Способ определения содержания железа в мышечной ткани свиней Российский патент 2023 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к животноводству, ветеринарии и экологии, используется в качестве теста для прижизненной оценки уровня железа в мышечной ткани свиней.

Железо является одним из самых распространенных переходных металлов на земле, жизненно важным для функционирования живых организмов. Оно играет важную роль в физиологии растений, животных и человека, являясь важным компонентом некоторых белков и ферментов, участвующих в многочисленных метаболических процессах [1]. Это эссенциальный тяжелый металл, который считается безопасным или относительно безопасным при низких концентрациях для живых организмов [2]. Примерно 1,62 миллиарда людей в мире имеют железодефицитную анемию, что соответствует 24,8% населения земного шара, при этом самая высокая распространенность наблюдается среди детей дошкольного возраста [3].

Усвоение гемового железа из мяса наиболее эффективно и, чаще, не зависит от других диетических факторов [4]. Комплексная работа, связанная с обогащением железом наиболее часто используемых целевой аудиторией пищевых продуктов и его идентификацией, в конечном итоге, может способствовать снижению дефицита данного микроэлемента [5]. Свинина относится к красному типу мяса, хотя общее содержание железа, например, в сыром мясе лопаточной части меньше в 3,5 раза, чем в говяжьей лопатке [6]. Но учитывая, что среднедушевое потребление свинины в РФ занимает второе место после птицы и составляет 20,7 кг на человека в год, этот вид мяса претендует на один из главных источников железа в рационе населения нашей страны [7].

Обеспечение надлежащего качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания требует постоянного мониторинга содержания химических элементов [8]. В связи с особой биологической ценностью и широким распространением дефицита железа перспективен поиск индикаторов его содержания в органах и тканях сельскохозяйственных животных.

Существует способ определения железа в пищевых продуктах. Он заключается в применении колориметрического метода после пробоподготовки. Минимальная масса железа, определяемая таким образом, составляет 10 мкг в колориметрируемом объеме [9]. Основным недостатком данного варианта является невозможность прижизненной реализации оценки железа в мышцах свиней без инвазивного вмешательства. Отбор проб для исследования после убоя животных не позволяет установить и корректировать прижизненно уровень железа.

Известен способ определения железа в печени свиней по концентрации мочевины, неорганического фосфора, в сыворотке крови и Са/Р отношения. Оценка уровня металла выполнена методом атомно-абсорбционной спектрометрии, коэффициенты корреляции составляют 0,659, -0,641, 0,711, соответственно, приведены уравнения регрессии: х = 145,482 + 57,098*у, х = 778,523 - 115,190*у, х = 177,592 + 179,676*у [10]. Недостатком является то, что данный способ позволяет определить концентрацию железа только в печени, также модели построены на меньшем количестве объектов в выборке.

Существуют способы определения железа в мышечной ткани рыбы на основании использования регрессионных моделей [11].

Анализ прототипа [10] не показал признаков сходства с представляемым решением по конкретному химическому элементу. Заявляемый способ позволяет определить прижизненно концентрацию железа в одном из наиболее часто используемых в пищу продукте животноводства – свинине.

Задачей данного изобретения является оценка концентрации железа в мышечной ткани свиней после выполнения биохимического исследования сыворотки крови, полученной при жизни животных, и определения уровня активности таких показателей, как аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ). Расчёт величины железа в мышечной ткани свиней осуществляется, используя регрессионную модель.

Задача изобретения реализуется с помощью определения уровня активности АСТ и АЛТ в сыворотке крови свиней и последующего расчета концентрации железа в мышечной ткани на основании уравнения регрессии: y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂, где y – это содержание железа в мг/кг, x₁ – уровень активности АЛТ в ЕД/л, x₂ – уровень активности АСТ в ЕД/л в сыворотке крови.

Пример выполнения.

Экспериментальная часть работы выполнялась в условиях крупного свинокомплекса, расположенного в Западной Сибири на животных шестимесячного возраста, которые содержались по стандарту для данного вида, на мясном откорме. Свиньи вакцинированы в соответствии с планами ветеринарно-профилактических мероприятий. Животных обеспечивали типовым кормлением полнорационным комбикормом в зависимости от живой массы животных. Рационы сбалансированы по питательным, минеральным веществам и витаминам. Контроль комбикормов по номенклатуре гарантированных и дополнительных показателей осуществляли в установленном порядке. Поение животных выполняли из собственных источников хозяйственно-питьевого водоснабжения, при этом качество воды соответствовало второму классу. После стандартной голодной диеты выполняли забор крови из периферической вены с помощью вакуумной системы без стабилизации для получения сыворотки.

После убоя животных отбирались пробы мышечной ткани весом около 100 г, образцы были очищены от видимой жировой и соединительной ткани, замораживались и хранились при температуре -24°C. Определение уровня железа выполнялось на базе Аналитического центра коллективного пользования Института геологии и минералогии им. В.С. Соболева Сибирского отделения Российской академии наук методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на оборудовании iCAP-PRO (Thermo Fisher Scientific) с индексом способа обзора плазмы Duo. Пробоподготовка включала автоклавирование навески 2 г с 2 мл концентрированной азотной кислоты квалификации «Особо чистый» при температуре 80-100 °C в течение 1 часа. Далее вносилось 5 мл перекиси водорода квалификации не ниже «Химически чистый» и выполнялось автоклавирование при температуре 200°C еще в течение 1 часа. После полного остывания содержимое переливалось в пластиковую пробирку объемом 50 мл и доводилось до метки 20 мл дистиллированной водой, перемешивалось. Для анализа на приборе бралась аликвота. Внутренним стандартом служил скандий.

Биохимические исследования сыворотки крови выполнялись на базе лаборатории кафедры ветеринарной генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ, с применением унифицированных методов исследования крови, на анализаторе Photometer 5010 (Германия) с использованием наборов реактивов компании ЗАО «Вектор-Бест». Для анализа данных использовалось ПО Microsoft Office Excel, язык программирования R версии 4.2.3 и среда анализа данных RStudio версии 2023.03.0 Build 386 (2009-2023 Posit Software, PBC).

Для прижизненного определения количества железа в мышечной ткани свиней необходимо из периферической вены, например, из краевой вены уха с помощью вакуумной системы забора крови для получения сыворотки с иглой 17-14G, соблюдая доаналитические правила, в том числе, касающиеся голодной диеты около 12 часов, взять кровь до метки на пробирке. С помощью набора реактивов для полуавтоматических или автоматических анализаторов в пробе сыворотки необходимо определить уровень активности АСТ и АЛТ, пользуясь инструкциями к наборам. После получения этих значений нужно по уравнению регрессии рассчитать количество железа в мышечной ткани свиней: y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂, где y – это содержание железа в мг/кг, x₁ – уровень активности АЛТ в ЕД/л, x₂ – уровень активности АСТ в ЕД/л в сыворотке крови.

Данные по содержанию железа в мышечной ткани свиней представлены в табл. 1. Установленные значения, касающиеся среднего популяционного уровня железа в мышцах клинически здоровых свиней можно предварительно считать нормативными показателями для данного вида животных в условиях Западной Сибири.

Табл. 1

Содержание железа в мышцах свиней, мг/кг

n Ме Q 1 Q 2 IQR Lim 73 13,0 10,2 16,00 5,8 4,8-145,0

Здесь и далее: Me – медиана; Q 1 и Q 2 – первый и второй квартиль; IQR – интерквартильный размах; Lim – максимальное и минимальное значение

В табл. 2 представлены данные по величине сывороточных ферментов, использующихся в регрессионной модели.

Табл. 2

Уровень активности АСТ и АЛТ сыворотки крови свиней, ЕД/л

Показатель n Ме Q 1 Q 2 IQR Lim АСТ 73 11,1 3,4 21,3 17,9 0,4-38,8 АЛТ 73 12,3 6,5 23,1 16,7 0,8-61,2

АЛТ и АСТ являются внутриклеточными компонентами, но не являются строго специфичными для какой-либо ткани или органа. Активность АСТ находится на нижней границе нормы (9,0–113,0 ЕД/л), а АЛТ – меньше нижнего предела (32,0–84,0 ЕД/л). Но более показательными могут быть только значения в динамике.

В стандартных технологических условиях на свиньях между представленными показателями получили корреляции средней силы, представленные в таблице 3, вывели множественную регрессионную модель для прогнозирования содержания железа в мышечной ткани свиней: y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂, где y – это содержание железа в мг/кг, x₁ – уровень активности АЛТ в ЕД/л, x₂ – уровень активности АСТ в ЕД/л в сыворотке крови. Учитывая критерий Фишера, установили значимости модели (p-value ˂ 0,001).

Табл. 3

Корреляции количества железа в мышечной ткани с сывороточными ферментами

Пары признаков n r±Sr p-value y = b₀ + b₁*x₁ + b₂*x₂ Fe мышцы – АСТ 73 -0,560±0,081 < 0,001 y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂ Fe мышцы – АЛТ 73 -0,555±0,081 < 0,001

r±Sr – коэффициент корреляции и ошибка коэффициента корреляции, y = b₀ + b₁*x₁ + b₂*x₂ – уравнение регрессии

Использование регрессионной модели позволяет прижизненно у свиней прогнозировать содержание железа в мышечной ткани, установив уровень активности АСТ и АЛТ в сыворотке крови.

Предлагаемый способ позволяет провести прижизненную оценку интерьера животных по уровню активности АСТ и АЛТ в мышцах свиней, используя только пробы крови.

Источники информации:

1. De R. Complex interactions in regulation of haematopoiesis-an unexplored iron mine/ R. De, K.U. Prakash, E.S. Edison// Genes (Basel).– 2021.– Vol. 12(8).– 1270.

2. Jyothi N.R. Heavy metal sources and their effects on human health. In heavy metals – their environmental impacts and mitigation/ N.R. Jyothi.– London: IntechOpen, 2020.– pp. 1–12.

3. WHO. The global prevalence of anemia in 2011.– Geneva: World Health Organization, 2015.– P. 43.

4. Hunt J. Dietary and physiological factors that affect the absorption and bioavailability of iron/ J. Hunt// International Journal for Vitamin and Nutrition Research.– 2005.– Vol. 75(6).– pp. 375–384.

5. Shubham K. Iron deficiency anemia: a comprehensive review on iron absorption, bioavailability and emerging food fortification approaches/ K. Shubham, T. Anukiruthika, S. Dutta et al.// Trends in Food Science & Technology.– 2020.– Vol. 99.– pp. 58–75.

6. Carpenter C.E. Evaluation of methods used in meat iron analysis and iron content of raw and cooked meats / C.E. Carpenter, E. Clark// Journal of Agricultural and Food Chemistry.– 1995.– Vol. 43.– pp. 1824–1827.

7. Хайруллина О.И. Тенденции производства и потребления основных видов мяса в России/ О.И. Хайруллина// Креативная экономика.– 2021.– Т. 15, № 5.– С. 2245–2260.

8. Khan Z.I. Potential toxic metal accumulation in soil, forage and blood plasma of buffaloes sampled from Jhang, Pakistan/ Z.I. Khan, I. Ugulu, S. Umar et al.// Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology.– 2018.– Vol. 101(2).– pp. 235–242.

9. ГОСТ 26928–86. Продукты пищевые. Метод определения железа [Текст].– Введ. 1988-06-30.– М.: Стандартинформ, 2010.– 5 с.

10. Патент № 2762614 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48. Способ определения уровня железа в печени свиней: № 2021107856: заявл. 23.03.2021: опубл. 21.12.2021/ О.А. Зайко, Т.В. Коновалова, О.И. Себежко [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный аграрный университет".

11. Патент № 2761045 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48. Способ определения содержания железа в мышечной ткани рыбы: № 2021103652: заявл. 12.02.2021: опубл. 02.12.2021 / К.С. Рявкина, Т.В. Коновалова, О.И. Себежко [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский государственный аграрный университет".

Изобретение относится к животноводству, ветеринарии и экологии, используется в качестве теста для прижизненной оценки уровня железа в мышечной ткани свиней. Способ состоит в том, что в сыворотке крови животных определяют уровень активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы. Далее рассчитывают содержание железа по уравнению регрессии: y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂, где y – это содержание железа в мг/кг, x₁ – уровень активности АЛТ в ЕД/л, x₂ – уровень активности АСТ в ЕД/л в сыворотке крови. Изобретение вызывает минимальный уровень стресса и обеспечивает точную прижизненную оценку железа в мышечной ткани животных. 3 табл., 1 пр.

Способ определения содержания железа в мышечной ткани свиней, отличающийся тем, что в качестве биосубстрата используется сыворотка крови, в которой проводят биохимическое определение уровня активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы и рассчитывают уравнение регрессии: y = 53,7138 - 0,7794*x₁ - 1,0579*x₂, где y – это содержание железа в мг/кг, x₁ – уровень активности АЛТ в ЕД/л, x₂ – уровень активности АСТ в ЕД/л в сыворотке крови.