ПРИМЕНЕНИЕ TPK В КАЧЕСТВЕ МИШЕНИ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2023 года по МПК A61K45/00 C12N9/12 C12N15/85 A61P25/28 

По настоящей заявке испрашивается приоритет Китайской патентной заявки No.201910711540.3, поданной ранее в Китайское патентное ведомство 2 августа 2019 г., озаглавленной «A method for constructing an animal model and the use of the corresponding model», и Китайской патентной заявки No.202010038537.2, поданной ранее в Китайское патентное ведомство 14 января 2020 г., озаглавленной «Use of TPK as a target in Alzheimer’s disease», полное содержание которых приведено в настоящем описании посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, в частности, к применению TPK в качестве мишени при болезни Альцгеймера.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенным типом деменции, в основном характеризующимся хронической и прогрессирующей регрессией когнитивных функций и памяти, и изменением личности. К 2015 г., во всем мире было более 50 миллионов пациентов с AD, и заболеваемость увеличивалась с возрастом людей более 65 лет. Вместе с непрерывным развитием прогресса глобального старения, AD приводит к тяжелой экономической и ментальной нагрузке на общество и семьи.

AD представляет собой заболевание с различными патофизиологическими изменениями, включая потерю нейронов, активацию глиальных клеток, характерные сенильные бляшки, сформированные посредством внеклеточного накопления белка бета-амилоида (Aβ), и нейрофибриллярные клубки, вызванные гиперфосфорилированием внутриклеточного белка Tau и т.д. Кроме того, потеря синапсов, нарушения церебрального метаболизма глюкозы, окислительный стресс и т.п. также представляют собой постоянные патологические изменения в головном мозге при AD, и уменьшение церебрального метаболизма глюкозы у пациентов является тесно связанным с когнитивным нарушением.

Поскольку патогенез является неясным, все еще отсутствует эффективный способ лечения AD. Классическая «гипотеза каскада Aβ» всегда является наиболее популярной теорией для объяснения патогенеза AD. На этом основании, разработаны различные модели на трансгенных животных, и проведены эксперименты для разработки лекарственных средств, все из которых, однако, в настоящее время были остановлены на фазе II/III клинических исследований или потерпели неудачу. Другие новые лекарственные средства, такие как ингибирующие аномальное накопление белка Tau, также не достигли желательных результатов. Существует множество факторов, ограничивающих прогресс исследований применительно к механизму и лекарственному средству для AD, первым из которых является выбор мишени для лекарственного средства. AD представляет собой заболевание с различными патофизиологическими изменениями, лекарственное средство против одиночной мишени не может полностью остановить прогрессирование заболевания, и является необходимой разработка новых терапевтических мишеней. Кроме того, существующие модели на животных для исследования AD в основном разработаны на основании генетического фона, и чтобы быть более точными, они представляют собой модели гипотезы каскада Aβ, а не модели AD на животных, и не могут полностью симулировать множественные патофизиологические изменения в головном мозге при AD; и для лекарственных средств, подтвержденных как эффективные в существующих моделях на животных, не могли достигнуть ожидаемых результатов в клинических исследованиях. В настоящее время является неотложной проблемой нахождение подходящих моделей на животных для AD.

Сущность изобретения

В свете этого, конкретный вариант осуществления изобретения относится к применению TPK в качестве новой мишени в лечении или предотвращении болезни Альцгеймера, конкретные технические решения этого являются следующими:

Применение гена или белка TPK в качестве мишени в лечении или предотвращении болезни Альцгеймера.

Необязательно, с использованием гена или белка TPK в качестве мишени, стимулируют активность киназы и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге.

Применение гена или белка TPK в качестве мишени в лекарственном средстве для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера, или в скрининге или получении лекарственного средства.

Необязательно, лекарственное средство, с использованием гена или белка TPK в качестве мишени, стимулирует активность киназы и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге.

Применение реагента, стимулирующего активность киназы и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, в получении лекарственного средства для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера.

Необязательно, реагент, стимулирующий активность киназы и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, представляет собой реагент, регулирующий белок TPK и/или реагент, регулирующий ген TPK.

Лекарственное средство для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера, которое, с использованием гена или белка TPK в качестве мишени, стимулирует активность киназы и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге.

Применение гена или белка TPK в качестве мишени в конструировании модели на животных болезни Альцгеймера.

Способ конструирования модели на животных, где модель на животных конструируют посредством нокаута гена TPK у животного-мишени.

Необязательно, животное-мишень представляет собой грызуна.

Необязательно, грызун представляет собой мышь.

Необязательно, экзон 4 в гене TPK подвергают нокауту.

Необязательно, способ включает следующие стадии: конструирование нацеливающего вектора TPK-loxp для нокаута гена, введение нацеливающего вектора в животное-мишень для получения TPK-loxP+/+ животного-мишени.

Необязательно, последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.

Необязательно, способ дополнительно включает стадии: скрещивания TPK-loxP+/+ животного-мишени с CamK2α-Cre/ERT2+/- животным-мишенью, получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ животного-мишени с условным нокаутом гена TPK.

Применение модели на животных, полученной посредством вышеуказанного способа, для конструирования модели на животных в исследовании нейродегенеративного заболевания с отличной от лечения заболевания целью.

Необязательно, нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

Способ конструирования нацеливающего вектора для модели на животных, где бактериальную искусственную хромосому используют в качестве вектора, прямые последовательности loxP вставляют на обоих концах последовательности, гомологичной экзону гена TPK, вместе с последовательностью гена устойчивости к неомицину.

Необязательно, экзон представляет собой экзон 4.

Необязательно, последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.

Нацеливающий вектор сконструирован посредством вышеупомянутого способа для конструирования нацеливающего вектора для модели на животных.

Изобретение относится к новой терапевтической мишени для AD, конкретный вариант осуществления изобретения может, посредством стимуляции активности киназы и/или уровня экспрессии белка TPK в головном мозге, лечить или предотвращать симптомы AD, вызванные посредством ингибирования на уровне белка TPK, такие как нарушение метаболизма тиамина, нарушение метаболизма глюкозы, вызывающие когнитивную регрессию, потерю нейронов, активацию глиальных клеток, дисфункцию синапсов, увеличенное накопление Aβ, увеличенное аномальное фосфорилирование белка Tau и т.д. Применительно к ограничению существующих моделей на животных для исследования AD и недостаткам современных моделей на животных с недостаточностью тиамина, способом конструирования модели на животных из конкретного варианта осуществления изобретения конструируют новую модель на животных с церебральной недостаточностью тиамина посредством нокаута гена TPK, в которой можно индуцировать снижение церебрального метаболизма глюкозы, вызывающее когнитивную регрессию, потерю нейронов, активацию глиальных клеток, дисфункцию синапсов, увеличенное накопление Aβ, увеличенное аномальное фосфорилирование белка Tau и т.д. Модель на животных может симулировать подобные AD хронические, множественные патофизиологические изменения, и может быть использована для исследования роли недостаточности TDP и нарушения метаболизма глюкозы при возникновении и развитии AD, так же как корреляции между различными патофизиологическими изменениями при AD, имеет очень важную научную значимость и практическую ценность для расширения исследования AD, изучения патогенеза AD, поиска новых молекулярных маркеров для диагностики заболевания и терапевтических мишеней для лекарственных средств, и т.д.

Краткое описание чертежей

Для более ясной иллюстрации примеров по изобретению или технических решений из предшествующей области техники, чертежи, предназначенные для использования в примерах, кратко представлены следующим образом.

На фиг. 1 показано сравнение уровней TDP, TMP и TM в головном мозге, крови, печени и почке у мышей из модели TD в примере 1.

На фиг. 2 показано сравнение уровней TDP, TMP и TM в головном мозге, крови, печени и почке у мышей из модели PTD в примере 1.

На фиг. 3 показано сравнение активности фермента TPK в головном мозге и крови, печени и почке у нормальных мышей в примере 1.

На фиг. 4 показана карта плазмиды для нацеливающего вектора, используемого в примере 2, на которой Amp представляет собой последовательность гена устойчивости к ампициллину, NotI представляет собой участок-мишень рестрикционной эндонуклеазы, 3’-плечо и 5’-плечо представляют собой гомологичные последовательности, фланкирующие экзон 4, кассета Neo представляет собой кодирующую последовательность гена устойчивости к неомицину, последовательность loxP предназначена для локализации и нацеливания на фрагмент, подлежащий нокауту, Frt представляет собой участок узнавания для Flp для разрезания последовательности Neo.

На фиг. 5 показана краткая блок-схема для получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ мышей в примере 2, в которой 1 представляет собой электротрансформацию полученным нацеливающим вектором эмбриональной стволовой клетки; 2 представляет собой отбор корректных положительных клонов; 3 представляет собой скрещивание с мышами Flp для удаления последовательности Neo и получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ мышей.

На фиг. 6 показано влияние нокаута гена TPK на экспрессию TPK и TDP, в которой a показывает сравнительную модель на мышах в экспериментах, в которых мыши WT представляют собой TPK^fl/fl мышей, т.е., TPK-loxP+/+ мышей, CamkII-KO мыши представляют собой CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ мыши представляют собой мышей с нокаутом TPK; b показывает структуру гена с нокаутом TPK-flox мыши; c-d показывают сравнение уровней экспрессии фермента TPK у CamkII-KO мышей и мышей WT; e-f представляют собой сравнения уровней TDP, TMP и TM у CamkII-KO мышей и мышей WT; g-i показывают CamK2α-Cre/ERT2+/-, полученных посредством скрещивания CamK2α-Cre/ERT2+/- мышей с мышами Ai9 с репортером люциферазой; Cre в основном экспрессирован в кортексе и гиппокампе у мыши Ai9, но не в мозжечке и стволе головного мозга.

На фиг. 7 показаны результаты тестов FDG-PET, нарушенной толерантности к глюкозе, так же как изменений массы тела и уровня глюкозы в крови натощак, проведенных через 1, 2, 2,5 месяцев после индуцированного тамоксифеном нокаута гена TPK в примере 2, соответственно, в котором a-f представляют собой оценки FDG-PET изменений метаболизма глюкозы в областях головного мозга через 1, 2, 2,5 месяцев после индуцированного тамоксифеном нокаута гена TPK; g-j представляют собой нарушенную толерантность к глюкозе через 1, 2, 2,5 месяцев после индуцированного тамоксифеном нокаута гена TPK; k-l представляют собой изменения массы тела и уровня глюкозы в крови натощак через 1, 2, 2,5 месяцев после индуцированного тамоксифеном нокаута гена TPK.

На фиг. 8 показаны результаты нарушения гликолиза и цикла трикарбоновых кислот после нокаута гена TPK в примере 2.

На фиг. 9 показаны результаты патологического тестирования до и после нокаута гена TPK в примере 2, в котором a-c показывают изменения в области площади поверхности кортекса и массы у мышей с нокаутом гена TPK; d показывает изменение в нейроне у мышей с нокаутом гена TPK; e показывает результат изменения положительных по Tunel клеток у мышей с нокаутом TPK; f показывает результаты оценки когнитивного нарушения в Y-образном лабиринте у мышей с нокаутом TPK.

На фиг. 10 показаны результаты патологических изменений в Aβ и tau, вызванных до и после нокаута гена TPK в примере 2, в котором a-c показывают детекцию посредством ELISA уровней растворимого и нерастворимого Aβ40 и Aβ42, так же как соотношение Aβ40/Aβ42 до и после нокаута гена TPK; d-e показывают изменения в уровне экспрессии белка и уровне мРНК APP и Bacel в гиппокампе и кортексе до и после нокаута гена TPK при детекции посредством WB и RT-ПЦР; f показывает изменения уровня фосфорилированного Tau в кортексе и гиппокампе до и после нокаута гена TPK посредством детекции иммунофлуоресцентного окрашивания.

На фиг. 11 показан результат ответа нейровоспаления и дисфункции кровеносного сосуда, вызванного до и после нокаута гена TPK в примере 2, в котором a-d показывают активацию и пролиферацию клеток микроглии и астроцитов в кортексе и гиппокампе мыши до и после нокаута гена TPK посредством IHC детекции; e-f показывают уровни мРНК Ibal и GFAP в гиппокампе и кортексе мыши до и после нокаута гена TPK при детекции посредством RT-ПЦР; g-j показывают морфологию кровеносного сосуда и подтекание IgG из кровеносного сосуда в кортексе и гиппокампе мыши до и после нокаута гена TPK при детекции посредством иммунофлуоресцентного окрашивания.

На фиг. 12 показана плазмида для сверхэкспрессии TPK в примере 3.

На фиг. 13 показаны результаты детекции посредством WB для плазмиды для сверхэкспрессии TPK и ее контрольной группы на линии клеток HEK293-APP через 24 час и 48 час в примере 3.

Конкретные варианты осуществления

Пациенты с AD имеют множество каскадных патофизиологических изменений в головном мозге, где нарушение церебрального метаболизма глюкозы является их постоянным патофизиологическим признаком, который является тесно связанным с когнитивной регрессией, и появляется за много лет до клинических симптомов. Глюкоза является первичным энергетическим субстратом для клеток в головном мозге, и промежуточные продукты метаболизма глюкозы также предоставляют субстраты для синтеза нейротрансмиттеров. Церебральный метаболизм глюкозы в основном включает два процесса, которые представляют собой трансмембранный транспорт и внутриклеточный метаболизм глюкозы, соответственно. Нарушение внутриклеточной утилизации глюкозы у пациентов с AD в основном вызвано уменьшенной активностью ключевых ферментов в метаболизме глюкозы, т.е., уменьшенной активностью транскетолазы, пируватдегидрогеназы и α-кетоглутаратдегидрогеназы. Тиаминдифосфат (TDP), первичная активная форма тиамина, является общим коферментом для этих трех ключевых ферментов и играет важную роль в метаболизме глюкозы. Уменьшение активности трех вышеуказанных ключевых ферментов и значительная потеря TDP являются специфическими и универсальными у пациентов с AD, которые не присутствуют у пациентов с сосудистой деменцией, лобно-височной деменцией и болезнью Паркинсона. Тиаминпирофосфаткиназа (TPK) является не только ключевым ферментом для синтеза TDP, но также критическим фактором для поддержания гомеостаза уровня TDP в головном мозге. Авторы настоящего изобретения, посредством дополнительных исследований, обнаружили, что снижение церебрального метаболизма глюкозы, вызванное недостаточностью TDP, является ассоциированным с возникновением AD, и AD является ассоциированным с экспрессией белка TPK. Кроме того, ингибирование уровня белка TPK в головном мозге посредством нокаута гена TPK может явно приводить к нарушению метаболизма тиамина, нарушению метаболизма глюкозы, и более важно, может неожиданно индуцировать подобное AD нейродегенеративное заболевание, энцефалатрофию, патологические изменения в Aβ и tau, нейровоспаление и нейроваскулярное нарушение. Таким образом, ген или белок TPK играет очень важную роль при AD, и таким образом, является новой мишенью для лечения и предотвращения AD. AD, вызванную посредством ингибирования белка TPK, можно предотвращать посредством стимуляции активности киназы и/или уровня экспрессии белка TPK в головном мозге с геном или белком TPK в качестве мишени, таким образом, предотвращения. Модель на животных, полученную с использованием способа конструирования модели на животных посредством нокаута гена TPK у животного-мишени, можно использовать в исследовании нейродегенеративных заболеваний, в частности, исследовании болезни Альцгеймера, включая исследования с целью лечения заболевания и с отличной от лечения заболевания целью. Исследования с отличной от лечения заболевания целью в модели на животных могут конкретно включать, например, 1) исследование и/или изучение механизма нейродегенеративных заболеваний; 2) получение и/или скрининг продуктов, способных лечить нейродегенеративные заболевания; 3) поиск и подтверждение молекулярных маркеров, способных диагностировать и/или предполагать нейродегенеративные заболевания.

В конкретном варианте осуществления изобретения, стимуляция уровня экспрессии белка TPK в головном мозге включает, но без ограничения, предотвращение ингибирования экспрессии белка TPK, увеличение уровня экспрессии белка TPK, увеличение активности белка TPK или увеличение стабильности белка TPK.

В конкретном варианте осуществления изобретения, реагент, стимулирующий уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, может представлять собой реагент, регулирующий белок TPK, и может также представлять собой реагент, регулирующий ген TPK. Реагент включает, но без ограничения, ускоритель, агонист, активатор для стимуляции уровня экспрессии белка TPK в головном мозге. Реагент может представлять собой соединение, химическую малую молекулу, биомолекулу и т.п., конкретно, например, реагенты, регулирующие белок TPK, такие как связывающий TPK белок, химический агонист для TPK или ферментов для модификации TPK и т.п., реагенты, регулирующие ген TPK, такие как вещество, активирующие репликацию или транскрипцию гена TPK, вещество, увеличивающее экспрессию гена TPK, осуществляющее повышающую регуляцию средство, стимулирующее промотор гена TPK, белок для специфической сверхэкспрессии гена TPK.

В конкретном варианте осуществления изобретения, лекарственное средство может содержать безопасную и эффективную дозу реагента, стимулирующего уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтический препарат обычно соответствует введению, лекарственная форма препарата может представлять собой препарат для инъекции, пероральный препарат (таблетку, капсулу, пероральный раствор), чрескожный препарат или препарат с замедленным высвобождением.

В конкретном варианте осуществления изобретения, животное-мишень представляет собой не относящееся к человеку животное, включая примата или грызуна и т.д., и кроме того, мышь. Экзон 4 в гене TPK подвергают нокауту в этом способе, для мыши, ген TPK имеет всего 9 экзонов, ATG локализован в экзоне 2, терминирующий кодон локализован в экзоне 9, и экзон 4 выбирают в качестве мишени для нокаута, с одной стороны, подвергнутая нокауту последовательность экзона не является целым кратным трем, и является способной приводить к мутациям сдвига рамки считывания в нижележащей рамке считывания; с другой стороны, чем ближе выбранный экзон локализован к участку инициации трансляции, тем меньшая функция гена может быть сохранена.

Конкретный вариант осуществления изобретения, в котором модифицированную систему рекомбиназы Cre-loxP можно использовать для получения модели на животных для условного нокаута гена TPK, включает стадии: конструирования нацеливающего вектора для нокаута гена TPK-loxP, введения нацеливающего вектора в животное-мишень для получения TPK-loxP+/+ животного-мишени, скрещивания TPK-loxP+/+ животного-мишени с CamK2α-Cre/ERT2+/- животным-мишенью, получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ животного-мишени с условным нокаутом гена TPK. В частности, бактериальную искусственную хромосому можно использовать в качестве вектора, и прямые последовательности loxP и последовательность гена устойчивости к неомицину можно вставлять фланкирующими гомологичную последовательность подходящего экзона; нацеливающим вектором трансформируют эмбриональную стволовую (ES) клетку посредством электротрансформации; клетку ES, трансформированную с использованием корректной последовательности, локализованной в корректном участке, идентифицируют посредством скрининга по устойчивости к антибиотику, ПЦР и Саузерн-блоттинга; положительный клон микроинъецируют в бластоцисту животного-мишени; и бластоцисту после успешной инъекции имплантируют в матку животного-мишени для получения химерного животного-мишени с интегрированной клеткой ES; полученное химерное животное-мишень скрещивают с животным-мишенью с инструментом Flp, последовательность гена устойчивости к неомицину вырезают посредством индукции, и TPK-loxP+/+ животное-мишень с потенциалом к нокауту можно получать после очистки; животное-мишень с инструментом Cre с CamK2α в комбинации с мутантным рецепторным элементом эстрогена (LBD-ER) отбирают для скрещивания с вышеуказанным TPK-loxP+/+ животным-мишенью; и после идентификации, получают имеющее стабильное наследование CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ животное-мишень.

В конкретном варианте осуществления изобретения, настоящее изобретение относится к способу конструирования нацеливающего вектора для модели на животных, в котором бактериальную искусственную хромосому используют в качестве вектора, и прямые последовательности loxP вставляют на обоих концах последовательности, гомологичной экзону гена TPK, вместе с последовательностью гена устойчивости к неомицину.

В конкретном варианте осуществления способа конструирования нацеливающего вектора для модели на животных по изобретению, экзон представляет собой экзон 4, и конструируют следующую последовательность-мишень: «5’-гомологичное плечо-loxP-экзон 4-frt-Neo-frt-loxP-гомологичное плечо-3’».

В конкретном варианте осуществления способа конструирования нацеливающего вектора для модели на животных по изобретению, последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.

В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение относится также к нацеливающему вектору для модели на животных, полученному посредством способа конструирования нацеливающего вектора для вышеуказанной модели на животных.

Изобретение далее проиллюстрировано в связи со следующими примерами.

Пример 1

Эксперименты проводили в простой модели диеты с недостаточностью тиамина (TD) и диеты с недостаточностью тиамина в комбинации с моделью инъекции пиритиамина (PTD), соответственно. Отслеживали динамические изменения в моделях TD и PTD. Шесть групп (n=4), включая TD 11 суток, 18 суток, 26 суток и PTD 7 суток, 11 суток, организовали для сравнения. Выбирали мышей C57 в возрасте 3 месяцев, рожденных в одни и те же сутки и имеющих сходную массу тела. Различные временные точки для начала получения моделей выбирали в зависимости от группировки, и получения моделей окончательно завершали на одни и те же сутки, так же как отбор образцов. Модели TD: получение моделей в течение 11 суток, 18 суток и 26 суток, соответственно, с использованием нормальной питьевой воды и диеты с недостаточностью тиамина; модели PTD: получение моделей в течение 7 суток и 11 суток, соответственно, с использованием нормальной питьевой воды, диеты с недостаточностью тиамина, и ежесуточной внутрибрюшинной инъекции 0,1 мг/мл PT (пиритиамина) в дозе 500 мкг/(кг∙сут.); контрольная группа: нормальная питьевая вода, нормальный корм, и внутрибрюшинная инъекция нормального солевого раствора. После завершения получения моделей, мышей подвергали анестезии посредством ингаляции изофлурана, глаза извлекали, образцы крови отбирали в пробирки с антикоагулянтом гепарином, которые затем быстро переворачивали для перемешивания. Равный объем 7,5% PCA добавляли к 150 мкл цельной крови, что перемешивали на встряхивателе. Мышей быстро умерщвляли посредством смещения шейных позвонков на льду, и отбирали образцы тканей головного мозга, почки, печени и т.п., и взвешивали. Массу тканей регистрировали. Ткани смешивали с KH2PO4 в соотношении ткань (мг):KH2PO4 (мкл)=100:900, измельчали в течение 90 с использованием измельчителя ткани, при 70 Гц, подвергали воздействию ледяной бани после полного измельчения в течение 30 мин, и сохраняли при -80°C до использования. Уровни TDP, TMP и TM (тиамина) определяли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. В моделях TD и PTD, сравнения активности TDP, TMP и TM в головном мозге, крови, печени и почке у мышей показаны на фиг. 1 и фиг. 2, и сравнение активности TPK в головном мозге, крови, печени и почке у нормальных мышей показано на фиг. 3.

В соответствии с вышеуказанными экспериментами, обнаружено на моделях TD, что, по сравнению с кровью, печенью и почкой, признак значимо более медленного уменьшения уровня TDP проявлялся в головном мозге, указывая на защиту против потери TDP в головном мозге (см. фиг. 1). В моделях PTD, PT, специфический ингибитор для TPK, может нарушать гомеостаз TDP в организме, особенно уровень TDP в головном мозге (см. фиг. 2). Обнаружено посредством дополнительной детекции активности тиаминпирофосфокиназы (TPK) в различных тканях нормальных мышей, что активность TPK являлась наивысшей в головном мозге (фиг. 3), и таким образом, можно предположить, что высокая активность TPK, специфическая для ткани головного мозга, являлась ключевой для поддержания гомеостаза TDP в головном мозге.

Пример 2

1. Конструирование нацеливающего вектора

Бактериальную искусственную хромосому (BAC) использовали в качестве вектора, и последовательность-мишень «5’-гомологичное плечо-loxP-экзон 4-frt-Neo-frt-loxP-гомологичное плечо-3’», сконструированную с использованием интронов, фланкирующих экзон 4, в качестве гомологичных плеч, вставляют для конструирования нацеливающего вектора для нокаута гена (см. фиг. 4).

2. Конструирование CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ мышей (см. фиг. 5)

Получение и скрининг TPK-floxP+/- эмбриональных стволовых клеток

(1) Получение эмбриональных стволовых клеток (ES) мышей

Первичные эмбриональные фибробласты мыши, в форме трофобластов, инокулировали в чашки, обработанные 0,1% желатином на сутки перед сутками размораживания клеток ES, и культивировали в культуральном бульоне с LIF, добавленным в концентрации 1000 ед./мл.

(2) Электротрансформация клеток ES

1. Клетки ES расщепляли панкреатином, с последующим ресуспендированием в PBS (приблизительно 2*10^7/мл), и помещали на лед;

2. Линеаризованный нацеливающий вектор (45 мкг) смешивали с 1 мл клеток, и загружали в резервуар для электропорации, и электротрансформировали с параметрами 600 В, 25 мкФ, 10 мс;

3. Клетки после электротрансформации инокулировали в чашки с трофобластами с полной конфлюэнтностью, и помещали в инкубатор при 37°C, бульон для скрининга клеток, содержащий G418 (280 мкг/мл), добавляли для замены через 24 час.

(3) Отбор и амплификация положительного клона ES

Отбор клонов начинали через несколько суток культивирования, отдельные недифференцированные клоны ES отбирали под микроскопом с небольшим увеличением и помещали в 96-луночный планшет для последующего культивирования; каждый клон разделяли на два, один подвергали криоконсервированию, и другой переносили в 24-луночный планшет для амплификации и пассирования.

(4) Идентификация подвергнутых нацеливанию клеток ES посредством ПЦР и Саузерн-блоттинга

Положительные клоны, устойчивые к G418, отбирали и амплифицировали, и геномную ДНК выделяли, ферментно расщепляли, и анализировали полосы после электрофореза в агарозном геле. Затем Саузерн-блоттинг проводили с использованием зондов, нацеленных на 5’- и 3’-концы экзона 4 Tpk, идентификацию проводили в соответствии с различиями между полосами между контрольными и подвергнутыми нацеливанию клетками ES. Где,

праймеры для идентификации посредством ПЦР представляли собой:

Праймеры Последовательность(5’-->3’) TpkloxP Прямой GTCACTTGAATATACCACAGTTCCCAG (SEQ ID NO.2) Обратный CATATTGGCACACTACCCTGGAT (SEQ ID NO.3) Tpk loxP-1 Прямой GCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA (SEQ ID NO.4) Обратный GACCACCAAACAGCATACACCAGCT (SEQ ID NO.5)

Праймеры для получения 5’- и 3’-зондов для Саузерн-блоттинга представляли собой:

Праймеры Последовательность(5’-->3’) Праймер для 5’-зонда Прямой ATCTTTCCAGTGTCTCATTC (SEQ ID NO.6) Обратный TACTTCTTGTTTCGGTCTT (SEQ ID NO.7) Праймер для 3’-зонда Прямой GGATGTTGGCATTGAAGC (SEQ ID NO.8) Обратный GATTTTAGGAGACGAGCA (SEQ ID NO.9)

Конструирование TPK-floxP химерной мыши посредством микроинъекции бластоцисты

(1) Получение бластоцисты мыши

Отбирали самок мышей C57BL/6 в возрасте 4 недель, и внутрибрюшинно инъецировали с использованием 10 IU гонадотропина в полдень. 10 IU хорионического гонадотропина человека инъецировали через 48 час, и самок мышей помещали в клетки вместе с самцами мышей. На утро следующих суток, у самок мышей проверяли копулятивные пробки (регистрировали как 0,5 суток), и самок мышей с копулятивными пробками умерщвляли через 3 суток, и матки извлекали, и бластоцисты вымывали с использованием бульона BMOC-3. Бластоцисты переносили в капли бульона, накапанные на чашку 60 мм, которые покрывали минеральным маслом. Микроинъекцию проводили после размножения бластоцеля.

(2) Микроинъекция бластоцисты

Подготавливали удерживающие пипетки и инъекционные пипетки для микроинъекции. Свежий бульон добавляли для замены к клеткам ES для инъекции за 3 час до инъекции. Суспензию отдельных клеток получали при расщеплении панкреатином. Небольшие и круглые клетки ES с блестящей поверхностью отбирали для инъекции, каждый эмбрион инъецировали с использованием 12~15 клеток ES, инъецированные бластоцисты, как правило, восстанавливали свою нормальную морфологию после 1 час культивирования, бластоцисты, имеющие интактную морфологию, отбирали для трансплантации.

(3) Трансплантация бластоцисты

Получение псевдобеременных мышей: самок мышей белой породы Kunming скрещивали с подвергнутыми вазолигированию самцами мышей и проверяли по образованию копулятивных пробок на следующие сутки (регистрировали как 0,5 суток). Псевдобеременных мышей можно использовать для трансплантации эмбриона через двое суток. Псевдобеременных мышей подвергали анестезии с использованием изофлурана, операцию на спинном отделе проводили для переноса 10 подвергнутых инъекции бластоцист в одну сторону матки. Если хирургическая трансплантация была успешной, новорожденные мыши могут быть рождены через 17 суток, возможно визуально определять, в соответствии с цветом шерсти через несколько суток, были ли получены TPK-floxP химерные мыши с интегрированными подвергнутыми нацеливанию ES клетками, и степень химерности оценивали в соответствии с соотношением коричневой шерсти ко всей шерсти.

Получение TPK-loxP+/+ химерной мыши

Полученных TPK-floxP химерных мышей скрещивали с мышами с инструментом Flp, фермент инструмента Flp может индуцировать расщепление последовательности Neo в участке Frt, и Tpk-loxP+/+ гомозиготных мышей с потенциалом к нокауту можно получать после очистки.

Получение CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ мышей

(1) Tpk-loxP+/+ мышей получали посредством вышепомянутой операции и подтверждали возможность достижения нокаута Tpk;

(2) Tpk-loxP+/+ мышей скрещивали с CamK2α-Cre/ERT2+/- мышами для получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; Tpk-loxP+/+ мышей, которых генетически идентифицировали, и затем разводили.

Праймеры для идентификации:

Праймеры Последовательность (5’-->3’) JD-TPK Прямой GAA TTC CAA AGC CAG CAT GT (SEQ ID NO.10) Обратный CCA CTC ACA GAC CCT TTG CA (SEQ ID NO.11) JD-CamK2α Прямой GAC AGG CAG GCC TTC TCT GAA (SEQ ID NO.12) Обратный CTT CTC CAC ACC AGC TGT GGA (SEQ ID NO.13)

Фенотип мышей, имеющих условный нокаут гена TPK

Нокаута гена TPK специфически в кортексе и гиппокампе достигали посредством скрещивания с CamkII-Cre/ERT2+/- мышами, и мышам в возрасте 3 месяцев внутрибрюшинно инъецировали тамоксифен для индукции нокаута гена TPK. Проводили фенотипирование мышей с нокаутом гена TPK, результаты которого показаны на фиг. 6-11.

Со ссылкой на фиг. 6, церебральный уровень белка TPK и уровень TDP можно было значимо уменьшать через 2,5 месяца после индукции тамоксифеном нокаута гена TPK, без влияния на уровень тиамина. Со ссылкой на фиг. 7, FDG-PET проводили через 1, 2, 2,5 месяцев после индукции тамоксифеном нокаута гена TPK, соответственно, обнаружено посредством анализа глюкозы в крови и теста толерантности к глюкозе, что мыши с нокаутом TPK имели значительное нарушение церебрального метаболизма глюкозы, дисгомеостаз периферической глюкозы и нарушение толерантности к глюкозе. Со ссылкой на фиг. 8, исследование метаболома показало, что нокаут гена TPK вызывал нарушение гликолиза и цикла трикарбоновых кислот. Со ссылкой на фиг. 9, патологическая детекция показала, что нокаут гена TPK может значительно вызывать церебральную атрофию, большую потерю синапсов и нейронов, увеличение количества положительных по Tunel клеток, конденсацию хромосом и кариопикноз. Со ссылкой на фиг. 10, патологические исследования Aβ и tau, которые являются необходимыми для AD, показали, что нокаут гена TPK может значимо увеличивать продукцию Aβ40 и Aβ42, увеличения в основном достигали посредством увеличения экспрессии APP и уровня белка Bace1, и увеличения фосфорилирования белка Tau. Со ссылкой на фиг. 11, воспалительный ответ играл важную роль в возникновении и развитии AD, и также обнаружено что присутствовали значительная активация астроцитов и микроглиальных клеток и увеличенная экспрессия фактора воспаления в кортексе и гиппокампе головного мозга у мышей с нокаутом гена TPK; в то же время, нокаут гена TPK приводил к нейроваскулярному нарушению и увеличенной проницаемости сосудов. В заключение, нокаут гена TPK, ключевого фермента для регуляции гомеостаза TDP в головном мозге, может приводить к значительному нарушению метаболизма тиамина, нарушению метаболизма глюкозы, и более важно, может неожиданно индуцировать подобное AD нейродегенеративное заболевание, энцефалатрофию, патологические изменения в Aβ и tau, нейровоспаление и нейроваскулярное нарушение.

Пример 3

Информация об антителах в этом примере являлась следующей:

Наименование антитела Источник Компания Каталожный # Разведение Очищенное (свободное от азида)против β-амилоида H6,клон:6E10 (первичное антитело) Мышь Biolegend 803003 1:2000 Антитело против GAPDH (первичное антитело) Кролик Wabways 1:2000 1:3000 Меченное HRP антитело козы против антитела мыши (вторичное антитело) Коза и мышь Beyotime A0216 1:1000 Меченное HRP антитело козы против антитела кролика (вторичное антитело) Коза и кролик Beyotime A0208 1:1000

Информация о реагентах в этом примере являлась следующей:

Наименование реагента Компания Каталожный # Партия # PMSF (100 Мм) Beyotime ST506 / Буфер для нанесения белка в SDS-PAGE (5X) Beyotime P0015L / Предварительно окрашенный белковый маркер (19-117 кДа) Beyotime P0066 / Предварительно окрашенная белковая лестница PageRuler™ Thermo 26616 00766861 Набор для анализа концентрации белка BCA (включая белковый маркер) Beyotime P0012S 080719191115 Набор для быстрого приготовления геля для SDS-PAGE Beyotime P0012AC P0012AC Порошок полученных способом теплового шока бычьей сыворотки/альбумина Equitech-Bio. Inc BAH67-0500 #1367 Буфер для лизиса клеток для Вестерн-блоттинга и IP Beyotime P0013 092919200101 DMEM Gibco 11965-092 1967762 0,25% Трипсин-ЭДТА Gibco 25200-056 / Opti-MEM I Среда с пониженным уровнем сыворотки, без фенола красного Gibco 11058-021 1967656 Липофектамин 2000 Invitrogen 11668-019 2001808 FBS Gibco 10099-141 1932595 Субстрат ECL для Вестерн-блоттинга Pierce 32109 UA277602

1. Конструирование плазмиды для сверхэкспрессии TPK

Последовательности TPK человека амплифицировали посредством ПЦР с кДНК, полученной посредством обратной транскрипции из клеток HEK 293 человеческого происхождения, и продукт амплификации ПЦР расщепляли с использованием рестрикционных эндонуклеаз (5': BamHI-HF (Буфер 4), 3': ClaI (Буфер 4+BSA)), и целевого фрагмента последовательности гена TPK1 732 п.о. (NM_022445) (SEQ ID NO.14). Восемь повторов метки Myc вставляли с C-конца кодирующей последовательности для получения TPK1-Myc, целевой фрагмент клонировали в вектор pCS2, и таким образом, конструировали плазмиду для сверхэкспрессии TPK (см. фиг. 12).

Праймеры для амплификации ПЦР:

Прямой праймер: AT-GGATCC(BamHI)-ACCATGGAGCATGCCTTTACCCCG (SEQ ID NO.15);

Обратный праймер: AT-ATCGAT(ClaI)-GGCTTTTGATGGCCATGGTCCA (SEQ ID NO.16).

2. Клетки HEK293-APP и культивирование

1) Клетки HEK293-APP культивировали в 10 см чашках, и среду в чашке удаляли при по меньшей мере 90% конфлюэнтности адгерентных клеток. Адгерентные клетки осторожно промывали с использованием 1 мл предварительно нагретого до 37°C буфера 1XPBS, с последующим удалением PBS, и затем, 1 мл предварительно нагретого до 37°C трипсина-ЭДТА с масс-объемной процентной концентрацией 0,25% добавляли в чашку, которую затем осторожно встряхивали, для полного контакта расщепляющего раствора с адгерентными клетками. Клетки HEK293-APP помещали при комнатной температуре, только приблизительно 2-4 мин было необходимо для расщепления.

2) 4 мл предварительно нагретой до 37°C среды DMEM, содержащей 10% FBS (объемная процентная концентрация) добавляли для остановки расщепления, с последующим осторожным пипетированием вверх и вниз. Суспензию клеток HEK293-APP собирали, и центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин.

3) Супернатант отбрасывали, и клетки HEK293-APP осторожно пипетировали вверх и вниз для диспергирования с использованием 1 мл наконечника, соответственно.

4) В соответствии с требованиями эксперимента, клетки HEK293-APP из 3) инокулировали в 12-луночные планшеты при 150000 клеток/лунку, после 2-суточного культивирования, клетки адгерентно вырастали до 75-85% конфлюэнтности, и затем проводили следующий эксперимент липосомной трансфекции.

3. Эксперимент липосомной трансфекции

1) Плазмиду извлекали с -20°C, растворяли при нормальной температуре, и центрифугировали при 13000 об./мин, комнатной температуре, в течение 3 мин.

2) Составление раствора плазмиды: X806 (плазмиду для сверхэкспрессии TPK (1,218 мкг/мкл)) и контр. плазмиду (пустую контрольную плазмиду (1,21 мкг/мкл)) предварительно смешивали со средой opti-MEM, соответственно, при масс-объемном соотношении 1:50.

3) Получение раствора липосом: липофектамин 2000 смешивали со средой opti-MEM в соответствии с масс-объемным соотношением 1:50.

4) Равные объемы раствора плазмиды и раствора липосом смешивали, и помещали при комнатной температуре на 20 мин для формирования комплекса плазмиды и липосомы. Смесь являлась стабильной в течение 6 часов.

5) Смесь добавляли в 12-луночный культуральный планшет, всего 150 мкл на лунку. Смесь пипетировали вверх и вниз, или планшет встряхивали вперед и назад, для избегания скопления.

6) Клетки HEK293-APP с добавленной смесью плазмиды-липосомы помещали в инкубатор с диоксидом углерода на 24 час и 48 час, с последующим сбором, обработкой и тестированием образцов белка из клеток.

4. Сбор и обработка образцов белка из клеток HEK293-APP

Клетки HEK293-APP, трансфицированные с использованием липосом, культивировали в течение 24 час и 8 час, с последующей промывкой клеток 3 раза с использованием предварительно нагретого до 37°C 1x PBS. PBS отбрасывали, и 100 мкл раствора для лизиса RIPA (содержащего ингибитор протеаз PMSF) добавляли в каждую лунку 12-луночного культурального планшета. Раствор для лизиса RIPA полностью приводили в контакт с клетками, с последующим помещением на лед на 5 мин. Клетки соскребали с использованием скребка для клеток или наконечника и затем собирали в пробирку, которую центрифугировали при 4°C, 13000 об./мин в течение 15 мин. Преципитат отбрасывали, супернатант белка собирали, концентрацию белка в нем определяли с использованием набора BCA, и затем экспрессию целевого белка детектировали посредством Вестерн-блоттинга.

5. Детекция посредством Вестерн-блоттинга

Сверхэкспрессию плазмиды TPK в линии клеток HEK293-APP в течение 24 час (TPK OVER-1) и 48 час (TPK OVER-1) детектировали посредством WB. Конкретный способ детекции являлся следующим.

1) Получение геля: верхний гель (масс-объемная процентная концентрация составляла 5%); нижний гель (масс-объемная процентная концентрация составляла 10%).

2) Электрофорез: 1 X рабочий буфер, прогон при 90 В в течение 20-30 мин и затем прогон при 120 В в течение 60-90 мин.

3) Перенос на мембрану: мембрану PVDF помещали в метанол для активации, с последующим переносом белка из полиакриламидного геля на твердую подложку, мембрану PVDF, при постоянной силе тока 400 мА в течение 100 мин.

4) Реакция с антителом: PVDF блокировали с использованием 5% BSA (масс-объемная процентная концентрация в TBST) в течение 2 часов, и добавляли первичное антитело, с последующим помещением при 4°C на ночь. После 3 промывок с использованием 1 X TBST в течение 10 мин, мембрану PVDF инкубировали с вторичным антителом, которое разводили с использованием 5% BSA (в TBST) в течение 2 часов при комнатной температуре, с последующими 3 промывками с использованием 1 X TBST в течение 10 мин.

5) Раствор для проявления ECL: проявление проводили с использованием люминесцентного устройства CLiNX (CLiNX, Chemi scopeseries 6000).

T-критерий использовали для статистического анализа. Результаты теста WB показали, что экспрессия белка APP в клетках HEK293-APP была значимо уменьшена, и значимые различия наблюдали при всех сравнениях (*p < 0,05; **p < 0,01) (см. фиг. 13).

Можно наблюдать, что сверхэкспрессия TPK может уменьшать уровни экспрессии белка APP в клетках HEK293-APP, уровни белка APP были уменьшены с значимым различием в группах как 24 час, так и 48 час, по сравнению с нулевой контрольной группой, что показывает, что плазмида для сверхэкспрессии TPK может ингибировать уровень экспрессии белка APP в клетках HEK293-APP. Таким образом, сверхэкспрессия TPK может уменьшать уровень экспрессии белка APP в клетках HEK293-APP.

Вышеупомянутое представляет собой просто предпочтительные варианты осуществления изобретения. Следует отметить, что специалист в данной области может дополнительно модифицировать и совершенствовать настоящее изобретение, не выходя за рамки принципа изобретения, что также можно считать находящимся в рамках объема изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SHANGHAI RAISING BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

<120> Применение TPK в качестве мишени при болезни Альцгеймера

<130> OP200755

<141> 2020-07-20

<150> 201910711540.3

<151> 2019-08-02

<150> 202010038537.2

<151> 2020-01-14

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13237

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60

attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120

gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180

caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240

ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300

cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360

agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420

cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgaat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg gtacgcggcc 660

gcgtttgggg gatgggagtc agtgaggaca tcctcttaga aacaggggaa gaggagtgga 720

ctgaggaaca gttggaggac agaacaaact ggagggggat agcgactggg ctggaaaaaa 780

gaagagatta aagtcaaaaa taatgactaa agccaaatgt agtgacacgt ttctgtagtc 840

ctataatgta ggaggctgat tctggaagat cacatattca aacaagtagc atactagtgt 900

atatagaaac aacttccttg gtggtaggat atgaggccta ttgaatagtc atcagtgttt 960

acatgatagt catgtatgca tgctatgttt ttttctatta ctatatgtat gcaataacaa 1020

ttatccttat gcttaccatc ttgtctatgt agacaagaat ttatattgtc tatctaggat 1080

ttctgcatca cagaggaagc acagtttaaa atactgtaat gtacagttgt ctgttcattt 1140

acacatattc ctcggcatct cccctcttgc tttatctaca ttgcctttct gtcatttctg 1200

gatatttatg ttaattggtg gcatacacca tagtaatttt ggtgattttc cattaaaatc 1260

agagctgtag ggattagttt aaaatcattg tgctagtcag aattcataga tactgggacc 1320

aaaatcgaac tccagtgttc ttttaagtca ctaaaatgtc gagatctttt ttttcttcct 1380

ctctacctcc tcctcttttt tttttcatat aaatacttgg aattacttta ataatatact 1440

ttgcagtaag tgaaattatt tctcttcagt tttattcaac agaagatttt gaaatagcca 1500

atttacctgt agttgtaagt acagttcttt tttttgttgt tgttaatatt gctaaatgct 1560

gagttaaaaa acaacactta agatatcttt aacattctca gagttccttc gatagaacag 1620

ttgttccagt ggtttttagt gtgttttagt tttcacatgt ttatcaacct gaagcacagt 1680

aaataattct tcaaccatta ccagacaatc tgcaaaaaat ttgctgtata agctaatgaa 1740

catttgacat taagagctaa ctcatgcagt aatgcttagg acaatgtaaa ttatgatgaa 1800

tggatatttt gggaccaatt tattgtgatt tatctgacgc ttcctttagc atgccctcca 1860

tttcggggtc tgttacatca tctttctctt tattggttat atgtattgca tgttttttaa 1920

attgcctcgt gtgaacctgt gctatcactg cttgctatat tcttcaaata ttttattttg 1980

caattaattt tatttatatg tttgtaaaat ttgaaaatag ttttttgaat aaagttttta 2040

aaaagtaaag aaaattttta tggtacctta taggaatcaa attgttctga aagcgaattc 2100

ttttcccttc agaaggaata tatccacatt tctaacttat gtgtaacaag aggatagtct 2160

gtacatttcc ttagttatta ttctcagttt ctacttataa ccttgataat atggataaat 2220

ttagttactg tttgtctttc ataagtttcc ctaaatctat tacataaaat atgttagaaa 2280

taatgtcttc aatttttttt gattgaaaaa ataatgggaa tgttatcaga gatgggtgtg 2340

ttgagtgcct tccggtgtct tcctttgatg ctgcctcttc tgctcattgc aaatgaagct 2400

tttgttagtc tagaggacat acatacattt gcttctcact ccatttcctt ccacagcaac 2460

gtgtgcttgc ataacaacta aacgaaaata acctgtgtct tgtttatttt gttttgtttg 2520

tttgtctgtg atatcactgg ggacaaaacc atgcttcaca aatgctaggt cagcacttta 2580

tcacacatct ttacccccgg ctcttaaaat tacttaaacg ttgaattcag ctgatctttg 2640

ctatgtaata tagtatggaa attgatatca ttatacttgt taatttttac cagttaaaca 2700

ctatttcttt cattttatag tgctttagta aataaatttt tacataaaag atctcaaaaa 2760

cttgttaatt ttgtttatgg agaattactt tttatactct gagggtaatt actgatcgtt 2820

taccatctgt ttctattaat cagtcttttt atgctcccca atcagtgata tttgctattt 2880

tatgtgagtt catttttccc tctccactga tgatgatttt gatatgttgg aaatgtgcca 2940

caaattcaat gaacttctgt tgtattccta gcgtaatatg aacgtgggtt ctagtcatta 3000

taaagtgttt agggtggtta atgaaactag ccacccctct gagttgtttt tatataaact 3060

ctaatttcat ttaatatttt gtagtagctt gggctcttct tttctaaaat gtaaacttct 3120

catattttga aaaattctaa caaaaagcag agaaaactgt ttactgaatg cccagtgtgt 3180

tcatgtgttg tgactagatg taattactaa attactaatt gtttaatgac cctactctgt 3240

agtatagaag ctcaagctaa aacttagtgt tttaccccct tagcctgatt ttgtttcata 3300

tatgacaggg atcacagaat agatagactt tgatgagctt ttcagtctgt ccatagagtt 3360

tgatagctaa ccattgcatt ctctcttctg atgttagcat atcaaaaatt agagttgaat 3420

gttcgaaatc tacttaaata taggtaaatc tgcacacacg atggtgatag gatagttttg 3480

aaaatgaaga attaggtcaa cagagtagtt tgtttcttct gaagctattt ctgtcttagg 3540

catttgctca tgctatgact tagtgtggaa gacgttgaaa ttttggacta ggaaatcagt 3600

tgaatgctgt gagtggaact tattgggctg ttctatttgg agcctggaag agagtgctgt 3660

tgagagtaat acagacagtg gaaacccaca gataggaata aagactctat tagcatttgg 3720

gatacacgct attcatgaaa tattttggaa aaaaaccaat ctggctatat ttttccactt 3780

gcttgagatg taagtaatga actaatttat ttggtggagg aaatttcaag atagcatgaa 3840

tttggggttg tggcatcatt actaccgatt acacttgtat aaatctacaa tgaaaaagta 3900

accaatgtac ttaatagctt ggatcttaat agttgtatag gggcagaaga caagacattg 3960

gtctgttaaa gataaagaaa ttgccatgat atcctgttaa atcaccaata tcgtgcaacc 4020

attcctacac cataggataa aaaaattgat tattcttaac tcctagggca aggatttaaa 4080

aaaaaattaa acgaggccaa ggctctctaa atcaacatga tcgaatctca catgaactct 4140

cagagaacca ggcgctgttc tcagttctgc acaaggtttt ttacatatac attatgactt 4200

tcagtttagt gtttttaatg gaattcctaa gtgtaagaac tagtgggcct tttttcttgt 4260

gccttctctg gggcattttc tttctctctc tctttttttt ttgtctagct ccaatatatt 4320

aatttttgtt ttatctcatt ttattttatt ctaaaaacga agcattaaaa agtagcaaca 4380

aaatgccata aagatccttt cttgaaaatt gatttaatag tttaaaaaca gtaatcttaa 4440

ctactaatat taacacccaa ttattaacat aatattgatg tttgacataa ttgaagagag 4500

gttttataaa ttgcaagaga gttgaaggaa ggtcacatac agaagaaaga caagaatgaa 4560

acatctggag aaaggtcgag ggaaggtaag actgtcccca gaaatgtttc agtggaattc 4620

ccagagacag acaggtaaac aggacagagg atggaaagta attgacttaa gatgacttag 4680

attcatgaga acttgagaga tccgcttcct cagctgtggg gagcacagtc tgcttaggca 4740

taattttgaa gttcaagaca tcagagaaaa ggaagatctt caatgtttct agagggaaga 4800

caaacagagg cacagaactg tgaaacaggc tgtcacttga atataccaca gttcccagta 4860

gaattccaaa gccagcatgt taacatagtc aaagcaactg gctgtcagaa gctgtagcct 4920

gccgtcttta taagcctgaa cccagcttcg gtaataaaag agggagctag cgtcgacacg 4980

tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattactg cgtacgaaaa ggtagaatgt 5040

agagcaggta gctccatatc ttctccacct ctgttcagat ggactggaga agatgcaaag 5100

ggtctgtgag tggttctgtc ttccaatgta gagtcacctg taataacaat agacacgcca 5160

taaggtaaat gtcatgatcc agggtagtgt gccaatatgc tctgagtgtt tgctctttag 5220

tgatgctcac atgacacact gtgctttgct atctctactg acataagatt tgtattcttt 5280

ttgtttgaag ctctcttaag agcctgtgct gatgggggtg ccaaccactt atatgatctc 5340

actgaaggag agagagaaag gtaagctcca gcgagtcagg gtctacatgg tcctcacttc 5400

tgctgctcct tgcttttaat tattctgtgg tgactagttc tttttcttca tattcatcat 5460

aggaaaccac ctctgtgaga gggctgggct gtataaccat gatgcattac ttctttctat 5520

gaatgagatc tcttagaatt aggatcatgt tttgtcttgt ttttaaatct gtattctatt 5580

actttaaagc ctagctaagt cacattatca tgtattgaaa tttatcgata agcttgatat 5640

cgaattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcaggtctga agaggagttt 5700

acgtccagcc aagctagctt ggctgcaggt cgtcgaaatt ctaccgggta ggggaggcgc 5760

ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt tagcagcccc gctgggcact tggcgctaca 5820

caagtggcct ctggcctcgc acacattcca catccaccgg taggcgccaa ccggctccgt 5880

tctttggtgg ccccttcgcg ccaccttcta ctcctcccct agtcaggaag ttcccccccg 5940

ccccgcagct cgcgtcgtgc aggacgtgac aaatggaagt agcacgtctc actagtctcg 6000

tgcagatgga cagcaccgct gagcaatgga agcgggtagg cctttggggc agcggccaat 6060

agcagctttg ctccttcgct ttctgggctc agaggctggg aaggggtggg tccgggggcg 6120

ggctcagggg cgggctcagg ggcggggcgg gcgcccgaag gtcctccgga ggcccggcat 6180

tctgcacgct tcaaaagcgc acgtctgccg cgctgttctc ctcttcctca tctccgggcc 6240

tttcgacctg cagcctgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca tagtataata 6300

cgacaaggtg aggaactaaa ccatgggatc ggccattgaa caagatggat tgcacgcagg 6360

ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 6420

ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 6480

gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct 6540

ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 6600

ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 6660

cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 6720

ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 6780

cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 6840

gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgatgat ctcgtcgtga cccatggcga 6900

tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 6960

ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 7020

agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 7080

ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagggg atcaattctc 7140

tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 7200

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 7260

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 7320

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 7380

ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctcg actagagctt gcggaaccct 7440

tcgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcatca gtcaggtaca taatataact 7500

tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtggatcca ctaggcgcgc ctgaggactt 7560

gaagattggc taaataaacc taaaatggct atttatattg ggattaatac actttaagtg 7620

aaaaaaaaaa aaaaaagcaa ctggactcct agaaaagaaa tagtctgctg tagaaatgtg 7680

aggttttata ttagtgttga ataaatctta gtgtgactta ctgtttctta attacttctg 7740

agttacagac gtatattttt gagacttcat ctaaagaatt gctctctgca atatcttggt 7800

ttcctgacct ttggatggtg agatattttt cagtgagaga acacatttga tagagataga 7860

ttttcaaact agtttagatg tgaaggtgtt tgtggcccaa ctctttttgg aaacacaaga 7920

tttcatggta tagttttgtg tgcagtttgt gaaaactcag tgtttgtaaa tacactgttc 7980

agtcattctc attctcgtat gtgttagtag ctattttgaa agggctggta tttgagaaat 8040

cgcctacttg gcttccaaaa caaaaataaa aatattatgg cataacaggc cctgtgtggg 8100

cactaaacat atgtactttg aaatcatgta tttttctttg taacatcaga atgtctaaca 8160

tcagctttct aatactggaa gtgctgttga gagcagctgg ttgcacgttg tggagaagtc 8220

atgtttcctt tgagatcaga tgctattgct aatgtctgga gactggctgc agttatcaaa 8280

aaggcaataa tagtgacagc ctaggacagt taaatttcat ttgcttattt actgcacaac 8340

tttgcaagtt tctctaccga atacctcaca tggacaatgc ctgaaaaaca tgcaagttgt 8400

tttaaaaagt gccgtggcac atagttcaga acagggaggc atgccatggg gcccagatta 8460

taaagtgggc actgtttgac tcgtgcctac agcctggttg ctaccaagta gttggcactt 8520

aaacactttt tccataatgg tagacacagc tccggaacgt ggcagttgaa catgacctct 8580

ctaatggtag atacaactca agaacataat taaaagcagg acttagcaag cattaactca 8640

gcactttcca cctacttcat gattatgaga accgtctgaa atgattatga aaaattacac 8700

atctttatac tgggtatttt atttagttga gccaagcact ggtagcaaag aaaaaaggga 8760

acacttttat tcatatttca aagcaaaaca ttagtgattt tggaaacaag taacattagt 8820

tttgatatta ttttaattaa tttcaaaata acaatcacat tataaataat ttgttttttt 8880

tttttggctt tcttgttttg ttttttgaga caggttctca ctatatagcc ctggttgtcc 8940

tggaactcac tatgtagacc agtctgactt caaactcaca agctctctgc ctcctgagta 9000

ctgggatcac aggtgttatg cccagtcaaa tttacaaata atcttattga acgcattgag 9060

gaatgtagat aatgtgtctt acaattgttt gtctacacat gaagatgttt agtgaagcaa 9120

tgcagttact actcattgat tttcaggttg gaccgatgct tgcagtgatt cttgctctga 9180

ctcctttgga catggttggc ctggggaagg gtagagtccc tagaagtgac aagtgaaact 9240

aactgctttg catgggaata aaatcctttg aataaatctc attacttcta cgccctaacc 9300

agtaaaacta attggataca ggtgactaca cataattcct cttaattgta ttttttaaca 9360

aaaagccctc acaatgaaaa acaaaataaa caccaacaaa atcctgagct ttaaaaggcc 9420

aaattacaga ttgtgggctg aggctggtct ctcttttttt tttttttttc ttaaatttga 9480

ttttattttt ttcacattcc atattccatt ccccgccccc cccacatcca ccctccaact 9540

gatccacatc ccacacctcc taggatcgcc cgggttgatt cgaggctgct aacaaatcga 9600

gtcgagcatc gagcagtgtg gttttcaaga ggaagcaaaa agcctctcca cccaggcctg 9660

gaatgtttcc acccaatgtc gagcagtgtg gttttgcaag aggaagcaaa aagcctctcc 9720

acccaggcct ggaatgtttc cacccaatgt cgagcaaacc ccgcccagcg tcttgtcatt 9780

ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt cccaggtcca cttcgcatat 9840

taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc agcgacccgc ttaacagcgt 9900

caacagcgtg ccgcagatct tggtggcgtg aaactcccgc acctcttcgg ccagcgcctt 9960

gtagaagcgc gtgccatgga tcctgatgat gttgttgatt cttctaaatc ttttgtgatg 10020

gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat tcaaaaaggt 10080

atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa agggttttat 10140

agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa cccgctctct 10200

ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt tctcgcacta 10260

aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac tgaaccgttg 10320

atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc ttcgcgtgta 10380

gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa taactgggaa 10440

caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg aaaacgtggc 10500

caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt caggcgatct 10560

ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat 10620

ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct 10680

aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa 10740

tgcagatcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 10800

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 10860

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 10920

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 10980

tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc ccgggcggtg gagctccagc 11040

ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 11100

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 11160

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 11220

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 11280

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 11340

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 11400

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 11460

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 11520

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 11580

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 11640

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 11700

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 11760

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 11820

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 11880

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 11940

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 12000

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 12060

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 12120

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 12180

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 12240

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 12300

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 12360

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 12420

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 12480

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 12540

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 12600

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 12660

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 12720

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 12780

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 12840

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 12900

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 12960

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 13020

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 13080

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 13140

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 13200

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 13237

<210> 2

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

gtcacttgaa tataccacag ttcccag 27

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

catattggca cactaccctg gat 23

<210> 4

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

gctgaccgct tcctcgtgct tta 23

<210> 5

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

gaccaccaaa cagcatacac cagct 25

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

atctttccag tgtctcattc 20

<210> 7

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

tacttcttgt ttcggtctt 19

<210> 8

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

ggatgttggc attgaagc 18

<210> 9

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

gattttagga gacgagca 18

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

gaattccaaa gccagcatgt 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

ccactcacag accctttgca 20

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

gacaggcagg ccttctctga a 21

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

cttctccaca ccagctgtgg a 21

<210> 14

<211> 732

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

atggagcatg cctttacccc gttggagccc ctgctttcca ctgggaattt gaagtactgc 60

cttgtaattc ttaatcagcc tttggacaac tattttcgtc atctttggaa caaagctctt 120

ttaagagcct gtgccgatgg aggtgccaac cgcttatatg atatcaccga aggagagaga 180

gaaagctttt tgcctgaatt catcaatgga gactttgatt ctattaggcc tgaagtcaga 240

gaatactatg ctactaaggg atgtgagctc atttcaactc ctgatcaaga ccacactgac 300

tttactaagt gccttaaaat gctccaaaag aagatagaag aaaaagactt aaaggttgat 360

gtgatcgtga cactgggagg ccttgctggg cgttttgacc agattatggc atctgtgaat 420

accttgttcc aagcgactca catcactcct tttccaatta taataatcca agaggaatcg 480

ctgatctacc tgctccaacc aggaaagcac aggttgcatg tagacactgg aatggagggt 540

gattggtgtg gccttattcc tgttggacag ccttgtatgc aggttacaac cacaggcctc 600

aagtggaacc tcacaaatga tgtgcttgct tttggaacat tggtcagtac ttccaatacc 660

tacgacgggt ctggtgttgt gactgtggaa actgaccacc cactcctctg gaccatggcc 720

atcaaaagct aa 732

<210> 15

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

atggatccac catggagcat gcctttaccc cg 32

<210> 16

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

atatcgatgg cttttgatgg ccatggtcca 30

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к применению гена или белка тиаминпирофосфаткиназы (TPK) в качестве мишени для лечения, предотвращения болезни Альцгеймера, в скрининге лекарственного средства для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера, в качестве мишени для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера, а также в конструировании модели на животных болезни Альцгеймера. Также раскрыто применение реагента, стимулирующего активность киназы белка TPK в головном мозге и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения болезни Альцгеймера. Изобретение также относится к лекарственному средству, которое содержит ген ТРК или белок ТРК. Изобретение эффективно для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера. 12 н. и 13 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 пр.

1. Применение гена или белка тиаминпирофосфаткиназы (TPK) в качестве мишени для предотвращения болезни Альцгеймера.

2. Применение гена или белка TPK в качестве мишени для лечения болезни Альцгеймера.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что предотвращение или лечение осуществляют с использованием гена или белка TPK в качестве мишени посредством стимуляции активности киназы белка TPK в головном мозге и/или уровня экспрессии белка TPK в головном мозге.

4. Применение гена или белка TPK в качестве мишени в скрининге лекарственного средства для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера.

5. Применение гена или белка TPK в качестве мишени для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера.

6. Применение по п.4 или 5, отличающееся тем, что лекарственное средство, с использованием гена или белка TPK в качестве мишени, стимулирует активность киназы белка TPK в головном мозге и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге.

7. Применение реагента, стимулирующего активность киназы белка TPK в головном мозге и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, в получении лекарственного средства для предотвращения болезни Альцгеймера.

8. Применение реагента, стимулирующего активность киназы белка TPK в головном мозге и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, в получении лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

9. Применение по п.7 или 8, отличающееся тем, что реагент, стимулирующий активность киназы белка TPK в головном мозге и/или уровень экспрессии белка TPK в головном мозге, представляет собой реагент, регулирующий белок TPK, и/или реагент, регулирующий ген TPK.

10. Лекарственное средство для предотвращения болезни Альцгеймера, отличающееся тем, что лекарственное средство содержит ген ТРК или белок ТРК.

11. Лекарственное средство для лечения болезни Альцгеймера, отличающееся тем, что лекарственное средство содержит ген ТРК или белок ТРК.

12. Применение гена или белка TPK в качестве мишени в конструировании модели на животных болезни Альцгеймера.

13. Способ конструирования модели на животных, отличающийся тем, что модель на животных конструируют посредством нокаута гена TPK у животного-мишени.

14. Способ конструирования модели на животных по п.13, отличающийся тем, что животное-мишень представляет собой грызуна.

15. Способ конструирования модели на животных по п.14, отличающийся тем, что грызун представляет собой мышь.

16. Способ конструирования модели на животных по п.15, отличающийся тем, что экзон 4 в гене TPK подвергают нокауту.

17. Способ конструирования модели на животных по п.13, отличающийся тем, что способ включает стадии: конструирования нацеливающего вектора TPK-loxp для нокаута гена, введения нацеливающего вектора в животное-мишень для получения TPK-loxP+/+ животного-мишени.

18. Способ конструирования моделей на животных по п.17, отличающийся тем, что последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.

19. Способ конструирования модели на животных по п.17, отличающийся тем, что способ дополнительно включает стадии: скрещивания TPK-loxP+/+ животного-мишени с CamK2α-Cre/ERT2+/- животным-мишенью, получения CamK2α-Cre/ERT2+/-; TPK-loxP+/+ животного-мишени с условным нокаутом гена TPK.

20. Способ конструирования нацеливающего вектора для модели на животных, отличающийся тем, что бактериальную искусственную хромосому используют в качестве вектора, прямые последовательности loxP вставляют на обоих концах последовательности, гомологичной экзону гена TPK, вместе с последовательностью гена устойчивости к неомицину.

21. Способ конструирования нацеливающего вектора по п.20, отличающийся тем, что экзон представляет собой экзон 4.

22. Способ конструирования нацеливающего вектора по п.21, отличающийся тем, что последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.

23. Нацеливающий вектор, который представляет собой бактериальную искусственную хромосому, содержащую прямые последовательности loxP, вставленные на обоих концах последовательности, гомологичной экзону гена TPK, вместе с последовательностью гена устойчивости к неомицину.

24. Нацеливающий вектор по п.23, отличающийся тем, что экзон представляет собой экзон 4.

25. Нацеливающий вектор по п.24, отличающийся тем, что последовательность нацеливающего вектора указана в SEQ ID NO. 1.