Штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16 AP (BKM Y-3389D) для получения белка Российский патент 2023 года по МПК C12N1/16 C12P21/00 C12R1/645 

Изобретение относится к промышленной биотехнологии и может быть использовано для производства белка, применяемого в кормопроизводстве для сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы (аквакультуры).

Высокопродуктивное животноводство, птицеводство и рыбоводство имеют потребность в комбикормах, богатых белком. Особенностью климатических условий Российской Федерации является производство продукции растениеводства с низким содержанием белка. В результате нехватка белка для производства кормов в Российской Федерации по экспертным оценкам составляет около 2 млн. тонн в год. Эта нехватка частично удовлетворяется за счет импорта таких источников белка как соевый шрот и рыбная мука, а частично, - за счет увеличения доли фуражного зерна в составе комбикормов, доходящая до 70%.

По этой причине создание крупнотоннажного отечественного производства белка, способного конкурировать по цене с импортируемыми соевым шротом и рыбной мукой, является актуальной задачей.

Во второй половине 20 века активно велись работы по созданию крупнотоннажных производств белка, с использованием промышленных штаммов микроорганизмов, способных синтезировать клеточный белок, потребляя непищевое сырье в качестве единственного источника углерода и энергии. В частности, в СССР было создано крупнейшее в мире микробиологическое производство белка путем управляемого культивирования дрожжей рода Candida на питательной среде с парафинами нефти, являвшимися отходами нефтепереработки. По оценке западных экспертов в СССР производилось около 70% мирового производства белка, получаемого с помощью микробиологических процессов. Однако используемый в этом производстве штамм дрожжей рода Candida Albicans обладал патогенностью и вызывал различные инфекционные заболевания у персонала, занятого на этих производствах. Более того, воздушные выбросы предприятий, содержащие получаемый с помощью этого штамма белок, стали причиной острых аллергических заболеваний населения, живущего в населенных пунктах около указанных промышленных производств. По этой причине, в конце 80-х годов это крупнейшее в мире микробиологическое производство белка было полностью прекращено.

Одновременно с этим в СССР и во многих зарубежных странах велись исследования по микробиологическому производству белка (в англоязычных публикациях такой белок получил название single cell protein) на питательной среде с метанолом как единственным источником углерода и энергии, используемым микроорганизмами для биосинтеза белка. В результате этих работ были получены патенты на штаммы микроорганизмов-продуцентов белка, использующих метанол в качестве единственного источника углерода и энергии.

В частности, известен штамм метилотрофных бактерий Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 (патент SU 989867 А1), который является продуцентом белка, получаемого на минеральной питательной среде с метанолом.

Известен штамм метилотрофных бактерий Methylomonas methanolica NRRL-B- 5458 (Патент США US 4048013 A), который был также предложен для получения белка при использовании метанола в качестве единственного источника углерода и энергии.

Известен штамм (Патент Китая CN 103484395 А) метилотрофных бактерий Methylovorus glucosotrophus М25 (CGMCC No.7036), культивируемых на питательной среде с метанолом, и используемых для производства белка, применяемого в качестве добавки в корм для сельскохозяйственных животных.

В Великобритании химический концерн ICI в 70-е и 80-е годы разработал и создал промышленное производство кормового белка под торговой маркой Pruteen с использованием метилотрофных бактерий Methylophilus methilotropus (патент СА 3008874), растущих в аэробных условиях на питательной среде с метанолом. В 1980 г. производство белка на промышленном предприятии этого концерна составило до 100000 тонн в год. Однако в связи с резким подорожанием природного газа, из которого производился метанол, а также из-за того, что процесс культивирования бактерий велся в стерильных условиях с высоким удельным потреблением энергии, производство белка Pruteen оказалось убыточным. По этой причине в конце 80-х годов предприятие было закрыто.

Аналогичная участь постигла промышленные предприятия по производству белка из метанола, созданные примерно в это же время в США (компанией Philips Petroleum), в Германии (компанией Hoechst-Uhde), в Японии (компанией Mitsubishi gas), в Швеции (компанией Sweden Norprotein) и во Франции (компанией IFP). Позднее такие же работы проводились в Китае, но тоже не получили развития в промышленном масштабе. Во всех перечисленных случаях недостатком технологического процесса являлась высокая себестоимость промышленного производства белка на питательной среде с метанолом. В частности, сообщалось, что себестоимость белка под торговой маркой Pruteen была в два раза выше оптовой цены соевого шрота. Это обстоятельство не позволяло ему конкурировать по цене с такими источниками белка, как соевый шрот и рыбная мука.

Недостатками используемых в этих производствах штаммов метилотрофных бактерий являлось то, что в применяемой для их культивирования питательной среде использовался дорогой метанол, а биосинтез белка велся в стерильных условиях с высоким потреблением энергии, что делало производство убыточным.

Полученный опыт показал, что себестоимость белка, получаемого с помощью промышленных штаммов микроорганизмов во многом определяется стоимостью питательной среды и энергетическими затратами на процесс производства. Затраты энергии зависят в основном от того, ведется ли процесс культивирования микроорганизмов, используемых для производства белка в стерильных условиях или в нестерильных. Если процесс ведется в стерильных аэробных условиях, то он всегда связан с высокими удельными затратами энергии как на тепловую стерилизацию оборудования и питательной среды, так и на приготовление высоких удельных объемов стерильного воздуха, подаваемого на аэрацию питательной среды для обеспечения потребности культуры микроорганизмов в растворенном кислороде. Поэтому ведение процесса биосинтеза белка в нестерильных условиях является важным подходом к снижению себестоимости его производства.

Как показал мировой опыт, для экономически эффективного промышленного производства белка требуется максимально снизить издержки производства. Возможности для этого дает проведение процесса культивирования микроорганизмов-продуцентов белка в нестерильных условиях, а также использование дешевой питательной среды. Первая возможность достигается получением микроорганизмов-продуцентов белка, способных потреблять метанол в качестве единственного источника углерода и энергии в условиях, неблагоприятных для роста посторонних микроорганизмов. Вторую возможность может дать использование штаммов микроорганизмов-продуцентов белка, устойчивых к присутствию в питательной среде различных загрязнений, содержащихся в неочищенном метаноле. Учитывая то, что доля, вносимая метанолом в стоимость питательной среды, составляет до 70%, использование более дешевого метанола-сырца является также эффективным путем снижения себестоимости производства белка.

Метанол может производиться из различного углеродсодержащего сырья, в частности, из нефти, угля, древесины, из природного и попутного нефтяного газа. Наиболее дешевым метанол получается из природного и попутного нефтяного газа. Производство метанола осуществляют методом органического синтеза, который ведут в несколько стадий. На первой стадии из исходного углеводородного сырья получают синтез-газ, содержащий водород и оксиды углерода. На второй стадии из синтез-газа получают полупродукт - неочищенный метанол, так называемый метанол-сырец. В нем, помимо метанола, доля которого составляет 83-85%, содержатся вода, диметиловый эфир и высшие спирты, в частности, изобутанол. На третьей стадии производится очистка метанола-сырца методом двойной последовательной ректификации с получением высокоочищенного продукта с содержанием метанола 99,95%. Очистка метанола-сырца на двух последовательных ректификационных колоннах приводит к удорожанию метанола. Как правило, цена очищенного метанола в 2-3 раза выше цены, по которой реализуется метанол-сырец. По этой причине, получение штамма микроорганизма-продуцента белка, способного расти на питательной среде, в которой вместо очищенного метанола используется метанол-сырец, является эффективным путем снижения себестоимости производства белка из метанола.

Перспективным направлением получения белка на среде с метанолом является использование метилотрофных дрожжей, в частности, вида Ogataea polymorpha (старое название Hansenula polymorpha). Метилотрофные дрожжи имеют ряд преимуществ по сравнению с метилотрофными бактериями. Они растут при более низких значениях рН среды, чем метилотрофные бактерии, что позволяет их культивировать в нестерильных условиях. Клетки дрожжей содержат сбалансированный набор аминокислот и витаминов группы В. Содержание незаменимых аминокислот в клетке дрожжей значительно выше, чем в клетке бактерий. По этой причине использование метилотрофных дрожжей для производства белка является более предпочтительным.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является патент Китая CN 105861343 А, который защищает штамм метилотрофных дрожжей Hansenula Polymorpha ССТСС NO:M 2016173, используемый для получения белка на питательной среде с метанолом. Недостатком этого штамма является его культивирование на дорогой питательной среде, в которой используются два источника углерода и энергии - химически чистый глицерин и чистый метанол.

Авторами заявляемого изобретения была поставлена задача получения штамма метилотрофных дрожжей, предназначенного для экономически эффективного промышленного производства белка.

Поставленная задача была решена получением нового штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3389D.

Полученный штамм метилотрофных дрожжей обладает следующими технологическими особенностями:

- повышенной устойчивостью к таким загрязнениям, содержащимся в метаноле-сырце, как диметиловый эфир и высшие спирты (в частности, изобутанол);

- повышенной устойчивостью к значительным колебаниям рН питательной среды, и температуры в процессе культивирования;

- высокой скоростью роста при низких значениях рН (4,0-5,0) питательной среды, что делает возможным вести процесс промышленного производства белка в нестерильных условиях с относительно низкими удельными затратами энергии;

- способностью активно расти на питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии;

- способностью активно расти на питательной среде с минимальным содержанием витаминов.

Новый штамм метилотрофных дрожжей был получен селекцией из культуры дрожжей, выделенной в природе из коры дерева.

Селекция проводилась по способности штамма расти с наивысшей удельной скоростью роста на обедненной витаминами питательной среде с метанолом-сырцом в присутствии таких загрязнений, как диметиловый эфир и изобутанол. Другим критерием отбора являлась максимальная удельная скорость роста штамма дрожжей на питательной среде со значением рН в диапазоне 4,0-5,0 для обеспечения возможности ведения процесса культивирования в нестерильных условиях. Наконец, отбирали штамм, наиболее устойчивый к резким колебаниям рН в диапазоне 4,0-9,0, температуры - от 30°С до 46°С. В качестве единственного источника углерода и энергии в питательной среде для культивирования штамма метилотрофных дрожжей использовался метанол-сырец следующего состава:

- метанол 83,1-85,0%;

- вода 14,7-15,2%;

- диметиловый эфир - 0,1-1,6%;

- изобутанол - 0,1 -0,3%.

Генетические модификации с полученным штаммом дрожжей не проводились.

В результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей, отвечающий всем вышеприведенным критериям отбора.

Для идентификации отобранного штамма метилотрофных дрожжей было проведено исследование его филогенетического статуса. Исследование проводили с выделения ДНК с помощью набора "ZymoResearch Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™" (Irvine, США), согласно рекомендациям фирмы производителя.

LSU rDNA D1/D2 регион амплифицировали с использованием праймеров NL1 (5'GCA TAT САА ТАА GCG GAG GAA AAG) и NL4 (5'GGT CCG TGT ТТС AAG ACG G), а также ITS1-5.8S-ITS2 регион амплифицировали с праймерами ITS4 (5ТСС ТСС GCT TAT TGA TAT GC) and ITS5 (5'GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G) [5] на термоциклере MJ mini (BioRad, США). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле, выделяли и очищали из легкоплавкой агарозы с использованием Haбopa "ZymoResearch Fungal/Bacterial MiniPrep™" (Irvine, США)

Секвенирование ДНК выполняли на автоматическом сиквенаторе "ABI PRISM" (США) с помощью набора реактивов "ABI PRISM ®RigDyeTM Terminator v.3.1".

Предварительный филогенетический скрининг сходства последовательностей генов проводили по базе данных GeneBank [NCBI] с помощью пакета программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, использовали специальные ресурсы: MycoBank www.mycobank.org и YeastIP http://genome.jouy.inra.fr/yeastip/authentification.php.

Для более точного определения филогенетического положения отобранного штамма метилотрофных дрожжей нуклеотидные последовательности генов выравнивали с последовательностями референтных штаммов ближайших прокариот с помощью программы CLUSTAL W [6]. Нуклеотидные последовательности также анализировали, используя программу Vector NTI (версия 9.1) ("Invitrogen", США). Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 [7]. Филогенетические деревья (филограммы) строили методом правдоподобия ("maximum likelihood"). Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа" 1000 альтернативных филограмм.

В результате проведенного исследования методом полифазной таксономии, включая секвенирование нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК, полученная культура метилотрофных дрожжей была идентифицирована как новый штамм известного вида - Ogataea polymorpha 16АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3389D.

Полученный штамм обладает следующими характерными признаками:

Культурально-морфологические:

На сусло-агаре колонии дрожжей - молочные, на ГКА (глюкозо-картофельном агаре) - белые, на агаризованной среде с 0.5% метанола-сырца - белые. Края колоний ровные, поверхность выпуклая, гладкая. При микроскопическом исследовании клетки дрожжей неподвижные, шаровидные/эллипсовидные, одиночные или в парах.

Физиолого-биохимические:

Термотолерантные дрожжи, способны расти на сусло-агаре при температуре до 46°С, оптимально при 30-40°С. Способны расти при рН 4,0-5,0. Используют широкий спектр полиуглеродных субстратов в качестве единственного источника углерода и энергии (метанол, метанол-сырец, глюкозу, арабинозу, сахарозу, рибозу, мальтозу, раффинозу, глицерин, трегалозу, цитрат), а также в качестве источника азота - аммиак, аммонийные соли, нитраты и метиламин.

Хемотаксономические:

Основной убихинон Q-7.

Данные молекулярно-генетического анализа:

Рекомендуемые среда и условия культивирования:

Сусло-агар: Сусло пивное неохмеленное 7 баллингов 1000 мл, агар-агар 18-20 г, рН до стерилизации 7.5.

Жидкая минеральная среда следующего состава:

KH₂PO₄ - 2.0 г/л

MgSO₄*7H₂O - 0.5 г/л

NH₄Cl - 2.0 г/л

метанол-сырец - 5 г/л

витамины:

тиамин - 500 мкг/л;

биотин - 30 мкг/л;

DL-лейцина 40 мкг/л

микроэлементы следующего состава (мг/л):

CaCl₂ - 370 мг/л,

ZnSO₄ *6H₂O - 180 мг/л,

CuSO₄*3H₂O - 210 мг/л,

MnSO₄*H₂O - 110, мг/л,

CoCl₂*6Н₂О - 180 мг/л,

FeSO₄ *7H₂O - 250 мг/л.

Значение рН питательной среды - в диапазоне 4.0-5.0.

Температура культивирования 30-40°С.

Рекомендуемые метод / условия сохранения:

Пересевы на среде сусло-агар через 3-4 месяца; криоконсервация в 10% ДМСО, 50% глицерине; лиофилизация (защитная среда: обезжиренное молоко).

Штамм не патогенен для человека, животных и растений в соответствии с Приложением 1 «Классификация микроорганизмов-возбудителей инфекционных заболеваний...» к санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N 86. Его безопасность подтверждена также в публикации зарубежных авторов: Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.

Полученный штамм обладает следующими признаками, делающими его пригодным для промышленного применения:

- штамм активно растет на минеральной питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии;

- штамм является термотолерантным (выдерживает температуру до 46°С, оптимальная температура для роста 36-40°С);

- штамм является ацидофильным (активно растет при рН 4,0-5,0);

- штамм активно растет при рН 4,0 на дешевой питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии, что позволяет его успешно культивировать в промышленном масштабе в нестерильных условиях.

Пример 1. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на указанной выше жидкой минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4.0 и температуре 36°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,11 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 27%. Содержание белка в биомассе штамма составило 48%.

Пример 2. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4.5 и температуре 40°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,13 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 36%. Содержание белка в биомассе штамма составило 50%.

Пример 3. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 5,0 и температуре 37°С, с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ = 0,15 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанола-сырца составил 39%. Содержание белка в биомассе штамма составило 54%.

Как видно из вышеприведенного описания, в результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР, который может быть использован для экономически эффективного промышленного производства белка.

Источники информации:

1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N86.

2. Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.

3. ТУ 20.14.22-046-00203803-2021 «Метанол-сырец. Технические условия».

GCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTTAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGAAGAAAGCTATCTTGGAGGTGGCCTTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATGGAGGGTGAGAATCCCGTGTGATGAGGTGTCCATTTCCGTGTAAGATGCTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTTGATCAGACTTGGTATTTAGCTATCATCGCTCCTTGTGGGTGGTGCTCTAGCTTTTTACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAAGATAATGACAGTTGAATGTGGCTCCTCGGAGTGTTATAGCTTCTGTTGATGTTGCCTACCGAGACTGAGGTCTGCGGCTTTTGCCTAGGATGCTGGCGTAATGATCCAATACCGCCC

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР, предназначенный для получения белка и депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Y-3389D. Изобретение обеспечивает эффективное производство белка. 3 пр.

Штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389D для получения белка.