Способ определения уровня свинца в почках овец Российский патент 2024 года по МПК A61B5/145 G01N33/50 

Предлагаемое изобретение относится к отрасли животноводства, ветеринарии и экологии, используется в качестве теста для прижизненной оценки уровня свинца в почках овец.

Свинец встречается в природе и может присутствовать повсюду: в воде, продуктах питания, почве и атмосфере. Воздействие этого металла (Pb) остается серьезной проблемой для окружающей среды и общественного здравоохранения во всем мире из-за его многочисленных применений на протяжении последних тысячелетий. Его пластичность и устойчивость к коррозии сделали его полезным для многих изделий, таких как водопроводные трубы. Он также имеет многочисленные промышленные и бытовые применения, что отражает его уникальные химические свойства.

Свинец - токсичный металл, изучался в течение многих лет учеными по всему миру, которые постоянно сообщали, что воздействие этого металла при вдыхании, проглатывании или контакте с кожей может привести к различным проблемам со здоровьем у людей. Несмотря на то, что оно затрагивает как взрослых, так и детей, следует отметить, что дети более уязвимы к неблагоприятным воздействиям из-за развития их органов и нервной системы. В нескольких исследованиях сообщалось, что безопасного уровня свинца в крови не существует, и даже небольшое воздействие может привести к снижению коэффициента интеллекта (IQ) и другим проблемам со здоровьем у детей.

Известен способ определения свинца в пищевых продуктах и продовольственном сырье [ГОСТ 33824-2016]. Он заключается в применении инверсионно-вольтамперометрического метода.

Недостатком данного способа является отсутствие возможности установить концентрацию свинца прижизненно и в дальнейшем корректировать его. Выполнение же одного из вариантов биопсии почек является инвазивной и затратной процедурой. Затруднения могут быть связаны с проведением ультразвуковым или рентгеновским исследованием, общим или локальным наркозом, а также с болью, кровотечением, инфекцией, повреждением окружающих органов и аллергической реакцией.

Существует способ определения концентрации свинца в легких крупного рогатого скота по концентрации в волосе Mn и/или Na. Химический анализ выполнялся методом атомно-эмиссионной спектрометрии, коэффициенты корреляции составляли 0,62 и 0,45, соответственно, приведены уравнения регрессии: y = 0,0179х-0,0067 и y=0,0000334х+0,007551 [Патент № 2602915 C1].

Недостатком способа является то, что есть возможность определить концентрацию свинца только в легких крупного рогатого скота, которые являются менее ценным субпродуктом, получаемым от данного вида животных, чем почки.

Известен способ определения содержания свинца в органах крупного рогатого скота: печень, почки, селезенка, сердце, легкие [Патент № 2421726 С1] и способ определения содержания свинца в органах свиней: легкое, печень, сердце, почки, селезенка [Патент № 2285920 С1].

Анализ прототипа [Патент № 2629605 C1] не показал сходство с представляемым нами способом, в котором предполагается определение свинца в мышечной ткани у крупного рогатого скота.

Предлагаемый способ позволяет прижизненно оценить концентрацию свинца в наиболее часто используемом в пищевом производстве субпродукте, которым являются почки.

Заявляемым способом решается задача оценки накопления свинца в почках овец путем проведения иммуноферментного анализа сыворотки крови, полученной прижизненно, и определения уровня тестостерона. Для расчёта уровня свинца в почках овец используется уравнение регрессии.

Предложенный способ отличается от ранее существующих тем, что концентрацию свинца в почках овец можно определить прижизненно, а не посмертно, используя в качестве биомаркера уровень тестостерона в сыворотке крови. При этом обеспечивается точность и простота выполнения метода, а также малая инвазивность.

Тестостерон - гормон, который играет важную роль в развитии и функционировании репродуктивной системы овец. Уровень тестостерона в организме может влиять на многие аспекты здоровья и физиологии, такие как обмен веществ, мышечная масса, плотность костей и др. Проблемы с уровнем тестостерона могут привести к различным заболеваниям, таким как недостаток или избыток гормона. Содержание тестостерона у овец может варьироваться в зависимости от возраста, пола и физиологического состояния животных. В среднем, содержание тестостерона у взрослых овец может составлять от 0,5 до 5 ммоль/л. У баранов содержание тестостерона обычно выше, чем у самок, или овец. Во время сезона размножения содержание тестостерона у баранов может достигать максимальных значений. Однако, следует отметить, что нормальные уровни тестостерона у овец могут различаться в разных исследованиях, поэтому конкретные значения могут варьироваться. Кроме того, уровень тестостерона может меняться в зависимости от внешних факторов, таких как изменение рациона, стресс, физическая активность и другие факторы.

Способ определения уровня свинца в почках овец, включающий анализ биосубстрата в виде сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию тестостерона методом иммуноферментного анализа, затем рассчитывают уравнение регрессии и определяют уровень свинца в почках овец:

y = 0,66+(-1,11x), где y - это содержание свинца в мг/кг, x - концентрация тестостерона в ммоль/л в сыворотке крови.

Пример выполнения.

В основе способа лежит опытная часть работы, которая выполнялась в условиях овцеводческой фермы, расположенной в Западной Сибири. Определение уровня свинца по заявляемому способу обеспечивает точность метода, безболезненность, отсутствие стрессирования и инфицирования животных, относительную простоту и удобство при проведении исследований.

Исследование проведено на баранчиках романовской породы в возрасте 6-9 мес., которые содержались по стандарту для данного вида, вакцинировались в соответствии с планами ветеринарно-профилактических мероприятий. После стандартной голодной диеты выполняли забор крови из периферической вены с помощью вакуумной системы для последующего получения сыворотки. Оборудование состояло из иглы и шприца с контейнером. Диаметр иглы обычно составляет 0,9 мм, она снабжается клапаном, который блокирует вытекание крови, а это снижает вероятность появления осложнений. Сама пробирка играет роль транспортного контейнера. Животные на момент взятия проб были клинически здоровы. Далее после забора проб цельную кровь для непродолжительного хранения поместили в холодильник (+2…+4°С). Сыворотку крови получили методом центрифугирования в условиях лаборатории кафедры ветеринарной генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ

В сыворотке крови по унифицированной методике был определен гормон тестостерон в условиях лаборатории кафедры ветеринарной генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ. Исследование на тестостерон выполняли методом конкурентного иммуноферментного анализа с набором реагентов «Стероид ИФА тестостерон» для количественного определения концентрации тестостерона в сыворотке крови. В соответствующие лунки вносилось по 25-50 мкл калибровочной пробы, контрольной сыворотки и исследуемых проб. Далее во все лунки вносилось по 100-150 мкл конъюгата. Планшет инкубировался в течение 90-120 минут при температуре +37°С (500-800 об/мин). Затем осуществлялась промывка лунок 4-5 раз по 250-300 мкл отмывочного раствора. Следующим этапом во все лунки вносилось 100 мкл раствора ТМБ на 2-3 минуты. Планшет инкубировался в темноте при +37°С 10-20 минут. В конце исследования во все лунки вносилось по 100 мкл стоп-реагент и проводилось измерение оптической плотности в течение 15 минут при длине волны 450 нм на анализаторе Thermo Scientific Multiskan FC.

Для обработки исходных данных использовали программы Microsoft Office Excel 2007 и язык статистического программирования и среды анализа данных «RStudio».

Для прижизненного определения количества свинца в почках овец необходимо из периферической вены, например, из краевой вены уха с помощью вакуумной системы забора крови для получения сыворотки с иглой 17-14G, соблюдая комплекс доаналитических правил, в том числе, соблюдение голодной диеты около 12 часов, осуществить забор венозной крови у овец. С помощью набора реактивов для полуавтоматических или автоматических анализаторов в пробе сыворотки определялась концентрация тестостерона. После получения соответствующего значениянеобходимо, пользуясь регрессионной моделью, рассчитать количество свинца в почках овец: y = 0,66+(-1,11x), где y - это содержание свинца в мг/кг, x - концентрация тестостерона в ммоль/л в сыворотке крови.

Данные по содержанию свинца в почках овец представлены в таблице 1. На установленные значения, характеризующие средние тенденции содержания свинца в почках овец, можно предварительно ориентироваться, как на нормативные показатели для указанного вида животных, выращенных в условиях Западной Сибири.

Табл. 1

Содержание свинца в почках овец, мг/кг

n ± S_x Me σ Q₁ Q₃ IQR Lim 29 0,17±0,03 0,029 0,124 0,022 0,036 0,014 0,003-0,6

Примечание. λ ± S_x - средняя арифметическая с ошибкой; Me - медиана; σ - стандартное отклонение; Q₁ - первый квартиль; Q₃ - третий квартиль; IQR - межквартильный размах; Lim - лимиты.

В табл. 2 представлены данные по величине гормона, использующегося в регрессионной модели.

Табл. 2

Содержание тестостерона в сыворотке крови овец, моль/л

n ± S_x Me σ Q₁ Q₃ IQR Lim 30 0,471±0,047 0,34 0,251 0,233 0,549 0,316 0,128-1,06

В типовых технологических условиях на овцах между уровнем свинца в почках и концентрацией тестостерона в сыворотке крови получили корреляцию средней силы, что представлено в таблице 3, вывели регрессионную модель для прогнозирования содержания свинца в почках овец: y = 0,66+(-1,11x), где y - это содержание свинца в мг/кг, x - концентрация тестостерона в ммоль/л в сыворотке крови.

Табл. 3

Корреляция количества свинца в почках с тестостероном в сыворотке крови овец

n r±S_r B_x/y y = a + bx 29 -0,55±0,161 -1,11 y = 0,66+(-1,11x)

Примечание. r±Sr - коэффициент корреляции и ошибка коэффициента корреляции, y = b₀ + b₁*x₁- уравнение регрессии

Таким образом, использование данной регрессионной модели дает возможность прижизненно у овец прогнозировать содержание свинца в почках, установив содержание тестостерона в сыворотке крови.

Предлагаемый способ позволяет провести прижизненную оценку одного из параметров интерьера животных по содержанию гормона, используя только пробы крови.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике. В сыворотке крови животных определяют концентрацию тестостерона. Используя концентрацию тестостерона, по оригинальной формуле рассчитывают содержание свинца в почках овец. Способ позволяет определить количество свинца по концентрации тестостерона, используя только пробы крови, что, в свою очередь, дает возможность провести прижизненную оценку. 3 табл., 1 пр.

Способ определения уровня свинца в почках овец, включающий анализ биосубстрата в виде сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию тестостерона методом иммуноферментного анализа, затем рассчитывают уравнение регрессии и определяют уровень свинца в почках овец:

y = 0,66+(-1,11x), где y – это содержание свинца в мг/кг, x – концентрация тестостерона в ммоль/л в сыворотке крови.