Способ определения содержания меди в печени свиней Российский патент 2024 года по МПК A01K1/00 

Изобретение имеет отношение к животноводству, ветеринарии и экологии, применяется в качестве теста для прижизненной оценки уровня меди в печени свиней.

Существует способ определения меди в пищевом сырье и продуктах, который заключается в применении атомно-абсорбционного метода для определения массовой доли металла [1]. Для реализации данного способа оценки меди в печени свиней прижизненно необходимо проведение одного из вариантов биопсии печени. Для получения оптимального по качеству образца лучше выполнять лапароскопическую или открытую биопсию. На примере выполнения данной процедуры у мелких домашних животных количественное определение меди с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии требуется минимум от 20 до 40 мг ткани печени, это проба, примерно, около двух сантиметров длиной. Биопсия печени является инвазивными дорогостоящим диагностическим инструментом. Также имеется ряд недостатков, связанных со степенью упитанности животного (чрескожный вариант биопсии), болью, возникновением кровотечения, внутрипеченочной гематомой, желчным перитонитом, перфорацией кишечника, сепсисом и другими осложнениями после вмешательства [2]. В отношении сельскохозяйственных животных в большинстве случаев подразумевается отбор проб для исследования после убоя животных, что не дает возможность оценивать и корректировать прижизненно концентрацию меди в печени свиней.

Существуют потенциальные способы определения меди в печени по концентрации некоторых аминокислот в сыворотке крови. Концентрация металла определялась методом атомно-абсорбционной спектрометрии, количественное содержание аминокислот устанавливалось методом ионообменной хроматографии, самый большой коэффициент корреляции составлял 0,703 с метионином [3].

В представленном способе даны коэффициенты корреляции Спирмена, что предполагает выполнение дальнейших исследований на большем количестве животных.

Также известны способы определения меди в печени овец и рыб с использованием регрессионных моделей [4, 5].

Оценка прототипа [3] не показала признаков сходства с представляемым решением по конкретному химическому элементу. Предлагаемый способ отличается возможностью получения регрессионной модели.

Технической задачей изобретения является оценка количества меди, содержащегося в печени свиней исследования сыворотки крови, полученной от живых животных и определения такого показателя, как аланинаминотрансфераза (АЛТ), путем расчёта концентрации металла с помощью уравнения регрессии.

Поставленная задача реализуется с помощью определения уровня активности АЛТ в сыворотке крови свиней с дальнейшим расчетом концентрации меди в печени, пользуясь уравнением регрессии: x = 14,896 – 0,302y, где x – это содержание меди «мг/кг», y – уровень активности аланинаминотрансферазы «ЕД/л» в сыворотке крови.

Пример выполнения.

Способ определения меди в печени свиней был осуществлен следующим образом. Экспериментальная часть выполнялась на базе крупного свинокомплекса, территориально расположенного в Западной Сибири. Животные содержались в стандартных условиях, которые соответствовали виду и мясному откорму, были вакцинированы в соответствии с планами ветеринарно-профилактических мероприятий. Типовое кормление осуществлялось полнорационным сбалансированным по питательным, минеральным веществам и витаминам комбикормом в зависимости от живой массы. Контроль комбикормов по номенклатуре гарантированных и дополнительных показателей осуществляли в установленном порядке. Поение животных выполняли из собственных источников хозяйственно-питьевого водоснабжения, при этом качество воды соответствовало второму классу.

Забор крови осуществлялся у клинически здоровых свиней в возрасте 6 месяцев из ушной вены острым методом с соблюдением правил асептики после 12-18 часовой голодной диеты, использовался 5%-й цитрат натрия в качестве антикоагулянта.

Проводился убой животных, после чего отбирались пробы печени, замораживались и хранились при температуре 18 °С. Определение уровня меди в паренхиматозном органе выполнялось в Аналитическом центре коллективного пользования Института геологии и минералогии им. В.С. Соболева Сибирского отделения Российской академии наук методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой с использованием спектрометра iCAP-6500 фирмы Thermo Scientific (USA).Навеску массой 100 г измельчали до однородной консистенции, высушивали в печи при температуре 60-70 °С 12 часов. Из полученного сухого остатка отбирали 3 г, озоляли в муфельной печи при 500-550 °С. Минерализация завершалась за 10-15 часов, зола становилась серого или белого цвета. Пробы остывали при комнатной температуре, зольный остаток растворяли в 3-х мл 50% соляной кислоты, выпаривали до сухого остатка на электроплите, его переносили в мерную колбу, разбавляя в 25 мл дистиллированной воды. Полученный раствор исследовали на содержание меди.

Биохимические исследования сыворотки крови выполнялись на базе лаборатории кафедры ветеринарной генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ, с применением унифицированных методов исследования крови, на анализаторе Photometer 5010 (Германия). Для оценки уровня активности фермента использовали набор реагентов компании ЗАО «Вектор-Бест» для определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке, плазме крови.

Регрессионную модель получили с помощью ПО Statistica 8 (StatSoftInc., USA), используя регрессионный анализ. Выполняли поиск мультиколлинеарных факторов, исключая имеющие меньший коэффициент регрессии Beta. Анализировали остатки на нормальность распределения и независимость от предсказанных по уравнению регрессии значений отклика. Рассматривали регрессионное уравнение на наличие факторов, не влияющих на концентрацию меди в печени свиней, исключали биохимические параметры, для которых уровень значимости был больше 0,05. Оценивали приемлемость регрессионной модели в целом, принимая, что она эффективнее, чем прогнозирование содержания металла по средним значениям, при уровне значимости менее 0,05. Анализировали коэффициент детерминации, в нашем случае он был выше 0,3, что свидетельствует о построении качественной регрессионной модели. Строили прогноз с помощью полученной регрессионной модели, проверяя ее на значениях, полученных на свиньях, которые не были включены в первоначальную выборку.

При помощи данного способа можно определить содержание меди в печени свиней. Это предлагается делать посредством установления такого параметра сыворотки крови, как АЛТ, с последующим расчетом концентрации меди в печени с использованием уравнения регрессии. Таким образом, по уровню активности указанного фермента всыворотке крови можно установить содержание меди в печени свиней.

В табл. 1 приведены данные по содержанию меди в печени свиней. Соотношение крайних вариант концентрации металла в печени составило 1:8,6. Установленные значения, касающиеся среднего популяционного уровня меди в печени клинически здоровых свиней, можно предварительно использовать для получения референтных интервалов для данного вида животных в условиях Западной Сибири.

Табл. 1

Содержание меди в печени свиней, мг/кг

n ±S Ме σ Q1 Q2 IQR Lim 39 9,46±0,85 7,7 5,3 5,3 14,0 8,7 2,9-25,0

Здесь и далее: ±S – средняя арифметическая и ошибка средней; Me – медиана; σ – среднеквадратическое отклонение; Q 1 и Q 2 – первый и второй квартиль; IQR – интерквартильный размах; Lim – максимальное и минимальное значение; обработка материала выполнялась при помощи ПО Statistica 8 (StatSoftInc., USA).

В табл. 2 представлены данные по уровню активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови свиней, коррелирующих с уровнем меди в печени этого вида животных.

Табл. 2

Уровень активности АЛТ в сыворотке крови свиней, ЕД/л

Показатель n ±S Ме σ Q1 Q2 IQR Lim АЛТ 43 15,15±1,90 18,96 12,43 1,53 23,44 21,91 0,77-47,03

АЛТ является важным ферментом, занимающим центральную роль в обмене белков, сочетано с некоторыми другими параметрами крови используется для диагностики повреждения паренхимы печени у свиней. Рассматриваются нормативные границы для свиней в пределах 32-84 ЕД/л. Но фактически общепризнанные референтные интервалы в ветеринарной медицине отсутствуют. Предполагается, что гематологические и биохимические нормы должны быть установлены отдельно для каждой географической территории.

В данном случае на клинически здоровых свиньях установили, что между уровнем активности АЛТ и концентрацией меди в печени животных существует связь среднего уровня (табл. 3), получили регрессионную модель для прогнозирования содержания металла по уравнению:

x = 14,896 – 0,302y, где y– это содержание АЛТ «ЕД/л» в сыворотке крови, x– содержание Cu«мг/кг» в печени свиней.

Табл. 3

Корреляции количества меди в печени с биохимическими параметрами сыворотки крови свиней

Пары признаков n r±Sr x= a + by Cu печень – АЛТ 37 –0,684±0,089*** x = 14,896 – 0,302y

r±Sr – коэффициент корреляции и ошибка коэффициента корреляции, x= a + by – уравнение регрессии

Построение прогноза с помощью ПО Statistica 8и данной регрессионной модели на значениях, полученных на животных, не включённых в первоначальную выборку, позволяет привести следующие примеры. В сыворотке крови был установлен уровень активности АЛТ14,22 ЕД/л, фактическая концентрация меди в печени животного составила 8,90мг/кг, расчетная концентрация равнялась10,60 мг/кг. В качестве еще одного примера: уровень активности фермента– 13,15ЕД/л, фактическая концентрация меди – 8,53 мг/кг, расчетная концентрация –10,92 мг/кг.

Использование представленной регрессионной модели позволяет прижизненно у свиней прогнозировать содержание меди в печени, установив уровень активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови.

Предлагаемый способ дает возможность прижизненно оценивать такой параметр интерьера животных, как содержание меди в печени свиней, используя только пробы крови.

Источники информации:

1. ГОСТ 30178-96. Издания. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов [Текст].– Введ. 1998-01-01.– М.: Стандартинформ, 2010.– 10 с.

2. Lidbury J.A. Getting the most out of liver biopsy/ J.A. Lidbury// Vet. Clin. North. Am. Small Anim. Pract.– 2017.– Vol. 47(3).– pp. 569-583.

3. Зайко О.А. Изменчивость и корреляция химических элементов в органах и тканях свиней скороспелой мясной породы СМ-1: дис. … канд. биол. наук.– Новосибирск, 2014.– 183 с.

4. Пат. № 2765236 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ оценки содержания меди в печени овец/ Саурбаева Р.Т., Андреева В.А., Климанова Е.А. и др.; заявитель и патентообладатель Новосибирский государственный аграрный университет.– № 2021106117; заявл. 09.03.2021; опубл. 26.01.2022.

5. Пат. № RU 2555518 C1 Российская Федерация, МПК G01N 33/48, G01N 33/12. Способ определения содержания меди в мышечной ткани рыбы/ Короткевич О.С., Миллер И.С., Коновалова Т.В. и др.; заявитель и патентообладатель Новосибирский государственный аграрный университет.– № 2014131162/15; заявл. 28.07.2014; опубл. 10.07.2015.

Изобретение относится к ветеринарии и представляет собой способ определения содержания меди в печени свиней, отличающийся тем, что выполняют забор венозной крови у животного данного вида, получают сыворотку крови, проводят ее биохимический анализ, определяют уровень активности аланинаминотрансферазы и рассчитывают содержание меди, пользуясь уравнением регрессии: x=14,896–0,302y, где x – это содержание меди, мг/кг, y – уровень активности аланинаминотрансферазы, ЕД/л, в сыворотке крови. Изобретение позволяет эффективно определять содержание меди в печени свиней. 2 табл.

Способ определения содержания меди в печени свиней, отличающийся тем, что выполняют забор венозной крови у животного данного вида, получают сыворотку крови, проводят ее биохимический анализ, определяют уровень активности аланинаминотрансферазы и рассчитывают содержание меди, пользуясь уравнением регрессии: x=14,896–0,302y, где x – это содержание меди, мг/кг, y – уровень активности аланинаминотрансферазы, ЕД/л, в сыворотке крови.