирусной частицы как части производственного процесса, то есть эпитопом или аффинной меткой. Место вставки обычно выбирают так, чтобы не мешать другим функциям вирусной частицы, например интернализации, транспортировке вирусной частицы. Специалист в данной области техники может определить подходящие сайты для вставки на основе его общих знаний. Конкретные сайты раскрыты в Choi et al., упомянутой выше.

Изобретение дополнительно включает обеспечение последовательностей генома AAV в порядке и конфигурации, отличных от порядка и конфигурации нативного генома AAV. Изобретение также включает замену одной или более последовательностей или генов AAV последовательностями из другого вируса или химерными генами, состоящими из последовательностей более чем одного вируса. Такие химерные гены могут состоять из последовательностей двух или более родственных вирусных белков разных видов вирусов.

Вектор AAV по изобретению может иметь форму нуклеотидной последовательности, содержащей геном AAV или его производное, и последовательность, кодирующую фактор комплемента I и/или трансген фактора комплемента H, или FHL1, или их производные.

Частицы AAV по изобретению включают транскапсидированные формы, в которых геном или производное AAV, имеющее ITR одного серотипа, упаковано в капсид другого серотипа. Частицы AAV по изобретению также включают мозаичные формы, в которых смесь немодифицированных белков капсида двух или более различных серотипов составляет вирусный капсид. Частица AAV также включает химически модифицированные формы, несущие лиганды, адсорбированные на поверхности капсида. Например, такие лиганды могут включать антитела для нацеливания на конкретный рецептор клеточной поверхности.

Таким образом, например, частицы AAV по изобретению включают частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV2 (AAV2/2), частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV5 (AAV2/5) и частицы с геномом AAV2 и капсидными белками AAV8 (AAV2/8), а также с геномом AAV2 и капсидными белками более чем одного серотипа.

Вектор AAV может содержать несколько копий (например, 2, 3 и т.д.) нуклеотидной последовательности, упомянутой в данном документе.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит одну или более ITR AAV. В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид дополнительно содержит две ITR AAV. В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит ITR AAV на 5'-конце и ITR AAV на 3'-конце. В некоторых вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8. В предпочтительных вариантах реализации, ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид содержит ITR 5'AAV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 18, или нуклеотидной последовательностью, идентичную ей по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

CGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT

SEQ ID NO: 18

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 20, или нуклеотидную последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% или 99%, непосредственно примыкаюгую к 3'-концу 5'-ITR.

TGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGTACC

SEQ ID NO: 20

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит ITR 3'AAV с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 19, или нуклеотидную последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% или 99%.

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAA AGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCG

SEQ ID NO: 19

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21, или нуклеотидную последовательность, идентичную ей по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% или 99%, непосредственно примыкаюгую к 5'-концу 3'-ITR.

CTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTA ATCATTAACTACA

SEQ ID NO: 21

Промоторы и регуляторные последовательности

Полинуклеотид или вектор по изобретению может также включать элементы, обеспечивающие экспрессию фактора комплемента I и кофактора CFI, такие как трансгены фактора комплемента H и/или FHL1 in vitro или in vivo. Их можно назвать последовательностями контроля экспрессии. Таким образом, полинуклеотид или вектор обычно содержат последовательности контроля экспрессии (например, содержащие последовательность промотора), функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансген.

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие: (а) промотор CMV, необязательно, причем промотор CMV расположен выше от нуклеотидных последовательностей, кодирующих фактор комплемента I и/или кофактор фактора комплемента I (CFI), например, фактор комплемента H и/или FHL1; (b) регуляторный элемент WPRE, необязательно, причем регуляторный элемент WPRE находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих фактор комплемента I и/или кофактор фактора комплемента I (CFI), например, фактор комплемента H и/или FHL1; и/или (c) сигнал поли-А, такой как сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота, необязательно, причем сигнал поли-А находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих фактор комплемента I и/или кофактор фактора комплемента I (CFI), такой как фактор комплемента H и/или FHL1.

В предпочтительных вариантах реализации, полинуклеотид или вектор содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, необязательно, при этом линкер содержит или определен сайтом расщепления фурином, GSG, 11a1D и последовательностью F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) регулирующий элемент WPRE, предпочтительно, при этом регулирующий элемент WPRE является регулирующим элементом WPRE3;

(g) сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(h) 3' AAV ITR.

Может быть использован любой подходящий промотор, выбор которого может быть легко сделан специалистом в данной области техники. Последовательность промотора может быть конститутивно активной (то есть работать на любом фоне клетки-хозяина) или, альтернативно, может быть активной только в конкретной среде клетки-хозяина, что позволяет осуществлять целевую экспрессию трансгена в конкретном типе клеток (например, тканеспецифический промотор). Промотор может проявлять индуцируемую экспрессию в ответ на присутствие другого фактора, например фактора, присутствующего в клетке-хозяине. В любом случае, когда вектор вводят для терапии, предпочтительно, чтобы промотор был функциональным на фоне клетки-мишени.

В некоторых вариантах реализации предпочтительно, чтобы промотор проявлял специфическую для клеток сетчатки экспрессию, чтобы трансген мог экспрессироваться только в популяциях клеток сетчатки. Таким образом, экспрессия промотора может быть специфичной для клеток сетчатки, например, ограничиваться только клетками нейросенсорной сетчатки и пигментным эпителием сетчатки.

Предпочтительные промоторы, которые не являются специфичными для клеток сетчатки, включают промотор куриного бета-актина (CBA), необязательно в комбинации с элементом энхансера цитомегаловируса (CMV). Примером промотора для применения в изобретении является промотор CAG, например промотор, используемый в кассете экспрессии rAVE (GeneDetect.com).

В предпочтительных вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор CMV.

Примером последовательности промотора CMV явяляется:

GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAG AAGACACCG

(SEQ ID NO: 13)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 13. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность промотора, представленного SEQ ID NO: 13.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13.

Еще одним примером промоторной последовательности является:

ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT

(SEQ ID NO: 5)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 5. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность промотора, представленного SEQ ID NO: 5.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит промотор с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5.

Примеры промоторов на основе человеческих последовательностей, которые могут индуцировать экспрессию генов, специфичных для сетчатки, включают родопсинкиназу для палочек и колбочек (Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), PR2.1 только для колбочек (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) и/или RPE65 (Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) или VMD2 (Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73) для пигментного эпителия сетчатки.

Полинуклеотид или вектор по изобретению может также содержать одну или более дополнительных регуляторных последовательностей, которые могут действовать пре- или посттранскрипционно. Регуляторная последовательность может быть частью локуса природного трансгена или может быть гетерологичной регуляторной последовательностью. Полинуклеотид или вектор по изобретению может содержать части 5'-UTR или 3'-UTR из нативного транскрипта трансгена.

Регуляторные последовательности представляют собой любые последовательности, которые облегчают экспрессию трансгена, т.е. действуют, увеличивая экспрессию транскрипта, улучшая ядерный экспорт мРНК или повышая ее стабильность. Такие регуляторные последовательности включают, например, энхансерные элементы, посттранскрипционные регуляторные элементы и сайты полиаденилирования.

Предпочтительным сайтом полиаденилирования является сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-А).

Примером сигнала гормона роста крупного рогатого скота поли-А (bGH поли-А) является:

GTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG

(SEQ ID NO: 14)

Еще одним примером сигнала поли-А гормона роста крупного рогатого скота (bGH поли-А) является:

TCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGG

(SEQ ID NO: 6)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 14 или 6, предпочтительно SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность сигнала полиаденилирования, представленного SEQ ID NO: 14 или 6.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит сигнал полиаденилирования с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 14 или 6, предпочтительно SEQ ID NO: 14.

В контексте полинуклеотида или вектора по изобретению такие регуляторные последовательности будут цис-действующими. Однако изобретение также включает использование транс-действующих регуляторных последовательностей, расположенных на дополнительных генетических конструкциях.

Предпочтительным посттранскрипционным регуляторным элементом для применения в векторе AAV по данному изобретению является посттранскрипционный регуляторный элемент гепатита сурка (WPRE) или его вариант.

Примером WPRE является:

ATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGG CCGCCTCCCCGC

(SEQ ID NO: 7)

WPRE представляет собой трехчастичный элемент, содержащий элементы гаммы, альфа и бета в указанном порядке. Также в изобретении можно использовать укороченную версию WPRE, которая содержит только минимальные гамма и альфа элементы (упоминается как WPRE3; Choi, J.-H. et al. (2014) Molecular Brain 7: 17).

Примером последовательности WPRE3 является:

AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGT

(SEQ ID NO: 15)

В некоторых вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит посттранскрипционный регуляторный элемент с нуклеотидной последовательностью, которая идентична по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% SEQ ID NO: 15 или 7, предпочтительно SEQ ID NO: 15. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность по существу сохраняла функциональную активность посттранскрипционного регуляторного элемента, представленного SEQ ID NO: 15 или 7.

В других вариантах реализации полинуклеотид или вектор содержит посттранскрипционный регуляторный элемент с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15 или 7, предпочтительно SEQ ID NO: 15.

Другой регуляторной последовательностью, которую можно использовать в полинуклеотиде или векторе по изобретению, является последовательность ДНК, обладающая способностью связывания с ядерным матриксом (SAR). Дополнительные регуляторные последовательности могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники.

СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ

Продукты, полинуклеотид или вектор по изобретению можно вводить системно (например, вливанием в периферическую вену) и можно вводить местно или регионально (например, в систему ЦНС путем интратекальной инъекции). В предпочтительных вариантах реализации продукт, полинуклеотид или вектор вводят внутриглазно.

Термин «внутриглазный» относится к внутренней части глаза, таким образом, внутриглазное введение относится к введению внутрь глаза субъекта.

В некоторых вариантах реализации продукт, полинуклеотид или вектор вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции. В некоторых вариантах реализации указанное введение осуществляется роботом.

Объем вводимой лекарственной композиции может, например, составлять около 10-500 мкл, например, около 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 или 50-150 мкл. Объем может, например, составлять около 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл. Предпочтительно объем вводимой лекарственной композиции составляет 100 мкл.

Специалист в данной области техники будет знаком с индивидуальными субретинальными, прямыми ретинальными, супрахориоидальными или интравитреальными инъекциями и сможет выполнять их.

Предпочтительно, продукт, полинуклеотид или вектор вводят с помощью субретинальной инъекции. В некоторых вариантах реализации, продукт, полинуклеотид, вектор или фармацевтическую композицию, содержащую их, вводят не более одного раза или не более двух раз в течение жизни субъекта.

Субретинальная инъекция

Субретинальные инъекции представляют собой инъекции в субретинальное пространство, то есть под нейросенсорную сетчатку. Во время субретинальной инъекции вводимый материал направляется внутрь фоторецепторных клеток и слоев пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и создает пространство между ними.

Когда инъекция проводится через небольшую ретинотомию, может возникнуть отслоение сетчатки. Отслоившийся приподнятый слой сетчатки, образованный введенным материалом, называется «пузырь».

Отверстие, создаваемое субретинальной инъекцией, должно быть достаточно маленьким, чтобы введенный раствор не возвращался обратно в полость стекловидного тела после введения. Такой рефлюкс будет особенно проблематичным при инъекции лекарства, потому что действие лекарства будет направлено в сторону от целевой зоны. Предпочтительно, инъекция создает самоуплотняющуюся точку входа в нейросенсорную сетчатку, т.е. после того, как инъекционная игла удалена, отверстие, созданное иглой, закрывается так, что через отверстие выходит очень мало или практически не выходит впрыснутый материал.

Для облегчения этого процесса коммерчески доступны специальные иглы для субретинальных инъекций (например, тефлоновые иглы для субретинальных инъекций DORC 41G, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, Нидерланды). Это иглы, предназначенные для проведения субретинальных инъекций.

Если во время инъекции не происходит повреждения сетчатки и до тех пор, пока используется достаточно маленькая игла, практически весь введенный материал остается локализованным между отслоившейся нейросенсорной сетчаткой и ПЭС в месте локализованного отслоения сетчатки (т.е. не происходит рефлюкса в полость стекловидного тела). Действительно, типичное сохранение пузыря в течение короткого периода времени указывает на то, что обычно происходит небольшой выход введенного материала в стекловидное тело. Пузырь может рассеиваться в течение более длительного периода времени, поскольку впрыскиваемый материал впитывается.

Визуализация глаза, в частности сетчатки, например, с помощью оптической когерентной томографии, может быть проведена до операции.

Двухстадийная субретинальная инъекция

Продукт, полинуклеотид или вектор по изобретению можно доставлять с повышенной точностью и безопасностью с помощью двухстадийного метода, в котором локализованная отслойка сетчатки создается субретинальной инъекцией первого раствора. Первый раствор не содержит продукта, полинуклеотида или вектора. Затем используют вторую субретинальную инъекцию для доставки лекарственного средства, содержащего продукт, полинуклеотид или вектор, в субретинальную жидкость пузыря, созданную первой субретинальной инъекцией. Поскольку инъекция, доставляющая лекарственное средство, не используется для отслоения сетчатки, на этой второй стадии может быть введен определенный объем раствора.

В некоторых вариантах реализации субретинальная инъекция вектора включает стадии:

(a) введение субъекту раствора путем субретинальной инъекции в количестве, эффективном для по меньшей мере частичного отслоения сетчатки с образованием субретинального пузыря, причем раствор не содержит продукта, полинуклеотида или вектора; и

(b) введение лекарственной композиции путем субретинальной инъекции в пузырь, образованный на стадии (а), причем лекарственное средство включает продукт, полинуклеотид или вектор.

Объем раствора, вводимого на стадии (а) для по меньшей мере частичного отделения сетчатки, может составлять, например, около 10-1000 мкл, например, около 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10-500, 50-500, 100-500, 250-500 мкл. Объем может составлять, например, около 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мкл.

Объем лекарственной композиции, вводимой на стадии (b), может составлять, например, около 10-500 мкл, например, около 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 или 50-150 мкл. Объем может составлять, например, около 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкл. Предпочтительно объем лекарственной композиции, вводимой на стадии (b), составляет 100 мкл. Большие объемы могут увеличить риск растяжения сетчатки, в то время как меньшие объемы трудно увидеть.

Раствор, который не содержит лекарственное средство (т.е. «раствор» стадии (а)), может быть составлен аналогично раствору, который действительно содержит лекарственное средство, как описано ниже. Предпочтительный раствор, который не содержит лекарственное средство, представляет собой сбалансированный физиологический раствор (BSS) или аналогичный буферный раствор, соответствующий pH и осмоляльности субретинального пространства.

Визуализация сетчатки во время операции

При определенных обстоятельствах, например, во время конечной стадии дегенерации сетчатки, идентифицировать сетчатку сложно, потому что она тонкая, прозрачная и ее трудно увидеть на фоне разрушенного и сильно пигментированного эпителия, на котором она находится. Использование синего витального красителя (например, Brilliant Peel®, Geuder; MembraneBlue-Dual^®, Dore) может облегчить идентификацию отверстия в сетчатке, сделанного для процедуры отслоения сетчатки (т.е. стадия (а) в методе двухстадийной субретинальной инъекции изобретения), так что лекарственное средство можно вводить через то же отверстие без риска обратного рефлюкса в полость стекловидного тела.

Использование синего витального красителя также позволяет идентифицировать любые области сетчатки, где есть утолщенная внутренняя ограничивающая мембрана или эпиретинальная мембрана, поскольку инъекция через любую из этих структур затрудняет чистый доступ в субретинальное пространство. Кроме того, сокращение любой из этих структур в ближайшем послеоперационном периоде может привести к растяжению входного отверстия сетчатки, что может привести к оттоку лекарственного средства в полость стекловидного тела.

Супрахориоидальная инъекция

Продукт, полинуклеотид или вектор по изобретению можно доставлять в супрахориоидальное пространство с использованием подхода ab externo, в котором используется микрокатетер (см., например, Peden et al. (2011) PLoS One 6 (2): e17140). В этом методе выполняется лимбальная перитомия конъюнктивы для обнажения оголенной склеры, с последующей склеротомией для обнажения оголенной сосудистой оболочки. Микрокатетер (например, iTrack 250A от iScience Interventional, опционально подключаемый к системе освещения, такой как система микроосвещения на основе лазерных диодов iLumin (iScience Interventional)) вводится в супрахориоидальное пространство и продвигается в направлении назад к диску зрительного нерва. После перемещения кончика микрокатетера в желаемое положение инъекция продукта, полинуклеотида или вектора формирует пузырек внутри сетчатки и сосудистой оболочки.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации продукт, полинуклеотид или вектор доставляется супрахориоидально способом, включающим (i) введение микрокатетера в супрахориоидальное пространство; (ii) продвижение микрокатетера в указанном пространстве до тех пор, пока кончик не окажется вблизи пораженной области сетчатки; и (iii) инъекцию продукта, полинуклеотида или вектора из наконечника микрокатетера для создания пузыря.

В некоторых вариантах реализации указанные выше процедуры введения выполняются непосредственно роботом.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ИНЪЕКЦИОННЫЕ РАСТВОРЫ

Лекарственные средства, например продукты, полинуклеотиды или векторы по изобретению, могут быть включены в фармацевтические композиции. Эти композиции могут содержать, помимо лекарственного средства, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, вспомогательное вещество, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала может быть определена специалистом в соответствии со способом введения, например, посредством субретинальной, прямая ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

Фармацевтическая композиция обычно находится в жидкой форме. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, нефть, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, хлорид магния, декстроза или другой раствор сахаридов или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. В некоторых случаях может использоваться поверхностно-активное вещество, такое как плюроновая кислота (PF68) 0,001%.

Для инъекции в очаг поражения активный ингредиент может быть в форме водного раствора, который не содержит пирогенов и имеет подходящий pH, изотоничность и стабильность. Квалифицированный специалист может приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические носители, такие как инъекция хлорида натрия, инъекция Рингера или инъекция лактата Рингера. При необходимости могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки.

Для замедленного высвобождения лекарственное средство может быть включено в фармацевтическую композицию, которая составлена для медленного высвобождения, например, в микрокапсулах, образованных из биосовместимых полимеров, или в липосомальных системах-носителях в соответствии со способами, известными в данной области техники.

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ

Следует принимать во внимание, что все ссылки в данном документе на лечение включают лечебное, паллиативное и профилактическое лечение; хотя в контексте изобретения ссылки на профилактику чаще связаны с профилактическим лечением. Лечение также может включать остановку прогрессирования заболевания.

Предпочтительно лечение млекопитающих, особенно людей. Однако в объем изобретения входят как лечение человека, так и ветеринарное лечение.

Термин «комбинация» или термины «в комбинации», «используемый в комбинации с» или «комбинированный препарат», используемые в данном документе, могут относиться к комбинированному введению двух или более агентов одновременно, последовательно или раздельно.

Используемый в данном документе термин «одновременно» означает, что агенты вводятся одновременно, то есть в одно и то же время.

Используемый в данном документе термин «последовательный» означает, что агенты вводятся один за другим.

Термин «раздельный», используемый в данном документе, означает, что агенты вводятся независимо друг от друга, но в пределах временного интервала, который позволяет агентам проявлять комбинированный, предпочтительно синергический, эффект. Таким образом, введение «раздельно» может позволить ввести один агент, например, в течение 1 минуты, 5 минут или 10 минут после другого.

ВАРИАНТЫ, ПРОИЗВОДНЫЕ, АНАЛОГИ, ГОМОЛОГИ И ФРАГМЕНТЫ

Помимо конкретных белков и нуклеотидов, упомянутых в данном документе, изобретение также включает применение их вариантов, производных, аналогов, гомологов и фрагментов.

В контексте изобретения вариант любой данной последовательности представляет собой последовательность, в которой конкретная последовательность остатков (будь то остатки аминокислот или нуклеиновых кислот) была модифицирована таким образом, что рассматриваемый полипептид или полинуклеотид по существу сохраняет свою функцию. Вариант последовательности может быть получен путем добавления, делеции, замены, модификации, замены и/или изменения по меньшей мере одного остатка, присутствующего в природном белке.

Термин «производное», используемый в данном документе в отношении белков или полипептидов по изобретению, включает любую замену, изменение, модификацию, замену, делецию и/или добавление одного (или более) аминокислотных остатков из или в последовательность, обеспечивая, что полученный белок или полипептид по существу сохраняет по меньшей мере одну из своих эндогенных функций.

Термин «аналог», используемый в данном документе по отношению к полипептидам или полинуклеотидам, включает любой миметик, то есть химическое соединение, которое обладает по меньшей мере одной из эндогенных функций полипептидов или полинуклеотидов, которые оно имитирует.

Обычно могут быть произведены аминокислотные замены, например, от 1, 2 или 3 до 10 или 20 замен при условии, что модифицированная последовательность по существу сохраняет требуемую активность или способность. Аминокислотные замены могут включать использование не встречающихся в природе аналогов.

Белки, используемые в изобретении, также могут иметь делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые вызывают молчащие изменения и приводят к функционально эквивалентному белку. Преднамеренные замены аминокислот могут быть сделаны на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков, до тех пора, пока сохраняется эндогенная функция. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, имеющими аналогичные значения гидрофильности, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.

Консервативные замены могут быть выполнены, например, в соответствии с приведенной ниже таблицей. Аминокислоты в одном блоке во втором столбце и предпочтительно в одной строке в третьем столбце могут быть заменены друг на друга:

АЛИФАТИЧЕСКИЕ Неполярные GAP I L V Полярные - незаряженные C S T M N Q Полярные - заряженные D E K R H АРОМАТИЧЕСКИЕ F W Y

Используемый в данном документе термин «гомолог» означает объект, имеющий определенную гомологию с аминокислотной последовательностью дикого типа и нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин «гомология» может быть приравнен к «идентичности».

Гомологичная последовательность может включать аминокислотную последовательность, которая может быть идентична по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% или 97% или на 99% рассматриваемой последовательности. Обычно гомологи содержат те же активные центры и т.д., что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства (т.е. аминокислотных остатков, имеющих сходные химические свойства/функции), в контексте изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательностей.

Гомологичная последовательность может включать нуклеотидную последовательность, которая может быть идентична по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% или 97% или на 99% рассматриваемой последовательности. Хотя гомологию также можно рассматривать с точки зрения сходства, в контексте изобретения предпочтительно выражать гомологию с точки зрения идентичности последовательностей.

Предпочтительно, ссылка на последовательность, которая имеет процент идентичности с любой из SEQ ID NO, подробно описанных в данном документе, относится к последовательности, которая имеет заявленную процентную идентичность по всей длине указанной SEQ ID NO.

Сравнение гомологии можно проводить на глаз или, чаще, с помощью легко доступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитывать процентную гомологию или идентичность между двумя или более последовательностями.

Процент гомологии может быть вычислен по смежным последовательностям, т.е. одна последовательность выравнивается с другой последовательностью, и каждая аминокислота в одной последовательности напрямую сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за раз. Это называется выравниванием «без пропусков». Обычно такое выравнивание без пропусков выполняется только для относительно небольшого числа остатков.

Хотя это очень простой и последовательный метод, он не принимает во внимание, что, например, в идентичной в остальном паре последовательностей одна вставка или делеция в нуклеотидной последовательности может привести к нарушению выравнивания следующих кодонов, таким образом потенциально может привести к значительному снижению процента гомологии при выполнении глобального выравнивания. Следовательно, большинство методов сравнения последовательностей разработаны для получения оптимальных выравниваний, которые учитывают возможные вставки и делеции без чрезмерного снижения общей оценки гомологии. Это достигается путем вставки «пробелов» в выравнивание последовательностей, чтобы попытаться максимизировать локальную гомологию.

Однако эти более сложные методы назначают «штрафы за пропуски» для каждого пробела, возникающего в выравнивании, так что для одинакового количества идентичных аминокислот выравнивание последовательности с минимальным возможным числом пробелов, отражающее более высокую степень родства между двумя сравниваемыми последовательностями, наберет более высокий балл, чем то, у которого много пробелов. Обычно используются «аффинные затраты на разрыв», при которых взимается относительно высокий штраф за существование разрыва и меньший штраф за каждый последующий остаток в разрыве. Это наиболее часто используемая система оценки пробелов. Высокие штрафы за пропуски, конечно, приведут к оптимизированному выравниванию с меньшим количеством пропусков. Большинство программ выравнивания позволяют изменять штрафы за пробелы. Однако при использовании такого программного обеспечения для сравнения последовательностей предпочтительно использовать значения по умолчанию. Например, при использовании пакета GCG Wisconsin Bestfit штраф за пропуск по умолчанию для аминокислотных последовательностей составляет -12 за пропуск и -4 за каждое удлинение.

Поэтому для расчета максимального процента гомологии необходимо прежде всего произвести оптимальное выравнивание с учетом штрафов за пробелы. Подходящей компьютерной программой для выполнения такого выравнивания является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры других программ, которые могут выполнять сравнение последовательностей, включают, помимо прочего, пакет BLAST (см. Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) и набор инструментов сравнения GENEWORKS. Как BLAST, так и FASTA доступны для автономного и онлайн-поиска (см. Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60). Однако для некоторых приложений предпочтительнее использовать программу GCG Bestfit. Другой инструмент, называемый BLAST 2 Sequences, также доступен для сравнения белковых и нуклеотидных последовательностей (см. FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).

Хотя конечный процент гомологии можно измерить с точки зрения идентичности, сам процесс выравнивания обычно не основан на сравнении пар по принципу «все или ничего». Вместо этого обычно используется масштабированная матрица оценок сходства, которая присваивает оценки каждому попарному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой широко используемой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. Программы GCG Wisconsin обычно используют либо общедоступные значения по умолчанию, либо настраиваемую таблицу сравнения символов, если таковая имеется (дополнительную информацию см. в руководстве пользователя). Для некоторых приложений предпочтительно использовать общедоступные значения по умолчанию для пакета GCG или, в случае другого программного обеспечения, матрицу по умолчанию, такую как BLOSUM62.

После того, как программное обеспечение произвело оптимальное выравнивание, можно рассчитать процент гомологии, предпочтительно процент идентичности последовательностей. Программное обеспечение обычно делает это как часть сравнения последовательностей и генерирует числовой результат.

«Фрагменты» полноразмерного фактора комплемента I или кофактора фактора комплемента I (CFI), такого как фактор комплемента H или FHL1, также являются вариантами, и этот термин обычно относится к выбранной области полипептида или полинуклеотида, которая представляет интерес либо функционально, либо например, в анализе. Таким образом, «фрагмент» относится к последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, которая является частью полноразмерного полипептида или полинуклеотида.

Такие варианты могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, таких как сайт-направленный мутагенез. Когда должны быть сделаны вставки, может быть получена синтетическая ДНК, кодирующая вставку, вместе с 5'- и 3'-фланкирующими областями, соответствующими природной последовательности с любой стороны от сайта вставки. Фланкирующие области будут содержать удобные сайты рестрикции, соответствующие сайтам в естественной последовательности, так что последовательность может быть разрезана подходящим ферментом(ами), а синтетическая ДНК лигирована в разрез. Затем ДНК экспрессируют в соответствии с изобретением, чтобы получить кодируемый белок. Эти методы только иллюстрируют многочисленные стандартные методы, известные в данной области техники, для манипулирования последовательностями ДНК, и также могут использоваться другие известные методы.

Специалист в данной области техники поймет, что они могут комбинировать все признаки изобретения, раскрытые в данном документе, не выходя за рамки раскрытого объема изобретения.

Предпочтительные признаки и варианты реализации изобретения теперь будут описаны посредством неограничивающих примеров.

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы химии, биохимии, молекулярной биологии, микробиологии и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалиста в данной области техники. Такие методы описаны в литературе. См., например, Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press. Каждый из этих общих текстов включен в данный документ посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Анализ с кофакторами

Рекомбинантный фактор комплемента I (CFI), кофактор (фактор комплемента H (CFH) или фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1)) и C3b инкубировали вместе в течение 20 минут при 37 °C.

Концентрации CFI и C3b были фиксированными, и было проведено титрование CFH или FHL1 в заданных соотношениях.

Расщепление C3b от iC3b количественно определяли с помощью ИФА.

Результаты этих исследований представлены на Фиг. 2А.

Из этих результатов можно сделать вывод, что минимальное функциональное молярное соотношение CFI: CFH/FHL1 составляет 1:2.

Измерение соотношений CFI: кофактор в нормальной сыворотке крови

Концентрации фактора комплемента I (CFI), фактора комплемента H (CFH) и фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) измеряли в нормальной сыворотке человека с помощью ИФА.

Было обнаружено, что молярное соотношение CFI: кофаткор в нормальной сыворотке составляет 1:8,3.

Сравнение соотношений CFI: кофактор в плазме и глазной жидкости

Впоследствии мы сравнили уровни CFI и CFH как в плазме крови, так и в глазных жидкостях. Данные показали, что в отличие от плазмы, в которой кофактор существует в несколько кратном молярном избытке по отношению к ферменту CFI, это соотношение является обратным в стекловидном теле и водянистой влаге (Фиг. 7).

Анализ отложения комплемента на липополисахариде (LPS)

Планшет для микротитрования покрывали 1 мкг/лунку LPS и инкубировали в течение ночи при 4 °C.

Затем планшет промывали и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C с нормальной сывороткой человека, дополненной различными количествами рекомбинантного фактора комплемента I (CFI), фактора комплемента H (CFH) или фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1). Затем планшет тщательно промывали и отложение комплемента измеряли с помощью мышиных антител к C3d (Abcam) и ослиных антител к антителам мыши (Jackson ImmunoResearch), используемых в качестве вторичных антител.

На Фиг. 2В показано влияние добавок CFI, CFH и FHL1 на отложение комплемента на LPS.

По оси абсцисс показано отношение фактора комплемента I (CFI) к фактору комплемента H + фактору комплемента H-подобного белка 1 (CFH и FHL1, «кофакторы»). Изменения в соотношении достигались только добавлением рекомбинантных CFI, CFH или FHL1.

Хотя исходное молярное соотношение 1:8,3 (естественное соотношение в нормальной сыворотке) уже имеет избыток кофактора по сравнению с ферментом, дополнительное преимущество по снижению отложения комплемента и, следовательно, активации достигается при дальнейшем увеличении отношения. Это дополнительное преимущество может быть связано с дополнительной функцией (активностью, ускоряющей распад, DAA) CFH и FHL1. И CFH, и FHL1 имеют DAA в том смысле, что они конкурируют с фактором комплемента B (FB) за связывание с C3b, вытесняют FB из C3b и тем самым «разрушают» конвертазу альтернативного пути.

Из этих экспериментов можно сделать вывод, что ниже минимального молярного отношения CFI: CFH/FHL1, равного 1:2, кофактор становится ограничивающим.

ПРИМЕР 2

Генерация бицистронных плазмид

Были сконструированы рекомбинантных трансгенных плазмид AAV (обозначенные RC204, RC206-210 и RC212-218), содержащих 5' и 3' инвертированные концевые повторы(ITR) AAV2, фланкирующие кассеты, описанные в Таблице 1.

Таблица 1

Номер RC Смежная последовательность 5 'ITR Промоутер Трансген # 1 Линкер Трансген # 2 WPRE Поли-А Смежная последовательность 3’ ITR Размер (по) RC204 Да CMV CFI IRES- CC FHL-1 Нет BGHpA Да 4882 RC206 CFI-CO IRES- CC FHL-1-CO Нет 4882 RC207 CFI IRES- PV FHL-1 Нет 5069 RC208 CFI-CO IRES- PV FHL-1-CO Нет 5069 RC209 FHL-1 Фурин- F2A CFI Стандарт 5052 RC210 FHL-1-CO Фурин- F2A CFI-CO Стандарт 5052 RC212 FHL-1-CO Фурин- F2A CFI-CO 3 4674 RC213 Нет CFI IRES- CC FHL-1 Нет Нет 4744 RC214 CFI IRES- PV FHL-1 Нет 4929 RC215 FHL-1 Фурин- F2A CFI Стандарт 4912 RC216 FHL-1-CO Фурин- F2A CFI-CO Стандарт 4912 RC217 FHL-1 Фурин- F2A CFI 3 4548 RC218 FHL-1-CO Фурин- F2A CFI-CO 3 4548

Используемая последовательность, примыкающая к 5'-ITR, представляла собой SEQ ID NO: 20.

10 Используемая последовательность промотора CMV представляла собой SEQ ID NO: 13.

Используемая последовательность FHL1 представляла собой SEQ ID NO: 16. Используемая последовательность FHL1 (FHL1-CO) с оптимизированными кодонами представляла собой SEQ ID NO: 12.

Используемая линкерная последовательность Фурин-F2A представляла собой SEQ ID NO: 17.

Используемая последовательность CFI представляла собой SEQ ID NO: 2. Используемая последовательность CFI (CFI-CO) с оптимизированными кодонами представляла собой SEQ ID NO: 10.

Используемая последовательность WPRE3 представляла собой SEQ ID NO: 15.

Используемая последовательность поли-A гормона роста крупного рогатого скота (BGHpA) представляла собой SEQ ID NO: 14.

Используемая последовательность, примыкающая к 3'-ITR, представляла собой SEQ ID NO: 21.

Общие последовательности RC212 и RC218 представляли собой SEQ ID NO: 22 и 23 соответственно.

Сравнение векторов по трансдукции

Получение векторов в прикреплённых HEK293

Отдельную трансфекцию клеток HEK293 12 плазмидами (RC204, RC206-210 и RC212-217) проводили по следующему протоколу:

1 день: Клетки HEK293 диссоциировали и подсчитывали с помощью ViCell. Клетки высевали в 10 см планшеты из расчета 6×10⁵ клеток на см² в 10 мл DMEM/Glutamax + 10% FBS на планшет.

День 2: Конфлюэнтность была проверена и составила 70-80%.

Среду заменили на DMEM/Glutamax + 5% FBS.

Через 4 часа клетки трансфицировали 5 мкг общей плазмидной ДНК (1,25 мкг конструкции ДНК, 1,25 мкг плазмиды RepCap, 2,5 мкг плазмиды Helper) на планшет с использованием PEI при соотношении ДНК: PEI 1:3 в дубликатах:

1. 2×5 мкг ДНК разводили в 2×1 мл ФСБ.

2. Добавляли 2×15 мкл PEI и инкубировали в течение 20 мин.

3. К клеткам по каплям добавляли 1 мл ДНК/PEI.

День 3: Добавляли 15 мМ бутирата натрия.

День 5: Среды собирали путем объединения дубликатов и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут для удаления остатков клеток.

Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли 1/5 объема AAVanced (AAV110A-1, Cambridge Bioscience).

Смесь инкубировали при 4 °C в течение 72 часов.

День 5: Смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 30 минут при 4 °C. Впоследствии супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 500 мкл ФСБ. Осадок центрифугировали в течение 3 минут при 1500 g, а затем супернатант снова отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 1/100 исходного объема супернатанта и хранили при -80 °C до титрования.

Трансдукция клеток HEK293 с использованием векторов

Отдельную трансдукцию клеток HEK293 12 вирусными векторам (RC204, RC206-210 и RC212-217) проводили по следующему протоколу:

1 день: Клетки HEK293 диссоциировали и подсчитывали с помощью ViCell. Клетки высевали в 24 луночные планшеты по 1x10⁵ клеток в 400 мкл DMEM/Glutamax + 10% FBS на лунку.

День 2: Требуемое количество вирусного вектора добавляли для достижения множественности инфекции (MOI) 2х10².

День 3: Среду удаляли и заменяли 300 мкл бессывороточной среды DMEM/Glutamax.

День 5: Супернатант собирали и центрифугировали при 14000 об/мин при 4 °C. Осветленный супернатант переносили в новые пробирки, готовые к анализу.

Вестерн-блоттинг

Супернатанты от трансдукции анализировали вестерн-блоттингом (первичные антитела к CFI и FHL-1; и использовали реагенты для детекции вестерн-блоттинга ECL Prime).

Результаты Вестерн-блоттинга представлены на Фиг. 3.

CFI ИФА

Супернатанты после трансдукции анализировали с помощью ИФА на CFI, используя следующую процедуру:

1 день: Планшет для ИФА покрывали 50 мкл на лунку поликлонального антитела барана к CFI, разведенного 1: 4000 в 1х буфере для покрытия. Планшеты хранили при 4 °C в течение ночи.

День 2: Планшет промывали 3 раза 200 мкл на лунку PBS-Tween (0,05%), затем наносили на ткань.

200 мкл 1% BSA фракции V в PBS-Tween (0,05%) вносили в каждую лунку и позволяли блокироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.

Образцы и стандартные кривые получали во время инкубации с блокировкой. Стандартная кривая была построена с использованием очищенного белка CFI (Sigma C5938-1MG), разбавленного в DMEM 2% FBS. Образцы разбавляли 1:5 и 1:10 в DMEM 2% FBS.

После 2 часов блокировки планшет промывали 3 раза, как описано выше, затем 50 мкл образца или стандарта загружали в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем антитело к CFI (Ox21) разводили 1:2000 в DMEM 5% FBS и 50 мкл этого вносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем ослиные антитела к мышиной HRP разводили 1: 5000 в DMEM 5% FBS, 50 мкл этого вносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как указано выше, затем в каждую лунку наносили 100 мкл реагента TMB и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение приблизительно 15 минут. После получения достаточного синего цвета в каждую лунку добавляли 100 мкл 1 М серной кислоты, чтобы остановить реакцию.

Затем была записана A450, данные были обработаны и перенесены в Microsoft Excel для анализа.

FHL1 ИФА

Супернатанты после трансфекции анализировали с помощью ИФА на FHL1, используя следующую процедуру:

1 день: Планшет для ИФА покрывали 50 мкл на лунку, 3 мкг/мл антитела к FHL-1 (Biorad, AbD33594.1) в 100 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,6. Планшеты хранили при 4 °C в течение ночи.

День 2: Планшет промывали 3 раза 200 мкл на лунку TBS-Tween (0,05%), затем наносили на ткань.

Образцы и стандартные кривые получали во время инкубации с блокировкой. Стандартная кривая была построена с использованием очищенного белка FHL1, разбавленного в DMEM 2% FBS. Образцы разбавляли 1:5 и 1:10 в блокирующем буфере.

Через 1 час планшет промывали, как указано выше, затем добавляли антитело к CFH (Ox24, Santa Cruz Biotechnologies, sc-53067) в концентрации 0,33 мкг/мл в блокирующем буфере и 50 мкл этого количества вносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как описано выше, затем добавляли ослиные антитела к мышиной HRP в концентрации 0,2 мкг/мл в блокирующем буфере, 50 мкл этого вносили в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Через 1 час планшет промывали, как указано выше, затем в каждую лунку наносили 100 мкл реагента TMB и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение приблизительно 15 минут. После получения достаточного синего цвета в каждую лунку добавляли 50 мкл 1 М серной кислоты, чтобы остановить реакцию.

Затем была записана A450, данные были обработаны и перенесены в Microsoft Excel для анализа.

Выводы

Результаты исследований вестерн-блоттинга и ИФА представлены на Фиг. 3 и 4 соответственно.

На основании анализа вестерн-блоттинга и ИФА можно сделать вывод, что:

Все кандидаты после трансдукции продуцируют как CFI, так и FHL1.

Оптимизация кодонов CFI и FHL1 увеличивает уровни белка.

RC206 и RC212 оптимальны для экспрессии CFI, однако RC212 достигает оптимального молярного отношения CFI:FHL1 (> 1: 2).

RC212 является лучшим кандидатом на основе экспрессии CFI/FHL1.

Векторная упаковка

Щелочной гель-анализ

24 мкл каждого неразбавленного образца и контроль SRM (2,45x10¹¹вг/мл; SRM # 16-048) загружали на 0,8% щелочной гель, который затем прогоняли в течение 19 часов при 20 В в холодной комнате в щелочном рабочем буфере (40 мл 50х щелочного буфера + 1960 мл воды MilliQ).

Затем гель инкубировали в 3 объемах геля 0,1 М Трис pH 8,0 в течение 1 ч при комнатной температуре, затем в 1 объеме геля 0,1 М NaCl, содержащего 4х окрашивание нуклеиновой кислоты SYBRGold, в течение 2 ч при комнатной температуре (в защищенном от воздействия света месте), затем дважды промывали водой MilliQ.

Затем гель визуализировали с использованием УФ-трансиллюминатора SYBRGold, установленного на Chemidoc, при времени экспозиции 10 секунд.

Результат представлен на Фиг. 5 (верхняя панель).

Соотношение полных и пустых частиц

Соотношение полных и пустых вирусных частиц анализировали путем сравнения титров, рассчитанных с помощью кПЦР (титр ДНК) и капсидного ИФА.

Результат представлен на Фиг. 5 (нижняя панель).

Выводы

Из этих анализов можно сделать вывод, что:

Эффективная упаковка существует только с RC212.

Похоже, существует неполная упаковка геномов размером > 4,7 ко.

Соотношение полностью пустых частиц RC212 сравнимо с контрольными моноцистронными векторами.

RC212 является лучшим кандидатом на основе анализа упаковки.

Анализ расщепления C3b

В анализе расщепления C3b 1 мг очищенный из плазмы C3b инкубировали в течение 1 часа при 37 °C с образцами супернатанта трансдуцированного HEK293.

Анализы проводили с использованием ИФА или вестерн-блоттинга (описанного ниже). Для остановки реакции добавляли 4x буфера Лэммли с β-меркаптоэтанолом. Образцы разбавляли и наносили на 10% полиакриламидный гель SDS PAGE (Bio-Rad). После переноса на PVDF-мембрану (Bio-Rad) и блокирования в блокирующем буфере (1xTBS pH 8 [Sigma]/0,05% Tween-20 и 5% сухого обезжиренного молока [Marvel]), расщепление C3b обнаруживали с использованием козьих антител к антителу человека к C3 (Biorad).

Результаты представлены на Фиг. 6, из чего можно сделать вывод, что RC212 является наиболее активным.

ПРИМЕР 3 - ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ПОНИЖЕНИЕ РЕГУЛИРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ПРИ ДОБАВЛЕНИЯ НЕСКОЛЬКИХ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ

Способ

Для измерения функциональной активности регуляторов комплемента был проведен анализ отложения LPS. Планшеты Nunc Maxisorb покрывали в течение ночи при 4 °C 1 мкг/мл LPS (Sigma, Escherichia coli O26: B6) в разбавленном буфере для покрытия ИФА (BioRad, BUF030B). Планшеты промывали PBS-0,05% Tween 20. Готовили 25% сыворотку в буфере альтернативного пути (PBS, 2 мМ MgCl2 и 10 мМ EGTA, pH 7,2) и добавляли регуляторы комплемента. Разведения добавляли в покрытый LPS планшет и инкубировали в течение 1 часа при 37 °C. 10 мМ ЭДТА добавляли в отдельную пробирку с сывороткой для предотвращения активации комплемента, и этот образец использовали для определения фонового сигнала в анализе. Планшет промывали, как и раньше, и измеряли активацию комплемента, определяя отложение C3 на планшете (козье антитело к C3d Abcam, ab17453; 1:20000). После 1 часа инкубации при температуре окружающей среды планшеты промывали и инкубировали в течение еще одного часа с ослиным антителом к мышинному антителу, конъюгированному с HRP (Jackson Immunoresearch, 715-035-150; 1:1000). После четырех промывок планшеты инкубировали с субстратом 1-Step Ultra TMB - ИФА (Life Technologies) и реакцию гасили 1 M H₂SO₄. ОП при 450 нм измеряли с использованием планшет-ридера Varioskan (Thermo Fisher), и IC50 определяли по кривым, подогнанным для 4PL, с использованием GraphPad Prism. В этих экспериментах использовалась женская сыворотка человека, с консервированным комплементом.

Результаты

Концентрацию IC50 белков-регуляторов комплемента, фактора комплемента I, растворимого рецептора комплемента 1, фактора комплемента H или фактора H-подобного белка 1 определяли в отдельном эксперименте с использованием той же платформы для анализа. В данном документе результаты показывают (Фиг. 8), что при добавлении концентраций регуляторных белков IC50 альтернативный путь (измеренный по уменьшению отложения C3) гасится (заштрихованные столбцы). Если фактор комплемента I дополняется одним из его кофакторов (растворимый рецептор комплемента 1, фактор комплемента H или фактор H-подобного белка 1), наблюдается дополнительное гашение (белые столбцы), демонстрируя, что увеличение концентрации двух регуляторов комплемента приводит к эффекту превосходящему таковому, который наблюдается при добавление их по отдельности. Эти результаты показывают, что состояния, вызванные чрезмерно реактивной системой комплемента, могут выиграть от двойного введения нескольких регуляторов комплемента.

Концентрации IC50 отдельных регуляторов широко различаются в зависимости от тестируемых регуляторов (sCR1 в ~ 10 раз более эффективен, чем FHL1 и в ~ 50 раз более эффективен, чем CFH и CFI), но также в зависимости от их молекулярной массы (sCR1 = 213 кДа, CFI = 88 кДа, CFH = 155 кДа и FHL1 = 49 кДа), для этого прямого сравнения использовали молярные концентрации. Эндогенные уровни белков также будут способствовать наблюдаемым различиям в эффективности; Фактор H имеет гораздо более высокую концентрацию в плазме, чем FHL1 или sCR1. Сравнивая способность регуляторов при их концентрации IC50 подавлять альтернативный путь, было продемонстрировано, что sCR1 является наиболее мощным регулятором, поскольку для достижения IC50 требуется самая низкая молярная концентрация. Поскольку CR1 представляет собой мембранно-связанный рецептор на эритроцитах, которых много в крови, но не в сыворотке/плазме, и только незначительные количества жидкостной CR1 (т.е. sCR1) присутствуют в сыворотке или плазме, это означает, что sCR1 будет очень мощным регулятором комплемента и кофактором CFI в участках, где эритроциты отделены от плазмы, таких как хориоидальное пространство, субретинальное пространство мембраны Бруха и клубочки.

ПРИМЕР 4 - ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I И ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА Н-ПОДОБНОГО БЕЛКА 1 IN VITRO

Способ

Клетки HEK-293 трансдуцировали одним из следующих векторов rAAV: AAV, экспрессирующим CFI (GT005); AAV, экспрессирующим FHL1 (RC001); или AAV, экспрессирующим CFI и FHL1 (GT007). Супернатанты анализировали невосстанавливающим вестерн-блоттингом для определения относительной экспрессии белка. Козьи антитела к CFI человека (Comptech) и козьи антитела к FH человека (Quidel, A312) использовали в качестве первичных антител для обнаружения белка CFI и FHL1.

Результаты

Вестерн-блоттинг показал, что белок CFI и FHL1 экспрессировался и секретировался в культуральную среду из всех трех конструкций (Фиг. 9A и B). Для подтверждения этого паттерна экспрессии супернатанты анализировали иммуноблоттингом для визуализации белка CFI для определения правильного процессинга и секреции в супернатанте. Как показано на Фиг. 9B, тяжелая и легкая цепи CFI, а также про-CFI секретируются из клеток HEK-293 после трансдукции с помощью GT007, подтверждая, что белок CFI транслировался и произошел протеолитический процессинг. В клетках млекопитающих, трансфицированных плазмидой, кодирующей кДНК CFI, не весь рекомбинантный про-CFI белок подвергается расщеплению, что приводит к секреции про-CFI (88 кДа), и также зрелого процессированного CFI, состоящего из тяжелой цепи 50 кДа и легкой цепи 38 кДа.

ПРИМЕР 5 - ФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I И ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА Н-ПОДОБНОГО БЕЛКА 1 IN VITRO

Способ

Для анализа функциональной активности CFI и FHL1, секретируемых трансдуцированными клетками, кондиционированный супернатант клеток HEK-293, трансдуцированных: AAV, экспрессирующим только CFI (GT005); AAV2, экспрессирующим только FHL1 (RC001); ко-трансдуцированных как GT005, так и RC001; или трансдуцированных AAV, экспрессирующим CFI и FHL1 (GT007), тестировали в анализе расщепления C3b (Фиг. 10). В этом анализе C3b смешивали с источником CFI и FHL1 и инкубировали в течение 4 часов при 37 °C. Это время инкубации было оптимизировано для концентраций трансгенов, экспрессируемых из трансдуцированных клеток. Принцип этого анализа основан на способности CFI в присутствии FHL1 расщеплять C3b на iC3b и C3f. Анализ анализировали вестерн-блоттингом C3b, окрашивая продукты расщепления C3b, и с помощью iC3b ИФА, который определяет количество продукта распада C3b, iC3b.

Результаты

Результаты как C3-вестерн-блоттинга, так и iC3b ИФА коррелируют и демонстрируют функциональную активность CFI и FHL1, экспрессированных in vitro. На вестерн-блоте C3b (Фиг. 10A) дорожка 1 показывает только C3b, дорожка 2 показывает C3b, смешанный с CFI и FHL1 (положительный контроль), и дорожка 3 показывает C3b, смешанный с кондиционированным супернатантом из нетрансдуцированных клеток (UTD, отрицательный контроль). Дорожка 4 показывает деградацию C3b при кондиционировании супернатанта клеток, ко-трансдуцированных с помощью GT005 (CFI) и RC001 (FHL1). Дорожка 5 показывает кондиционированный супернатант клеток, трансдуцированных GT007 (экспрессирующих CFI и FHL1). Анализ подтверждает, что кондиционированный супернатант клеток, трансдуцированных GT007, содержит активные CFI и FHL1, которые разлагают C3b до iC3b.

iC3b ИФА (Фиг. 10B) выполняли с использованием того же супернатанта, который использовался для вестерн-блоттинга C3b, и количество iC3b было определено как прямая функция функциональности белка. Как и раньше, C3b, инкубированный с CFI и FHL1, действует как положительный контроль, как кондиционированный супернатант клеток, совместно трансдуцированных GT005 и RC001. Супернатант клеток, трансдуцированных GT007, демонстрирует активность расщепления C3b, подтверждая присутствие активных CFI и FHL1.

ПРИМЕР 6 - ЭФФЕКТИВНОСТЬ IN VIVO В МЫШНОЙ МОДЕЛИ ХОРИОИДАЛЬНОЙ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ (CNV)

Способ

Модель индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации была выполнена на мышах. Мыши (n = 12-14 на группу) получали односторонние субретинальные инъекции векторов AAV за 4 недели до индукции CNV или афлиберцепта (положительный контроль) сразу после индукции CNV. Контралатеральный глаз служил контролем. За мышами наблюдали с помощью визуализации in vivo, флуоресцентной ангиографии (FA) и оптической когерентной томографии спектральной области (SD-OCT) на 4 и 7 дни. В конце периода исследования на 7 день наблюдения после индукции CNV мышей умерщвляли передозировкой анестезии, собирали сыворотку и удаляли глаза. Нервную сетчатку вырезали и свежезамораживали в жидком азоте. Хориоиды фиксировали и подготавливали хориоидальные срезы. Гистологический анализ хориодальных срезов использовали для количественной оценки площади окрашивания изолектином B4 в поражениях CNV.

Результаты

Группа афлиберцепта значительно повлияла на степень утечки CNV по сравнению с контрольной группой с нулевым вектором через 4 дня после индукции CNV (P <0,0001 по сравнению со всеми другими группами), но это было потеряно к 7 дню, предположительно из-за вымывания лекарственного средства с течением времени. Площадь утечки CNV была значительно уменьшена в глазах, обработанных афлиберцептом, как на 4 день (P <0,0001 для всех сравнений групп), так и на 7 день (P = 0,019 по сравнению с группой с нулевым вектором).

Хориоидальные срезы совместно окрашивали изолектином, меченным флуоресцеином. Изолектин B4 окрашивает эндотелиальные клетки и используется для визуализации поражений CNV. Данные были распределены ненормально, как оценивалось с помощью теста Колмогорова-Смирнова (P <0,05), и поэтому статистическая значимость наблюдаемых различий была определена с использованием анализа Обобщенной линейной модели (GLM). Все группы обработки показали статистически значимое уменьшение площади, окрашенной изолектином B4, по сравнению с группой нулевой обработки (GLM, P <0,05 для всех). Совместное введение векторов, экспрессирующих CFI и FHL1 (GT005: RC001), обеспечило наиболее значительное снижение.

Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и вариации раскрытых агентов, композиций, применений и способов изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было раскрыто в связи с конкретными предпочтительными вариантами реализации, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами реализации. Действительно, различные модификации раскрытых способов реализации изобретения, которые очевидны для специалиста, предназначены для того, чтобы находиться в пределах объема следующей формулы изобретения.

Изобретение далее описывается следующими пронумерованными параграфами:

1. Продукт, содержащий (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующиеих, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии.

2. Продукт, содержащий (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении или профилактике опосредованного комплементом заболевания глаза.

3. Продукт для применения по параграфу 2, в котором опосредованное комплементом расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию, предпочтительно ВМД.

4. Продукт для применения по параграфу 3, в котором ВМД представляет собой сухую ВМД.

5. Продукт для применения по любому из предыдущих параграфов, в котором продукт предлагает (i) и (ii) субъекту в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 2:1, предпочтительно по меньшей мере 3:1, более предпочтительно не менее 8:1, более предпочтительно не менее 15:1.

6. Продукт для применения по любому из предыдущих параграфов, в котором продукт предлагает (i) и (ii) субъекту в молярном соотношении (i):(ii) от 2:1 до 12:1, предпочтительно от 3:1 и 10:1.

7. Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI).

8. Выделенный полинуклеотид по параграфу 7, в котором полинуклеотид дополнительно содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие:

(a) промотор CMV, необязательно, при этом промотор CMV расположен выше нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii);

(b) регуляторный элемент WPRE, необязательно, при этом регуляторный элемент WPRE находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii); и/или

(c) сигнал поли-А, необязательно, сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота, при этом сигнал поли-А необязательно находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

9. Выделенный полинуклеотид по параграфам 7 или 8, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая (i), расположена выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (ii).

10. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-9, в котором полинуклеотид дополнительно содержит один или более инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).

11. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-10, в котором полинуклеотид содержит ITR AAV на 5'-конце и ITR AAV на 3'-конце.

12. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-11, в котором полинуклеотид содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, необязательно, при этом линкер содержит или определен сайтом расщепления фурином, GSG, 11aа1D и последовательностью F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) регулирующий элемент WPRE, необязательно, при этом регулирующий элемент WPRE является регулирующим элементом WPRE3;

(g) сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(h) 3' AAV ITR.

13. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-12, в котором ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8.

14. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-13, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие FHL1 или CFH, и CFI, оптимизированы по кодонам.

15. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-14, в котором: (а) нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 12; и/или (b) нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 10.

16. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-15, в котором: (а) нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12; и/или (b) нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, представляет собой SEQ ID NO: 10.

17. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-16, в котором полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична ей.

18. Выделенный полинуклеотид по любому из параграфов 7-17, в котором полинуклеотид имеет размер менее или равный 4,7 к.о.

19. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из параграфов 7-18.

20. Вектор по параграфу 19, в котором вектор представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV).

21. Вектор по параграфам 19 или 20, в котором вектор находится в форме вирусной векторной частицы.

22. Вектор по параграфу 21, в котором частица вектора AAV содержит геном AAV2 или AAV8 и капсидные белки AAV2 или AAV8.

23. Клетка, содержащая полинуклеотид по любому из параграфов 7-18.

24. Клетка, трансдуцированная вектором по любому из параграфов 19-22.

25. Фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид, вектор или клетку по любому из параграфов 7-24 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

26. Полинуклеотид, вектор или клетка по любому из параграфов 7-24 для применения в терапии.

27. Полинуклеотид, вектор или клетка по любому из параграфов 7-24 для применения при лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза.

28. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по параграфу 27, в котором опосредованное комплементом расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию, предпочтительно ВМД.

29. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по параграфу 28, в котором ВМД представляет собой сухую ВМД.

30. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-29, в котором образование географической атрофии предотвращается или уменьшается, и/или степень географической атрофии снижается.

31. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-30, в котором прогрессирование географической атрофии замедлено.

32. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-31, в котором наблюдается уменьшение увеличения площади географической атрофии по меньшей мере на 10% в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период.

33. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-32, в котором введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта или в глазу, например, в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) субъекта, необязательно до уровня, который превышает нормальный уровень для субъекта, глаза или его ПЭС.

34. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-33, в котором полинуклеотид, вектор или клетку вводят внутриглазно.

35. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-34, в котором полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

36. Полинуклеотид, вектор или клетка для применения по любому из параграфов 26-35, в котором полинуклеотид, вектор или клетку вводят в глаз субъекта путем субретинальной инъекции.

37. Способ лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, включающий введение полинуклеотида, вектора или клетки по любому из параграфов 7-24 нуждающемуся в этом субъекту.

38. Способ предлагающий (i) фактор комплемента H-подобного белка 1 (FHL1) или фактор комплемента H (CFH); и (ii) фактор комплемента I (CFI) субъекту, включающий доставку полинуклеотида, вектора или клетки по любому из параграфов 7-24 в глаз субъекта.

Иллюстрации к изобретению RU 2 809 247 C2

Реферат патента 2023 года ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I И КОФАКТОР ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I, КОДИРУЮЩИЕ ИХ ВЕКТОРЫ И ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: продукт, содержащий кофактор фактора комплемента I (CFI) и фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии, выделенный полинуклеотид, кодирующий кофактор фактора комплемента I (CFI) и фактор комплемента I (CFI), экспрессионный вектор и клетки-хозяина, продуцирующие кофактор фактора комплемента I (CFI) и фактор комплемента I (CFI). Также раскрыты фармацевтическая композиция для лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, способ лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза и способ доставки в глаз субъекта кофактора фактора комплемента I (CFI) и фактора комплемента (CFI). Изобретение используется для лечения расстройств глаза. 8 н. и 32 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 табл., 6 пр.

Формула изобретения RU 2 809 247 C2

1. Продукт, содержащий (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI) или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза.

2. Продукт для применения по п. 1, где опосредованное комплементом расстройство глаза представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическую ретинопатию, глаукому, болезнь Штаргардта, центральную серозную хориоретинопатию, пигментный ретинит, увеит или задний увеит.

3. Продукт для применения по п. 2, отличающийся тем, что опосредованное комплементом расстройство глаза представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию, предпочтительно ВМД.

4. Продукт для применения по п. 3, отличающийся тем, что ВМД представляет собой сухую ВМД.

5. Продукт для применения по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что кофактор фактора комплемента I (CFI) выбран из группы, состоящей из фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1); фактора комплемента H (CFH); рецептора комплемента 1 (CR1) или его фрагмента; и мембранного кофакторного белка (MCP) или его фрагмента.

6. Продукт для применения по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что продукт обеспечивает (i) и (ii) субъекту в молярном соотношении (i):(ii) по меньшей мере 2:1, предпочтительно по меньшей мере 3:1, более предпочтительно по меньшей мере 8:1, более предпочтительно по меньшей мере 15:1.

7. Продукт для применения по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что продукт обеспечивает (i) и (ii) субъекту в молярном соотношении (i):(ii) от 2:1 до 12:1, предпочтительно от 3:1 до 10:1.

8. Выделенный полинуклеотид, кодирующий (i) кофактор фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактор комплемента I (CFI).

9. Выделенный полинуклеотид по п. 8, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая (i), расположена выше нуклеотидной последовательности, кодирующей (ii).

10. Экспрессионный вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по п. 8 или 9.

11. Экспрессионный вектор по п. 10, отличающийся тем, что экспрессионный вектор дополнительно содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие:

(a) промотор CMV, необязательно при этом промотор CMV расположен выше нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii);

(b) регуляторный элемент WPRE, необязательно при этом регуляторный элемент WPRE находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii); и/или

(c) сигнал поли-А, необязательно сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота, при этом сигнал поли-А необязательно находится ниже нуклеотидных последовательностей, кодирующих (i) и (ii).

12. Экспрессионный вектор по п. 10 или 11, отличающийся тем, что экспрессионный вектор дополнительно содержит один или более инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV).

13. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-12, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит ITR AAV на 5'-конце и ITR AAV на 3'-конце.

14. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-13, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит:

(a) 5' AAV ITR;

(b) промотор CMV;

(d) линкер, необязательно при этом линкер представляет собой или определен сайтом расщепления фурином, GSG, последовательностью 11aа1D и последовательностью F2A;

(e) нуклеотидную последовательность, кодирующую CFI;

(f) регулирующий элемент WPRE, необязательно при этом регулирующий элемент WPRE является регулирующим элементом WPRE3;

(g) сигнал поли-А гормона роста крупного рогатого скота; и

(h) 3' AAV ITR.

15. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-14, отличающийся тем, что кофактор фактора комплемента I (CFI) выбран из группы, состоящей из фактора комплемента H-подобного белка 1 (FHL1); фактора комплемента H (CFH); рецептора комплемента 1 (CR1) или его фрагмента; и мембранного кофакторного белка (MCP) или его фрагмента.

16. Экспрессионный вектор по любому из пп. 12-15, отличающийся тем, что ITR AAV представляют собой ITR AAV2 или AAV8.

17. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-16, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кофактор CFI и CFI, оптимизированы по кодонам.

18. Экспрессионный вектор по любому из пп. 15-17, отличающийся тем, что: (а) нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 12; и/или (b) нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 10.

19. Экспрессионный вектор по любому из пп. 15-18, отличающийся тем, что: (а) нуклеотидная последовательность, кодирующая FHL1, представляет собой SEQ ID NO: 12; и/или (b) нуклеотидная последовательность, кодирующая CFI, представляет собой SEQ ID NO: 10.

20. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-19, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23, или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична ей.

21. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-20, отличающийся тем, что экспрессионный вектор имеет размер менее или равный 4,7 т.п.н.

22. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-21, отличающийся тем, что экспрессионный вектор представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV) и кофактор CFI представляет собой FHL1.

23. Экспрессионный вектор по любому из пп. 10-22, отличающийся тем, что экспрессионный вектор находится в форме вирусной векторной частицы.

24. Экспрессионный вектор по п. 23, отличающийся тем, что частица вектора AAV содержит геном AAV2 или AAV8 и капсидные белки AAV2 или AAV8.

25. Клетка-хозяин, продуцирующая кофактор фактора комплемента I (CFI) и фактор комплемента I (CFI), содержащая полинуклеотид по п. 8 или 9.

26. Клетка-хозяин, продуцирующая кофактор фактора комплемента I (CFI) и фактор комплемента I (CFI), трансдуцированная экспрессионным вектором по любому из пп. 10-24.

27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, содержащая полинуклеотид по п. 8 или 9, экспрессионный вектор по любому из пп. 10-24 или клетку-хозяина по п. 25 или 26 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

28. Полинуклеотид по п. 8 или 9, экспрессионный вектор по любому из пп. 10-24 или клетка-хозяин по п. 25 или 26 для применения в лечении или профилактике опосредованного комплементом расстройства глаза.

29. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по п. 28, где опосредованное комплементом расстройство глаза представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), диабетическую ретинопатию, глаукому, болезнь Штаргардта, центральную серозную хориоретинопатию, пигментный ретинит, увеит или задний увеит.

30. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по п. 29, отличающийся тем, что указанное опосредованное комплементом расстройство представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) или диабетическую ретинопатию, предпочтительно ВМД.

31. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по п. 30, отличающийся тем, что ВМД представляет собой сухую ВМД.

32. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-31, отличающийся тем, что образование географической атрофии предотвращается или уменьшается, и/или степень географической атрофии снижается.

33. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-32, отличающийся тем, что прогрессирование географической атрофии замедляется.

34. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-33, отличающийся тем, что наблюдается уменьшение увеличения площади географической атрофии по меньшей мере на 10% в течение 12 месяцев после введения в обработанный глаз субъекта по сравнению с необработанным глазом за тот же период.

35. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-34, отличающийся тем, что введение полинуклеотида, вектора или клетки увеличивает уровень инактивации C3b и деградации iC3b у субъекта или в глазу, например в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС) субъекта, необязательно до уровня, который превышает нормальный уровень для субъекта, глаза или его ПЭС.

36. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетку вводят внутриглазно.

37. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-36, отличающийся тем, что полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетку-хозяина вводят в глаз субъекта путем субретинальной, прямой ретинальной, супрахориоидальной или интравитреальной инъекции.

38. Полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетка-хозяин для применения по любому из пп. 28-37, отличающийся тем, что полинуклеотид, экспрессионный вектор или клетку-хозяина вводят в глаз субъекта путем субретинальной инъекции.

39. Способ лечения или профилактики опосредованного комплементом расстройства глаза, включающий введение полинуклеотида по п. 8 или 9, экспрессионного вектора по любому из пп. 10-24 или клетки-хозяина по п. 25 или 26 нуждающемуся в этом субъекту.

40. Способ доставки в глаз субъекта (i) кофактора фактора комплемента I (CFI); и (ii) фактора комплемента (CFI), включающий доставку полинуклеотида по п. 8 или 9, экспрессионного вектора по любому из пп. 10-24 или клетки-хозяина по п. 25 или 26 в глаз субъекту.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2809247C2

DANIEL RICKLIN ET AL: "The renaissance of complement therapeutics", NATURE REVIEWS
NEPHROLOGY, vol
Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью	1916	Драго С.И.	SU14A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия	1921	Настюков А.М. Настюков К.И.	SU1A1
ДЛИН В.В., ИГНАТОВА М.С
Нефропатии, связанные с патологией системы комплемента, РОССИЙСКИЙ ВЕСТНИК ПЕРИНАТОЛОГИИ И ПЕДИАТРИИ, 6, 2016
WO 2017053732 A2, 30.03.2017
WO 2017072515 A1, 04.05.2017.

RU 2 809 247 C2

Авторы

Драйсман Анна

Эллис Скотт

Джоэл Джозефин Хезер Люсьен

Даты

2023-12-08—Публикация

2019-12-23—Подача

название	год	авторы	номер документа
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ	2016	Грундаль, Кристиан Фаннелл, Тим Холловуд, Крис	RU2740038C2
ЛЕЧЕНИЕ КОМПЛЕМЕНТ-ОПОСРЕДУЕМЫХ РАССТРОЙСТВ	2017	Лахманн, Питер Александер, Ян	RU2768982C2
АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ КОМПЛЕМЕНТА Bb	2015	Лян Яньбинь Ли Чэнь Ли Ирис Гузман Виктор М.	RU2673036C2
КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ОПОСРЕДОВАННОГО КОМПЛЕМЕНТОМ	2016	Сун, Вэньчао Гуллипалли, Дамодар Мива, Такаси	RU2727411C2
АНАЛОГИ ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА В И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2012	Чень Чан Чунг Калеко Майкл Ли Бейби Луо Тианси Миллер Джеффри Аллен Ван Рюйгон	RU2639521C2
МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)	2018	Котин, Роберт Майкл Алкан, Озан Джонс, Аннализе Керр, Дуглас Энтони Малакиан, Ара Карл Симмонс, Мэтью Джон Райт, Тереза Л.	RU2800026C2
АНТИТЕЛА К КОМПОНЕНТУ КОМПЛЕМЕНТА С5	2015	Бациу Питер С. Лян Яньбинь Гу Джейсон Бернетт Мэтью Мучхал Умеш Десжарлайс Джон	RU2693430C2
РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)	2018	Котин, Роберт Майкл Керр, Дуглас Самайоа, Филлип Алкан, Озан Симмонс, Мэттью Дж.	RU2811724C2
АНТИТЕЛА ПРОТИВ C3b И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С КОМПЛЕМЕНТОМ НАРУШЕНИЙ	2008	Ван Локерен Кампагне Менно	RU2473563C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ДЕГЕНЕРАЦИИ ЖЕЛТОГО ПЯТНА	2015	Скариа Абрахам	RU2703145C2

Описание патента на изобретение RU2809247C2

Похожие патенты RU2809247C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 809 247 C2

Реферат патента 2023 года ФАКТОР КОМПЛЕМЕНТА I И КОФАКТОР ФАКТОРА КОМПЛЕМЕНТА I, КОДИРУЮЩИЕ ИХ ВЕКТОРЫ И ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ

Формула изобретения RU 2 809 247 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2809247C2

RU 2 809 247 C2