Штамм метилотрофных дрожжей для получения кормового белка Российский патент 2025 года по МПК C12N1/16 C12P21/00 C12P13/04 C12P19/42 

Изобретение относится к промышленной биотехнологии и может быть использовано для производства кормового белка, а также комплекса аминокислот и витаминов группы В, применяемых в кормопроизводстве для сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы.

Высокопродуктивное животноводство, птицеводство и рыбоводство имеют потребность в комбикормах богатых белком, аминокислотами и витаминами.

По этой причине создание отечественного производства кормового белка, и комплекса аминокислот и витаминов является актуальной задачей.

Известно получение корма для животных, обогащенного аминокислотами и производными аминокислот (см. RU 2662666). Согласно описанию к этому патенту, для получения комплекса аминокислот сначала осуществляют обработку лигноцеллюлозного биомассового материала путем облучения пучком электронов дозой, составляющей от приблизительно 10 Мрад до 150 Мрад. Облучение снижает среднечисленную молекулярную массу биомассового материала от 200-320 кДа до менее чем 10 кДа. Осахаривают облученный биомассовый материал. Объединяют обработанный материал с микроорганизмом, который генетически модифицирован для сверхэкспрессии одной или нескольких аминокислот или производных аминокислот, с получением продукта.

Известен способ получения белково-углеродной биологически активной кормовой добавки, который предусматривает обработку суспензии зерновой дробины мультиэнзимной композицией с последующим культивированием на полученном питательном субстрате культуры дрожжей Yarrowia lypolytica Y-2375 (патент RU 2391857).

Известным источником комплекса аминокислот и витаминов группы В является биомасса дрожжей (1). Клетки дрожжей содержат сбалансированный набор аминокислот и витаминов группы В. Содержание незаменимых аминокислот в клетке дрожжей, значительно выше, чем в клетке бактерий. Перспективным путем дешевого получения комплекса аминокислот и витаминов группы В может быть использование штаммов метилотрофных дрожжей, выращиваемых на питательной среде с метанолом. Особый интерес представляют собой штаммы метилотрофных дрожжей, способные расти на питательной среде с метанолом-сырцом, т.е. в присутствии различных загрязнений, таких как диметиловый эфир и высшие спирты. Учитывая то, что доля, вносимая метанолом в стоимость питательной среды, составляет до 70%, использование более дешевого метанола-сырца является эффективным путем снижения себестоимости производства биомассы метилотрофных дрожжей.

Метанол-сырец может производиться из различного углеродсодержащего сырья, в частности, из нефти, угля, древесины, из природного и попутного нефтяного газа (SU 963960; RU 2678528; RU 2410170).

Важным источником дешевого метанола-сырца является переработка различных органических отходов, связанных с человеческой деятельностью.

Известен способ переработки отходов (см. патент RU 2014346), возникающих в процессе производства и потребления. В этом изобретении за счет обработки отходов газифицирующим агентом, полученную газовую смесь подвергают тепловой обработке с получением синтез-газа. Синтез-газ обрабатывают в присутствии катализатора с получением жидких углеводородов и/или спиртов, в частности, метанола-сырца.

Получение комплекса аминокислот и витаминов группы В при использовании метанола-сырца, производимого из органических отходов человеческой деятельности, является наиболее перспективным. В этом случае решается две задачи: охрана окружающей среды и получение ценной биологически активной добавки для сельского хозяйства.

Существует группа метилотрофных дрожжей, к которым относится культура Candida boidinii, использующих в качестве источника углерода и энергии метанол, [www.elib.grsu.by/doc/8324; BY 3278, 2000].

Известен штамм метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389, используемый для получения белка из метанола-сырца, как единственного источника углерода и энергии (патент RU 2805960). Штамм используется для получения полезного белкового продукта в виде биомассы метилотрофных дрожжей культивируемых на питательной среде с метанолом-сырцом. Недостатком вышеуказанного штамма метилотрофных дрожжей является относительно низкое содержание комплекса аминокислот и витаминов группы В в биомассе этого штамма.

Решаемой технической задачей заявляемого изобретения является получение штамма метилотрофных дрожжей, предназначенного для экономически эффективного промышленного производства белка и комплекса аминокислот и витаминов группы В и способного расти на минеральной питательной среде с метанолом-сырцом, являющимся единственным источником углерода и энергии.

Поставленная задача была решена получением нового штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3388D.

Полученный штамм метилотрофных дрожжей обладает следующими технологическими особенностями:

- повышенной устойчивостью к таким загрязнениям, содержащимся в метаноле-сырце, как диметиловый эфир и высшие спирты (в частности, изобутанол);

- повышенной устойчивостью к значительным колебаниям рН питательной среды, и температуры в процессе культивирования;

- высокой скоростью роста при низких значениях рН (4,0-5,0) питательной среды, что делает возможным вести процесс промышленного производства белка в нестерильных условиях с относительно низкими удельными затратами энергии;

- способностью активно расти на питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии,

- способностью активно расти на питательной среде с минимальным содержанием витаминов.

Новый штамм метилотрофных дрожжей был получен селекцией из культуры дрожжей, выделенной в природе с коры дерева.

Селекция проводилась по способности штамма расти с наивысшей удельной скоростью роста на обедненной витаминами питательной среде с метанолом-сырцом в присутствии таких загрязнений, как диметиловый эфир и изобутанол. Другим критерием отбора являлась максимальная удельная скорость роста штамма дрожжей на питательной среде со значением рН в диапазоне 4,0-5,0 для обеспечения возможности ведения процесса культивирования в нестерильных условиях. Также критерием отбора была устойчивость штамма дрожжей к резким колебаниям рН в диапазоне 4,0-8,0, температуры - от 30°С до 46°С. Наконец, отбирали штамм дрожжей с наиболее высоким содержанием комплекса аминокислот и витаминов группы В.

В качестве единственного источника углерода и энергии в питательной среде для культивирования штамма метилотрофных дрожжей использовался метанол-сырец следующего состава, %:

метанол 83,1-85,0 вода 14,7-15,2 диметиловый эфир 0,1-1,6 изобутанол 0,1-0,3

Генетические модификации с полученным штаммом дрожжей не проводились.

В результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей, отвечающий всем вышеприведенным критериям отбора.

Для идентификации отобранного штамма метилотрофных дрожжей было проведено исследование его филогенетического статуса. Исследование проводили с выделения ДНК с помощью набора "ZymoResearch Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™" (Irvine, США), согласно рекомендациям фирмы производителя.

LSU rDNA D1/D2 регион амплифицировали с использованием праймеров NL1 (5'GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) и NL4 (5'GGTCCGTGTTTCAAGACGG), а также ITS1-5.8S-ITS2 регион амплифицировали с праймерами ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC) and ITS5 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) (5) на термоциклере MJ mini (BioRad, США). Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле, выделяли и очищали из легкоплавкой агарозы с использованием Haбopa "ZymoResearch Fungal/Bacterial MiniPrep™" (Irvine, США).

Секвенирование ДНК выполняли на автоматическом сиквенаторе "ABI PRISM" (США) с помощью набора реактивов "ABI PRISM ®RigDyeTM Terminator v.3.1".

Предварительный филогенетический скрининг сходства

последовательностей генов проводили по базе данных GeneBank [NCBI] с помощью пакета программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, использовали специальные ресурсы: MycoBank www.mycobank.org и YeastIP http://genome.jouy.inra.fr/yeastip/authentification.php.

Для более точного определения филогенетического положения отобранного штамма метилотрофных дрожжей нуклеотидные последовательности генов выравнивали с последовательностями референтных штаммов ближайших прокариот с помощью программы CLUSTAL W (6). Нуклеотидные последовательности также анализировали, используя программу Vector NTI (версия 9.1) ("Invitrogen", США). Филогенетический анализ выполнен при помощи программы MEGA 5 (7). Филогенетические деревья (филограммы) строили методом правдоподобия ("maximum likelihood"). Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap-анализа" 1000 альтернативных филограмм.

В результате проведенного исследования методом полифазной таксономии, включая секвенирование нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК, полученная культура метилотрофных дрожжей была идентифицирована как новый штамм известного вида - Ogataea parapolymorpha 2АР. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН с регистрационным номером ВКМ Y-3388D.

Полученный штамм обладает следующими характерными признаками:

Культурально-морфологические:

На сусло-агаре колонии дрожжей - молочные, на ГКА (глюкозо-картофельном агаре) - белые, на агаризованной среде с 0,5% метанола-сырца - белые. Края колоний ровные, поверхность выпуклая, гладкая. При микроскопическом исследовании клетки дрожжей неподвижные, шаровидные/эллипсовидные, одиночные или в парах.

Физиолого-биохимические:

Термотолерантные дрожжи, способны расти на сусло-агаре при температуре до 46°С, оптимально при 36-40°С. Способны расти при рН 4,0-5,0. Используют широкий спектр полиуглеродньгх субстратов в качестве единственного источника углерода и энергии (метанол, метанол-сырец, глюкозу, арабинозу, сахарозу, рибозу, мальтозу, целлобиозу, глицерин, цитрат).

В нижеприведенной Табл. 1 показана способность штамма дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D утилизировать различные углеродные соединения в качестве единственного источника углерода и энергии.

В качестве источника азота штамм дрожжей 2АР ВКМ Y-3388D способен использовать нитраты калия или натрия, аммиак, метилированные амины.

Хемотаксономические свойства:

Основной убихинон Q-7.

Данные молекулярно генетического анализа:

Перечень последовательностей нуклеотидов штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D представлен на отдельном листе (стр. 15).

Рекомендуемые среда и условия культивирования:

Сусло-агар: Сусло пивное неохмеленное 7 баллингов 1000 мл, агар-агар 18-20 г, рН до стерилизации 7,5.

Рекомендуемые среды для культивирования:

1) Рекомендуемая среда для получения посевной культуры:

Сусло-агар:

Сусло пивное неохмеленное 7 баллингов - 1000 мл,

агар-агар - 18-20 г,

рН до стерилизации 7,5.

2) Рекомендуемая среда для процесса культивирования:

Жидкая минеральная среда следующего состава:

Минеральные соли:

KH₂PO₄ - 2.0 г/л

MgSO₄*7H₂O - 0.5 г/л

NH₄Cl - 2.0 г/л

метанол-сырец - 5 г/л

Витамины:

тиамин - 500 мкг/л;

биотин - 30 мкг/л;

DL-лейцина - 40 мкг/л

Микроэлементы (мг/л):

CaCl₂ - 370 мг/л,

ZnSO₄*6H₂O - 180 мг/л,

CuSO₄*3H₂O - 210 мг/л,

MnSO₄*H₂O - 110, мг/л

CoCl₂*6Н₂О - 180 мг/л,

FeSO₄*7H₂O - 250 мг/л.

Значение рН питательной среды - в диапазоне 4,0-5,0.

Температура культивирования 36-40°С.

Рекомендуемые метод / условия сохранения:

Пересевы на среде сусло-агар через 3-4 месяца; криоконсервация в 10% ДМСО, 50% глицерине; лиофилизация (защитная среда обезжиренное молоко).

Штамм непатогенен для человека, животных и растений в соответствие с Приложением 1 «Классификация микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний…» к Санитарно-эпидемиологическим правилам СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. Дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N 86). Его безопасность подтверждена также в публикации зарубежных авторов: Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.

Полученный штамм обладает следующими признаками, делающими его пригодным для промышленного применения:

- штамм активно растет на минеральной питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии;

- штамм является термотолерантным (выдерживает температуру до 46°С, оптимальная температура для роста 34-40°С);

- штамм является ацидофильным (активно растет при рН 4,0-5,0);

- штамм активно растет при рН 4,0 на дешевой питательной среде с метанолом-сырцом в качестве единственного источника углерода и энергии, что позволяет его успешно культивировать в промышленном масштабе в нестерильных условиях.

Пример 1. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на указанной выше жидкой минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4,0 и температуре 36°С с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ=0,13 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанолу-сырцу составил 39%. Содержание белка в биомассе штамма составило 50%.

Пример 2. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 4.5 и температуре 40°С с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ=0,12 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанолу-сырцу составил 27%. Содержание белка в биомассе штамма составило 54%.

Пример 3. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 5,0 и температуре 37°С с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ=0,17 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанолу-сырцу составил 32%. Содержание белка в биомассе штамма составило 52%.

Пример 4. Культивирование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389D (далее - штамм) проводили в аппарате управляемого культивирования АНКУМ-2М (рабочий объем 6 л) на такой же, что и в примере 1 минеральной среде с метанолом-сырцом при рН 5,0 и температуре 37°С с измерением оптической плотности культуры каждые 6 часов для определения удельной скорости роста. Оптическую плотность пересчитывали на массу сухих клеток по предварительно построенным калибровочным кривым. Максимальная удельная скорость роста культуры μ=0,15 ч^-1 свидетельствует о благоприятных условиях культивирования полученного штамма. Экономический выход по используемому субстрату метанолу-сырцу составил 39%. Содержание белка в биомассе штамма составило 54%.

Полученную биомассу метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D и Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389D концентрировали методом центрифугирования при 4000 об/мин. Концентрат биомассы метилотрофных дрожжей разводили водой в соотношении 1:1 и затем подвергали автолизу с добавлением тимола и хлороформа в течение 3 суток при температуре 52+/-2°С. Полученный автолизат метилотрофных дрожжей концентрировали методом центрифугирования при 4000 об/мин. Концентрированный автолизат метилотрофных дрожжей высушивали в распылительной сушилке при температуре 200+/-10°С до остаточной влажности 9%.

Проведенное тестирование автолизата метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D и автолизата дрожжей Ogataea polymorpha 16АР ВКМ Y-3389D на содержание аминокислот и витаминов группы В дало результаты, представленные в табл. 2 и 3.

Из Табл. 2 и 3 видно, что содержание аминокислот и витаминов группы В в автолизате биомассы штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D значительно превосходит аналогичное содержание в автолизате биомассы штамма дрожжей Ogataea polymorpha 16АР BKMY-3389D.

Из вышеприведенного описания следует, что в результате проведенной селекции был получен новый штамм метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D, который может быть использован для экономически эффективного промышленного производства кормового белка и комплекса аминокислот и витаминов группы В.

Полученный из биомассы штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D комплекс аминокислот и витаминов группы В может быть использован в качестве биологически активной добавки в корм сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы (аквакультуры).

Источники информации:

1. Гусельникова Т.В., Белов А.П. Содержание белка и свободных аминокислот в углеродокисляющих дрожжах в зависимости от азотного питания. Известия ТСХА, выпуск 6, 1988, с. 130-134.

2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами», в ред. Дополнений и изменений N 2, утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.06.2011 N86).

3. Holzchy DL, Chandler FW, Ajello L, Ahearn DG (1979) Evaluation of industrial yeasts for pathogenicity, Medical Micology 17:71-78.

4. ТУ 20.14.22-046-00203803-2021 «Метанол сырец. Технические условия».

5. White, T.J., Bruns, Т., Lee, S., Taylor JW (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics T.J. White, T. Bruns,, S. Lee, J.W. Taylor. - Текст: непосредственный // In: Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (eds) PCR protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., New York, USA, pp 315-322

6. Thompson, J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin, F., Higgins D.G. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools/ J.D.Thompson, T.J. Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, D.G. Higgins - Текст: непосредственный // Nucleic Acids Res. - 1997. - V. 25. - P. 4876-4882.

7. Tamura, K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods - Текст: непосредственный // Mol. Biol. Evol. - 2011. - V. 28. - P. 2731-2739.

--->

<?xml version=”1.0” encoding=”UTF-8”?>

<!DOCTYPE ST26SquenceListing PUBLIC “-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN” “ST26SequenceListing_V1_3.dtd”>

<ST26SequenceListing dtdVersion=”V1_3” filename=”Invention_SEQL.xml”

SoftwareName= WIPO Sequence” softwareVersion=”1.0”

productionDate=”2023-03-18” originalFreeTextLanguageCode=”en”

nonEnglishFreeTextLanguageCode=”ru” >

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RU/2024104237/10

</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-02-20</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode =”ru”>ООО «Эй Пи

Интернэйшнл»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>AP International Ltd.</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode=”ru”>Дмитрий А. Попов</InventorName>

<InventorNameLatin>Dmitry A. Popov</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode=”ru”>Штамм метилотрофных дрожжей для

производства белка</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode=”en”>Methylotrophic yeast strain for

protein production</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNnumber=”1”> {…} </SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>576</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</ INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</<INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1…576</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism<

INSDQualifier_name>

< INSDQualifier_value>>Ogataea

parapolymorpha< INSDQualifier_value>

<INSDSeq_sequence>

atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaagagct

caaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttgaagaaagtaatcttggaggtggccttt

gtctatgttccttggaacaggacgtcatggagggtgagaatcccgtgtgatgaggtgtccatctccgtgt

aagatgctttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctcaaagtgggtggtaaattccatctaaagct

aaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtactgtgaaggaaagatgaaaagaactttgaaaagagag

tgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggtatttgatcagacttggtatttagctatcatcgctc

cttgtgggtggtgctctagctttttactgggccagcatcagttttggtggcaagataatgacagttgaat

gtggctcctcggagtgttatagcttctgttgatattgcctaccgggactgaggtctgcggcttttgccta

ggatgctggcgtaatg

</INSDSeq_sequence>

<INSDSeq>

<---

Изобретение относится к промышленной биотехнологии. Предложен штамм метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D для получения кормового белка. Изобретение может быть использовано для получения кормового белка, а также для увеличения содержания аминокислот и витаминов группы В в автолизате указанных дрожжей. 3 табл., 4 пр.

Штамм метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha 2АР ВКМ Y-3388D для получения кормового белка.