НАЦЕЛИВАНИЕ НА SRC-3 В ИММУННЫХ КЛЕТКАХ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2024 года по МПК C12N5/783 A61K35/17 A61P35/00 

[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с регистрационным номером 63/106770, поданной 28 октября 2020 г., которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.

Заявление относительно исследований или разработок, спонсируемых Федеральным правительством

[0002] Настоящее изобретение было сделано при поддержке правительства в соответствии с грантом W81XWH-13-1-0285, выданным Министерством Обороны, и в соответствии с грантом HD008188, выданным Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство имеет определенные права на это изобретение.

Область техники

[0003] Варианты осуществления изобретения относятся по меньшей мере к областям биологии клетки, молекулярной биологии, иммунологии и медицины, включая противораковую терапию.

Предпосылки создания изобретения

[0004] Коактиватор стероидных рецепторов-3 (SRC-3) функционирует как ключевой фактор пролиферации рака молочной железы (РМЖ), метастазирования и резистентности к стандартной и эндокринной терапии рака. В качестве онкогена, SRC-3 действует как плейотропный коактиватор ядерных рецепторов и множества других факторов транскрипции, которые управляют программами, необходимыми для пролиферации и метастазирования раковых клеток. Важно отметить, что SRC-3 также играет основную роль в регуляции иммунной системы хозяина.

[0005] Настоящее изобретение направлено на реализацию давно назревшей потребности в разработке эффективных методов лечения рака путем нацеливания на SRC-3 по уникальному механизму.

Краткое описание сущности изобретения

[0006] Настоящее изобретение относится к системам, способам и композициям для лечения, замедления прогрессирования, замедления начала развития или снижения риска возникновения рака любого вида. В своих конкретных вариантах, настоящее изобретение относится к адоптивному переносу клеток, при котором клетки, вводимые индивидууму, нуждающемуся в этом, представляют собой иммунные клетки, которые (1) имеют нарушение экспрессии эндогенного SRC-3; и/или (2) подвергались воздействию одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3. В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммунные клетки представляют собой CD4⁺-клетки включая регуляторные Т-клетки (Treg), которые представляют собой клетки CD4⁺-клетки.

[0007] Существующие в настоящее время ингибиторы иммунных контрольных точек, нацеленные на Treg, в основном присутствуют на поверхностных белках (рецепторах), которые нарушают взаимодействие на клеточной поверхности с другими иммунными клетками. Настоящее изобретение отличается тем, что SRC-3 в качестве мишени гена Treg представляет собой ядерный белок, который функционирует для регуляции программ экспрессии ядерного гена Treg. В настоящей заявке показано, что благодаря роли SRC-3 в качестве основного регулятора транскрипции, его удаление у мыши с генетической моделью может модулировать функцию Treg так чтобы, это способствовало уничтожению опухоли, но позволяло избежать серьезных побочных эффектов, которые часто наблюдаются при введении ингибиторов иммунных контрольных точек. В своих конкретных вариантах, настоящее изобретение относится к CRISPR-опосредованному методу нацеливания на ген SRC-3 в иммунных клетках, включая генетически модифицированные клетки Treg, которые будут использоваться для адоптивного переноса человеку, страдающему раком. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает уникальный способ уничтожения опухоли на основе иммунной системы.

[0008] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к сконструированной иммунной клетке, имеющей нарушение коактиватора-3 стероидного рецептора (SRC-3). В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммунная клетка представляет собой Т-клетку, такую как регуляторная Т-клетка. Т-клеткой может быть CD4⁺-, CD25⁺- и/или ВОХР3⁺-клетка. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нарушение дополнительно определяется как генетическая модификация иммунной клетки, дающая пониженный уровень экспрессии SRC-3 или практически не дающая экспрессии SRC-3. В определенных случаях, иммунную клетку конструируют с использованием одной или нескольких руководящих РНК и фермента Cas9. Иммунная клетка может быть аутологичной, аллогенной или сингенной для индивидуума.

[0009] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей: (а) любую иммунную клетку, описанную в настоящей заявке; и (b) один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3. В некоторых случаях, (а) и (b) находятся в разных составах, хотя они могут находиться в одном и том же составе. В конкретных вариантах осуществления изобретения, агент, нацеленный на SRC-3, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, антитело, белок, нуклеиновую кислоту или их комбинацию. Низкомолекулярный ингибитор SRC-3 может представлять собой буфалин, госсипол, веррукарин A, SI-2, SI-10, SI-12, их функциональное производное или их комбинацию. Антитело может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом, и его конкретные примеры включают 5Е11, LS-C801929, РА1-845, АХ15.3, РА5-29854, EPR4374(3) или их комбинацию.

[0010] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у индивидуума, включающему стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количества любых клеток, описанных в настоящей заявке. Рак может представлять собой SRC-3⁺-рак. Рак может представлять собой рак молочной железы, рак яичников, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак желудка, множественную миелому, рак щитовидной железы или рак поджелудочной железы.

[0011] В некоторых случаях, перед стадией введения, клетки подвергают ex vivo воздействию эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3, таких как низкомолекулярный ингибитор (буфалин, госсипол, веррукарин А, SI-2, SI-10, SI-12, их функциональное производное и их комбинация), антитело (моноклональное антитело или поликлональное антитело или его фрагменты, такие как scFv), белок, нуклеиновая кислота или их комбинации. Специфические антитела включают 5Е11, LS-C801929, РА1-845, АХ15.3, РА5-29854, EPR4374(3) или их комбинацию. В некоторых случаях, индивидууму вводят терапевтически эффективное количество дополнительного противоракового средства, такого как хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия, гормональная терапия, медикаментозная терапия, белковая терапия, иммунотерапия или их комбинации. Дополнительная терапия рака может включать введение одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3. Клеточная и дополнительная противораковая терапия могут быть проведены индивидууму по существу в одно и то же время или в разное время. Клеточную и дополнительную противораковую терапию можно проводить, а можно и не проводить в одном и том же составе. Клетки могут быть введены внутривенно, внутрибрюшинно, внутриартериально, местно, путем ингаляции, внутримышечно, интрастернально, путем внутрисуставной инъекции или инфузии. Клетки могут быть введены один или несколько раз, и если их вводят несколько раз, то продолжительность между введениями составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев.

[0012] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у индивидуума, включающему стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количества любой композиции, описанной в настоящей заявке, включая композицию, которая содержит (а) любую иммунную клетку, описанную в настоящей заявке; и (b) один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3. В таких случаях, (а) и (b) можно вводить, а можно и не вводить индивидууму в различных составах и/или в одно и то же или в разное время. При введении в разное время, продолжительность между введениями (а) и (b) может составлять 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев. Композицию можно вводить индивидууму один или несколько раз, и если композицию вводят индивидууму многократно, то продолжительность между введениями составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев. Рак может представлять собой SRC-3⁺-рак. Рак может представлять собой рак молочной железы, рак яичников, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак желудка, множественную миелому, рак щитовидной железы или рак поджелудочной железы. В отдельных случаях, перед стадией введения, клетки в (а) подвергают ex vivo воздействию эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.

[0013] В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу продуцирования любых иммунных клеток, описанных в настоящей заявке, где указанный способ включает стадию нарушения экспрессии SRC-3 в иммунных клетках.

[0014] Иммунные клетки могут представлять собой Т-клетки, включая Treg. В конкретных случаях, способ дополнительно определяют как: (а) получение CD4⁺-Т-клеток или CD4⁺-Treg, соответственно; и (b) воздействие на CD4⁺-Т-клетки или CD4⁺-Treg, соответственно, одного или нескольких агентов, которые нарушают экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках или Treg, соответственно. В конкретных вариантах осуществления изобретения, Т-клетки или Treg получают из селезенки, костного мозга, крови, плазмы или их комбинации. Этот способ может дополнительно включать стадию получения регуляторных Т-клеток из CD4⁺-Т-клеток. В отдельных случаях, регуляторными Т-клетками являются CD25⁺- и/или Fox3p⁺-клетки. В конкретных случаях, один или несколько агентов, которые нарушают экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках, содержат нуклеиновую кислоту. В конкретных аспектах, один или более агентов, которые нарушают экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках, включают реагенты CRISPR. Этот способ может дополнительно включать стадию воздействия на иммунные клетки ex vivo эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.

[0015] Вышеизложенное описание приводится в общих чертах для пояснения признаков и технических преимуществ настоящего изобретения, чтобы можно было лучше понять сущность изобретения, которая изложена ниже. Далее будут описаны дополнительные признаки и преимущества, которые составляют предмет формулы изобретения. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что раскрытая здесь концепция и конкретные варианты осуществления изобретения могут быть легко реализованы в качестве основы для модификации или разработки других структур для достижения одних и тех же целей, изложенных в настоящей заявке. Специалистам в данной области также должно быть очевидно, что такие эквивалентные конструкции не выходят за рамки существа и объема изобретения, изложенных в прилагаемой формуле изобретения. Новые признаки, которые рассматриваются как характерные для описанных здесь конструкций, как в отношении организации, так и в отношении способа их применения, вместе с дополнительными целями и преимуществами, будут более понятны из нижеследующего описания при их рассмотрении на примере прилагаемых чертежей. Однако, следует четко понимать, что каждый из этих чертежей представлен лишь в целях иллюстрации и описания и не должен рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

[0016] Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся ссылки, которые рассматриваются на примере прилагаемых чертежей.

[0017] Фиг. 1: Комплексное иммунофенотипирование мышей с нокаутом гена Src-3 (KO) выявило обширный лимфоцитоз. Было проведено иммунофенотипирование периферической крови старых (16-20 месяцев) мышей с нокаутом Src-3 (-/-, n=6) и однопометных мышей дикого типа (+/+, n=7). У мышей с нокаутом SRC-3 наблюдалось значительное повышение числа Т- и В-клеток, а также клеток определенных подтипов. При этом, не наблюдалось статистически значимых различий в количествах гранулоцитов, моноцитов, эозинофилов, макрофагов, дендритных клеток и NK-клеток (данные не показаны).

[0018] Фиг. 2А-2В: Экспрессия SRC-3 была сильно обогащена и коррелировала с Foxp3 в регуляторных Т-клетках (Treg). Фиг. 2А: Репрезентативный график интенсивностей зонда Ncoa3 (Src-3) (использовались два зонда) из выбранных тканей на основе геномики BioGPS (10), показал, что Src-3 в высокой степени экспрессируется в линиях Т-клеток с максимальной экспрессией в Foxp3⁺-CD4⁺-Т-клетках (Treg). Фиг. 2В. Корреляция 296 корегуляторов на основе NURSA с экспрессией Foxp3 в Treg была проведена с использованием Immuno-Navigator (12), исходя из базы данных коэкспрессии с коррекцией в зависимости от партии. Ncoa3 в высокой степени коррелирует с экспрессией Foxp3 в Treg.

[0019] Фиг. 3А-3В: SRC-3 регулирует экспрессию FOXP3 в человеческих Treg. Фиг. 3А: Сайленсинг SRC-3 в человеческих Treg (от здорового донора) снижает экспрессию мРНК маркерных генов Treg и медиаторов иммунных контрольных точек. Treg-доноры были инфицированы лентивирусными векторами, экспрессирующими кшРНК, направленную против люциферазы (shLuc) или SRC-3, и уровни мРНК были оценены с помощью ОТ-кол.ПЦР. Фиг. 3В: SRC-3 может стимулировать функцию промотора FOXP3. SRC-3 коактивирует репортерную активность под контролем промотора FoxP3 в анализе методом временной трансфекции. Клетки 2 93Т трансфицировали репортерной люциферазой под контролем промотора FoxP3 (любезно предоставленной Лабораторией GR Lee, Hwang et al. 2016, Nat. Commun.) с увеличивающимися концентрациями экспрессионной плазмиды SRC-3.

[0020] Фиг. 4А-4С: Опухоли Е0771 ВС удаляли у генетически модифицированной мыши-модели, где SRC-3 был специфически делетирован в клетках Treg, экспрессирующих Foxp3. Фиг. 4А: Мышей с Floxed SRC-3 подвергали возвратному скрещиванию в течение 10 поколений с фоном C57BL/6J и скрещивали с мышью, нокаутированной по Foxp3-EGFP/CRE/ERT2 также на фоне C57BL/6J. Обработка тамоксифеном приводила к активации Cre и вырезанию экзонов 11 и 12 гена SRC-3. Фиг. 4 В: Контрольным мышам C57BL/6J и мышам с нокаутом TregrSRC вводили тамоксифен в течение пяти дней, а затем, еще через три недели вводили 1×10⁶ опухолевых клеток Е0771 ВС, экспрессирующих люциферазу, в очищенные жировые тельца молочных желез. Фиг. 4С: Объем опухоли измеряли в течение 32-дневного периода (слева). Справа показаны изображения опухолей и селезенки по окончании исследований.

[0021] Фиг. 5: Количественное определение мРНК SRC-3 (NcoA3) в общей массе Т-лимфоцитов после нацеливания на ген SRC-3 на основе CRISPR. Для анализа, проводимого с помощью ОТ-кол.ПЦР как описано выше, использовали следующие праймеры. Праймеры NCoA3 (зонд 103): слева: AAG ACT СТТ TAG GAC CGC ТТТ ТАС Т (SEQ ID NO: 1); справа: АСА CTG CGC CAT GGT ТАА Т (SEQ ID NO: 2). Праймеры GAPDH (зонд 52): слева: GGG ТТС СТА ТАА ATA CGG ACT GC (SEQ ID NO: 3); справа: CCA ТТТ TGT СТА CGG GAC GA (SEQ ID NO: 4). (PE-) означает клетки, не являющиеся мишенью; (РЕ+) означает клетки-мишени для гена SRC-3.

[0022] Фиг. 6: Экспериментальная конструкция мышей с адоптивной моделью опухоли клеток Treg с нокаутом SRC-3.

[0023] Фиг. 7А-7В: Адоптивный перенос клеток Treg с нокаутом SRC-3 удаляет опухоли Е0771. Фиг. 7А: Опухолевые клетки карциномы молочной железы Е0771, меченные люциферазой, имплантировали в очищенные жировые тельца мышей C57BL/6 дикого типа. После этого, животным (по 2 на экспериментальную группу) вводили Treg с нокаутом SRC-3, контрольные (Cont) Treg или Treg вообще не вводили (без ACT, что соответствует клеткам дикого типа), и рост опухоли контролировали с помощью визуализации опухоли под действием люциферазы. Удаление опухолей у животных, которым вводили Treg с нокаутом SRC-3, отмечено стрелками. Количественная визуализация опухоли под действием люциферазы показана на фиг. 7В.

Подробное описание изобретения

I. Примеры определений

[0001] В соответствии с принятым соглашением в области патентного права, артикли «а» и «an», если они употребляются в настоящем описании вместе со словом «содержащий» включая формулу изобретения, означают «один или более». Следует также отметить, что используемые в описании и в прилагаемой формуле изобретения артикли «а» и «an» и «the», употребляемые с существительными в формах единственного числа, могут также относиться и к существительным во множественном числе, если из контекста описания не следует иное. Так, например, термин «нуклеиновая кислота» включает множество нуклеиновых кислот, включая их смеси. Некоторые варианты осуществления изобретения могут состоять или по существу состоять из одного или нескольких элементов, стадий способа и/или способов согласно изобретению. Предполагается, что любой способ или композиция, описанные в настоящей заявке, могут быть реализованы вместе с любыми другими способами или композициями, описанными в настоящей заявке, и что различные варианты осуществления изобретения могут быть объединены.

[0002] Во всем описании настоящей заявки, если из контекста не следует иное, то слова «содержать», «содержит» и «содержащий» следует понимать как подразумевающие включение указанной стадии или указанного элемента, или группы стадий или элементов, но не исключение любоой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов. Под термином «состоящий из» подразумевается включение всего, что следует за фразой «состоящий из» и ограничивается ими. Таким образом, словосочетание «состоящий из» указывает на то, что перечисленные элементы являются обязательными или необходимыми, и при этом, никакие другие элементы не могут присутствовать. Под словосочетанием «состоящий в основном из» подразумевается включение любых элементов, перечисленных после этого словосочетания, и при этом, могут присутствовать и другие элементы, которые не мешают функционированию или действию, указанному в описании для перечисленных элементов, или не способствуют ему. Таким образом, выражение «состоящий в основном из» указывает на то, что перечисленные элементы являются обязательными или необходимыми, но никакие другие элементы не являются необязательными и могут присутствовать или отсутствовать в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов.

[0003] Термины «или» и «и/или» используются здесь для описания нескольких компонентов в комбинации или отдельно. Так, например, «х, у и/или z» может относиться только к «х», только к «у», только к «z», «х, у и z», «(x и у) или z», «х или (у и z)» или «х или у или z». В частности, предполагается, что х, у или z могут быть специально исключены из варианта осуществления изобретения.

[0004] В настоящей заявке, термин «приблизительно» используется в соответствии с его простым и обычным значением в области биологии клетки и молекулярной биологии и указывает на то, что значение включает среднеквадратическое отклонение для метода, применяемого для определения такого значения.

[0005] Используемый здесь термин «один вариант осуществления изобретения», «вариант осуществления изобретения», «конкретный вариант осуществления изобретения», «родственный вариант осуществления изобретения», «определенный вариант осуществления изобретения», «дополнительный вариант осуществления изобретения» или «другой вариант осуществления изобретения» или их комбинации означает, что конкретный признак, структура или свойство, описанные в отношении варианта осуществления изобретения, включены по меньшей мере в один вариант осуществления изобретения. Таким образом, наличие приведенных выше фраз в различных местах данного описания не обязательно относится к одному и тому же варианту осуществления изобретения. Кроме того, конкретные признаки, структуры или свойства могут быть объединены любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления изобретения.

[0006] Используемый здесь термин «нарушение» или «изменение» гена относится к устранению или к уменьшению экспрессии одного или нескольких генных продуктов, кодируемых рассматриваемым геном, в клетке по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствии такого изменения. Примеры генных продуктов включают мРНК и белковые продукты, кодируемые геном. Изменение в одних случаях является временным или обратимым, а в других случаях, постоянным. В некоторых случаях, происходит изменение функционального или полноразмерного белка или мРНК, несмотря на то, что может быть получен усеченный или нефункциональный продукт. В некоторых вариантах осуществления изобретения, активность или функция гена, в отличие от экспрессии, являются нарушенными. Нарушение или изменение гена обычно индуцируют искусственными способами, то есть, добавлением или введением соединения, молекулы, комплекса или композиции и/или изменением нуклеиновой кислоты гена или нуклеиновой кислоты, связанной с этим геном, например, на уровне ДНК. Типичные способы изменения генов включают сайленсинг генов, нокдаун, нокаут и/или методы изменения генов, такие как редактирование генов. Примерами являются технологии с использованием антисмысловых последовательносей, таких как РНКи, киРНК, кшРНК и/или рибозимы, которые обычно приводят к временному снижению экспрессии, а также методы редактирования генов, которые приводят к целевой инактивации или изменению генов, например, путем индуцирования разрывов и/или гомологичной рекомбинации. Примеры включают инсерции, мутации и/или делеции. Нарушения или изменения обычно приводят к подавлению и/или к полному прекращению экспрессии нормального продукта или продукта «дикого типа», кодируемого геном. Примерами таких нарушений или изменений генов являются инсерции, сдвиг рамки считывания и миссенс-мутации, делеции, нокин и нокаут гена или части гена, включая делеции всего гена. Такие изменения могут происходить в кодирующей области, например, в одном или нескольких экзонах, что будет приводить к невозможности продуцирования полноразмерного продукта, функционального продукта или любого продукта, например, путем встраивания стоп-кодона. Такие изменения могут также возникать в результате изменений в промоторе или в энхансере или в другой области, влияющих на активацию транскрипции, что позволяет предотвратить транскрипцию гена. Нарушения или изменения генов включают нацеливание на гены, в том числе инактивацию целевых генов путем гомологичной рекомбинации.

[0007] Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые без исключения водные растворители (например, воду, спиртовые/водные растворы, физиологические растворы, носители для парентерального введения, такие как хлорид натрия, декстроза Рингера и т.п.), безводные растворители (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат), дисперсионные среды, материалы для покрытий, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные или противогрибковые средства, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и инертные газы), агенты, придающие изотоничность, агенты, замедляющие всасывание, соли, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие вещества, эксципиенты, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подсластители, ароматизаторы, красители, вещества, пополняющие запас жидкостей и питательных веществ, такие как вещества и их комбинации, известные специалистам в данной области. рН и точная концентрация различных компонентов в фармацевтической композиции регулируются в соответствии с хорошо известными параметрами.

[0008] Используемый здесь термин «субъект» обычно относится к индивидууму, нуждающемуся в лечении. Субъектом может быть любое животное, которое является объектом для проведения метода или введения материала, включая млекопитающих, например, человека, лабораторных животных (например, приматов, крыс, мышей, кроликов), домашний скот (например, коров, овец, коз, свиней, индеек и кур), домашних питомцев (например, собак, кошек и грызунов), лошадей и трансгенных животных, не являющихся человеком. Индивидуумом может быть пациент, например, страдающий заболеванем или пациент, у которого подозревается наличие заболевания (которое можно назвать патологическим состоянием), такого как рак одного или более видов. Индивидуумом может быть индивидуум, который проходит или уже прошел курс противораковой терапии. По меньшей мере в некоторых вариантах осуществления изобретения, термин «индивидуум» может быть использован как синоним. Рассматриваемые здесь «субъект» или «индивидуум» могут находиться, а могут и не находиться в медицинском учреждении и могут проходить лечение амбулаторно. Индивидуум может заказать одну или несколько медицинских композиций через Интернет. Индивидуумом может быть человек любого возраста или животное, не являющееся человеком, а поэтому индивидуумами могут быть как взрослые, так и молодые (например, дети) и младенцы, а также индивидуумы, находящиеся в утробе матери. Человек может быть любого пола, расы или этнической принадлежности.

[0009] «Терапия» или лечение заболевания или состояния относится к выполнению протокола, который может включать введение пациенту одного или нескольких лекарственных средств с целью облегчения признаков или симптомов заболевания, включая рак. Желаемые эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования заболевания, облегчение или смягчение болезненного состояния, ремиссию или улучшение прогноза. Облегчение может происходить до появления признаков или симптомов заболевания или состояния, а также после их появления. Таким образом, «лечение» или «терапия» может включать «профилактику» или «предупреждение» заболевания или нежелательного состояния. Кроме того, «лечение» или «терапия» не требует полного облегчения признаков или симптомов, не требует излечения, а в частности, включает протоколы, оказывающие лишь незначительное влияние на пациента.

[0010] Термин «терапевтическая польза» или «терапевтически эффективный», используемый в настоящей заявке, относится ко всему, что способствует или улучшает самочувствие индивидуума после медикаментозного лечения этого состояния. Этот термин включает, но не ограничивается ими, снижение частоты или тяжести признаков или симптомов заболевания. Так, например, лечение рака может включать уменьшение размера опухоли, снижение инвазивности опухоли, снижение скорости роста раковой опухоли, профилактику метастазирования или отсрочку начала метастазирования. Лечение рака может также относиться к увеличению продолжительности жизни индивидуума, больного раком.

II. Варианты осуществления изобретения

[0011] Настоящее изобретение относится к способам и композициям для эффективной терапии рака, включая терапию рака, которая позволяет избежать серьезных осложнений для проходящего лечение индивидуума. В конкретных вариантах осуществления изобретения, терапия включает модификацию иммунных клеток, в том числе ex vivo, и введение модифицированных иммунных клеток индивидууму с раком. В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммунные клетки представляют собой Т-клетки определенного типа, такие как Treg, и их модификация была сделана так, чтобы стандартная функция Treg не подвергалась нежелательному воздействию.

[0012] Конкретные варианты осуществления изобретения охватывают SRC-3 в качестве ключевой мишени в иммунных клетках, включая по меньшей мере Treg. Что касается Treg, то специфическое нарушение, нацеленное на компартмент, приводит к уничтожению опухоли по меньшей мере у сингенной модели раковой опухоли молочной железы, как показано в настоящей заявке. Ключевое отличие, которое отличает настоящую стратегию нарушения SRC-3 в Treg от других ингибиторов иммунных контрольных точек, заключается в том, что SRC3 является ядерным белком, и модификации согласно изобретению модулируют функцию Treg без потери всей активности Treg, которая, в других случаях, может привести к серьезным побочным эффектам. Кроме того, в настоящем изобретении предложен метод специфического удаления SRC3 ex vivo в Т-клетках посредством нацеливания на гены на основе CRISPR. Так, например, в своих конкретных вариантах, применяемых к человеческим CD4⁺-лимфоцитам, настоящее изобретение относится к способам введения адоптивных терапевтических средств на основе Т-клеток/Treg для лечения рака.

III. Иммунные клетки

[0013] В настоящем изобретении, иммунные клетки модифицируют для нарушения экспрессии эндогенного SRC-3, что позволяет клеткам быть эффективными для лечения рака у реципиента этих клеток. Хотя иммунные клетки могут быть любого типа, однако, в конкретных вариантах осуществления изобретения, они представляют собой Т-клетки любого типа, включая по меньшей мере Treg и В-клетки.

[0014] Варианты осуществления изобретения включают модификации Т-клеток, в том числе Treg, в которых модификация все еще позволяет Т-клеткам выполнять желаемые функции (для Treg, регулировать иммунный ответ на собственные и чужеродные частицы (антигены)). Следовательно, способы и композиции, описанные в настоящей заявке, обеспечивают терапию рака, которая имеет пониженный риск токсичности по сравнению с другими видами терапии с использованием модифицированных Т-клеток, включая модифицированные регуляторные Т-клетки.

[0015] В способах и композициях согласно изобретению могут быть использованы Т-клетки любого типа. Термин «Т-клетка» относится к Т-лимфоцитам и включает, но не ограничивается ими, CD4⁺-Т-клетки, CD8⁺-Т-клетки, γ:δ⁺-Т-клетки или NK-T-клетки. CD4⁺-Т-клетки включают клетки ТН0, ТН1 и ТН2, а также регуляторные Т-клетки (Treg). Существует по меньшей мере три типа регуляторных Т-клеток: CD4⁺-CD25⁺-Treg, CD25-TH3-Treg и CD25-TR1-Treg. «Цитотоксическая Т-клетка» относится к Т-клетке, которая может уничтожать другую клетку. Большинство цитотоксических Т-клеток представляют собой Т-клетки, рестриктированные по CD8⁺-MHC класса I, однако, некоторые цитотоксические Т-клетки представляют собой CD4⁺-Т-клетки. В конкретных вариантах осуществления изобретения, Т-клетка согласно изобретению представляет собой CD4⁺-клетку.

[0016] Любые используемые здесь Т-клетки могут быть отобраны по одному или нескольким специфическим маркерам и/или могут быть отобраны против одного или нескольких специфических маркеров. Могут быть проведены любые стадии отбора, например, позитивного отбора, негативного отбора или того и другого. В конкретных вариантах осуществления изобретения, Treg представляют собой CD4⁺-, CD25⁺- и/или FOXP3⁺-клетки. В отдельных случаях, Treg представляют собой CD4⁺-, CD25⁺- и FOXP3⁺-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения, Treg представляют собой клетки, содержащие CTL-ассоциированный белок 4 (CTLA4)⁺, хемокиновый рецептор С-С типа 7 (CCR7)⁺ и/или антигенный лиганд CD62 (CD62L)⁺. Эти клетки также включают Treg, которые вследствие нарушения гена SRC-3, впоследствии перестают экспрессировать FOXP3, CD25 и/или CD4.

[0017] В некоторых вариантах осуществления изобретения, нацеливание на иммунные CD4⁺-клетки, включая CD4⁺-Т-клетки, проводят с применением способов и композиций согласно изобретению для нарушения экспрессии SRC-3, и по меньшей мере в некоторых случаях, из них могут быть дополнительно отобраны Treg для использования в качестве терапевтических клеток. В альтернативных случаях, различные CD4⁺-клетки модифицируют и совместно используют в качестве терапевтических клеток без проведения дополнительной стадии выделения Treg.

[0018] В случаях, когда используются Т-клетки, источником Т-клеток может быть любой подходящий источник, включая селезенку, костный мозг, кровь, плазму или их комбинацию. В некоторых случаях, Т-клетки могут быть закуплены. В любом случае, Т-клетки могут быть аутологичными по отношению к реципиенту или аллогенными или сингенными по отношению к реципиенту. Т-клетки могут быть подвергнуты манипуляции до проведения стадии конструирования клеток в целях нарушения SRC-3. В некоторых случаях, клетки обрабатывают из источника, например, для удаления нежелательных компонентов. Клетки могут быть подвергнуты воздействию одной или нескольких композиций, которые усиливают их активность у индивидуума перед использованием, например, воздействию одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3, или других композиций, таких как один или несколько цитокинов и/или один или несколько факторов роста. Клетки могут подвергаться воздействию одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3, до, во время и/или после проведения стадий модификации для нарушения экспрессии SRC-3.

IV. Модификация экспрессии генов

[0019] В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммунные клетки согласно изобретению модифицируют для изменения экспрессии SRC-3, и такое конструирование клеток может быть осуществлено любым подходящим способом. Сконструированные клетки генетически модифицируют так, чтобы они не экспрессировали или имели сниженную экспрессию эндогенного SRC-3 в клетках. Снижение экспрессии может достигать уровня, при котором ее невозможно обнаружить стандартными методами.

[0020] В некоторых вариантах осуществления изобретения, экспрессию измененного гена осуществляют путем нарушения гена, такой как нокаут, инсерция, миссенс-мутация или мутация со сдвигом рамки считывания, например биаллельная мутация со сдвигом рамки считывания, делеция всего гена или его части, например, одного или несколько экзонов или их частей, и/или нокин. Так, например, на экспрессию измененного гена можно воздействовать специфичными к последовательности нуклеазами или нуклеазами-мишенями, включая ДНК-связывающие нуклеазы-мишени, такие как нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и нуклеазы, действующие под контролем РНК, такие как CRISPR-ассоциированная нуклеаза (Cas), специально разработанная для нацеливания на последовательность гена SRC-3 или его часть.

[0021] В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение экспрессии, активности и/или функции гена осуществляют путем нарушения гена. В некоторых аспектах, ген был модифицирован таким образом, чтобы его экспрессия снижалась по меньшей мере или приблизительно на 20, 30 или 40%, а в основном по меньшей мере или приблизительно на 50, 60, 70, 80, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более по сравнению с экспрессией в отсутствии модификации гена или в отсутствии компонентов, введенных для осуществления модификации.

[0022] В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение является временным или обратимым, а поэтому экспрессия гена восстанавливается позднее. В других вариантах осуществления изобретения, изменение не является обратимым или временным, например, оно является постоянным.

[0023] В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение гена осуществляют путем индуцирования одного или нескольких двухцепочечных разрывов и/или одного или нескольких одноцепочечных разрывов в гене SRC-3, а обычно, путем нацеливания. В некоторых вариантах осуществления изобретения, двухцепочечные или одноцепочечные разрывы происходят под действием нуклеазы, например, эндонуклеазы, такой как нуклеаза, нацеленная на ген. В некоторых аспектах, разрывы индуцируются в кодирующей области гена, например, в экзоне SRC-3. Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, индуцирование происходит вблизи N-концевой части кодирующей области SRC-3, например, в первом экзоне, во втором экзоне или в последующем экзоне.

[0024] В некоторых аспектах, двухцепочечные или одноцепочечные разрывы подвергаются репарации посредством процесса клеточной репарации, такого как негомологичное соединение концов (NHEJ) или репарация на основе гомологии (HDR). В некоторых аспектах, процесс репарации подвержен ошибкам и приводит к нарушению гена, такой как мутация со сдвигом рамки считывания, например, двуаллельная мутация со сдвигом рамки считывания, которая может привести к полному нокауту гена SRC-3. Так, например, в некоторых аспектах, нарушению включает индуцирование делеции, мутации и/или инсерции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нарушение приводит к образованию раннего стоп-кодона. В некоторых аспектах, наличие инсерции, делеции, транслокации, мутации со сдвигом рамки считывания и/или преждевременного стоп-кодона приводит к нарушению экспрессии, активности и/или функции гена.

[0025] Любой(ые) агент(ы) для нарушения экспрессии SRC-3 может (могут) быть доставлен(ы) в клетки-реципиенты, такие как иммунные клетки, которые включают Т-клетки любого типа, включая Treg, и любым подходящим способом. В конкретных вариантах осуществления изобретения, агент(ы) может (могут) быть доставлен(ы) путем нуклеофекции любого типа, с использованием липофектина, посредством электропорации любого типа, с использованием катионных полимеров, невирусных векторов (таких как плазмиды), вирусных векторов (включая аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы или аденоассоциированные вирусные векторы), носителей на основе циклоамилозы, наночастиц любого типа (включая металлические, неорганические или полимерные наночастицы, полученные с использованием PLGA/PLA или на основе DODAP), липополиплексов и т.п.

[0026] В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение гена достигается с применением методов с использованием антисмысловых последовательностей, таких как РНК-интерференция (РНКи), короткая интерферирующая РНК (киРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК) и/или рибозимы, используемые для селективного подавления или для подавления экспрессии гена. Технология на основе киРНК представляет собой РНКи, в которой используется молекула двухцепочечной РНК, имеющая последовательность, гомологичную нуклеотидной последовательности мРНК, которая транскрибируется из гена, и последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности. киРНК обычно гомологична/комплементарна одной области мРНК, которая транскрибируется с гена, или может представлять собой киРНК, включающую множество молекул РНК, которые гомологичны/комплементарны различным областям. В некоторых аспектах, киРНК содержится в полицистронной конструкции.

[0027] Ниже приводятся примеры модификации клеток для нарушения экспрессии SRC-3:

A. ZFP И ZFN

[0028] В некоторых вариантах осуществления изобретения, нацеленная на ДНК молекула, которая нацелена на SRC-3, включает ДНК-связывающий белок, такой как один или несколько белков «цинковых пальцев» (ZFP) или белков, подобных активаторам транскрипции (TAL), слитых с эффекторным белком, таким как эндонуклеаза. Примеры включают ZFN, TALE и TALEN.

[0029] В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула, нацеленная на ДНК, содержит один или несколько белков «цинковых пальцев» (ZFP) или их доменов, которые связываются с ДНК по последовательность-специфическому механизму. ZFP или его домен представляет собой белок или домен в более крупном белке, который связывается с ДНК по последовательность-специфическому механизму посредством одного или нескольких «цинковых пальцев», областей аминокислотной последовательности внутри связывающего домена, структура которых стабилизируется за счет координации иона цинка. «ДНК-связывающий белок «цинковый палец» часто сокращенно называют белком «цинковый палец» или ZFP. Среди ZFP существуют искусственные домены ZFP, нацеленные на специфические последовательности ДНК, обычно длиной 9-18 нуклеотидов, генерируемые посредством сборки отдельных «пальцев».

[0030] ZFP включают те ZFP, в которых один пальцеобразный домен имеет длину приблизительно 30 аминокислот и содержит альфа-спираль, включающую два инвариантных гистидиновых остатка, координированных посредством цинка с двумя цистеинами одного бета-витка, и имеющую два, три, четыре, пять или шесть «пальцев». Обычно, специфичность ZFP к последовательности может быть изменена путем замены аминокислот в четырех положениях спирали (-1, 2, 3 и 6) на спирали распознавания «цинковых пальцев». Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, ZFP или молекула, содержащая ZFP, не встречаются в природе, то есть, их конструируют для связывания с выбранным сайтом-мишенью.

[0031] В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула, нацеленная на ДНК, представляет собой или содержит ДНК-связывающий домен с «цинковыми пальцами», слитый с доменом расщепления ДНК с образованием нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN). В некоторых вариантах осуществления изобретения, слитые белки содержат домен расщепления (или полудомен расщепления) по меньшей мере от одного рестриктирующего фермента типа HS и один или несколько доменов, связывающих «цинковые пальцы», которые могут быть сконструированы, а могут быть и не сконструированы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, домен расщепления происходит от рестриктирующей эндонуклеазы типа liS Fok I. Fok I обычно катализирует расщепление двухцепочечной ДНК на расстоянии 9 нуклеотидов от ее сайта узнавания на одной цепи и 13 нуклеотидов от ее сайта узнавания на другой цепи.

[0032] Многие геноспецифические сконструированные «цинковые пальцы» имеются в продаже. Так, например, компания Sangamo Biosciences (Richmond, СА, USA) разработала платформу (CompoZr) для конструирования цинковых пальцев в партнерстве с сотрудниками компании Sigma-Aldrich (St. Louis, МО, USA), что позволило исследователям обойти процесс конструирования и подтверждения «цинковых пальцев» в целом, и получить специфически нацеленные «цинковые пальцы» для нескольких тысяч белков (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). В некоторых вариантах осуществления изобретения используются коммерчески доступные «цинковые пальцы», либо их получают по индивидуальному заказу (См., например, каталожные номера Sigma-Aldrich CSTZFND, CSTZFN, CTil-lKT и PZD0020).

В. TAL, TALE И TALEN

[0033] В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула, нацеленная на ДНК SRC-3, содержит встречающийся в природе или сконструированный (не встречающийся в природе) ДНК-связывающий домен белка, подобного активатору транскрипции (TAL), например, в эффекторном белке, подобном активатору транскрипции (TALE), см., например, публикацию патента США №2011/0301073, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.

[0034] ДНК-связывающий домен TALE или TALE представляет собой полипептид, содержащий один или несколько повторяющихся доменов/звеньев TALE. Повторяющиеся домены участвуют в связывании TALE с его родственной последовательностью ДНК-мишени. Одно «повторяющееся звено» (также называемое «повтором») обычно имеет длину 33-35 аминокислот и проявляет по меньшей мере некоторую гомологию последовательности с другими последовательностями повтора TALE в природном белке TALE. Каждое повторяющееся звено TALE включает 1 или 2 ДНК-связывающих остатка, составляющих вариабельный остаток повтора (RVD), обычно в положениях 12 и/или 13 повтора. Природный (канонический) код распознавания ДНК этих TALE был определен таким образом, что последовательность HD в положениях 12 и 13 способствует связыванию с цитозином (С), NG связывается с Т; NI с А; NN связывается с G или А, а NO связывается с Т, при этом, также известны неканонические (атипичные) RVD. В некоторых вариантах осуществления изобретения, TALE могут быть нацелены на любой ген путем конструирования массивов TAL со специфичностью к последовательности ДНК-мишени. Последовательность-мишень обычно начинается с тимидина.

[0035] В некоторых вариантах осуществления изобретения, молекула представляет собой ДНК-связывающую эндонуклеазу, такую как нуклеаза TALE (TALEN). В некоторых аспектах, TALEN представляет собой слитый белок, содержащий ДНК-связывающий домен, полученный из TALE, и нуклеазный каталитический домен для расщепления последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.

[0036] В некоторых вариантах осуществления изобретения, TALEN распознает и расщепляет последовательность-мишень в гене. В некоторых аспектах, расщепление ДНК приводит к образованию двухцепочечных разрывов. В некоторых аспектах, разрывы стимулируют скорость гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ). Обычно, NHEJ представляет собой несовершенный процесс репарации, который часто приводит к изменениям в последовательности ДНК в сайте расщепления. В некоторых аспектах, механизмы репарации включают повторное связывание участков, которые остались от двух концов ДНК, посредством прямого повторного лигирования или посредством так называемого соединения концов, опосредованного микрогомологией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, репарация посредством NHEJ приводит к небольшим инсерциям или делециям и может быть использована для нарушения и, таким образом, репрессии гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация может представлять собой замену, делецию или добавление по меньшей мере одного нуклеотида. В некоторых аспектах, клетки, в которых произошло событие мутагенеза, индуцированное расщеплением, то есть, событие мутагенеза, следующее за событием NHEJ, могут быть идентифицированы и/или отобраны с применением хорошо известных методов.

[0037] В некоторых вариантах осуществления изобретения, повторы TALE были подвергнуты сборке для специфического нацеливания на ген (Gaj et al., 2013). Была создана библиотека TALEN, нацеленных на 18740 генов, кодирующих человеческие белки (Kim et al., 2013). Специально разработанные массивы TALE являются коммерчески доступными и могут быть приобретены у Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA), и Life Technologies (Grand Island, NY, USA). В частности, TALEN, нацеленные на CD38, являются коммерчески доступными (см. Gencopoeia, каталожные номера HTN222870-1, HTN222870-2 и HTN222870-3). Примеры молекул описаны, например, в публикациях патентов США №№ US 2014/0120622 и 2013/0315884.

[0038] В некоторых вариантах осуществления изобретения, TALEN вводят в виде трансгенов, кодируемых одним или несколькими плазмидными векторами. В некоторых аспектах, плазмидный вектор может содержать маркер отбора, который обеспечивает идентификацию и/или отбор клеток, в которые был введен указанный вектор.

С. RGEN (СИСТЕМЫ CRISPR/CAS)

[0039] В некоторых вариантах осуществления изобретения, изменение гена SRC-3 осуществляют с использованием одной или нескольких ДНК-связывающих нуклеиновых кислот, например, изменение осуществляют с использованием эндонуклеазы под контролем РНК (RGEN). Так, например, изменение может быть осуществлено с использованием кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) и CRISPR-ассоциированных (Cas) белков. В основном, «система CRISPR» относится к транскриптам и другим элементам, участвующим в экспрессии или в регуляции активности CRISPR-ассоциированных («Cas») генов, включая последовательности, кодирующие ген Cas, последовательность tracr (трансактивирующую CRISPR) (например, tracr-PHK или активную частичную tracr-PHK), сопряженную последовательность tracr (включающую «прямой повтор» и частичный прямой повтор, процессированный tracr-PHK, в комбинации с эндогенной системой CRISPR), руководящую последовательность (также называемую «спейсером» в комбинации с эндогенной системой CRISPR) и/или другие последовательности и транскрипты, происходящие от локуса CRISPR.

[0040] Нуклеаза CRISPR/Cas или система нуклеаз CRISPR/Cas может включать некодирующую молекулу РНК (руководящую) РНК, которая специфически связывается с ДНК, и белок Cas (например, Cas9) с функциональностью нуклеазы (например, с двумя нуклеазными доменами). Один или несколько элементов системы CRISPR могут происходить от системы CRISPR типа I, типа II или типа III, например, они могут происходить от конкретного организма, содержащего эндогенную систему CRISPR, такого как Streptococcus pyogenes.

[0041] В некоторых аспектах, в клетку вводят нуклеазу Cas и рРНК (включая слияние cr-РНК, специфичной для последовательности-мишени, и фиксированную tracr-PHK). В основном, сайты-мишени на 5'-конце рРНК нацеливают нуклеазу Cas на сайт-мишень, например, ген, посредством комплементарного спаривания оснований. Сайт-мишень может быть выбран исходя из его расположения непосредственно на 5'-конце последовательности мотива, примыкающего к протоспейсеру (РАМ), например, обычно NGG или NAG. В этом отношении, рРНК нацеливают на желаемую последовательность путем модификации первых 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 или 10 нуклеотидов руководящей РНК так, чтобы они соответствовали последовательности ДНК-мишени. В основном, система CRISPR характеризуется элементами, которые способствуют образованию комплекса CRISPR в сайте последовательности-мишени. Обычно, «последовательность-мишень» относится к последовательности, для которой руководящая последовательность должна быть сконструирована так, чтобы она была комплементарной, при этом, гибридизация между последовательностью-мишенью и руководящей последовательностью способствует образованию комплекса CRISPR. При этом, полная комплементарность является необязательной при условии, что такая комплементарность является достаточной для обеспечения гибридизации и стимуляции образования комплекса CRISPR.

[0042] Система CRISPR может индуцировать образование двухцепочечных разрывов (DSB) в сайте-мишени SRC-3 с последующими нарушениями или изменениями, описанными в настоящей заявке. В других вариантах осуществления изобретения, варианты Cas9, называемые «никазами», используются для образования разрыва одиночной цепи в сайте-мишени. Спаренные никазы могут быть использованы, например, для повышения специфичности, и каждая из этих никаз регулируется парой различных последовательностей, нацеленных на рРНК, в результате чего при одновременном введении одноцепочечных разрывов вводится 5'-выступающий конец. В других вариантах осуществления изобретения, каталитически неактивный Cas9 подвергают слиянию с гетерологичным эффекторным доменом, таким как репрессор или активатор транскрипции, для воздействия на экспрессию гена.

[0043] Последовательность-мишень для SRC-3 может содержать любой полинуклеотид, такой как полинуклеотиды ДНК или РНК. Последовательность-мишень может быть расположена в ядре или цитоплазме клетки, например, внутри органеллы клетки. Обычно, последовательность или матрица, которая может быть использована для рекомбинации в целевой локус, содержащий последовательности-мишени, называют «матрицей для редактирования», или «полинуклеотидом для редактирования» или «последовательностью для редактирования». В некоторых аспектах, экзогенный матричный полинуклеотид может называться матрицей для редактирования. В некоторых аспектах, рекомбинация представляет собой гомологичную рекомбинацию.

[0044] Обычно, в случае эндогенной системы CRISPR, образование комплекса CRISPR (содержащего руководящую последовательность, гибридизованную с последовательностью-мишенью и образующую комплекс с одним или несколькими белками Cas) приводит к расщеплению одной или обеих цепей в пределах или вблизи (например, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 или более пар оснований) последовательности-мишени. Последовательность tracr, которая может содержать всю или часть или состоять из всей или части последовательности tracr дикого типа (например, приблизительно или более чем приблизительно 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов последовательности tracr дикого типа), может также образовывать часть комплекса CRISPR, например, посредством гибридизации по меньшей мере части последовательности tracr со всей или частью сопряженной последовательности tracr, которая функционально связана с руководящей последовательностью. Последовательность tracr имеет комплементарность, достаточную для гибридизации сопряженной последовательности tracr и участия в формировании комплекса CRISPR, например, последовательности, которая по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% комплементарна последовательности по всей длине последовательности сопряжения tracr при оптимальном выравнивании.

[0045] Один или несколько векторов, регулирующих экспрессию одного или нескольких элементов системы CRISPR, могут быть введены в клетку таким образом, чтобы экспрессия элементов системы CRISPR регулировала образование комплекса CRISPR в одном или нескольких сайтах-мишенях. Компоненты также могут быть доставлены в клетки в виде белков и/или РНК. Так, например, фермент Cas, руководящая последовательность, связанная с последовательностью tracr, и последовательность tracr могут быть функционально связаны с отдельными регуляторными элементами на отдельных векторах. Альтернативно, два или более элементов, экспрессируемых из одних и тех же или различных регуляторных элементов, могут быть объединены в одном векторе с одним или более дополнительными векторами, обеспечивающими любые компоненты системы CRISPR, не включенные в первый вектор. Вектор может содержать один или несколько сайтов инсерции, таких как последовательность узнавания рестриктирующей эндонуклеазой (также называемую «сайтом клонирования»). В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или несколько сайтов инсерции расположены выше и/или ниже одного или нескольких элементов последовательности одного или нескольких векторов. В случае нескольких различных руководящих последовательностей можно использовать одну экспрессионную конструкцию для нацеливания активности CRISPR на несколько различных соответствующих последовательностей-мишеней внутри клетки.

[0046] Вектор может содержать регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, такой как белок Cas. Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (также известные как Csn1 и Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, их гомологи или их модифицированные варианты. Эти ферменты являются известными, например, аминокислотная последовательность белка Cas 9 S. pyogenes может быть взята из базы данных SwissProt под регистрационным номером Q99ZW2.

[0047] Фермент CRISPR может представлять собой Cas9 (например, от S. pyogenes или S. pneumonia). Фермент CRISPR может регулировать расщепление одной или обеих цепей в сайте расположения последовательности-мишени, например, в пределах последовательности-мишени и/или в пределах комплемента последовательности-мишени. Вектор может кодировать фермент CRISPR, который был мутирован по отношению к соответствующему ферменту дикого типа, так, чтобы мутантный фермент CRISPR был не способен расщеплять одну или обе цепи полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень. Так, например, замена аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvC I Cas9 от S. pyogenes превращает Cas9 из нуклеазы, которая расщепляет обе цепи, в никазу (расщепляет одну цепь). В некоторых вариантах осуществления изобретения, никаза Cas9 может быть использована в комбинации с руководящей(ими) последовательностью(ями), например, с двумя руководящими последовательностями, которые нацелены, соответственно, на смысловую и антисмысловую цепи ДНК-мишени. Эта комбинация позволяет разрезать обе цепи и может быть использована для индуцирования NHEJ или HDR.

[0048] В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность, кодирующая фермент, а именно, фермент CRISPR, была оптимизирована по кодонам для экспрессии в конкретных клетках, таких как эукариотические клетки. Эукариотические клетки могут представлять собой клетки конкретного организма или клетки, происходящие от конкретного организма, такого как млекопитающее, включая, но не ограничиваясь ими, человека, мышь, крысу, кролика, собаку или примата, не являющегося человеком. В основном, оптимизация по кодонам относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для повышения экспрессии в представляющих интерес клетках-хозяевах путем замены по меньшей мере одного кодона нативной последовательности кодонами, которые чаще всего или очень часто используются в генах этой клетки-хозяина при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Различные виды обладают конкретной предрасположенностью к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Смещение кодонов (различия в использовании кодонов между организмами) часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, считается зависящей, среди прочего, от свойств транслируемых кодонов и доступности определенных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно указывает на наличие кодонов, наиболее часто используемых в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в данном организме исходя из оптимизации кодонов.

[0049] Обычно, руководящая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, имеющую комплементарность полинуклеотидной последовательности-мишени, достаточную для гибридизации с последовательностью-мишенью и прямого последовательность-специфичного связывания комплекса CRISPR с последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, степень комплементарности между руководящей последовательностью и соответствующей последовательностью-мишенью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания составляет приблизительно или приблизительно более, чем 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более.

[0050] Оптимальное выравнивание может быть осуществлено с использованием любого подходящего алгоритма выравнивания последовательностей, неограничивающий пример которого включает алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вюнша, алгоритмы, основанные на преобразовании Берроуза-Уилера (например, выравнивателя Берроуза-Уилера), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, Сан-Диего, Калифорния), SOAP (доступен на soap.genomics.org.cn) и Mag (доступен на mag.sourceforge.net).

[0051] Фермент CRISPR может представлять собой часть слитого белка, содержащего один или несколько доменов гетерологичного белка. Слитый белок фермента CRISPR может содержать любую дополнительную белковую последовательность и необязательно линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры белковых доменов, которые могут быть слиты с ферментом CRISPR, включают, но не ограничиваются ими, эпитопные метки, последовательности репортерных генов и белковые домены, обладающие одной или несколькими из следующих активностей, таких как метилазная активность, деметилазная активность, активность активации транскрипции, активность подавления транскрипции, активность рилизинг-фактора транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК и активность связывания нуклеиновых кислот. Неограничивающие примеры эпитопных меток включают гистидиновые (His) метки, метки V5, метки FLAG, метки гемагглютинина вируса гриппа (НА), метки Мус, метки VSV-G и метки тиоредоксина (Тгх). Примеры репортерных генов включают, но не ограничиваются ими, гены глутатион-5-трансферазы (GST), пероксидазы хрена (HRP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), бета-галактозидазы, бета-глюкуронидазы, люциферазы, белка, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра (GFP), HcRed, DsRed, белка, флуоресцирующего в голубом диапазоне спектра (CFP), белка, флуоресцирующего в желтом диапазоне спектра (YFP), и аутофлуоресцентных белков, включая белок, флуоресцирующий в синем диапазоне спектра (BFP). Фермент CRISPR может быть слит с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, который связывается с молекулами ДНК или с другими клеточными молекулами, включая, но не ограничиваясь ими, белок, связывающийся с мальтозой (МБР), S-метку, слитые белки, содержащие ДНК-связывающий домен Lex A (DBD), слитые белки, содержащие ДНК-связывающий домен GAL4A и слитые белки ВР16 вируса простого герпеса (HSV). Дополнительные домены, которые могут образовывать часть слитого белка, содержащего фермент CRISPR, описаны в патенте США 20110059502, который включен в настоящее описание посредством ссылки.

V. Способы применения

[0052] В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам лечения рака посредством иммунотерапии, включающей введение эффективного количества иммунных клеток с нарушением SRC-3 согласно изобретению. В одном варианте осуществления изобретения рассматриваются способы лечения, замедления прогрессирования, замедления начала развития или снижения риска развития рака у индивидуума путем введения индивидууму эффективного количества клеточного терапевтического средства с нарушением SRC-3. Способы согласно изобретению могут применяться для лечения солидных раковых опухолей или рака крови. В конкретных вариантах осуществления изобретения, рак является позитивным по SRC-3. Рак может быть первичным, метастазирующим, невосприимчивым к терапии и т.п. Рак может представлять собой рак любого типа и на любой стадии. Индивидуум может подвергаться риску развития рака, как и любой индивидуум в населении в целом, и индивидуумом с риском развития рака может быть индивидуум из-за его образа жизни или семейного анамнеза, например, если человек курит, страдает ожирением, злоупотребляет алкоголем, имеет некоторые типы вирусных инфекций, таких как папилломавирус человека (ВПЧ), подвергается воздействию одного или нескольких канцерогенов или чрезмерному воздействию радиации, включая ультрафиолетовое излучение солнца. Количество такого воздействия может считаться чрезмерным, если оно больше, чем в среднем у индивидуума в данной группе.

[0053] Опухоли, для которых применимы раскрытые здесь способы лечения, включают злокачественные клетки любого типа, например, клетки, которые обнаруживаются в солидной опухоли или в опухоли крови. Примеры солидных опухолей могут включать, но не ограничиваются ими, опухоль органа, выбранного из группы, состоящей из молочной железы, яичника, поджелудочной железы, толстой кишки, слепой кишки, желудка, головного мозга, головы, шеи, почки, гортани, саркомы, легкого, мочевого пузыря, меланомы, предстательной железы, ткани желудка и эндометрия. Примеры опухолей крови включают опухоли костного мозга, Т- или В-клеточные злокачественные новообразования, лейкозы, лимфомы, бластомы, миеломы и т.п. Конкретные примеры рака, который можно лечить с применением способов, описанных в настоящей заявке, включают, но не ограничиваются ими, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), рак брюшины, рак кишечника или желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта и стромальный рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой и ободочной кишки, карциному эндометрия или матки, карциному слюнных желез, рак почек, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, различные виды рака головы и шеи и меланому.

[0054] Рак конкретно может относиться к следующим гистологическим типам, которыми являются, но не ограничиваются ими: злокачественное новообразование; карцинома; карцинома недифференцированная; гигантская и веретеноклеточная карцинома; мелкоклеточная карцинома; папиллярная карцинома; плоскоклеточная карцинома; лимфоэпителиальная карцинома; базально-клеточная карцинома; пиломатричная карцинома; переходно-клеточная карцинома; папиллярная переходно-клеточная карцинома; аденокарцинома; злокачественная гастринома; холангиокарцинома; гепатоцеллюлярная карцинома; комбинированная гепатоцеллюлярная карцинома и холангиокарцинома; трабекулярная аденокарцинома; аденоидно-кистозная карцинома; аденокарцинома в аденоматозном полипе; аденокарцинома, семейный полипоз толстой кишки; солидная карцинома; карциноидная злокачественная опухоль; бронхиоло-альвеолярная аденокарцинома; папиллярная аденокарцинома; хромофобная карцинома; ацидофильная карцинома; оксифильная аденокарцинома; базофильная карцинома; светлоклеточная аденокарцинома; гранулярноклеточная карцинома; фолликулярная аденокарцинома; папиллярная и фолликулярная аденокарцинома; неинкапсулирующая склерозирующая карцинома; карцинома коры надпочечников; эндометроидная карцинома; карцинома придатков кожи; апокриновая аденокарцинома; аденокарцинома сальных желез; церуминозная аденокарцинома; мукоэпидермоидная карцинома; цистаденокарцинома; папиллярная цистаденокарцинома; папиллярная серозная цистаденокарцинома; муцинозная цистаденокарцинома; муцинозная аденокарцинома; карцинома клеток сегнетового кольца; инфильтрирующая карцинома протоков; медуллярная карцинома; дольковая карцинома; воспалительная карцинома; болезнь Педжета, то есть, заболевание молочной железы; ацинарно-клеточная карцинома; аденосквамозная карцинома; аденокарцинома с плоскоклеточной метаплазией; злокачественная тимома; злокачественная опухоль стромы яичника; злокачественная текома; злокачественная гранулезноклеточная опухоль; злокачественная андробластома; карцинома клеток Сертоли; злокачественная опухоль клеток Лейдига; злокачественная липидноклеточная опухоль; злокачественная параганглиома; злокачественная параганглиома за пределами молочной железы; феохромоцитома; гломангиосаркома; злокачественная меланома; амеланотическая меланома; поверхностно распространяющаяся меланома; злокачественная меланома по типу лентиго; акрально-лентигинозные меланомы; узелковые меланомы; злокачественная меланома в гигантском пигментном невусе; эпителиоидноклеточная меланома; злокачественный голубой невус; саркома; фибросаркома; злокачественная фиброзная гистиоцитома; миксосаркома; липосаркома; лейомиосаркома; рабдомиосаркома; эмбриональная рабдомиосаркома; альвеолярная рабдомиосаркома; стромальная саркома; смешанная злокачественная опухоль; смешанная опухоль мюллеровских протоков; нефробластома; гепатобластома; карциносаркома; злокачественная мезенхимома; злокачественная опухоль Бреннера; злокачественная опухоль Phyllodes; синовиальная саркома; злокачественная мезотелиома; дисгерминома; эмбриональная карцинома; злокачественная тератома; злокачественная опухоль струмы яичников; хориокарцинома; злокачественная мезонефрома; гемангиосаркома; злокачественная гемангиоэндотелиома; саркома Капоши; злокачественная гемангиоперицитома; лимфангиосаркома; остеосаркома; юкстакортикальная остеосаркома; хондросаркома; злокачественная хондробластома; мезенхимальная хондросаркома; гигантоклеточная опухоль кости; саркома Юинга; злокачественная одонтогенная опухоль; амелобластная одонтосаркома; злокачественная амелобластома; амелобластная фибросаркома; злокачественная пинеалома; хордома; злокачественная глиома; эпендимома; астроцитома; протоплазматическая астроцитома; фибриллярная астроцитома; астробластома; глиобластома; олигодендроглиома; олигодендробластома; примитивная нейроэктодермальная опухоль; саркома мозжечка; ганглионейробластома; нейробластома; ретинобластома; нейрогенная опухоль обонятельных органов; злокачественная менингиома; нейрофибросаркома; злокачественная неврилеммома; злокачественная гранулярноклеточная опухоль; злокачественная лимфома; болезнь Ходжкина; ходжкинская лимфома; парагранулема; злокачественная лимфома; малая лимфоцитарная лимфома; крупноклеточная диффузная злокачественная лимфома; фолликулярная злокачественная лимфома; грибовидный микоз; другие неходжкинские лимфомы определенного типа; В-клеточная лимфома; низкозлокачественная/фолликулярная неходжкинская лимфома (НХЛ); мелкоклеточная лимфоцитарная (МЛ) НХЛ; промежуточная/фолликулярная НХЛ; диффузная НХЛ средней степени злокачественности; высокозлокачественная иммунобластная НХЛ; высокозлокачественная лимфобластная НХЛ; высокозлокачественная мелкоклеточная непрозрачноклеточная НХЛ; общая НХЛ; лимфома клеток коры головного мозга; лимфома, связанная со СПИДом; макроглобулинемия Вальденстрема; злокачественный гистиоцитов; множественная миелома; тучноклеточная саркома; иммунопролиферативное заболевание тонкой кишки; лейкоз; лимфолейкоз; лейкоз плазматических клеток; эритролейкоз; лимфосаркомоклеточный лейкоз; миелоидный лейкоз; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз; тучноклеточный лейкоз; мегакариобластный лейкоз; миелоидная саркома; ретикулоэндотелиоз; хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); острый миелоидный лейкоз (ОМЛ); и хронический миелобластный лейкоз.

[0055] В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммунные клетки доставляют индивидууму, нуждающемуся в этом, например, индивидууму, который страдает раком или у которого подозревается рак. Эти клетки усиливают иммунную систему индивидуума с последующей атакой на соответствующий рак. В некоторых случаях, индивидууму вводят одну или несколько доз иммунных клеток. В случаях, когда индивидууму вводят две или более доз иммунных клеток, продолжительность между введениями должна быть достаточной для того, чтобы дать время для размножения у индивидуума, и в конкретных вариантах осуществления изобретения, продолжительность между дозами составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более дней. В некоторых случаях, продолжительность между введениями составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели, 1-12 месяцев или более или любой другой диапазон в этих пределах.

[0056] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму может быть назначена немиелоабляционная лимфоистощающая химиотерапия до терапии иммунными клетками. Немиелоабляционной лимфоистощающей химиотерапией может быть любая подходящая терапия, которую можно проводить любым подходящим способом. Немиелоабляционная лимфоистощающая химиотерапия может включать, например, введение циклофосфамида и флударабина, особенно если рак представляет собой меланому, которая может быть метастазирующей. Репрезентативный способ введения циклофосфамида и флударабина представляет собой внутривенное введение. Аналогичным образом может быть введена любая подходящая доза циклофосфамида и флударабина. В конкретных аспектах, приблизительно 60 мг/кг циклофосфамида вводят в течение двух дней, после чего вводят приблизительно 25 мг/м² флударабина в течение пяти дней.

[0057] В некоторых вариантах осуществления изобретения, индивидууму вводят один или несколько факторов роста и/или один или несколько цитокинов, которые способствуют росту и активации иммунных клеток, либо одновременно с иммунными клетками, либо после введения иммунных клеток. Фактор роста иммунных клеток может представлять собой любой подходящий фактор роста, который способствует росту и активации иммунных клеток. Примеры подходящих факторов роста иммунных клеток включают интерлейкин (IL)-2, IL-7, IL-15 и IL-12, которые могут быть использованы отдельно или в различных комбинациях, таких как IL-2 и IL-7, IL-2 и IL-15, IL-7 и IL-15, IL-2, IL-7 и IL-15, IL-12 и IL-7, IL-12 и IL-15 или IL-12 и IL-2.

[0058] Терапевтически эффективные количества иммунных клеток могут быть введены несколькими способами, включая парентеральное введение, например, внутривенную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутригрудинную или внутрисуставную инъекцию, интраназальную, внутриартериальную инъекцию или инфузию.

[0059] Терапевтически эффективным количеством иммунных клеток для применения в адоптивной клеточной терапии является такое количество, при котором достигается желаемый эффект у индивидуума, подвергаемого лечению. Так, например, такми количеством может быть количество иммунных клеток, необходимое для ингибирования роста, или для регрессии рака, или для устранения по меньшей мере одного симптома рака.

[0060] Популяция иммунных клеток может быть введена в соответствии со схемами лечения, соответствующими заболеванию, например, могут быть введены разовая доза или несколько доз в течение одного или нескольких дней для облегчения патологического состояния или могут быть введены периодические дозы в течение длительного периода времени для ингибирования прогрессирования заболевания и предотвращения рецидива заболевания. Точная доза, используемая в препарате, также будет зависеть от способа введения и тяжести заболевания или расстройства и должна определяться лечащим врачом в соответствии с особенностями каждого пациента. Терапевтически эффективное количество иммунных клеток будет зависеть от индивидуума, подвергаемого лечению, тяжести и типа заболевания и способа введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дозы, которые могут быть использованы для лечения человека, составляют по меньшей мере 3,8×10⁴, по меньшей мере 3,8×10⁵, по меньшей мере 3,8×10⁶, по меньшей мере 3,8×10⁷, по меньшей мере 3,8×10⁸, по меньшей мере 3,8×10⁹ или по меньшей мере 3,8×10¹⁰ иммунных клеток/м². В определенном варианте, доза, используемая при лечении человека, составляет от приблизительно 3,8×10⁹ до приблизительно 3,8×10¹⁰ иммунных клеток/м². В дополнительных вариантах осуществления изобретения, терапевтически эффективное количество иммунных клеток может варьироваться от приблизительно 5×10⁶ клеток на кг массы тела до приблизительно 7,5×10⁸ клеток на кг массы тела, например, от приблизительно 2×10⁷ клеток до приблизительно 5×10⁸ клеток на кг массы тела или от приблизительно 5×10⁷ клеток до приблизительно 2×10⁸ клеток на кг массы тела. Точное количество иммунных клеток может быть легко определено специалистом в данной области в зависимости от возраста, массы, пола и физиологического состояния индивидуума. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-ответ, построенных по данным, полученным в тест-системах in vitro или на животных-моделях.

[0061] Иммунные клетки могут быть введены в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами для лечения рака. Комбинированная терапия может включать, но не ограничивается ими, введение одного или нескольких противоопухолевых средств или вакцины. В отдельных случаях, химиотерапевтические средства (например, метотрексат, треосульфан, бусульфан); средства для лучевой терапии; или хемокины, интерлейкины или их ингибиторы (например, BAFF, IL-2, антитело против IL-2R, IL-4, ингибиторы киназы JAK) можно вводить в дополнение к иммунным клеткам. Такие дополнительные фармацевтические средства могут быть введены до, во время или после введения иммунных клеток в зависимости от желаемого эффекта. Такое введение клеток и одного или нескольких дополнительных противораковых средств может осуществляться одним и тем же способом или различными способами и либо в один и тот же участок, либо в различные участки.

VI. Фармацевтические композиции

[0062] В настоящей заявке описаны фармацевтические композиции и составы, содержащие иммунные клетки (например, иммунные клетки с нарушением SRC-3, включая Т-клетки, такие как Treg-клетки) и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения рассматриваются композиции, содержащие: (а) любую из иммунных клеток, описанных в настоящей заявке; и (b) один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3. В таких случаях, (а) и (b) могут присутствовать, а могут и не присутствовать в одном и том же составе и могут быть, а могут и не быть приготовлены для доставки одним и тем же способом введения.

[0063] Фармацевтические композиции и составы, описанные в настоящей заявке, могут быть приготовлены путем смешивания активных ингредиентов (таких как антитело или полипептид), имеющих желаемую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 22-е издание, 2012 г.) в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваются ими: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее, чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примеры фармацевтически приемлемых носителей согласно изобретению дополнительно включают интерстициальные диспергирующие агенты, такие как растворимые нейтральные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Некоторые иллюстративные sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в патентных публикациях США №2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте настоящего изобретения, sHASEGP комбинируют с одной или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

VII. Комбинированная терапия

[0064] В некоторых вариантах осуществления изобретения, композиции и способы согласно изобретению включают популяцию иммунных клеток в комбинации по меньшей мере с одной дополнительной терапией. Дополнительной терапией может быть лучевая терапия, хирургическое вмешательство, химиотерапия, генотерапия, ДНК-терапия, вирусная терапия, РНК-терапия, иммунотерапия, трансплантация костного мозга, нанотерапия, терапия моноклональными антителами, белковая терапия или их комбинации. Дополнительная терапия может быть проведена в форме адъювантной или неоадъювантной терапии. Дополнительная терапия может представлять собой введение одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3, таких как антитела любого типа, низкомолекулярные ингибиторы, нуклеиновые кислоты, белки или их комбинации.

[0065] В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой введение низкомолекулярных ингибиторов SRC-3 или антиметастатических агентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой введение средств, ограничивающих побочные эффекты (например, средств, предназначенных для уменьшения возникновения и/или тяжести побочных эффектов лечения, таких как средства против тошноты и т.п.). В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой комбинацию лучевой терапии и хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой гамма-облучение. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительная терапия представляет собой терапию, нацеленную на путь РВК/AKT/mTOR, введение ингибитора HSP90, ингибитора тубулина, ингибитора апоптоза и/или химиопрофилактического средства. Дополнительная терапия может представлять собой введение одного или нескольких химиотерапевтических средств, известных специалистам в данной области.

[0066] Терапия иммунными клетками может быть проведена до, во время или после проведения дополнительной противораковой терапии или она может быть проведена в различных комбинациях. Введения могут быть осуществлены с интервалами от одновременного введения до введения с интервалом в нескольких минут, часов, дней или недель. В тех вариантах осуществления изобретения, где терапию иммунными клетками проводят пациенту отдельно от ыыкдения дополнительного терапевтического средства, необходимо, чтобы интервал между каждой доставкой не занимал значительного периода времени, для того, чтобы два соединения все еще были способны оказывать благоприятное комбинированное воздействие на пациента.

[0067] Введение любого соединения или проведение любой терапии пациенту в соответствии с вариантами осуществления изобретения должно быть проведено в соответствии с общими протоколами введения таких соединений с учетом токсичности агентов, если таковая имеется. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения рассматривается стадия мониторинга токсичности, связанной с комбинированной терапией.

А. Химиотерапия

[0068] В соответствии с вариантами осуществления изобретения можно использовать широкий спектр химиотерапевтических средств. Термин «химиотерапия» относится к использованию лекарственных средств для лечения рака. «Химиотерапевтическое средство» означает соединение или композицию, которые вводят при лечении рака. Эти агенты или лекарственные средства классифицируют по способу их действия в клетке, например, по их влиянию на клеточный цикл и по тому, на какой стадии это происходит. Альтернативно, агент может быть охарактеризован по его способности непосредственно связываться с ДНК, интеркалировать ДНК или индуцировать хромосомные и митотические аберрации, влияющие на синтез нуклеиновых кислот.

[0069] Примерами химиотерапевтических средств являются алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (а в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотные аналоги горчичного газа, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид и урациловый аналог горчичного газа; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энидииновые антибиотики (например, калихеамицин, а в частности, калихеамицин гамма1I и калихеамицин омегаI1); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотические хромофоры, аклациномицины, актиномицин, аутрарницин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаларницин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, хеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин и зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, птероптерин и триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн и тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин и флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан и тестолактон; средства, ингибирующие функцию коры надпочечников, такие как митотан и трилостан; восполнитель недостатка фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатрексат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльформитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лосоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; таксоиды, например, паклитаксел и доцетаксел, гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; координационные комплексы платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (например, СРТ-11); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметиллорнитин (ДМФО); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; карбоплатин, прокарбазин, пликомицин, гемцитабиен, навельбин, ингибиторы фарнезил-протеинтрансферазы, трансплатин и любые их фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные.

B. Лучевая терапия

[0070] Другие широко используемые факторы, вызывающие повреждение ДНК, включают хорошо известные средства, такие как γ^_лучи, рентгеновские лучи и/или направленная доставка радиоизотопов в опухолевые клетки. Также рассматриваются и другие формы повреждающих ДНК факторов, такие как микроволны, облучение протонным пучком (патенты США 5760395 и 4870287) и УФ-облучение. Наиболее вероятно, что все эти факторы влияют на широкий спектр повреждений ДНК, предшественников ДНК, репликации и репарации ДНК, а также сборки и поддержания хромосом. Диапазон доз для рентгеновских лучей колеблется в пределах суточных доз от 50 до 200 рентген в течение длительных периодов времени (от 3 до 4 недель) до разовых доз от 2000 до 6000 рентген. Диапазоны доз радиоизотопов широко варьируются и зависят от периода полураспада изотопа, силы и типа испускаемого излучения и поглощения опухолевыми клетками.

C. Иммунотерапия

[0071] Квалифицированному специалисту в данной области будет очевидно, что помимо рассматриваемых здесь средств, дополнительные иммунотерапевтические средства могут быть использованы в комбинации или в сочетании со способами согласно вариантам осуществления изобретения. При лечении рака, иммунотерапевтические средства обычно используют в зависимости от иммунных эффекторных клеток и молекул для нацеливания на раковые клетки и их уничтожения. Таким примером является ритуксимаб (RITUXAN®). Иммунный эффектор может представлять собой, например, антитело, специфичное к какому-либо маркеру на поверхности опухолевой клетки. Само по себе антитело может служить эффектором терапии, либо оно может стимулировать рекрутинг других клеток так, чтобы они фактически способствовали уничтожению клеток. Антитело также может быть конъюгировано с лекарственным средством или токсином (химиотерапевтическим средством, радионуклидом, цепью А рицина, холерным токсином, коклюшным токсином и т.п.) и может служить в качестве нацеливающего агента. Альтернативно, эффектор может представлять собой лимфоцит, несущий поверхностную молекулу, которая прямо или опосредованно взаимодействует с опухолевой клеткой-мишенью. Различные эффекторные клетки включают цитотоксические Т-клетки и NK-клетки.

[0072] Конъюгаты антитело-лекарственное средство в последнее время стали революционным подходом к разработке противораковых препаратов. Рак является одной из основных причин смертности во всем мире. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) включают моноклональные антитела (MAb), которые ковалентно связаны с лекарственными средствами, уничтожающими клетки. Этот подход сочетает в себе высокую специфичность MAb против антигенных мишеней с сильнодействующими цитотоксическими препаратами, что позволяет получить «вооруженные» MAb, которые доставляют полезную нагрузку (лекарственное средство) к опухолевым клеткам с повышенными уровнями антигена. Направленная доставка лекарственного средства также сводит к минимуму его воздействие на нормальные ткани, что приводит к снижению токсичности и к улучшению терапевтического индекса. Апробирование FDA двух препаратов ADC, ADCETRIS® (брентуксимаба ведотина) в 2011 году и KADCYLA® (трастузумаба эмтансина или Т-DM1) в 2013 году лишь подтвердило правильность подхода просто в качестве примеров.

[0073] В одном из аспектов, относящихся к иммунотерапии, опухолевая клетка должна нести определенный маркер, подходящий для нацеливания, то есть, отсутствующий на большинстве других клеток. Существует множество онкомаркеров, и любой из них может подходить для нацеливания в соответствии с вариантами настоящего изобретения. Общие опухолевые маркеры включают CD20, карциноэмбриональный антиген, тирозиназу (р97), gp68, TAG-72, HMFG, сиалиловый антиген Льюиса, MucA, MucB, FLAP, рецептор ламинина, erb В и р155. Альтернативным аспектом иммунотерапии является сочетание противораковых эффектов с иммуностимулирующими эффектами. Также существуют иммуностимулирующие молекулы, включая цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, гамма-IFN, хемокины, такие как MIP-1, МСР-1, IL-8, и факторы роста, такие как лиганд FLT3.

[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения, иммунотерапевтическое средство может представлять собой ингибитор иммунной контрольной точки. Иммунные контрольные точки либо усиливают сигнал (например, костимулирующие молекулы), либо подавляют сигнал. Ингибиторы иммунных контрольных точек, на которые может быть нацелена блокада иммунных контрольных точек, включают рецептор аденозина А2А (A2AR), В7-Н3 (также известный как CD276), аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (BTLA), цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами (CTLA-4, также известный как CD152), индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), иммуноглобулин клеток-киллеров (KIR), ген активации лимфоцитов-3 (LAG3), белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1), домен иммуноглобулина Т-клеток и муциновый домен 3 (TIM-3) и V-домен Ig-cynpeccopa активации Т-клеток (VISTA). В частности, ингибиторы иммунных контрольных точек нацелены на систему PD-1 и/или CTLA-4. Другой иммунной контрольной точкой, на которую можно воздействовать способами, представленными в настоящей заявке, является белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), также известный как CD152. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитор иммунной контрольной точки представляет собой антитело против CTLA-4 (например, человеческое антитело, гуманизованное антитело или химерное антитело), его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноадгезин, слитый белок или олигопептид.

D. Хирургическая операция

[0075] Приблизительно 60% больных раком подвергаются хирургическому вмешательству того или иного типа, включая профилактические, диагностические или постадийные, лечебные и паллиативные операции. Лечебная хирургия включает резекцию, при которой вся или часть раковой ткани физически удаляется, иссекается и/или разрушается, и такая хирургия может быть проведена в комбинации с другими видами терапии, такими как лечение в соответствии с вариантами осуществления изобретения, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия, генотерапия, иммунотерапия и/или альтернативные методы лечения. Резекция опухоли означает физическое удаление по меньшей мере части опухоли. В дополнение к резекции опухоли, хирургическое лечение включает лазерную хирургию, криохирургию, электрохирургию и хирургию под микроскопом (операцию Мооса).

[0076] При иссечении части или всех раковых клеток, ткани или опухоли, в организме может образовываться полость. Лечение может быть осуществлено путем перфузии, прямой инъекции или путем местного нанесения на область в комбинации с дополнительной противораковой терапией. Такое лечение можно повторять, например, через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней, или через каждые 1, 2, 3, 4 и 5 недель, или через каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. Эти препараты также могут иметь разную дозировку.

VIII. Сконструированные В-клетки и способы их применения

[0077] В конкретных вариантах осуществления изобретения, иммунные клетки, которые были сконструированы так, чтобы они разрушали SRC-3, включают В-клетки. В конкретных вариантах осуществления изобретения, В-клетки с нарушением SRC-3 используют для лечения любого патологического состояния, при котором В-клетки могут быть эффективны, но в конкретных вариантах осуществления изобретения, модифицированные В-клетки используют для лечения одного или нескольких воспалительных заболеваний или для лечения рака любого типа, включая, например, по меньшей мере В-клеточные лимфомы и те виды рака, которые перечислены в другом разделе настоящей заявки.

[0078] В некоторых вариантах осуществления изобретения, В-клетки либо закупают, либо берут у индивидуума, нуждающегося в лечении. В-клетки могут быть взяты у здорового человека для аллогенных целей. В-клетки могут быть сконструированы ex vivo стандартными способами для нарушения экспрессии эндогенного SRC-3 в В-клетках. В некоторых случаях, сконструированные В-клетки подвергают воздействию одного или нескольких агентов, включая TGF-[3 или опухолеспецифические антигены, которые повышают эффективность В-клеток после введения индивидууму, нуждающемуся в этом.

[0079] В конкретных вариантах осуществления изобретения, сконструированные В-клетки, лишенные экспрессии SRC-3 или имеющие пониженную экспрессию SRC-3 по сравнению с несконструированными В-клетками, вводят в эффективном количестве индивидууму, страдающему одним или несколькими воспалительными заболеваниями, или индивидууму с риском их развития. Хотя воспалительное заболевание может быть любого типа, однако, в конкретных вариантах осуществления изобретения, такое заболевание представляет собой, например, аллергию, астму, аутоиммунные заболевания, глютеновую болезнь, гломерулонефрит, гепатит, воспалительное заболевание кишечника, предперфузионное повреждение, отторжение трансплантата, анкилозирующий спондилит (АС), подагру, миозит, ревматоидный артрит, склеродермию, синдром Сьегрена, системную красную волчанку (СКВ, волчанку), воспалительное заболевание области таза или васкулит. Лечение В-клетками может уменьшить или отсрочить тяжесть заболевания, отсрочить начало развития заболевания, устранить один или несколько симптомов заболевания и т.п.

IX. Промышленные изделия или наборы

[0080] В настоящей заявке также описаны промышленные изделия или наборы, содержащие иммунные клетки. Иммунные клетки могут представлять собой Т-клетки, такие как Treg-клетки. Набор может включать клетки без нарушения SRC-3; один или несколько реагентов для нарушения SRC-3 (включая, например, нуклеиновые кислоты и белки, которые стимулируют специфический нокаут или нокдаун SRC-3); клетки, которые имеют нарушение SRC-3; один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3; буферы, соли, инструкции по применению или их комбинации. В конкретных вариантах осуществления изобретения, набор содержит реагенты CRISPR для нацеливания на SRC-3, Т-регуляторные клетки или и то и другое.

[0081] Промышленное изделие или набор могут дополнительно включать вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению иммунных клеток для лечения или замедления прогрессирования рака у индивидуума. Любые из описанных здесь иммунных клеток могут быть включены в промышленные изделия или наборы. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, пакеты и шприцы. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло, пластик (такой как поливинилхлорид или полиолефин) или металлический сплав (такой как нержавеющая сталь или сплав никеля-молибдена). В некоторых вариантах осуществления изобретения, контейнер содержит состав, а этикетка на контейнере или вложенная в него может содержать инструкции по применению. Промышленное изделие или набор могут дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, промышленное изделие дополнительно включает одно или несколько других средств (например, химиотерапевтическое средство и противоопухолевое средство). Подходящие контейнеры для одного или нескольких агентов включают, например, бутыли, флаконы, пакеты и шприцы.

Примеры

[0082] Нижеследующие примеры включены для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что методы, раскрытые в нижеследующих примерах, представляют собой разработанные изобретателями методы, которые успешно работают на практике с применением средств и композиций согласно изобретению, и, таким образом, могут рассматриваться как конкретные способы их применения на практике. Однако, для специалистов в данной области будет очевидно, что исходя из описания настоящего изобретения, в конкретные варианты осуществления изобретения могут быть внесены различные изменения, и при этом может быть получен результат или аналогичный результат, не выходящий за рамки существа и объема изобретения.

Пример 1

SRC-3 регулирует популяции иммунных клеток

[0083] Хотя клеточно-автономные онкогенные функции SRC-3 (название гена: NCOA3) в клетках рака молочной железы хорошо известны специалистам (1^_9), однако, роль(и) SRC-3, экспрессируемого в иммунных клетках, пока еще почти неизвестна(ы). Генетическая делеция гена Src-3 у мышей приводит к размножению лимфоидной линии, что в свою очередь приводит к увеличению количества CD4⁺- и CD8⁺-Т-клеток, а также В-лимфоцитов (впервые сообщалось в (11), и недавние данные, резюмирующие такое наблюдение, приведены на фиг. 1). В периферической крови мышей с нокаутом Src-З наблюдались повышенные уровни нескольких цитокинов, включая CXCL2, IL2, IL1α и β, CCL2 и GCSF (данные не показаны). Эти результаты раскрывают иммуносупрессорные функции SRC-3, указывают на то, что он представляет собой новый регулятор транскрипционных иммунных контрольных точек, и убедительно свидетельствуют о том, что фармакологическое ингибирование SRC-3 в иммунных клетках может усиливать их способность атаковать раковые клетки. Однако, точную популяцию иммунных клеток, в которой SRC-3 выполняет эту роль, еще предстоит определить. Анализ экспрессии генов общедоступных наборов данных показал, что экспрессия SRC-3 является очень высокой в клетках Treg и коррелирует с экспрессией Foxp3 (фиг. 2). Среди 296 корегуляторов, отобранных в Атласе передачи сигналов ядерных рецепторов (NURSA), NCOA3 (Src-3) был вторым наиболее коррелирующим коактиватором с экспрессией Foxp3 в Treg (фиг. 3).

Пример 2

Генетическое нарушение SRC-3 в TREG способствует надежному удалению раковой опухоли молочной железы

[0084] Учитывая ранее опубликованные данные, показывающие, что SRC-3^-/--мыши имеют лимфопролиферативный фенотип, и что нарушение экспрессии SRC-3 в Treg приводит к снижению экспрессии иммуносупрессивных белков в клетках этого типа, авторы настоящего изобретения охарактеризовали SRC-3 как белок, модулирующий иммунную контрольную точку, в частности, в «компартменте Treg», с использованием генетической системы мыши-модели. Авторы настоящего изобретения провели возвратное скрещивание мышей SRC-3flox/flox в течение 10 поколений с чистым фоном C57BL/6J, а затем скрещивали эту мышь с мышью Foxp3:EGFP-Cre-ERT2, которая уже имела фон C57BL/6J, для получения мыши с нокаутом Treg:SRC-3.

[0085] Лечение тамоксифеном активирует Cre, что приводит к нарушению гена SRC-3, а в частности, в Treg. С использованием этой генетически сконструированной системы мышей-моделей, эффекты нарушения гена SRC-3 были протестированы в широком диапазоне иммунокомпетентных сингенных опухолевых клеточных линий, совместимых с фоном C57BL/6J, включая линию опухоли молочной железы мыши Е0771, показанную ниже. Опухоли Е0771 являются особенно агрессивными, и хорошо известно, что у этой системы-модели трудно регулировать рост опухоли. Однако, у мышей-хозяев, у которых SRC-3 был разрушен конкретно в Treg, опухоли были по существу уничтожены, в то время как у животных-хозяев дикого типа опухоли быстро разрастались до еще больших размеров (фиг. 4).

[0086] Результаты этого исследования убедительно продемонстрировали, что SRC-3 является недавно открытой и ключевой регуляторной мишенью иммунной контрольной точки. Другим неожиданным и важным результатом этого эксперимента на животных-моделях было то, что животные оказались здоровыми, с селезенкой нормального размера и без каких-либо значительных изменений массы тела или активности. Этот результат отличается от результата, полученного для мышей с мутацией Foxp3, которые имеют перхоть, и которые имеют тяжелый аутоиммунный фенотип и погибают в раннем возрасте. В конкретном варианте осуществления изобретения, мыши Treg:SRC-3KO отличаются от мышей с перхотью, поскольку генетическое нарушение SRC-3 в клетках Foxp3 нарушает только иммуносупреесорную активность определенных субпопуляций Treg. Существующие в клинике препараты-модуляторы иммунных контрольных точек обладают сильными, ограничивающими дозу и опасными для жизни побочными эффектами. Следовательно, в конкретных вариантах осуществления изобретения, ингибирование только некоторых аспектов биологических функций Treg с помощью SRC-3 SMI позволяет проводить нацеливание только на иммуносупрессию, связанную с опухолью, без чрезмерной стимуляции в целом нежелательных событий в иммунной системе в других тканях.

Пример 3

Нацеливание на SRC-3 в Treg на основе CRISPR

[0087] Генетически модифицированная мышиная модель продемонстрировала, что специфическое нацеливание на SRC-3 в Treg приводит к уничтожению агрессивной карциномы молочной железы. Чтобы это открытие можно было использовать в целях клинически применимого терапевтического лечения, авторы настоящего изобретения разработали способ нацеливания на ген SRC-3 в иммунных клетках мыши с использованием подхода на основе CRISPR, описанного ниже. В конкретных вариантах осуществления изобретения, генетически измененные клетки используют в качестве источника Т-клеток/Treg для адоптивной терапии в целях уничтожения опухолей молочной железы в сингенных системах мышей-моделей. Этот процесс можно адаптировать к человеческим CD4⁺-клеткам (в качестве примера), которые могут быть использованы для лечения пациентов с раком молочной железы или с раком других видов.

[0088] Селезенку брали у самцов мышей C57BL/6 в возрасте 12 недель. Моноклеточную суспензию спленоцитов приготовливали путем пропускания селезенки через клеточный 4 0 мкм-фильтр с использованием поршневого конца шприца. Суспензию спленоцитов помещали в коническую пробирку, центрифугировали (1500 об/мин, 5 минут) и осадок эритроцитов подвергали удалению с использованием буфера для удаления эритроцитов (Sigma R 7757), в результате чего получали осадок лимфоцитов бежевого цвета. Лимфоциты высевали на покрытые CD3 планшеты с использованием полной среды RPMI (L-glu, FBS, антибиотики) с добавлением CD28/IL2/MeSH. После культивирования в течение трех дней оценивали жизнеспособность клеток (80%), и общую массу лимфоцитов подвергали обогащению CD4 с использованием набора Miltenyi для обогащения CD4 (130-104-545). Обогащенные CD4-клетки (40М) оставляли еще на два дня в описанных выше условиях, что приводило к увеличению клеточной популяции до более чем 100 миллионов клеток.

[0089] Нуклеофекция: Обогащенную и размноженную популяцию CD4-клеток подвергали нуклеофекции с помощью рибонуклеопротеина (RNP), содержащего руководящую РНК (гРНК) Cas9-NCoA3 с использованием нуклеофектора Lonza 4D и набора для нуклеофекции первичных клеток (Lonza V4XP-3024). RNP приготавливали путем смешивания флуоресцентно меченной trcr-PHK (IDT #1075928) с cr-РНК (IDT) в соотношении 1:1 (11,25 мкл trcr-PHK-ATTO 550 с тремя различными cr-РНК по 3,75 мкл каждой). рРНК (состоящую из trcr-PHK+cr-РНК) инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Затем рРНК (в концентрации 50 мкМ) смешивали с белком Cas9 (IDT # 1081059, в концентрации 60 мкМ) в соотношении 3:1, в результате чего получали 15 мкМ RNP с избытком рРНК-компонента. RNP инкубировали при 37°С в течение 15 минут, а затем смешивали с буфером для нуклеофекции в соотношении 1:5. Было приготовлено 13 реакционных смесей для нуклеофекции, каждая из которых содержала от 8 до 10 миллионов СБ4-клеток и 130 мкл буферной смеси для RNP нуклеофекции (конечная концентрация RNP составляла 3,5 мкМ с 3-кратным избытком рРНК-компонента). Нуклеофекцию проводили в нуклеофекторе 4D путем обработки каждой нуклеокюветы в соответствии с импульсной программой EN138 в соответствии с инструкцией производителя.

[0090] После нуклеофекции, в клетки добавляли культуральную среду и эти клетки переносили в чашку для культивирования, покрытую CD3. После восстановления в течение ночи, клетки сортировали с помощью проточной цитометрии, чтобы можно было разделить нуклеофицированную популяцию (путем отслеживания флуоресцентно меченной рРНК).

[0091] Отсортированные популяции (позитивные и негативные) культивировали в течение пяти дней, чтобы обеспечить возможность генетического редактирования, а также метаболизма белка и размножения клеток. Затем из этих клеток выделяли общую РНК с последующей двухстадийной ОТ-кол.ПЦР для анализа на нарушение экспрессии SRC-3 (ген обозначен Ncoa3).

[0092] Эти результаты продемонстрировали, что нарушение SRC-3 в Т-лимфоцитах на основе CRISPR является надежной и дает высокий выход жизнеспособных и способных к размножению клеток для дальнейших применений, таких как адоптивный перенос Т-клеток.

[0093] Полученные данные убедительно указывают на то, что SRC-3 является ключевой мишенью для Treg, и его специфическое нарушение в этом клеточном компартменте приводит к уничтожению опухоли у модели сингенной опухоли рака молочной железы. Существующая стратегия нарушения SRC-3 в Treg отличается от других стратегий с применением ингибиторов иммунных контрольных точек, поскольку SRC-3 представляет собой ядерный белок, который модулирует функцию Treg таким образом, что это способствует удалению опухоли без полного ингибирования функции этих клеток, которое ассоциируется с потенциально тяжелыми побочными эффектами. В настоящем изобретении предложен подход к специфической абляции SRC-3 ex vivo в Т-клетках, полученных от мышей, с использованием нацеливания на гены на основе CRISPR. При применении с использованием человеческих CD4⁺-лимфоцитов, этот метод обладает явным потенциалом в качестве адоптивного терапевтического средства на основе Т-клеток/Treg для лечения рака человека.

Пример 4

Адоптивный перенос клеток Treg с нокаутом SRC-3 мышам с опухолью молочной железы

[0094] Учитывая ранее опубликованные данные, показывающие, что SRC-3^-/--мыши имеют лимфопролиферативный фенотип, и что нарушение экспрессии SRC-3 в Treg приводит к снижению экспрессии иммуносупрессорных белков в клетках этого типа, авторы настоящего изобретения охарактеризовали SRC-3 как белок, модулирующий иммунную контрольную точку, в частности, в «компартменте Treg», с использованием генетической системы мыши-модели. Авторы настоящего изобретения провели возвратное скрещивание мышей SRC-3flox/flox в течение 10 поколений с чистым фоном C57BL/6J, а затем скрещивали эту мышь с мышью Foxp3:EGFP-Cre-ERT2, которая уже имела фон C57BL/6J, для получения мыши C57BL/6J с нокаутом Treg:SRC-3.

[0095] Лечение тамоксифеном активирует Cre, что приводит к нарушению гена SRC-3, а в частности, в клетках Treg. Эту генетически сконструированную систему мыши-модели использовали для получения Treg-клеток с нокаутом SRC-3 (KO), выделенных из селезенки, взятой у животных, имеющих Treg-клетки с нокаутом SRC-3. Приблизительно 1,6 миллиона клеток Treg с нокаутом SRC-3 были выделены из селезенки, и выделенные клетки Treg с нокаутом SRC-3 были жизнеспособными на 92%. В качестве контроля, клетки Treg (приблизительно 1,9 миллиона) также выделяли из селезенки, взятой у мыши SRC-3 flox/flox (SRC-3^F/F), и выделенные контрольные клетки были жизнеспособны на 93%.

[0096] Эффекты выделенных клеток Treg с нокаутом SRC-3 тестировали на мышах C57BL/6J, несущих опухоли, происходящие от клеток Е0771, которые происходят от линии клеток рака молочной железы мышей, первоначально выделенной из спонтанной опухоли мыши C57BL/6 (Фиг. 6). Опухоли Е0771 являются особенно агрессивными, а поэтому трудно подавить рост опухоли Е0771 у мышей C57BL/6J с интактным иммунитетом. Однако, опухоли Е0771 были по существу удалены у мышей, обработанных отдельными клетками Treg с нокаутом SRC-3 (0,9 миллиона клеток), по сравнению с ростом опухолей Е0771 у мышей C57BL/6J без адоптивного переноса клеток Treg (без AT). И напротив, перенос 0,9 миллиона клеток Treg от контрольных мышей SRC-3^F/F (Cont Treg, Control SRC-3+ Treg) не подавлял рост клеток Е0771 по сравнению с ростом опухолей Е0771 у мышей C57BL/6J без адоптивного переноса клеток Treg (фиг. 7). Кроме того, адоптивный перенос клеток Treg с нокаутом SRC-3 не вызывал очевидной токсичности, и животные, получавшие клеток Treg с нокаутом SRC-3, оставались репродуктивно фертильными (данные не представлены).

[0097] Результаты этого исследования продемонстрировали, что адоптивный перенос клеток Treg с нокаутом SRC-3 является подходящим для лечения рака, и в конкретных вариантах осуществления изобретения, клетки Treg с нокаутом SRC-3 используются для регуляции и/или устранения роста опухоли.

Ссылки

[0098] Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, соответствуют уровню техники в области, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включены в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и отдельно указана для включения в качестве ссылки.

1. Geng С, Не В, Xu L, Barbieri СЕ, Eedunuri VK, Chew SA, Zimmermann M, Bond R, Shou J, Li C, Blattner M, Lonard DM, Demichelis F, Coarfa C, Rubin MA, Zhou P, O'Malley BW, Mitsiades N. Prostate cancer-associated mutations in speckle-type POZ protein (SPOP) regulate steroid receptor coactivator 3 protein turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110(17):6997-7002. doi: 10.1073/pnas.1304502110. PubMed PMID: 23559371; PMCID: PMC3637757.

2. Eedunuri VK, Rajapakshe K, Fiskus W, Geng C, Chew SA, Foley C, Shah SS, Shou J, Mohamed JS, Coarfa C, O'Malley BW, Mitsiades N. miR-137 Targets pl60 Steroid Receptor Coactivators SRC1, SRC2, and SRC3 and Inhibits Cell Proliferation. Mol Endocrinol. 2015;29(8):1170-83. doi: 10.1210/me.2015-1080. PubMed PMID: 26066330; PMCID: PMC4518002.

3. Coarfa C, Fiskus W, Eedunuri VK, Rajapakshe K, Foley C, Chew SA, Shah SS, Geng C, Shou J, Mohamed JS, O'Malley BW, Mitsiades N. Comprehensive proteomic profiling identifies the androgen receptor axis and other signaling pathways as targets of microRNAs suppressed in metastatic prostate cancer. Oncogene. 2016;35(18):2345-56. doi: 10.1038/onc.2015.295. PubMed PMID: 26364608; PMCID: PMC5915337.

4. Wang Y, Lonard DM, Yu Y, Chow DC, Palzkill TG, O'Malley BW. Small molecule inhibition of the steroid receptor coactivators, SRC-3 and SRC-1. Mol Endocrinol. 2011; 25 (12):2041-53. Epub 2011/11/05. doi: me.2011-1222 [pii] 10.1210/me.2011-1222. PubMed PMID: 22053001; PMCID: 3231837.

5. Tien JC, Liu Z, Liao L, Wang F, Xu Y, Wu YL, Zhou N, Ittmann M, Xu J. The steroid receptor coactivator-3 is reguired for the development of castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. 2013; 73(13):3997-4008. Epub 2013/05/08. doi: 0008-5472.CAN-12-3929 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-12-3929. PubMed PMID: 23650284; PMCID: 3732785.

6. Zhou HJ, Yan J, Luo W, Ayala G, Lin SH, Erdem H, Ittmann M, Tsai SY, Tsai MJ. SRC-3 is required for prostate cancer cell proliferation and survival. Cancer Res. 2005;65(17):7976-83. Epub 2005/09/06. doi: 65/17/7976 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-04-4076. PubMed PMID: 16140970.

7. Yan J, Yu CT, Ozen M, Ittmann M, Tsai SY, Tsai MJ. Steroid receptor coactivator-3 and activator protein-1 coordinately regulate the transcription of components of the insulin-like growth factor/AKT signaling pathway. Cancer Res. 2006;66(22):11039-46. Epub 2006/11/17. doi: 66/22/11039 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-06-2442. PubMed PMID: 17108143.

8. Ayala G, Yan J, Li R, Ding Y, Thompson TC, Mims MP, Hayes TG, MacDonnell V, Lynch RG, Frolov A, Miles BJ, Wheeler TM, Harper JW, Tsai MJ, Ittmann MM, Kadmon D. Bortezomib-mediated inhibition of steroid receptor coactivator-3 degradation leads to activated Akt. Clin Cancer Res. 2008;14(22):7511-8. Epub 2008/11/18. doi: 14/22/7511 [pii] 10.1158/1078-0432.CCR-08-0839. PubMed PMID: 19010869; PMCID: 2820291.

9. Yan J, Erdem H, Li R, Cai Y, Ayala G, Ittmann M, Yu-Lee LY, Tsai SY, Tsai MJ. Steroid receptor coactivator-З/AIB1 promotes cell migration and invasiveness through focal adhesion turnover and matrix metalloproteinase expression. Cancer Res. 2008;68(13):5460-8. Epub 2008/07/03. doi: 68/13/5460 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-08-0955. PubMed PMID: 18593949.

10. Wu C, Orozco C, Boyer J, Leglise M, Goodale J, Batalov S, Hodge CL, Haase J, Janes J, Huss JW, 3rd, Su Al. BioGPS: an extensible and customizable portal for guerying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 2009;10(11):R130. doi: 10.1186/gb-2009-10-11-r130. PubMed PMID: 19919682; PMCID: PMC3091323.

11. Coste A, Antal MC, Chan S, Kastner P, Mark M, O'Malley BW, Auwerx J. Absence of the steroid receptor coactivator-3 induces B-cell lymphoma. EMBO J. 2006; 25(11):2453-64. Epub 2006/05/06. doi: 7601106 [pii] 10.1038/sj.emboj.7601106. PubMed PMID: 16675958; PMCID: 1478181.

12. Vandenbon A, Dinh VH, Mikami N, Kitagawa Y, Teraguchi S, Ohkura N, Sakaguchi S. Immuno-Navigator, a batch-corrected coexpression database, reveals cell type-specific gene networks in the immune system. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113 (17):E2393-402. doi: 10. 1073/pnas.1604351113. PubMed PMID: 27078110; PMCID: PMC4855614.

[0099] Хотя настоящее изобретение и его преимущества были подробно описаны, однако, следует отметить, что в него могут быть включены различные изменения, замены и модификации, не выходящие за рамки существа и объема конструкции, как определено в прилагаемой формуле изобретения. Кроме того, объем настоящей заявки не ограничивается конкретными вариантами способа, устройства, способа приготовления, состава вещества, средств, методов и стадий, описанных в настоящей заявке. Как будет очевидно для специалиста в данной области исходя из настоящего раскрытия, способы, устройства, способы приготовления, составы вещества, средства, методы или стадии, которые уже существуют в настоящее время, или которые будут разработаны в будущем, по существу будут выполнять те же функции или будут давать по существу такой же результат, как и описанные здесь соответствующие варианты осуществления изобретения. Соответственно, прилагаемая формула изобретения включает такие способы, устройства, способы приготовления, составы вещества, средства, методы или стадии, входящие в объем настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БАЙЛОР КОЛЛЕДЖ ОФ МЕДСИН

<120> TНАЦЕЛИВАНИЕ НА SRC-3 В ИММУННЫХ КЛЕТКАХ В КАЧЕСТВЕ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО

ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> N426945EP

<140> EP 21887800.7

<141> 2021-08-27

<150> US 63/106,770

<151> 2020-10-28

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> NCoA3 праймер (слева)

<400> 1

aagactcttt aggaccgctt ttact 25

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> NCoA3 праймер (справа)

<400> 2

acactgcgcc atggttaat 19

<210> 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GAPDH праймер (слева)

<400> 3

gggttcctat aaatacggac tgc 23

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GAPDH праймер (справа)

<400> 4

ccattttgtc tacgggacga 20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к фармацевтической композиции, содержащей: сконструированную регуляторную Т-клетку, имеющую устранение или уменьшение экспрессии коактиватора стероидных рецепторов-3 (SRC-3) по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствие такого устранения или уменьшения в клетке; и один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3. Также раскрыт способ получения регуляторных Т-клеток, имеющих устранение или уменьшение экспрессии коактиватора стероидных рецепторов-3 (SRC-3), включающий стадию устранения или уменьшения экспрессии SRC-3 в регуляторных Т-клетках по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствие такого устранения или уменьшения в клетке. Изобретение эффективно для лечения рака у индивидуума. 4 н. и 44 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр.

1. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая:

(a) сконструированную регуляторную Т-клетку, имеющую устранение или уменьшение экспрессии коактиватора стероидных рецепторов-3 (SRC-3) по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствие такого устранения или уменьшения в клетке; и

(b) один или несколько агентов, нацеленных на SRC-3.

2. Композиция по п. 1, где (а) и (b) находятся в разных составах.

3. Композиция по п. 1, где (а) и (b) находятся в одном и том же составе.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, где агент, нацеленный на SRC-3, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, антитело, белок, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

5. Композиция по п. 4, где низкомолекулярный ингибитор SRC-3 представляет собой буфалин, госсипол, веррукарин A, SI-2, SI-10, SI-12, их функциональное производное или их комбинацию.

6. Композиция по п. 4 или 5, где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

7. Композиция по любому из пп. 4-6, где антитело представляет собой 5Е11, LS-C801929, РА1-845, АХ15.3, РА5-29854, EPR4374(3) или их комбинацию.

8. Способ лечения рака у индивидуума, включающий стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количества сконструированных регуляторных Т-клеток, имеющих устранение или уменьшение экспрессии коактиватора стероидных рецепторов-3 (SRC-3) по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствие такого устранения или уменьшения в клетке.

9. Способ по п. 8, где рак представляет собой SRC-3⁺-рак.

10. Способ по п. 8 или 9, где рак представляет собой рак молочной железы, яичников, эндометрия, предстательной железы, желудка, множественную миелому, рак щитовидной железы или рак поджелудочной железы.

11. Способ по любому из пп. 8-10, где перед стадией введения клетки подвергают ex vivo воздействию эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.

12. Способ по п. 11, где агент, нацеленный на SRC-3, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, антитело, белок, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

13. Способ по п. 12, где низкомолекулярный ингибитор SRC-3 представляет собой буфалин, госсипол, веррукарин A, SI-2, SI-10, SI-12, их функциональное производное или их комбинацию.

14. Способ по п. 12 или 13, где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

15. Способ по любому из пп. 12-14, где антитело представляет собой 5Е11, LS-C801929, РА1-845, АХ15.3, РА5-29854, EPR4374(3) или их комбинацию.

16. Способ по любому из пп. 8-15, где индивидууму проводят дополнительную противораковую терапию, например вводят терапевтически эффективное количество дополнительного противоракового средства.

17. Способ по п. 16, где дополнительная противораковая терапия включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, химиотерапию, гормональную терапию, медикаментозную терапию, белковую терапию, иммунотерапию или их комбинацию.

18. Способ по п. 16 или 17, где дополнительная противораковая терапия включает введение одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.

19. Способ по п. 18, где агент, нацеленный на SRC-3, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, антитело, белок, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

20. Способ по п. 19, где низкомолекулярный ингибитор SRC-3 представляет собой буфалин, госсипол, веррукарин A, SI-2, SI-10, SI-12, их функциональное производное или их комбинацию.

21. Способ по п. 19 или 20, где антитело представляет собой моноклональное антитело или поликлональное антитело.

22. Способ по любому из пп. 19-21, где антитело представляет собой 5Е11, LS-C801929, РА1-845, АХ15.3, РА5-29854, EPR4374(3) или их комбинацию.

23. Способ по любому из пп. 16-22, где клетки и дополнительное противораковое средство вводят индивидууму по существу в одно и то же время.

24. Способ по любому из пп. 16-22, где клетки и дополнительное противораковое средство вводят индивидууму в разное время.

25. Способ по любому из пп. 16-24, где клетки и дополнительное противораковое средство находятся в одном и том же составе.

26. Способ по любому из пп. 16-24, где клетки и дополнительное противораковое средство находятся в разных составах.

27. Способ по любому из пп. 8-26, где клетки вводят внутривенно, внутрибрюшинно, внутриартериально, местно, путем ингаляции, внутримышечно, интрастернально, путем внутрисуставной инъекции или инфузии.

28. Способ по любому из пп. 8-27, где клетки вводят один или несколько раз.

29. Способ по п. 28, где при многократном введении клеток индивидууму продолжительность между введениями составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев.

30. Способ лечения рака у индивидуума, включающий стадию введения индивидууму терапевтически эффективного количества композиции по любому из пп. 1-7.

31. Способ по п. 30, где (а) и (b) вводят индивидууму в разных составах.

32. Способ по п. 30, где (а) и (b) вводят индивидууму в одном и том же составе.

33. Способ по п. 31, где (а) и (b) вводят индивидууму по существу в одно и то же время.

34. Способ по п. 31, где (а) и (b) вводят индивидууму в разное время.

35. Способ по п. 34, где при введении (а) и (b) индивидууму в разное время продолжительность между введениями (а) и (b) составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев.

36. Способ по любому из пп. 30-35, где композицию вводят индивидууму один или несколько раз.

37. Способ по п. 36, где при введении композиции индивидууму в разное время продолжительность между введениями составляет 1-24 часа, 1-7 дней, 1-4 недели или 1-12 месяцев.

38. Способ по любому из пп. 30-37, где рак представляет собой SRC-3⁺-рак.

39. Способ по любому из пп. 30-38, где рак представляет собой рак молочной железы, рак яичников, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак желудка, множественную миелому, рак щитовидной железы или рак поджелудочной железы.

40. Способ по любому из пп. 30-39, где перед стадией введения клетки в (а) подвергают ex vivo воздействию эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.

41. Способ получения регуляторных Т-клеток, имеющих устранение или уменьшение экспрессии коактиватора стероидных рецепторов-3 (SRC-3), включающий стадию устранения или уменьшения экспрессии SRC-3 в регуляторных Т-клетках по сравнению с уровнем экспрессии генного продукта в отсутствие такого устранения или уменьшения в клетке.

42. Способ по п. 41, где указанный способ дополнительно включает:

(a) получение CD4⁺-Т-клеток или CD4⁺-Treg, соответственно; и

(b) воздействие на CD4⁺-Т-клетки или CD4⁺-Treg, соответственно, одного или нескольких агентов, которые нарушают экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках или Treg, соответственно.

43. Способ по п. 42, где Т-клетки или Treg получают из селезенки, костного мозга, крови, плазмы или их комбинации.

44. Способ по п. 42 или 43, дополнительно включающий стадию получения регуляторных Т-клеток из CD4⁺-Т-клеток.

45. Способ по п. 44, где регуляторные Т-клетки представляют собой CD25⁺-клетки и/или Fox3p⁺-клетки.

46. Способ по любому из пп. 42-45, где один или несколько агентов, нарушающих экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках, содержат нуклеиновую кислоту.

47. Способ по п. 46, где один или несколько агентов, нарушающих экспрессию эндогенного SRC-3 в Т-клетках, включают реагенты CRISPR.

48. Способ по любому из пп. 41-47, дополнительно включающий стадию воздействия на иммунные клетки ex vivo эффективного количества одного или нескольких агентов, нацеленных на SRC-3.