ЧАСТИЦЫ, КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ПЕПТИДОМ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/35 A61K38/43 A61K39/00 A61K9/14 A61K47/60 A61K9/19 A61K9/51 A61P37/06 A61P37/08 

ПОДДЕРЖКА ФЕДЕРАЛЬНЫХ ОРГАНОВ США

Настоящее изобретение выполнено при государственной поддержке, грант R01 EB013198 Национальных институтов здравоохранения. Государство имеет определенные права на настоящее изобретение.

Смежные заявки

Изобретение испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/865,389, поданной 13 августа 2013 г., предварительной заявке на патент США № 61/869,279, поданной 23 августа 2013 г., и предварительной заявке на патент США № 61/887,112, поданной 4 октября 2013 г. Настоящая заявка также связана с заявкой на договор о патентной кооперации (PCT) № PCT/US2013/047079, поданной 21 июня 2013 г., которая испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/662,687, поданной 21 июня 2012 г. Содержание каждого из этих документов полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Содержание текстового файла, поданного в электронном виде, полностью включено в настоящий документ путем ссылки: экземпляр списка последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: COUR-002_01US_Seqlist.txt, дата записи: 13 августа 2013 г., размер файла 1,17 Мбайт).

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Воспалительные заболевания и расстройства представляют собой состояния, при которых патологический или иной нерегулируемый воспалительный ответ вносит свой вклад в этиологию или тяжесть заболевания. Примеры включают в себя аутоиммунные заболевания, такие как диабет I типа и целиакия.

Многие из этих заболеваний характеризуются инфильтрацией мононуклеарных клеток в месте повреждения ткани или иной травмы. Примеры мононуклеарных клеток, обнаруженных в этих инфильтратах, включают в себя лимфоциты, в частности Т-лимфоциты, и клетки системы мононуклеарных фагоцитов (клетки MPS), такие как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, клетки микроглии и другие.

Многие из клеток, обнаруженных в инфильтратах мононуклеарных клеток, возможно, участвуют в этих патологических воспалительных ответах. Например, известно, что при заболеваниях, таких как рассеянный склероз, Т-клетки CD4⁺ играют центральную роль в патологическом аутоиммунном ответе. На более раннем этапе активации Т-клеток дендритные клетки и другие клетки MPS могут быть ответственны за активацию Т-клеток CD4⁺. Клетки MPS также могут стимулировать воспаление посредством фагоцитоза, хотя по отношению к по меньшей мере некоторым воспалительным заболеваниям остается неясным, способны ли такие клетки вносить вклад в воспаление в отсутствие Т-клеток CD4⁺.

Моноциты периферической крови можно отнести к одной из двух групп в зависимости от того, экспрессируются ли определенные молекулы на поверхности клеток или нет. В частности, считается, что «резидентные моноциты» или «зрелые моноциты» человека имеют фенотип CD14^loCD16⁺ (мышиный аналог - CX3CR1^hiCCR2^-Gr1^-). Считается, что другая группа клеток, «воспалительные моноциты» или «незрелые моноциты», имеет фенотип CD14⁺CD16^- (мышиный аналог - CX₃CR1^loCCR2⁺Gr1⁺). (Geissmann F. et al., 2003 Immunity 19: 71-82)

Важно, что, хотя последние считаются «воспалительными» в том смысле, что наблюдается их миграция в воспаленную ткань из периферических кровяных клеток костномозгового происхождения, не показано, что они вызывают воспаление напрямую или через воздействие на другие клетки. Для различных клеток MPS, которые могут образовываться при дифференцировке этих клеток, также дополнительно не показано, что они вызывают воспаление.

Традиционные клинические стратегии долговременной иммунной супрессии при расстройствах, связанных с нежелательным иммунным ответом, основаны на длительном введении иммуносупрессорных лекарственных средств широкого спектра действия, например блокаторов сигнала 1, таких как циклоспорин A (CsA), FK506 (такролимус) и кортикостероиды. Длительное применение высоких доз таких лекарственных средств может приводить к токсическим побочным эффектам. Более того, даже у пациентов, способных переносить эти лекарственные средства, необходимость пожизненной терапии иммуносупрессорными лекарственными средствами связана с существенной опасностью тяжелых побочных эффектов, включая опухоли, серьезные инфекции, нефротоксичность и метаболические расстройства.

Разработаны способы индукции антиген-специфической толерантности, включающие связывание с клетками антигена или пептида. Например, в одном способе индуцированная пептидом клеточная толерантность включала сбор, выделение и обработку клеток периферической крови специфичными для заболевания аутоантигенами и связующим реагентом этиленкарбодиимидом (ECDI) в стерильных условиях с последующим обратным введением донору/пациенту. Этот процесс является дорогостоящим, должен проводиться в жестко контролируемых условиях опытными медработниками и ограничен количеством центров, способных проводить такую процедуру. Использование эритроцитов крови в качестве донорского типа клеток расширяет возможные источники и включает сюда аллогенных доноров, что значительно увеличивает обеспечение исходными клетками и потенциально расширяет сферу предоставления такого лечения до любых учреждений, сертифицированных для переливания крови. Такие подходы имеют существенные ограничения в плане обеспечения исходными клетками и обязательной гистосовместимости для сведения к минимуму иммунного ответа на донорские клетки. Кроме того, местная обработка клеток для присоединения аутоантигенов посредством EDCI создает существенную проблему для контроля качества. Более того, для таких подходов также необходимы по меньшей мере некоторые знания патологического антигена, для которого нужно выработать толерантность.

В последнее время были описаны связанные с пептидом частицы, которые устраняют необходимость в запасе исходных клеток и обходят требование гистосовместимости, характерное для предыдущих подходов, см. WO 2010/085509, полностью включенную в настоящий документ путем ссылки. Однако использование антигенов, связанных с наружной поверхностью частиц, ассоциируется с повышенной анафилактической реакцией и создает существенные проблемы в плане химического взаимодействия, производства и контроля. Неожиданно было обнаружено, что этих неблагоприятных явлений можно избежать в том случае, когда антиген инкапсулирован внутрь частицы. Еще более неожиданно было то, что размер и заряд частиц можно изменять, улучшая толерантность к определенным антигенам.

Антиген-специфическая толерантность обычно не является идеальной, поскольку в заболеваниях человека конкретные эпитопы/антигены по существу неизвестны. Более того, антигены у разных субъектов могут слишком варьироваться, чтобы антиген-специфический подход был эффективен, и, следовательно, было бы необходимо определять, какие антигены будут обнаруживаться у конкретного пациента, или потребовалось бы перед введением соединять с частицами библиотеку возможных пептидов. Синтез и индивидуальное связывание таких пептидов требует времени и является дорогостоящим. Следовательно, существует потребность в терапии, решающей эти проблемы и таким образом устраняющей необходимость в источнике гистосовместимых клеток.

Изложение сущности изобретения

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены композиции (например, для индукции антиген-специфической толерантности), содержащие частицу-носитель (например, PLG-частицу), соединенную с антигенным пептидом. В определенных вариантах осуществления частица-носитель представляет собой частицу сополимера лактида и гликолида (PLG). В других вариантах осуществления частица-носитель представляет собой стабилизированную при помощи PLURIONICS® частицу полипропиленсульфида.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие антиген, связанный с частицей-носителем, обладающей отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал частицы составляет от около -100 мВ до около 0 мВ. В некоторых вариантах осуществления дзета-потенциал частицы составляет от около -50 мВ до около -40 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой сополимер, имеющий молярное соотношение от около 50 : 50, 80 : 20 до около 100 : 0. В некоторых вариантах осуществления соотношение сополимеров может составлять, без ограничений, полистирол : поли(винилкарбоксилат)/80 : 20, полистирол : поли(винилкарбоксилат)/90 : 10, поли(винилкарбоксилат) : полистирол/80 : 20, поли(винилкарбоксилат) : полистирол/90 : 10, полимолочная кислота : полигликолевая кислота/80 : 20, полимолочная кислота : полигликолевая кислота/90 : 10 или полимолочная кислота : полигликолевая кислота/50 : 50. В других вариантах осуществления частица представляет собой частицу полистирола, частицу карбоксилированного полистирола, частицу стабилизированного при помощи PLURIONICS® пропиленсульфида или частицу сополимера молочной и гликолевой кислот. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой частицу сополимера молочной и гликолевой кислот.

В некоторых вариантах осуществления средний диаметр частицы составляет от около 0,1 мкм до около 10 мкм. В некоторых вариантах осуществления средний диаметр частицы составляет от 0,2 мкм до приблизительно 2 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр частицы составляет от около 0,3 мкм до около 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр частицы составляет от около 0,5 мкм до около 3 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр частицы составляет от около 0,5 мкм до около 1 мкм. В некоторых вариантах осуществления диаметр частицы составляет около 0,5 мкм.

В дополнительных вариантах осуществления антиген содержит по меньшей мере часть аутоиммунного антигена, антигена, экспрессированного на ткани для трансплантации субъекту, фермента или аллергена. В некоторых вариантах осуществления антиген содержит по меньшей мере часть основного белка миелина, ацетилхолинового рецептора, эндогенного антигена, миелин-олигодендроцитарного гликопротеина, антигена бета-клеток поджелудочной железы, инсулина, проинсулина, специфичного для островков белка, связанного с каталитической субъединицей глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), глутаматдекарбоксилазы (GAD), коллагена 11 типа, gp39 человеческого хряща, fp130-RAPS, протеолипидного белка, фибрилларина, малого ядрышкового белка, рецептора тиреотропного фактора, гистонов, гликопротеина gp70, пируватдегидрогеназа-дигидролипоамидацетилтрансферазы (PCD-E2), антигена волосяных фолликулов, аквапорина 4, десмоглеина 1, десмоглеина 3, никотинового ацетилхолинового рецептора, A-глиадина и человеческого тропомиозина изоформы 5, пыльцы гречки заметной (BaGP), аллергена персика Pru p 3, аллергена молока альфа-s1-казеина, аллергена сельдерея Api g 1, аллергена бразильского ореха Bere1, аллергена молока B-лактоглобулина, бычьего сывороточного альбумина, аллергена фундука Cora 1.04, аллергена яиц овальбумина, антигемофилического фактора, адвата, когената, элоктата, слитного белка рекомбинантного фактора VIII и Fc, рефакто, Novo VIIa, рекомбинантного фактора VII, эптакога альфа, геликсата, монанина, фактора коагуляции IX, вилата, цередазы, аглюцеразы, церезима, имиглюцеразы, Elelso, талиглюцеразы альфа, фабразима, агалсидазы бета, альдуразима, альфа-L-идуронидазы, миозима, кислой глюкозидазы, элапразы, идуронат-2-сульфатазы, наглазим арилсульфатазы B или N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, белковых препаратов, использованных при замене фермента или фактора коагуляции, например миозима, аглюцеразы, имиглюцеразы, талиглюцеразы, агалзидазы бета, L-идуронидазы, кислой глюкозидазы, идуронат-2-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, антигемофилического фактора, фактора VII, эптакога альфа, фактора IX, миглустата, ромипластима, эпотетина альфа, белка C, ларонидазы, люмизима или фактора VIII.

В дополнительных вариантах осуществления антиген содержит аутоиммунный антиген, антиген, экспрессированный на ткани для трансплантации субъекту, фермент или аллерген. В не имеющих ограничительного характера вариантах осуществления антиген содержит, например, основной белок миелина, ацетилхолиновый рецептор, эндогенный антиген, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин, антиген бета-клеток поджелудочной железы, инсулин, глутаматдекарбоксилазу (GAD), коллаген 11 типа, gp39 человеческого хряща, fp130-RAPS, протеолипидный белок фибрилларин, малый ядрышковый белок, рецептор тиреотропного фактора, гистоны, гликопротеин gp70, пируватдегидрогеназа-дегидролипоамидацетилтрансферазу (PCD-E2), антиген волосяных фолликулов, аквапорин 4, десмоглеин 1, десмоглеин 3, никотиновый ацетилхолиновый рецептор, A-глиадин и человеческий тропомиозин изоформы 5, пыльцу гречки заметной (BaGP), аллерген персика Pru p 3, аллерген молока альфа-s1-казеин, аллерген сельдерея Api g 1, аллерген бразильского ореха Bere1, аллерген молока B-лактоглобулин, бычий сывороточный альбумин, аллерген фундука Cor a 1.04, инсулин, проинсулин, специфичный для островков белок, связанный с каталитической субъединицей глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), аллерген яиц овальбумин, белковые препараты, использованные при замене фермента или фактора коагуляции, например миозима, аглюцеразы, имиглюцеразы, талиглюцеразы, агалзидазы бета, L-идуронидазы, кислой глюкозидазы, идуронат-2-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, антигемофилического фактора, фактора VII, эптакога альфа, фактора IX, миглустата, ромипластима, эпотетина альфа, белка C, ларонидазы, люмизима или фактора VIII.

В дополнительных вариантах осуществления частицы связаны с антигеном, содержащим один или более эпитопов. В дополнительном варианте осуществления эпитоп связан с аллергией, аутоиммунным заболеванием, ферментом, используемым в ферментозаместительной терапии, болезнью лизосомального накопления или воспалительным заболеванием или расстройством. В одном варианте осуществления эпитоп связан с диабетом I типа, рассеянным склерозом, системной волчанкой, оптиконевромиелитом, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, тромботической тромбоцитопенической пурпурой, мембранной нефропатией, буллезным пемфигоидом, пемфигус вульгарис, миастенией гравис, болезнью накопления мукополисахарида, ганглиозидозом, щелочной гипофосфатазией, болезнью накопления холестериновых эфиров, гиперурикемией, дефицитом гормона роста, почечной анемией, болезнью Гоше, болезнью Фабри, болезнью Гурлера, болезнью Хантера, болезнью Марото - Лами, гемофилией A, гемофилией B, болезнью фон Виллебранда, венозным тромбозом, пурпурой фульминанс, мукополисахаридозом VI, болезнью Помпе, целиакией или воспалительным заболеванием кишечника, включая болезнь Крона или колит, например язвенный колит. В дополнительном варианте осуществления эпитопы находятся в белковых терапевтических средствах, используемых при замещении ферментов или факторов коагуляции, таких как миозим, аглюцераза, имиглюцераза, талиглюцераза, агалзидаза бета, L-идуронидаза, кислая глюкозидаза, идуронат-2-сульфатаза, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза, антигемофилический фактор, фактор VII, эптаког альфа, фактор IX, миглустат, ромипластим, эпотетин альфа, белок C, ларонидаза, лумизим, фактор VIII. В дополнительном варианте осуществления эпитоп представляет собой эпитоп, описанный в таблице 2 или 3. В одном варианте осуществления частицы соединены с антигенами, содержащими только один эпитоп, связанный с одним заболеванием и/или расстройством. В дополнительном варианте осуществления антигены содержат более одного эпитопа, которые связаны с одним и тем же заболеванием и/или расстройством. В дополнительном варианте осуществления антигены содержат более одного эпитопа, которые связаны с разными заболеваниями и/или расстройствами.

В некоторых вариантах осуществления антиген связан с упомянутой частицей конъюгатной молекулой. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с упомянутой частицей линкером. В некоторых вариантах осуществления конъюгатная молекула представляет собой этиленкарбодиимид (ECDI). В определенных вариантах осуществления антиген связан с комплексом стрептавидин-биотин. В некоторых вариантах осуществления линкеры включают в себя, без ограничений, различные бифункциональные агенты для соединения белков, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCL), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидные соединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамид), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и соединения с двумя активными фторными группами (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Конкретные соединительные агенты включают в себя N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP), образующие дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления антиген связан с наружной поверхностью частицы, обладающей отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления антиген инкапсулируется в частицу, обладающую отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления частица является биоразлагаемой. В некоторых вариантах осуществления частица является поверхностно-функционализированной. В некоторых вариантах осуществления частица является карбоксилатной поверхностно-функционализированной.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены способы индукции у субъекта антиген-специфической толерантности, включающие введение упомянутому субъекту эффективного количества композиции, содержащей связанную с антигеном частицу, причем упомянутая частица имеет отрицательный дзета-потенциал, и при этом упомянутая частица и антиген индуцируют толерантность к упомянутому антигену у упомянутого субъекта. В некоторых вариантах осуществления введение выполняют с целью лечения или предотвращения заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления введение проводят до или после начала заболевания или состояния, вызванного упомянутым антигеном. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, аллергии, отторжения трансплантата, болезни лизосомального накопления, ферментативной недостаточности, воспалительного ответа и гипериммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние выбирают из группы, состоящей из рассеянного склероза, диабета I типа, астмы, пищевой аллергии, аллергии на факторы окружающей среды, целиакии, воспалительного заболевания кишечника, включая болезнь Крона или язвенный колит, и состояния, вызванного упомянутым антигеном у упомянутого субъекта для уменьшения чрезмерной реакции на упомянутый антиген. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают повторение упомянутого введения упомянутой композиции упомянутому субъекту.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к активации индуцированной гибели эффекторных Т-клеток.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к анергии эффекторных Т-клеток.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к апоптозу эффекторных Т-клеток.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к превращению эффекторных Т-клеток в регуляторные Т-клетки.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к индукции и экспансии как антиген-специфических, так и неспецифических регуляторных Т-клеток. В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к выделению эффекторных Т-клеток в лимфоузлах и селезенке с ингибированием их способности к перемещению на периферию и вызову воспаления.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц приводит к уменьшению зависимой от Т-клеток продукции антител.

В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы лечения целиакии у субъекта, включающие введение упомянутому субъекту эффективного количества композиции, содержащей связанную с антигеном частицу, причем частица имеет отрицательный дзета-потенциал. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой глиадин или эпитоп глиадина. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой один или более антигенов, которые выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1295-1724, SEQ ID NO: 1726-1766 и SEQ ID NO: 4986-5140. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой глиадин, а связанная с антигеном частица имеет средний размер после синтеза около 600-1500 нанометров и средний заряд после синтеза от около -30 до около -80 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 600-1200 нанометров и средний заряд после синтеза от около -40 до около -70 мВ. В определенных вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 600 мкм и средний заряд после синтеза около -50 мВ. В дополнительных вариантах осуществления частица представляет собой частицу полистирола, частицу карбоксилированного полистирола, частицу стабилизированного при помощи PLURIONICS пропиленсульфида или частицу сополимера молочной и гликолевой кислот.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы лечения диабета у субъекта, включающие введение упомянутому субъекту эффективного количества композиции, содержащей связанную с антигеном частицу, причем частица имеет отрицательный дзета-потенциал. В некоторых вариантах осуществления диабет представляет собой диабет I типа. В некоторых вариантах осуществления диабет представляет собой диабет II типа.

В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой инсулин, проинсулин, специфичный для островков белок, связанный с каталитической субъединицей глюкозо-6-фосфатазы (IGRP), или эпитопы, производные от инсулина, проинсулина или IGRP. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой один или более антигенов, которые выбирают из группы, состоящей из ID NO: 1767-1840, SEQ ID NO: 1842-1962, SEQ ID NO: 1964-2027, SEQ ID NO: 2029-2073, SEQ ID NO: 2075-2113, SEQ ID NO: 2115-2197, SEQ ID NO: 2199-2248, SEQ ID NO: 2250-2259, SEQ ID NO: 2261-2420, SEQ ID NO: 2422-2486 и SEQ ID NO: 2489-2505. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой инсулин, а связанная с антигеном частица имеет средний размер после синтеза около 300-800 нанометров и средний заряд после синтеза от около -30 до около -70 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 350-600 нанометров и средний заряд после синтеза от около -40 до около -60 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 500 нанометров и средний заряд после синтеза около -50 мВ. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой проинсулин, а связанная с антигеном частица имеет средний размер после синтеза около 300-800 нанометров и средний заряд после синтеза от около -30 до около -70 мВ. В определенных вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 400-600 нанометров и средний заряд после синтеза от около -40 до около -60 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 570 нанометров и средний заряд после синтеза около -45 мВ. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой IGRP, а связанная с антигеном частица имеет средний размер после синтеза около 300-800 нанометров и средний заряд после синтеза от около -30 до около -70 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 400-700 нанометров и средний заряд после синтеза от около -40 до около -60 мВ. В некоторых вариантах осуществления частица имеет средний размер после синтеза около 600 нанометров и средний заряд после синтеза около -40 мВ. В определенных вариантах осуществления частица представляет собой частицу полистирола, частицу карбоксилированного полистирола, частицу стабилизированного при помощи PLURIONICS пропиленсульфида или частицу сополимера молочной и гликолевой кислот.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта при помощи ферментозаместительной терапии, включающие введение упомянутому субъекту эффективного количества композиции, содержащей связанную с антигеном частицу, причем частица имеет отрицательный дзета-потенциал. В некоторых вариантах осуществления субъекта подвергают ферментозаместительной терапии для лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из гемофилии, гемофилии A, гемофилии B, болезни фон Виллебранда, болезни накопления мукополисахаридов, ганглиозидоза, щелочной гипофосфатазии, болезни накопления холестериновых эфиров, гиперурикемии, дефицита гормона роста, почечной анемии, болезни Гоше, болезни Фабри, болезни Гурлера, болезни Помпе, болезни Хантера и болезни Марото - Лами. В некоторых вариантах осуществления связанная с антигеном частица содержит один или более ферментов, которые выбирают из группы, состоящей из адвата, антигемофилического фактора, когената, элоктата, слитного белка рекомбинантного фактора VIII и Fc, рефакто, Novo VIIa, рекомбинантного фактора VII, эптакога альфа, геликсата, монанина, фактора коагуляции IX, вилата, цередазы, аглюцеразы, церезима, имиглюцеразы, Elelso, талиглюцеразы альфа, фабразима, агалсидазы бета, альдуразима, альфа-L-идуронидазы, миозима, кислой глюкозидазы, элапразы, идуронат-2-сульфатазы, наглазим арилсульфатазы B и N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой частицу полистирола, частицу карбоксилированного полистирола, частицу стабилизированного при помощи PLURIONICS пропиленсульфида или частицу сополимера молочной и гликолевой кислот. В определенных вариантах осуществления частица представляет собой сополимер, имеющий молярное соотношение от около 80 : 20 до около 100 : 0. В определенных вариантах осуществления частица представляет собой частицу полистирола, частицу карбоксилированного полистирола, частицу стабилизированного при помощи PLURIONICS пропиленсульфида или частицу сополимера молочной и гликолевой кислот. В других вариантах осуществления частица представляет собой частицу сополимера молочной и гликолевой кислот с соотношением полимолочная кислота : полигликолевая кислота в сополимере около 50 : 50. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой частицу сополимера молочной и гликолевой кислот с соотношением полимолочная кислота : полигликолевая кислота в сополимере около 50 : 50.

В дополнительном варианте осуществления введение частиц изобретения предотвращает накопление у субъекта нейтрофилов и других гранулоцитов. В дополнительном варианте осуществления частицы изобретения вводят субъекту с раковым заболеванием.

В одном варианте осуществления введение частиц изобретения усиливает регенерацию поврежденной ткани. В дополнительном варианте осуществления частицы усиливают регенерацию эпителиальных клеток. В другом дополнительном варианте осуществления частицы усиливают ремиелинизацию нейронов. В другом варианте осуществления у субъекта имеется аутоиммунное заболевание. В еще одном варианте осуществления у субъекта имеется воспалительное заболевание кишечника, включая язвенный колит и/или болезнь Крона. В еще одном варианте осуществления у субъекта имеется рассеянный склероз.

В некоторых вариантах осуществления композицию вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят подкожно, перорально, внутримышечно, в лимфатические узлы, внутрипортально или в виде аэрозоля. В одном варианте осуществления введение отрицательно заряженных частиц индуцирует антиген-специфическую толерантность у субъекта. В одном варианте осуществления частицы, индуцирующие антиген-специфическую толерантность, содержат один или более эпитопов, связанных с аллергией, аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием. В одном варианте осуществления эпитопы выбирают из описанных в таблице 2 или 3. В одном варианте осуществления отрицательно заряженные частицы представляют собой частицы полистирола, алмаза, стабилизированного при помощи PLURONICS® полипропиленсульфида или сополимера молочной и гликолевой кислот. В одном варианте осуществления частицы карбоксилированы. В одном варианте осуществления дзета-потенциал частиц составляет менее чем приблизительно -100 мВ. В одном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от около -75 мВ до 0 мВ, например от -50 мВ до 0 мВ, или от -100 мВ до -50 мВ, или от -75 мВ до -50 мВ, или от -50 мВ до -40 мВ. В одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 0,1 мкм до около 10 мкм, например от около 0,2 мкм до около 2 мкм, или от около 0,3 мкм до около 5 мкм, или от около 0,5 мкм до около 3 мкм, или от около 0,5 мкм до около 1 мкм.

В одном варианте осуществления у субъекта имеется аутоиммунное заболевание. В одном варианте осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой рассеянный склероз, склеродермию, диабет I типа, ревматоидный артрит, тиреоидит, системную красную волчанку, синдром Рейно, синдром Шегрена, аутоиммунный увеит, аутоиммунный миокардит, воспалительное заболевание кишечника, боковой амиотрофический склероз (БАС), системную волчанку, оптиконевромиелит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, тромботический тромбоцитопеническую пурпуру, мембранную нефропатию, буллезный пемфигоид, пемфигус вульгарис, миастению гравис, целиакию, язвенный колит или болезнь Крона. В одном варианте осуществления частица содержит полноразмерный полипептид или его фрагмент. В одном варианте осуществления частица содержит один или более эпитопов основного белка миелина. В одном варианте осуществления эпитоп основного белка миелина взят из SEQ ID NO: 4975 или SEQ ID NO: 4976. В одном варианте осуществления частицы содержат один или более эпитопов миелин-олигодендроцитарного гликопротеина. В одном варианте осуществления эпитоп миелин-олигодендроцитарного гликопротеина взят из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4978. В одном варианте осуществления частица содержит один или более инсулиновых эпитопов. В одном варианте осуществления один или более инсулиновых эпитопов взят из SEQ ID NO: 4981. В одном варианте осуществления частица содержит один или более эпитопов глутаматдекарбоксилазы. В одном варианте осуществления один или более эпитоп глутаматдекарбоксилазы взят из SEQ ID NO: 4982. В одном варианте осуществления частица содержит один или более эпитопов протеолипидного белка. В одном варианте осуществления эпитоп протеолипидного белка взят из SEQ ID NO: 4977. В одном варианте осуществления частица содержит один или более эпитопов глиадина. В одном варианте осуществления эпитопы глиадина содержат SEQ ID NO: 4983-4985.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении дополнительно предложен способ получения иммуномодифицированной частицы с отрицательным дзета-потенциалом, включающий этап, на котором обеспечивают взаимодействие предшественника иммуномодифицированной частицы с буферным раствором в условиях, способствующих образованию иммуномодифицированной частицы с отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления предшественник иммуномодифицированной частицы получают путем сополимеризации. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор имеет щелочной pH. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор представляет собой бикарбонат натрия, бикарбонат калия, бикарбонат лития, дигидрофосфат калия, дигидрофосфат натрия или дигидрофосфат лития.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая антиген, инкапсулированный внутрь ядра поверхностно-функционализированной липосомы. В дополнительном варианте осуществления липосома содержит фосфатидилхолин : фосфатидилглицерин : холестерин в соотношении 30 : 30 : 40. В еще одном дополнительном варианте осуществления упомянутый антиген содержит аутоиммунный антиген, антиген, экспрессированный на ткани для трансплантации субъекту, или аллерген. В некоторых вариантах осуществления частица представляет собой частицу сополимера молочной и гликолевой кислот с соотношением полимолочная кислота : полигликолевая кислота в сополимере около 50 : 50. В некоторых вариантах осуществления частицы содержат PEMA. В некоторых вариантах осуществления PEMA присутствует в концентрации от около 0,1% до около 2,0%.

Краткое описание рисунков

На Фиг. 1 показан (A) микрофаг частицы сополимера лактида и гликолида (PLG). B и C демонстрируют характеризацию частиц сополимера лактида и гликолида с функционализированной поверхностью при помощи динамического рассеяния света, включая анализ распределения размеров частиц, среднего размера (нм), ζ-потенциала (мВ) и эффективности связывания пептида (%) OVA_323-339 и PLP_139-151 с частицами PLG-PEMA. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 2,5 × 10⁵ импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида варьировалась в пределах 5-15% на партию, но по существу имела Z-средний диаметр 567 нм, максимальный диаметр 670 нм и коэффициент полидисперсности 0,209.

На Фиг. 2 показано, что PLG-наночастицы индуцируют антиген-специфическую толерантность. Иммунодоминантный эпитоп протеолипидного белка PLP_139-151 (PLG-PLP_139-151) использовали для индукции толерантности с целью предотвращения рецидива экспериментального аутоиммунного энцефалита (R-EAE). Мыши получали PLP_139-151-PLGA (N = 5), или OVA_323-339-PLGA (N = 5), или неконъюгированные PLGA (N = 5) на -7-е сутки относительно времени иммунизации (0-е сутки). Пик заболевания, как правило, наблюдали приблизительно на 12-14-е сутки и у мышей проводили балльную оценку клинической картины заболевания. Частицы без пептида или частицы, модифицированные контрольным пептидом OVA_323-339, не предотвращали индукцию заболевания. Однако балл клинической оценки PLGA-частиц, модифицированных PLP_139-151, составлял 0 (отсутствие заболевания) во всех случаях, за исключением того, что в период между 20-ми и 30-ми сутками наблюдали низкий балл клинической оценки менее 1.

На Фиг. 3 показано, что тип введенной частицы влиял на развитие EAE в мышиной модели. A) показывает средний балл клинической оценки и B) показывает средний суммарный балл у животных с EAE. Мыши получали OVA_323-339-PLS (N = 5), OVA_323-339-PLGA_PHOSPOREX (N = 5), OVA_323-339-PLGA_PEMA (N = 5), PLP_139-151-PLA (N = 5), PLP_139-151-PLGA_PHOSPOREX (N = 5) или PLP_139-151-PLG_PEMA (N = 5) на -7-е сутки относительно времени иммунизации (0-е сутки). Пик заболевания, как правило, наблюдали приблизительно на 12-14-е сутки и у мышей проводили балльную оценку клинической картины заболевания. Частицы любой композиции, модифицированные контрольным пептидом OVA_323-339, не предотвращали индукцию заболевания. Однако связанные с PLP_139-151 PLG-гранулы более эффективно снижали индукцию R-EAE, чем связанные с PLP_139-151 коммерческие PLG-частицы (phosphorex) или частицы полистирола.

На Фиг. 4 показано, что у мышей, получавших растворимый OVA, на 28-е сутки наблюдалось снижение температуры по сравнению с животными, получавшими частицы OVA-PLG. В течение 1 часа после введения частиц не наблюдалось никакого снижения температуры тела.

На Фиг. 5 показано, что введение частиц PLP-PLG в ходе ремиссии не вызывает смертности, ассоциированной с анафилактической реакцией. EAE индуцировали у самок мышей линии SJL/J возрастом шесть - восемь недель путем подкожной инъекции PLP_139-151 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) и отслеживали и регистрировали развитие клинических признаков заболевания (B). На 21-е сутки после индукции заболевания мышам делали внутривенные инъекции растворимого PLP_139-151 (белые квадраты)_, растворимого OVA_323-339 (белые круги) или тех же самых пептидов, связанных с PLG-наночастицами (заштрихованы). Температуру животных отслеживали и регистрировали каждые 10 минут в течение 1 часа после инъекции (A).

На Фиг. 6 показано введение оптимальной дозы PLP_139-151-PLG за семь суток перед индукцией заболевания. Развитие клинических признаков заболевания измеряли в сравнении с мышами SJL/J, получавшими OVA_323-339 -PLG (A). Самкам мышей SJL/J в возрасте шести - восьми недель внутривенно вводили PLG-наночастицы, связанные либо с PLP_139-151 (квадраты), либо с OVA_323-339 (круги). EAE индуцировали путем подкожной инъекции PLP_139-151 в CFA через 7 суток (B), 25 суток (C) или 50 суток (D). У животных из панели B отслеживали клинические признаки заболевания в течение 100 суток. На 8-е сутки после индукции заболевания у субпопуляции мышей, показанных на панели В, проводили реакцию гиперчувствительности замедленного типа (DTH) (E). Избранным типичным животным из панели B, праймированным при помощи PLP_139-151/CFA (OVA_323-339-PLG и PLP_139-151-PLG), наносили на ухо в качестве раздражителя праймирующий эпитоп PLP_139-151 и контрольный пептид OVA_323-339. Через 24 ч определяли набухание уха в качестве показателя DTH, с вычитанием ответов, наблюдавшихся перед раздражением. Самкам мышей SJL/J в возрасте шести - восьми недель вводили внутривенно PLG-наночастицы, связанные с PLP_178-191 (треугольник), OVA_323-339 (круг) или PLP_139-151 (квадрат) или только несвязанные частицы (пустой круг) (F). EAE индуцировали через 7 суток после этого путем внутривенного введения PLP_178-191 в CFA и отслеживали признаки заболевания в показанных временных точках.

На Фиг. 7A-D показано, что профилактическая толерантность была наиболее эффективна при внутривенном или внутрибрюшинном введении частиц PLG-PLP_139-151. У животных, получавших PLP_139-151-PLG внутривенно, заболевание не развивалось, и в большинстве временных точек средний балл клинической оценки был равен 0.

На Фиг. 8A-F показано, что введение частиц OVA_323-339-PLG ингибировало ответы Th1 и Th17 у получавших лечение животных.

На Фиг. 9A-C показано снижение инфильтрации иммунных клеток в спинной мозг у животных, получавших PLP_139-151-PLG, которая была более сходна с нормальной тканью, чем с тканью животных, получавших OVA_323-339-PLG. У животных, получавших OVA_323-339-PLG, наблюдалось положительное окрашивание на CD45, CD4 и CD11b; тогда как у животных, получавших PLP_139-151-PLG, окрашивание на эти факторы было минимальным.

На Фиг. 10A-C показано, что введение частиц PLP_139-151-PLG уменьшает нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и активацию макрофагов в спинном мозге получавших лечение мышей. Животные получали либо полный адъювант Фрейнда (CFA), либо частицы OVA_323-339-PLG, либо частицы PLP_139-151-PLG. Определяли баллы клинической оценки клинических признаков и процентную долю возникновения EAE (B), а спинной мозг контролировали при помощи метода визуализации in vivo (A и C).

На Фиг. 11A и B показан спинной мозг получавших лечение мышей с использованием визуализации in vivo. Панели C-F представляют собой графики, показывающие количественную оценку данных визуализации.

На Фиг. 12 показано, что введение PLG-частиц с инкапсулированным в них пептидом PLP_139-151 ингибировало индукцию R-EAE у мышей. Возможность инкапсуляции аутоантигенов предусматривает использование сложных смесей белков или даже гомогенатов органов, что невозможно при поверхностном связывании, и позволяет обеспечить большее покрытие антигеном и, таким образом, более эффективное распределение эпитопов.

На Фиг. 13 показано, что животные, получавшие частицы PLP_139-151-PLG и антитело к CD25, демонстрировали временами больший средний балл клинической оценки, чем животные, получавшие частицы PLP_139-151-PLG и контрольное антитело IgG.

На Фиг. 14 показана терапевтическая толерантность, индуцированная частицами PLP_139-151-PLG, при активном и адоптивном EAE. Адоптивный EAE индуцировали у самок мышей SJL/J возрастом шесть - восемь недель путем адоптивного переноса 2,5 x 10⁶ бластных клеток, активированных при помощи PLP_139-151. Мыши получали внутривенно пептид PLP_139-151 (квадраты) или OVA_323-339 (круги), связанный с PLG-наночастицами размером 500 нм, через 2 суток (A), 14 суток (C), 18 суток (E) или 21 сутки (F) после индукции заболевания. Балльную клиническую оценку заболевания определяли в сравнении с таковой после обработки спленоцитами, связанными с антигеном (A). У мышей с толерантностью, вызванной PLP_139-151 или OVA_323-339, на 42-е сутки отбирали головной и спинной мозг для гистологического анализа. Срезы, взятые у мышей из панели A, окрашивали на белок PLP и на CD45 (B). Срезы спинного мозга, взятые у мышей из панели (C), окрашивали красителем Luxol Fast Blue (D). Зоны демиелинизации и инфильтрации клеток показаны стрелками.

На Фиг. 15 представлены графики, показывающие средние баллы клинической оценки у мышей с активным EAE и адоптивным EAE после лечения спленоцитами (SP) или PLG-частицами, конъюгированными с OVA_323-339 или PLP_139-151. Мыши получали внутривенно PLP_139-151-SP, PLP_139-151-PLG, или OVA_323-339-SP, или OVA_323-339-PLG, причем пептид был связан с наночастицами размером 500 нм, через 10 суток (A) или через 2 суток (B) после индукции заболевания, и определяли средний балл клинической оценки. В обоих случаях частицы PLP_139-151-PLG индуцировали у мышей толерантность.

На Фиг. 16 показано, что инфильтрация клеток в центральную нервную систему также существенно снижалась у мышей с толерантностью, вызванной PLP-PLG. SJL/J-мышам внутривенно вводили PLG-наночастицы размером 500 нм, связанные с PLP_139-151 (квадраты) или OVA_323-339 (круги), через 2 суток после индукции EAE методом адоптивного переноса. На пике заболевания (14-е сутки) забирали головной и спинной мозг и методом проточной цитометрии определяли количество лимфоцитов (B), антигенпредставляющих клеток (АПК) (C), микроглии (D), периферических дендритных клеток (E), миелоидных дендритных клеток (F) и макрофагов (G). Стратегия дискриминации этих популяций показана в (A). Препараты клеток ЦНС стимулировали форболмеристатацетатом (PMA) и иономицином за 5 ч перед внутриклеточным окрашиванием на IL-17A и IFN-γ (H).

На Фиг. 17 показано, что введение пептида PLP_139-151, инкапсулированного в PLG-частицу, индуцирует толерантность при введении частицы с PBS. Однако введение антитела к PD-1 уменьшает эту толерантность.

На Фиг. 18 показано, что введение пептида PLP_139-151, инкапсулированного в PLG-частицу, индуцирует толерантность при введении частицы с PBS. Введение антитела к CD40 уменьшает эту толерантность, но уменьшение толерантности обращается при добавлении антитела к IL-12.

На Фиг. 19A-G показано, что профилактическое введение OVA-PLG уменьшало секрецию IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 и снижало уровни сывороточного OVA IgE и эозинофилов в легком.

На Фиг. 20 показано, что пептид OVA, инкапсулированный в частицы PLG, при профилактическом введении ингибирует OVA-специфический вторичный иммунный ответ in vitro в медиастинальных лимфоузлах. Пролиферация в лимфоузлах, наблюдавшаяся после повторной стимуляции 25 мкг OVA, снижается у животных, получавших OVA-PLG (A). Более того, введение OVA-PLG снижает выброс цитокинов после повторной стимуляции OVA. Уровни IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 снижаются у мышей, получавших OVA-PLG (B).

На Фиг. 21A и В показано, что терапевтическое введение OVA-PLG уменьшает секрецию IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 и снижает уровни сывороточного OVA IgE и эозинофилов в легком.

На Фиг. 22 показано, что пептид OVA, инкапсулированный в частицы PLG, при терапевтическом введении снижает уровень OVA-специфических Th2-цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) лучше, чем PLG-частицы, связанные с OVA. Мышам внутрибрюшинно вводили OVA/Alum в дозе 10 мкг/мышь на 0-е сутки и на 14­е сутки. Мышам внутривенно вводили либо OVA, связанный с PLG-частицами, либо OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, на 28-е сутки и на 42-е сутки. В период с 56-х по 58-е сутки мышам трижды вводили аэрозольный OVA. На графиках показана секреция цитокинов при введении животным OVA, связанного с PLG-частицами (A), либо OVA, инкапсулированного в PLG-частицы (B).

На Фиг. 23 показан уровень глюкозы в крови животных с диабетом I типа после введения частиц p31-PLG. Введение наночастиц PLG, связанных с пептидом p31, приводило к снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с уровнем, наблюдавшимся при введении частиц, связанных с пептидом MOG_35-55 (A и B). Наблюдавшаяся у животных процентная доля клеток, секретирующих IFNγ, также снижалась у мышей, получавших p31-PLG, по сравнению с мышами, получавшими частицы MOG_35-55-PLG (C).

На Фиг. 24A-B показано, что для индуцируемой p31-PLG толерантности необходимы клетки Treg. Диабет I типа индуцировали методом адоптивного переноса. Через два часа после переноса активированных клеток мышам NOD.SCID у мышей вызывали толерантность либо частицами p31-PLG, либо частицами MOG_35-55-PLG. Уменьшение численности клеток Treg нарушало толерантность, вызванную введением частиц p31-PLG.

На Фиг. 25 показано, что введение связанных с инсулином PLG-частиц существенно увеличивало долю мышей, у которых диабет не развивался в течение более чем 300 суток (69,6% по сравнению с 22,7%; p = 0,0027). NOD-мышам в возрасте 6, 8 и 10 недель посредством внутривенного введения вводили PLG-частицы, связанные либо с BSA (N = 22), либо с инсулином (N = 23). Проводили оценку развития диабета у мышей.

На Фиг. 26 показана процентная доля донорских клеток CD45.1, наблюдавшаяся у мыши-реципиента. У самок мышей CD45.2 толерантность вызывали введением OVA-PLG или Dby-PLG на -7-е сутки. На -1-е сутки мыши получали дозу облучения 200 рад, а затем им трансплантировали 1 x 10⁶, 5 x 10⁶ или 1 x 10⁷ клеток костного мозга самцов мышей CD45.1 на 0-е сутки. Толерантность у мышей-реципиентов вызывали при помощи OVA-PLG, Dby-SP или Dby-PLG на 1-е сутки и отбирали кровь для анализа химеризма методом FACS.

На Фиг. 27 показана процентная доля донорских клеток CD45.1 у мышей-реципиентов после вызова толерантности при помощи OVA-PLG, Dby-SP или Dby-PLG на 1-е сутки. У одной мыши из группы положительного контроля не наблюдали значимого приживления (~ 10%). Ни у одной мыши отрицательного контроля не наблюдали приживленных донорских клеток. У одной мыши из группы Dby-SP не наблюдали значимого приживления (~ 10%). У двух мышей OVA-PLG донорские клетки прижились (~ 10%): у одной произошло полное отторжение к 16-й неделе. У одной мыши Dby-PLG отторжение началось на 12-й неделе и к 16-й неделе дошло до 10%. У группы Dby-PLG приживление находилось в диапазоне 10-56% к 16-й неделе. У мышей OVA-PLG наблюдали: 1) спонтанное приживление, 2) гомологию последовательности между OVA323 и Dby или 3) толерогенные свойства частиц. Частицы Dby-PLG обеспечивали большее приживление, чем Dby-SP и OVA-PLG.

На Фиг. 28 показано, что время вызова толерантности влияет на процентную долю клеток CD45.1 у мыши-реципиента. В группе положительного контроля наблюдали меньшее приживление (~ 4%), чем ожидалось (~ 10%). Одна мышь из группы отрицательного контроля имела 5% приживление. Из всех 3 групп OVA-PLG приживление демонстрировала одна мышь в группе -7-е сутки, +1-е сутки (12%). Толерантность на 1-е сутки имеет большую клиническую значимость, чем толерантность на -7-е сутки.

На Фиг. 29 показано, что меченные кумарином-6 PLGA-частицы, связанные или не связанные с антигеном, отслеживали через 3 часа после введения, но не через 24 часа после введения. Частицы отслеживали через 3 часа после введения, но не через 24 часа после введения. Срезы селезенки (левый столбец), печени (средний столбец) и легкого (правый столбец) от интактных мышей без инъекций (верхний ряд) и от мышей, получавших внутривенно флуоресцентные микрочастицы PLGA/PEMA, взятые через 3 ч после инъекции (средний ряд) и через 24 ч после инъекции (нижний ряд), с контрастным окрашиванием DAPI.

На Фиг. 30 показано, что PLGA-частицы через 6 и 15 часов колокализуются с клетками F4/80⁺ в печени.

На Фиг. 31 показано, что макрофаги краевой зоны преимущественно захватывают меченные TAMRA частицы, связанные с PLP_139-151, через 24 часа после внутривенной инфузии. Наибольшая процентная доля клеток PLP_139-151⁺ представляет собой макрофаги краевой зоны.

На Фиг. 32 показана зависимость ежедневного среднего балла клинической оценки от количества суток после праймирования PLP139-151/CFA. R-EAE, индуцированный PLP139-151/CFA, ингибируется у мышей SJL/J путем индукции иммунологической толерантности с помощью поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своем ядре растворимый PLP139-151.

На Фиг. 33 показано, что мыши, получавшие инкапсулированный OVA-PLG, демонстрировали наибольшее снижение накопления эозинофилов.

На Фиг. 34 показано, что мыши, получавшие инкапсулированный OVA-PLG, демонстрировали наибольшее снижение уровня IgE в сыворотке по сравнению с не получавшими лечение или контрольными получавшими лечение животными.

На Фиг. 35 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц, содержащих в своих ядрах растворимый PLP139-151, сополимера лактида и гликолида посредством анализа динамического светорассеяния. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 1,792 x 105 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела Z-средний диаметр 584 нм, максимальный диаметр 679 нм и коэффициент полидисперсности 0,162. Эти результаты являются типичными для 6 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 36 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый PLP139-151, посредством измерения ζ-потенциала. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 6,67 x 104 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела максимальный ζ-потенциал -48,9 мВ и ζ-отклонение 5,14 мВ. Эти результаты являются типичными для 6 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 37 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин, сополимера лактида и гликолида посредством анализа динамического светорассеяния. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 1,822 x 105 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела Z-средний диаметр 569,7 нм, максимальный диаметр 700,3 нм и коэффициент полидисперсности 0,230. Эти результаты являются типичными для 3 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 38 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин, посредством измерения ζ-потенциала. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 2,67 x 104 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела максимальный ζ-потенциал -52,2 мВ и ζ-отклонение 5,38 мВ. Эти результаты являются типичными для 3 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 39 представлен график, демонстрирующий, что поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие в своих ядрах растворимый пептид PLP_139-151, индуцируют иммунологическую толерантность на мышиной модели рассеянного склероза. Животные получали либо поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие в своих ядрах растворимый пептид PLP_139-151 (круги), либо поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие в своих ядрах растворимый пептид OVA_323-339 (квадраты). Средний балл клинической оценки животных, получавших липосомы с пептидом PLP_139-151, был ниже, чем у животных, получавших липосомы с пептидом OVA_323-339.

На Фиг. 40 показано, что заряд введенной частицы влиял на развитие EAE в мышиной модели. Панель (A) показывает средний балл клинической оценки, а панель (B) показывает средний суммарный балл у животных с EAE. Мыши получали TIMP (толерогенные иммуномодифицирующие частицы) с зарядом -60 мВ или -25 мВ, конъюгированные с антигеном. Мышам вводили OVA_323-339-TIMP_-60мв, OVA_323-339-PLGA_-25мв, PLP_139-151-TIMP_-60мв или PLP_139-151-PLGA_-25мв и определяли балльную клиническую оценку заболевания. Более отрицательно заряженные частицы TIMP_-60мв индуцировали толерантность более эффективно, чем частицы PLGA_-25мв.

На Фиг. 41 показано, что заряд иммуномодифицирующей частицы важен для направления иммуномодифицирующей частицы к антигенпредставляющей клетке. Животным дикого типа или животным MARCO -/+ вводили либо PS-IMP, либо носитель. Результаты показывают, что частицы со сниженным отрицательным зарядом имеют меньшую эффективность из-за меньшего взаимодействия с фагоцитарным рецептором MARCO (A). Антитело к MARCO само по себе не способно обеспечить эффективность, аналогичную PLGA IMP (B).

На Фиг. 42 показаны основные параметры частиц, необходимые для толерантности в мышиной модели EAE. На панели (A) показано, что наиболее эффективным является средний размер частиц 500 нм. Мышам вводили 500 нм частицы OVA_323-339-PSB, 100 нм частицы PLP_139-151-PSB, 500 нм частицы PLP_139-151-PSB, 1,75 мкм частицы PLP_139-151-PSB или 4,5 мкм частицы PLP_139-151-PSB и определяли балльную клиническую оценку заболевания. На панели (B) показано, что через 24 часа после внутривенной инфузии флуоресцентно-меченые частицы с соотношением 50 : 50 лактид : гликолид практически выводились из селезенки, печени и легкого.

На Фиг. 43 показано, что TIMP с инкапсулированными антигенами являются более эффективными, чем связанные с пептидом частицы. В мышиной модели аллергии на животных воздействовали OVA в качестве антигена, а затем вводили пустые частицы PLG, не вводили ничего, вводили PLGA-частицы с OVA, связанным с наружной поверхностью частицы (A), или вводили PLGA-частицы с OVA, инкапсулированным внутрь частицы (TIMP) (B). На панели (A) показано, что частицы OVA-PLG с присоединенным к поверхности пептидом не снижают TH2-ответ. На панели (B) показано, что частицы TIMP_PEMA-60мв (OVA инкапсулирован внутрь частицы) ингибируют TH2-ответ. На панели (C) показано, что частицы TIMP_PEMA-60мв (OVA инкапсулирован внутрь частицы) ингибируют вторичный иммунный ответ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наночастицы, связанные с антигеном, могут индуцировать толерантность к аутоиммунному заболеванию и снижать иммунный ответ. Эти частицы могут индуцировать толерантность независимо от того, связаны они с поверхностью частицы или инкапсулированы внутри нее. Следовательно, эти частицы могут подходить для лечения любого заболевания или состояния, которое характеризуется чрезмерным воспалительным иммунным ответом, такого как аутоиммунные заболевания или аллергии.

В настоящем документе термин «частица» относится к очень малому количеству любой композиции веществ нетканевого происхождения, это может быть сфера или сферический элемент, гранула или липосома. Термин «частица», термин «иммуномодифицирующая частица», термин «частица-носитель» и термин «гранула» могут использоваться на взаимозаменяемой основе в зависимости от контекста. Кроме того, термин «частица» также может охватывать гранулы и сферы.

Термин «отрицательно заряженная частица» в настоящем документе означает частицы, модифицированные таким образом, чтобы иметь суммарный заряд поверхности меньше нуля.

«Карбоксилированные частицы», или «карбоксилированные гранулы», или «карбоксилированные сферы» включают в себя любую частицу, модифицированную таким образом, чтобы на ее поверхности находилась карбоксильная группа. В некоторых вариантах осуществления добавление карбоксильной группы усиливает поглощение частиц фагоцитами/моноцитами из системы кровообращения, например, посредством взаимодействия с фагоцитарными рецепторами, такими как MARCO. Карбоксилирование частиц можно произвести с помощью любого соединения, которое вводит карбоксильные группы, включая, без ограничений, поли(этилен-малеиновый ангидрид) (PEMA).

В настоящем документе «антигенный фрагмент» относится к фрагменту, например пептиду, который обнаруживается иммунной системой хозяина. Примеры антигенных фрагментов включают в себя, без ограничений, ферменты, аутоантигены и/или бактериальные или вирусные белки, пептиды, лекарственные средства или компоненты. Без связи с какой-либо теорией, притом что карбоксилированные гранулы сами по себе могут обнаруживаться иммунной системой, в целях изобретения карбоксилированные гранулы, к которым ничего больше не присоединено, не считаются «антигенным фрагментом».

В настоящем документе «свободные гранулы», или «свободные частицы», или «свободные сферы» относятся к гранулам, частицам или сферам, которые не были карбоксилированы.

В настоящем документе «провоспалительные медиаторы» или «провоспалительные полипептиды» относятся к полипептидам или их фрагментам, которые вызывают, поддерживают или продлевают воспаление у субъекта. Примеры провоспалительных медиаторов включают в себя, без ограничений, цитокины и хемокины.

В настоящем документе термин «воспалительный моноцит» относится к любой миелоидной клетке, экспрессирующей любую комбинацию CD14/CD26 и CCR2.

В настоящем документе термин «ингибиторный нейтрофил» относится к нейтрофилам и/или супрессорным клеткам моноцитарного происхождения.

В настоящем документе термин «Th-клетка» или «хелперная Т-клетка» относится к клеткам CD4⁺. Т-клетки CD4⁺ помогают другим белым клеткам крови осуществлять иммунологические процессы, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и В-клетки памяти и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов. T-клетки активируются, когда пептидные антигены представляются молекулами MHC класса II, экспрессированными на поверхности антигенпредставляющих клеток (АПК).

В настоящем документе термин «клетка Th1» относится к субпопуляции Th-клеток, продуцирующей провоспалительные медиаторы. Клетки Th1 секретируют цитокины, усиливающие иммунный ответ и играющие роль в защите хозяина от патогенов, отчасти путем привлечения нейтрофилов и макрофагов к инфицированным тканям. Клетки Th1 секретируют такие цитокины, как IFN-гамма, IL2, IL-10 и ФНО-альфа/бета, координируя защиту от внутриклеточных патогенов, таких как вирусы и некоторые бактерии.

В настоящем документе термин «клетки Th2» относится к субпопуляции Th-клеток, которая участвует в активации и поддержании опосредуемого антителами иммунного ответа против внеклеточных паразитов, бактерий, аллергенов и токсинов. Клетки Th2 участвуют в реализации этих функций, продуцируя различные цитокины, такие как IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 и IL-17E (IL-25), ответственные за продукцию антител, активацию эозинофилов и ингибирование некоторых функций макрофагов, тем самым обеспечивая независимые от фагоцитов защитные ответы.

В настоящем документе термин «клетка Th17» относится к субпопуляции Th-клеток. Клетки Th17 секретируют цитокины, усиливающие иммунный ответ и играющие роль в защите хозяина от патогенов путем привлечения нейтрофилов и макрофагов к инфицированным тканям. Клетки Th17 секретируют такие цитокины, как IL17, IL21, IL22, IL24, IL26 и ФНО-альфа, координируя защиту от внеклеточных патогенов, включая грибы и бактерии.

Термин «связанный» в настоящем документе относится к антигену, связанному с наружной поверхностью частицы или инкапсулированному внутри частицы. Таким образом, термин «антиген, связанный с частицей», включает в себя как связывание с поверхностью, так и инкапсулирование внутрь частицы.

Термин IMP в настоящем документе означает иммуномодифицирующие частицы, которые не связаны с антигеном. Термин TIMP в настоящем документе означает толерогенные иммуномодифицирующие частицы, которые связаны с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антиген прикрепляется к поверхности TIMP. В других вариантах осуществления антиген инкапсулирован внутри TIMP.

Частицы могут быть любой формы или конформации. Однако в некоторых вариантах осуществления предпочтительным является применение частиц, которые менее склонны к агрегации in vivo. В этих вариантах осуществления приведены примеры частиц, которые имеют сферическую форму.

Другой аспект изобретения относится к композиции, содержащей иммуномодифицированную частицу, имеющую отрицательный дзета-потенциал и не содержащую антигенных фрагментов. В дополнительном варианте осуществления в изобретении предложены композиции, содержащие иммуномодифицированную частицу с отрицательным дзета-потенциалом, связанную с антигеном. В дополнительном варианте осуществления антиген связан с наружной поверхностью частицы. В предпочтительном варианте осуществления антиген инкапсулирован внутри частицы.

Еще один аспект изобретения относится к способу получения иммуномодифицированной частицы, имеющей отрицательный дзета-потенциал и не содержащей антигенных фрагментов. Способ включает обеспечение взаимодействия предшественника иммуномодифицированной частицы с буферным раствором в условиях, способствующих образованию иммуномодифицированной частицы с отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления изобретения предшественник иммуномодифицированной частицы получают посредством сополимеризации. Микроструктура частицы может зависеть от способа сополимеризации.

В некоторых вариантах осуществления молекула антигенного пептида связывается с частицей-носителем (например, иммуномодифицированной частицей) при помощи конъюгатной молекулы и/или линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления связывание антигенного пептида и/или апоптотической сигнальной молекулы с носителем (например, PLG-частицей) включает одно или более ковалентных и/или нековалентных взаимодействий. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид прикрепляется к поверхности частицы-носителя с отрицательным дзета-потенциалом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид инкапсулируется внутрь частицы-носителя с отрицательным дзета-потенциалом.

В одном варианте осуществления буферный раствор, контактирующий с иммуномодифицированной частицей, может иметь щелочной pH. Подходящий щелочной pH для щелочного раствора включает в себя 7,1; 7,5; 8,0; 8,5; 9,5; 10,0; 10,5; 11,0; 11,5; 12,0; 12,5; 13,0 и 13,5. Буферный раствор также может состоять из любого подходящего основания и его конъюгата. В некоторых вариантах осуществления изобретения буферный раствор может включать в себя, без ограничений, бикарбонат натрия, бикарбонат калия, бикарбонат лития, дигидрофосфат калия, дигидрофосфат натрия или дигидрофосфат лития и их конъюгаты.

В одном варианте осуществления изобретения иммуномодифицированные частицы содержат сополимеры. Эти сополимеры могут иметь различное молярное соотношение. Подходящее соотношение сополимеров иммуномодифицированных частиц, представленных в настоящем изобретении, может составлять 25 : 75, 30 : 70, 35 : 65, 40 : 60, 45 : 55, 50 : 50, 55 : 45, 60 : 40, 65 : 35, 70 : 30, 75 : 25, 80 : 20, 81 : 19, 82 : 18, 83 : 17, 84 : 16, 85 : 15, 86 : 14, 87 : 13, 88 : 12, 89 : 11, 90 : 10, 91 : 9, 92 : 8, 93 : 7, 94 : 6, 95 : 5, 96 : 4, 97 : 3, 98 : 2, 99 : 1 или 100 : 0. В другом варианте осуществления сополимер может представлять собой периодические, статистические, линейные, разветвленные сополимеры (включая звездообразные, щеткообразные или гребнеобразные сополимеры). В некоторых вариантах осуществления соотношение сополимеров может составлять, без ограничений, полистирол : поли(винилкарбоксилат)/80 : 20, полистирол : поли(винилкарбоксилат)/90 : 10, поли(винилкарбоксилат) : полистирол/80 : 20, поли(винилкарбоксилат) : полистирол/90 : 10, полимолочная кислота : полигликолевая кислота/50 : 50, полимолочная кислота : полигликолевая кислота/80 : 20 или полимолочная кислота : полигликолевая кислота/90 : 10.

В одном варианте осуществления частицы изобретения получают путем добавления композиции, содержащей полимер (например, PLGA) к раствору поли(этилен-малеинового ангидрида) (PEMA). Концентрация PEMA в растворе может составлять от около 0,1% до около 10%. В одном варианте осуществления концентрация PEMA в растворе составляет от около 0,2% до около 5%. В другом варианте осуществления концентрация PEMA в растворе составляет от около 0,1% до 4%. В другом варианте осуществления концентрация PEMA в растворе составляет от около 0,1% до 2%. В другом варианте осуществления концентрация PEMA в растворе составляет от около 0,5% до 1%. В одном варианте осуществления процентная доля PEMA в растворе составляет 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10%. В одном варианте осуществления процентная доля PEMA в растворе составляет около 0,5%. В другом варианте осуществления процентная доля PEMA в растворе составляет около 1,0%. Другие соединения, которые можно использовать, включают в себя, без ограничений, поли(этилен-альт-малеиновый ангидрид), поли(изобутилен-со-малеиновая кислота), поли(метилвиниловый эфир-альт-малеиновая кислота), поли(метилвиниловый эфир-альт-малеиновой кислоты моноэтиловый эфир), поли(метилвиниловый эфир-альт-малеиновый ангидрид), поли(метилвиниловый эфир-альт-малеиновый ангидрид), сшитый с 1,9-декадиеновым порошком и/или поли(стирол-альт-малеиновой кислоты) натриевая соль.

В одном варианте осуществления частица представляет собой липосому. В дополнительном варианте осуществления частица представляет собой липосому, содержащую следующие липиды в следующих молярных соотношениях - 30 : 30 : 40 фосфатидилхолин : фосфатидилглицерин : холестерин. В еще одном варианте осуществления антиген инкапсулирован внутри липосомы.

Необязательно, чтобы все частицы были одного размера, хотя частицы, как правило, должны иметь размер, достаточный для изолирования в селезенке или печени и запуска фагоцитоза или захвата посредством рецепторного или нерецепторного механизма антигенпредставляющей клеткой, включая эндотелиальную клетку или другую клетку системы мононуклеарных фагоцитов (MPS). Предпочтительно частицы имеют микроскопический или наноскопический размер для усиления растворимости, предотвращения возможных осложнений, вызванных агрегацией in vivo, и содействия пиноцитозу. Размер частиц может представлять собой фактор, влияющий на поглощение из интерстициального пространства в области созревания лимфоцитов. Частица со средним диаметром от около 0,1 мкм до около 10 мкм способна запускать фагоцитоз. Таким образом, в одном варианте осуществления диаметр частицы находится в этих пределах. В другом варианте осуществления средний диаметр частицы составляет от около 0,3 мкм до около 5 мкм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частицы составляет от около 0,5 мкм до около 3 мкм. В другом варианте осуществления средний диаметр частицы составляет от около 0,2 мкм до около 2 мкм. В дополнительном варианте осуществления средний размер частицы составляет около 0,1 мкм или около 0,2 мкм, или около 0,3 мкм, или около 0,4 мкм, или около 0,5 мкм, или около 1,0 мкм, или около 1,5 мкм, или около 2,0 мкм, или около 2,5 мкм, или около 3,0 мкм, или около 3,5 мкм, или около 4,0 мкм, или около 4,5 мкм, или около 5,0 мкм. В конкретном варианте осуществления частица имеет средний размер 0,5 мкм. В некоторых вариантах осуществления общая масса частиц составляет менее около 10 000 кДа, менее около 5000 кДа или менее около 1000 кДа, 500 кДа, 400 кДа, 300 кДа, 200 кДа, 100 кДа, 50 кДа, 20 кДа, 10 кДа. Частицы в композиции необязательно должны быть одинакового диаметра. В качестве примера, фармацевтический состав может содержать множество частиц, некоторые из которых имеют размер около 0,5 мкм, а другие - около 1,0 мкм. Любое сочетание размеров частиц в этих указанных диапазонах будет подходящим.

Частицы настоящего изобретения могут обладать определенным дзета-потенциалом. В определенных вариантах осуществления дзета-потенциал является отрицательным. В одном варианте осуществления дзета-потенциал составляет менее чем приблизительно -100 мВ. В одном варианте осуществления дзета-потенциал составляет менее чем приблизительно -50 мВ. В определенных вариантах осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -100 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -75 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -60 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -50 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -40 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -30 мВ до 0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -20 мВ до +0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -10 мВ до -0 мВ. В дополнительном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -100 мВ до -50 мВ. В другом конкретном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -75 мВ до ­50 мВ. В конкретном варианте осуществления дзета-потенциал частиц находится в диапазоне от -50 мВ до -40 мВ.

В некоторых вариантах осуществления заряд носителя (например, положительный, отрицательный, нейтральный) выбирают для придания специфичных для применения полезных свойств (например, физиологической совместимости, благоприятных взаимодействий пептида с поверхностью и т. п.). В некоторых вариантах осуществления носитель имеет суммарный нейтральный или отрицательный заряд (например, для уменьшения неспецифического связывания с клеточной поверхностью, которая обычно несет суммарный отрицательный заряд). В некоторых вариантах осуществления носители могут быть конъюгированы, прямо или опосредованно, с антигеном, для которого желательно выработать толерантность (который в настоящем документе также именуется антиген-специфическим пептидом, антигенным пептидом, аутоантигеном, индуцирующим антигеном или антигеном для индукции толерантности). В некоторых случаях носитель имеет множество сайтов связывания (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10… 20… 50… 100 или более), чтобы существовало множество экземпляров антиген-специфического пептида или множества разных пептидов, экспонированных на поверхности (например, для повышения вероятности толерогенного ответа). В некоторых вариантах осуществления носитель экспонирует один тип антигенного пептида. В некоторых вариантах осуществления носитель экспонирует на поверхности множество разных антигенных пептидов. В некоторых вариантах осуществления поверхность носителя имеет функциональные группы для ковалентного прикрепления выбранных фрагментов (например, антигенных пептидов). В некоторых вариантах осуществления функциональные группы на поверхности носителя предоставляют сайты для нековалентного взаимодействия с выбранными фрагментами (например, антигенными пептидами). В некоторых вариантах осуществления носитель имеет поверхность, на которой конъюгируемые фрагменты могут абсорбироваться без образования химических связей.

Размер и заряд частиц является критичным для индукции толерантности. Хотя частицы будут отличаться по размеру и заряду в зависимости от инкапсулированного в них антигена (см. таблицу 1, где представлены примеры конкретных частиц), в целом частицы настоящего изобретения эффективно индуцируют толерантность, если имеют размер от около 100 нанометров до около 1500 нанометров и имеют заряд от 0 до около -70 мВ, а также являются наиболее эффективными для индуцирования толерантности, если имеют размер 400-800 мкм и заряд от около -25 мВ до -70 мВ. Кроме того, как показано в таблице 1, отчасти из-за концентрации частиц и присутствия сахарозы и D-маннита в процессе лиофилизации, средний размер и заряд частиц могут немного изменяться в ходе лиофилизации, и, следовательно, приводятся средние размеры как после синтеза, так и после лиофилизации. В настоящем документе термины «размер после синтеза» и «заряд после синтеза» относятся к размеру и заряду частиц перед лиофилизацией. Термины «размер после лиофилизации» и «заряд после лиофилизации» относятся к размеру и заряду частиц после лиофилизации.

ТАБЛИЦА 1. АНАЛИЗ ТИПИЧНЫХ ЧАСТИЦ

В некоторых вариантах осуществления частица является неметаллической. В этих вариантах осуществления частица может быть образована из полимера. В предпочтительном варианте осуществления частица биологически разлагается в организме субъекта. В этом варианте осуществления частицы могут вводиться субъекту во множестве доз, при этом не происходит накопление частиц в организме субъекта. Примеры подходящих частиц включают в себя частицы полистирола, PLGA-частицы, частицы стабилизированного при помощи PLURIONICS полипропиленсульфида и частицы алмаза.

Предпочтительно поверхность частицы образована из материала, минимизирующего неспецифические или нежелательные биологические взаимодействия. Взаимодействия между поверхностью частицы и интерстициальной тканью могут влиять на лимфатическое поглощение. Поверхность частиц может быть покрыта материалом для предотвращения или уменьшения неспецифических взаимодействий. Пространственная стабилизация путем покрытия частиц гидрофильными слоями, такими как поли(этиленгликоль) (ПЭГ) и его сополимеры, такими как PLURONICS® (включая сополимеры поли(этиленгликоля)-блок-поли(пропиленгликоля)-блок-поли(этиленгликоля)), может уменьшать неспецифические взаимодействия с белками интерстициальной ткани, что демонстрируется улучшенным лимфатическим поглощением после подкожных инъекций. Все эти факты указывают на важность физических свойств частиц для лимфатического поглощения. Биоразлагаемые полимеры можно использовать для получения всех или некоторых из полимеров и/или частиц и/или слоев. Биоразлагаемые полимеры могут подвергаться разложению, например, в результате взаимодействия функциональных групп с водой в растворе. В настоящем документе термин «разложение» означает обретение растворимости путем снижения молекулярной массы или превращения гидрофобных групп в гидрофильные группы. Полимеры со сложноэфирными группами по существу подвержены спонтанному гидролизу, например полилактиды и полигликолиды.

Частицы настоящего изобретения также могут содержать дополнительные компоненты. Например, носители могут иметь визуализирующие агенты, введенные в носитель или конъюгированные с ним. Пример наносфер носителя с визуализирующим агентом, который в настоящее время доступен в продаже, представляет собой наносферы Kodak X-sight. Неорганические квантово-размерные люминесцентные нанокристаллы, известные как квантовые точки (КТ), оказались идеальными донорами для методик резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET): их высокий квантовый выход и настраиваемые размерозависимые стоксовы сдвиги позволяют частицам с различными размерами излучать в диапазонах от синего до инфракрасного, причем их возбуждение происходит на одной длине волны в ультрафиолетовом диапазоне. (Bruchez, et al., Science, 1998, 281, 2013; Niemeyer, C. M Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 5796; Waggoner, A. Methods Enzymol. 1995, 246, 362; Brus, L. E. J. Chem. Phys. 1993, 79, 5566). Квантовые точки, такие как гибридные органические/неорганические квантовые точки, основанные на классе полимеров, известных как дендримеры, можно использовать при биологическом мечении, визуализации и в оптических биосенсорных системах (Lemon, et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 12886). В отличие от традиционного синтеза неорганических квантовых точек, синтез наночастиц гибридных квантовых точек не требует высоких температур или высокотоксичных нестабильных реагентов (Etienne, et al., Appl. Phys. Lett. 87, 181913, 2005).

Частицы могут быть образованы из широкого диапазона материалов. Частица предпочтительно образована из материала, подходящего для биологического применения. Например, частицы могут быть образованы из стекла, кремнезема, сложных полиэфиров гидроксикарбоновых кислот, полиангидридов дикарбоновых кислот или сополимеров гидроксикарбоновых кислот и дикарбоновых кислот. В более общем случае частицы-носители могут быть образованы из сложных полиэфиров с линейной цепью или разветвленных, замещенных или незамещенных, насыщенных или ненасыщенных, линейных или поперечносшитых алканила, галогеналкила, тиоалкила, аминоалкила, арила, аралкила, алкенила, аралкенила, гетероарила или алкоксигидроксикислот, или полиангидридов с линейной цепью или разветвленных, замещенных или незамещенных, насыщенных или ненасыщенных, линейных или поперечносшитых алканила, галогеналкила, тиоалкила, аминоалкила, арила, аралкила, алкенила, аралкенила, гетероарила или алкоксидикарбоновых кислот. Кроме того, частицы-носители могут представлять собой квантовые точки или быть образованы из квантовых точек, например частицы полистирола со свойствами квантовых точек (Joumaa et al. (2006) Langmuir 22: 1810-6). Также можно использовать частицы-носители, включая сочетания сложноэфирных и ангидридных связей (например, сополимеры гликолевой и себациновой кислот). Например, частицы-носители могут содержать материалы, включая полимеры полигликолевой кислоты (PGA), полимеры полимолочной кислоты (PLA), полимеры полисебациновой кислоты (PSA), сополимеры молочной и гликолевой кислот (PLGA или PLG, термины являются взаимозаменяемыми), сополимеры молочной и себациновой кислот (PLSA), сополимеры гликолевой и себациновой кислот (PGSA), полимеры полипропиленсульфида, поли(капролактон), хитозан и т. п. Другие биосовместимые биоразлагаемые полимеры, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя полимеры или сополимеры капролактонов, карбонатов, амидов, аминокислот, сложных ортоэфиров, ацеталей, цианоакрилатов и разлагаемых уретанов, а также их сополимеры с линейной цепью или разветвленными, замещенными или незамещенными алканилом, галогеналкилом, тиоалкилом, аминоалкилом, алкенилом или ароматическими гидрокси- или дикарбоновыми кислотами. Кроме того, биологически важные аминокислоты с реакционноспособными группами боковой цепи, такие как лизин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин, треонин, тирозин и цистеин или их энантиомеры, могут быть включены в сополимеры с любым из перечисленных выше материалов, чтобы обеспечить наличие реакционноспособных групп для конъюгации с антигенными пептидами и белками или конъюгирующими фрагментами. Биоразлагаемые материалы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя алмаз, PLA, PGA, полипропиленсульфид и полимеры PLGA. Биосовместимые, но биологически неразлагаемые материалы также могут использоваться в частицах-носителях изобретения. Например, могут использоваться биологически неразлагаемые полимеры акрилатов, этиленвинилацетатов, ацилзамещенных ацетатов целлюлозы, неразлагаемых уретанов, стиролов, винилхлоридов, винилфторидов, винилимидазолов, хлорсульфонированных олефинов, этиленоксидов, виниловых спиртов, TEFLON® (DuPont, г. Уилмингтон, штат Делавэр) и нейлонов.

Частицы настоящего изобретения можно производить любым способом, хорошо известным в данной области. Примеры способов производства частиц включают в себя, без ограничений, полимеризацию в микроэмульсии, полимеризацию на границе раздела фаз, полимеризацию осаждением, выпаривание в эмульсионной среде, диффузию в эмульсионной среде, замещение растворителя и высаливание (Astete and Sabliov, J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 17: 247-289(2006)). Посредством преобразования способа производства PLGA-частиц можно регулировать свойства частиц (например, размер, распределение по размеру, дзета-потенциал, морфологию, гидрофобность/гидрофильность, фиксацию полипептидов и т. п.). На размер частицы влияет ряд факторов, включая, без ограничений, концентрацию PLGA, используемый при производстве частиц растворитель, свойства органической фазы, используемые при производстве поверхностно-активные вещества, вязкость диспергирующей и дисперсной фаз, свойства используемого растворителя, температуру используемой воды, ультразвуковую обработку, скорость выпаривания, добавки, напряжение сдвига, стерилизацию и свойства любого инкапсулированного антигена или полипептида.

Размер частиц зависит от концентрации полимера; чем выше концентрации полимеров, тем больше размер образованных частиц. Например, если в качестве растворителя используется пропиленкарбонат, повышение концентрации PLGA с 1% до 4% (вес./об.) может увеличить средний размер частиц с около 205 нм до около 290 нм. Альтернативно, в этилацетате и 5% Pluronic F-127 повышение концентрации PLGA с 1% до 5% (вес./об.) увеличивает средний размер частиц с 120 нм до 230 нм.

Вязкость диспергирующей и дисперсной фаз также является важным параметром, влияющим на процесс диффузии, ключевой этап образования частиц меньшего размера. Размер частиц увеличивается с повышением вязкости дисперсной фазы, причем размер частиц уменьшается с повышением вязкости диспергирующей фазы. Как правило, чем ниже фазовое отношение органического растворителя к водному, тем меньше размер частиц.

Скорость гомогенизатора и характер перемешивания также влияют на размер частиц; как правило, повышение скорости и интенсивности перемешивания приводит к уменьшению размера частиц, но существует точка, в которой дополнительное повышение скорости и интенсивности перемешивания больше не приводит к уменьшению размера частиц. Положительное воздействие на уменьшение размера оказывает гомогенизация эмульсии с помощью гомогенизатора высокого давления по сравнению с простым перемешиванием. Например, при фазовом отношении 20% в 5% ПВС средний размер частиц при перемешивании составляет 288 нм, а при гомогенизации (высокое давление 30 МПа (300 бар)) средний размер частиц составляет 231 нм.

Значительного уменьшения размера частиц можно достичь путем варьирования температуры воды, добавляемой для улучшения диффузии растворителя. Средний размер частиц уменьшается с повышением температуры воды.

Свойства полипептида, инкапсулированного в частице, также влияет на размер частиц. Как правило, инкапсуляция гидрофобных полипептидов приводит к образованию частиц меньшего размера по сравнению с инкапсуляцией более гидрофильных полипептидов. В способе двойной эмульсии фиксация более гидрофильных полипептидов улучшается за счет использования высокомолекулярного PLGA и высокомолекулярного первого поверхностно-активного вещества, повышающего внутрифазовую вязкость. Взаимодействие между растворителем, полимером и полипептидом влияет на эффективность включения полипептида в частицу.

Молекулярная масса PLGA влияет на конечный средний размер частиц. Как правило, чем больше молекулярная масса, тем больше средний размер частиц. Например, при изменении композиции и молекулярной массы PLGA (например, 12-48 кДа для 50 : 50 PLGA; 12-98 кДа для 75 : 25 PLGA) средний размер частиц будет варьироваться (около 102-154 нм; около 132-152 нм соответственно). Даже когда частицы имеют одинаковую молекулярную массу, их композиция может влиять на средний размер частиц; например, частицы с соотношением 50 : 50 по существу образуют частицы меньшего размера, чем частицы с соотношением 75 : 25. Концевые группы полимера также влияют на размер частиц. Например, полученные частицы со сложноэфирными концевыми группами образуют частицы со средним размером 740 нм (индекс полидисперсности (PI) = 0,394) по сравнению со средним размером PLGA-частиц с кислотными концевыми группами, который составляет 240 нм (PI = 0,225).

Используемый растворитель также может влиять на размер частиц: растворители, снижающие поверхностное натяжение раствора, также уменьшают размер частиц.

Органический растворитель удаляют путем выпаривания в вакууме, чтобы предотвратить повреждение полимера и полипептида и стимулировать уменьшение конечного размера частиц. Выпаривание органического растворителя в вакууме является более эффективным при получении частиц меньшего размера. Например, выпаривание в вакууме позволяет получить частицы со средним размером частиц, который приблизительно на 30% меньше среднего размера частиц, полученных при выпаривании в обычном режиме.

Амплитуда длины волны при ультразвуковой обработке также влияет на характеристики частиц. Для образования стабильных миниэмульсий без дальнейшего изменения размера капли амплитуда длины волны должна составлять более 20% при ультразвуковой обработке длительностью 600-800 с. Однако главным недостатком ультразвуковой обработки является потеря монодисперсности образованной эмульсии.

Органические фазы, которые можно использовать при производстве частиц изобретения, включают в себя, без ограничений, этилацетат, метилэтилкетон, пропиленкарбонат и бензиловый спирт. Диспергирующие фазы, которые можно использовать, включают в себя, без ограничений, поверхностно-активное вещество полоксамер 188.

При производстве частиц изобретения можно использовать различные поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активное вещество может быть анионным, катионным или неионным. Для синтеза частиц широко используются поверхностно-активные вещества семейства полоксамера и полоксаминов. Поверхностно-активные вещества, которые можно использовать, включают в себя, без ограничений, ПЭГ, Tween-80, желатин, декстран, плюроник L-63, ПВС, метилцеллюлозу, лецитин и DMAB. Кроме того, биоразлагаемые и биосовместимые поверхностно-активные вещества включают в себя, без ограничений, витамина E TPGS (сукцинат D-α-токоферилполиэтиленгликоля 1000). В определенных вариантах осуществления необходимы два поверхностно-активных вещества (например, при выпаривании способом двойной эмульсии). Эти два поверхностно-активных вещества могут включать в себя гидрофобное поверхностно-активное вещество для первой эмульсии и гидрофобное поверхностно-активное вещество для второй эмульсии.

Растворители, которые можно использовать при производстве частиц изобретения, включают в себя, без ограничений, ацетон, тетрагидрофуран (ТГФ), хлороформ и члены семейства продуктов хлорирования, метилхлорид. При выборе органических растворителей необходимо руководствоваться двумя критериями: полимер должен быть растворим в этом растворителе, и растворитель должен быть совершенно не смешивающимся с водной фазой.

Соли, которые можно использовать при производстве частиц изобретения, включают в себя, без ограничений, гексагидрат хлорида магния, тетрагидрат ацетата магния.

Распространенные высаливающие агенты включают в себя, без ограничений, электролиты (например, хлорид натрия, ацетат магния, хлорид магния) или неэлектролиты (например, сахарозу).

Стабильность и размер частиц изобретения можно улучшить путем добавления соединений, включающих в себя, без ограничений, жирные кислоты или короткие углеродные цепи. Добавление более длинных углеродных цепей лауриновой кислоты соотносится с улучшением характеристик частиц. Более того, добавление гидрофобных добавок может улучшить размер частиц, включение полипептида в частицу и профиль высвобождения. Композиции частиц можно стабилизировать посредством лиофилизации. Добавление криозащитного агента, такого как трегалоза, может уменьшить агрегацию частиц после лиофилизации.

Подходящие гранулы, которые в настоящее время доступны в продаже, включают в себя гранулы полистирола, такие как FluoSpheres (Molecular Probes, г. Юджин, штат Орегон).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложена система, содержащая: (a) каркас для доставки, выполненный с возможностью доставки химических и/или биологических агентов субъекту; и (b) связанные с антигеном частицы сополимера лактида и гликолида для индукции антиген-специфической толерантности. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть упомянутого каркаса для доставки является микропористой. В некоторых вариантах осуществления связанные с антигеном частицы сополимера лактида и гликолида инкапсулированы в упомянутый каркас. В некоторых вариантах осуществления химические и/или биологические агенты выбирают из группы, состоящей из белка, пептида, низкомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот, клеток и частиц. В некоторых вариантах осуществления химические и/или биологические агенты содержат клетки, а упомянутые клетки содержат островковые клетки поджелудочной железы.

Физические свойства также связаны с функциональностью наночастицы после ее поглощения и удержанием в областях с незрелыми лимфоцитами. Они включают в себя механические свойства, такие как жесткость или высокая эластичность. В некоторых вариантах осуществления за основу берется каучукообразное ядро, например ядро из поли(пропиленсульфида) (ППС) с наружным слоем, например наружным гидрофильным слоем, как в ПЭГ или системе ППС-ПЭГ, недавно разработанной и описанной для системной (но не направленной или иммунной) доставки. Каучукообразное ядро является противоположностью по существу жесткого ядра, как в системе полистирольных или металлических наночастиц. Термин «каучукообразный» относится к определенным эластичным материалам, помимо натуральных или синтетических каучуков, причем этот термин известен специалистам в области полимеров. Например, для получения гидрофобного каучукообразного ядра можно использовать поперечносшитый ППС. ППС представляет собой полимер, который в окислительных условиях разлагается до полисульфоксида и конечного продукта полисульфона, превращаясь из гидрофобного каучука в гидрофильный водорастворимый полимер. Для использования можно адаптировать другие сульфидные полимеры, причем термин «сульфидный полимер» относится к полимеру, у которого в основной цепи единицы повтора присутствует сера. Другие каучукообразные полимеры, которые можно использовать, представляют собой сложные полиэфиры с температурой стеклования в гидратированных условиях менее чем приблизительно 37 °C. Гидрофобное ядро можно преимущественно использовать в сочетании с гидрофильным наружным слоем, поскольку ядро и наружный слой не будут иметь тенденцию смешиваться, т. е. наружный слой будет стремиться пространственно вытягиваться в направлении от ядра. Ядро означает частицу с нанесенным на нее слоем. Слой означает материал, покрывающий по меньшей мере часть ядра. Слой может быть абсорбированным или ковалентно связанным. Частица или ядро могут быть сплошными или полыми. Каучукообразные гидрофобные ядра являются предпочтительными по сравнению с жесткими гидрофобными ядрами, такими как кристаллические или стеклообразные (как в случае полистирола) ядра, поскольку частицы с каучукообразными гидрофобными ядрами могут переносить большее количество гидрофобных лекарственных средств.

Другим физическим свойством является гидрофильность поверхности. Растворимость гидрофильного материала (несшитого) в воде может составлять по меньшей мере 1 грамм на литр. Пространственная стабилизация частиц с помощью гидрофильных полимеров может улучшить их поглощение из интерстициальной ткани вследствие уменьшения неспецифических взаимодействий; однако возросшая невидимость частицы также может уменьшать ее интернализацию фагоцитарными клетками в областях с незрелыми лимфоцитами. Однако проблему баланса между этими конкурирующими особенностями удалось решить, и в настоящей заявке описано создание наночастиц для эффективной лимфатической доставки в дендритные клетки (DC) и другие АПК в лимфатических узлах. Некоторые варианты осуществления включают в себя гидрофильный компонент, например слой гидрофильного материала. Примеры подходящих гидрофильных материалов представляют собой один или более из полиалкиленоксидов, полиэтиленоксидов, полисахаридов, полиакриловых кислот и полиэфиров. Молекулярную массу полимеров в слое можно скорректировать для обеспечения подходящей степени пространственной изоляции in vivo, например, от около 1000 до около 100 000 или более; специалистам в данной области будет сразу понятно, что следует учитывать все диапазоны и значения, находящиеся в рамках явно обозначенных диапазонов, например, между 10 000 и 50 000.

Наночастицы могут содержать функциональные группы для дополнительного взаимодействия. Функциональные группы для дополнительного взаимодействия включают в себя электрофилы или нуклеофилы; они подходят для взаимодействия с другими молекулами. Примерами нуклеофилов являются первичные амины, тиолы и гидроксилы. Примерами электрофилов являются сложные сукцинимидилэфиры, альдегиды, изоцианаты и малеинимиды.

Для того чтобы конъюгировать антигенные белки и пептиды с носителями, можно использовать множество средств, хорошо известных в данной области. Эти способы включают в себя все стандартные химические способы, которые не разрушают или серьезно не ограничивают биологическую активность антигенных пептидов и белков и которые позволяют значительному числу антигенных пептидов и белков конъюгировать с носителем в ориентации, позволяющей антигенному пептиду или белку взаимодействовать с имеющим сродство рецептором T-клеток. По существу предпочтительными являются способы, в которых с носителем конъюгируют C-концевые области антигенного пептида или белка или C-концевые области слитного белка, содержащего антигенный пептид или белок. Точные химические реакции будут, несомненно, зависеть от характера материала носителя, наличия или отсутствия C-концевых соединений с антигенным пептидом или белком и/или наличия или отсутствия конъюгирующих фрагментов.

Если это необходимо для доступности, функциональные группы могут быть размещены на частице. Одним местом размещения могут быть боковые или концевые группы на центральном полимере, или полимерах, которые покрывают центральный полимер, или полимерах, иным образом связанных с частицей. Например, в настоящий документ включены примеры, которые описывают ПЭГ, стабилизирующий наночастицы, который легко можно функционализировать для направления к определенным клеткам или для доставки белкового и пептидного лекарственного средства.

Для фиксации пептидов или белков на поверхности носителя можно использовать конъюгаты, такие как этиленкарбодиимид (ECDI), гексаметилендиизоцианат, диглицидиловый эфир пропиленгликоля, который содержит 2 эпоксиостатка, и эпихлоргидрин. Без связи с какой-либо теорией предполагается, что ECDI выполняет две основные функции для индукции толерантности: (a) он химически связывает белок/пептиды с клеточной поверхностью посредством катализирования формирования пептидной связи между свободной аминной и свободной карбоксильной группами; и (b) он индуцирует имитацию носителем апоптозной клеточной смерти, так что они захватываются в селезенке антигенпредставляющими клетками хозяина (которые могут включать в себя эндотелиальные клетки) и индуцируют толерантность. Именно такое неиммуногенное представление Т-клеткам хозяина приводит к прямой индукции анергии в аутореакционных клетках. Кроме того, ECDI служит сильным стимулом для индукции специфичных регуляторных Т-клеток.

В одном ряде вариантов осуществления антигенные пептиды и белки связываются с носителем посредством ковалентной химической связи. Например, реакционноспособная группа или фрагмент рядом с C-концом антигена (например, C-концевая карбоксильная группа или гидроксил, тиол или аминогруппа из аминокислотной боковой цепи) могут быть конъюгированы путем прямой химической реакции непосредственно с реакционноспособной группой или фрагментом на поверхности носителя (например, гидроксильной или карбоксильной группой PLA или PGA полимера, концевой аминной или карбоксильной группой дендримера или гидроксильной, карбоксильной или фосфатной группой фосфолипида). Альтернативно может использоваться конъюгационный фрагмент, который ковалентно конъюгирует как с антигенными пептидами и белками, так и с носителем, таким образом связывая их вместе.

Реакционноспособные карбоксильные группы на поверхности носителя могут быть присоединены к свободным аминам (например, из остатков Lys) на антигенном пептиде или белке при их взаимодействии, например, с 1-этил-3-[3,9-диметиламинопропил] карбодиимидгидрохлоридом (EDC) или N-гидроксисукцинимидным эфиром (NHS). Аналогично, такую же химическую реакцию можно использовать для того, чтобы конъюгировать свободные амины на поверхности носителя со свободными карбоксилами (например, из С-конца или из остатков Asp или Glu) на антигенном пептиде или белке. Альтернативно, свободные аминные группы на поверхности носителя могут быть ковалентно связаны с антигенными пептидами и белками или со слитными белками, содержащими антигенные пептиды или белки, с использованием химической реакции сульфо-SIAB, по существу как описано Arano et al. (1991) Chem. 2: 71-6.

В другом варианте осуществления антиген с носителем может конъюгироваться нековалентной связью между лигандом, связанным с антигенным пептидом или белком, и антилигандом, присоединенным к носителю. Например, к С-концу антигенного пептида или белка можно присоединить метку с последовательностью, распознаваемой биотинлигазой, и эта метка может быть биотинилирована с помощью биотинлигазы. Затем биотин может выступать в качестве лиганда для нековалентного конъюгирования антигенного пептида или белка с авидином или стрептавидином, который адсорбируется или иным способом связывается с поверхностью носителя как антилиганд. Альтернативно, при антигенных пептидах и белках, как описано выше, слитых с иммуноглобулиновым доменом, несущим Fc-область, Fc-домен может действовать как лиганд, а белок A, ковалентно или нековалентно связанный с поверхностью носителя, может выступать в качестве антилиганда и нековалентно коньюгировать антигенный пептид или белок с носителем. В данной области хорошо известны другие средства, которые можно применять для нековалентного конъюгирования антигенных пептидов и белков с носителями, включая технологии хелатирования ионов металлов (например, с использованием полигистидиновой метки к С-концу антигенного пептида или белка, или слитного белка, содержащего антигенный пептид или белок, и Ni⁺-покрытого носителя), и данные способы могут заменить способы, описанные в настоящем документе.

Конъюгация фрагмента нуклеиновой кислоты с несущей молекулой может быть выполнена любым числом способов, обычно включая один или более поперечносшивающих агентов и функциональных групп на фрагменте нуклеиновой кислоты и несущей молекуле. Связующие группы добавляют к несущим молекулам с использованием стандартных методик синтетической химии. Связующие группы можно добавить к фрагментам нуклеиновой кислоты с использованием стандартных методик синтетической химии. У медработника есть возможность выбора антигенов для применения в комбинациях настоящего изобретения. Присутствующий в комбинации индуцирующий антиген влияет на специфичность индуцируемого толерогенного ответа. Он может совпадать или не совпадать с антигеном-мишенью, который представляет собой антиген, присутствующий у получающего лечение субъекта или вводимый ему, который является мишенью для нежелательного иммунологического ответа и для которого желательна толерантность.

Индуцирующий антиген настоящего изобретения может представлять собой полипептид, полинуклеотид, углевод, гликолипид или другую молекулу, выделенную из биологического источника, или же он может представлять собой химически синтезированную малую молекулу, полимер или производное биологического материала при условии, что он в соответствии с настоящим описанием обладает способностью индуцировать толерантность при комбинации со связывающимся со слизистой компонентом.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен носитель (например, иммуномодифицирующая частица), связанный с одним или более пептидами, полипептидами и/или белками. В некоторых вариантах осуществления носитель (например, PLG-носитель), такой как описанный в настоящем документе, эффективен для индуцирования антиген-специфической толерантности и/или предотвращения начала заболевания, связанного с иммунной системой, (такого как EAE в мышиной модели) и/или уменьшения тяжести ранее существовавшего заболевания, связанного с иммунной системой. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы настоящего изобретения могут вызывать в Т-клетках начало ранних событий, связанных с активацией Т-клеток, но не позволяют Т-клеткам приобретать эффекторную функцию. Например, введение композиций настоящего изобретения может приводить к получению Т-клетками квазиактивированного фенотипа, такого как повышение регуляции CD69 и/или CD44, но без проявления эффекторной функции, на что указывает отсутствие синтеза IFN-γ или IL-17. В некоторых вариантах осуществления введение композиций настоящего изобретения приводит к приобретению Т-клетками квазиактивированного фенотипа без конверсии интактных антиген-специфических Т-клеток в регуляторный фенотип, например в клетки, имеющие фенотипы CD25⁺/Foxp3⁺.

В некоторых вариантах осуществления поверхность носителя (например, частицы) содержит химические фрагменты и/или функциональные группы, которые позволяют присоединять к носителю (например, ковалентно, нековалентно) антигенные пептиды и/или другие функциональные элементы. В некоторых вариантах осуществления число, ориентация, пространственное расположение и т. д. химических фрагментов и/или функциональных групп на носителе (например, частице) варьируется в соответствии с химическим составом носителя, желаемым применением и т. п.

В некоторых вариантах осуществления носитель содержит один или более биологических или химических агентов, прикрепленных, адсорбированных, инкапсулированных и/или содержащихся по всему носителю. В некоторых вариантах осуществления химический или биологический агент инкапсулирован внутри и/или содержится по всему веществу частиц. Настоящее изобретение не ограничено характером химических или биологических агентов. Такие агенты включают в себя, без ограничений, белки, молекулы нуклеиновых кислот, низкомолекулярные лекарственные средства, липиды, углеводы, клетки, компоненты клеток и т. п. В некоторых вариантах осуществления на носитель или внутрь него помещают два или более (например, 3, 4, 5 и т. п.) разных химических или биологических агента. В некоторых вариантах осуществления агенты предусматривают определенную скорость высвобождения. В некоторых вариантах осуществления множество разных агентов предусматривают разные скорости высвобождения. Например, первый агент может высвобождаться в течение нескольких часов, а второй агент может высвобождаться в течение более длительного времени (например, суток, недель, месяцев и т. д.). В некоторых вариантах осуществления носитель или его часть выполнены с возможностью медленного высвобождения биологических или химических агентов. В некоторых вариантах осуществления медленное высвобождение обеспечивает высвобождение биологически активных количеств агента в течение периода времени по меньшей мере 30 суток (например, 40 суток, 50 суток, 60 суток, 70 суток, 80 суток, 90 суток, 100 суток, 180 суток и т. п.). В некоторых вариантах осуществления носитель или его часть выполнены достаточно пористыми, чтобы клетки могли врастать в поры. Размер пор можно выбрать с учетом конкретных интересующих типов клеток и/или требуемой величины врастания. В некоторых вариантах осуществления частицы содержат интересующий антиген без других непептидных активных агентов, таких как лекарственные средства или иммуномодуляторы. Более того, в некоторых вариантах осуществления частицы изобретения не содержат иммуностимуляторных или иммуносупрессорных пептидов помимо интересующего антигена. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления частицы не содержат других белков или пептидов (например, костимуляторных молекул, молекул MHC, иммуностимуляторных пептидов или иммуносупрессорных пептидов), ни на поверхности, ни инкапсулированных внутри частиц.

Неожиданно было обнаружено, что инкапсулирование антигена, биологических и/или химических агентов в частицу изобретения индуцирует иммунологическую толерантность и имеет несколько преимуществ. Во-первых, инкапсулированные частицы вызывают более медленный цитокиновый ответ. Во-вторых, при использовании множества антигенов, биологических и/или химических агентов инкапсулирование устраняет конкуренцию между этими различными молекулами, которая может возникать, если агенты прикреплены к поверхности частицы. В-третьих, инкапсулирование позволяет заключать в частицу большее количество антигенов, биологических и/или химических агентов. В-четвертых, инкапсулирование позволяет упростить использование сложных белковых антигенов или гомогенатов органов (например, гомогената поджелудочной железы для диабета I типа или экстракта арахиса при аллергии на арахис). Наконец, инкапсулирование антигенов, биологических и/или химических агентов внутрь частицы вместо конъюгации к поверхности частицы сохраняет суммарный отрицательный заряд на поверхности частицы. Инкапсуляция антигена, биологических и/или химических агентов в частицы изобретения можно выполнить любым способом, известным в данной области. В одном варианте осуществления полипептидные антигены инкапсулированы в частицы при помощи двойного эмульсионного процесса. В дополнительном варианте осуществления полипептидные антигены являются водорастворимыми.

В другом варианте осуществления полипептидные антигены инкапсулированы в частицы при помощи одинарного эмульсионного процесса. В дополнительном варианте осуществления полипептидные антигены являются более гидрофобными. Иногда двойной эмульсионный процесс приводит к образованию крупных частиц, что может приводить к утечке активного гидрофильного компонента и снижать эффективность захватывания. Слияние и Оствальдовское созревание представляют собой два механизма, которые могут дестабилизировать каплю двойной эмульсии, а диффузия гидрофильного активного компонента через органическую фазу представляет собой основной механизм, ответственный за низкий уровень захватывания активного компонента. В некоторых вариантах осуществления благоприятным может быть уменьшение размера наночастиц. Одной из стратегий достижения этой цели является применение второй сильной скорости сдвига. Эффект утечки можно уменьшить, используя высокую концентрацию полимера и высокую молекулярную массу полимера, в сочетании с увеличением вязкости внутренней водной фазы и с увеличением молекулярной массы поверхностно-активного вещества.

В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены носители, имеющие на своей поверхности (или внутри) клетки или другие биологические или химические агенты. Если используются клетки, носители не ограничены определенным типом клеток. В некоторых вариантах осуществления носители содержат на себе островковые клетки поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления микропористые носители дополнительно содержат на себе белки внеклеточного матрикса (ECM) и/или экзендин-4. Носители не имеют ограничений по типу. В некоторых вариантах осуществления носитель имеет области с разной пористостью (например, с разным размером пор, глубиной пор и/или плотностью пор). В некоторых вариантах осуществления содержат на себе (или внутри себя) фармацевтические агенты, ДНК, РНК, белки внеклеточного матрикса, экзендин-4 и т. п. В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предложены способы трансплантации островковых клеток поджелудочной железы с такими носителями. В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцирующий антиген представляет собой одну выделенную или полученную рекомбинантным способом молекулу. Для лечения состояний, при которых антиген-мишень распределяется по разным местам организма хозяина, по существу необходимо, чтобы индуцирующий антиген был идентичен или иммунологически связан с антигеном-мишенью. К примерам таких антигенов относится большинство полинуклеотидных антигенов и некоторые углеводные антигены (например, антигены группы крови).

В сфере настоящего изобретения можно использовать любые подходящие антигены. В некоторых вариантах осуществления индуцирующий антиген влияет на специфичность индуцируемого толерогенного ответа. Индуцирующий антиген может совпадать или не совпадать с антигеном-мишенью, который является антигеном, присутствующим у получающего лечение пациента или вводимым ему, который является мишенью для нежелательной иммунологической реакции и для которого желательна толерантность.

Если антиген предпочтительно экспрессируется на конкретном органе, клетке или типе клеток, медработник имеет возможность использовать индуцирующий антиген, идентичный или иммунологически связанный с антигеном-мишенью. Однако также есть дополнительная возможность использовать антиген, посторонний для мишени. Это антиген, который может быть не связан иммунологически с антигеном-мишенью, но предпочтительно экспрессируется в ткани, в которой экспрессируется антиген-мишень. Рабочая теория по вопросу эффективности подавления посторонним агентом состоит в том, что супрессия является активным процессом, опосредованным клетками, который снижает активность эффекторной части иммунного ответа в клетках-мишенях. Супрессорные клетки специфично стимулируются индуцирующим антигеном на поверхности слизистой и двигаются в зону ткани, где предпочтительно экспрессируется посторонний антиген. Посредством интерактивного или опосредованного цитокинами механизма локализованные супрессорные клетки далее снижают активность эффекторных клеток (или индукторов эффекторных клеток) в ближайшем окружении, независимо от того, на что они реагируют. Если эффекторные клетки специфичны к мишени, отличной от индуцирующего антигена, результатом будет эффект постороннего агента. За дополнительной информацией о реакции на посторонний агент и списком толерогенных пептидов, оказывающих такое действие, читателю предлагается обратиться к международной патентной публикации WO 93/16724. Подразумеваемым следствием теории постороннего агента является то, что для практического использования настоящего изобретения специалисту не нужно идентифицировать или выделять конкретный антиген-мишень, для которого желательно выработать толерантность. Медработнику необходимо лишь получить по меньшей мере одну молекулу, предпочтительно экспрессирующуюся в целевой зоне, для использования в качестве индуцирующего антигена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индуцирующий антиген имеет форму, не идентичную антигену, экспрессированному у получающего лечение субъекта, но является фрагментом или производным этого антигена. Индуцирующие агенты настоящего изобретения содержат пептиды, основанные на молекуле соответствующей специфичности, но адаптированной посредством фрагментации, замены остатков, мечения, конъюгации и/или слияния с пептидами, имеющими другие функциональные свойства. Адаптацию можно проводить для любых желательных целей, включая, без ограничений, устранение любого нежелательного свойства, такого как токсичность или иммуногенность, или для усиления любого желательного свойства, такого как связывание со слизистой оболочкой, проникновение в слизистую или стимуляция толерогенной ветви иммунного ответа. Термины «пептид инсулина», «пептид коллагена», «пептид основного белка миелина» в настоящем документе относятся не только к интактной субъединице, но также к аллотипическим и синтетическим вариантам, фрагментам, слитным пептидам, конъюгатам и другим производным, содержащим область, гомологичную (предпочтительно на 70% идентичную, более предпочтительно на 80% идентичную, а еще более предпочтительно - на 90% идентичную на уровне аминокислот) по меньшей мере 10, а предпочтительно 20 последовательным аминокислотам соответствующей молекулы, аналогом которой она является, причем гомологичная область производного соединения имеет общую с родительской молекулой способность индуцировать толерантность к антигену-мишени.

Известно, что толерогенные области индуцирующего антигена часто отличаются от иммунодоминантных эпитопов для стимуляции образования антител. Толерогенные области по существу представляют собой области, которые могут представляться в конкретных клеточных взаимодействиях с участием Т-клеток. Толерогенные области могут представляться и могут быть способны индуцировать толерантность при представлении интактного антигена. Некоторые антигены содержат скрытые толерогенные области в том смысле, что обработка и представление исходного антигена в обычных условиях не приводит к толерантности. Описание скрытых антигенов и их идентификацию можно найти в международной патентной публикации WO 94/27634.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используется два, три или большее количество индуцирующих антигенов. Эти варианты осуществления может быть желательно реализовать при наличии множества антигенов-мишеней или для создания множества посторонних для мишени агентов. Например, для лечения диабета со связывающимся со слизистой компонентом можно смешивать как инсулин, так и глюкагон. Также может быть желательно создать коктейль антигенов для охвата нескольких возможных альтернативных мишеней. Например, коктейль фрагментов антигенов гистосовместимости можно использовать для вызова толерантности у субъекта, которому планируется в будущем сделать пересадку аллотрансплантата неизвестного фенотипа. Алловариантные области человеческих лейкоцитарных антигенов известны в данной области: например, Immunogenetics 29:231, 1989. В другом примере смесь аллергенов может выступать в качестве индуцирующего антигена для лечения атопии.

Индуцирующие антигены можно получить с помощью ряда методик, известных в данной области, в зависимости от характера молекулы. Полинуклеотидные, полипептидные или углеводные антигены можно выделить из тех клеток вида, который планируется лечить, в которых содержится большое количество этих антигенов. Короткие пептиды удобно получать методом синтеза из аминокислот. Более длинные пептиды с известной последовательностью можно получать путем синтеза кодирующей последовательности или ПЦР-амплификации кодирующей последовательности из природного источника или вектора с последующим экспрессированием кодирующей последовательности в подходящей бактериальной или эукариотической клетке-хозяине.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комбинация содержит сложную смесь антигенов, полученных из клетки или ткани, одна или более которых выступают в качестве индуцирующего антигена. Антигены могут иметь форму целых клеток, интактных или обработанных фиксирующим агентом, например формальдегидом, глутаровым альдегидом или спиртом. Антигены могут иметь форму лизата клеток, созданного путем солюбилизации детергентом или механического разрушения клеток или ткани с последующей очисткой. Антигены также можно получать при помощи субклеточного фракционирования, в частности путем обогащения плазматической мембраны с помощью таких методик, как дифференциальное центрифугирование, необязательно с последующей солюбилизацией детергентом и диализом. Также подходящими являются другие методики разделения, такие как аффинная и ионообменная хроматография солюбилизированных мембранных белков.

В одном варианте осуществления антигенный пептид или белок представляет собой аутоантиген, аллоантиген или трансплантационный антиген. В еще одном конкретном варианте осуществления аутоантиген выбирают из группы, состоящей из основного белка миелина, коллагена или их фрагментов, ДНК, ядерных и ядрышковых белков, митохондриальных белков и белков β-клеток поджелудочной железы.

Изобретение предусматривает индукцию толерантности к аутоантигену для лечения аутоиммунных заболеваний путем введения антигена, для которого желательно выработать толерантность. Например, аутоантитела к основному белку миелина (MBP) наблюдаются у пациентов с рассеянным склерозом, и, соответственно, антигенные пептиды или белки MBP можно использовать в рамках изобретения и доставлять их с использованием композиций настоящего изобретения для лечения и предотвращения рассеянного склероза.

В качестве еще одного не имеющего ограничительного характера примера, у субъекта, являющегося кандидатом на трансплантацию не от идентичного близнеца, может развиться отторжение трансплантированных клеток, тканей или органов, поскольку трансплантированные антигены являются чужеродными для реципиента. Предварительная выработка толерантности субъекта-реципиента к предполагаемому трансплантату устраняет или уменьшает последующее отторжение. При практическом использовании настоящего изобретения можно добиться уменьшения или избавления от препятствующей отторжению терапии. В другом примере многие аутоиммунные заболевания характеризуются клеточным иммунным ответом на эндогенный или собственный антиген. Толерантность иммунной системы к эндогенному антигену является желательной для борьбы с заболеванием.

В дополнительном примере сенсибилизация субъекта к промышленному загрязняющему агенту или химическому соединению, которая может встречаться в трудовой деятельности, может создавать опасность иммунной реакции. Предварительная выработка толерантности иммунной системы субъекта к химическому веществу, в частности, в той форме, в которой химическое вещество реагировало с эндогенными белками субъекта, может быть желательна для предотвращения последующего развития иммунного ответа на рабочем месте.

Аллергены представляют собой другие антигены, для которых также желательной является выработка толерантности иммунного ответа. В одном варианте осуществления антиген представляет собой глиадин. В дополнительном варианте осуществления антиген представляет собой A-глиадин.

Следует отметить, что даже при заболеваниях, при которых патогенный аутоантиген неизвестен, можно индуцировать супрессию посторонним агентом с использованием антигенов близкого анатомического расположения. Например, при ревматоидном артрите наблюдаются аутоантитела к коллагену, и, соответственно, ген, кодирующий коллаген, можно использовать в качестве экспрессирующего антиген генного модуля при лечении ревматоидного артрита (см., например, Choy (2000) Curr Opin Investig Drugs 1: 58-62). Кроме того, выработку толерантности к аутоантигенам бета-клеток можно использовать для предотвращения развития диабета I типа (см., например, Bach and Chatenoud (2001) Ann Rev Immunol 19: 131-161).

В качестве другого примера, аутоантитела к миелин-олигодендроцитарному гликопротеину (MOG) наблюдаются при аутоиммунном энцефаломиелите и при многих других заболеваниях ЦНС, а также при рассеянном склерозе (см., например, Iglesias et al. (2001) Glia 36: 22-34). Соответственно, использование конструктов, экспрессирующих антиген MOG, в настоящем изобретении позволяет проводить лечение рассеянного склероза, в также родственных ему аутоиммунных заболеваний центральной нервной системы.

Другие примеры потенциальных антигенов для применения при лечении аутоиммунных заболеваний включают в себя антигены бета-клеток поджелудочной железы, инсулин и GAD для лечения инсулинзависимого сахарного диабета; коллаген 11 типа, гликопротеин человеческого хряща gp 39 (HCgp39) и gpl30-RAPS для лечения ревматоидного артрита; основной белок миелина (MBP), протеолипидный белок (PLP) и миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (MOG, см. выше) для лечения рассеянного склероза; фибрилларин и малый ядрышковый белок (snoRNP) для лечения склеродермы; рецептор тиреотропного фактора (TSH-R) для лечения болезни Грейвса; ядерные антигены, гистоны, гликопротеин gp70 и рибосомальные белки для лечения системной красной волчанки; пируватдегидрогеназа-дегидролипоамидацетилтрансферазу (PCD-E2) для лечения первичного билиарного цирроза печени; антигены волосяного фолликула для лечения очаговой алопеции; человеческий тропомиозин и изоформу 5 (hTM5) для лечения язвенного колита.

В одном варианте осуществления частицы изобретения связаны с антигенами, содержащими один или более эпитопов, связанных с аллергиями, аутоиммунными заболеваниями и/или воспалительными заболеваниями или расстройствами. Антигены могут содержать один или более экземпляров эпитопа. В одном варианте осуществления антигены содержат один эпитоп, связанный с одним заболеванием или расстройством. В дополнительном варианте осуществления антигены содержат более одного эпитопа, которые связаны с одним и тем же заболеванием или расстройством. В другом дополнительном варианте осуществления антигены содержат более одного эпитопа, которые связаны с разными заболеваниями или расстройствами. В дополнительном варианте осуществления антигены содержат один или более эпитопов, связанных с одним или более видами аллергии. В дополнительном варианте осуществления антигены содержат один или более эпитопов, связанных с рассеянным склерозом, диабетом I типа, целиакией и/или воспалительным заболеванием кишечника, включая болезнь Крона или язвенный колит. В одном варианте осуществления эпитопы взяты от основного белка миелина (например, SEQ ID NO: 4975 и 4976), протеолипидного белка (например, SEQ ID NO: 4977), миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (например, SEQ ID NO: 1 и 4978), аквапорина (например, SEQ ID NO: 4979), гликопротеина, связанного с миелином (например, SEQ ID NO: 4980), инсулина (например, SEQ ID NO: 4981), глутаматдекарбоксилазы (например, SEQ ID NO: 4982), глиадина (например, SEQ ID NO: 4983-4985 или 5136-5140), α3-цепи коллагена IV типа (например, SEQ ID NO: 5017) или их фрагментов, гомологов или изоформ. В дополнительном варианте осуществления эпитопы взяты от клейковины, включая глиадин и/или глютенин. В одном варианте осуществления эпитопы взяты от гомологов инсулина, таких как описанные в патенте США № 8,476,228, содержание которого полностью включено в настоящий документ для всех целей. В одном варианте осуществления эпитопы глиадина представляют собой SEQ ID NO: 13, 14, 16, 320 или 321 в заявке на патент США № 20110293644, содержание которой полностью включено в настоящий документ для всех целей.

В таблицах 2 и 3 описаны дополнительные не имеющие ограничительного характера примеры эпитопов, связанных с различными аутоиммунными заболеваниями и/или воспалительными заболеваниями или расстройствами, которые рассматриваются в настоящем изобретении.

Таблица 2. Типичные линейные эпитопы

Не все эпитопы являются линейными; эпитопы также могут быть прерывистыми, конформационными эпитопами. Известен ряд прерывистых эпитопов, связанных с аутоиммунными заболеваниями или воспалительными заболеваниями и/или расстройствами. Не имеющие ограничительного характера примеры прерывистых эпитопов приведены в таблице 3.

Таблица 3. Типичные прерывистые эпитопы

Комбинации антигенов и/или эпитопов можно тестировать на способность обеспечивать толерантность путем проведения экспериментов с выделенными клетками или на животных моделях.

В некоторых вариантах осуществления индуцирующие толерантность композиции настоящего изобретения содержат апоптотическую сигнальную молекулу (например, в дополнение к антигенному пептиду или иной антигенной молекуле). В некоторых вариантах осуществления апоптотическая сигнальная молекула связана и/или ассоциирована с поверхностью носителя. В некоторых вариантах осуществления апоптотические сигнальные молекулы позволяют антигенпредставляющим клеткам хозяина, таким как клетки ретикуло-эндотелиальной системы, воспринимать носитель как апоптозное тело; это позволяет представлять связанные пептидные эпитопы так, чтобы индуцировалась толерантность. Без связи с какой-либо теорией предполагается, что это предотвращает повышение активации молекул, участвующих в стимуляции иммунных клеток, таких как молекулы MHC классов I/II и костимуляторные молекулы. Такие апоптотические сигнальные молекулы также могут выступать в качестве маркеров фагоцитоза. Например, апоптотические сигнальные молекулы, подходящие для настоящего изобретения, описаны в заявке на патент США № 20050113297, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Молекулы, подходящие для настоящего изобретения, включают в себя молекулы, направляющие фагоциты, включая макрофаги, дендритные клетки, моноциты, гранулоциты и нейтрофилы.

В некоторых вариантах осуществления молекулы, подходящие для использования в качестве апоптотических сигнальных молекул, обеспечивают эффект выработки толерантности к связанным пептидам. Кроме того, носитель, связанный с апоптотической сигнальной молекулой, может связываться с Clq в ходе распознавания апоптозных клеток (Paidassi et al., (2008) J. Immunol. 180: 2329-2338; полностью включено в настоящий документ путем ссылки). Например, молекулы, которые могут использоваться в качестве апоптотических сигнальных молекул, включают в себя фосфатидилсерин, аннексин-1, аннексин-5, глобулярный EGF-фактор 8 молочного жира (MFG-E8) или семейство тромбоспондинов (например, тромбоспондин-1 (TSP-1)). Различные молекулы, подходящие для использования в качестве апоптотических сигнальных молекул в настоящем изобретении, описаны, например, в заявке на патент США 2012/0076831, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки).

В некоторых вариантах осуществления апоптотическая сигнальная молекула может быть конъюгирована с антиген-специфическим пептидом. В некоторых вариантах апоптотическую сигнальную молекулу конъюгируют с антиген-специфическим пептидом путем создания слитного белка. Например, слитный белок может содержать по меньшей мере один антиген-специфический пептид (или его фрагмент или вариант), соединенный по меньшей мере с одной апоптотической сигнальной молекулой (или ее фрагментом или вариантом). В отношении создания слитных белков термины «слитный белок», «слитный пептид», «слитный полипептид» и «химерный пептид» используются на взаимозаменяемой основе. Подходящие фрагменты антиген-специфического пептида включают в себя любой фрагмент полноразмерного пептида, который сохраняет функцию генерации требуемой антиген-специфической толерантности настоящего изобретения. Слитный белок можно создать различными способами, известными в данной области (например, с помощью генетической химеризации, химической конъюгации и т. п.). Два белка могут быть слиты непосредственно или при помощи аминокислотного линкера. Полипептиды, образующие слитный белок, обычно соединяют C-концом к N-концу, однако они также могут быть соединены C-концом к C-концу, N-концом к N-концу или N-концом к С-концу. Полипептиды в слитном белке могут находиться в любом порядке. Можно использовать пептидную линкерную последовательность для разделения первого и второго полипептидного компонента на расстояние, достаточное для того, чтобы каждый полипептид сворачивался в свою вторичную и третичную структуры. Аминокислотные последовательности, которые можно с пользой применять в качестве линкеров, включают в себя последовательности, описанные в публикации Maratea et. al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262 (1986); патенте США № 4,935,233 и патенте США 4,751,180, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Линкерная последовательность может по существу иметь длину от 1 до около 50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкерные последовательности не требуются и/или не используются, например, когда первый и второй полипептиды содержат области с N-концевыми неосновными аминокислотами, которые можно использовать для разделения функциональных доменов и предотвращения пространственных влияний.

Индикатором толерогенной активности является способность интактного антигена или фрагмента стимулировать выработку соответствующего цитокина в целевой зоне. Предполагается, что иммунорегуляторные цитокины, высвобождаемые супрессорными T-клетками в целевой зоне, представляют собой TGF-β (Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:421, 1992). Другими факторами, которые могут вырабатываться в условиях толерантности, являются цитокины IL4 и IL-10, а также медиатор PGE. И наоборот, лимфоциты в тканях, которые подвергаются активному иммунному разрушению, секретируют такие цитокины, как IL-I, IL-2, IL-6 и γ-IFN. Следовательно, эффективность потенциального индуцирующего антигена можно оценить посредством измерения ее способности к стимуляции соответствующего типа цитокинов.

С учетом вышесказанного быстрый скрининг-тест для определения толерогенных эпитопов индуцирующего антигена, эффективных связывающихся со слизистой компонентов, эффективных комбинаций или эффективных способов и режимов введения через слизистую оболочку можно проводить с использованием сингенных животных в качестве доноров для клеточных анализов in vitro. Животным вводят тестовую композицию через поверхность слизистой оболочки и через некоторое время проводят стимуляцию посредством парентерального введения антигена-мишени в полном адъюванте Фрейнда. Клетки селезенки выделяют и культивируют in vitro в присутствии антигена-мишени в концентрации около 50 мкг/мл. Антиген-мишень можно заменять потенциальными белками или подфрагментами для картирования местоположения толерогенных эпитопов. Секрецию цитокинов в среде можно количественно определить посредством стандартного иммунологического анализа.

Способность клеток подавлять активность других клеток можно определить, используя клетки, выделенные из иммунизированного целевым антигеном животного, или создав клеточную линию, чувствительную к антигену-мишени (Ben-Nun et al., Eur. J. Immunol. 11: 195, 1981; полностью включено в настоящий документ путем ссылки). В одном варианте настоящего эксперимента популяцию супрессорных клеток подвергают мягкому облучению (около 1000-1250 рад) для предотвращения пролиферации, супрессоры выращивают совместно с клетками-респондерами, а затем используют введение меченного тритием тимидина (MTT) для количественного определения пролиферативной активности клеток-респондеров. В другом варианте популяцию супрессорных клеток и популяцию клеток-респондеров культивируют на верхнем и нижнем уровнях двухкамерной системы культивирования Transwell (Costar, г. Кембридж, штат Массачусетс), которая позволяет совместно инкубировать популяции клеток, находящиеся на расстоянии не более 1 мм друг от друга и разделенные поликарбонатной мембраной (WO 93/16724). При таком подходе необязательно облучать популяцию супрессорных клеток, поскольку пролиферативную активность клеток-респондеров можно измерить отдельно.

В вариантах осуществления изобретения, в которых антиген-мишень уже присутствует у субъекта, нет необходимости выделять антиген или заранее сочетать его с связывающимся со слизистой компонентом. Например, антиген может определенным образом экспрессироваться у субъекта как следствие патологического состояния (например, воспалительного заболевания кишечника или целиакии) или как следствие потребления пищевого аллергена. Тестирование проводят, подавая связывающийся со слизистой компонент в одной или более дозах или составах и определяют способность вызывать выработку толерантности к антигену in situ.

Также можно разработать эффективные композиции и способы введения для лечения конкретного заболевания с помощью соответствующих животных моделей заболевания. Способность лечения уменьшать или задерживать симптоматику заболевания отслеживают по уровню циркулирующих биохимических и иммунологических показателей заболевания, результатам иммуногистологического исследования поврежденной ткани и основным клиническим признакам, соответствующим используемой модели. Не имеющие ограничительного характера примеры животных моделей, которые можно применять для тестирования, представлены в следующем разделе.

В настоящем изобретении рассматривается модуляция толерантности посредством модуляции ответа TH1, ответа TH2, ответа TH17 или комбинации этих ответов. Модуляция ответа TH1 охватывает изменение экспрессии, например, гамма-интерферона. Модуляция ответа TH2 охватывает изменение экспрессии, например, любой комбинации IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Как правило, усиление (ослабление) ответа TH2 будет содержать увеличение (уменьшение) экспрессии по меньшей мере одного из IL-4, IL-5, IL-10 или IL-13; чаще усиление (ослабление) ответа TH2 будет содержать увеличение экспрессии по меньшей мере двух из IL-4, IL-5, IL-10 или EL-13, наиболее часто усиление (ослабление) ответа TH2 будет содержать увеличение экспрессии по меньшей мере трех из DL-4, IL-5, IL-10 или IL-13, в идеальном случае усиление (ослабление) ответа TH2 будет содержать увеличение (уменьшение) экспрессии каждого из IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Модулирование TH17 охватывает изменение экспрессии, например, TGF-бета, IL-6, IL-21 и IL23 и влияет на уровни IL-17, IL-21 и IL-22.

Другие подходящие способы оценки эффективности композиций и способов настоящего изобретения известны в данной области, как описано, например, в заявке на патент США 2012/0076831 (полностью включена в настоящий документ путем ссылки).

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к праймированию иммунной толерантности у субъекта, ранее не подвергавшегося индукции толерантности путем терапевтического вмешательства. Эти варианты осуществления по существу включают в себя множество введений комбинации антигена и связывающегося со слизистой компонента. Для обеспечения долгосрочного результата во время праймирования, как правило, выполняют по меньшей мере три введения, часто по меньшей мере четыре введения, а иногда по меньшей мере шесть введений, хотя толерантность может проявляться у субъекта на ранней стадии курса лечения. Наиболее часто каждую дозу дают в виде болюсного введения, но для использования также подходят составы длительного введения, способные к высвобождению в слизистую оболочку. Если выполняется множество введений, время между введениями по существу составляет от 1 суток до 3 недель и, как правило, от около 3 суток до 2 недель. По существу используют один и тот же антиген и связывающийся со слизистой компонент в одинаковой концентрации и введение проводят на одну и ту же поверхность слизистой оболочки, но возможны и варианты коррекции любых из этих параметров в ходе курса лечения.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к поддержанию или продлению ранее выработанной иммунной толерантности. Эти варианты осуществления по существу относятся к одному введению или краткому курсу лечения в то время, когда сформированная толерантность снижается или может снижаться. Поддержание по существу выполняют через период от 1 месяца до 1 года и, как правило, от 2 до 6 месяцев после праймирования или предыдущего поддержания. Настоящее изобретение также включает в себя варианты осуществления, которые используют регулярное поддержание толерантности со схемой введений, производимых два раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели или по любому другому регулярному расписанию.

Частицы настоящего изобретения можно вводить в любой дозе, эффективной для подавления воспалительного иммунного ответа у нуждающегося в лечении субъекта или для лечения бактериальной или вирусной инфекции у нуждающегося в лечении субъекта. В определенных вариантах осуществления субъекту обеспечивают введение от около 10² до около 10²⁰ частиц. В дополнительном варианте осуществления обеспечивают введение от около 10³ до около 10¹⁵ частиц. В другом дополнительном варианте осуществления обеспечивают введение от около 10⁶ до около 10¹² частиц. В еще одном дополнительном варианте осуществления обеспечивают введение от около 10⁸ до около 10¹⁰ частиц. В предпочтительном варианте осуществления предпочтительная доза составляет 0,1% твердых частиц/мл. Соответственно, для гранул 0,5 мкм предпочтительная доза составляет около 4 x 10⁹ гранул, для гранул 0,05 мкм предпочтительная доза составляет около 4 x 10¹² гранул, для гранул 3 мкм предпочтительная доза составляет 2 x 10⁷ гранул. Однако любая доза, которая является эффективной для лечения конкретного состояния, подлежащего лечению, включена в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение подходит для лечения расстройств, связанных с иммунной системой, таких как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, ферментативные недостаточности и аллергические реакции. Замещение системы синтетических биосовместимых частиц для индуцирования иммунной толерантности позволяет упростить производство, расширить доступность терапевтических агентов, повысить единообразие образцов, увеличить количество возможных участков лечения и значительно снизить вероятность аллергических ответов на клетку-носитель.

В настоящем документе термин «иммунный ответ» включает в себя иммунные ответы, опосредованные Т-клетками и/или В-клетками. Примеры иммунных ответов включают в себя ответы Т-клеток, например, выработку цитокинов и клеточноопосредованную цитотоксичность. Кроме того, термин «иммунный ответ» включает в себя иммунные ответы, на которые косвенно влияет активация Т-клеток, например выработка антител (гуморальные ответы), и активация цитокинчувствительных клеток, например макрофагов. Иммунные клетки, участвующие в иммунном ответе, включают в себя лимфоциты, такие как B-клетки и T-клетки (клетки CD4⁺, CD8⁺, Th1 и Th2); антигенпредставляющие клетки (например, профессиональные антигенпредставляющие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги, B-лимфоциты, клетки Лангерганса, и непрофессиональные антигенпредставляющие клетки, такие как кератиноциты, эндотелиальные клетки, астроциты, фибробласты, олигодендроциты); естественные клетки-киллеры; миелоидные клетки, такие как макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты. В некоторых вариантах осуществления модифицированные частицы настоящего изобретения эффективно уменьшают миграцию воспалительных клеток к месту воспаления.

В настоящем документе термин «анергия», «толерантность» или «антиген-специфическая толерантность» относится к нечувствительности Т-клеток к стимуляции, опосредованной рецепторами Т-клеток. Такая нечувствительность по существу является антиген-специфической и сохраняется после прекращения воздействия антигенного пептида. Например, у Т-клеток анергия характеризуется недостаточной выработкой цитокина, например IL-2. Анергия Т-клеток возникает, когда Т-клетки подвергаются воздействию антигена и получают первый сигнал (сигнал, опосредованный Т-клеточным рецептором или CD-3) при отсутствии второго сигнала (костимулирующий сигнал). В этих условиях повторное воздействие того же антигена на клетки (даже если повторное воздействие происходит в присутствии костимулирующей молекулы) приводит к невозможности выработки цитокинов и в дальнейшем к невозможности пролиферации. Таким образом, невозможность выработки цитокинов предотвращает пролиферацию. Однако анергичные Т-клетки могут пролиферировать, если они культивируются с цитокинами (например, IL-2). Например, анергия Т-клеток также может наблюдаться при недостаточной выработке IL-2 Т-лимфоцитами, как показывают измерения способом ИФА или посредством анализа пролиферации с использованием индикаторной клеточной линии. Альтернативно можно использовать репортерный генный конструкт. Например, анергичные Т-клетки не могут инициировать транскрипцию генов DL-2, индуцируемую гетерологичным промотором под контролем энхансера гена 5' IL-2 или мультимером с последовательностью API, который может находиться в энхансере (Kang et al. 1992 Science. 257: 1134).

В настоящем документе термин «иммунологическая толерантность» относится к способам, которые подействовали на часть субъектов, получавших лечение, в сравнении с субъектами, не получавшими лечения, когда наблюдается: a) снижение уровня специфического иммунного ответа (считается, что он по меньшей мере частично опосредован антиген-специфическими эффекторными Т-лимфоцитами, B-лимфоцитами, антителом или их эквивалентами); b) задержка наступления или прогрессирования специфического иммунного ответа; или c) снижение риска наступления или прогрессирования специфического иммунного ответа. «Специфическая» иммунологическая толерантность возникает, когда иммунологическая толерантность действует преимущественно в отношении определенных антигенов, в сравнении с другими. «Неспецифическая» иммунологическая толерантность возникает, когда иммунологическая толерантность не ограничена антигенами, приводящими к воспалительному иммунному ответу. «Квазиспецифическая» иммунологическая толерантность возникает, когда иммунологическая толерантность действует частично избирательно в отношении антигенов, приводящих к патогенному иммунному ответу, но не действует в отношении тех, которые приводят к защитному иммунному ответу.

Толерантность к аутоантигенам и аутоиммунному заболеванию достигается за счет различных механизмов, включая негативную селекцию аутореакционных Т-клеток в тимусе, и механизмов периферической толерантности для тех аутореакционных Т-клеток, которые избежали делеции в тимусе и обнаруживаются на периферии. Примеры механизмов, обеспечивающих толерантность периферических Т-клеток, включают «игнорирование» собственных антигенов, анергию или невосприимчивость к аутоантигену, иммунное отклонение цитокинов и индуцируемую активацией гибель аутореакционных Т-клеток. Кроме того, было показано, что регуляторные Т-клетки участвуют в опосредовании периферической толерантности. См., например, Walker et al. (2002) Nat. Rev. Immunol. 2: 11-19; Shevach et al. (2001) Immunol. Rev. 182: 58-67. В некоторых ситуациях утрачивается (или нарушается) периферическая толерантность к аутоантигену и следует аутоиммунный ответ. Например, было показано, что в животной модели EAE активация антигенпредставляющих клеток (АПК) посредством рецепторов врожденного иммунитета TLR нарушает аутотолерантность и индуцирует EAE (Waldner et al. (2004) J. Clin. Invest. 113: 990-997).

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления в изобретении предложены способы повышения представления антигенов наряду с подавлением или понижением стимуляции клеток, зависимых от TLR7/8, TLR9 и/или TLR7/8/9. Как описано в настоящем документе, введение конкретных модифицированных частиц приводит к представлению антигенов клетками DC или АПК наряду с подавлением ответов клеток, зависимых от TLR7/8, TLR9 и/или TLR7/8/9, которые связаны с иммуностимулирующими полинуклеотидами. Такое подавление может включать в себя снижение уровней одного или более цитокинов, связанных с TLR.

Как было описано выше, в настоящем изобретении представлены новые соединения с биологическими свойствами, подходящими для лечения опосредованных Mac-1 и LFA-1 расстройств.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения представлены фармацевтические композиции, которые содержат иммуномодифицирующие частицы и необязательно содержат фармацевтически приемлемый носитель. В определенных вариантах осуществления такие композиции необязательно дополнительно содержат один или более дополнительных терапевтических агентов. Альтернативно, модифицированные частицы настоящего изобретения могут вводиться нуждающемуся в лечении пациенту в комбинации с введением одного или более терапевтических агентов. Например, дополнительные терапевтические агенты для совместного введения или включения в фармацевтическую композицию с соединением настоящего изобретения могут представлять собой разрешенный противовоспалительный агент или любой из ряда агентов, проходящих процедуру получения разрешения в Управлении США по контролю за продуктами и лекарствами, который в конечном счете будет разрешен для лечения любого расстройства, характеризуемого неконтролируемым воспалительным иммунным ответом, или бактериальной или вирусной инфекции. Также следует понимать, что некоторые из модифицированных частиц настоящего изобретения могут существовать в свободной форме для лечения или, в соответствующих случаях, в виде их фармацевтически приемлемого производного.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель, который в настоящем изобретении включает в себя все без исключения растворители, разбавители или другой жидкий носитель, вспомогательные вещества для получения дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие вещества, смазывающие вещества и т. п., которые можно использовать для получения конкретной требуемой дозированной формы. В справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) описаны различные носители, которые используются при составлении фармацевтических композиций, и известные методики их получения. За исключением случаев, когда та или иная общеизвестная несущая среда оказывается несовместимой с соединениями изобретения, например, по причине продуцирования любого нежелательного биологического эффекта или иного неблагоприятного взаимодействия с любым (-и) другим (-и) компонентом (-ами) фармацевтической композиции, его применение считается частью объема настоящего изобретения. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают в себя, без ограничений, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошковый трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатно-буферные растворы, а также другие нетоксические совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния. По усмотрению специалиста, составляющего рецептуру, в композиции также могут присутствовать красители, высвобождающие агенты, покрывающие агенты, подсластители, вкусовые добавки, ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Жидкие дозированные формы для перорального введения включают в себя, без ограничений, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активных соединений жидкие дозированные формы могут содержать инертные разбавители, которые обычно используются в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как, например, этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное масла, масло зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот сорбитана, а также их смеси. В дополнение к инертным разбавителям композиции для перорального введения могут также включать в себя адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгаторы и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы и отдушки.

Частицы настоящего изобретения можно вводить перорально, назально, внутривенно, внутримышечно, интраокулярно, чрескожно, внутрибрюшинно или подкожно. В одном варианте осуществления частицы изобретения вводят внутривенно.

Эффективное количество и способ введения настоящего изобретения для модуляции иммунного ответа могут варьировать в зависимости от субъекта, излечиваемого состояния и других факторов, известных специалистам в данной области. К факторам, которые следует учитывать, относятся способ введения и количество вводимых доз. Такие факторы известны в данной области, и специалисты в данной области могут успешно определять их без ненужного экспериментирования. Подходящим диапазоном доз является диапазон, обеспечивающий желаемую регуляцию иммунного ответа. Подходящий диапазон доз носителя, указанный в количестве полученного носителя, может представлять собой любой из следующих: от 0,5 до 10 мг/кг, от 1 до 9 мг/кг, от 2 до 8 мг/кг, от 3 до 7 мг/кг, от 4 до 6 мг/кг, 5 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг, от 5 до 10 мг/кг. Альтернативно, дозировка может определяться на основе количества частиц. Например, подходящий диапазон доз носителя, указанный в количестве полученного носителя, может представлять собой, например, около 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ или большее количество частиц на дозу. Абсолютное количество, выдаваемое каждому пациенту, зависит от фармакологических свойств, таких как биодоступность, клиренс и способ введения. Подробная информация о фармацевтически приемлемых носителях, разбавителях и эксципиентах, а также способах получения фармацевтических композиций и составов представлена в публикации Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18^th Edition, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA., полностью включенной в настоящий документ путем ссылки.

Эффективное количество и способ введения конкретного состава носителя может варьироваться в зависимости от конкретного пациента, желаемого результата и/или типа расстройства, стадии заболевания и других факторов, очевидных для специалиста в данной области. Способ (-ы) введения, которые могут применяться в конкретной области применения, очевидны для специалиста в данной области. Способы введения включают в себя, без ограничений, местный, дермальный, трансдермальный, трансмукозальный, эпидермальный, парентеральный, желудочно-кишечный, носоглоточный и легочный, включая трансбронхиальный и трансальвеолярный способ. Подходящим диапазоном доз является диапазон, который обеспечивает доставку композиции иммунорегулирующих частиц, достаточной для достижения концентрации в ткани около 1-50 мкM, измеряемой по уровню в крови. Абсолютное количество, выдаваемое каждому пациенту, зависит от фармакологических свойств, таких как биодоступность, клиренс и способ введения.

В настоящем изобретении предложены составы носителя, подходящие для местного применения, включая, без ограничений, физиологически приемлемые имплантаты, мази, кремы, ополаскиватели и гели. К примерам способов дермального введения относятся способы, менее инвазивные, чем трансдермальная передача, эпидермальное введение и подкожная инъекция.

Трансдермальное введение проводят путем нанесения крема, ополаскивателя, геля и т. п., способного обеспечить проникновение носителя через кожу и попадание в кровяное русло. Композиции, подходящие для трансдермального введения, включают в себя, без ограничений, фармацевтически приемлемые суспензии, масла, кремы и мази, наносимые непосредственно на кожу или заключаемые в защитный носитель, такой как трансдермальное устройство (так называемый «пластырь»). Примеры подходящих кремов, мазей и т. п. можно найти, например, в настольном справочнике врача. Трансдермальная передача также может осуществляться посредством ионтофореза, например, с использованием доступных в продаже пластырей, непрерывно подающих содержащийся в них продукт через неповрежденную кожу в течение нескольких суток или более. Применение этого способа позволяет проводить контролируемую передачу фармацевтических композиций в относительно высоких концентрациях, позволяет вводить комбинации лекарственных средств и позволяет одновременно применять промотор абсорбции.

Парентеральный способ введения включает в себя, без ограничений, электрический способ (ионтофорез) или способ прямой инъекции, такой как прямая инъекция в центральную систему внутривенного вливания, внутривенная, внутримышечная, внутрибрюшинная, внутрикожная или подкожная инъекция. Составы носителя, подходящие для парентерального введения, по существу готовят в соответствующей требованиям Фармакопеи США (USP) воде или в воде для инъекций, и они могут дополнительно содержать буферы pH, солевые наполнители, консерванты и другие фармацевтически приемлемые эксципиенты. Иммунорегуляторный полинуклеотид для парентерального введения можно приготовить в фармацевтически приемлемых стерильных изотонических растворах, таких как физраствор или фосфатно-солевой буфер для инъекций.

Желудочно-кишечные способы введения включают в себя, без ограничений, пищевой и ректальный способы, и в данном случае может подразумеваться применение, например, фармацевтически приемлемых порошков, пилюль или жидкостей для перорального введения и суппозиториев для ректального введения.

Носоглоточный и легочный способ введения осуществляют путем ингаляции, и в данном случае могут подразумеваться такие способы доставки, как интраназальный, трансбронхиальный и трансальвеолярный способ. Изобретение включает в себя составы носителя, подходящие для введения путем ингаляции, включая, без ограничений, жидкие суспензии для создания аэрозолей, а также порошковые формы для систем доставки путем ингаляции сухого порошка. Устройства, подходящие для введения составов носителя путем ингаляции, включают в себя, без ограничений, распылители, испарители, небулайзеры и системы доставки путем ингаляции сухого порошка.

Препараты для инъекций, например стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, можно готовить в соответствии с известными в данной области принципами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций также может представлять собой стерильный раствор для инъекций, суспензию или эмульсию в нетоксичном разбавителе или растворителе, приемлемом для парентерального введения, например в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, которые можно использовать, представляют собой воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия фармацевтической чистоты (согласно Фармакопее США). Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, для получения препаратов для инъекций применяют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Составы для инъекций можно стерилизовать, например, путем фильтрования через задерживающий бактерии фильтр или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые перед применением можно растворять или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций.

Для продления действия лекарственного средства часто желательно замедлить всасывание лекарственного средства при подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно добиться за счет применения жидкой суспензии или кристаллического или аморфного материала с низкой растворимостью в воде. При этом скорость всасывания лекарственного средства зависит от скорости его растворения, которая в свою очередь может зависеть от размеров кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, пролонгированное всасывание парентерально введенной формы лекарственного средства обеспечивается растворением или суспендированием лекарственного средства в масляном носителе. Формы депо для инъекций получают путем формирования микрокапсулированных матриц лекарственного средства в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. Варьируя соотношение количеств лекарственного средства и полимера и свойства конкретного использованного полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают в себя сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Составы депо для инъекций также готовят включением лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями тела.

В некоторых вариантах осуществления синтетические биоразлагаемые частицы настоящего изобретения обеспечивают простоту производства, широкую доступность терапевтических агентов и увеличение участка лечения. В конкретных вариантах осуществления биоразлагаемые частицы сополимера лактида и гликолида с функционализированной поверхностью, имеющие высокую плотность карбоксильных групп на поверхности, синтезированные с использованием поверхностно-активного вещества поли(этилен-альт-малеинового ангидрида), позволяют получить носитель, обладающий многими преимуществами по отношению к другим частицам-носителям и/или поверхностям. Эксперименты, проведенные при разработке вариантов осуществления настоящего изобретения, продемонстрировали конъюгацию пептидов (например, пептида PLP_139-151) с этими частицами. Было показано, что такие связанные с пептидом частицы являются эффективными для предотвращения развития заболевания и индукции иммунологической толерантности (например, при R-EAE, мышиной модели рассеянного склероза, индуцированного у мышей SJL/J при помощи PLP_139-151/CFA). Связанные с пептидом носители настоящего изобретения обладают многими преимуществами по отношению к другим структурам, индуцирующим толерантность. В некоторых вариантах осуществления частицы являются биоразлагаемыми и, следовательно, не будут присутствовать в теле в течение длительного времени. Время полного разложения можно контролировать. В некоторых вариантах осуществления частицы функционализируют для облегчения их интернализации без активации клеток (например, загрузка фосфатидилсерина в микросферы из PLG). В некоторых вариантах осуществления в частицы встраивают лиганды, наводящие их на определенную популяцию клеток. В некоторых вариантах осуществления на поверхность или внутрь частиц включают противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β, чтобы ограничить активацию типа клеток, интернализировавшего частицы, и облегчить индукцию толерантности посредством энергии и/или уничтожения, а также активацию регуляторных Т-клеток. Было обнаружено, что композиция частиц влияет на длительность нахождения частиц в теле, а для индукции толерантности необходимы быстрый захват частиц и быстрый клиренс/разложение. Поскольку соотношение лактид : гликолид свыше 50 : 50 уменьшает скорость разложения, в частицах изобретения соотношение лактид : гликолид составляет около 50 : 50 или менее. В одном варианте осуществления в частицах изобретения соотношение D,L-лактид : гликолид составляет около 50 : 50.

Твердые дозированные формы для перорального введения включают в себя капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах модифицированные частицы смешивают с по меньшей мере одним инертным фармацевтически приемлемым эксципиентом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальцийфосфатом и/или а) наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, манит и кремниевая кислота, b) связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, c) увлажняющими веществами, такими как глицерин, d) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, e) замедлителями растворения, такими как парафин, f) ускорителями всасывания, такими как четвертичные аммониевые соединения, g) смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат, h) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и i) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, а также их смесями. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированная форма также может содержать буферные агенты.

Твердые композиции аналогичного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягко- и твердонаполненных желатиновых капсулах с применением таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т. п. Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно готовить с использованием покрытий и оболочек, таких как энтеросолюбильные и другие покрытия, хорошо известные в области приготовления фармацевтических композиций. Они могут необязательно содержать опалесцирующие агенты и также могут иметь композицию, обеспечивающую высвобождение только активного (-ых) компонента (-ов) или преимущественно в определенной части пищеварительного тракта, необязательно в замедленной форме. Примеры возможных для применения инкапсулирующих композиций включают в себя полимерные вещества и воски. Твердые композиции аналогичного типа также можно использовать в качестве наполнителей в мягко- и твердонаполненных желатиновых капсулах с применением таких эксципиентов, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т. п.

Модифицированные частицы также можно получить в микроинкапсулированной форме с одним или более перечисленными выше эксципиентами. Твердые дозированные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно получить с использованием покрытий и оболочек, таких как энтеросолюбильные покрытия, покрытия с контролем высвобождения и другие покрытия, хорошо известные в области приготовления фармацевтических композиций. В таких твердых дозированных формах активное соединение можно смешивать с по меньшей мере одним инертным разбавителем, например сахарозой, лактозой и крахмалом. В соответствии с принятой практикой такие дозированные формы также могут содержать дополнительные вещества, помимо инертных разбавителей, например смазывающие вещества для таблетирования и другие вспомогательные вещества для таблетирования, такие как стеарат магния и микрокристаллическую целлюлозу. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированные формы могут также содержать буферные агенты. Они могут необязательно содержать опалесцирующие агенты, а также могут иметь композицию, обеспечивающую высвобождение только модифицированных частиц или преимущественно в определенной части пищеварительного тракта, необязательно в замедленной форме. Примеры возможных для применения инкапсулирующих композиций включают в себя полимерные вещества и воски.

Настоящее изобретение включает в себя фармацевтически приемлемые составы для местного применения из модифицированных частиц, обладающие признаками изобретения. В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый состав для местного применения» означает любой состав, который является фармацевтически приемлемым для внутрикожного введения модифицированных микрочастиц изобретения посредством нанесения соединения на эпидермис. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав для местного применения содержит систему носителя. Фармацевтически эффективные носители включают в себя, без ограничений, растворители (например, спирты, полимерные спирты, воду), кремы, лосьоны, мази, масла, пластыри, липосомы, порошки, эмульсии, микроэмульсии и буферные растворы (например, гипотонический или буферный физраствор) или любой другой носитель, известный в данной области как используемый для введения лекарственных препаратов для местного применения. Более полный список известных в данной области носителей представлен путем ссылки в стандартной справочной литературе, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th Edition, 1980 и 17^th Edition, 1985, оба выпущены издательством Mack Publishing Company, г. Истон, штат Пенсильвания, описания которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки. В некоторых других вариантах осуществления составы изобретения для местного применения могут содержать эксципиенты. Для получения фармацевтически приемлемых составов для местного применения, обладающих признаками изобретения, могут использоваться любые известные в данной области фармацевтически приемлемые эксципиенты. Примеры эксципиентов, которые могут быть включены в составы для местного применения изобретения, включают в себя, без ограничений, консерванты, антиоксиданты, увлажнители, умягчители, буферные агенты, солюбилизирующие агенты, другие агенты, усиливающие проницаемость, средства защиты кожи, поверхностно-активные вещества и пропелленты и/или дополнительные терапевтические агенты, используемые в комбинации с модифицированными частицами. Подходящие консерванты включают в себя, без ограничений, спирты, четвертичные амины, органические кислоты, парабены и фенолы. Подходящие антиоксиданты включают в себя, без ограничений, аскорбиновую кислоту и ее сложные эфиры, бисульфит натрия, бутилированный гидрокситолуол, бутилированный гидроксианизол, токоферолы и хелатирующие агенты, такие как ЭДТА и лимонная кислота. Подходящие увлажнители включают в себя, без ограничений, глицерин, сорбит, полиэтиленгликоли, мочевину и пропиленгликоль. Подходящие буферные агенты для применения в изобретении включают в себя, без ограничений, буферы на основе лимонной, соляной и молочной кислот. Подходящие солюбилизирующие агенты включают в себя, без ограничений, четвертичные хлориды аммония, циклодекстрины, бензилбензоат, лецитин и полисорбаты. Подходящие средства защиты кожи, которые могут использоваться в составах для местного применения изобретения, включают в себя, без ограничений, масло, содержащее витамин Е, аллантоин, диметикон, глицерин, вазелин и оксид цинка.

В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемые составы для местного применения изобретения содержат по меньшей мере модифицированные частицы изобретения и агент, усиливающий проницаемость. Выбор состава для местного применения будет зависеть от нескольких факторов, включая подлежащее лечению состояние, физико-химические характеристики соединения, обладающего признаками изобретения, и других присутствующих эксципиентов, их стабильность в составе, доступное производственное оборудование, а также ценовых ограничений. В настоящем документе термин «агент, усиливающий проницаемость» означает агент, способный транспортировать фармакологически активное соединение через роговой слой в эпидермис или дерму, предпочтительно с незначительной системной абсорбцией или ее отсутствием. Широкое разнообразие соединений оценивали относительно их эффективности по усилению скорости проникновения лекарственных средств через кожный покров. См., например, Percutaneous Penetration Enhancers, Maibach H. I. and Smith H. E. (eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995), где оценивается применение и тестирование различных усилителей проницаемости кожи, а также Buyuktimkin et al., Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Gosh T. K., Pfister W. R., Yum S. I. (Eds.), Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, Ill. (1997). В некоторых примерах осуществления агенты, усиливающие проницаемость, для применения в настоящем изобретении включают в себя, без ограничений, триглицериды (например, соевое масло), композиции алоэ (например, гель алоэ вера), этиловый спирт, изопропиловый спирт, октолифенилполиэтиленгликоль, олеиновую кислоту, полиэтиленгликоль 400, пропиленгликоль, N-децилметилсульфоксид, сложные эфиры жирных кислот (например, изопропилмиристат, метиллаурат, моноолеат глицерина и моноолеат пропиленгликоля) и N-метилпирролидон.

В определенных вариантах осуществления композиции могут быть представлены в виде мазей, паст, кремов, лосьонов, гелей, порошков, растворов, аэрозолей, средств для ингаляции или пластырей. В некоторых примерах вариантов осуществления составы композиций в соответствии с изобретением представляют собой кремы, которые могут дополнительно содержать насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, такие как стеариновая кислота, пальмитиновая кислота, олеиновая кислота, пальмитоолеиновая кислота, цетиловый или олеиловый спирты, причем, в частности, предпочтительной является стеариновая кислота. Кремы изобретения могут также содержать неионное поверхностно-активное вещество, например полиокси-40-стеарат. В определенных вариантах осуществления активный компонент в стерильных условиях смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и любыми необходимыми консервантами или буферными растворами. Считается, что офтальмологические составы, ушные капли и глазные капли также входят в объем изобретения. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает применение трансдермальных пластырей, которые обладают дополнительным преимуществом обеспечения контролируемой доставки соединения в тело. Такие дозированные формы получают растворением или диспергированием соединения в соответствующей среде. Как описано выше, агенты для усиления проницаемости также можно применять для увеличения потока соединения через кожу. Скоростью проницаемости можно управлять с помощью либо обеспечения мембраны, регулирующей скорость проницаемости, либо диспергирования соединения в полимерной матрице или геле.

Модифицированные частицы можно вводить посредством аэрозоля. Это достигается путем получения водного аэрозоля, липосомного препарата или твердых частиц, содержащих модифицированные частицы. Можно применять безводную суспензию (например, фторуглеродный пропеллент).

Обычно водный аэрозоль получают путем введения в состав водного раствора или суспензии агента вместе с обычными фармацевтически приемлемыми носителями и стабилизаторами. Носители и стабилизаторы варьируются в зависимости от требований к определенному соединению, но обычно включают в себя неионогенные поверхностно-активные вещества (Tweens, Pluronics® или полиэтиленгликоль), нетоксичные белки, такие как сывороточный альбумин, сложные эфиры сорбита, олеиновую кислоту, лецитин, аминокислоты, такие как глицин, буферы, соли, сахара или сахарные спирты. Аэрозоли по существу получают на основе изотонических растворов.

Следует также понимать, что модифицированные частицы и фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть получены и использованы в видах комбинированной терапии, т. е. соединения и фармацевтические композиции могут быть введены в состав в смеси с, или введены одновременно с, перед или после одного или более других требуемых терапевтических средств или медицинских процедур. При выборе конкретной терапевтической комбинации (терапевтических средств или процедур) с целью использования в комбинированной схеме лечения будет приниматься во внимание совместимость требуемых терапевтических средств и/или процедур и желаемый для достижения терапевтический эффект. Следует также понимать, что используемые терапевтические средства могут достичь желаемого эффекта в отношении одного и того же расстройства (например, соединение, обладающее признаками изобретения, можно вводить одновременно с другим противовоспалительным средством), или они могут достигать различных эффектов (например, контроль каких-либо неблагоприятных побочных эффектов).

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие модифицированные частицы настоящего изобретения, дополнительно содержат один или более дополнительных терапевтически активных компонентов (например, противовоспалительных и/или паллиативных компонентов). Для целей изобретения термин «паллиативный» относится к лечению, которое фокусируется на облегчении симптомов заболевания и/или побочных эффектов схемы лечения, но не является лечебным. Например, паллиативное лечение включает в себя болеутоляющие, противорвотные лекарственные средства и лекарственные средства против тошноты.

В изобретении представлены способы регулирования иммунного ответа у субъекта, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно - человека, включающие введение субъекту модифицированных частиц, описанных в настоящем документе. Способы иммунорегуляции, представленные в настоящем изобретении, включают в себя те, которые подавляют и/или ингибируют врожденный иммунный ответ или адаптивный иммунный ответ, включая, без ограничений, иммунный ответ, стимулированный иммуностимулирующими полипептидами или вирусными или бактериальными компонентами.

Модифицированные частицы вводят в количестве, достаточном для регулирования иммунного ответа. Как описано в настоящем документе, регулирование иммунного ответа может быть гуморальным и/или клеточным и измеряется с использованием стандартных методик, известных в данной области и описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, вводят вместе (например, одновременно, перед или после) с имплантатом (например, устройством) и/или трансплантатом (например, тканью, клетками, органом) для опосредования, нейтрализации, регуляции и/или уменьшения соответствующего иммунного ответа.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от расстройства, связанного с нежелательной иммунной активацией, такого как аллергическое заболевание или состояние, аллергия и астма. Субъект с аллергическим заболеванием или астмой представляет собой субъект с обнаруживаемым симптомом существующего аллергического заболевания или астмы. У такого субъекта толерантность можно индуцировать, например, при помощи частиц в комплексе с определенными пищевыми продуктами (например, белками арахиса и т. п.), вводимыми путем инъекции белками (например, белками пчелиного яда и т. п.) или вводимыми путем ингаляции веществами (например, белками пыльцы амброзии, белками, содержащимися в клетках кожи домашних животных, и т. п.), которые вызывают аллергическую реакцию.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от расстройства, связанного с нежелательной иммунной активацией, такого как аутоиммунное заболевание и воспалительное заболевание. Субъект с аутоиммунным заболеванием или воспалительным заболеванием представляет собой субъект с обнаруживаемым симптомом существующего аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания. У такого субъекта толерантность можно выработать, например, при помощи частиц в комплексе с соответствующими аутоантигенами, обуславливающими конкретное аутоиммунное заболевание.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от расстройства, связанного с ферментозаместительной терапией. У такого субъекта толерантность можно вызвать, например, частицами в комплексе с ферментами, которые пациенты с генетической недостаточностью не способны продуцировать, чтобы предотвратить у них образование нейтрализующих антител на рекомбинантные ферменты, вводимые для лечения данной недостаточности, например толерантности к человеческому фактору VIII у пациентов с гемофилией, обусловленной генетической недостаточностью способности к продукции фактора VIII. Другой пример может включать в себя замещение фермента при таких состояниях, как болезнь накопления мукополисахаридов, ганглиозидоз, щелочная гипофосфатазия, заболевание накопления эфиров холестерина, гиперурикемия, дефицит гормона роста, почечная анемия, или с болезнями лизосомального накопления, включая болезнь Фабри, болезнь Гоше, болезнь Гурлера, болезнь Хантера, болезнь Марото - Лами, болезнь Ниманна - Пика, болезнь Тея - Сакса и болезнь Помпе.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от сильного или иным образом неблагоприятного иммунного ответа в отношении агента, вводимого для лечения заболевания, что фактически или потенциально ставит под угрозу здоровье пациента или его лечение. Кроме того, новые соединения, предлагаемые в изобретении, могут быть предоставлены субъектам, у которых не проявляется иммунный ответ на агент, но у которых он может потенциально проявиться в будущем. В определенных вариантах осуществления субъект получает ферментозаместительную терапию. В определенных вариантах осуществления терапевтические агенты включают в себя, без ограничений, пептиды или агенты на белковой основе, ДНК-вакцины, миРНК, олигомеры, переключающие сайт сплайсинга, и наночастицы на основе РНК. В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты включают в себя, без ограничений, адват, антигемофилический фактор, когенат, элоктат, слитный белок рекомбинантного фактора VIII и Fc, рефакто, Novo VIIa, рекомбинантный фактор VII, эптаког альфа, геликсат, монанин, фактор коагуляции IX, вилат, цередазу, аглюцеразу, церезим, имиглюцеразу, Elelso, талиглюцеразу альфа, фабразим, агалсидазу бета, альдуразим, альфа-L-идуронидазу, миозим, кислую глюкозидазу, элапразу, идуронат-2-сульфатазу, наглазим арилсульфатазу B и N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят терапевтические агенты, применяемые для лечения заболеваний, включая, без ограничений, гемофилию, гемофилию A, гемофилию B, болезнь фон Виллебранда, болезнь Гоше, болезнь Фабри, болезнь Гурлера, болезнь Помпе, болезнь Хантера, болезнь накопления мукополисахаридов, ганглиозидоз, щелочную гипофосфатазию, заболевание накопления эфиров холестерина, гиперурикемию, дефицит гормона роста, почечную анемию и болезнь Марото - Лами.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от орфанного аутоиммунного состояния. Такие состояния включают в себя, без ограничений, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, мембранную нефропатию, буллезный пемфигоид, пемфигус вульгарис и миастению гравис.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает от расстройства, связанного с терапией заболевания. В случае рекомбинантных антител толерантность индуцируют, например, к гуманизированному антителу, применяемому в терапевтическом контексте, для предотвращения выработки у пациента нейтрализующих антител к терапевтическим антителам, например, индуцируют толерантность к гуманизированному антителу, устраняющему иммунную субпопуляцию, или к антителу к цитокину, используемому для лечения аутоиммунного заболевания.

Аутоиммунные заболевания можно разделить на две широкие категории: органоспецифические и системные. Аутоиммунные заболевания включают в себя, без ограничений, ревматоидный артрит (РА), системную красную волчанку (СКВ), сахарный диабет I типа, сахарный диабет II типа, рассеянный склероз (РС), иммуноопосредованное бесплодие, такое как преждевременная недостаточность яичников, склеродермию, болезнь Шегрена, витилиго, алопецию (облысение), полигландулярную недостаточность, болезнь Грейвса, гипотиреоз, полимиозит, пузырчатку обыкновенную, пузырчатку листовидную, воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона и язвенный колит, аутоиммунный гепатит, включая связанный с вирусом гепатита В (ВГВ) и вирусом гепатита С (ВГC), гипопитуитаризм, болезнь «трансплантат против хозяина» (GvHD), миокардит, болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания кожи, увеит, злокачественную анемию, целиакию, гипопаратиреоз, оптикомиелит, мембранозную нефропатию, буллезный пемфигоид, обыкновенную пузырчатку, миастению гравис.

Аутоиммунные заболевания могут также включать в себя, без ограничений, тиреоидит Хашимото, аутоиммунные полигландулярные синдромы I типа и II типа, паранеопластическую пузырчатку, буллезную пузырчатку, герпетиформный дерматит, линейный IgA дерматоз, буллезный приобретенный эпидермолиз, узелковую эритему, пемфигоид беременных, рубцовый пемфигоид, эссенциальную криоглобулинемию смешанного типа, хроническую буллезную болезнь детского возраста, гемолитическую анемию, тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Гудпасчера, аутоиммунную нейтропению, миастению гравис, миастенический синдром Итона - Ламберта, синдром мышечной скованности, острый рассеянный энцефаломиелит, синдром Гийена - Барре, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулонейропатию, мультифокальную моторную нейропатию с блоком проводимости, хроническую нейропатию с моноклональной гаммапатией, опсоклонический-миоклонический синдром, мозжечковую дегенерацию, энцефаломиелит, ретинопатию, первичный билиарный склероз, склерозирующий холангит, глютензависимую энтеропатию, анкилозирующий спондилит, реактивные артриты, полимиозит/дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Бехчета, псориаз, узелковый полиартериит, аллергический ангиит и гранулематоз (болезнь Черджа - Стросса), синдром полиангиита «с перекрытием», аллергический васкулит, гранулематоз Вегенера, височный артериит, артериит Такаясу, болезнь Кавасаки, выделенный васкулит центральной нервной системы, облитерирующий тромбангиит, саркоидоз, гломерулонефрит и криопатии. Эти состояния хорошо известны в медицинских областях и описаны, например, в Harrison's Principles of Internal Medicine, 14^th ed., Fauci A S et al., eds., New York: McGraw-Hill, 1998.

Животные модели для изучения аутоиммунного заболевания известны в данной области. Например, модели с использованием животных, наиболее схожие с аутоиммунными заболеваниями человека, включают в себя линии животных, у которых спонтанно развивается определенное заболевание с высокой частотой. Примеры таких моделей включают в себя, без ограничений, мышей с диабетом без ожирения (NOD), у которых развивается заболевание, аналогичное диабету I типа, а также животных, подверженных заболеванию, сходному с системной красной волчанкой, таких как новозеландские гибридные, MRL-Fas^lpr и BXSB-мыши. Животные модели с индуцированным аутоиммунным заболеванием включают в себя, без ограничений, модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), которая представляет собой модель рассеянного склероза, коллаген-индуцированного артрита (CIA), которая представляет собой модель ревматоидного артрита, трансгенных мышей с Т-клетками, специфичными к десмоглеину 3, используемых в качестве экспериментальной модели пемфигус вульгарис, и модель экспериментального аутоиммунного увеита (EAU), которая представляет собой модель увеита. Животные модели аутоиммунного заболевания также были созданы с помощью генетических манипуляций и включают в себя, например, нокаутных мышей по IL-2/IL-10 для моделирования воспалительного заболевания кишечника, нокаутных мышей по Fas или Fas-лиганду для моделирования СКВ и нокаутных мышей по антагонисту к рецептору IL-I для моделирования ревматоидного артрита.

В определенных вариантах осуществления субъект страдает бактериальной или вирусной инфекцией. Субъект с бактериальной или вирусной инфекцией представляет собой субъект с обнаруживаемым симптомом существующей бактериальной или вирусной инфекции.

Не имеющий ограничительного характера список вирусных инфекций, поддающихся лечению модифицированными частицами настоящего изобретения, включает в себя инфекции, вызываемые вирусом простого герпеса, инфекции, вызываемые вирусом гепатита, инфекции, вызываемые вирусом лихорадки Западного Нила, инфекции, вызываемые флавивирусом, инфекции, вызываемые вирусом гриппа, риновирусные инфекции, папилломавирусные инфекции, паромиксовирусные инфекции, инфекции, вызываемые вирусом парагриппа, и ретровирусные инфекции. Предпочтительными вирусами являются вирусы, инфицирующие центральную нервную систему субъекта. Наиболее предпочтительными вирусами являются вирусы, что вызывают геморрагическую лихорадку, энцефалит или менингит.

Не имеющий ограничительного характера список бактериальных инфекций, поддающихся лечению модифицированными частицами настоящего изобретения, включает в себя стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, микобактериальные инфекции, инфекции, вызываемые бациллами, инфекции, вызываемые сальмонеллой, инфекции, вызываемые вибрионом, инфекции, вызываемые спирохетой, и инфекции, вызываемые нейссериями. Предпочтительными являются бактерии, которые инфицируют центральную нервную систему субъекта. Наиболее предпочтительными являются те бактерии, которые вызывают энцефалит или менингит.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применению композиций настоящего изобретения перед началом заболевания. В других вариантах осуществления изобретение относится к применению композиций настоящего изобретения для ингибирования текущего заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к облегчению заболевания у субъекта. Облегчение заболевания у субъекта означает обеспечение лечения, предотвращения или подавления заболевания у субъекта.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к предотвращению рецидива заболевания. Например, нежелательный иммунный ответ может развиться к одной области пептида (например, к антигенной детерминанте). Рецидив заболевания, связанный с нежелательным иммунным ответом, может развиться в связи с возникновением иммунного ответа на другую область пептида. Поскольку иммуномодифицирующие частицы настоящего изобретения не имеют присоединенных к ним пептидов или антигенных фрагментов, частицы будут эффективны против множества эпитопов. При некоторых расстройствах иммунного ответа, включая РС и другие Th1/17-опосредованные аутоиммунные заболевания, Т-клеточные ответы могут быть динамичными и развиваться в ходе возвратно-ремиттирующего и/или хронического прогрессирующего заболевания. Динамический характер Т-клеточного репертуара имеет последствия для лечения некоторых заболеваний, поскольку по мере прогрессирования заболевания может меняться мишень. Ранее для прогнозирования прогрессирования болезни было необходимо предварительное знание характера иммунных ответов. В настоящем изобретении предложены композиции, которые могут предотвратить эффект динамического изменения заболевания, зависящего от феномена «распространения эпитопа». Известной моделью рецидива заболевания является иммунная реакция на протеолипидный белок (PLP), выступающая в качестве модели рассеянного склероза (РС). Первоначальный иммунный ответ может произойти в ответ на PLP139-15. Последующее начало заболевания может стать результатом рецидива иммунного ответа на PLP[pi]s-iβi.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к трансплантации. Это относится к переносу образца ткани или трансплантата от субъекта-донора субъекту-реципиенту и часто осуществляется на реципиентах-людях, которые нуждаются в ткани для восстановления физиологической функции, обеспечиваемой тканью. Трансплантируемые ткани включают в себя (без ограничений) целые органы, такие как почки, печень, сердце, легкое; компоненты органов, такие как кожные трансплантаты и роговица глаза; и клеточные суспензии, такие как клетки костного мозга и культуры клеток, отобранных и размноженных из костного мозга или циркулирующей крови, и переливания цельной крови.

Серьезное потенциальное осложнение любой трансплантации происходит из-за антигенных различий между реципиентом-хозяином и трансплантируемой тканью. В зависимости от характера и степени различий возможен риск иммунологической атаки организма хозяина на трансплантат, или трансплантата на хозяина, или того и другого. Степень риска определяется по результатам наблюдения за характером ответа в популяции субъектов аналогичного фенотипа, получивших сходное лечение, и на основании корреляции различных возможных влияющих факторов, в соответствии с принятыми клиническими процедурами. Иммунологическая атака может быть результатом уже существующего иммунного ответа (например, в случае предварительно образованного антитела) или ответа, который инициируется в ближайшее время после трансплантации (например, генерация Th-клеток). Антитело, Th-клетки или Tc-клетки могут участвовать в иммунном ответе в любой комбинации друг с другом и с разнообразными эффекторными молекулами и клетками. Однако антигены, которые участвуют в иммунном ответе, по существу неизвестны, поэтому существуют сложности в разработке антиген-специфических видов терапии или индукции антиген-специфической толерантности.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к снижению риска реакции «хозяин против трансплантата» при заболевании, ведущей к отторжению тканевого трансплантата реципиентом. Лечение можно осуществлять для предотвращения или снижения эффекта гиперострого, острого или хронического ответа отторжения трансплантата. Лечение предпочтительно начинать достаточно заблаговременно до трансплантации, так что толерантность уже будет достигнута к моменту пересадки трансплантата; но в тех случаях, когда это невозможно, лечение можно начать одновременно с трансплантацией или после нее. Независимо от времени начала лечение по существу продолжают через определенные промежутки времени по меньшей мере в течение первого месяца после трансплантации. Последующие дозы могут не требоваться, если происходит достаточное приживление трансплантата, но лечение можно возобновить в том случае, если имеются какие-либо признаки отторжения или воспаления трансплантата. Конечно, процедуры, направленные на формирование толерантности в соответствии с настоящим изобретением, могут комбинироваться с другими формами иммуносупрессии для достижения даже более низкой степени риска.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к снижению или иным способом ослабления воспалительного ответа, индуцированного как ответ на хирургическое вмешательство. В одном варианте осуществления изобретения иммуномодифицирующие частицы вводят перед хирургическим вмешательством. В дополнительном варианте осуществления изобретения иммуномодифицирующие частицы вводят одновременно или в ходе хирургического вмешательства. В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения иммуномодифицирующие частицы вводят после хирургического вмешательства.

Частицы настоящего изобретения также можно применять для лечения абсцессов или эмпием для уменьшения воспалительного ответа, формируемого у субъекта после воздействия инфекционных агентов, таких как бактерии или паразиты. В одном варианте осуществления изобретения иммуномодифицирующие частицы вводят в сочетании с антибактериальной и/или антипаразитарной терапией, известными в данной области.

Частицы изобретения также можно применять для уменьшения или иным способом ослабления воспалительного ответа, индуцированного как ответ на физическую травму или повреждение, включая, без ограничений, спортивную травму, рану, травму спинного мозга, травму головного мозга и/или травму мягких тканей. В одном варианте осуществления изобретения иммуномодифицирующие частицы вводят после перенесения субъектом травмы или повреждения.

Частицы изобретения также можно применять для уменьшения воспалительного ответа, связанного с развитием и/или ростом раковых клеток. Раковые заболевания, которые подвергаются лечению, включают в себя, без ограничений, рак центральной нервной системы, базально-клеточную карциному, раковые опухоли головного мозга, лимфому Беркитта, лимфому, рак шейки матки, рак яичников, рак яичек, рак печени, немелкоклеточный и мелкоклеточный рак легких, меланому, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной кишки и рак прямой кишки, рак эндометрия, рак почек (паренхимы почек), лейкоз, неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, меланому и рак щитовидной железы. В одном варианте осуществления подкожная инъекция частиц изобретения предотвращает накопление ингибиторных нейтрофилов, таким образом уменьшая иммунный ответ у пациента, страдающего раковым заболеванием.

Частицы изобретения также могут подходить для регенерации поврежденной ткани. В одном варианте осуществления введение частиц пациенту усиливает регенерацию поврежденных эпителиальных клеток пищеварительного тракта. В дополнительном варианте осуществления пациент страдает от колита, болезни Крона или воспалительного заболевания кишечника. В другом варианте осуществления введение пациенту частиц изобретения увеличивает ремиелинизацию нейронов. В дополнительном варианте осуществления пациент страдает от рассеянного склероза.

В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения (например, носитель PLG, соединенный с антигенной молекулой) могут использоваться с одним или более каркасами, матрицами и/или системами доставки (см., например, заявку на патент США № 2009/0238879; патент США № 7,846,466; патент США № 7,427,602; патент США № 7,029,697; патент США № 6,890,556; патент США № 6,797,738; патент США № 6,281,256, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления частицы (например, связанные с антигеном PLG-частицы) связаны, адсорбированы, встроены, конъюгированы и т. п. с каркасом, матрицей и/или системой доставки (например, для доставки субъекту химического/биологического материала, клетки, ткани и/или органа). В некоторых вариантах осуществления каркас, матрица и/или система доставки (например, для доставки субъекту химического/биологического материала, клетки, ткани и/или органа) содержат и/или состоят из материалов, описанных в настоящем документе (например, PLG, конъюгированного с одним или более антигенными пептидами).

В некоторых вариантах осуществления предложены микропористые каркасы (например, для трансплантации биологического материала (например, клеток, тканей и т. п.) субъекту). В некоторых вариантах осуществления предложены микропористые каркасы, на которых присутствуют агенты (например, белки внеклеточного матрикса, экзендин-4) и биологический материал (например, островковые клетки поджелудочной железы). В некоторых вариантах осуществления каркасы применяют для лечения заболеваний (например, диабета I типа) и родственных способов (например, диагностических способов, исследовательских способов, скринингового поиска лекарственных средств). В некоторых вариантах осуществления предложены каркасы с описанными в настоящем документе носителями, конъюгированными с антигеном, которые находятся на каркасе и/или внутри него. В некоторых вариантах осуществления каркасы получают из материалов, конъюгированных с антигенами (например, конъюгированного с антигенами PLG).

В некоторых вариантах осуществления каркас и/или система доставки содержит один или более слоев и/или содержит один или более химических и/или биологических объектов/агентов (например, белков, конъюгированных с пептидом частиц, низкомолекулярных соединений, клеток, тканей и т. п.), см., например, заявку на патент США 2009/0238879, которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления связанные с антигеном частицы вводят совместно с каркасной системой доставки для того, чтобы вызвать иммунологическую толерантность к каркасу и связанным с ним материалам. В некоторых вариантах осуществления микропористый каркас вводят субъекту с описанными в настоящем документе частицами, находящимися на каркасе или внутри него. В некоторых вариантах осуществления связанные с антигеном частицы соединены с каркасной системой доставки. В некоторых вариантах осуществления каркасная система доставки содержит связанные с антигеном частицы.

Специалистам в данной области будут очевидны различные модификации, рекомбинации и вариации описанных элементов и вариантов осуществления без выхода за рамки сущности и объема изобретения. Хотя описаны конкретные варианты осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими вариантами осуществления. Действительно, подразумевается, что различные модификации описанных схем и вариантов осуществления, очевидные специалистам в данной области, входят в объем приведенной ниже формулы изобретения. Например, в заявках на патенты США 2012/0076831, 2002/0045672, 2005/0090008, 2006/0002978 и 2009/0238879 (каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки) и патентах США №№ 7,846,466; 7,427,602; 7,029,697; 6,890,556; 6,797,738; и 6,281,256 (каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки) указана конкретная информация, модификации и вариации, которые находят применение в различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе.

Все публикации и патенты, упомянутые в настоящей заявке и/или перечисленные ниже, полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предоставлены для дополнительной иллюстрации преимуществ и элементов изобретения, но не предназначены для ограничения объема настоящего описания.

Материалы и способы

Получение химерных мышей

Мышей B6.SJL-Ptprc^aPep3^b/BoyJ (CD45.1) возрастом шесть - восемь недель облучали однократно дозой 950 рад. Через двенадцать часов мышам вводили 10⁷ клеток костного мозга от доноров C57BL/6-7.2fms-EGFP. Мышам давали сульфаметоксазол (Sigma Aldrich) и триметоприм (Sigma Aldrich) с питьевой водой в течение 10 суток после облучения. Мышей заражали WNV через шесть недель после облучения, как описано выше. Химеризм контролировали с помощью проточной цитометрии, и он неизменно составлял 96-99% клеток донорского происхождения, как было показано ранее (Getts et al., J Neurochem. 103: 1019, 2007).

Иммуногистология

Мышам проводили анестезию и перфузировали 50 мл стерильного PBS. За исключением сердца, которое обрабатывали с заключением в парафиновые блоки (Getts et al., J. Neurochem 103: 10919-1030, 2007), все органы выделяли и замораживали небольшими фрагментами в среде Optimum Cutting Temperature Compound (OCT; Tissue-Tek, г. Токио, Япония). Срезы ткани толщиной восемь мкм нарезали с помощью криостатического микротома, высушивали на воздухе в течение ночи и хранили при ­80 °С до использования. Замороженные срезы оттаивали и проводили гистологическое (стандартное окрашивание гематоксилином и эозином) или иммуногистохимическое исследование (Getts et al., J. Exp Med 205: 2319-2337, 2008). Антитела к MARCO, SIGN-R1 и SIGLEC-1 (R&D Systems, штат Миннесота США), CD68 (Abcam, штат Массачусетс, США) и Ki67 (Abcam) использовали в соответствии с указаниями. Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX-51 с камерой DP-70 и программного обеспечения DP manager 2.2.1 (Olympus, г. Токио, Япония).

Микроскопия и регистрация изображений

Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX-51 (Olympus, Япония) с камерой DP-70 и программного обеспечения DP manager 2.2.1 (Olympus).

Выделение лейкоцитов из головного мозга и печени

Как описано ранее (Getts et al, J Exp Med. 29: 2319, 2007), лейкоциты получали из головного мозга перфузируемых с помощью PBS мышей путем расщепления мозговой ткани в течение 60 минут при 37 °C в PBS дезоксирибонуклеазой (0,005 г/мл; Sigma Aldrich) и коллагеназой IV (0,05 г/мл; Sigma Aldrich). Расщепление останавливали при помощи 10% FCS и гомогенат пропускали через нейлоновое сито с ячейками 70 мкм (Becton Dickinson, штат Нью-Джерси, США). Осадок, полученный после центрифугирования в течение 10 мин при 340 x g, повторно суспендировали в 30% Percoll (Amersham, Норвегия) и покрывали слоем 80% Percoll. Лейкоциты собирали с поверхности раздела 30%/80% раствора после центрифугирования при 1140 x g в течение 25 минут при комнатной температуре. Тот же протокол использовали для получения лейкоцитов из печени со взвешиванием ткани перед обработкой.

Выделение лейкоцитов из селезенки, крови и костного мозга

Для анализа путем проточной цитометрии правое бедро рассекали и клетки костного мозга вымывали с помощью шприцев с PBS. Для выделения костномозговых предшественников использовали бедренные и большеберцовые кости по меньшей мере 4 мышей. Клеточную суспензию, полученную после промывки, фильтровали через клеточное сито 70 мкм и центрифугировали в течение 5 мин при 340 g. Эритроциты в полученном осадке лизировали лизирующим буфером для эритроцитов на основе NH₄Cl (BD Pharm Lyse™; BD Pharmingen), после чего центрифугировали в течение 5 мин при 340 x g. В случае периферической крови ее собирали через прокол сердца и немедленно переносили в цитратный буфер (mMol, Sigma Alrich). Полученную суспензию расслаивали на 70% Percoll и центрифугировали при 1140 x g в течение 20 минут при комнатной температуре при отключенном тормозе. Поверхность раздела отбирали и клетки промывали однократно в PBS, центрифугировали при 340 x g. Для выделения лейкоцитов селезенки ее пропускали через клеточное сито 7070 мкм и центрифугировали в течение 5 мин при 340 g. Эритроциты в полученном осадке лизировали лизирующим буфером для эритроцитов на основе NH₄Cl (BD Pharm Lyse™; BD Pharmingen), после чего центрифугировали в течение 5 мин при 340 x g.

Проточная цитометрия

Клетки, собранные (как описано выше) из головного мозга, печени, крови и костного мозга, промывали в PBS и блокировали антителами к CD16/CD32 (Biolegend). Жизнеспособные клетки подсчитывали способом вытеснения трипанового синего, который, как правило, показывал жизнеспособность > 95% клеток.

Измеряли экспрессию молекул на поверхности клеток и проводили сортировку на приборе FACS ARIA (Becton Dickinson), оснащенном аргоновым ионным и HeNe-лазером. Жизнеспособные популяции выделяли с помощью прямого и бокового светорассеяния с последующей оценкой степени их флуоресценции посредством прямого выделения. Сортировку проводили с использованием специальных параметров флуоресценции и рассеяния, идентифицирующих интересующую популяцию. Строгость сортировки была установлена на требуемую чистоту > 98% для популяций клеток костного мозга.

Полученные FACS файлы с данными анализировали с помощью программы для анализа результатов проточной цитометрии Flow Jo (FlowJo, Ashland, штат Орегон, США). Количества интересующих клеточных популяций рассчитывали на основании процентных показателей, полученных при анализе данных проточной цитометрии, а также абсолютных подсчетов клеток из каждого органа.

Адоптивный перенос

При разработке вариантов осуществления настоящего изобретения проводили эксперименты для исследования второй модели активного заболевания, называемой адоптивным переносом. Вместо иммунизации животных пептидом лимфоциты из селезенки мышей с активным заболеванием переносили реципиенту, у которого вследствие этого развивалось заболевание. При разработке вариантов осуществления настоящего изобретения проводили эксперименты, чтобы охарактеризовать способность PLG-наночастиц деактивировать адоптивно перенесенные активированные эффекторные клетки. У мышей, получавших частицы или спленоциты, связанные с контрольным пептидом, наблюдалось увеличение балла клинической оценки, начиная с 4-х суток. Мыши, получавшие частицы PLG-PLP_139-151 на 2-е сутки, имели средний балл клинической оценки 0 во всех временных точках вплоть до 40­х суток, кроме двух, а средний балл клинической оценки в этих других временных точках составлял 0,25.

Мультиплексный ИФА

Мультиплексный планшетный твердофазный ИФА-анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Quansys Biosciences, г. Логан, штат Юта, США). Вкратце, ткань головного мозга, селезенки и печени гомогенизировали в PBS, очищали центрифугированием при 1000 x g и хранили при -20 °C до выполнения анализа. Также использовали образцы сыворотки. Оттаявшие образцы и стандарты разбавляли предоставленным буфером и по 30 мкл каждого образца наносили в каждую лунку, содержащую 16 пятен, каждое из которых содержало захватное антитело для определенного растворимого белка. Затем планшеты инкубировали в течение 1 часа на орбитальном шейкере при 120 об/мин. Планшеты промывали 3 раза, в каждую лунку добавляли по 30 мкл антител для отслеживания и инкубировали в течение еще одного часа. После 3 промывок добавляли стрептавидин-HRP и инкубировали в течение дополнительных 15 минут. Затем планшеты промывали 6 раз и добавляли субстратную смесь. Планшеты немедленно сканировали на сканере CCD (Kodak, г. Рочестер, штат Нью-Йорк, США). Изображения с планшета анализировали с использованием программного обеспечения Quansys Q-view (Quansys Biosciences).

Индукция и оценка экспериментального аутоиммунного энцефалита (EAE)

Мышам подкожно вводили эмульсию, содержащую 0,1 мг пептида MOG (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 1); Auspep, г. Парквилл, Виктория, Австралия; > 95%, очищение методом ВЭЖХ) и полный адъювант Фрейнда, содержащий 2 мг/мл Mycobacterium tuberculosis (Sigma Aldrich). Через двое суток мышам вводили 500 мкл коклюшного токсина (Sigma Aldrich) внутрибрюшинно. У мышей отслеживали прогрессирование заболевания и оценивали его по следующей шкале: 1, потеря тонуса хвоста и/или слабость 1 задней лапы; 2, слабость более чем одной задней лапы, нарушение походки; 3, паралич 1 конечности; 4, паралич более чем одной конечности, недержание; 5, агония.

Статистические данные

Строили графики и проводили компьютерный статистический анализ в программах GraphPad Prism и InStat соответственно (обе программы производства GraphPad, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США). В зависимости от данных проводили непарный двусторонний т-тест Стьюдента или однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестом Тьюки - Крамера, значение P < 0,05 считали достоверным.

Для анализа корреляции между такими параметрами, как потеря веса, инфильтрация и титр вируса, использовали нелинейную регрессию (аппроксимацию кривой) полиномиальной функцией второго порядка (Y = A + B*X + C*X^2).

Пример 1

Получение отрицательно заряженных иммуномодифицирующих частиц (IMP)

К раствору поли(этилен-малеинового ангидрида) (PEMA) в D₂O (4 мл, 1% вес./об.) добавляли по каплям раствор сополимера лактида и гликолевой кислоты (PLG) в дихлорметане (ДХМ) (2 мл, 20% вес./об.). Смесь обрабатывали ультразвуком на льду при 16 Вт в течение 30 с с использованием ультразвукового процессора VC 30. Полученный сырой гомогенат затем выливали в раствор D₂O (200 мл, содержащий 0,5% вес./об. PEMA). Гомогенизированной суспензии позволяли перемешиваться в течение ночи с установкой режима скорости 3.5 с использованием магнитной мешалки Bellco Glass, Inc., Bellstir Multi-stir 9 (10 Вт в течение 10 с, 16 Вт в течение 10 с, 16 Вт в течение 30 с).

Результаты

После трех часов перемешивания проводили анализы размера частиц с использованием динамического светорассеяния в одноразовых кюветах из полистирола:

a. 10 Вт, 10 с - Z-средний = 499,9 нм - PdI = 0,23, пик = 634,5 нм;

b. 16 Вт, 10 с - Z-средний = 528,9 нм - PdI = 0,227, пик = 657,5 нм;

c. 16 Вт, 30 с - Z-средний = 471,6 нм - PdI = 0,228, пик = 580,5 нм;

d. 16 Вт, 60 с - Z-средний = 491,1 нм - PdI = 0,275, пик = 600,8 нм.

После завершения реакции полученную сырую суспензию очищали.

Очистка

Свежие D₂O и 10 x буферный раствор бикарбоната натрия охлаждали в течение ночи до 4 °C. Используя клеточный фильтр с величиной пор 40 мкм, 36 мл суспензии частиц отфильтровывали из каждой партии в соответственно меченную центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 4 мл охлажденного 10 x буферного раствора бикарбоната натрия. Из каждого лабораторного стакана получали приблизительно 6 таких пробирок. Все пробирки центрифугировали в течение около 15 минут при 7 000 g и 4 °C и аспирировали супернатант. Получение суспензии повторяли с использованием упомянутой выше процедуры, при этом максимально возможное количество осажденных частиц суспендировали в 1 мл охлажденной D₂O.

Повторно суспендированные частицы переносили в новую пробирку, содержащую 4 мл охлажденного 10 x буферного раствора бикарбоната натрия. (Этап 1)

Повторное суспендирование частиц повторяли до успешного повторного суспендирования всех осажденных частиц. (Этап 2)

Затем содержимое 6 центрифужных пробирок объединяли в одну центрифужную пробирку (пробирка объемом 50 мл) и эту пробирку заполняли оставшимся объемом 40 мл охлажденной D₂O. (Промывка 1)

Пробирку центрифугировали в течение 20 минут при 7 000 g и 4 ˚C и аспирировали супернатант.

Этапы 1 и 2 и промывку 1 полученных частиц каждый раз повторяли по меньшей мере еще два раза. Наконец, полученные осажденные частицы затем подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте и лиофилизировали досуха в коллекторе с получением отрицательно заряженных IMP.

На Фиг. 1 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида посредством анализа динамического светорассеяния. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 2,5 x 10⁵ импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела Z-средний диаметр 567 нм, максимальный диаметр 670 нм и коэффициент полидисперсности 0,209.

В таблице 4 приведены результаты измерений для поверхностно-функционализированных частиц PLG-PEMA. Данные в таблице являются типичными, поскольку каждая партия несколько отличается от других. Однако числовые данные в таблице основаны на комбинировании нескольких партий частиц. Измерения, выполняемые для частиц двойной эмульсии, аналогичны приведенным в таблице 2.

Таблица 4. Параметры поверхностно-функционализированных частиц PLG-PEMA

Пример 2

Введение связанных с антигеном PLGA-гранул предотвращает рецидив экспериментального аутоиммунного энцефалита

PLG-наночастицы исследовали с использованием иммунодоминантного эпитопа протеолипидного белка PLP_139-151 (PLG-PLP_139-151), который применяли для индукции толерантности для предотвращения рецидива экспериментального аутоиммунного энцефалита (R-EAE). Мышей R-EAE готовили, как описано выше.

Пептиды, вводимые животным, были соединены с частицами со средним диаметром 500 нм. Мыши получали PLP_139-151-PLGA (N = 5), или OVA_323-339-PLGA (N = 5), или неконъюгированные PLGA (N = 5) на -7-е сутки относительно времени иммунизации (0-е сутки). Пик заболевания, как правило, наблюдали приблизительно на 12-14-е сутки и у мышей проводили балльную оценку клинической картины заболевания. Частицы без пептида или частицы, модифицированные контрольным пептидом OVA_323-339, не предотвращали индукцию заболевания. Однако PLGA-частицы, модифицированные PLP_139-151, давали 0 баллов клинической оценки (отсутствие заболевания) во всех случаях, за исключением низких баллов клинической оценки менее 1, наблюдавшихся в период между 20-ми и 30-ми сутками (Фиг. 2). Предшествующие исследования с немодифицированными PLG-частицами или с использованием частиц полистирола не приводили к такому эффективному ослаблению заболевания, причем частицы полистирола обычно вызывали анафилактическую реакцию.

Кроме того, специфическая инактивация миелин-специфических Т-клеток CD4⁺ отражалась в отсутствии реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) в ответ на оба иммунизирующих эпитопа PLP_139-151. Таким образом, профилактическое лечение PLG-PLP_139-151 на -7-е сутки специфически предотвращало развитие EAE, что указывает на повышение способности частиц предотвращать заболевание. Балльная оценка, полученная при использовании частиц, была такой же хорошей или даже лучше оценки, полученной с использованием связанных с антигеном спленоцитов.

Тип вводимой частицы также влиял на развитие EAE в мышиной модели. Мыши получали OVA_323-339-PLS (N = 5), OVA_323-339-PLGA_PHOSPOREX (N = 5), OVA_323-339-PLGA_PEMA (N = 5), PLP_139-151-PLA (N = 5), PLP_139-151-PLGA_PHOSPOREX (N = 5) или PLP_139-151-PLG_PEMA (N = 5) на -7-е сутки относительно времени иммунизации (0-е сутки). Пик заболевания, как правило, наблюдали приблизительно на 12-14-е сутки и у мышей проводили балльную оценку клинической картины заболевания. Частицы любой композиции, модифицированные контрольным пептидом OVA_323-339, не предотвращали индукцию заболевания. Однако связанные с PLP_139-151 PLG-гранулы более эффективно снижали индукцию R-EAE, чем связанные с PLP_139-151 коммерческие PLG-частицы (Phosphorex) или частицы полистирола (Фиг. 3A и 3B).

Пример 3

Внутривенная инфузия связанных с антигеном PLG-частиц не вызывала падения температуры, вызванного анафилактической реакцией, у животных, предварительно сенситизированных OVA/Alum

Из-за наличия активного заболевания анафилактическая реакция на антигены является проблемой, которая может привести к немедленной гибели, и это было описано применительно к частицам, связанным с полистиролом. Анафилактическая реакция связана с существенным падением температуры тела. Чтобы проверить, вызовет ли внутривенное введение OVA-PLG падение температуры, вызванное анафилактической реакцией, у сенсибилизированных животных, мышей иммунизировали на 0-е сутки путем внутрибрюшинной инъекции 10 мкг OVA/Alum. На 14-е сутки мышей снова иммунизировали путем внутрибрюшинного введения 10 мкг OVA/Alum и затем вызывали толерантность при помощи внутривенного введения OVA-PLG на 21-е сутки. На 28-е сутки у мышей вызывали толерантность путем внутривенного введения либо частиц OVA-PLG, либо OVA.

Как показано на Фиг. 4, у мышей, получавших растворимый OVA, на 28-е сутки наблюдалось снижение температуры по сравнению с животными, получавшими частицы OVA-PLG. В течение 1 часа после введения частиц не наблюдалось никакого снижения температуры тела.

На Фиг. 5 показано, что введение частиц PLP-PLG в ходе ремиссии не вызывает смертности, ассоциированной с анафилактической реакцией. EAE индуцировали у самок мышей линии SJL/J возрастом шесть - восемь недель путем подкожной инъекции PLP_139-151 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) и отслеживали и регистрировали развитие клинических признаков заболевания (Фиг. 5B). На 21-е сутки после индукции заболевания мышам делали внутривенные инъекции растворимого PLP_139-151 (белые квадраты), растворимого OVA_323-339 (белые круги) или тех же самых пептидов, связанных с PLG-наночастицами (заштрихованы). Температуру животных контролировали и регистрировали каждые 10 минут в течение 1 часа после инъекции (Фиг. 5A).

Пример 4

Профилактическое лечение введением частиц PLP-PLG вызывало длительную антиген-специфическую толерантность

Оптимальную дозировку определяли путем внутривенного введения увеличивающихся концентраций PLP_139-151-PLG за семь суток до индукции заболевания и отслеживали развитие клинической картины в сравнении с мышами SJL/J, получавшими OVA_323-339-PLG (Фиг. 6A). Самкам мышей SJL/J в возрасте шести - восьми недель внутривенно вводили PLG-наночастицы, связанные либо с PLP_139-151 (квадраты), либо с OVA_323-339 (круги). EAE индуцировали путем подкожной инъекции PLP_139-151 в CFA через 7 суток (Фиг. 6B), 25 суток (Фиг. 6C) или 50 суток (Фиг. 6D). У животных из панели B отслеживали клинические признаки заболевания в течение 100 суток. На Фиг. 6E показано, что на 8-е сутки после индукции заболевания у субпопуляции мышей с панели В проводили реакцию гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Избранным типичным животным из панели B, праймированным при помощи PLP_139-151/CFA (OVA_323-339-PLG и PLP_139-151-PLG), наносили на ухо в качестве раздражителя праймирующий эпитоп PLP_139-151 и контрольный пептид OVA_323-339. Через 24 ч определяли набухание уха в качестве показателя DTH, с вычитанием ответов, наблюдавшихся перед раздражением. На Фиг. 6F показано, что самкам мышей SJL/J в возрасте шести - восьми недель вводили внутривенно PLG-наночастицы, связанные с PLP_178-191 (треугольник), OVA_323-339 (круг) или PLP_139-151 (квадрат) или только несвязанные частицы (пустой круг) (F). EAE индуцировали через 7 суток после этого путем внутривенного введения PLP_178-191 в CFA и отслеживали признаки заболевания в показанных временных точках.

Пример 5

Лечение рецидива экспериментального аутоиммунного энцефалита связанными с антигеном частицами

При разработке вариантов осуществления настоящего изобретения проводили эксперименты для исследования способности частиц PLG-PLP_139-151 лечить, а не предотвращать заболевание, а также для определения того, влияет ли способ введения на развитие заболевания. Мышей иммунизировали в 0-е сутки, используя PLP_139-151 и адъювант. Обычно максимальный балл клинической оценки у мышей отмечался на 12-14-е сутки. В этой модели мыши получали на 10-е сутки частицы PLG-PLP_139-151 или контрольные частицы PLG-OVA_323-339, вводимые внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или перорально. Как показано на Фиг. 7, профилактическая толерантность была наиболее эффективна при внутривенном или внутрибрюшинном введении частиц PLG-PLP_139-151. У животных, получавших PLP_139-151-PLG внутривенно, заболевание не развивалось, и в большинстве временных точек средний балл клинической оценки был равен 0. Эти животные отличались от животных, получавших частицы полистирола с PLP_139-151, среди которых наблюдалась гибель от анафилактической реакции у > 70% животных.

Пример 6

Толерантность, вызванная связанными с антигеном частицами, ингибирует индукцию антиген-специфических ответов клеток Th1 и Th17 при активном рецидиве экспериментального аутоиммунного энцефалита

Чтобы определить, ингибирует ли введение связанных с антигеном частиц индукцию хелперных Т-клеток, мышам BALB/c на -7-е сутки вводили внутривенно MOG_35-55-PLG или OVA_323-339-PLG. На 0-е сутки мышам подкожно вводили частицы OVA_323-339-PLG и полный адъювант Фрейнда (CFA). На 10-е сутки животных повторно стимулировали либо частицами MOG_35-55-PLG, либо частицами OVA_323-339-PLG и выделяли клетки дренирующих лимфоузлов. На 10-е сутки измеряли CPM и уровни IL-17, GM-CSF, IFN-γ, IL-10 и IL-4. Как показано на Фиг. 8, введение частиц OVA_323-339-PLG ингибировало у получавших лечение животных ответы Th1 и Th17.

Пример 7

Толерантность индуцировали PLGA-частицами, связанными с PLP-_139-151

Дополнительную терапевтическую стратегию толерантности осуществляли путем введения мышам PLP_139-151-PLG или OVA_323-339-PLG. Гистологический анализ показал, что введение частиц PLP_139-151-PLG ингибирует воспаление и демиелинизацию шейного отдела спинного мозга. Мышам вводили PLP-PLG или OVA_323-339-PLG и ткань отбирали на 40-е сутки. Выделяли шейный отдел спинного мозга и делали срезы для исследования иммунного ответа в ЦНС, который лежит в основе патологии R-EAE и рассеянного склероза. На Фиг. 9 показано снижение инфильтрации иммунных клеток в спинной мозг у животных, получавших PLP_139-151-PLG, которая была более сходна с нормальной тканью, чем с тканью животных, получавших OVA_323-339-PLG. У животных, получавших OVA_323-339-PLG, наблюдалось положительное окрашивание на CD45, CD4 и CD11b; тогда как у животных, получавших PLP_139-151-PLG, окрашивание на эти факторы было минимальным.

Введение частиц PLP_139-151-PLG также уменьшает нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и активацию макрофагов в спинном мозге получавших лечение мышей. Животные получали полный адъювант Фрейнда (CFA), частицы OVA_323-339-PLG или частицы PLP_139-151-PLG. Определяли баллы клинической оценки и процентную долю возникновения EAE (Фиг. 10B), а спинной мозг контролировали посредством метода визуализации in vivo (Фиг. 10A и 11). Система Angiosense измеряет сосудистую утечку в ЦНС, а система Prosense измеряет активированные макрофаги (активация катепсина приводит к расщеплению репортера, дающего флуоресцентный сигнал). На гистограммах силе сигналов, наблюдаемых на изображениях головного и спинного мозга, присвоены числовые значения.

Толерантность также можно индуцировать частицами с инкапсулированным антигеном. На Фиг. 12 показано, что введение PLG-частиц с инкапсулированным в них пептидом PLP_139-151 ингибировало индукцию R-EAE у мышей. Возможность инкапсуляции аутоантигенов предусматривает использование сложных смесей белков или даже гомогенатов органов и позволяет обеспечить большее покрытие антигеном и, таким образом, более эффективное распределение эпитопов.

Пример 8

Толерантность, индуцированная PLGA-частицами, связанными с PLP-_139-151, частично зависит от экспансии/активации регуляторных Т-клеток

Мышам SJL/J на -9-е сутки вводили антитела к CD25, обычный маркер регуляторных T-клеток (Treg), а затем на -7-е сутки вводили либо частицы OVA_323-339-PLG и антитело к CD25, либо частицы OVA_323-339-PLG и контрольное антитело IgG, частицы PLP_139-151-PLG и антитело к CD25, или частицы PLP_139-151-PLG и контрольное антитело IgG. Как показано на Фиг. 13, животные, получавшие частицы PLP_139-151-PLG и антитело к CD25, демонстрировали временами больший средний балл клинической оценки, чем животные, получавшие частицы PLP_139-151-PLG и контрольное антитело IgG. Это подтверждает, что клетки Treg, или по меньшей мере Т-клетки, экспрессирующие CD25, участвуют в индукции толерантности.

Пример 9

Терапевтическая толерантность индуцируется частицами PLP_139-151-PLG, при активном и адоптивном EAE

Сравнивали терапевтическую толерантность, индуцированную частицами PLP_139-151-PLG, при активном и адоптивном EAE. Адоптивный EAE индуцировали у самок мышей SJL/J возрастом шесть - восемь недель путем адоптивного переноса 2,5 x 10⁶ бластных клеток, активированных при помощи PLP_139-151. Мыши получали внутривенно пептид PLP_139-151 (квадраты) или OVA_323-339 (круги), связанный с PLG-наночастицами размером 500 нм, через 2 суток (Фиг. 14A), 14 суток (Фиг. 14C), 18 суток (Фиг. 14E) или 21 сутки (Фиг. 14F) после индукции заболевания. Балльную клиническую оценку заболевания определяли в сравнении с оценкой после обработки спленоцитами, связанными с антигеном (Фиг. 14A). У мышей с толерантностью, вызванной PLP_139-151 или OVA_323-339, на 42-е сутки отбирали головной и спинной мозг для гистологического анализа. Срезы, взятые у мышей из панели A, окрашивали на белок PLP и на CD45 (Фиг. 14B). Срезы спинного мозга, взятые у мышей из панели C, окрашивали красителем Luxol Fast Blue (Фиг. 14D). Зоны демиелинизации и инфильтрации клеток показаны стрелками. Результаты показывают, что толерантность индуцируется частицами PLP_139-151-PLG у мышей с адоптивным EAE.

На Фиг. 15 представлены графики, показывающие средние баллы клинической оценки у мышей с активным EAE и адоптивным EAE после лечения спленоцитами (SP) или PLG-частицами, конъюгированными с OVA_323-339 или PLP_139-151. Мыши получали внутривенно PLP_139-151-SP, PLP_139-151-PLG, или OVA_323-339-SP, или OVA_323-339-PLG, причем пептид был связан с наночастицами размером 500 нм, через 10 суток (Фиг. 15A) или через 2 суток (Фиг. 15B) после индукции заболевания, и определяли средний балл клинической оценки. В обоих случаях частицы PLP_139-151-PLG ослабляли заболевание, что указывает на индукцию толерантности.

Инфильтрация клеток в центральную нервную систему также существенно снижалась у мышей с толерантностью, вызванной PLP-PLG. SJL/J-мышам внутривенно вводили PLG-наночастицы размером 500 нм, связанные с PLP_139-151 (квадраты) или OVA_323-339 (круги), через 2 суток после индукции EAE методом адоптивного переноса. На пике заболевания (14-е сутки) забирали головной и спинной мозг и методом проточной цитометрии определяли количество лимфоцитов (Фиг. 16B), антигенпредставляющих клеток (АПК) (Фиг. 16C), микроглии (Фиг. 16D), периферических дендритных клеток (Фиг. 16E), миелоидных дендритных клеток (Фиг. 16F) и макрофагов (Фиг. 16G). Стратегия дискриминации этих популяций показана на Фиг. 16A. Препараты клеток ЦНС стимулировали PMA и иономицином за 5 ч перед внутриклеточным окрашиванием на IL-17A и IFN-γ (Фиг. 16H).

Пример 10

Введение моноклонального антитела к PD-1 нарушает индукцию толерантности PLG-наночастицами, инкапсулирующими PLP_139-151, при EAE с адоптивным переносом

Чтобы проверить влияние введения антитела к PD-1 на индуцированную PLP_139-151 толерантность у мышей с адоптивным EAE, на 0-е сутки мышам посредством внутривенного введения вводили 3 x 10⁶ активированных PLP_139-151 T-клеточных бластов. На 2-е сутки они получали внутривенно PLP_139-151 или OVA_323-339, инкапсулированный в PLG-частицы либо с PBS, либо с антителом к PD-1. На 4, 6, 8, 10 и 12-е сутки все животные получали либо 250 мкг антитела к PD-1, либо PBS.

Как показано на Фиг. 17, введение пептида PLP_139-151, инкапсулированного в PLG-частицу, индуцировало толерантность при введении частицы с PBS. Однако введение антитела к PD-1 уменьшает эту толерантность.

Пример 11

Введение агонистического моноклонального антитела к CD40 нарушает индукцию толерантности PLG-наночастицами, инкапсулирующими PLP_139-151, при EAE с адоптивным переносом, зависимым от IL-12 способом

Чтобы проверить влияние введения агонистического антитела к CD40 на индуцированную PLP_139-151 толерантность у мышей с адоптивным EAE, на 0-е сутки мышам посредством внутривенного введения вводили 3 x 10⁶ активированных PLP_139-151 T-клеточных бластов. На 2-е сутки мыши посредством внутривенного введения получали пептид PLP_139-151 или OVA_323-339, инкапсулированный в PLG-частицы. На 3-и сутки животные получали контрольное антитело IgG2a, антитело к CD40 или антитело к CD40 и антитело к IL-12.

На Фиг. 18 показано, что введение пептида PLP_139-151, инкапсулированного в PLG-частицу, индуцирует толерантность при введении частицы с PBS. Введение агонистического антитела к CD40 уменьшало эту толерантность, но уменьшение толерантности обращалось при добавлении антитела к IL-12.

Пример 12

Пептид OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, при профилактическом введении ингибирует аллергическое воспаление дыхательных путей и OVA-специфические Th2-ответы in vivo

Для оценки профилактического эффекта OVA, инкапсулированного в PLG-частицы, на воспаление дыхательных путей мышам внутривенно вводили OVA-PLG на -7-е сутки. На 0-е сутки мыши получали внутрибрюшинные инъекции OVA/Alum в дозе 10 мкг/мышь. На 7-е сутки мышам снова внутривенно вводили OVA-PLG, а на 14­е сутки вводили еще одну внебрюшинную инъекцию 10 мкг/мышь OVA/Alum. В период с 28-х по 30-е сутки мышам трижды вводили аэрозольный OVA.

Как показано на Фиг. 19, профилактическое введение OVA-PLG уменьшало секрецию IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 и снижало уровни сывороточного OVA IgE и эозинофилов в легком.

Пептид OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, при профилактическом введении ингибирует OVA-специфический вторичный иммунный ответ in vitro в медиастинальных лимфоузлах. Как показано на Фиг. 20А, пролиферация в лимфоузлах, наблюдавшаяся после повторной стимуляции 25 мкг OVA, снижается у животных, получавших OVA-PLG. Более того, введение OVA-PLG снижает выброс цитокинов после повторной стимуляции OVA. На Фиг. 20B показано, что уровни IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 снижаются у мышей, получавших OVA-PLG.

Пример 13

Пептид OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, при терапевтическом введении ингибирует аллергическое воспаление дыхательных путей и OVA-специфические Th2-ответы in vivo

Для оценки терапевтического эффекта OVA, инкапсулированного в PLG-частицы, на воспаление дыхательных путей мышам внутрибрюшинно вводили OVA/Alum в дозе 10 мкг/мышь на 0-е сутки и на 14-е сутки. Мышам внутривенно вводили OVA-PLG на 28-е и 42-е сутки. В период с 56-х по 58-е сутки мышам трижды вводили аэрозольный OVA.

Как показано на Фиг. 21, терапевтическое введение OVA-PLG уменьшало секрецию IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10 и снижало уровни сывороточного OVA IgE и эозинофилов в легком.

На Фиг. 22 показано, что пептид OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, при терапевтическом введении снижает уровень OVA-специфических Th2-цитокинов в BAL лучше, чем PLG-частицы, связанные с OVA. Животные получали лечение, как описано выше, за исключением того, что на 28-е и 42-е сутки мышам вводили либо OVA, инкапсулированный в PLG-частицы, либо OVA, связанный с PLG-частицами. Неожиданно было обнаружено, что инкапсулированный пептид OVA ингибировал секрецию цитокинов Th2 больше, чем пептид OVA, связанный с поверхностью PLG-частицы.

Пример 14

Толерантность, индуцированная PLG-частицами с пептидом p31 хромогранина A, ингибирует диабет I типа

Диабет I типа индуцировали у мышей BDC2.5, выделяя клетки из селезенки, подмышечных, плечевых, паховых и панкреатических лимфоузлов у мышей возрастом 3 недели. Выделенные клетки культивировали и активировали in vitro путем инкубации 2 x 10⁶ клеток/мл с 0,5 мкM пептида p31 в течение 96 часов. 5 x 10⁶ клеток трансфицировали путем внутривенного введения мышам NOD.SCID (6-8 недель) в момент времени 0. Толерантность у мышей индуцировали путем внутривенного введения пептида p31 или MOG_35-55, связанного с SP или PLG, по истечении периода времени от 2 часов до 3 суток.

На Фиг. 23A и 23B показаны уровни глюкозы в крови животных после лечения. Введение частиц PLG, связанных с пептидом p31, приводило к снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с уровнем, наблюдавшимся при введении частиц, связанных с пептидом MOG_35-55. На Фиг. 23С показано, что наблюдавшаяся у животных процентная доля клеток, секретирующих IFNγ, также снижалась у мышей, получавших p31-PLG, по сравнению с мышами, получавшими частицы MOG_35-55-PLG.

Для индуцируемой p31-PLG толерантности необходимы клетки Treg. Диабет I типа индуцировали у мышей, как описано выше, а через 2 часа после переноса активированных клеток мышам NOD.SCID у мышей вызывали толерантность либо частицами p31-PLG, либо частицами MOG_35-55-PLG. Как показано на Фиг. 24, уменьшение численности клеток Treg нарушало толерантность, вызванную введением частиц p31-PLG.

Пример 15

Толерантность, вызванная PLG-частицами, связанными с инсулином, ингибирует развитие спонтанного диабета I типа у мышей NOD

NOD-мышам в возрасте 6, 8 и 10 недель посредством внутривенного введения вводили PLG-частицы, связанные либо с BSA (N = 22), либо с инсулином (N = 23). Затем у мышей оценивали развитие диабета, который определяли как уровень глюкозы в крови > 250 мг/дл. Как показано на Фиг. 25, введение связанных с инсулином PLG-частиц существенно увеличивало долю мышей, у которых диабет не развивался в течение более чем 300 суток (69,6% по сравнению с 22,7%; p = 0,0027).

Пример 16

Кинетика приживления

У самок мышей CD45.2 индуцировали толерантность, используя либо OVA-PLG, либо контрольный пептид Dby-PLG (основной антиген H-Y, экспрессирующийся у самцов мышей C57BL/6) на -7-е сутки. На -1-е сутки мыши получали дозу облучения 200 рад, а затем им трансплантировали 1 x 10⁶, 5 x 10⁶ или 1 x 10⁷ клеток костного мозга самцов мышей CD45.1 на 0-е сутки. Толерантность у мышей-реципиентов вызывали при помощи OVA-PLG, Dby-SP или Dby-PLG на 1-е сутки и отбирали кровь для анализа химеризма методом FACS. На Фиг. 26 показана процентная доля донорских клеток CD45.1, наблюдавшаяся у мыши-реципиента.

На Фиг. 27 показана процентная доля донорских клеток CD45.1 у мышей-реципиентов после вызова толерантности при помощи OVA-PLG, Dby-SP или Dby-PLG на 1-е сутки. У одной мыши из группы положительного контроля не наблюдали значимого приживления (~ 10%). Ни у одной мыши отрицательного контроля не наблюдали приживленных донорских клеток. У одной мыши из группы Dby-SP не наблюдали значимого приживления (~ 10%). У двух мышей OVA-PLG донорские клетки прижились (~ 10%): у одной произошло полное отторжение к 16-й неделе. У одной мыши Dby-PLG отторжение началось на 12-й неделе и к 16-й неделе дошло до 10%. У группы Dby-PLG приживление находилось в диапазоне 10-56% к 16-й неделе. У мышей OVA-PLG наблюдали: 1) спонтанное приживление, 2) гомологию последовательности между OVA323 и Dby, или 3) толерогенные свойства частиц. Частицы Dby-PLG обеспечивали большее приживление, чем Dby-SP и OVA-PLG.

На Фиг. 28 показано, что время вызова толерантности влияет на процентную долю клеток CD45.1 у мыши-реципиента. В группе положительного контроля наблюдали меньшее приживление (~ 4%), чем ожидалось (~ 10%). Одна мышь из группы отрицательного контроля имела 5% приживление. Из всех 3 групп OVA-PLG приживление демонстрировала одна мышь в группе -7-е сутки, +1-е сутки (12%). Толерантность на 1-е сутки имеет большую клиническую значимость, чем толерантность на -7-е сутки.

Пример 17

Окрашенные кумарином-6 PLGA-частицы не отслеживаются через 24 часа после введения

Мышам вводили окрашенные кумарином-6 PLGA-частицы, которые имели или не имели связанного антигена. Как показано на Фиг. 29, частицы отслеживали через 3 часа после введения, но не через 24 часа после введения. Срезы селезенки (левый столбец), печени (средний столбец) и легкого (правый столбец) от интактных мышей без инъекций (верхний ряд) и от мышей, получавших внутривенно флуоресцентные микрочастицы PLGA/PEMA, взятые через 3 ч после инъекции (средний ряд) и через 24 ч после инъекции (нижний ряд), с контрастным окрашиванием DAPI.

Пример 18

Наночастицы ассоциируются in vivo с макрофагами

Анализ печени через 6 часов и 15 часов после введения показывает, что PLGA-частицы колокализованы с клетками F4/80⁺ в печени (Фиг. 30).

Макрофаги краевой зоны преимущественно захватывают меченные TAMRA частицы, связанные с PLP_139-151, через 24 часа после внутривенной инфузии. Как показано на Фиг. 31, наибольшая процентная доля клеток PLP_139-151⁺ представляет собой макрофаги краевой зоны.

Пример 19

Ингибирование R-EAE у мышей SJL/J с использованием поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый PLP139-151

Группам мышей SJL/J вводили внутривенно 2,5 мг поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида размером 500-700 нм, содержащих в ядрах растворимый пептид PLP139-151, на -7-е сутки и ­1­е сутки относительно праймирования при помощи PLP139-151/CFA на 0-е сутки. Контрольных мышей праймировали на 0-е сутки, но они не получали частицы на ­7­е сутки или -1-е сутки. У мышей отслеживали клинические признаки R-EAE в течение дополнительных 20 суток.

Результаты, представленные на Фиг. 32, показывают зависимость ежедневного среднего балла клинической оценки от количества суток после праймирования PLP139-151/CFA. R-EAE, индуцированный PLP139-151/CFA, ингибируется у мышей SJL/J путем индукции иммунологической толерантности с помощью поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своем ядре растворимый PLP139-151.

Пример 20

Ингибирование аллергического воспаления дыхательных путей при помощи поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих растворимый овальбумин

У мышей индуцировали аллергическое воспаление дыхательных путей (AIA). Группам мышей Balb/c вводили внутривенно 2,5 мг поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида размером 500-700 нм, содержащих в ядрах растворимый овальбумин или растворимый бычий сывороточный альбумин (контроль), на -7-е сутки и +7-е сутки относительно праймирования при помощи овальбумина/alum на 0-е сутки и +14-е сутки. У мышей проводили раздражение аэрозольным овальбумином на +28-30-е сутки. Затем мышей усыпляли и собирали жидкость бронхоальвеолярного лаважа. Также измеряли уровни овальбумин-специфических IgE в сыворотке.

Количество эозинофилов в бронхоальвеолярном лаваже указывает на тяжесть AAI - чем больше количество, тем тяжелее заболевание. Уровни IgE в сыворотке указывают на тяжесть AAI - чем выше уровни, тем тяжелее заболевание.

На Фиг. 33 показано, что мыши, получавшие инкапсулированный OVA-PLG, демонстрировали наибольшее снижение накопления эозинофилов. На Фиг. 34 показано, что мыши, получавшие инкапсулированный OVA-PLG, демонстрировали наибольшее снижение уровня IgE в сыворотке по сравнению с не получавшими лечение или контрольными получавшими лечение животными.

Индуцированное комбинацией овальбумин/alum аллергическое воспаление дыхательных путей у мышей Balb/c ингибировали путем индукции иммунологической толерантности с помощью поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин.

Пример 21

Синтез поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида с инкапсулированным антигеном

В настоящем примере подробно описан состав и частично охарактеризованы биоразлагаемые частицы сополимера лактида и гликолида, которые были поверхностно-функционализированы при помощи высокой плотности карбоксильных групп и которые содержат в своих ядрах растворимый антиген, причем ядра окружены оболочкой из сополимера лактида и гликолида, причем частицы применяют для индукции толерантности при аутоиммунных заболеваниях и для лечения аллергий.

Высокая плотность карбоксильных групп достигалась в результате использования поли(этилен-альт-малеинового ангидрида) (PEMA), полимера с карбоксильными группами, встроенными в основную цепь, в качестве поверхностно-активного вещества для процесса эмульгирования.

Как описано выше, биоразлагаемые частицы сополимера лактида и гликолида, содержащие в своих ядрах растворимый PLP139-151 и поверхностно-функционализированные высокой плотностью карбоксильных групп, эффективно индуцируют иммунологическую толерантность у мышей SJL/J с R-EAE, индуцированным PLP139-151/CFA, мышиной модели рассеянного склероза. Кроме этого, биоразлагаемые частицы сополимера лактида и гликолида, содержащие в своих ядрах растворимый овальбумин и поверхностно-функционализированные высокой плотностью карбоксильных групп, эффективно индуцируют иммунологическую толерантность у мышей Balb/c с AAI, индуцированным сочетанием овальбумин/Alum, мышиной модели аллергической астмы.

Частицы сополимера лактида и гликолида, содержащие в своих ядрах растворимый овальбумин или бычий сывороточный альбумин, поверхностно-функционализированные высокой плотностью карбоксильных групп, синтезировали методом «двойная эмульсия - выпаривание растворителя» следующим образом.

1. 150 мкл раствора 200 мг/мл овальбумина или бычьего сывороточного альбумина в очищенной от эндотоксинов воде добавляли по каплям к 2 мл 20% вес./об. раствора сополимера лактида и гликолида в дихлорметане в сцинтилляционном флаконе объемом 20 мл.

2. Полученную смесь помещали на лед и обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд при мощности 10 Вт с использованием соникатора с зондом.

3. Добавляли 10 мл 1% вес./об. раствора поли(этилен-альт-малеинового ангидрида) в воде.

4. Полученную смесь помещали на лед и обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд при мощности 16 Вт с использованием соникатора с зондом.

5. Полученную эмульсию выливали в 200 мл 0,5% вес./об. раствора поли(этилен-альт-малеинового ангидрида) в лабораторном стакане объемом 600 мл и перемешивали в течение ночи, чтобы частицы затвердели.

6. Отвержденные частицы очищали центрифугированием и 3 раза промывали бикарбонатным буфером pH 9,6.

7. Очищенные частицы повторно суспендировали в растворе, содержащем 4% вес./об. сахарозы и 3% вес./об. D-маннита в воде, быстро замораживали жидким азотом и лиофилизировали досуха.

На Фиг. 35 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц, содержащих в своих ядрах растворимый PLP139-151, сополимера лактида и гликолида посредством анализа динамического светорассеяния. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 1,792 x 105 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела Z-средний диаметр 584 нм, максимальный диаметр 679 нм и коэффициент полидисперсности 0,162. Эти результаты являются типичными для 6 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 36 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый PLP139-151, посредством измерения ζ-потенциала. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 6,67 x 104 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела максимальный ζ-потенциал -48,9 мВ и ζ-отклонение 5,14 мВ. Эти результаты являются типичными для 6 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 37 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин, сополимера лактида и гликолида посредством анализа динамического светорассеяния. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 1,822 x 105 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела Z-средний диаметр 569,7 нм, максимальный диаметр 700,3 нм и коэффициент полидисперсности 0,230. Эти результаты являются типичными для 3 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

На Фиг. 38 показана характеризация поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин, посредством измерения ζ-потенциала. Поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида анализировали на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, г. Уэстборо, штат Массачусетс) со скоростью счета 2,67 x 104 импульсов в секунду в воде 18,2 MОм. Популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида имела максимальный ζ-потенциал -52,2 мВ и ζ-отклонение 5,38 мВ. Эти результаты являются типичными для 3 партий частиц, синтезированных в соответствии с описанным выше протоколом.

Пример 22

Поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие внутри своих ядер растворимый PLP_139-151, индуцируют иммунологическую толерантность в мышиной модели рассеянного склероза

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что биоразлагаемые липосомальные средства доставки, поверхностно-функционализированные высокой плотностью отрицательно заряженных групп и содержащие в своих ядрах растворимый антиген, индуцируют иммунологическую толерантность при R-EAE, мышиной модели рассеянного склероза.

Липосомы, использованные в исследовании, состояли из следующих липидов в следующих молярных соотношениях - 30 : 30 : 40 фосфатидилхолин : фосфатидилглицерин : холестерин. Группам мышей SJL/J внутривенно вводили поверхностно-функционализированные липосомы размером 200 нм (10 мкмоль общего липида на мышь), содержащие в своих ядрах растворимый пептид PLP_139-151, на -7-е сутки относительно праймирования PLP_139-151/CFA на 0-е сутки. Контрольных мышей праймировали на 0-е сутки, на -7-е сутки вводили им поверхностно-функционализированные липосомы размером 500-700 нм (10 мкмоль общего липида на мышь), содержащие в своих ядрах растворимый пептид OVA_323-339. У мышей отслеживали клинические признаки R-EAE в течение дополнительных 17 суток.

В результатах показана зависимость ежедневного среднего балла клинической оценки от количества суток после праймирования PLP_139-151/CFA. Как показано на Фиг. 39, животные, получавшие поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие в своих ядрах растворимый пептид PLP_139-151, имели более низкий балл клинической оценки, чем животные, получавшие поверхностно-функционализированные липосомы, содержащие растворимый пептид OVA_323-339.

Результаты исследования показывают, что биоразлагаемые липосомы, содержащие в своих ядрах PLP_139-151 и поверхностно-функционализированные высокой плотностью отрицательно заряженных групп, эффективно индуцируют иммунологическую толерантность у мышей SJL/J с R-EAE, индуцированным PLP_139-151/CFA, мышиной моделью рассеянного склероза.

Толерантность, индуцированная частицами, связанными с антигеном или инкапсулирующими антиген, является антиген-специфической, дозозависимой и долгосрочной (> 150 суток). Толерантность лучше всего индуцируется внутривенным введением связанной с антигеном частицы диаметром от 500 нм до 1 мкм с дзета-потенциалом < -5 мВ. Индукция толерантности зависит от захвата частиц фагоцитарным рецептором MARCO, который «видит» полианионные поверхности (например, карбоксилированные частицы PS/PLG). Толерантность индуцируется и поддерживается посредством комбинации анергии (частично обращается антителами к PD-1 и агонистическими антителами к CD40) и iTreg (частично обращается антителами к CD25). Частицы изобретения накапливаются преимущественно в печени и макрофагах краевой зоны (CD11b^hi CD11c^lo MARCO⁺ Sign-R1⁺ Siglec-1^-).

Существует множество преимуществ использования связанных с антигеном частиц для лечения аутоиммунных заболеваний по сравнению с использованием возбужденных или направленных антигеном незрелых толерогенных дендритных клеток или полученных инженерными методами антиген-специфических Treg-клеток. Быстрота и простота получения и индукции толерогена с использованием готового универсального толерогенного носителя, пригодного для производства в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP); не нужно выделять и размножать незрелые дендритные клетки или Treg-клетки ex vivo; не нужно беспокоиться, что незрелые дендритные клетки активируются при манипуляциях ex vivo и превратятся в стимуляторные, а не толерогенные, или о превращении клеток Treg в Th1/17 после переноса; поскольку незрелые АПК краевой зоны хозяина обрабатывают и представляют антиген толерогенным способом, АПК хозяина могут отбирать нужные иммунодоминантные аутоэпитопы из PLG-частиц, инкапсулирующих интактные аутоантигены или тканевые экстракты (например, OVA, инкапсулированные в PLG-частицы, предотвращают AAD, индуцированный OVA/Alum); и протокол является антиген-специфическим, без подавления посторонним агентом, безопасным, высокоэффективным и может индуцировать иммунологическую толерантность как у эффекторных Т-клеток (Th1, Th2, Th17 и CD8), так и у интактных Т-клеток, вовлеченных в распространение эпитопа.

Синтетические биоразлагаемые частицы и липосомы могут обеспечить простоту производства, широкую доступность терапевтических агентов и увеличение числа возможных участков лечения. С этой целью специально разработаны поверхностно-функционализированные биоразлагаемые частицы сополимера лактида и гликолида с высокой плотностью поверхностных карбоксильных групп с использованием поверхностно-активного вещества поли(этилен-альт-малеинового ангидрида).

Также разработаны поверхностно-функционализированные липосомы с использованием фосфатидилхолина : фосфатидилглицерина : холестерина в соотношении 30 : 30 : 40.

Дополнительно разработаны такие частицы, содержащие в своих ядрах растворимый овальбумин, чтобы преодолеть проблемы, связанные с химическим загрязнением и чистотой, которые могут возникать при поверхностном конъюгировании пептида или белка. Эти поверхностно-функционализированные частицы сополимера лактида и гликолида, содержащие в своих ядрах растворимый овальбумин, эффективно предотвращают развитие заболевания и, следовательно, индуцируют иммунологическую толерантность в AAI, индуцированном у мышей Balb/c сочетанием овальбумин/Alum, мышиной модели аллергической астмы. Пептид или белок, конъюгированный с функционализированными при помощи карбоксильных групп частицами сополимера лактида и гликолида с использованием EDC, прикрепляется беспорядочным образом, в результате чего образуются агрегаты антигена и агрегаты частица - антиген - частица, которые трудно охарактеризовывать и очищать для получения гомогенных популяций.

Получена гомогенная популяция поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида, содержащих в своих ядрах растворимый овальбумин, которые не требуют поверхностной конъюгации с антигеном.

Дополнительно показано, что биоразлагаемые липосомы, содержащие в своих ядрах PLP_139-151 и поверхностно-функционализированные высокой плотностью отрицательно заряженных групп, эффективно индуцируют иммунологическую толерантность у мышей SJL/J с R-EAE, индуцированным PLP_139-151/CFA, мышиной моделью рассеянного склероза.

Липосомы и частицы сополимера лактида и гликолида настоящего изобретения имеют много преимуществ. Преимущества заключаются в следующем.

1) Биоразлагаемые частицы не присутствуют длительное время в теле, а время полного разложения можно контролировать.

2) Частицы и липосомы можно функционализировать для облегчения интернализации без активации клеток. Для этой цели в микросферы PLG был введен фосфатидилсерин.

3) Частицы и липосомы также можно выполнить так, чтобы они включали лиганды, нацеливающие на конкретную популяцию клеток.

4) Также можно включить в них противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и TGF-β, чтобы ограничить активацию типа клеток, интернализировавшего частицы, и облегчить индукцию толерантности посредством анергии и/или уничтожения, а также активацию регуляторных Т-клеток.

Такая комбинированная функция частицы или липосомы может обеспечить многосторонний подход к индукции толерантности, так что конфигурация частиц является существенным продвижением по сравнению с частицами полистирола. Потенциальные клинические сферы применения данной технологии индукции толерантности включают в себя:

(1) аутоиммунные заболевания, опосредованные T-клетками и антителами (такие как рассеянный склероз, диабет I типа, ревматоидный артрит, системная волчанка и т. п.), - толерантность можно индуцировать частицами в комплексе со значимыми аутоантигенами, лежащими в основе конкретного аутоиммунного заболевания;

(2) пищевые и легочные аллергии, кожные аллергии и астма - толерантность можно индуцировать частицами в комплексе с конкретными пищевыми (например, белками арахиса и т. п.), впрыскиваемыми (белки пчелиного яда и т. п.) или вдыхаемыми веществами (например, белками пыльцы амброзии, белками, содержащимися в клетках кожи домашних животных, и т. п.), которые вызывают аллергическую реакцию;

(3) отторжение трансплантата - можно индуцировать толерантность к антигенам трансплантата на донорских органах или клетках перед трансплантацией для предотвращения отторжения трансплантата реципиентом;

(4) ферментозаместительная терапия - можно индуцировать толерантность к ферментам, которые не продуцируются у пациентов с генетической недостаточностью, чтобы предотвратить образование нейтрализующих антител к рекомбинантным ферментам, вводимым для лечения конкретной недостаточности.

Пример 23

Частицы, наиболее эффективно индуцирующие толерантность, имеют отрицательный заряд и средний диаметр 500 нм

Основными параметрами частицы с точки зрения индукции толерантности являются размер и заряд композиции. Как показано на Фиг. 40A и B, заряд частицы влияет на эффективность индукции толерантности. Сравнение мышей с EAE, получавших конъюгированные с OVA частицы с зарядом -25 мВ или -60 мВ, показало, что композиции, содержащие частицы с зарядом -60 мВ, индуцируют толерантность более эффективно, чем частицы с зарядом -25 мВ. Мышам вводили TIMP (толерогенные иммуномодифицирующие частицы) с зарядом -60 мВ или -25 мВ. Мышам вводили OVA_323-339-TIMP_-60мв, OVA_323-339-PLGA_-25мв, PLP_139-151-TIMP_-60мв или PLP_139-151-PLGA_-25мв (все антигены являются инкапсулированными) и определяли балльную клиническую оценку. Панель (A) показывает средний балл клинической оценки, а панель (B) показывает средний суммарный балл у животных с EAE.

Отрицательный заряд частицы влияет на способность частицы взаимодействовать с фагоцитарным рецептором MARCO. На Фиг. 41 показано, что заряд иммуномодифицирующей частицы важен для направления иммуномодифицирующей частицы к антигенпредставляющей клетке. Животным дикого типа или животным MARCO -/+ вводили либо PS-IMP, либо носитель. Результаты показывают, что частицы со сниженным отрицательным зарядом имеют меньшую эффективность из-за меньшего взаимодействия с фагоцитарными рецепторами, такими как MARCO, которые имеют положительно заряженные коллагенподобные домены.

Помимо заряда на индукцию толерантности влияет размер и композиция биоразлагаемых TIMP. Как показано на Фиг. 42A, наиболее эффективными для индукции толерантности в модели ЕАЕ были частицы со средним диаметром около 500 нм. Мышам вводили 500 нм частицы OVA_323-339-PSB, 100 нм частицы PLP_139-151-PSB, 500 нм частицы PLP_139-151-PSB, 1,75 мкм частицы PLP_139-151-PSB или 4,5 мкм частицы PLP_139-151-PSB и определяли балльную клиническую оценку заболевания. Носители PLGA имели медленную кинетику высвобождения в течение 1 месяца, и изменение соотношения полимеров может влиять на высвобождение частиц. Для индукции толерантности необходимы быстрый захват частиц и быстрый клиренс/разложение. Поскольку соотношение лактид : гликолид свыше 50 : 50 уменьшает скорость разложения, в частицах изобретения в одном варианте осуществления соотношение лактид : гликолид составляет 50 : 50. На Фиг. 42B показано, что частицы быстро разрушаются.

Помимо заряда и среднего диаметра TIMP инкапсулирование антигенов внутрь частицы является более эффективным в модели аллергии, чем связывание частиц с антигеном. В модели аллергии у связанных с антигеном частиц имелась предрасположенность к индукции анафилактической реакции, и они не являлись эффективным средством терапии. Напротив, как показано на Фиг. 43, TIMP с зарядом ­60 мВ являются терапевтически эффективными в мышиной модели аллергии. Животных подвергали воздействию OVA в качестве аллергена и затем воздействовали пустыми PLG- или TIMP-частицами, PLG- или TIMP-частицами с OVA, или не вводили ничего. На панели (A) показано, что частицы OVA-PLG не уменьшают TH2-ответ при аллергии. На панели (B) показано, что TIMP_PEMA-60мВ ингибируют TH2-ответ. На панели (C) показано, что TIMP_PEMA-60мВ ингибируют вторичные иммунные ответы.

Пример 24

Одноэмульсионный синтез поверхностно-функционализированных частиц сополимера лактида и гликолида с инкапсулированным антигеном

Полипептидные антигены можно встраивать в частицы сополимера лактида и гликолида с использованием двойного эмульсионного процесса (см. пример 21), однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что при встраивании более гидрофобных частиц, таких как глиадин, лучше встраивать антиген в частицу при помощи одноэмульсионного процесса с использованием растворителей.

Для создания частиц, содержащих глиадин, использовали сополимер лактида и гликолида с карбоксильными концевыми группами, соотношением D,L-лактид : гликолид 50 : 50 и удельной вязкостью 0,18 дл/г в гексафтор-2-пропаноле. Частицы сополимера лактида и гликолида, содержащие в своих ядрах глиадин, поверхностно-функционализированные высокой плотностью карбоксильных групп, синтезировали методом «одинарная эмульсия - выпаривание растворителя» следующим образом.

1. Пять миллиграмм глиадина и 200 мг PLG растворяли в 50 мкл трифторуксусной кислоты (TFA) и 700 мкл диметилсульфоксида и 1250 мкл дихлорметана (ДХМ).

2. Полученную смесь по каплям добавляли в 4 мл 1% вес./об. водного раствора PEMA и обрабатывали ультразвуком в течение 30 с при амплитуде 100%.

3. Полученную эмульсию выливали в 200 мл 0,5% вес./об. водного раствора PEMA и перемешивали в течение 12 часов для полного испарения ДХМ.

4. Затем частицы трижды промывали в 0,1 M буфере карбоната натрия/бикарбоната натрия, pH 9,6. Альтернативно для промывки частиц можно использовать дважды дистиллированную H₂O.

5. Очищенные частицы повторно суспендировали в растворе, содержащем 4% вес./об. сахарозы и 3% вес./об. D-маннита в воде, быстро замораживали до -80 °C и лиофилизировали досуха.

Хотя в настоящем документе описаны и проиллюстрированы конкретные варианты осуществления изобретения, такие варианты осуществления следует рассматривать только как иллюстрирующие изобретение, но не как ограничивающие изобретение в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Все патенты, заявки и другие публикации, процитированные в настоящем документе, полностью включены в него путем ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Cour Pharmaceuticals

<120> Частицы, конъюгированные с пептидом

<130> COUR-002/01US

<160> 5140

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys

20

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ala Ser Phe Asp Lys Ala Lys Leu Lys

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 3

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ala Thr Gly Leu Cys Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly

1 5 10 15

His Glu Ala Leu

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ala Val Pro Val Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser

1 5 10 15

Ile Ala Phe Pro

20

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 7

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 8

Cys Arg Val Leu Cys Cys Tyr Val Leu

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Asp Ala Lys Ile Arg Ile Phe Asp Leu

1 5

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His Phe Val Met Gln Arg Leu

1 5 10 15

Pro Leu

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 11

Glu Asn Pro Val Val Ala Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 12

Glu Asn Pro Val Val Asp Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 13

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 14

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr

1 5 10 15

Val Thr Gly Gly

20

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Phe Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala

1 5

<210> 19

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Phe Tyr Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Thr Thr Ile Cys Gly

20

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 20

Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly

20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 21

Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu

1 5

<210> 22

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe

1 5 10

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 23

Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala

1 5 10 15

Arg Arg

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ile Thr Arg Glu Glu Lys Pro Ala Val Thr Ala Ala Pro Lys Lys

1 5 10 15

<210> 25

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys

1 5 10

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Tyr

1 5 10 15

Arg Gly Gln His

20

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu

1 5 10 15

Ile Glu Thr Tyr

20

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 29

Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe Met Gly Val

1 5 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 30

Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu

1 5

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe

1 5 10 15

Phe Gly Gly Asp

20

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Leu Val Gly Ala Pro Phe Ala Ser Leu Val Ala Thr Gly Leu Cys Phe

1 5 10 15

Phe Gly Val Ala

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala

1 5 10 15

Val Arg Gln Ile

20

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Met Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly Arg Phe

1 5 10 15

Thr Lys Phe

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 35

Met Asp Arg Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Tyr Ser Glu

1 5 10

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 36

Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val

1 5

<210> 37

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ser Gln

20

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His Ser Leu Glu

1 5 10 15

Arg Val Cys His

20

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 40

Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 41

Arg Pro Pro Ile Phe Ile Arg Arg Leu

1 5

<210> 42

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met

1 5 10 15

Tyr Gly Val Leu

20

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 44

Ser Val Arg Asp Arg Leu Ala Arg Leu

1 5

<210> 45

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 45

Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro

1 5 10

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 46

Thr Gly Gly Val Tyr His Phe Val Lys Lys His Val His Glu Ser

1 5 10 15

<210> 47

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Thr Gly Thr Glu Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln

1 5 10 15

Asp Tyr Glu Tyr

20

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 48

Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met

1 5 10

<210> 49

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg

1 5 10 15

Asp Ser Arg Ser

20

<210> 50

<211> 13

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 50

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro

1 5 10

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu

1 5

<210> 52

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 52

Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ser Arg

20

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val

1 5

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ile Gly Ser Leu

20

<210> 55

<211> 23

<212> PRT

<213> Т-клеточный лимфотропный вирус человека

<400> 55

Ile Gln Ala Ile Val Ser Ser Pro Cys His Asn Ser Leu Ile Leu Pro

1 5 10 15

Pro Phe Ser Leu Ser Pro Val

20

<210> 56

<211> 24

<212> PRT

<213> Т-клеточный лимфотропный вирус человека

<400> 56

Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro Leu Leu Pro His Ser Asn Leu Asp His

1 5 10 15

Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp

20

<210> 57

<211> 20

<212> PRT

<213> Т-клеточный лимфотропный вирус человека

<400> 57

Pro Pro Pro Tyr Val Glu Pro Thr Ala Pro Gln Val Leu Pro Val Met

1 5 10 15

His Pro His Gly

20

<210> 58

<211> 23

<212> PRT

<213> Т-клеточный лимфотропный вирус человека

<400> 58

Gln Gly Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gln Glu Gln Cys Arg Phe Pro Asn

1 5 10 15

Ile Thr Asn Ser His Val Pro

20

<210> 59

<211> 20

<212> PRT

<213> Т-клеточный лимфотропный вирус человека

<400> 59

Arg Ala Ser Leu Ser Thr Trp His Val Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser

1 5 10 15

Val Pro Ser Ser

20

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 62

His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile

1 5 10 15

<210> 64

<211> 13

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 64

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Ala Arg Thr Pro

1 5 10

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 66

Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu

1 5

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 67

His Thr Gln Pro Tyr Ala Tyr Glu Ala Arg Asp His

1 5 10

<210> 68

<211> 15

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 68

Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu

1 5 10 15

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile

1 5 10 15

<210> 70

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 70

Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr

1 5 10

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro

1 5 10 15

Arg

<210> 72

<211> 22

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 72

Glu Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Tyr Leu Ile Asn Val Ile

20

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 73

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg

1 5

<210> 74

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

<210> 75

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

Thr Pro Pro

<210> 76

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

1 5 10 15

Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro

20 25

<210> 77

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Gly Thr Glu Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp

1 5 10 15

Tyr Glu

<210> 78

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser Leu

1 5 10 15

<210> 79

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser

1 5 10 15

Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg

20 25

<210> 80

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Leu Lys Gly Val Asp Ala

1 5 10 15

Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys

20 25

<210> 81

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

Glu Val Gly Glu Leu Ser Arg Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Gly Asn Gly

1 5 10 15

Arg Trp Met Leu Thr Leu Ala Lys Asn Met Glu Val Arg Ala Ile

20 25 30

<210> 82

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Thr Thr

<210> 83

<211> 33

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

Gly Asn Gly Arg Trp Met Leu Thr Leu Ala Lys Asn Met Glu Val Arg

1 5 10 15

Ala Ile Phe Thr Gly Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Pro Val Pro Thr Gln

20 25 30

Gly

<210> 84

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Glu Val

20

<210> 85

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

1 5 10 15

His Gly Arg Thr

20

<210> 86

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly

1 5 10 15

Arg Gly Leu Ser

20

<210> 87

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe

1 5 10 15

Leu Pro Arg His

20

<210> 88

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Gly

<210> 89

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys

20

<210> 90

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ile Gly

20

<210> 91

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

Pro Ile Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile

1 5 10 15

Ser Pro Gly Lys

20

<210> 92

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 92

Gln Lys Ser Gln Arg Ser Gln Ala Glu Asn Pro Val

1 5 10

<210> 93

<211> 12

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 93

Gln Lys Ser Gln Arg Ser Gln Asp Glu Asn Pro Val

1 5 10

<210> 94

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser

1 5 10 15

Ala His Lys Gly

20

<210> 95

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly

1 5 10 15

Gly Asp Arg Gly

20

<210> 96

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro

1 5 10 15

Met Ala Arg Arg

20

<210> 97

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met

1 5 10 15

Tyr Gly Val Leu Pro

20

<210> 98

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

Thr Gly Thr Glu Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln

1 5 10 15

Asp Tyr Glu Tyr Leu

20

<210> 99

<211> 13

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 99

Val His Phe Phe Arg Asn Ile Val Thr Ala Arg Thr Pro

1 5 10

<210> 100

<211> 13

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 100

Val His Phe Phe Arg Asn Ile Val Thr Ala Arg Thr Pro

1 5 10

<210> 101

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro

1 5 10 15

Ser Gln Gly Lys

20

<210> 102

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr Met

20

<210> 103

<211> 44

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His

20 25 30

Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe

35 40

<210> 104

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104

Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg

1 5 10 15

Asp Thr Gly Ile Leu

20

<210> 105

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 105

Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr

20

<210> 106

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro Pro Pro

<210> 107

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 107

Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Tyr Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Leu

1 5 10 15

Thr Thr

<210> 108

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 108

Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gln Gly

20

<210> 109

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

Gly Val Leu Pro Trp Asn Ala Phe Pro Gly Lys Val Cys Gly Ser Asn

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ile Cys Lys Thr Ala Glu

20 25

<210> 110

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 110

His Leu Ile Leu Ala Pro Ser Ile Arg His Ala Pro

1 5 10

<210> 111

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 111

His Leu Val Met Ala Pro Ser Val Ala Arg Gly Leu

1 5 10

<210> 112

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 112

His Val Gln Leu Ala Pro Pro Ile Ala Leu Arg His

1 5 10

<210> 113

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 113

His Val Val Leu Ala Pro Asn Val Gln Ser Pro Leu

1 5 10

<210> 114

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 114

His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu

1 5 10 15

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys

20

<210> 115

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 115

Lys Lys Gln Ser Lys Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Ala

1 5 10

<210> 116

<211> 33

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 116

Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

Leu Ile Asn Val Ile His Ala Phe Gln Tyr Val Ile Tyr Gly Thr Ala

20 25 30

Ser

<210> 117

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 117

Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro

1 5 10 15

Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe

20 25 30

<210> 118

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 118

Leu Thr Phe Met Ile Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu

1 5 10 15

Met Gly Arg Gly Thr Lys Phe

20

<210> 119

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 119

Met Ile Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly Arg

1 5 10 15

Gly Thr Lys Phe

20

<210> 120

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 120

Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala

1 5 10 15

Arg His Gly Phe Leu

20

<210> 121

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser Leu Cys

1 5 10 15

Ala Asp Ala Arg Met Tyr

20

<210> 122

<211> 34

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

Thr Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His

1 5 10 15

Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro

20 25 30

Asp Lys

<210> 123

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 123

Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly Gln

1 5 10 15

Lys Gly Arg Gly

20

<210> 124

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 124

Val Val Thr Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro Gly Met

1 5 10

<210> 125

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 125

Trp His Ala Pro Gln Thr Pro Tyr Trp Ala Ser Met

1 5 10

<210> 126

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 126

Trp His Ile Pro Pro Asn Ile Gly Arg Thr Phe Ser

1 5 10

<210> 127

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 127

Trp His Gln Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Trp Glu Ser

1 5 10

<210> 128

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 128

Trp His Thr Gln Pro Ala His Val Val Thr Pro Met

1 5 10

<210> 129

<211> 12

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 129

Trp His Thr Ser Asp Pro Leu Pro Pro Ala Gln Pro

1 5 10

<210> 130

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 130

Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly

1 5 10 15

Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Leu Gly Trp

20 25

<210> 131

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 131

Ala Arg Trp Glu Leu Asn Leu

1 5

<210> 132

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 132

Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Thr Val

20

<210> 133

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 133

Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg

1 5 10 15

Gly Ala Pro Lys

20

<210> 134

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 134

Glu Lys Asp Arg Phe Ser Val Asn Leu Asp Val Ser His Phe Ser Pro

1 5 10 15

Glu Glu Leu Lys

20

<210> 135

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 135

Glu Pro Leu Tyr Gly Pro Tyr

1 5

<210> 136

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

Phe Asp Thr Gly Leu Ser Glu Met Arg Leu Glu Lys Asp Arg Phe Ser

1 5 10 15

Val Asn Leu Asp

20

<210> 137

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 137

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile

20 25

<210> 138

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 138

Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly

1 5 10 15

Ser Leu Pro Gln

20

<210> 139

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 139

Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn

1 5 10 15

<210> 140

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

Gly Val Leu Thr Val Asn Gly Pro Arg Lys Gln Val Ser Gly Pro Glu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Pro

20

<210> 141

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 141

Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn

1 5 10 15

Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp

20

<210> 142

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 142

His Gly Phe Ile Ser Arg Glu Phe His Arg Lys Tyr Arg Ile Pro Ala

1 5 10 15

Asp Val Asp Pro

20

<210> 143

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 143

His Gly Lys His Glu Glu Arg Gln Asp Glu His Gly Phe Ile Ser Arg

1 5 10 15

Glu Phe His Arg

20

<210> 144

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 144

His Leu Leu Glu Ser Asp Leu Phe Pro Thr Ser Thr Ser Leu Ser Pro

1 5 10 15

Phe Tyr Leu Arg

20

<210> 145

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 145

Ile Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg Phe Ser

1 5 10 15

Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe

20 25

<210> 146

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 146

Lys Tyr Arg Ile Pro Ala Asp Val Asp Pro Leu Thr Ile Thr Ser Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Asp

20

<210> 147

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 147

Leu Ala Thr Pro Asn Pro Ser

1 5

<210> 148

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 148

Leu Thr Ile Thr Ser Ser Leu Ser Ser Asp Gly Val Leu Thr Val Asn

1 5 10 15

Gly Pro Arg Lys

20

<210> 149

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 149

Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp Ala Pro Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp

20

<210> 150

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 150

Met Asp Ile Ala Ile His His Pro Trp Ile Arg Arg Pro Phe Phe Pro

1 5 10 15

Phe His Ser Pro

20

<210> 151

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 151

Pro Glu Phe Ala Pro Trp Ala

1 5

<210> 152

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 152

Pro Glu Gln Pro Pro Ile His

1 5

<210> 153

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 153

Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn

20 25

<210> 154

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 154

Pro Pro Ser Phe Leu Arg Ala Pro Ser Trp Phe Asp Thr Gly Leu Ser

1 5 10 15

Glu Met Arg Leu

20

<210> 155

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 155

Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro

1 5 10 15

Pro Ser Gln Gly

20

<210> 156

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 156

Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala

1 5 10 15

Glu Gly Gln Arg

20

<210> 157

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 157

Gln Val Ser Gly Pro Glu Arg Thr Ile Pro Ile Thr Arg Glu Glu Lys

1 5 10 15

Pro Ala Val Thr

20

<210> 158

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 158

Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu

1 5 10 15

Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly

20 25

<210> 159

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 159

Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser

1 5 10 15

Tyr Gln Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu

20 25

<210> 160

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 160

Arg Arg Pro Phe Phe Pro Phe His Ser Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln

1 5 10 15

Phe Phe Gly Glu

20

<210> 161

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 161

Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Leu Gly Trp Tyr Arg Pro

1 5 10 15

Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

20

<210> 162

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 162

Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu His Leu Leu Glu Ser Asp

1 5 10 15

Leu Phe Pro Thr

20

<210> 163

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 163

Ser Thr Ser Leu Ser Pro Phe Tyr Leu Arg Pro Pro Ser Phe Leu Arg

1 5 10 15

Ala Pro Ser Trp

20

<210> 164

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 164

Ser Trp Tyr Ala Arg His Thr

1 5

<210> 165

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 165

Ser Trp Tyr Ala Arg His Tyr

1 5

<210> 166

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 166

Thr Ile Lys Asn Thr Phe Phe

1 5

<210> 167

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg

1 5 10

<210> 168

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 168

Thr Pro Thr Phe Met Tyr Phe

1 5

<210> 169

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 169

Thr Ser Pro Ser Val Ala Tyr

1 5

<210> 170

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 170

Thr Thr Pro Leu Thr Asn Leu

1 5

<210> 171

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

1 5 10

<210> 172

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 172

Val Asp His Gln His Pro Ser

1 5

<210> 173

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 173

Val Lys Val Leu Gly Asp Val Ile Glu Val His Gly Lys His Glu Glu

1 5 10 15

Arg Gln Asp Glu

20

<210> 174

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 174

Val Ser His Phe Ser Pro Glu Glu Leu Lys Val Lys Val Leu Gly Asp

1 5 10 15

Val Ile Glu Val

20

<210> 175

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 175

Tyr Ala Gln Pro Ser Glu Arg

1 5

<210> 176

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 176

Ala Ala Ala Gln Met Pro Ala Tyr Gln Glu Leu Val Glu Glu Ala

1 5 10 15

<210> 177

<211> 26

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 177

Ala Ala Arg Thr Thr His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gln Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe

20 25

<210> 178

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 178

Ala Gly Val Thr Leu Ile Ser Pro Phe Val Gly Arg Ile Leu Asp

1 5 10 15

<210> 179

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

Ala Arg Arg Lys Val Ala Met Ala Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

1 5 10 15

Gly Gln Gly

<210> 180

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 180

Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg

1 5 10 15

Thr Gln Asp Glu

20

<210> 181

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 181

Ala Arg Val Ala Glu His Pro Asp Ala Arg Leu Ala Trp Ala Arg

1 5 10 15

<210> 182

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 182

Ala Ser Asp Leu Glu Lys Ile His Leu Asp Glu Lys Ser Phe Arg

1 5 10 15

<210> 183

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 183

Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln

1 5 10 15

Ala Pro Gly Gln

20

<210> 184

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 184

Cys Phe Tyr Gln Lys Lys Glu Glu Asp Trp Ile Cys Cys Ala Cys Gln

1 5 10 15

Lys Thr Arg

<210> 185

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

Asp Ala Thr Thr Asn Pro Ser Leu Ile Leu Ala Ala Ala Gln Met

1 5 10 15

<210> 186

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 186

Asp Phe Leu Thr Ile Ser Pro Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 187

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 187

Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile

1 5 10 15

Leu Asp Ser Ile

20

<210> 188

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 188

Asp Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Lys Ile Tyr Asn Tyr Tyr Lys

1 5 10 15

<210> 189

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 189

Asp Gln Met Ala Val Glu Lys Leu Ser Asp Gly Ile Arg Lys Phe

1 5 10 15

<210> 190

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 190

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Val Ser Thr Ala Ser Leu Thr Ile

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp

20

<210> 191

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 191

Asp Arg Lys Tyr Ser Ile Cys Lys Ser Gly Cys Phe Tyr Gln Lys Lys

1 5 10 15

Glu Glu Asp

<210> 192

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 192

Asp Ser Tyr Thr Leu Thr Glu Glu Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Arg Val

1 5 10 15

Lys

<210> 193

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 193

Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Lys

20

<210> 194

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 194

Glu Ala Gly Ile Ser Lys Asp Arg Ile Leu Ile Lys Leu Ser Ser

1 5 10 15

<210> 195

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 195

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Ser Gly Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Ser Arg Asp Val Tyr

20

<210> 196

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 196

Glu Lys Ser Phe Arg Trp Leu His Asn Glu Asp Gln Met Ala Val

1 5 10 15

<210> 197

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 197

Glu Asn Leu His Arg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys

1 5 10 15

Trp

<210> 198

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 198

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro Pro Pro Ser

20

<210> 199

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 199

Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asp Tyr Ala

1 5 10 15

Gln Lys Phe Gln Gly Arg

20

<210> 200

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 200

Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile Thr Leu

1 5 10 15

<210> 201

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 201

Phe Gly Ala Glu Ile Leu Lys Lys Ile Pro Gly Arg Val Ser Thr

1 5 10 15

<210> 202

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 202

Phe His Ala Ile Asp Glu Tyr Lys Pro Gln Asp Ala Thr Thr Asn

1 5 10 15

<210> 203

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус кори

<400> 203

Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 204

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 204

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

1 5 10 15

Gly Gly Arg Asp

20

<210> 205

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 205

Phe Thr Thr Val Val Ala Asp Thr Gly Asp Phe His Ala Ile Asp

1 5 10 15

<210> 206

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 206

Gly Glu Leu Leu Gln Asp Asn Ala Lys Leu Val Pro Val Leu Ser

1 5 10 15

<210> 207

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 207

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro

1 5 10 15

Gly Lys Gly Leu Glu

20

<210> 208

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 208

Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala Phe Glu Gly

1 5 10 15

Thr Cys Val Ser Ile

20

<210> 209

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 209

Gly Ile His Cys Asn Met Thr Leu Leu Phe Ser Phe Ala Gln Ala

1 5 10 15

<210> 210

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус иммунодефицита человека

<400> 210

Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 211

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 211

Gly Ile Arg Lys Phe Ala Ala Asp Ala Val Lys Leu Glu Arg Met

1 5 10 15

<210> 212

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 212

Gly Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala

1 5 10 15

Glu Asp Thr Ala Val Tyr

20

<210> 213

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 213

Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly

1 5 10 15

Lys Asp Ser His

20

<210> 214

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 214

Gly Arg Ile Leu Asp Trp His Val Ala Asn Thr Asp Lys Lys Ser

1 5 10 15

<210> 215

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

Gly Arg Val Ser Thr Glu Val Asp Ala Arg Leu Ser Phe Asp Lys

1 5 10 15

<210> 216

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 216

Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly

1 5 10 15

Arg Asp Ser Arg

20

<210> 217

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 217

His Phe Ser Ile His Cys Cys Pro Pro Phe Thr Phe Leu Asn Ser Lys

1 5 10 15

Lys Glu Ile

<210> 218

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly

1 5 10 15

Asp Arg Gly Ala

20

<210> 219

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 219

Ile Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Gly Ile Gln Ala Gly Lys Glu

1 5 10 15

<210> 220

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 220

Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly

1 5 10 15

Leu Ser Leu Ser

20

<210> 221

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 221

Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met

1 5 10 15

Ala Arg

<210> 222

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 222

Lys Leu Glu Arg Met Leu Thr Glu Arg Met Phe Asn Ala Glu Asn Gly

1 5 10 15

<210> 223

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 223

Lys Leu Gly Gly Ser Gln Glu Asp Gln Ile Lys Asn Ala Ile Asp

1 5 10 15

<210> 224

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 224

Lys Asn Ala Ile Asp Lys Leu Phe Val Leu Phe Gly Ala Glu Ile

1 5 10 15

<210> 225

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 225

Leu Ser Phe Asp Lys Asp Ala Met Val Ala Arg Ala Arg Arg Leu

1 5 10 15

<210> 226

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 226

Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly

1 5 10 15

Tyr Gly Gly Arg

20

<210> 227

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 227

Leu Ser Tyr Ser His Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Lys Arg Pro Thr Lys

1 5 10 15

Asp Ser Tyr Thr

20

<210> 228

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 228

Leu Val Glu Glu Ala Ile Ala Tyr Gly Arg Lys Leu Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 229

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 229

Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr

20 25

<210> 230

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 230

Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp Gln Ala Pro Glu Tyr

1 5 10 15

Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp

20 25

<210> 231

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 231

Met Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Thr Ala Ser

20

<210> 232

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 232

Met Glu Ser Ala Leu Asp Gln Leu Lys Gln Phe Thr Thr Val Val

1 5 10 15

<210> 233

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 233

Met Ser Gln Lys Pro Ala Lys Glu Gly Pro Arg Leu Ser Lys Asn Gln

1 5 10 15

Lys Tyr Ser

<210> 234

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 234

Met Ser Ser Ser Pro Val Lys Arg Gln Arg Met Glu Ser Ala Leu

1 5 10 15

<210> 235

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 235

Asn Pro Val Met Glu Arg Phe Ala Ala His Ala Gly Asp Leu Val

1 5 10 15

<210> 236

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 236

Asn Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Asp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

1 5 10 15

Leu Val Thr Val

20

<210> 237

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 237

Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His

1 5 10 15

Gly Val His Tyr Phe Asn Ser

20

<210> 238

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 238

Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His

1 5 10 15

Lys Gly Phe Lys

20

<210> 239

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 239

Pro Pro Phe Thr Phe Leu Asn Ser Lys Lys Glu Ile Val Asp Arg Lys

1 5 10 15

Tyr Ser Ile Cys Lys Ser Gly

20

<210> 240

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 240

Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His

1 5 10 15

Phe Phe Lys Asn

20

<210> 241

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 241

Pro Arg Pro Glu Val Arg Pro Pro Pro Ala Lys Gln Arg Pro Pro Gln

1 5 10 15

Lys Ser Lys Gln Gln Pro Arg Ser Ser

20 25

<210> 242

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 242

Gln Ala Gly Lys Glu Leu Glu Glu Gln His Gly Ile His Cys Asn

1 5 10 15

<210> 243

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 243

Gln Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

1 5 10

<210> 244

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 244

Gln Lys Tyr Ser Glu His Phe Ser Ile His Cys Cys Pro Pro Phe Thr

1 5 10 15

Phe Leu Asn Ser Lys Lys

20

<210> 245

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 245

Gln Pro Arg Ser Ser Pro Leu Arg Gly Pro Gly Ala Ser Arg Gly Gly

1 5 10 15

Ser Pro Val Lys Ala Ser Arg Phe

20

<210> 246

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 246

Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr

1 5 10 15

Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp

20

<210> 247

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 247

Gln Arg Pro Pro Gln Lys Ser Lys Gln Gln Pro Arg Ser Ser Pro Leu

1 5 10 15

Arg Gly Pro Gly Ala Ser Arg

20

<210> 248

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 248

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly

1 5 10

<210> 249

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 249

Gln Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser

1 5 10

<210> 250

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 250

Gln Thr Trp Gly Thr Gly Ile Glu Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

1 5 10 15

Val Thr Val Leu

20

<210> 251

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Lys Val Ala

1 5 10 15

Met Ala Thr Thr Tyr

20

<210> 252

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 252

Arg Ala Arg Arg Leu Ile Glu Leu Tyr Lys Glu Ala Gly Ile Ser

1 5 10 15

<210> 253

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 253

Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly

1 5 10 15

Gly Arg Ala Ser

20

<210> 254

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 254

Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr

1 5 10 15

Gly Ser Leu Pro

20

<210> 255

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 255

Arg Leu Ser Lys Asn Gln Lys Tyr Ser Glu His Phe Ser Ile His Cys

1 5 10 15

Cys Pro Pro

<210> 256

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 256

Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala

1 5 10 15

His Lys Gly

<210> 257

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 257

Ser Phe Ala Gln Ala Val Ala Cys Ala Glu Ala Gly Val Thr Leu

1 5 10 15

<210> 258

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 258

Ser Gly Cys Phe Tyr Gln Lys Lys Glu Glu Asp Trp Ile Cys Cys Ala

1 5 10 15

Cys Gln Lys Thr Arg Thr Ser Arg

20

<210> 259

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 259

Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly

1 5 10 15

Phe Leu Pro Arg

20

<210> 260

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 260

Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp

1 5 10 15

His Ala Arg His

20

<210> 261

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 261

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Ser

1 5 10 15

Leu Tyr Leu Gln

20

<210> 262

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 262

Ser Tyr Ala Gly Gly Ser Ala Cys Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Thr Val Leu

<210> 263

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 263

Thr Asp Lys Lys Ser Tyr Glu Pro Leu Glu Asp Pro Gly Val Lys

1 5 10 15

<210> 264

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 264

Thr Phe Leu Asn Ser Lys Lys Glu Ile Val Asp Arg Lys Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Cys Lys Ser

<210> 265

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 265

Thr Gly Glu Ile Lys Ala Leu Ala Gly Cys Asp Phe Leu Thr Ile

1 5 10 15

<210> 266

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 266

Thr Ile Val Met Gly Ala Ser Phe Arg Asn Thr Gly Glu Ile Lys

1 5 10 15

<210> 267

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 267

Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His

1 5 10 15

Val Ser Leu Leu

20

<210> 268

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 268

Val Pro Val Leu Ala Phe Asp Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Glu

1 5 10 15

<210> 269

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 269

Val Pro Val Leu Ser Ala Lys Ala Ala Gln Ala Ser Asp Leu Glu

1 5 10 15

<210> 270

<211> 20

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 270

Tyr Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro Pro

20

<210> 271

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 271

Tyr Asn Tyr Tyr Lys Lys Phe Ser Tyr Lys Thr Ile Val Met Gly

1 5 10 15

<210> 272

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 272

Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly

1 5 10 15

<210> 273

<211> 20

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 273

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr

20

<210> 274

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 274

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His

20 25 30

Arg Asp Thr Gly Ile Leu

35

<210> 275

<211> 17

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 275

Asp Ala Tyr Pro Cys Tyr Phe Phe Lys Ser Ala Cys Arg Pro Arg Ala

1 5 10 15

Pro

<210> 276

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 276

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

Thr

<210> 277

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 277

Glu Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 278

<211> 12

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 278

Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu

1 5 10

<210> 279

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 279

Glu Asn Pro Lys Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 280

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 280

Glu Pro Ala Arg Ser Arg Ser Arg

1 5

<210> 281

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 281

Glu Pro Met Thr Pro His Gln Trp Ile Thr Leu Tyr Arg Ser Tyr

1 5 10 15

<210> 282

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 282

Phe Cys Pro Pro Ile Leu Pro Tyr Ser Ala Trp Cys Pro Val Pro

1 5 10 15

<210> 283

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 283

Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys

1 5 10 15

Gly Phe Lys Gly

20

<210> 284

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 284

Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly

1 5 10

<210> 285

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 285

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His

1 5 10 15

Gly Phe Leu

<210> 286

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 286

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His

1 5 10 15

Gly Phe Leu Pro

20

<210> 287

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 287

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys

1 5 10 15

<210> 288

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 288

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

1 5 10 15

His Gly Arg Thr Gln Asp

20

<210> 289

<211> 15

<212> PRT

<213> Папилломавирус человека

<400> 289

Ile Gly Gly Arg Val His Phe Phe Lys Asp Ile Ser Pro Ile Ala

1 5 10 15

<210> 290

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 290

Lys Leu Ser Asp Gly Ile Arg Lys Phe Ala Ala

1 5 10

<210> 291

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 291

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly

1 5 10 15

<210> 292

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 292

Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe

1 5 10 15

Lys Asn Ile Val Thr

20

<210> 293

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 293

Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe

1 5 10 15

Lys Asn Ile Val Thr

20

<210> 294

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 294

Leu Leu Phe Ser Phe Ala Gln Ala Val

1 5

<210> 295

<211> 20

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 295

Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly

1 5 10 15

Ile Leu Asp Ser

20

<210> 296

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 296

Met Pro Val Ser Arg Leu Cys Ile Glu Leu Asp Trp Cys Pro Pro

1 5 10 15

<210> 297

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 297

Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp

1 5 10 15

Gly Ala Glu Gly

20

<210> 298

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 298

Arg Gly Thr Gln Glu Trp Thr Glu Leu Trp Val Ser Phe Arg Ala

1 5 10 15

<210> 299

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 299

Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys

1 5 10 15

<210> 300

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 300

Ser Arg Gly Ser His Glu Trp Ala Val Leu Phe Arg Phe Tyr Tyr

1 5 10 15

<210> 301

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 301

Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro

1 5 10 15

<210> 302

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 302

Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu

1 5 10

<210> 303

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 303

Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe

1 5 10

<210> 304

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 304

Thr Gln Asp Gln Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 305

<211> 12

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 305

Thr Ser Val Phe Asp Lys Leu Lys His Leu Val Asp

1 5 10

<210> 306

<211> 21

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 306

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Gln Gly Lys Gly Arg

20

<210> 307

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 307

Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

1 5 10

<210> 308

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 308

Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Gln

1 5 10 15

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 309

Tyr Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu

1 5 10 15

Pro

<210> 310

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 310

Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe

1 5

<210> 311

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 311

Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser

1 5 10 15

<210> 312

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 312

Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met

1 5

<210> 313

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 313

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

Thr Pro Pro Pro Ser

20

<210> 314

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 314

Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro

1 5 10

<210> 315

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 315

Thr Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His

1 5 10 15

Ser Leu Glu Arg Val

20

<210> 316

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 316

Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly

1 5 10 15

Gly Gln

<210> 317

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 317

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly Tyr

20

<210> 318

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 318

Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Ala Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala His Tyr

<210> 319

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 319

Asp Ala Ile Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg

1 5 10 15

Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe

20

<210> 320

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 320

Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg

1 5 10 15

Gly Ser Gly Lys Asp

20

<210> 321

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 321

Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu

1 5 10 15

Val Gly Trp Tyr

20

<210> 322

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 322

Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu Gly

1 5 10 15

Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg

20

<210> 323

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 323

Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ala Ser Asp

20

<210> 324

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 324

Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His Ser

1 5 10 15

Leu Glu Arg Val Cys His

20

<210> 325

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус простого герпеса

<400> 325

Gly Gly Arg Arg Leu Phe Phe Val Lys Ala His Val Arg Glu Ser

1 5 10 15

<210> 326

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 326

Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu

1 5 10 15

Gly Gln Arg Pro

20

<210> 327

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 327

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala

20

<210> 328

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 328

Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His

1 5 10 15

Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp

20

<210> 329

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 329

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Glu Val Glu Leu

20

<210> 330

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 330

Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg

1 5 10 15

<210> 331

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 331

Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly

1 5 10 15

Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro Met Ala

20 25

<210> 332

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 332

His Ala Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gln

1 5 10 15

Gly His Arg

<210> 333

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 333

His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile

1 5 10 15

Thr

<210> 334

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 334

Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile Thr Tyr Ala Leu Thr

1 5 10 15

<210> 335

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 335

Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln

1 5 10 15

Leu Glu Lys Ser

20

<210> 336

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 336

Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe

1 5 10 15

Gly Asp Tyr Lys

20

<210> 337

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 337

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ser

<210> 338

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 338

Pro Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

1 5 10 15

Pro Arg Thr Pro

20

<210> 339

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 339

Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe

1 5 10 15

Gly Gly Asp Arg

20

<210> 340

<211> 19

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 340

Gln Ala His Ser Leu Glu Arg Val Ser His Ser Leu Gly Lys Trp Leu

1 5 10 15

Gly His Pro

<210> 341

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 341

Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp

1 5 10 15

Arg Gly Ala Pro

20

<210> 342

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 342

Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys

1 5 10 15

Asp Ser His His

20

<210> 343

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 343

Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr

1 5 10 15

Gln Asp Glu Asn

20

<210> 344

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 344

Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr

1 5 10 15

Leu Ser Lys Ile

20

<210> 345

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 345

Ala Ala Arg Thr Thr His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gln Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Gln Asn Pro Val His Phe

20 25

<210> 346

<211> 25

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 346

Ala Glu Tyr Arg Gly Arg Val Ser Leu Val Glu Asp His Ile Ala Glu

1 5 10 15

Gly Ser Val Ala Val Arg Ile Gln Glu

20 25

<210> 347

<211> 17

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 347

Ala Lys Pro Val Val His Leu Phe Ala Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 348

<211> 26

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 348

Ala Pro Phe Asp Val Ile Gly Pro Gln Glu Pro Ile Leu Ala Val Val

1 5 10 15

Gly Glu Asp Ala Glu Leu Pro Cys Arg Leu

20 25

<210> 349

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 349

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe

1 5 10

<210> 350

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 350

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Lys Tyr Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ser Thr

<210> 351

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 351

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ser Thr Met Asp

20

<210> 352

<211> 26

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 352

Ala Val Val Gly Glu Asp Ala Glu Leu Pro Cys Arg Leu Ser Pro Asn

1 5 10 15

Val Ser Ala Lys Gly Met Glu Leu Arg Trp

20 25

<210> 353

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 353

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn

1 5 10

<210> 354

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 354

Glu Asn Pro Val Val His Glu Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

1 5 10 15

Pro

<210> 355

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 355

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10

<210> 356

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 356

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Leu Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 357

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 357

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Arg Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 358

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 358

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Gln Gly Gln Lys Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly

<210> 359

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 359

Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser

1 5 10 15

Gly Ser Pro Met Ala Arg Arg

20

<210> 360

<211> 25

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 360

Ile Ala Glu Gly Ser Val Ala Val Arg Ile Gln Glu Val Lys Ala Ser

1 5 10 15

Asp Asp Gly Glu Tyr Arg Cys Phe Phe

20 25

<210> 361

<211> 25

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 361

Lys Ala Ser Asp Asp Gly Glu Tyr Arg Cys Phe Phe Arg Gln Asp Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Glu Glu Ala Ile Val His Leu

20 25

<210> 362

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 362

Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe

1 5 10 15

Lys Asn Ile Val Thr Pro

20

<210> 363

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 363

Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro

1 5 10 15

Arg

<210> 364

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 364

Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10

<210> 365

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 365

Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro

<210> 366

<211> 20

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 366

Arg Gln Asp Glu Asn Tyr Glu Glu Ala Ile Val His Leu Lys Val Ala

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ser

20

<210> 367

<211> 23

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 367

Arg Trp Phe Arg Glu Lys Val Ser Pro Ala Val Phe Val Ser Arg Glu

1 5 10 15

Gly Gln Glu Gln Glu Gly Glu

20

<210> 368

<211> 24

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 368

Ser Pro Asn Val Ser Ala Lys Gly Met Glu Leu Arg Trp Phe Arg Glu

1 5 10 15

Lys Val Ser Pro Ala Val Phe Val

20

<210> 369

<211> 18

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 369

Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly

1 5 10 15

Ser Pro

<210> 370

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 370

Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Glu

1 5 10

<210> 371

<211> 24

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 371

Val Ser Arg Glu Gly Gln Glu Gln Glu Gly Glu Met Ala Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Arg Val Ser Leu Val Glu Asp

20

<210> 372

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 372

Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp

20

<210> 373

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 373

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Arg

<210> 374

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 374

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly

<210> 375

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 375

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly

<210> 376

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 376

His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser

1 5 10

<210> 377

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 377

Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe

1 5 10 15

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr

20

<210> 378

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 378

Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Ile Tyr Phe Gln Gly Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ala Asp Asp Ser Gly

20

<210> 379

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 379

Leu Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg

1 5 10 15

Asn Val Arg Phe

20

<210> 380

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 380

Gln Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile

1 5 10 15

Gly Glu Gly Lys

20

<210> 381

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 381

Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu

1 5 10 15

Asp Pro Phe Tyr

20

<210> 382

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 382

Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp

1 5 10 15

Gln Asp Gly Asp

20

<210> 383

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 383

Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln

1 5 10 15

Glu Glu Ala Ala

20

<210> 384

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 384

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro

1 5 10 15

Met Ala Arg Arg

20

<210> 385

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 385

Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys

1 5 10 15

Leu Gly Lys

<210> 386

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 386

Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe

1 5 10 15

Thr Cys Phe Phe

20

<210> 387

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 387

Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp Gln Ala Pro Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Arg Thr Glu

20

<210> 388

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 388

Leu Met Trp Ala Lys Ile Gly Pro Val

1 5

<210> 389

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 389

Ser Leu Leu Leu Glu Leu Glu Glu Val

1 5

<210> 390

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 390

Val Leu Phe Ser Ser Asp Phe Arg Ile

1 5

<210> 391

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 391

Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys

1 5 10

<210> 392

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 392

Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro

1 5 10

<210> 393

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 393

Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His

1 5 10

<210> 394

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 394

Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu

1 5 10

<210> 395

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 395

Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly Val Leu Val

1 5 10

<210> 396

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 396

Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro

1 5 10

<210> 397

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 397

Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser

1 5 10

<210> 398

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 398

Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro

1 5 10

<210> 399

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 399

Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val

1 5 10

<210> 400

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 400

Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val Gly Asp

1 5 10

<210> 401

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 401

Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu

1 5 10

<210> 402

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 402

Ile Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro

1 5 10

<210> 403

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 403

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly

1 5 10 15

Arg Gly Leu

<210> 404

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 404

Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu

1 5 10

<210> 405

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 405

Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr

1 5 10

<210> 406

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 406

Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly

1 5 10 15

Ile Leu Asp

<210> 407

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 407

Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys

1 5 10

<210> 408

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 408

Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn

1 5 10

<210> 409

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 409

Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp

1 5 10 15

Gly Ala Glu

<210> 410

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 410

Gln Asp Gly Asp Gln Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg

1 5 10

<210> 411

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 411

Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg

1 5 10

<210> 412

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 412

Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser

1 5 10 15

Ala His Lys

<210> 413

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 413

Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp Gln Ala Pro

1 5 10

<210> 414

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 414

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro

1 5 10 15

Met Ala Arg

<210> 415

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 415

Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val

1 5 10 15

Val His Phe

<210> 416

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 416

Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly

1 5 10

<210> 417

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 417

Ser Ser Tyr Ala Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro

1 5 10

<210> 418

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 418

Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5

<210> 419

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 419

Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly

1 5 10

<210> 420

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 420

Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu

1 5 10

<210> 421

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 421

Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val

1 5 10

<210> 422

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 422

Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp

1 5 10

<210> 423

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 423

Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5

<210> 424

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 424

Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe

1 5 10

<210> 425

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 425

Ala Ala Met Glu Leu

1 5

<210> 426

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 426

Ala Asp Ala Arg Met

1 5

<210> 427

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 427

Ala His Arg Glu Thr

1 5

<210> 428

<211> 15

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 428

Ala Leu Ala Val Leu His Phe Tyr Pro Asp Lys Gly Ala Lys Asn

1 5 10 15

<210> 429

<211> 21

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 429

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Thr Tyr Glu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Gln Arg Gly

20

<210> 430

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 430

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Arg Gln Arg Gly

20

<210> 431

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 431

Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg

1 5 10 15

Asp Thr Gly Ile Leu

20

<210> 432

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 432

Asp Phe Ala Arg Val His Phe Ile Arg Ala Leu His Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 433

<211> 15

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 433

Asp Phe Ala Arg Val His Phe Ile Ser Ala Leu His Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 434

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 434

Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys

1 5 10 15

Asp Thr Asp Lys Gly

20

<210> 435

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 435

Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys

1 5 10 15

Met Lys Glu Lys Gly

20

<210> 436

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 436

Gly Asn Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser

1 5 10 15

Ser Glu Leu Asn

20

<210> 437

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 437

Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg

1 5 10 15

Gln Arg Gly

<210> 438

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 438

Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly

1 5 10 15

<210> 439

<211> 18

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 439

Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 440

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 440

His Arg Thr Phe Glu

1 5

<210> 441

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 441

His Ser Tyr Gln Glu

1 5

<210> 442

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 442

Lys Thr Gly Gln Phe Leu

1 5

<210> 443

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 443

Lys Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly

1 5 10 15

His Asp Thr Val Ser

20

<210> 444

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 444

Leu Val Lys Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp

1 5 10 15

Met Asp His Glu

20

<210> 445

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 445

Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser

1 5 10 15

<210> 446

<211> 24

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 446

Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser Gly Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Glu Asn Pro Val Val

20

<210> 447

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 447

Pro Lys Ser Gly His Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly

1 5 10 15

Gln Gly

<210> 448

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 448

Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Ala Leu

<210> 449

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 449

Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp

1 5 10 15

Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser

20 25 30

Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly

35 40

<210> 450

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 450

Gln Ala Pro Glu Tyr

1 5

<210> 451

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium

<400> 451

Gln Arg Cys Arg Val His Phe Leu Arg Asn Val Leu Ala Gln Val

1 5 10 15

<210> 452

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 452

Gln Arg Cys Arg Val His Phe Met Arg Asn Leu Tyr Thr Ala Val

1 5 10 15

<210> 453

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 453

Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg

1 5 10 15

Phe Ser Gly

<210> 454

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 454

Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys

1 5 10 15

<210> 455

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 455

Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser Pro

1 5 10 15

Met Ala Arg Arg

20

<210> 456

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 456

Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu

1 5 10 15

Ile Ile Asn Glu Thr

20

<210> 457

<211> 19

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 457

Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Lys Pro Gly Phe

1 5 10 15

Gly Tyr Gly

<210> 458

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 458

Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg

1 5 10 15

Ala

<210> 459

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 459

Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln

1 5 10 15

Tyr Tyr Glu Glu

20

<210> 460

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 460

Thr Ser Gly Val Thr Gln Ser Pro His Thr Leu Ile Lys Thr Arg Gly

1 5 10 15

Gln Gln Val Thr Leu Arg

20

<210> 461

<211> 15

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<400> 461

Val Leu Ala Arg Leu His Phe Tyr Arg Asn Asp Val His Lys Glu

1 5 10 15

<210> 462

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 462

Val Thr Leu Arg Ile

1 5

<210> 463

<211> 20

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 463

Tyr Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro Pro

20

<210> 464

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус гриппа A

<400> 464

Tyr Arg Asn Leu Val Trp Phe Ile Lys Lys Asn Thr Arg Tyr Pro

1 5 10 15

<210> 465

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 465

Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala His Tyr Gly

20

<210> 466

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 466

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala

1 5 10 15

Gln Gly Thr Leu

20

<210> 467

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 467

Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg

1 5 10 15

His Arg Asp Thr Gly Ile Leu

20

<210> 468

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 468

Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser

1 5 10 15

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

20 25 30

His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe

35 40 45

<210> 469

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 469

Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg

1 5 10 15

Thr Ala His

<210> 470

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 470

Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys

1 5 10 15

Gly Phe

<210> 471

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 471

His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys

1 5 10 15

<210> 472

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 472

Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Lys Asp Ser

20

<210> 473

<211> 12

<212> PRT

<213> Cavia porcellus

<400> 473

Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly

1 5 10

<210> 474

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 474

Leu Cys Asn Met Tyr Lys Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala

1 5 10 15

His Tyr Gly Ser

20

<210> 475

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 475

Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Lys

20

<210> 476

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 476

Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser

<210> 477

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 477

Leu Pro Ser His Ala Arg Ser Gln Pro Gly Leu Cys Asn Met Tyr Lys

1 5 10 15

Lys Asp Ser His

20

<210> 478

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 478

Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe

1 5 10 15

Gly Gly Asp

<210> 479

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 479

Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Ala Glu Gly Gln Arg

1 5 10 15

Pro Gly Phe Gly

20

<210> 480

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 480

Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys Pro

1 5 10 15

Gly Arg Ser Pro

20

<210> 481

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 481

Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val

1 5 10 15

Val His Phe Phe

20

<210> 482

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 482

Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

1 5 10 15

Pro Arg Thr Pro

20

<210> 483

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 483

Thr Gln Asp Gln Asp Pro Asx Asx His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 484

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 484

Val Pro Trp Leu Lys Pro Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser His Ala Arg

1 5 10 15

Ser Gln Pro Gly

20

<210> 485

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 485

Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly

20

<210> 486

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 486

Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala His Tyr

<210> 487

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 487

Ala Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly

20 25

<210> 488

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 488

Asp Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10

<210> 489

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 489

Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr

1 5 10 15

Lys Ser Ala

<210> 490

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 490

Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly

1 5 10 15

Lys Gly Arg

<210> 491

<211> 43

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 491

Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser

1 5 10 15

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

20 25 30

His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val

35 40

<210> 492

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 492

Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro

1 5 10

<210> 493

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 493

Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro

1 5 10 15

Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys

20 25 30

Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln

35 40

<210> 494

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 494

Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val

1 5 10 15

Asp Ala Gln

<210> 495

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 495

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

1 5 10 15

His

<210> 496

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 496

Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Lys Asp

<210> 497

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 497

Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe

1 5 10 15

Lys Leu Gly

<210> 498

<211> 24

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 498

Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly

1 5 10 15

Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe

20

<210> 499

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 499

Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His

1 5 10 15

Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln

20 25

<210> 500

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 500

Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr

1 5

<210> 501

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 501

Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Tyr

<210> 502

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 502

Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 503

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 503

Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe

1 5 10 15

Ser Trp Gly

<210> 504

<211> 33

<212> PRT

<213> Oryctolagus cuniculus

<400> 504

Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Thr Val Leu Ser Arg Phe

1 5 10 15

Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Lys Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg

20 25 30

Ala

<210> 505

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 505

Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg

<210> 506

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 506

Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln

20

<210> 507

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 507

Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp

1 5 10 15

Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

20 25

<210> 508

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 508

Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys

1 5 10 15

Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His

20 25

<210> 509

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 509

Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg

1 5 10 15

Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser

20 25

<210> 510

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 510

Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser

1 5 10 15

Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg

20 25 30

<210> 511

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 511

Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly

1 5 10 15

Gly Asp Arg

<210> 512

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 512

Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr

1 5 10 15

Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn

20 25

<210> 513

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 513

Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val

1 5 10 15

Val

<210> 514

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 514

Ser Ser Leu Gly Arg Ala Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly

1 5 10 15

<210> 515

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 515

Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg His

1 5 10 15

Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly

20 25 30

<210> 516

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 516

Ala His Ser Leu Glu Arg Val Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly

1 5 10 15

His Pro Asp Lys Phe

20

<210> 517

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 517

Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Thr

20

<210> 518

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 518

Cys Asn Met Tyr Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala

1 5 10

<210> 519

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 519

Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Ser

1 5 10 15

Leu Cys Ala Asp

20

<210> 520

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 520

Asp Gln Ala Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala

1 5 10 15

Ile Gly Glu Gly Lys

20

<210> 521

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 521

Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gly Gly Phe Thr

20

<210> 522

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 522

Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Val Ser Pro Gly Val Leu

1 5 10 15

Val Leu Leu Ala Val

20

<210> 523

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 523

Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg Ile Ser Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly

1 5 10 15

Met Glu Val Gly Trp

20

<210> 524

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 524

Glu Tyr Leu Ile Asn Val Ile His Ala Phe Gln Tyr Val Ile Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Ala Ser Phe Phe

20

<210> 525

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 525

Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr

1 5 10 15

Gly Thr Glu Lys Leu

20

<210> 526

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 526

Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val Pro

1 5 10 15

Trp Leu Lys

<210> 527

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 527

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

1 5 10 15

Gly Gly Arg Asp Ser

20

<210> 528

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 528

Phe Met Ile Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly

1 5 10 15

Arg Gly Thr Lys Phe

20

<210> 529

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 529

Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala

<210> 530

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 530

Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ala Ser Asp Tyr

20

<210> 531

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 531

Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg

1 5 10 15

Thr Ala His Tyr

20

<210> 532

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 532

Gly Cys Gly His Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys Leu Ile Glu Thr

1 5 10 15

Tyr Phe Ser Lys Asn

20

<210> 533

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 533

Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly

1 5 10 15

Arg Phe Phe Gly Gly

20

<210> 534

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 534

Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Ala

1 5 10 15

Met Glu Leu Lys Val

20

<210> 535

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 535

Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys

1 5 10 15

Thr Thr Ile Cys Gly

20

<210> 536

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 536

Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala

1 5 10 15

Pro Lys Arg Gly Ser

20

<210> 537

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 537

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Glu Val Glu

20

<210> 538

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 538

Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His Ser Leu Glu Arg Val

1 5 10 15

Cys His Cys Leu Gly

20

<210> 539

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 539

Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser His Ala Arg Ser Gln Pro Gly Leu Cys

1 5 10 15

Asn Met Tyr Lys Asp

20

<210> 540

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 540

Gly Val Leu Pro Trp Asn Ala Phe Pro Gly Lys Val Cys Gly Ser Asn

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ile

20

<210> 541

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 541

His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile

1 5 10 15

Thr Tyr Ala Leu Thr

20

<210> 542

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 542

His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg

1 5 10 15

His Gly Phe Leu

20

<210> 543

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 543

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu

1 5 10

<210> 544

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 544

His Pro Ile Arg Ala Leu Val Gly Asp Glu Val Glu Leu Pro Cys Arg

1 5 10 15

Ile Ser Pro Gly Lys

20

<210> 545

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 545

Ile Thr Val Gly Leu Val Phe Leu Cys Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly

1 5 10 15

Lys Leu Arg Ala Glu

20

<210> 546

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 546

Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Pro Gly Phe

20

<210> 547

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 547

Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Gln Lys Gly Arg Gly

20

<210> 548

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 548

Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys

1 5 10 15

Arg Gly Ser Gly Lys Asp

20

<210> 549

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 549

Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu Ile Glu Asn Leu

1 5 10 15

His Arg Thr Phe Asp

20

<210> 550

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 550

Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg Asp Ser Arg Ser Gly Ser

1 5 10 15

Pro Met Ala Arg Arg

20

<210> 551

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 551

Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala Glu Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala

1 5 10 15

Val Arg Gln Ile Phe

20

<210> 552

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 552

Met Tyr Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Pro Gln Lys Ser

20

<210> 553

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 553

Pro Gly Phe Gly Tyr Gly Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His

1 5 10 15

Lys Gly Phe Lys Gly

20

<210> 554

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 554

Pro Gly Lys Asn Ala Thr Gly Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro

1 5 10 15

Phe Ser Arg Val Val

20

<210> 555

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 555

Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala

1 5 10 15

<210> 556

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 556

Pro Lys Arg Gly Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys Pro Gly Arg Ser

1 5 10 15

<210> 557

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 557

Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His

1 5 10 15

Phe Phe Lys Asn Ile

20

<210> 558

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 558

Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Arg Phe Ser Trp

20

<210> 559

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 559

Arg Ala Glu Ile Glu Asn Leu His Arg Thr Phe Asp Pro His Phe Leu

1 5 10 15

Arg Val Pro Cys Trp

20

<210> 560

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 560

Arg Asn Val Arg Phe Ser Asp Glu Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg

1 5 10 15

Asp His Ser Tyr Gln

20

<210> 561

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 561

Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln

1 5 10 15

Gly Thr Leu Ser Lys

20

<210> 562

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 562

Ser Gly Lys Val Pro Trp Leu Lys Pro Gly Arg Ser Pro Leu Pro Ser

1 5 10 15

His Ala Arg Ser Gln

20

<210> 563

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 563

Ser Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly

1 5 10

<210> 564

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 564

Ser Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly Val Leu Pro Trp Asn Ala

1 5 10 15

Phe Pro Gly Lys Val

20

<210> 565

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 565

Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Ala Met Glu Leu Lys Val Glu Asp Pro Phe

1 5 10 15

Tyr Trp Val Ser

20

<210> 566

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 566

Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile Gly Glu Gly Lys Val Thr Leu Arg

1 5 10 15

Ile Arg Asn Val Arg

20

<210> 567

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 567

Thr Phe Asp Pro His Phe Leu Arg Val Pro Cys Trp Lys Ile Thr Leu

1 5 10 15

Phe Val Ile Val

20

<210> 568

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 568

Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Ala Glu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Pro Gly Phe Gly

20

<210> 569

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 569

Val Ala Leu Ile Ile Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly

1 5 10 15

Gln Phe Leu Glu Glu

20

<210> 570

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 570

Val Phe Ala Cys Ser Ala Val Pro Val Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp

1 5 10 15

Thr Thr Cys Gln Ser

20

<210> 571

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 571

Val Ile Val Pro Val Leu Gly Pro Leu Val Ala Leu Ile Ile Cys Tyr

1 5 10 15

Asn Trp Leu His Arg

20

<210> 572

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 572

Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Ile Asn Val Ile

1 5 10 15

His Ala Phe Gln Tyr

20

<210> 573

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 573

Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro

1 5 10 15

Ser Lys Thr Ser Ala

20

<210> 574

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 574

Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly Gln Phe Leu Glu Glu Leu

1 5 10 15

Arg Asn Pro Phe

20

<210> 575

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 575

Tyr Arg Asn Gly Lys Asp Gln Asp Gly Asp Gln Ala Pro Glu Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Arg Thr Glu Leu

20

<210> 576

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 576

Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Val Ser Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Met Ile Ala Ala Thr Tyr Asn Phe Ala Val Leu Lys Leu Met Gly Arg

20 25 30

<210> 577

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 577

Ala Cys Ser Ala Val Thr Val Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp

1 5 10

<210> 578

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 578

Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala

1 5 10 15

Gln Gly Thr

<210> 579

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 579

Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala

20

<210> 580

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 580

Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly Lys Gly Leu Ser Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

<210> 581

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 581

Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys Gly Cys Glu Val Glu Ala Leu Thr Gly

1 5 10 15

Thr Glu Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp

20 25 30

<210> 582

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 582

Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu

1 5 10 15

Gly Gly Arg

<210> 583

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 583

Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Ile Asn Val

1 5 10

<210> 584

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 584

Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln

1 5 10 15

Gly Glu Val

<210> 585

<211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 585

Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala Arg His

1 5 10 15

Gly Phe Leu Pro Arg His Arg Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly

20 25 30

Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly

35 40

<210> 586

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 586

Gly Thr Ala Ser Phe Phe Phe Leu Tyr Gly Ala Leu Leu Leu Ala Tyr

1 5 10 15

Gly Phe Tyr Thr Thr Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys

20 25 30

<210> 587

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 587

His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser

1 5 10 15

His Gly Arg

<210> 588

<211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 588

Ile Gly Arg Phe Phe Gly Gly Asp Arg Gly Ala Pro Lys Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Lys Asp Ser His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr

20 25

<210> 589

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 589

Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His Gln Ala His Ser Leu Glu Arg

1 5 10 15

Val Cys His Cys Leu Gly Cys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val

20 25 30

<210> 590

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 590

Lys Val Cys Gly Ser Asn Leu Leu Ser Ile Cys Lys Thr Ala Glu Phe

1 5 10 15

Gln Met Thr Phe His Leu Phe Ile Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala Ala

20 25 30

<210> 591

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 591

Leu Phe Ile Ala Ala Phe Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Val Ser

1 5 10 15

<210> 592

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 592

Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly Ile Thr Tyr Ala Leu Thr Val

1 5 10 15

Val Trp Leu Leu Val Phe Ala Cys Ser Ala Val Pro Val Tyr Ile Tyr

20 25 30

<210> 593

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 593

Leu Leu Glu Cys Cys Ala Arg Cys Leu Val Gly Ala Pro Phe Ala Ser

1 5 10 15

Leu Val Ala Thr Gly Leu Cys Phe Phe Gly Val Ala Leu Phe Cys

20 25 30

<210> 594

<211> 35

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 594

Pro Trp Asn Ala Phe Pro Gly Lys Val Cys Gly Ser Asn Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Cys Lys Thr Ala Glu Phe Gln Met Thr Phe His Leu Phe Ile Ala

20 25 30

Ala Phe Val

35

<210> 595

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 595

Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro Pro

20

<210> 596

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 596

Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Cys Gly Lys Gly Leu Ser

1 5 10 15

Ala Thr Val Thr Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln

20 25 30

<210> 597

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 597

Ser Ala Ser Ile Gly Thr Leu Cys Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly Val

1 5 10 15

Leu Pro Trp Asn Ala Phe Phe Gly Lys Val Cys Gly Ser Asn Leu Leu

20 25 30

<210> 598

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 598

Ser Ala Val Pro Val Tyr Ile Tyr Phe Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln

1 5 10 15

Ser Ile Ala Ala Pro Cys Lys Thr Ser Ala Ser Ile Gly Thr Leu Cys

20 25 30

<210> 599

<211> 15

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 599

Thr Val Thr Gly Gly Gln Lys Gly Arg Gly Ser Arg Gly Gln His

1 5 10 15

<210> 600

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 600

Tyr Phe Ser Lys Asn Tyr Gln Asp Tyr Glu Tyr Leu Ile Asn Val Ile

1 5 10 15

His Ala Phe Gln Tyr Val Ile Tyr Gly Thr Ala Ser Phe Phe Phe Leu

20 25 30

<210> 601

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 601

Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10

<210> 602

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 602

Lys Val Glu Asp Pro Phe Tyr Trp Val

1 5

<210> 603

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 603

Pro Thr Arg Ala Pro Ser Gly Pro Arg Pro Pro

1 5 10

<210> 604

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 604

Arg Arg Arg Glu Gly Pro Asp Arg Ser Pro Arg

1 5 10

<210> 605

<211> 15

<212> PRT

<213> Аденовирус человека

<400> 605

Asp Phe Glu Val Val Thr Phe Leu Lys Asp Val Leu Pro Glu Phe

1 5 10 15

<210> 606

<211> 15

<212> PRT

<213> Pseudomonas aeruginosa

<400> 606

Asp Arg Leu Leu Met Leu Phe Ala Lys Asp Val Val Ser Arg Asn

1 5 10 15

<210> 607

<211> 15

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> эпитоп, связанный с рассеянным склерозом

<400> 607

Glu Asn Pro Val Val His Tyr Phe Arg Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 608

<211> 15

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 608

Phe Arg Gln Leu Val His Phe Val Arg Asp Phe Ala Gln Leu Leu

1 5 10 15

<210> 609

<211> 13

<212> PRT

<213> Вирус простого герпеса

<400> 609

Gly Gly Arg Arg Leu Phe Phe Val Lys Ala His Val Arg

1 5 10

<210> 610

<211> 15

<212> PRT

<213> Ортореовирус млекопитающих

<400> 610

Met Ala Arg Ala Ala Phe Leu Phe Lys Thr Val Gly Phe Gly Gly

1 5 10 15

<210> 611

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 611

Lys Leu Ile Glu Thr Tyr Phe Ser Lys

1 5

<210> 612

<211> 9

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 612

Lys Leu Val Glu Thr Tyr Ile Ser Lys

1 5

<210> 613

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 613

Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu Leu Phe Tyr Ser Ile Gly Ile Asp

1 5 10 15

Gln Ile Ser Ser Glu

20

<210> 614

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 614

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala

1 5 10 15

Gln Pro Asp Lys Ser

20

<210> 615

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 615

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala

1 5 10 15

Gln Gln Asp Lys Ser

20

<210> 616

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 616

Ala Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala

1 5 10 15

Gln Leu Asp Lys Ser

20

<210> 617

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 617

Asp Leu Gly His Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Gln

1 5 10 15

Asp Thr Asn Lys Gly

20

<210> 618

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 618

Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly

1 5 10 15

Thr Thr Gly Lys Gly

20

<210> 619

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 619

Asp Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly

1 5 10 15

Glu Leu Thr Ser Asn

20

<210> 620

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 620

Asp Pro Gly Lys Gly Pro Glu Phe Leu Phe Thr Leu Tyr Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Glu Lys Glu Lys

20

<210> 621

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 621

Asp Pro Gly Lys Ser Leu Glu Ser Leu Phe Val Leu Leu Ser Asn Gly

1 5 10 15

Ala Val Lys Gln Glu

20

<210> 622

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 622

Asp Pro Gly Met Glu Leu His Leu Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Asn

1 5 10 15

Ser Thr Glu Lys Gly

20

<210> 623

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 623

Asp Pro Gly Met Gly Leu Lys Leu Ile Tyr Tyr Ser Val Gly Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Asp Lys Gly

20

<210> 624

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 624

Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Asp Gln Gly

20

<210> 625

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 625

Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Glu Gly

1 5 10 15

Thr Thr Ala Lys Gly

20

<210> 626

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 626

Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Arg Ile His Tyr Ser Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Asp Lys Gly

20

<210> 627

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 627

Asp Pro Gly Arg Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ile Arg Glu Asn Glu

1 5 10 15

Lys Glu Lys Arg Lys

20

<210> 628

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 628

Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu

1 5 10 15

Leu Ile Ile Asn Glu

20

<210> 629

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 629

Asp Thr Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Thr Ile Met Thr Phe Ser Glu

1 5 10 15

Asn Thr Lys Ser Asn

20

<210> 630

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 630

Glu Lys Lys Ala Pro Thr Phe Leu Phe Met Leu Thr Ser Ser Gly Ile

1 5 10 15

Glu Lys Lys Ser

20

<210> 631

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 631

Glu Leu Gly Lys Gly Pro Gln Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val

1 5 10 15

Gly Glu Lys Lys Asp

20

<210> 632

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 632

Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val

1 5 10 15

Gly Glu Lys Lys Asp

20

<210> 633

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 633

Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met

1 5 10 15

Asp Met Lys Gln Asp

20

<210> 634

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 634

Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr Val Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Glu Val Lys Lys Leu

20

<210> 635

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 635

Glu Ser Gly Lys Gly Pro Gln Phe Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Met

1 5 10 15

Asp Lys Arg Gln Gly

20

<210> 636

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 636

Glu Thr Ala Lys Thr Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly

1 5 10 15

Asp Glu Lys Lys Lys

20

<210> 637

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 637

Phe Pro Gly Cys Ala Pro Arg Leu Leu Val Lys Gly Ser Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Gln

<210> 638

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 638

Phe Pro Gly Lys Gly Pro Ala Leu Leu Ile Ala Ile Arg Pro Asp Val

1 5 10 15

Ser Glu Lys Lys Glu

20

<210> 639

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 639

Phe Pro Lys Lys Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Thr Tyr Glu Gln

20

<210> 640

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 640

Phe Pro Lys Lys Ser Leu Met Gln Ile Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Thr Tyr Glu Gln

20

<210> 641

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 641

Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Thr Tyr Glu Gln

20

<210> 642

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 642

Phe Pro Ser Gln Gly Pro Arg Phe Ile Ile Gln Gly Tyr Lys Thr Lys

1 5 10 15

Val Thr Asn

<210> 643

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 643

Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu Lys Met

1 5 10 15

Gln Ser Asp Lys Gly

20

<210> 644

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 644

His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly

1 5 10 15

Leu Glu Glu Lys

20

<210> 645

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 645

His Asp Gly Gly Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr Asn Gly Leu Asp Gly

1 5 10 15

Leu Glu Glu Thr

20

<210> 646

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 646

His Pro Ala Gly Ala Ile Val Ser Leu Phe Met Leu Ser Ser Gln Lys

1 5 10 15

Lys Lys His

<210> 647

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 647

His Pro Asn Lys Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Ala Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Lys Gly Ile

20

<210> 648

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 648

Ile His Ser Gln Gly Pro Gln Tyr Ile Ile His Gly Leu Lys Asn Asn

1 5 10 15

Glu Thr Asn

<210> 649

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 649

Ile Leu Gly Gln Lys Val Glu Phe Leu Val Ser Phe Tyr Asn Asn Glu

1 5 10 15

Ile Ser Glu Lys Ser

20

<210> 650

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 650

Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys

1 5 10 15

Leu Ser Ile Asn Glu

20

<210> 651

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 651

Lys His Gly Glu Ala Pro Val Phe Leu Met Ile Leu Leu Lys Gly Gly

1 5 10 15

Glu Gln Lys Gly His

20

<210> 652

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 652

Lys His Gly Glu Ala Pro Val Phe Leu Met Ile Leu Leu Lys Gly Gly

1 5 10 15

Glu Gln Met Arg Arg

20

<210> 653

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 653

Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Phe Leu Val Tyr Phe Gln Asn Glu Glu

1 5 10 15

Leu Ile Gln Lys Ala

20

<210> 654

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 654

Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp

1 5 10 15

Phe Asn Asn Glu Ala

20

<210> 655

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 655

Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His Tyr Tyr Asn Lys Asp

1 5 10 15

Phe Asn Asn Glu Ala

20

<210> 656

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 656

Lys Tyr Gly Glu Gly Leu Ile Phe Leu Met Met Leu Gln Lys Gly Gly

1 5 10 15

Glu Glu Lys Ser His

20

<210> 657

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 657

Leu Pro Ser Gln Gly Pro Glu Tyr Val Ile His Gly Leu Thr Ser Asn

1 5 10 15

Val Asn Asn

<210> 658

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 658

Asn Pro Trp Gly Gln Leu Ile Asn Leu Phe Tyr Ile Pro Ser Gly Thr

1 5 10 15

Lys Gln Asn

<210> 659

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 659

Asn Gln Asn Lys Glu Phe Met Leu Leu Ile Ser Phe Gln Asn Glu Gln

1 5 10 15

Val Leu Gln Glu Thr

20

<210> 660

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 660

Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu

1 5 10 15

Arg Glu Lys His Ser

20

<210> 661

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 661

Pro Pro Ser Gly Glu Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp

1 5 10 15

Glu Gln Asn Glu Ile Ser

20

<210> 662

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 662

Pro Pro Ser Arg Gln Met Ile Leu Val Ile Arg Gln Glu Ala Tyr Lys

1 5 10 15

Gln Gln Asn Ala Thr Glu

20

<210> 663

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 663

Pro Ser Ser Gly Glu Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp

1 5 10 15

Glu Gln Asn Ala Thr Glu

20

<210> 664

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 664

Arg Pro Gly Gly His Pro Val Phe Leu Ile Gln Leu Val Lys Ser Gly

1 5 10 15

Glu Val Lys Lys Gln

20

<210> 665

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 665

Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Asn Phe Lys Glu

1 5 10 15

Gln Thr Glu Asn Asn

20

<210> 666

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 666

Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu

1 5 10 15

Arg Val Glu Asn Asn

20

<210> 667

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 667

Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile His Tyr Tyr Asn Gly Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Lys Gly

20

<210> 668

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 668

Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu

1 5 10 15

Glu Arg Ala Lys Gly

20

<210> 669

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 669

Thr Leu Glu Glu Glu Leu Lys Phe Phe Ile Tyr Phe Gln Asn Glu Glu

1 5 10 15

Ile Ile Gln Lys Ala

20

<210> 670

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 670

Thr Leu Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Thr

1 5 10 15

Gln Arg Asn Lys Gly

20

<210> 671

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 671

Thr Leu Gly Gln Gly Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Gln Asn Glu Ala

1 5 10 15

Gln Leu Glu Lys Ser

20

<210> 672

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 672

Val Phe Leu Cys Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 673

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 673

Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu

1 5 10 15

Glu Arg Gly Arg Gly

20

<210> 674

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 674

Val Leu Lys Asn Glu Phe Lys Phe Leu Val Ser Phe Gln Asn Glu Asn

1 5 10 15

Val Phe Asp Glu Thr

20

<210> 675

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 675

Val Met Gly Lys Glu Ile Lys Phe Leu Leu His Phe Val Lys Glu Ser

1 5 10 15

Lys Gln Asp Glu Ser

20

<210> 676

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 676

Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys

1 5 10 15

Asp Lys Asn Glu Asp

20

<210> 677

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 677

Tyr Pro Gly Glu Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Ala Thr Lys Ala Asp

1 5 10 15

Asp Lys Gly Ser Asn

20

<210> 678

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 678

Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Leu Ser Gly Ser

1 5 10 15

Thr Leu Val Glu Ser Ile

20

<210> 679

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 679

Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Leu Ser Gly Ser

1 5 10 15

Thr Leu Val Lys Gly Ile

20

<210> 680

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 680

Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Ala Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Lys Gly Ile

20

<210> 681

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 681

Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Ser Gly Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Lys Gly Ile

20

<210> 682

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 682

Tyr Pro Asn Gln Gly Leu Gln Leu Leu Leu Lys Tyr Thr Thr Gly Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Lys Gly Ile

20

<210> 683

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 683

Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe Leu Leu Lys Tyr Ile Thr Gly Asp

1 5 10 15

Asn Leu Val Lys Gly Ser

20

<210> 684

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 684

Tyr Pro Ser Lys Pro Leu Gln Leu Leu Gln Arg Glu Thr Met Glu Asn

1 5 10 15

Ser

<210> 685

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 685

Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly

1 5 10 15

Asp Lys Glu Asp

20

<210> 686

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 686

Tyr Ser Arg Gln Arg Leu Gln Leu Leu Leu Arg His Ile Ser Arg Glu

1 5 10 15

Ser Ile

<210> 687

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 687

Ala Asp Ala Arg Met Tyr Gly Val

1 5

<210> 688

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 688

Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly

1 5 10 15

Gly Arg Arg Lys

20

<210> 689

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 689

Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Pro

20

<210> 690

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 690

Glu Ala Leu Thr Gly Thr Glu Lys

1 5

<210> 691

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 691

Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ala

20

<210> 692

<211> 31

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 692

Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly

1 5 10 15

Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp

20 25 30

<210> 693

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 693

Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ala Asp

20

<210> 694

<211> 29

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 694

Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln

1 5 10 15

Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly

20 25

<210> 695

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 695

Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Arg His

1 5 10 15

Arg Asp Gly Val

20

<210> 696

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 696

Gly Asn Gly Leu Gly Glu Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly

20

<210> 697

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 697

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

1 5 10 15

Tyr His Gln Glu

20

<210> 698

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 698

Gly Ser Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg

1 5 10 15

Pro Ser Cys Ile

20

<210> 699

<211> 30

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 699

Gly Ser Gly Pro Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg

1 5 10 15

Pro Ser Cys Ile Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly

20 25 30

<210> 700

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 700

His Ala Arg His Gly Phe Leu Pro Arg

1 5

<210> 701

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 701

Ile Ile Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg

1 5

<210> 702

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 702

Lys Leu Arg Ala Glu Ile Glu Asn Leu

1 5

<210> 703

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 703

Lys Gln Arg Ile Lys Ser Gln Glu Arg

1 5

<210> 704

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 704

Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser Lys

1 5 10

<210> 705

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 705

Leu Leu Ala Val Leu Pro Val Leu Leu Leu

1 5 10

<210> 706

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 706

Leu Leu Glu Cys Cys Ala Arg Cys Leu

1 5

<210> 707

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 707

Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu

1 5

<210> 708

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 708

Leu Arg Ile Arg Asn Val Arg Phe

1 5

<210> 709

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 709

Leu Arg Lys Phe Ser Ser Leu Cys Tyr

1 5

<210> 710

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 710

Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu

1 5 10 15

Lys Gly Asp Thr

20

<210> 711

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 711

Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro

1 5 10 15

Ser Thr Gly Pro

20

<210> 712

<211> 7

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 712

Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro

1 5

<210> 713

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 713

Pro Gln Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

1 5 10 15

Arg Gly Arg Gly

20

<210> 714

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 714

Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Pro Gly Gly Ser

20

<210> 715

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 715

Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile Gly Cys Lys Gly Thr His

1 5 10 15

Gly Gly Thr Gly

20

<210> 716

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 716

Arg Thr Glu Leu Leu Lys Asp Ala Ile

1 5

<210> 717

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 717

Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys

1 5 10

<210> 718

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 718

Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln Arg Arg Gly Gly

1 5 10 15

Asp Asn His Gly

20

<210> 719

<211> 20

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 719

Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro Phe Phe

1 5 10 15

His Pro Val Gly

20

<210> 720

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 720

Ser Leu Asp Val Met Ala Ser Gln Lys

1 5

<210> 721

<211> 36

<212> PRT

<213> Вирус герпеса человека

<400> 721

Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro

1 5 10 15

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

20 25 30

Tyr His Gln Glu

35

<210> 722

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 722

Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln

1 5

<210> 723

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 723

Leu Ser Leu Ser Arg Phe Ser Trp Gly Ala Glu Gly Gln Arg Pro Gly

1 5 10 15

Phe Gly Tyr Gly

20

<210> 724

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 724

Ala Ala His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu

1 5 10 15

Asp Lys Phe

<210> 725

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 725

Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His

1 5 10 15

<210> 726

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 726

Ala Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Arg Ile

1 5 10

<210> 727

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 727

Ala Gly Glu Tyr Asp His Leu Pro Glu Gln Ala Phe

1 5 10

<210> 728

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 728

Ala Leu Met Glu Gly Gly Glu Asn Gly Pro Trp

1 5 10

<210> 729

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 729

Ala Leu Met Leu Ala Ile Ser His Gly Arg Gln

1 5 10

<210> 730

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 730

Ala Leu Tyr Ser Gly Val His Lys Lys

1 5

<210> 731

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 731

Ala Gln Val Ile Ile Leu Asn His Pro Gly Gln Ile Ser Ala Gly

1 5 10 15

<210> 732

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 732

Ala Arg Lys Leu Ile Gly Asp Pro Asn Leu Glu Phe

1 5 10

<210> 733

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 733

Ala Ser Ser Ser Val Leu Ser Ser Pro Ala

1 5 10

<210> 734

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 734

Ala Ser Val Asp Leu Lys Asn Thr Gly Arg Glu Glu Phe

1 5 10

<210> 735

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 735

Ala Ser Val Asp Leu Lys Asn Thr Gly Arg Glu Glu Phe Leu

1 5 10

<210> 736

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 736

Ala Ser Val Asp Leu Lys Asn Thr Gly Arg Glu Glu Phe Leu Thr Ala

1 5 10 15

<210> 737

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 737

Ala Thr Ala Leu Pro Thr Gly Thr Ser Lys

1 5 10

<210> 738

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 738

Ala Thr Ala Asn Gln Ile Ile Leu Lys

1 5

<210> 739

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 739

Ala Thr Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys

1 5

<210> 740

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 740

Ala Thr Val Ala Gly Val His Val Lys

1 5

<210> 741

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 741

Ala Thr Val Arg Gln Lys Leu Gln Asp Glu Thr Asn

1 5 10

<210> 742

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 742

Ala Thr Val Thr Pro Ser Pro Val Lys

1 5

<210> 743

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 743

Ala Val Ala Leu Pro Leu Gln Thr Lys

1 5

<210> 744

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 744

Ala Val Ile Leu Pro Pro Leu Ser Pro Tyr Phe Lys

1 5 10

<210> 745

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 745

Ala Val Gln Arg Thr Leu Leu Glu Lys

1 5

<210> 746

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 746

Ala Val Thr Asp Val Ile Ile Ala Lys

1 5

<210> 747

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 747

Ala Val Val Asp Lys Ala Ala Glu Ala Gly Gly Ala Glu Glu Gln Tyr

1 5 10 15

Gly

<210> 748

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 748

Ala Val Tyr Ser His Val Ile Gln Lys

1 5

<210> 749

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 749

Ala Trp Lys Arg Ala Glu Ala Ile Glu Ser Ser Leu

1 5 10

<210> 750

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 750

Cys Pro Leu Ser Leu Ala Ala Gln Leu Asp

1 5 10

<210> 751

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 751

Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg

1 5 10

<210> 752

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 752

Asp Glu Trp Val Lys Pro Lys Asp Met Leu Gly Pro Lys

1 5 10

<210> 753

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 753

Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val Leu Leu Gln Tyr Thr Gly

1 5 10 15

His Ile

<210> 754

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 754

Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn Asp Met Lys Val Arg Lys

1 5 10

<210> 755

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 755

Asp Leu Pro Ser Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Gly Pro

1 5 10

<210> 756

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 756

Asp Leu Pro Trp Phe Arg Thr Leu Ser Trp

1 5 10

<210> 757

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 757

Asp Leu Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Asn Asp Leu Lys

1 5 10

<210> 758

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 758

Asp Pro Pro Leu Ile Ala Leu Asp Lys Asp Ala Pro Leu Arg

1 5 10

<210> 759

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 759

Asp Thr Asp His Tyr Phe Leu Arg Tyr

1 5

<210> 760

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 760

Asp Thr Gly Ile Leu Asp Ser Ile Gly Arg Phe

1 5 10

<210> 761

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 761

Asp Val Ala Ser Val Gln Gln Gln Arg Gln Glu Gln Ser Tyr

1 5 10

<210> 762

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 762

Asp Val Gly Val Tyr Arg Ala Val Thr Pro Gln Gly Arg Pro Asp

1 5 10 15

<210> 763

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 763

Asp Val Ile Gly Asp Leu His Gln Cys Gln

1 5 10

<210> 764

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 764

Asp Val Ile Arg Leu Ile Met Gln Tyr

1 5

<210> 765

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 765

Glu Ile Ile Glu Glu Thr Lys Val Glu Asp Glu Lys

1 5 10

<210> 766

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 766

Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln Asn Cys Ser

1 5 10 15

<210> 767

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 767

Glu Leu Ile Asn Asn Glu Leu Ser His Phe

1 5 10

<210> 768

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 768

Glu Pro Gly Glu Pro Glu Phe Lys Tyr Ile Gly Asn Met His Gly Asn

1 5 10 15

Glu

<210> 769

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 769

Glu Pro Asn Ala Ile Val Ser Asp Gly Lys Tyr His Val Val Arg

1 5 10 15

<210> 770

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 770

Glu Arg Ile Ala Gly Leu Glu Gln Glu Asp

1 5 10

<210> 771

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 771

Glu Arg Thr Ala Lys Glu Leu Asp Thr Asn Thr

1 5 10

<210> 772

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 772

Glu Ser Asn Ala Ile Ile Asn Asp Gly Lys Tyr His Val Val Arg

1 5 10 15

<210> 773

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 773

Glu Thr Asp Leu Leu Asp Ile Arg Ser Glu Tyr

1 5 10

<210> 774

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 774

Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

1 5 10

<210> 775

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 775

Phe Gly Glu Ser Leu Pro Ala Arg Phe

1 5

<210> 776

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 776

Phe Gly Tyr Ser Asn Arg Val Val Asp Leu

1 5 10

<210> 777

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 777

Phe Ile Thr Ala Asp His Leu Ile Glu Lys Leu Arg Thr

1 5 10

<210> 778

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 778

Phe Leu Gly Val Ala Tyr Gly Ala Thr Arg Tyr Asn

1 5 10

<210> 779

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 779

Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe

1 5 10

<210> 780

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 780

Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val Asp

1 5 10

<210> 781

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 781

Phe Arg Asp Gln Glu Gly Gln Asp Val Leu Leu

1 5 10

<210> 782

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 782

Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

1 5 10

<210> 783

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 783

Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly

1 5 10

<210> 784

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 784

Phe Ser Glu Thr Gly Ala Gly Lys His Val Pro Arg Ala

1 5 10

<210> 785

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 785

Phe Ser Glu Thr Gly Ala Gly Lys His Val Pro Arg Ala Val Phe

1 5 10 15

<210> 786

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 786

Phe Ser Gln Phe Gly Pro Ile Glu Arg Ala

1 5 10

<210> 787

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 787

Phe Ser Val Ala Thr Val Gln Thr Thr Trp

1 5 10

<210> 788

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 788

Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe

1 5 10

<210> 789

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 789

Phe Thr Arg Ser Leu Phe Val Asn

1 5

<210> 790

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 790

Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile

1 5

<210> 791

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 791

Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys

1 5

<210> 792

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 792

Gly His Leu Tyr Arg Glu Asp Gln Thr Ser Pro Ala Pro Gly

1 5 10

<210> 793

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 793

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

1 5 10 15

<210> 794

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 794

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

1 5 10 15

Leu

<210> 795

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 795

Gly Asn Arg Ile Ala Gln Trp Gln Ser Phe Gln Leu Glu Gly

1 5 10

<210> 796

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 796

Gly Arg Thr Leu Gln Asn Thr Met Val Asn

1 5 10

<210> 797

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 797

Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp

1 5 10

<210> 798

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 798

Gly Thr Ala Asp Val His Phe Glu Arg

1 5

<210> 799

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 799

Gly Thr Phe Gly Gly Leu Gly Ser Lys

1 5

<210> 800

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 800

Gly Thr Ile Asn Ile Val His Pro Lys

1 5

<210> 801

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 801

Gly Val Ile Asp Val Ile Thr Lys Thr Trp

1 5 10

<210> 802

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 802

Gly Trp Ser Ser His Pro Pro Pro Ser Pro Cys Arg Glu Gln Glu Ile

1 5 10 15

Arg

<210> 803

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 803

His Gly Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ala Ser Thr Met Asp His Ala

1 5 10 15

<210> 804

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 804

His Ile Ile Leu Val Leu Ser Gly Lys

1 5

<210> 805

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 805

His Ser Glu Arg His Val Leu Leu Tyr

1 5

<210> 806

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 806

Ile Phe Ala Asn Ala His Thr Tyr His

1 5

<210> 807

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 807

Ile Phe Glu Lys Ser Phe Val Asn

1 5

<210> 808

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 808

Ile Ile Glu Glu Thr Lys Val Glu Asp Glu Lys

1 5 10

<210> 809

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 809

Ile Ile Tyr Lys Gly Gly Thr Ser Arg

1 5

<210> 810

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 810

Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val

1 5

<210> 811

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 811

Ile Pro Asn Lys Asn Arg Ala Glu Gln Leu

1 5 10

<210> 812

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 812

Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn

1 5 10

<210> 813

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 813

Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Val Ser

1 5 10

<210> 814

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 814

Ile Ser Lys Leu Ser Ala Lys Phe Gly Gly Gln Ala

1 5 10

<210> 815

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 815

Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg

1 5 10 15

<210> 816

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 816

Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg

1 5 10 15

Lys

<210> 817

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 817

Ile Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn Arg Val Val Asp

1 5 10 15

Leu

<210> 818

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 818

Ile Thr Ala Asn Ala Thr Glu Pro Gln Lys Ala Glu Asn

1 5 10

<210> 819

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 819

Ile Thr Gln Asn Gly Asp Tyr Gln Leu Arg Thr Gln

1 5 10

<210> 820

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 820

Ile Thr Ser Ile Val Lys Asp Ser Ser Ala Ala Arg Asn Gly

1 5 10

<210> 821

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 821

Ile Val Ala Gly Thr Leu Thr Asn Lys

1 5

<210> 822

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 822

Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly

1 5 10 15

<210> 823

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 823

Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly Arg Gly

1 5 10 15

Leu Ser

<210> 824

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 824

Ile Val Val Tyr Pro Val His Gly Phe Met Tyr

1 5 10

<210> 825

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 825

Lys Ile Ala Asp Arg Phe Leu Leu Tyr

1 5

<210> 826

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 826

Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu Tyr Asn Asn Ala Asp Gly

1 5 10 15

<210> 827

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 827

Lys Pro Arg Asp Val Ser Ser Val Glu Leu

1 5 10

<210> 828

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 828

Lys Pro Thr Ile Ser Val Lys Glu Ala Phe Tyr

1 5 10

<210> 829

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 829

Lys Ser Ala Ile Glu Gly Ile Lys Tyr Ile Ala Glu Thr Met Lys Ser

1 5 10 15

Asp

<210> 830

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 830

Lys Thr Tyr Gly Glu Ile Phe Glu Lys

1 5

<210> 831

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 831

Lys Val Lys Lys Ile Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 832

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 832

Lys Val Lys Lys Ile Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Ala Gly

1 5 10 15

<210> 833

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 833

Lys Val Lys Lys Ile Tyr Leu Asp Glu Lys Arg Leu Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

<210> 834

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 834

Lys Val Val Pro Glu Met Thr Glu Ile Leu Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 835

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 835

Lys Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr

1 5 10

<210> 836

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 836

Lys Tyr Leu Pro Gly Pro Leu Gln Asp Met Phe Lys

1 5 10

<210> 837

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 837

Leu Ala Ser Gly Val His Gly Leu Pro Leu Leu

1 5 10

<210> 838

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 838

Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr

1 5 10

<210> 839

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 839

Leu Asp Phe Leu Lys Ala Val Asp Thr Asn Arg Ala Ser

1 5 10

<210> 840

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 840

Leu Asp Thr His Pro Leu Pro Leu Val Glu Val

1 5 10

<210> 841

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 841

Leu Glu Arg Ile Gln Ile Gln Glu Ala Ala Lys Lys Lys Pro Gly

1 5 10 15

<210> 842

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 842

Leu Phe Ala Leu Thr Leu Pro Ile Trp

1 5

<210> 843

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 843

Leu Gly Ser Val Ala Gly Ile Phe Asn Tyr Tyr

1 5 10

<210> 844

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 844

Leu Gly Val Leu Glu Ser Asp Leu Pro Ser

1 5 10

<210> 845

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 845

Leu Ile Leu Pro Glu Ala Val Gly Gly Thr Val Phe

1 5 10

<210> 846

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 846

Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Val Ala Arg

1 5 10

<210> 847

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 847

Leu Leu Val Ile Val Glu Leu Ile Pro Ser Thr Ser Ser

1 5 10

<210> 848

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 848

Leu Leu Val Pro Thr Lys Ala Arg Phe Pro Ala Phe Glu Leu

1 5 10

<210> 849

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 849

Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro Phe Gln Tyr Lys Asn

1 5 10

<210> 850

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 850

Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys

1 5 10

<210> 851

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 851

Leu Arg Pro Ile Gln Ala Leu Gly Thr Glu Tyr

1 5 10

<210> 852

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 852

Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

1 5 10

<210> 853

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 853

Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe

1 5 10

<210> 854

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 854

Leu Thr Asp Arg Glu Leu Glu Glu Tyr

1 5

<210> 855

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 855

Leu Val Glu Ala Lys Gln Tyr Ile Ile

1 5

<210> 856

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 856

Leu Val Ser Ala Ser Gln Asp Gly Lys Leu

1 5 10

<210> 857

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 857

Leu Val Val Tyr Phe Phe Arg Val Arg Asn

1 5 10

<210> 858

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 858

Met Leu Ser Asn Pro Asp Leu Met Arg Gln

1 5 10

<210> 859

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 859

Met Pro Ile Leu Gly Leu Gly Thr Trp

1 5

<210> 860

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 860

Met Ser Ile Leu Gly Met Thr Pro Gly Phe Gly Asp Lys Thr Phe

1 5 10 15

<210> 861

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 861

Met Ser Leu Lys Gln Thr Pro Leu Ser Arg

1 5 10

<210> 862

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 862

Asn Glu Ile Glu Asp Thr Phe Arg Gln Phe

1 5 10

<210> 863

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 863

Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro Phe Gln Tyr Lys Asn

1 5 10

<210> 864

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 864

Asn Gln Glu Leu Arg Ala Asp Gly Thr Val Asn Gln Ile Glu Gly

1 5 10 15

<210> 865

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 865

Asn Arg Ile Thr Ile Pro Val Gln Thr Phe

1 5 10

<210> 866

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 866

Asn Thr Asp Ser Pro Leu Arg Tyr

1 5

<210> 867

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 867

Asn Thr Glu Glu Glu Gly Leu Lys Tyr

1 5

<210> 868

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 868

Asn Trp Val Arg Lys Val Phe Ile Asp Thr Ile Pro Asn Ile Met Phe

1 5 10 15

Phe Ser

<210> 869

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 869

Pro Glu Val Leu Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu

1 5 10

<210> 870

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 870

Pro Lys Phe Glu Val Ile Glu Lys Pro Gln Ala

1 5 10

<210> 871

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 871

Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala

1 5 10 15

<210> 872

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 872

Pro Ser Ile His Ile Trp Asp Thr Glu Thr Ile

1 5 10

<210> 873

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 873

Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu

1 5 10

<210> 874

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 874

Gln Glu Glu Leu Pro Ser Leu Trp Asn Ser Arg Val Gly Phe

1 5 10

<210> 875

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 875

Gln Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser

1 5 10

<210> 876

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 876

Gln Leu Tyr Met Ile Gln Lys Lys Ser

1 5

<210> 877

<211> 9

<212> PRT