АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD79B, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

В данной заявке испрашивается приоритет китайской патентной заявки «Антитело против CD79B, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение» (номер заявки 201910083330.4), поданной 28 января 2019 г., которая включается в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителу против человеческого CD79B и его антигенсвязывающему фрагменту, химерному антителу и гуманизированному антителу, содержащему область(ти) CDR антитела против CD79B, фармацевтической композиции, содержащей антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, а также к его применению в качестве противоракового лекарственного средства, в частности, в качестве лекарственного средства для лечения лимфомы (DLBCL) (диффузная В-клеточная крупнокпеточная лимфома).

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественная опухоль (рак) представляет собой вторую ведущую причину смерти в мире, что ставит ее сразу после сердечных заболеваний. Лимфома представляет собой злокачественную опухоль, которая возникает из лимфоидной гематопоэтической системы, и является самой распространенной гематологической опухолью в мире. Частота возникновения лимфомы в Китае увеличивалась в последние годы, и текущая частота возникновения составляет примерно 6,68 случаев на 100000 человек.

Лимфома подразделяется на два типа: неходжкинская лимфома (NHL) и ходжкинская лимфома (HL). Неходжкинская лимфома представляет собой общий термин для группы заболеваний с ненормальной пролиферацией лимфоцитов с сильной гетерогенностью. Ее частота возникновения значительно выше, чем у ходжкинской лимфомы, составляя более, чем 80% лимфом. Среди них диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома (DLBCL) является самым обычным типом лимфомы у взрослых, составляя примерно 32,5% от всех неходжкинских лимфом; у азиатского населения эта доля даже выше - близка к 40%. Она является более обычной у пожилых пациентов с медианным возрастом начала 60-64 года. Пациентов мужчин немного больше, чем пациентов женщин.

В настоящее время стандартной схемой первой линии для диффузной В-кпеточной крупноклеточной лимфомы (DLBCL) является ритуксимаб, объединенный с химиотерапией (R-CHOP). Перед выводом на рынок ритуксимаба стандартной схемой лечения первой линии против DLBCL была схема на основе антрациклина CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон). Схема лечения R-CHOP значительно улучшила долговременную выживаемость пациентов с DLBCL. Результаты клинического испытания показывают то, что по сравнению с традиционной схемой CHOP схема R-CHOP может значительно продлевать медианное общее время выживания пациентов с DLBCL на 4,9 года, медианное время выживания без признаков заболевания на более, чем 6,6 лет, и 5-летний показатель выживания без признаков заболевания увеличивался от 30% до 54%. Однако все же имеется от 10% до 15% не поддающихся лечению пациентов, которые не отвечают, и от 20% до 30% пацентов имеют рецидивы. И не все пациенты с DLBCL подходят для схемы R-CHOP, как, например, пожилые пациенты старше 80 лет, физическое состояние которых не допускает стандартного лечения R-CHOP; другим примером является пример более агрессивных типов лимфомы и рецидивирующей лимфомы, и схема R-CHOP может быть несостоятельной. Следовательно, крайне небходимой является разработка нового поколения иммунотерапий с меньшими побочными эффектами для лечения DLBCL.

Согласно классификации лимфоцитов по происхождению диффузная В-кпеточная крупноклеточная лимфома (DLBCL) принадлежит к В-клеточной лимфоме. Комплекс рецептора В-клеток (BCR) является самой главной молекулой на поверхности В-клеток. Комплекс BCR состоит из мембранного иммуноглобулина (mIg), который распознает и связывает антиген, и гетеродимеров Igα (CD79a) и Igβ (CD79B), которые передают сигналы стимуляции антигеном. Igα и Igβ представляют собой 47 кДа и 37 кДа гликопротеины, соответственно, и они принадлежат к надсемейству иммуноглобулинов. Гены, кодирующие Igα и Igβ, называются mb-1 и В29 соответственно. И Igα, и Igβ имеют Ig-подобный домен на аминоконце внеклеточной области. И Igα, и Igβ могут использоваться в качестве субстратов протеинтирозинкиназ и участвуют в трансдукции сигнала BCR. BCR широко экспрессируется на В-клеточных лимфомах и на нормальных В-клетках. Ввиду клинического успеха и надежной безопасности ритуксимаба, нацеленного на CD20, разработка терапевтических способов, нацеленных на BCR, также должна иметь хороший куративный эффект и безопасность.

В ответ на неудовлетворенные медицинские потребности, связанные с CD79B, многие международные фармацевтические компании, включающие Roche Pharmaceuticals, активно разрабатывают антитела против CD79B и родственные продукты. Связанными с этим патентами являются такие как US 9085630, WO 2009012256, WO 2009012268, WO 2009099728, WO 2014011519, WO 2014011521, WO 2016090210, WO 2016205176, WO 2016040856, WO 2016021621, WO 2017009474, WO 2014177615 и т.д.

На основе экспрессии CD79B полезным является получение терапевтических антител против антигена CD79B. В данной области все еще имеется неудовлетворенная потребность в разработке эффективных антител против человеческого CD79B для лечения гематопоэтических опухолей или задержки прогрессирования.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему раскрытию предложено антитело против CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, кодирующая его нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин, конъюгат антитело-лекарственное средство и его фармацевтическая композиция, и способ их применения для лечения или замедления развития рака, особенно гематопоэтических опухолей.

В первом аспекте согласно настоящему раскрытию предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела, где:

вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (HCDR), как показано в последовательностях, выбранных из следующих: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25; и/или

вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (LCDR), как показано в последовательностях, выбранных из следующих: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 26.

В некоторых воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором: вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(I) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно; или

(II) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; или

(III) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25 соответственно;

и/или вариабельная область легкой цепи содержит:

(I) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно; или

(II) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно; или

(III) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12 соответственно.

В некоторых конкретных воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит любой один, выбранный из следующих (l)-(lll):

(I) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно;

(II) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно;

(III) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.

В некоторых конкретных воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором:

вариабельная область тяжелой цепи содержит:

(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 3, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 3; или

(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 5, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 5; или

(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 17, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 17;

и/или вариабельная область легкой цепи содержит:

(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 4, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 4; или

(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 6, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 6; или

(III) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 18, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 18.

В некоторых конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 4.

В некоторых других конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 5, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 6.

В некоторых других конкретных воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 17, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 18.

В некоторых конкретных воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, в котором:

тяжелая цепь содержит:

(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 19, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 19; или

(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 21, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 21; или

и/или легкая цепь содержит:

(I) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 20, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 20; или

(II) последовательность, как показано в SEQ ID NO: 22, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной, 96%-ной, 97%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 22;

В некоторых конкретных воплощениях тяжелая цепь антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 19, и легкая цепь является такой, как показано в SEQ ID NO: 20.

В некоторых других конкретных воплощениях тяжелая цепь антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 21, и легкая цепь является такой, как показано в SEQ ID NO: 22.

В некоторых воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, которое представляет собой мышиное антитело или его фрагмент.

В некоторых конкретных воплощениях вариабельная область легкой цепи мышиного антитела против CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента содержит область FR легкой цепи и/или константную область легкой цепи мышиной цепи κ, λ или ее варианта.

В некоторых конкретных воплощениях мышиное антитело против CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область FR тяжелой цепи и/или константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или его варианта.

В некоторых воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, которое представляет собой химерное антитело или его фрагмент. В некоторых конкретных воплощениях химерное антитело против CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область FR легкой цепи и/или константную область легкой цепи человеческой цепи κ, λ или ее варианта и/или область FR тяжелой цепи, и/или константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или его варианта.

В некоторых воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, которое представляет собой гуманизированное антитело, человеческое антитело или его фрагмент.

В некоторых воплощениях предложено гуманизированное антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, в котором последовательность легкой цепи показана в SEQ ID NO: 20 или ее вариант последовательности; данный вариант последовательности содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен в легкой цепи, или имеет по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 20. Последовательность тяжелой цепи показана в SEQ ID NO: 19 или ее вариант последовательности; данный вариант последовательности содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен в тяжелой цепи, или имеет по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 19.

В некоторых воплощениях предложено гуманизированное антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, в котором последовательность легкой цепи показана в SEQ ID NO: 22 или ее вариант последовательности; или имеет по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 22; данный вариант последовательности содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен в легкой цепи. Последовательность тяжелой цепи показана в SEQ ID NO: 21 или ее вариант последовательности; данный вариант последовательности содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен в тяжелой цепи или имеет по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность с SEQ ID NO: 21.

В некоторых воплощениях человеческое антитело против CD79B или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержит константную область человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или его варианта. В некоторых конкретных воплощениях человеческое антитело против CD79B или его фрагмент содержит константную область человеческого IgG1 или IgG2.

В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против человеческого CD79B или его фрагмент, как описано выше, дополнительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или его варианта, предпочтительно содержит область FR тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, более предпочтительно содержит область FR тяжелой цепи человеческого IgG1 или IgG2.

В некоторых воплощениях предложено антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, где данный антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fv, sFv, F(ab')₂, линейного антитела, одноцепочечного антитела, scFv, sdAb, sdFv, нанотела, пептитела, доменного антитела и мультиспецифичного антитела (биспецифичное антитело, диатело, триатело и тетратело, тандемное ди-scFv и тандемное три-scFv).

В некоторых воплощениях предложено выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое может конкурировать с вышеупомянутым моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с человеческим CD79B или его эпитопом.

Аминокислотные остатки CDR VH/VL антитела против человеческого CD79B в настоящем раскрытии определяются и аннотируются посредством системы нумерации Chothia.

Во втором аспекте согласно настоящему раскрытию предложен полинуклеотид, кодирующий антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано выше, который может представлять собой ДНК или РНК.

В третьем аспекте согласно настоящему раскрытию предложен экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, как описано выше, который может представлять собой эукариотический экспрессионный вектор, прокариотический экспрессионный вектор или вирусный вектор.

В четвертом аспекте согласно настоящему раскрытию предложена клетка-хозяин, трансформированная экспрессионным вектором, как описано выше, которая может представлять собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку.

В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку или клетку млекопитающего. В некоторых конкретных воплощениях клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli, Pichia pastoris, клетку яичника китайского хомяка (СНО) или клетку 293 человеческой эмбриональной почки (HEK).

В пятом аспекте согласно настоящему раскрытию предложен конъюгат антитело-лекарственное средство.

Конъюгат антитело-лекарственное средство согласно настоящему раскрытию содержит или состоит из следующего: антитело, линкер и лекарственное средство.

В конкретном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство согласно настоящему раскрытию представляет собой антитело, ковалентно связанное с лекарственным средством через линкер.

В некоторых воплощениях конъюгат антитело-лекарственное средство содержит цитотоксическое средство. В некоторых конкретных воплощениях цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсина, химиотерапевтического средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

В шестом аспекте согласно настоящему раскрытию предложен способ получения антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий: осуществление экспрессии данного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине, как описано выше, и выделение данного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки-хозяина.

В седьмом аспекте согласно настоящему раскрытию предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, которая содержит терапевтически эффективное количество вышеупомянутого антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

В некоторых конкретных воплощениях единичная доза фармацевтической композиции содержит от 0,01% до 99% по массе антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента, или количество антитела против CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента в единичной дозе фармацевтической композиции составляет от 0,1 мг до 2000 мг, и, в некоторых конкретных воплощениях - от 1 мг до 1000 мг.

В восьмом аспекте согласно настоящему раскрытию дополнительно предложено применение в получении лекарственного средства любого одного или комбинации, выбранной из следующих: антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему раскрытию, фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию, конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему раскрытию; где данное лекарственное средство или фармацевтическую композицию применяют для лечения пролиферативного заболевания или задержки прогрессирования пролиферативного заболевания; указанное пролиферативное заболевание может представлять собой рак или опухоль. В некоторых воплощениях рак или опухоль представляет собой лимфому или лейкоз. В конкретном воплощении лимфома выбрана из группы, состоящей из следующих: диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома, неходжкинская лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома и лимфома из клеток мантии. В конкретном воплощении неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из следующих: агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая безболезненная NHL, трудно поддающаяся лечению NHL и трудно поддающаяся лечению безболезненная NHL. В конкретном воплощении лейкоз выбран из группы, состоящей из следующих: хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз.

В девятом аспекте согласно настоящему раскрытию дополнительно предложен способ лечения или предупреждения пролиферативного заболевания или задержки прогрессирования пролиферативного заболевания, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества или задерживающего заболевание эффективного количества антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему раскрытию, или фармацевтической композиции по настоящему раскрытию, или конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему раскрытию; где данное пролиферативное заболевание может представлять собой рак или опухоль. В некоторых воплощениях рак или опухоль представляют собой лимфому или лейкоз. В конкретном воплощении лимфома выбрана из группы, состоящей из следующих: диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома, неходжкинская лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома и лимфома из клеток мантии. В конкретном воплощении неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из следующих: агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая безболезненная NHL, трудно поддающаяся лечению NHL и трудно поддающаяся лечению безболезненная NHL. В конкретном воплощении лейкоз выбран из группы, состоящей из следующих: хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: результаты выявления ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) сывороточного титра мышей Balb/c, иммунизированных белком ECD (внеклеточный домен) человеческого CD79B-hFc.

Фиг. 2: результаты выявления FACS (флуоресцентная сортировка клеток) сывороточного титра мышей Balb/c, иммунизированных белком ECD человеческого CD79B-hFc.

Фиг. 3: результаты выявления ELISA сывороточного титра мышей SJL, иммунизированных белком ECD человеческого CD79B-hFc.

Фиг. 4: результаты выявления FACS сывороточного титра мышей SJL, иммунизированных белком ECD человеческого CD79B-hFc.

Фиг. 5: результаты выявления ELISA сывороточного титра мышей SJL, иммунизированных белком ECD человеческого CD79B-his.

Фиг. 6: результаты выявления FACS сывороточного титра мышей SJL, иммунизированных белком ECD человеческого CD79B-his.

Фиг. 7: результаты выявления ELISA мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B, где hIgG1 представляет собой антитело негативного контроля, и SN8 представляет собой антитело позитивного контроля.

Фиг. 8: результаты выявления FACS мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B, где hIgG1 представляет собой антитело негативного контроля, и SN8 представляет собой антитело позитивного контроля.

Фиг. 9: результаты выявления FACS в отношении перекрестной реактивности мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B, где mIgG представляет собой антитело негативного контроля; anti-cyno HR008 -мышиное моноклональное антитело против CD79B яванского макака, последовательность антитела которого происходит из мышиного моноклонального антитела против CD79B яванского макака (клон номер 10D10) в патенте WO 2009012268 A1, представляет собой антитело позитивного контроля.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины

Для облегчения понимания настоящего раскрытия определенные технические и научные термины конкретно определяются ниже. Если в данном документе где-нибудь еще ясно не определено иначе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, обычно понятные обычным специалистам в области, к которой относится настоящее раскрытие.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды аминокислот, используемые в настоящем раскрытии, являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, р3558 (1968).

«CD79B» относится к любому CD79B, происходящему из любого позвоночного, включая млекопитающего, такого как примат (например, человек и обезьяна Масаса (яванский макак)) и грызун (например, мышь или крыса). Термин «CD79B» охватывает «полноразмерный», не подвергавшийся процессингу CD79B и любую форму CD79B, подвергавшуюся процессингу из клеток. Данный термин также охватывает встречающиеся в природе варианты CD79B, например, сплайсированные варианты, аллельные варианты и изоформы. Полипептиды CD79B, описанные в данном документе, могут быть выделены из множества источников, таких как типы человеческих тканей или другие источники, или получены рекомбинантными или синтетическими способами.

Термин «антитело», описанный в настоящем раскрытии, относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру тетрапептидной цепи, состоящую из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, связанных межцепочечной(ными) дисульфидной(ными) связью(зями). Аминокислотный состав и последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина являются отличными таким образом, что их антигенность также является отличной. Согласно этому иммуноглобулины могут быть подразделены на пять типов или изотипов иммуноглобулинов, а именно: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и их соответствующие тяжелые цепи представляют собой цепь μ, цепь δ, цепь γ, цепь α и цепь ε соответственно. Тот же самый тип Ig может быть разделен на разные подклассы согласно разнице в аминокислотном составе шарнирной области и числу, и положению дисульфидных связей тяжелой цепи. Например, IgG может быть разделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкая цепь подразделяется на цепь κ или цепь λ посредством различия константной области. Каждый из пяти типов Ig может иметь цепь κ или цепь λ. Последовательность из примерно 110 аминокислот около N-конца тяжелой и легкой цепей антитела значительно варьирует и называется вариабельной областью (область V); остальная аминокислотная последовательность около С-конца является относительно стабильной и называется константной областью (область С). Вариабельная область включает 3 гипервариабельные области (HVR) и 4 каркасные области (FR) с относительно консервативными последовательностями. 3 гипервариабельные области определяют специфичность антитела и также известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) состоит из 3 областей CDR и 4 областей FR. Последовательностью от амино конца к карбокси концу является: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 3 области CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; 3 области CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и положение аминокислотных остатков CDR области VL и области VH антитела или антигенсвязывающего фрагмента соответствует известным правилам нумерации Chothia (ABM).

Термин «человеческое антитело» или «рекомбинантное человеческое антитело» включает человеческие антитела, полученные, экспрессируемые, созданные или выделенные посредством рекомбинантных способов, и участвующие методики и способы хорошо известны в данной области, как, например:

(1) антитела, выделенные из трансгенных и трансхромосомных животных (например, мышей) с генами иммуноглобулинов человека или из гибридом, полученных из них;

(2) антитела, выделенные из клеток-хозяев (таких как трансфектиономы), трансформированных для экспресии антител;

(3) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител; и

(4) антитела, полученные, экспрессируемые, созданные или выделенные другими методиками, которые используются для сплайсинга последовательностей генов иммуноглобулинов человека в другие последовательности ДНК.

Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные области и константные области, в которых используются специфические последовательности иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии, кодируемые генами зародышевой линии, но также включают последующие реаранжировки и мутации, такие как мутации, случающиеся во время созревания антител.

Термин «мышиное антитело» в настоящем раскрытии представляет собой моноклональное антитело против человеческого CD79B или его эпитопа, полученное согласно знаниям и квалификации в данной области. Во время получения опытному субъекту инъецируют антиген CD79B или его эпитоп, и затем выделяют гибридомы, экспрессирующие антитела с желательной последовательностью или функциональными свойствами. В конкретном воплощении настоящего раскрытия мышиное антитело против CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать константную область легкой цепи мышиной цепь κ, λ или ее вариант, или дополнительно содержит константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или его варианта.

Термин «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела по настоящему раскрытию могут включать аминокислотные остатки, которые не кодируются последовательностями иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии (как, например, мутации, введенные случайным или сайтнаправленным мутагенезом in vitro или посредством соматических мутаций in vivo). Однако термин «человеческое антитело» не включает антитела, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии другого вида млекопитающих (такого как мышь), были пересажены на последовательности человеческого каркаса (а именно «гуманизированные антитела»).

Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с пересаженными CDR, относится к антителу, полученному пересадкой последовательностей CDR видов, не являющихся человеком, в каркас вариабельных областей человеческого антитела. Оно может преодолевать сильные реакции иммунного ответа, индуцированные химерным антителом, так как оно несет большое количество белковых компонентов видов, не являющихся человеком. Для того чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, вариабельную область человеческого антитела можно подвергать минимальным обратным мутациям для поддержания активности.

«Химерное антитело» представляет собой антитело, образованное слиянием вариабельной области антитела первого вида с константной областью антитела второго вида, что может облегчать иммунный ответ, индуцированный антителом первого вида. Создание химерного антитела требует создания гибридомы, секретирующей специфичные моноклональные антитела первого вида, затем клонирования гена вариабельной области из клеток гибридомы первого вида (такого как мышь) и затем клонирования гена константной области антитела второго вида (такого как человек), связывания гена вариабельной области первого вида с геном константной области второго вида с образованием химерного гена, который вставляют в экспрессионный вектор, и, наконец, осуществления экспрессии молекулы химерного антитела в эукариотической промышленной системе или прокариотической промышленной системе. Константная область антитела второго вида (например, человека) может быть выбрана из группы, состоящей из следующих: константная область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или его варианта, предпочтительно включающая константную область тяжелой цепи человеческого IgG2 или IgG4, или применение IgG1 без ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после мутаций аминокислот.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к любому фрагменту, который сохраняет антигенсвязывающую активность интактного антитела. В частности, можно упомянуть фрагменты Fab, фрагменты Fab' фрагменты F(ab')₂ и фрагменты Fv или фрагменты sFv, которые связыватся с человеческим CD79B, но не ограничиваясь ими. Фрагмент Fv содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, но не имеет константной области и имеет наименьший фрагмент антитела со всеми антигенсвязывающими сайтами. В общем, Fv антитела также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, и может образовать структуру, требующуюся для связывания антигена. Разные линкеры также можно использовать для связывания двух вариабельных областей антитела в полипептидную цепь, которая называется одноцепочечное антитело или одноцепочечный Fv (sFv).

Термин «связывание с CD79B» в настоящем раскрытии относится к способности взаимодействовать с CD79B или его эпитопом. CD79B или его эпитоп может быть человеческого происхождения. Термин «антигенсвязывающий сайт» в настоящем раскрытии относится к линейному сайту или непрерывному трехмерному сайту на антигене, распознаваемому антителом или антигенсвязывающим фрагментом по настоящему раскрытию.

Термин «эпитоп» относится к сайту на антигене, который специфично связывается с иммуноглобулином или антителом. Эпитопы могут образоваться смежными аминокислотами или несмежными аминокислотами, которые подходят близко друг к другу посредством третичного свертывания белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно поддерживаются после воздействия денатурирующего растворителя, тогда как эпитопы, образованные третичным сворачиванием, обычно теряются после обработки денатурирующим растворителем. Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3-15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, что эпитоп связывается данным антителом, хорошо известны в данной области, включая анализы выявления посредством иммуноблоттинга, иммунопреципитации и т.д. Способы определения пространственной конформации эпитопа включают методики, известные в данной области, и методики, описанные в данном документе, например, рентгеновский анализ кристаллов, двухмерный ядерный магнитный резонанс и т.д.

Термин «специфичное связывание» и «селективное связывание» относится к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. В общем, когда в качестве аналита используется рекомбинантный человеческий CD79B или его эпитоп, а в качестве лиганда используется антитело, при измерении в приборе посредством технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR), антитело связывается с заданным антигеном или его эпитопом с константой диссоциации (K_D) приблизительно ниже 10^-7 М или даже меньше, и его аффинность связывания с заданным антигеном или его эпитопом по меньшей мере в два раза больше аффинности связывания с неспецифичными антигенами (такими как BSA (бычий сывороточный альбумин) и т.д.), отличными, чем заданный антиген (или его эпитоп) или близкородственные антигены.

Термин «перекрестная реакция» относится к способности антител по настоящему раскрытию связываться с CD79B из разных видов. Например, антитело по настоящему раскрытию, которое связывается с человеческим CD79B, также может связываться с CD79B другого вида. Перекрестная реактивность измеряется посредством выявления удельной реактивности с очищенным антигеном в анализах связывания (например, SPR и ELISA) или связывания, или функционального взаимодействия с клетками, которые физиологически экспрессируют CD79B. Способы определения перекрестной реактивности включают стандартные анализы связывания, как описано в данном документе, например, анализ поверхностным плазмонным резонансом или проточной цитометрией.

Термины «ингибировать» или «блокировать» используются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование CD79B

предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, которая наблюдается при связывании CD79B без ингибирования или блокирования. Также подразумевается то, что ингибирование и блокирование включают любое измеряемое уменьшение аффинности связывания с CD79B при контакте с антителом против CD79B по сравнению с CD79B, не контактирующим с антителом против CD79B.

Подразумевается то, что «ингибирование роста» (например, по отношению к клеткам) включает любое измеряемое уменьшение роста клеток.

Способы продуцирования и очистки антител или антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны и могут быть найдены в предшествующем уровне техники, как, например, в Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (главы 5-8 и 15). Например, человеческий CD79B или его фрагмент может использоваться для иммунизации мышей, и полученные антитела могут быть ренатурированы, очищены, и может быть осуществлено секвенирование аминокислот посредством традиционных способов. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены традиционными способами. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по изобретению является генетически модифицированным с введением одной или более чем одной человеческой области FR на области CDR, не являющиеся человеческими. Последовательности человеческого FR зародышевой линии можно получать на веб-сайте ImmunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr или из Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему раскрытию могут быть получены и очищены традиционными способами. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую цепь (SEQ ID NO: 20) и легкую цепь (SEQ ID NO: 21) можно клонировать и рекомбинировать в экспрессионный вектор GS. Рекомбинантный экспрессионный вектор иммуноглобулина можно стабильно трансфицировать в клетки СНО. В качестве более рекомендованного предшествующего уровня техники экспрессионные системы млекопитающего могут приводить к гликозилированию антител, особенно на высококонсервативном N-конце области Fc. Стабильные клоны получают осуществлением экспрессии антител, которые специфично связываются с человеческими антигенами. Позитивные клоны размножают в бессывороточной среде биореактора для продукции антител. Культуральная среда, в которую секретируются антитела, может быть очищена и отобрана традиционными методиками. Антитела могут быть отфильтрованы и сконцентрированы традиционными способами. Растворимые смеси и полимеры также могут быть удалены традиционными способами, например, молекулярными ситами и обменом ионов. Образующийся продукт нужно немедленно заморозить, как, например, при -70°С или лиофилизировать.

Антитело по настоящему раскрытию относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело (mAb), описанное в настоящем раскрытии, относится к антителу, полученному из линии клеток одного клона, причем указанная линия клеток не ограничивается линией клеток клона эукариотических, прокариотических клеток или фага. Моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинацией с использованием, например, методики гибридомы, технологии генной инженерии, технологии фагового дисплея, технологии синтеза (такой как пересадка CDR) или других существующих технологий.

Для скрининга антител на конкурентное связывание с тем же самым эпитопом можно использовать традиционные методики, известные специалистам в данной области. Например, можно проводить исследования по конкуренции и перекрестной конкуренции для получения антител, которые конкурируют или перекрестно конкурируют друг с другом за связывание с антигеном. Высокопроизводительный способ получения антител, которые связываются с тем же самым эпитопом, на основе их перекрестной конкуренции описывается в международной публикации патента WO 03/48731. Следовательно, для получения антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые конкурируют с молекулами антитела по настоящему раскрытию за связывание с тем же самым эпитопом на CD79B, можно использовать традиционные методики, известные специалистам в данной области.

Термины «передача», «введение» и «обработка», при применении к животным, человеку, экспериментальным субъектам, клеткам, тканям, органам или биологическим жидкостям, относятся к контакту экзогенного лекарственного средства, терапевтического средства, диагностического средства или композиции с животными, человеком, субъектами, клетками, тканями, органами или биологическими жидкостями. Термины «передача», «введение» и «обработка» могут относиться, например, к лечению, фармакокинетике, диагностике, исследованию и экспериментальным способам. Обработка клеток включает контакт реактивов с клетками и контакт реактивов с жидкостью, которая, в свою очередь, находится в контакте с клетками. Термины «передача», «введение» и «обработка» также относятся к обработке, например, клеток реактивами, диагностике, связыванию композициями или другой клеткой in vitro и ex vivo. Термин «осуществление обработки», при применении к человеческим, ветеринарным или исследовательским субъектам, относится к терапевтической обработке, профилактической обработке или профилактическим мерам, исследовательским и диагностическим применениям.

Термин «лечение» относится к внутренней или внешней подаче терапевтического средства, такого как композиция, содержащая любое одно из антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему раскрытию, субъекту, который уже имеет или подозревается в наличии, или является чувствительным к одному или более чем одному заболеванию или его симптому, и известно то, что данное терапевтическое средство имеет терапевтическое влияние на указанные симптомы. В общем, терапевтическое средство дают в эффективном количестве для облегчения одного или более чем одного симптома заболевания у обработанного субъекта или популяции либо для индукции регрессии таких симптомов, либо для ингибирования развития таких симптомов в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения любого конкретного симптома заболевания (также называется «терапевтически эффективным количеством») может варьировать согласно множеству факторов, например, состоянию заболевания субъекта, возрасту и массе тела, и способности лекарственного средства продуцировать желательный терапевтический эффект у субъекта. Были ли облегчены симптомы заболевания можно оценивать посредством любых способов клинического анализа, обычно используемых докторами или другими профессионалами сферы здравоохранения, для оценки тяжести или прогрессирования симптомов. Хотя воплощения настоящего раскрытия (например, способы лечения или продукты) могут быть неэффективными в облегчении целевого симптома заболевания у определенного субъекта, но, при определении согласно любым способам на основе статистического критерия, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Тепстра и критерий Вилкоксона, они должны уменьшать целевой симптом заболевания у статистически значимого числа субъектов.

«Эффективное количество» включает достаточное количество для уменьшения интенсивности или предупреждения симптомов или состояний медицинского состояния. Эффективное количество также относится к достаточному количеству для обеспечения или облегчения постановки диагноза. Эффективное количество для конкретного субъекта или ветеринарного субъекта может варьировать в зависимости от следующих факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья субъекта, способ, путь и дозировка введения, и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или схему дозировки, при которой избегаются значимые побочные эффекты или токсические эффекты.

«Идентичность» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. При занятии положений в двух последовательностях одинаковой мономерной субъединицей основания или аминокислоты, например, если каждое положение двух молекул ДНК занимается аденином, тогда данные молекулы являются гомологичными в данном положении. Процентная доля идентичности между двумя последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, которые делят данные две последовательности, с делением на число всех положений, подлежащих сравнению, ×100%. Например, в случае оптимального выравнивания последовательностей, если имеется 6 совпадений или гомологий в 10 положения в двух последовательностях, тогда данные две последовательности являются на 60% гомологичными. Вообще говоря, сравнение делается при выравнивании двух последовательностей с получением максимальной процентной доли идентичности.

Выражения «клетка», «линия клеток» и «культура клеток» в том виде, в котором они используются в данном документе, могут использоваться взаимозаменяемо, и все такие названия включают их потомство. Следовательно, термины «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичные опытные клетки и полученные из них культуры, независимо от числа пассажей. Также следует понимать, что из-за преднамеренных или непреднамеренных мутаций все потомство не может быть точно таким же в показателях содержания ДНК. В объем данного термина включается подвергнутое скринингу мутантное потомство с такой же функцией или биологической активностью, что и исходные трансформированные клетки. Когда термин относится к разным показаниям, это было бы очевидным из контекста.

Термин «возможный» или «возможно» означает то, что описанное событие или условия, которые следуют за термином «возможный», могут (но не обязательно) случаются, и описание включает случаи, где событие или условия случаются или не случаются. Например, фраза «возможно содержащий от 1 до 3 вариабельных областей тяжелой цепи антитела» означает то, что вариабельные области тяжелой цепи антитела конкретных последовательностей могут (но не обязательно) присутствуют.

Термин «фармацевтическая композиция» означает смесь, содержащую одно или более чем одно антитело или антигенсвязывающие фрагменты, или конъюгаты, описанные в данном документе, или физиологически/фармацевтически приемлемую соль или их пролекарство и другой(гие) химический(кие) компонент(ты), а также другие компоненты, такие как физиологически/фармацевтически приемлемый(мые) носитель(ли) и эксципиент(ты). Целью фармацевтической композиции является стимуляция введения в организм, что облегчает поглощение активного ингредиента и, посредством этого, оказание им биологической активности.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры включаются для дополнительного описания данного раскрытия, но данные примеры не ограничивают объем изобретения.

Экспериментальные способы, которые не определяют конкретные условия в Примерах или Опытных примерах настоящего раскрытия, обычно следуют традиционным условиям или условиям, рекомендованным изготовителем сырья или продукта. См. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; Current Protocols Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY. Реактивы без конкретных источников представляют собой традиционные реактивы, приобретенные на рынке.

Пример 1. Клонирование и экспрессия белковых антигенов Антитела (содержащие легкую и тяжелую цепи) и антигены конструировали посредством способов ПЦР (полимеразная цепная реакция) с перекрывающимися праймерами, известных в данной области, и фрагменты ДНК, полученные посредством ПЦР с перекрывающимися праймерами, вставляли в экспрессионный вектор рЕЕ6.4 (Lonza Biologies) посредством применения двух сайтов расщепления ферментов Hindlll/BstBI, и антитела, и антигены экспрессировались в клетках 293F (Invitrogen, кат.№R790-07). Полученный рекомбинантный белок использовали для иммунизации или скрининга. Последовательность человеческого гена CD79B получают из NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) (NP_000617.1), и его внеклеточная область (ECD) содержит 159 аминокислот (Met1-Asp159).

> Аминокислотная последовательность слитого белка внеклеточного домена (ECD) человеческого CD79B и человеческой области FC (ECD человеческого CD79B-hFc):

> Аминокислотная последовательность слитого белка внеклеточного домена (ECD) человеческого CD79B и His метки (ECD человеческого CD79B-His):

Пример 2. Получение мышиных моноклональных антител

1. Иммунизация мыши и выявление сывороточного титра Слитый белок внеклеточного домена (ECD) человеческого CD79B и человеческой области FC (ECD человеческого CD79B-hFc), и слитый белок внеклеточной области (ECD) человеческого CD79B и His метки (ECD человеческого CD79B-His) использовали в качестве иммуногенов для иммунизации мышей Balb/c и SJL посредством внутрибрюшинной инъекции, соответственно, для стимуляции мышей к продукции антител против внеклеточного домена (ECD) человеческого CD79B in vivo.

Экспериментальные стадии были следующими:

1) Иммунизация посредством внутрибрюшинной инъекции. Количество антигена, требующегося для данной иммунизации, рассчитывали согласно методике иммунизации. Белковый антиген разводили PBS до соответствующей концентрации антигена, как требуется, и затем данный антиген эмульгировали. Эмульгированную смесь антигена и адъюванта переносили в 2,0 мл стерильный шприц, уделяя внимание пузырькам сообщающегося с атмосферой воздуха. Хвост мыши ухватывали правой рукой, и кожу головы и шеи мыши легко ухватывали большим и указательным пальцем левой руки. При направлении брюшной полости вверх сайт инъекции на правой части живота мыши протирали ватным шариком с 75%-ным спиртом. Препарат антигена загружали в шприц заранее, причем заострение иглы было направлено вверх, и голова мыши была направлена вниз. Кончик иглы горизонтально вонзался в кожу, шприц вонзался в брюшную полость мыши под углом 45 градусов с брюшной полостью, и смесь антигена и адъюванта медленно инъецировалась. После того, как иммунизация была завершена, проводили наблюдение в течение по меньшей мере 2 ч.

2) Отбор мышиной сыворотки. Номера пробирок с сывороткой маркировали так, чтобы они соответствовали каждой мыши, и провряли номер на ухе мыши. Мышей захватывали одной рукой, и отбирали примерно 100 мкл цельной крови через подчелюстную вену. Отобранному образцу цельной крови давали постоять при комнатной температуре в течение примерно 2 ч; затем сыворотку в верхней части центрифужной пробирки отбирали центрифугированием. Данная сыворотка могла храниться в холодильнике при 4°С в пределах одной недели для выявления титра антител и других родственных экспериментов. Сыворотка могла храниться в холодильнике при -80°С для долговременного хранения для того, чтобы избегать повторного замораживания и оттаивания.

3) Выявление сывороточного титра иммунизированных мышей посредством ELISA. Перед началом данного эксперимента 96-луночный планшет метили соответствующим образом и покрывали антигеном в концентрации 1 мкг/мл, 50 мкл на лунку в течение ночи в холодильнике при 4°С .На следующие сутки планшет с антигеном, покрытый сутками ранее, вынимали и промывали с использованием промывателя планшетов (промывочный раствор: 1×PBST (фосфатно-солевой буферный раствор с Tween)). После промывки данный планшет блокировали блокирующим раствором 1%-ного BSA (бычий сывороточный альбумин), приготовленным в 1×PBST, при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли разные разведения сыворотки, подлежащие анализу, и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли 100 мкл разведенного 1:5000 вторичного козьего антитела против мышиного антитела и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 0,5 ч. После промывки данного планшета хромогенный раствор А и В ТМВ (тетраметилбензидин) смешивали в соотношении 1:1 и затем происходило развитие окрашивания. Реакцию проявки завершали с использованием 1 н. соляной кислоты через 15 мин. Значения флуоресценции при 450 нм выявляли на многофункциональном планшет-ридере Spectra Max М5.

4) Выявление сывороточного титра иммунизированных мышей посредством FACS. Суспензии клеток DoHH2 или обезьяньих одноядерных клеток периферической крови центрифугировали, и данные клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, и подсчитывали. Добавляли подлежащую анализу сыворотку каждой группы иммунизированных мышей. После 60 мин инкубации при комнатной температуре данные клетки три раза промывали и затем добавляли вторичное антитело против Fc мышиного IgG, конъюгированное с FITC (флуоресцеин изотиоцианат). После 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте клетки три раза промывали и аккуратно ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, для выявления на приборе.

Результаты выявления сывороточного титра ELISA и FACS для каждой группы мышей показаны на Фиг. 1-Фиг. 7.

Пять мышей Balb/c иммунизировали белком ECD человеческого CD79b-hFc, пронумерованным 5491, 5492, 5493, 5494 и 5495. Результаты выявления сывороточного титра посредством ELISA показаны на Фиг. 1. Данные результаты показали то, что сывороточный титр у иммунизированных мышей достигал больше, чем 1:100К. Результаты выявления сывороточного титра посредством FACS показаны на Фиг. 2. Можно видеть то, что антитела, продуцированные в мышиной сыворотке, могли специфично распознавать белок CD79B на поверхности клеток DoHH2.

Пять мышей SJL иммунизировали белком ECD человеческого CD79b-hFc, пронумерованным 5496, 5497, 5498, 5499 и 5500. Результаты выявления сывороточного титра посредством ELISA показаны на Фиг. 3. Данные результаты показали то, что сывороточный титр у иммунизированных мышей достигал больше, чем 1:100К. Результаты выявления сывороточного титра посредством FACS показаны на Фиг. 4. Можно видеть то, что антитела, продуцированные в мышиной сыворотке, могли специфично распознавать белок CD79B на поверхности клеток DoHH2.

Пять мышей SJL иммунизировали белком ECD человеческого CD79b-his, пронумерованным 5726, 5727, 5728, 5729 и 5730. Результаты выявления сывороточного титра посредством ELISA показаны на Фиг. 5. Данные результаты показали то, что сывороточный титр у иммунизированных мышей достигал больше, чем 1:10K. Результаты выявления сывороточного титра мышей посредством FACS показаны на Фиг. 6. Можно видеть то, что антитела, продуцированные в мышиной сыворотке, могли специфично распознавать белок CD79B на поверхности клеток DoHH2.

Из приведенных выше результатов может быть известно то, что иммунизированные мыши продуцировали специфичные антитела против CD79B, и вышеупомянутые мыши могли использоваться для слияния клеток для получения линий клеток гибридомы, способных секретировать специфичные антитела против CD79B.

2. Получение гибридомы и скрининг антител

Слияние клеток индуцируется спонтанно или искусственно для стимуляции слияния мышиных лимфоцитов и миеломных клеток SP2/0 (АТСС, CCL-121™) в гибридомные клетки, которые имеют функцию секреции антител и могут бесконечно пролиферировать. Лимфоциты иммунизированной группы мышей и миеломных клеток сливали посредством применения способа электрослияния, и гибридомные клетки использовали для последующего скрининга антител.

1) Эксперимент по электрослиянию. За одну неделю до слияния клетки SP2/0 размножали в 10%-ной среде DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко). У умерщвленных мышей удаляли селезенку и лимфатические узлы в боксе биологической безопасности, промывали и растирали в чашках Петри, и отбирали лимфоциты. SP2/0 и лимфоциты смешивали в заданной пропорции, слияние осуществляли с использованием прибора электрослияния, и устанавливали программу. После слияния клетки высаживали в 96-луночный планшет и культивировали в инкубаторе при 37°С, 5% CO₂. Состояние клеток наблюдали каждые сутки, и показатель слияния клеток подсчитывали через 5 суток после слияния. Слитые гибридомные клетки подвергали скринингу через 9-14 суток после слияния, и клетки в позитивной лунке отбирали для размножения в 24-луночном планшете.

2) Субклонирование способом ограниченного разведения. Линии клеток, подлежащие субклонированию, ресуспендировали из 24-луночных культуральных лунок и подсчитывали. Каждую линию клеток разводили до концентрации клеток 5-10 клеток/мл. Разведенную клеточную суспензию добавляли в 15 см одноразовые культуральные чашки, и 0,2 мл добавляли в каждую лунку 96-луночного культурального планшета, причем каждая лунка содержит 1-2 клетки. 96-луночный планшет, инокулированный клетками, помещали в инкубатор при 37°С, 5% CO₂ для культивирования. Через 7-10 суток планшет для субклонирования выявляли и подвергали скринингу согласно ростовому статусу клеток, и позитивные клоны отбирали и переносили в 24 лунки для дальнейшего подтверждения позитивных.

3) Скрининг ELISA. Перед началом эксперимента 96-луночный планшет метили соответствующим образом и покрывали антигеном в концентрации 1 мкг/мл, 50 мкл на лунку в течение ночи в холодильнике при 4°С.На следующие сутки планшет с антигеном, покрытый сутками ранее, вынимали и промывали с использованием промывателя планшетов (промывочный раствор: 1×PBST). После промывки данный планшет блокировали 1%-ным блокирующим раствором BSA, приготовленным в 1×PBST, при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли 50 мкл супернатанта клеток, подлежащего анализу, и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли 100 мкл разведенного 1:5000 вторичного козьего антитела против мышиного антитела и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 0,5 ч. После промывки данного планшета хромогенный раствор А и В ТМВ смешивали в соотношении 1:1, и затем происходило развитие окрашивания. Реакцию проявки завершали с использованием 1 н. соляной кислоты через 15 мин. Значения флуоресценции при 450 нм выявляли на многофункциональном планшет-ридере Spectra Max М5.

4) Скрининг FACS. Суспензии клеток DoHH2 центрифугировали, и данные клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, и подсчитывали. Добавляли подлежащий анализу супернатант клеток. После 60 мин инкубации при комнатной температуре данные клетки три раза промывали и затем добавляли вторичное антитело против Fc мышиного IgG, конъюгированное с FITC. После 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте клетки три раза промывали и аккуратно ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, для выявления на приборе.

5) Идентификация позитивных клонов гибридомы. После слияния и скрининга субклонов мышиных клеток селезенки авторы данного изобретения получали целый ряд специфичных антител против человеческого антигена CD79B. Среди них 17 гибридом с наилучшей способностью к связыванию в ELISA и FACS использовали для продукции и очистки антител. Результаты по выявлению ELISA супернатанта культуры позитивных клонов клеток гибридомы против человеческого CD79B показаны в Таблице 1. Результаты по выявлению FACS супернатанта культуры позитивных клонов клеток гибридомы против человеческого CD79B показаны в Таблице 2. mIgG использовали в качестве негативного контроля как в анализе ELISA, так и FACS.

3. Продукция, очистка и идентификация мышиных моноклональных антител

1) Продукция и очистка мышиных моноклональных антител. Клетки гибридомы, используемые для продукции антител, наблюдали под микроскопом. Данные клетки отбирали при выращивании до не более чем 70% и при хорошем состоянии клеток и подсчитывали с использованием счетчика клеток Countstar IC1000. Концентрацию клеток доводили до 1×10⁵ - 5×10⁵ клеток/мл с использованием хорошо приготовленной среды, и клетки переносили в роллерные флаконы. Роллерные флаконы с перенесенными клетками загружали на инкубатор для роллерных флаконов для инкубации при 37°С в течение 10-15 суток. Статус роста клеток наблюдали каждые сутки. Данную культуру вынимали для очистки после того, как среда становилась оранжевой и прозрачной. Антитела очищали пропусканием супернатанта клеток через колонки с белком А, и очистку проводили согласно традиционным способам.

2) Выявление ELISA мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B. Перед началом эксперимента 96-луночный планшет метили соответствующим образом и покрывали антигеном в концентрации 1 мкг/мл, 50 мкл на лунку в течение ночи в холодильнике при 4°С. На следующие сутки планшет с антигеном, покрытый сутками ранее, вынимали и один раз промывали с использованием промывателя планшетов (промывочный раствор: 1×PBST). После промывки данный планшет блокировали блокирующим раствором 1%-ного BSA, приготовленным в 1×PBST, при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли 50 мкл антитела, разведенного до 100 нМ (1:10), и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 1 ч. После промывки данного планшета промывочным раствором 1×PBST 3 раза добавляли 100 мкл разведенного 1:5000 вторичного козьего антитела против мышиного антитела и инкубировали в инкубаторе при 37°С в течение 0,5 ч. После промывки данного планшета хромогенный раствор А и В ТМВ смешивали в соотношении 1:1 и затем происходило развитие окрашивания. Реакцию проявки завершали с использованием 1 н. соляной кислоты через 15 мин. Значения флуоресценции при 450 нм выявляли на многофункциональном планшет-ридере Spectra Max М5. Среди них три мышиных моноклональных антитела против человеческого CD79B имели самую сильную способность к связыванию в ELISA, включая mAb015, mAb016 и mAb017 (см. Фиг. 7 относительно конкретных данных). Среди них hIgG1 был антителом негативного контроля, и SN8 был антителом позитивного контроля. SN8 представляет собой антитело, используемое в конъюгированном с антителом лекарственном средстве полатузумаб ведотин, разработанном Roche Pharmaceuticals (относительно последовательности дается ссылка на источник последовательности: US 20170362318 А). В настоящее время полатузумаб ведотин был одобрен FDA (Управление США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств) для распространения на рынке. Из результатов можно видеть то, что в эксперименте ELISA способность к связыванию трех мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B: mAb015, mAb016 и mAb017, отобранных предпочтительно по настоящему раскрытию, была аналогичной способности к связыванию SN8.

3) Выявление FACS мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B. После центрифугирования суспензии клеток DoHH2 данные клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, и подсчитывали. Добавляли 100 мкл антитела, разведенного до 100 нМ (1:10), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки данных клеток три раза добавляли вторичное антитело против Fc мышиного IgG, конъюгированное с FITC. После 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте клетки три раза промывали и аккуратно ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, для выявления на приборе. Среди них три мышиных моноклональных антитела против человеческого CD79B имели наивысшую активность связывания в FACS, включая mAb015, mAb016 и mAb017 (см. Фиг. 8 относительно конкретных данных). Среди них hIgG1 представлял собой антитело негативного контроля, и SN8 представлял собой антитело позитивного контроля. Из данных результатов может быть известно то, что в эксперименте FACS способность связывания трех мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B: mAb015, mAb016 и mAb017, предпочтительно отобранных по настоящему раскрытию, была лучше, чем SN8.

4) Выявление FACS перекрестной активности мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B. Клетки 293F-cynoCD79B получали способом временной трансфекции. После центрифугирования клеточной суспензии клетки ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, и подсчитывали. Добавляли 100 мкл антитела в концентрациях 10 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно. Данные клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания клеток три раза добавляли вторичное антитело против Fc мышиного IgG, конъюгированное с FITC. После 30 мин инкубации при комнатной температуре в темноте данные клетки три раза промывали и аккуратно ресуспендировали в PBS, содержащем 0,1% BSA, для выявления на приборе. Результаты выявления FACS, показывающие перекрестную активность мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B, показаны на Фиг. 9, где mIgG1 представляет собой антитело негативного контроля, anti-cyno HR008 представляет собой мышиное моноклональное антитело против CD79B яванского макака, последовательность антитела которого происходит из мышиного моноклонального антитела против CD79B яванского макака (номер клона 10D10) в патенте WO 2009012268 A1. Из данных результатов можно видеть то, что все мышиные моноклональные антитела против человеческого CD79B, подвергнутые скринингу в данном раскрытии, не распознавали CD79B яванского макака.

5) Выявление SPR (поверхностный плазмонный резонанс) мышиных моноклональных антител против человеческого CD79B. Аффинность между антителом против человеческого CD79B и его антигеном - человеческим CD79B-His выявляли поверхностным плазмонным резонансом (SPR). Антиген -человеческий белок CD79B-His иммобилизовали на чипе СМ5. Был установлен уровень связывания 100 RU (единицы ответа). Проточным буфером был HBS-EP+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,05% поверхностно-активное вещество Р20). Разведенное антитело протекало через опытный канал и контрольный канал со скоростью тока 30 мкл/мин в течение 3 мин, и диссоциацию осуществляли в течение 5 мин. Затем прогоняли регенерирующий буфер (10 мМ глициновый буфер, рН 1,5) при скорости тока 30 мкл/мин в течение 30 с. Данные анализировали с использованием программы Biacore 8К evaluation.

Пример 3. Определение аминокислотной последовательности вариабельной области мышиного моноклонального антитела

Линии моноклональных клеток высокоаффинной гибридомы, полученные в Примере 2, подвергали определению аминокислотной последовательности вариабельной области. Затем рекомбинантно экспрессировали человеческие и мышиные химерные антитела (сАЬ), и затем осуществляли дополнительную идентификацию антител. Вариабельные области тяжелой и легкой цепи гена антитела амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) с обратной транскрипцией, связывали с вектором и секвенировали с получением последовательности легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела. Во-первых, общую клеточную РНК одиночных линий клеток с хорошей активностью в Примере 2 экстрагировали посредством применения набора для очистки РНК (Qiagen, номер товара 74134, см. спецификацию относительно стадий). Затем получали одноцепочечую кДНК посредством применения набора для синтеза кДНК (Invitrogen, номер товара 18080-051), то есть, олиго-dT праймера кДНК обратной транскрипции. Ее использовали в качестве матрицы для синтеза последовательностей вариабельной области легкой и тяжелой цепи антитела посредством способа ПЦР, и ПЦР-продукт клонировали в ТА вектор pMD-18T и затем высылали для секвенирования. Полученные последовательности легкой и тяжелой цепи антитела, соответственно, клонировали в экспрессионный вектор (см. Пример 1 относительно способа), рекомбинантное моноклональное антитело экспрессировали, подтверждали активность (см. Пример 2 относительно способа) и затем проводили работу по гуманизации.

Аминокислотные остатки CDR VH/VL антитела против человеческого CD79B в настоящем раскрытии определяются и аннотируются системой нумерации Chothia.

> Вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела мышиной гибридомы mAb015:

> Вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела мышиной гибридомы mAb015:

> Вариабельная область тяжелой цепи антитела мышиной гибридомы mAb017:

> Вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела мышиной гибридомы mAb017:

> Вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела мышиной гибридомы mAb016:

≥ Вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела мышиной гибридомы mAb016:

Последовательности мышиных CDR согласно правилам нумерации Chothia показаны в Таблице 3:

Пример 4. Гуманизация антител против человеческого CD79B После выравнивания устанавливали гомологию последовательностей легкой и тяжелой цепи мышиных моноклональных антител против CD79B, полученных в Примере 3, относительно модели гуманизированного антитела базы данных антител. Согласно данной модели были отобраны оптимальные гуманизированные моноклональные антитела против CD79B в качестве предпочтительных молекул посредством скрининга обратными мутациями. Данный способ начинался с поиска опубликованной модели кристаллической структуры мышиного Fab базы данных (такой как база данных PDB) на кристаллические структуры, аналогичные или гомологичные структуре полученных молекул мышиного кандидата, и кристаллические структуры Fab с высоким разрешением (как, например, меньше 2,5 А) отбирали для установления мышиной модели Fab. Последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного антитела сравнивали с последовательностями в данной модели. Последовательности, согласующиеся с последовательностями мышиного антитела в модели, сохраняли для получения структурной модели мышиного антитела; несогласующиеся аминокислоты были потенциальными сайтами обратной мутации. Структурную модель мышиного антитела прогоняли с использованием программы Swiss-pdb viewer для оптимизации энергии (минимизации). Аминокислоты в разных положениях в данной модели (за исключением CDR) подвергали обратной мутации, и полученные (гуманизированные) мутантные антитела сравнивали с антителами перед гуманизацией на выявление активности. Гуманизированные антитела с хорошей активностью сохраняли. Затем области CDR оптимизировали, включая избежание сайтов гликозилирования, дезамидирования и окисления. Описанные выше антитела клонировали, экспрессировали и очищали посредством способов клонирования генов и рекомбинантной экспрессии. После выявления посредством SPR и т.д. гуманизированные антитела hAb015 и hAb017, которые сохраняли наилучшую активность, наконец отбирали. См. Таблицу 4 относительно конкретных данных. Гуманизированные антитела hAb015 и hAb017 сохраняли аналогичную аффинность и связанные функции, как и мышиные моноклональные антитела.

Последовательности гуманизированных антител hAb015 и hAb017 показаны ниже.

> Последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела hAb015:

> Последовательность легкой цепи гуманизированного антитела hAb015:

> Последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела hAb017:

> Последовательность легкой цепи гуманизированного антитела hAb017:

Пример 5. Эндоцитоз антител против CD79B

Для того чтобы проанализировать, могли ли антитела против CD79B в настоящем раскрытии эндоцитироваться в клетки наряду с человеческим CD79B после связывания с человеческим CD79B, проводили эксперимент по эндоцитозу с клетками DOHH-2 (DSMZ, АСС 47) с высоким уровнем экспрессии человеческого белка CD79B для оценки способности данных антител эндоцитироваться.

Клетки DOHH-2 культивировали согласно подходящему традиционному способу для суспензионных клеток. Состав полной среды был следующим: среда RPMI 1640 (GIBCO, кат. №: 11835-030) плюс 10% (об./об.) фетальная телячья сыворотка (FBS) (GIBCO, кат .№: 10099-141) и пенициллин/стрептомицин (GIBCO, кат. №: 15070-063).

В данном эксперименте клетки отбирали посредством низкотемпературного центрифугирования при 4°С, 1000 об./мин в течение 5 мин. Данные клетки ресуспендировали в 10-15 мл буфера FACS, предварительно охлажденного на льду. Состав буфера FACS был следующим: фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), рН 7,4, плюс 2% фетальной телячьей сыворотки (FBS). Во время всего эксперимента буфер FACS предварительно охлаждали на льду. После центрифугирования и подсчета клетки добавляли в 96-луночный планшет в количестве 300000 клеток/лунку. После центрифугирования и отбрасывания супернатанта добавляли 12,5 мкг/мл раствора, блокирующего Fc (BD, кат. №: 564220) в объеме 100 мкл/лунку. Данные клетки блокировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем в соответствующие лунки добавляли 20 мкг/мл антител против CD79B, подлежащих анализу, и инкубировали при 4°С в темноте в течение 1 ч. Данные клетки дважды промывали предварительно охлажденным буфером PBS для удаления несвязавшихся антител. Добавляли полную клеточную среду (среда RPMI 1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки), и клетки инкубировали при 37°С и 5% CO₂ в течение 0 ч, 1 ч, 2 ч или 4 ч. После центрифугирования и отбрасывания супернатанта добавляли 100 мкл/лунку 2%-ного буфера PFA (параформальдегид). Данные клетки ресуспендировали и давали им постоять в течение 10 мин. Затем данные клетки промывали буфером FACS 3 раза, затем добавляли 100 мкл раствора вторичного антитела (флуоресцентно меченое вторичное антитело козы против человеческого антитела: разведение 1:250 с концентрацией 2 мкг/мл, Biolegend, кат. №409304) и инкубировали при 4°С в темноте в течение 0,5 ч. Добавляли предварительно охлажденный буфер PBS и центрифугировали при 4°С с отбрасыванием супернатанта, повторяя три раза. Клетки ресуспендировали в буфере FACS в объеме 200 мкл/лунку и выявляли проточной цитометрией (BD FACS Calibur).

Результаты показали то, что ни одно из трех антител: SN8, hAb015 и hAb017 не могло эндоцитироваться клетками DOHH-2 при инкубации при 4°С. Тем временем, при инкубации при 37°С большинство антител эндоцитировалось клетками DOHH-2 через 1 ч, и эндоцитоз антител достигал максимума после 4 ч. Все 3 антитела относительно хорошо эндоцитировались.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> TUOJIE BIOTECH(SHANGHAI) CO., LTD.

<120> АНТИТЕЛО ПРОТИВ CD79B, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702007CPCT

<150> 201910083330.4

<151> 2019-01-28

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 433

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (0)..(433)

<223> Человеческое CD79B ECD-hFc

<400> 1

Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser

1 5 10 15

Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr

20 25 30

Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp

35 40 45

Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr

115 120 125

Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe

130 135 140

Ile Ile Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala

145 150 155 160

Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr

165 170 175

Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp

180 185 190

Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

195 200 205

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

210 215 220

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

225 230 235 240

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

245 250 255

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

260 265 270

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

275 280 285

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

290 295 300

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

305 310 315 320

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

325 330 335

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

340 345 350

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

355 360 365

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

370 375 380

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

385 390 395 400

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

405 410 415

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

420 425 430

Lys

<210> 2

<211> 207

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (0)..(207)

<223> Человеческое CD79B ECD-His

<400> 2

Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser

1 5 10 15

Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr

20 25 30

Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp

35 40 45

Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu

50 55 60

Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu

100 105 110

Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr

115 120 125

Leu Lys Asp Gly Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe

130 135 140

Ile Ile Val Pro Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala

145 150 155 160

Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr

165 170 175

Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp

180 185 190

Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu His His His His His His

195 200 205

<210> 3

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(117)

<223> Вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела

мышиной гибридомы mAb015

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(112)

<223> Вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела

мышиной гибридомы mAb015

<400> 4

Asp Phe Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Arg Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 119

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(119)

<223> Вариабельная область тяжелой цепи моноклонального антитела

мышиной гибридомы mAb017

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Asp Tyr Asp Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 6

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(112)

<223> Вариабельная область легкой цепи моноклонального антитела

мышиной гибридомы mAb017

<400> 6

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His His

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(7)

<223> CDR1 тяжелой цепи mAb015

<400> 7

Gly Ser Ser Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(6)

<223> CDR2 тяжелой цепи mAb015

<400> 8

Phe Pro Arg Ser Gly Asn

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(8)

<223> CDR3 тяжелой цепи mAb015

<400> 9

Gly Asp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(16)

<223> CDR1 легкой цепи mAb015

<400> 10

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(7)

<223> CDR2 легкой цепи mAb015 mAb016 mAb017

<400> 11

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(9)

<223> CDR3 легкой цепи mAb015 mAb016 mAb017

<400> 12

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(7)

<223> CDR1 тяжелой цепи mAb017

<400> 13

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(6)

<223> CDR2 тяжелой цепи mAb017

<400> 14

Tyr Pro Arg Ser Gly Asn

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(10)

<223> CDR3 тяжелой цепи mAb017

<400> 15

Gly Ser Asp Tyr Asp Gly Asp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(16)

<223> CDR1 легкой цепи mAb017

<400> 16

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His His Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 17

<211> 117

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(117)

<223> Вариабельная область тяжелой цепи mAb016

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ile Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ser Arg Gly Glu Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 112

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(112)

<223> Вариабельная область легкой цепи mAb016

<400> 18

Val Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 447

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(447)

<223> Последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела

hAb015

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Asp Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(219)

<223> Последовательность легкой цепи гуманизированного антитела

hAb015

<400> 20

Asp Phe Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 449

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(449)

<223> Последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела

hAb017

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Asp Tyr Asp Gly Asp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 22

<211> 219

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<222> (0)..(219)

<223> Последовательность легкой цепи гуманизированного антитела

hAb017

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His His

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(7)

<223> CDR1 тяжелой цепи mAb016

<400> 23

Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(6)

<223> CDR2 тяжелой цепи mAb016

<400> 24

Phe Pro Gly Ser Gly Asn

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(8)

<223> CDR3 тяжелой цепи mAb016

<400> 25

Gly Glu Leu Gly Asp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 26

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(16)

<223> CDR1 легкой цепи mAb016

<400> 26

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 27

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (0)..(7)

<223> CDR1 тяжелой цепи hAb015

<400> 7

Gly Ser Ser Phe Ser Ser Tyr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу против человеческого CD79B, или его антигенсвязывающему фрагменту, способу его получения, а также к композиции и конъюгату, его содержащему. Также раскрыты полинуклеотид, кодирующий антитело против человеческого CD79B, или его антигенсвязывающий фрагмент, а также вектор и клетка-хозяин, его содержащие. Изобретение эффективно для лечения рака или опухоли, характеризующихся экспрессией CD79B. 9 н. и 20 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит любое одно, выбранное из следующего (I)-(III):

(I) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 7 или 27, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно;

(II) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно;

(III) вариабельная область тяжелой цепи, содержащая HCDR1, HCDR2 и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, содержащая LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно.

2. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в котором:

вариабельная область тяжелой цепи содержит:

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 3, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 3; или

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 5, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 5;

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 17, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью c SEQ ID NO: 17;

и/или вариабельная область легкой цепи содержит:

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 4, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 4; или

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 6, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 6;

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 18, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 18.

3. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, в котором:

вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 3, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 4; или

вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 5, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 6; или

вариабельная область тяжелой цепи антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 17, и вариабельная область легкой цепи является такой, как показано в SEQ ID NO: 18.

4. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которое представляет собой мышиное антитело, химерное антитело, человеческое антитело или гуманизированное антитело или его фрагмент.

5. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, которое представляет собой гуманизированное антитело, с его тяжелой цепью, содержащей: последовательность, как показано в SEQ ID NO: 19, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 19; или

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 21, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 21;

и/или легкая цепь содержит: последовательность, как показано в SEQ ID NO: 20, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 20; или

последовательность, как показано в SEQ ID NO: 22, или последовательность с по меньшей мере 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной или 99%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 22.

6. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, в котором тяжелая цепь антитела против CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 19, и легкая цепь является такой, как показано в SEQ ID NO: 20; или

тяжелая цепь антитела против человеческого CD79B или антигенсвязывающего фрагмента является такой, как показано в SEQ ID NO: 21, и легкая цепь является такой, как показано в SEQ ID NO: 22.

7. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, в котором:

гуманизированное антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или его варианта;

антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab'-SH, Fv, scFv и/или фрагмента (Fab')₂.

8. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, в котором гуманизированное антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2 или IgG4.

9. Антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, в котором гуманизированное антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи человеческого lgG1 или lgG2.

10. Конъюгат антитело против человеческого CD79B - лекарственное средство для применения в лечении рака или опухоли, характеризующихся экспрессией CD79B, в котором антитело включает антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9.

11. Конъюгат антитело против человеческого CD79B - лекарственное средство по п. 10, в котором указанный конъюгат антитело-лекарственное средство содержит цитотоксическое средство.

12. Конъюгат антитело против человеческого CD79B - лекарственное средство по п. 11, в котором указанное цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из токсина, химиотерапевтического средства, антибиотика, радиоактивного изотопа и нуклеолитического фермента.

13. Полинуклеотид, кодирующий антитело против человеческого CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9.

14. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 13, который представляет собой эукариотический вектор, прокариотический вектор или вирусный вектор.

15. Клетка-хозяин для экспрессии антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая вектор по п. 14.

16. Клетка-хозяин по п. 15, в которой указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, дрожжевую клетку или клетку млекопитающего.

17. Клетка-хозяин по п. 16, в которой указанная клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli, Pichia pastoris, клетку яичника китайского хомяка или клетку человеческой эмбриональной почки 293.

18. Способ получения антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий:

осуществление экспрессии антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине по п. 15 и выделение антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

19. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака или опухоли, характеризующихся экспрессией CD79B, содержащая:

любой один из или любую их комбинацию, выбранную из следующего: антитело против CD79B или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, конъюгат антитело-лекарственное средство по пп. 10-12, полинуклеотид по п. 13, вектор по п. 14; и

фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.

20. Применение антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, конъюгата антитело-лекарственное средство по пп. 10-12, полинуклеотида по п. 13 или вектора по п. 14 в получении лекарственного средства или фармацевтической композиции, где:

лекарственное средство или фармацевтическую композицию применяют для лечения рака или опухоли, характеризующихся экспрессией CD79B.

21. Применение по п. 20, где рак или опухоль, характеризующиеся экспрессией CD79B, представляют собой лимфому или лейкоз.

22. Применение по п. 21, где лимфома выбрана из группы, состоящей из следующего: диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома, неходжкинская лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома и лимфома из клеток мантии.

23. Применение по п. 22, где неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из следующего: агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая безболезненная NHL, рефрактерная NHL, рефрактерная безболезненная NHL.

24. Применение по п. 21, где лейкоз выбран из группы, состоящей из следующего: хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз.

25. Способ лечения рака или опухоли, характеризующихся экспрессией CD79B, включающий:

введение субъекту эффективного количества антитела против человеческого CD79B или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, конъюгата антитело-лекарственное средство по пп. 10-12, полинуклеотида по п. 13, вектора по п. 14, фармацевтической композиции по п. 19 или любой их комбинации.

26. Способ по п. 25, в котором рак или опухоль, характеризующиеся экспрессией CD79B, представляют собой лимфому или лейкоз.

27. Способ по п. 26, в котором указанная лимфома выбрана из группы, состоящей из следующего: диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома, неходжкинская лимфома, мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома и лимфома из клеток мантии.

28. Способ по п. 27, в котором неходжкинская лимфома выбрана из группы, состоящей из следующего: агрессивная NHL, рецидивирующая агрессивная NHL, рецидивирующая безболезненная NHL, рефрактерная NHL и рефрактерная безболезненная NHL.

29. Способ по п. 26, в котором лейкоз выбран из группы, состоящей из следующего: хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз и острый лимфоцитарный лейкоз.