КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К КОНЪЮГАТАМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ CD19 Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 A61K47/68 A61P35/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 62/669,183, поданной 9 мая 2018 года, содержание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Технология конъюгатов антитела-лекарственного средства (ADC) представляет собой мишень-направленную технологию, которая позволяет осуществлять селективный апоптоз раковых клеток. Как правило, ADC функционируют, направленно воздействуя на раковые клетки с использованием антитела и затем высвобождая токсичное соединение (то есть лекарственное средство) в клетке, вызывая, таким образом, гибель клетки. Поскольку технология ADC позволяет точно доставлять лекарственное средство в раковую клетку-мишень и высвобождать его при определенных условиях, одновременно сводя к минимуму сопутствующее повреждение здоровых клеток, технология ADC повышает эффективность терапевтического антитела и снижает риск возникновения нежелательной реакции.

Во время своей дифференцировки и пролиферации B-клетки экспрессируют широкий спектр молекул клеточной поверхности. Примеры включают поверхностные маркеры лейкоцитов CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85 и CD86. Эти маркеры традиционно рассматривали в качестве терапевтических мишеней для лечения B-клеточных нарушений или заболеваний, таких как, например, B-клеточные неоплазии, аутоиммунные заболевания и отторжение трансплантата. CD19 - поверхностный белок, присутствующий на B-клетках и некоторых раковых клетках, происходящих из B-клеток, таких как многие B-клеточные лимфомы. В мышах получали моноклональные антитела против CD19. Однако мышиные антитела обычно иммуногенны для человека, а гуманизированные антитела могут быть иммуногенными для человека.

Таким образом, существует потребность в улучшенных конъюгатах антител-лекарственных средств, которые направленно взаимодействуют с CD19.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых аспектах изобретение относится к конъюгатам антитела-лекарственного средства (ADC). В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к конъюгату антитела-лекарственного средства, включающему антитело, линкер и действующее вещество (например, лекарственное средство). Конъюгат антитела-лекарственного средства может включать саморасщепляющуюся группу, например, для использования при высвобождении действующего вещества от антитела и линкера.

В изобретении предложены моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или их биспецифичные варианты, которые связывают CD19. Эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или их биспецифичные варианты совокупно именуются в настоящем документе как моноклональные антитела против CD19 или мАт против CD19 или их антигенсвязывающие фрагменты или любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или их биспецифичные варианты. Предпочтительно моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или их биспецифичные варианты специфичны по меньшей мере к CD19 человека. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или их биспецифичные варианты, которые распознают CD19 человека, также являются перекрестно-реактивными в отношении по меньшей мере еще одного нечеловеческого белка CD19, такого как, в качестве неограничивающего примера, CD19 не относящегося к человеку примата, например CD19 яванского макака, и/или CD19 грызуна.

В некоторых аспектах изобретение относится к конъюгатам антитела-лекарственного средства (ADC), включающим антитело, по меньшей мере один разветвленный линкер, ковалентно соединенный с антителом и по меньшей мере одно или два действующих вещества, ковалентно соединенных с разветвленным линкером. Разветвленный линкер может включать разветвляющее звено по меньшей мере с одним лекарственным средством, соединенным с разветвляющим звеном через вторичный линкер; разветвляющее звено соединено с антителом первичным линкером. Первичный и/или вторичный линкер может включать по меньшей мере одно звено полиэтиленгликоля.

В некоторых аспектах изобретение относится к конъюгату антитела, представленному Формулой I, или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату:

где:

Ат представляет собой антитело против CD19 или его антигенсвязывающий фрагмент или биспецифичное антитело, включающее первое плечо, которое связывает CD19, где Ат включает определяющую комплементарность область 1 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH1), определяющую комплементарность область 2 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH2), определяющую комплементарность область 3 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH3), определяющую комплементарность область 1 вариабельной области легкой цепи (CDRL1), определяющую комплементарность область 2 вариабельной области легкой цепи (CDRL2) и определяющую комплементарность область 3 вариабельной области легкой цепи (CDRL3); где

CDRH1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или 29;

CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или 30;

CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 31;

CDRL 1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, 37, 41 или 44,

CDRL 2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 38, 42 или 45;

CDRL 3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, 35, 36, 40, 43 или 46;

каждый X независимо является химической группой, включающей действующее вещество и линкер, где линкер соединяет Ат с действующим веществом; и

y является целым числом от 1 до 20.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1A-1F являются серией графиков, на которых показана способность различных антител против CD19 согласно изобретению связывать шесть разных клеточных линий B-лимфоцитов (Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2), клеточную линию с сайленсингом CD19 (Raji миРНК) и клеточную линию отрицательного контроля (Jurkat), как определено с помощью FACS-анализа.

ФИГ. 2 является серией графиков, на которых показана способность различных антител против CD19 согласно изобретению связывать CD19 яванского макака, экспрессируемый трансфицированными клетками CHO, или клеточную линию отрицательного контроля (CHO), как определено с помощью FACS-анализа.

На ФИГ. 3A показаны графики, изображающие способность различных антител против CD19 согласно изобретению при концентрации 30 мкг/мл или 3 мкг/мл связываться с человеческими T-клетками и моноцитами.

На ФИГ. 3B показаны графики, изображающие способность различных антител против CD19 согласно изобретению при концентрации 30 мкг/мл или 3 мкг/мл связываться с B-клетками яванского макака.

На ФИГ. 3C показаны графики, изображающие способность различных антител против CD19 согласно изобретению при концентрации 30 мкг/мл или 3 мкг/мл связываться с человеческими T-клетками и моноцитами.

На ФИГ. 4A-4G показан объем опухоли в динамике у мышей CB17-SCID, которым имплантировали клетки Ramos и затем обрабатывали ADC против CD19 9G8, ADC неспецифичного к опухоли человеческого IgG1 против HER2 или ритуксимабом. Мыши, которые получали ADC против CD19 9G8, демонстрировали регрессиию роста опухоли.

На ФИГ. 4H показан средний вес в динамике у мышей CB17-SCID, которым имплантировали клетки Ramos и затем обрабатывали изотипом IgG1 человека, ADC против CD19 9G8, ADC неспецифичного к опухоли IgG1 человека против HER2 или ритуксимабом.

На ФИГ. 5A показан средний объем опухоли в динамике у мышей CB17-SCID, которым имплантировали клетки Ramos и затем обрабатывали ADC против CD19 9G8, ADC неспецифичного к опухоли человеческого IgG1 против HER2 или ритуксимабом. Мыши, которые получали ADC против CD19 9G8, демонстрировали регрессию роста опухоли до дня 70.

На ФИГ. 5B показан процент выживших мышей CB17-SCID, которым имплантировали клетки Ramos и затем обработывали ADC против CD19 9G8 (CaaX антитело человека против CD19 9G8 изотипа IgG1), ADC неспецифичного к опухоли IgG1 человека против HER2 или ритуксимабом. Мыши, которые получали ADC против CD19 9G8, показали 100% выживаемость до дня 70.

На ФИГ. 6A и 6B показан уровень ингибирования (%) ADC против CD19 или dPBD (SG2057). Уровень ингибирования % ADC был сопоставим с уровнем ингибирования dPBD.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Базовая структура конъюгата антитела-лекарственного средства является следующей: антитело-линкер-низкомолекулярное лекарственное средство или токсин. Линкер в идеальном варианте позволяет лекарственному средству действовать на раковую клетку-мишень, например, после отделения от антитела (например, посредством опосредованного ферментом гидролиза), после того, как лекарственное средство достигает клетки-мишени. Линкер также играет функциональную роль, соединяя антитело и лекарственное средство. Эффективность и токсичность конъюгата антитела-лекарственного средства частично зависит от линкера, и, таким образом, линкер играет важную роль в безопасности лекарственного средства, как описано в патенте США 9,919,057, публикации РСТ WO 2017/089890 и публикации РСТ WO 2017/089895, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.

Линкеры конъюгатов антитела-лекарственного средства можно приближенно подразделить на нерасщепляемые или расщепляемые. Многие нерасщепляемые линкеры присоединяют к антителам при использовании тиоэфира, включающего цистеин антитела. Присоединяемое лекарственное средство обычно не может диссоциировать от антитела in vivo. Однако в случае широко используемого тиол-малеимидного метода конъюгат антитела-лекарственного средства является нестабильным, что может приводить к диссоциации лекарственного средства из конъюгата до или после того, как оно достигает клетки-мишени.

Расщепляемые линкеры представляют собой линкеры, которые могут подвергаться гидролизу, например, лизосомальным ферментом. Расщепляемый линкер может включать дисульфидную связь, например, включающую цистеин антитела. Дисульфидный линкер, который обеспечивает диссоциацию путем реакции тиольного обмена, частично основан на захвате конъюгата антитела-лекарственного средства в клетку-мишень и контакта дисульфида с цитозолем, который является восстанавливающим окружением. Впрочем, поскольку различные типы тиолов (например, альбумин и глутатион) присутствуют в крови, лекарственное средство может диссоциировать от антитела до достижения своей мишени.

Недавно был описан новый подход к созданию конъюгатов антитела-лекарственного средства, в котором используют пренилирование белков на С-конце аминокислотной последовательности с установкой модифицированного изопреноидного звена, которое позволяет присоединять лекарственное средство или другое действующее вещество к антителу мягким и сайт-специфическим способом (например, патентная публикация США 2012/0308584, которая полностью включена в настоящий документ посредством отсылки). Возможны дальнейшие уточнения, и описания дополнительных расщепляемых линкеров можно найти в следующих источниках: патент США 9,919,057, публикация РСТ WO 2017/089890 и публикация РСТ WO 2017/089895, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.

В изобретении предложены конъюгаты антитела-лекарственного средства на основе антител, которые связывают CD19. Такие антитела включают моноклональные антитела против CD19 или мАт против CD19, а также их антигенсвязывающие фрагменты и описаны в заявке на патент США 15/804517, опубликованной как US 2018/0142018 A1, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством отсылки. Предпочтительно моноклональные антитела являются специфичными, по меньшей мере, к CD19 человека. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела, которые распознают CD19 человека, также обладают перекрестной реактивностью по меньшей мере к одному другому нечеловеческому белку CD19, такому как, в качестве неограничивающего примера, CD19 не относящегося к человеку примата, например CD19 яванского макака, и/или CD19 грызуна. Настоящее описание также включает антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против CD19, раскрытое в настоящем документе.

В изобретении также предложены моновалентные антитела и/или биспецифичные антитела, которые включают, по меньшей мере, первое плечо, которое является специфичным к CD19. Предпочтительно моновалентные антитела и/или биспецифичные антитела является специфичными, по меньшей мере, к CD19 человека. В некоторых вариантах осуществления моновалентные антитела и/или биспецифичные антитела, которые распознают CD19 человека, также обладают перекрестной реактивностью по меньшей мере с одним другим нечеловеческим белком CD19, таким как, в качестве неограничивающего примера, CD19 не относящегося к человеку примата, например CD19 яванского макака, и/или CD19 грызуна. В изобретении также предложены антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и моновалентное антитело против CD19 и/или биспецифичное антитело против CD19, раскрытое в настоящем документе.

Биспецифичные антитела согласно изобретению обеспечивают одновременное связывание двух плеч антитела с двумя антигенами на поверхности клетки (так называемое совместное связывание), что приводит к аддитивному или синергическому повышению аффинности за счет механизма авидности. Как следствие, совместное связывание обеспечивает высокую селективность в отношении клеток, экспрессирующих оба антигена, по сравнению с клетками, экспрессирующими только один антиген. Кроме того, аффинности двух плеч биспецифичного антитела к их соответствующим мишеням может быть установлено таким образом, что связывание с клетками-мишенями в основном направляется одним из плеч антитела. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело включает первое плечо, которое связывает CD19, и второе плечо, которое связывает вторую мишень, которая не является CD19. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело включает первое плечо, которое связывает CD19, и второе плечо, которое связывает опухолеассоциированный антиген (ТАА). В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело включает первое плечо, которое связывает CD19, и второе плечо, которое связывает опухолеассоциированный антиген (TAA), где первое плечо связывается с CD19 с высокой аффинностью, а второе плечо связывается с TAA с низкой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления TAA является антигеном, который экспрессируется на клеточной поверхности раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления раковая клетка выбрана из клетки рака легкого, клетки рака бронхов, клетки рака предстательной железы, клетки рака молочной железы, клетки рака толстой и прямой кишки, клетки рака поджелудочной железы, яичника, лейкозной клетки, клетки лимфомы, клетки рака пищевода, клетки рака печени, клетки рака мочеточника и/или мочевого пузыря, клетки рака почки, клетки рака полости рта, клетки рака глотки, клетки рака матки и/или клетки меланомы. В некоторых вариантах осуществления подходящие вторые мишени включают, в качестве неограничивающего примера, CD47, CD20, CD22, CD40, BAFFR, CD5, CD32b, ICOSL, IL6R и/или IL21R.

В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело является полностью человеческим биспецифичным антителом формата IgG, таким как формат κλ-body, описанный в публикации РСТ WO 2012/023053, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.

Примерные моноклональные антитела против CD19 согласно изобретению и их антигенсвязывающие фрагменты включают, например, антитело 5F5, антитело 7F11, антитело 9G8, антитело F6, антитело 7F1 и антитело 10D8 или их антигенсвязывающий фрагмент.

Примерные биспецифичные антитела против CD19 согласно изобретению, в которых по меньшей мере один связывающий участок является специфичным к CD19, включают, например, антитело 5F5, антитело 7F11, антитело 9G8, антитело F6, антитело 7F1 и антитело 10D8 или их антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления примерные моноклональные антитела против CD19 согласно изобретению и их антигенсвязывающие фрагменты включают комбинацию определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (CDR-областей), выбранных из CDR-последовательностей, показанных в Таблице 1, и CDR-областей легкой цепи, выбранных из CDR-последовательностей, показанных в Таблице 2, где CDR-области, показанные в Таблицах 1 и 2, определены согласно номенклатуре IMGT.

В некоторых вариантах осуществления примерные моноклональные антитела против CD19, моноспецифичные антитела против CD19, моновалентные антитела против CD19 и/или биспецифичные антитела согласно изобретению включают комбинацию определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (CDR-областей), выбранных из CDR-последовательностей, показанных в Таблице 1, и CDR-областей легкой цепи, выбранных из CDR-последовательностей, показанных в Таблице 2, где CDR-области, показанные в Таблицах 1 и 2, определены согласно номенклатуре IMGT.

Таблица 1: CDR-области тяжелой цепи антител против CD19

Антитело CDRH1 CDRH2 CDRH3 5F5 GYSFTSYW
(SEQ ID NO: 23) IYPGDSDT
(SEQ ID NO: 24) ARGISGIYNLHGFDI
(SEQ ID NO: 25) 7F11 GYSFTSYW
(SEQ ID NO: 23) IYPGDSDT
(SEQ ID NO: 24) ARGVSGIYNLHGFDI
(SEQ ID NO: 26) 9G8 GYSFTSYW
(SEQ ID NO: 23) IYPGDSDT
(SEQ ID NO: 24) ARGVSGIYNLHGFDI
(SEQ ID NO: 26) F6 GYSFTSYW
(SEQ ID NO: 23) IYPGDSDT
(SEQ ID NO: 24) APVVWYYDFWSGADAFDI
(SEQ ID NO: 27) 7F1 GYSFTSYW
(SEQ ID NO: 23) IYPGDSDT
(SEQ ID NO: 24) ARGDYWTGFAY
(SEQ ID NO: 28) 10D8 GGTFSSYA
(SEQ ID NO: 29) IIPIFGTA
(SEQ ID NO: 30) ARDRGYDYVWGSYRYGAFDI
(SEQ ID NO: 31)

Таблица 2: CDR-области легкой цепи антител против CD19

Антитело CDRL1 CDRL2 CDRL3 5F5 QSISSY
(SEQ ID NO:32) AAS
(SEQ ID NO: 33) QQASLDSPLT
(SEQ ID NO: 34) 7F11 QSISSY
(SEQ ID NO:32) AAS
(SEQ ID NO: 33) QQGMWDNPFT
(SEQ ID NO: 35) 9G8 QSISSY
(SEQ ID NO:32) AAS
(SEQ ID NO: 33) QQGRFGSPFT
(SEQ ID NO:36) F6 QSVSSN
(SEQ ID NO:37) GAS
(SEQ ID NO: 38) QQGSLEAPQT
(SEQ ID NO: 40) 7F1 SSNIGNNY
(SEQ ID NO:41) DNN
(SEQ ID NO: 42) GTWDLGWNSV
(SEQ ID NO: 43) 10D8 SSDVGGYNY
(SEQ ID NO:44) EVS
(SEQ ID NO: 45) SSYDVWVPHMV
(SEQ ID NO: 46)

В одном аспекте конъюгаты антитела-лекарственного средства, раскрытые в настоящем документе, представлены Формулой I или их фармацевтически приемлемой солью или сольватом:

где:

Ат является антителом против CD19 или его антигенсвязывающим фрагментом или биспецифичным антителом, включающим первое плечо, которое связывает CD19, где Ат включает определяющую комплементарность область 1 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH1), определяющую комплементарность область 2 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH2), определяющую комплементарность область 3 вариабельной области тяжелой цепи (CDRH3), определяющую комплементарность область 1 вариабельной области легкой цепи (CDRL1), определяющую комплементарность область 2 вариабельной области легкой цепи (CDRL2) и определяющую комплементарность область 3 вариабельной области легкой цепи (CDRL3); где

CDRH1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 или 29;

CDRH2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или 30;

CDRH3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 31;

CDRL1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, 37, 41 или 44,

CDRL2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, 38, 42 или 45;

CDRL3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, 35, 36, 40, 43 или 46;

каждый X независимо является химической группой, включающей одно или более действующих веществ и линкер, где линкер соединяет Ат с действующим веществом(ами); и

y является целым числом от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления Ат является моноклональным антителом, доменным антителом (dAb), одноцепочечным антителом (scAb), Fab-фрагментом, F(ab')2-фрагментом, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), scFv-Fc фрагментом, однодоменным антителом из домена тяжелой цепи, однодоменным антителом из домена легкой цепи, вариантным антителом, мультимерным антителом или биспецифичным антителом. Ат может быть кроличьим, мышиным, химерным, гуманизированным или полностью человеческим моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления Ат имеет изотип IgG, такой как изотип IgG1.

В некоторых вариантах осуществления Ат включает комбинацию вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 6, 12, 16 или 20, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 8, 10, 14, 18 или 22.

В некоторых вариантах осуществления Ат включает комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранную из:

(a) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

(b) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;

(c) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;

(d) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(e) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и

(f) вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19 представляет собой 5F5, 7F11, 9G8, F6, 7F1 или 10D8. В некоторых вариантах осуществления CD19 является CD19 человека.

Предпочтительно, связь между Ат и действующим веществом является расщепляемой. Как правило, линкер представлен Формулой II:

G представляет собой группу глюкуроновой кислоты или , где R³ представляет собой водород или защитную группу карбоксила, и каждый R⁴ независимо представляет собой водород или защитную группу гидроксила;

B представляет собой действующее вещество;

каждый R¹ и R² независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил или C_3-8 циклоалкил; или

W представляет собой -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO₂NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- или -PO₂NR'-, где C, S или P непосредственно связан с фенильным кольцом, и каждый R' и R'' независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, моно- или ди-C_1-8 алкиламино, C_3-20 гетероарил или C_6-20 арил;

в каждом случае Z независимо представляет собой C_1-8 алкил, галоген, циано или нитро;

n является целым числом от 0 до 3; и

L является линкером, соединяющим Ат и W.

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой C_1-50 алкилен или гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов. В некоторых вариантах осуществления L удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих условий:

(i) L включает по меньшей мере одну ненасыщенную связь;

(ii) два атома в L замещены двухвалентным заместителем, таким образом, что заместитель, с атомами, которые он соединяет, образует гетероарилен;

(iii) L представляет собой гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов; или

(iv) алкилен замещен одним или более C_1-20 алкилами.

В некоторых вариантах осуществления L включает по меньшей мере одно звено производного изопренила, представленное Формулой III, которое распознает изопреноид-трансфераза:

В некоторых таких вариантах осуществления линкер представлен Формулой II:

G представляет собой группу глюкуроновой кислоты или , где R³ представляет собой водород или защитную группу карбоксила, и каждый R⁴ независимо представляет собой водородом или защитную группу гидроксила;

B представляет собой действующее вещество;

каждый R¹ и R² независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил или C_3-8 циклоалкил; или

W представляет собой -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO₂NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- или -PO₂NR'-, где C, S или P непосредственно связан с фенильным кольцом, и каждый R' и R'' независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, моно- или ди-C_1-8 алкиламино, C_3-20 гетероарил или C_6-20 арил;

в каждом случае Z независимо представляет собой C_1-8 алкил, галоген, циано или нитро;

n является целым числом от 0 до 3;

где действует одно из следующего:

A) L представляет собой C_1-50 алкилен или гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов, и удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих условий:

(i) L включает по меньшей мере одну ненасыщенную связь;

(ii) два атома в L замещены двухвалентным заместителем таким образом, что заместитель, с атомами, которые он соединяет, образует гетероарилен;

(iii) L представляет собой гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов;

(iv) алкилен замещен одним или более C_1-20 алкилами; или

B) L включает по меньшей мере одно звено производного изопренила, представленное Формулой III, распознаваемое изопреноид-трансферазой:

В некоторых вариантах осуществления G представляет собой ; R³ представляет собой водород или защитную группу карбоксила; и каждый R⁴ независимо представляет собой водород или защитную группу гидроксила. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления каждый R¹ и R² представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления каждый Z независимо представляет собой C_1-8 алкил, галоген, циано или нитро.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления n равно 0.

В некоторых вариантах осуществления W представляет собой -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO₂NR'-, -P(O)R''NR'-, -SONR'- или -PO₂NR'-, где C, S или P непосредственно связан с фенильным кольцом, и каждый R' и R'' независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, моно- или ди-C_1-8 алкиламино, C_3-20 гетероарил или C_6-20 арил. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления W представляет собой -C(O)-, -C(O)NR'- или -C(O)O-. В некоторых еще больше предпочтительных вариантах осуществления, W представляет собой -C(O)NR'-, где C(O) связан с фенильным кольцом, а NR' связан с L.

В некоторых вариантах осуществления G представляет собой ; W представляет собой -C(O)NR'-, где C(O) связан с фенильным кольцом, а NR' связан с L; и каждый R¹ и R² представляет собой водород.

В некоторых вариантах осуществления L представляет собой C_1-50 алкилен или гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов, и удовлетворяет по меньшей мере одному из следующих условий:

(i) L включает по меньшей мере одну ненасыщенную связь;

(ii) два атома в L замещены двухвалентным заместителем таким образом, что заместитель, с атомами, которые он соединяет, образует гетероарилен;

(iii) L представляет собой гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов; и

(iv) алкилен замещен одним или более C_1-20 алкилами.

В некоторых вариантах осуществления L включает оксим, и по меньшей мере одно звено полиэтиленгликоля ковалентно связывает оксим с действующим веществом.

В некоторых вариантах осуществления L является азотсодержащим гетероалкиленом, содержащим 1-50 атомов, линкер включает по меньшей мере два атома гидрофильной аминокислоты, и азот образует пептидную связь с карбонилом гидрофильной аминокислоты.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления W представляет собой -C(O)NR'-, и азот в W является атомом азота гидрофильной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления гидрофильная аминокислота является аминокислотой, включающей боковую цепь, содержащую группу, которая несет заряд при нейтральном pH в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления гидрофильной аминокислотой является аргинин, аспартат, аспарагин, глутамат, глутамин, гистидин, лизин, орнитин, пролин, серин или треонин. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления гидрофильной аминокислотой является аргинин, аспартат, аспарагин, глутамат, глутамин, гистидин, лизин, орнитин, пролин, серин или треонин. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления гидрофильной аминокислотой является аспартат или глутамат. В других предпочтительных вариантах осуществления гидрофильной аминокислотой является орнитин или лизин. В других предпочтительных вариантах осуществления гидрофильной аминокислотой является аргинином. В некоторых вариантах осуществления аминокислота ковалентно связывает оксим линкера с полиэтиленгликолевым звеном линкера.

В некоторых вариантах осуществления линкер включает пептид, и пептид включает по меньшей мере одну гидрофильную аминокислоту, предпочтительно аминокислоту, имеющую боковую цепь, содержащую группу, которая несет заряд при нейтральном pH в водном растворе (например, амин, гуанидин или карбоксильную группу). В некоторых вариантах осуществления каждая аминокислота пептида независимо выбрана из аланина, аспартата, аспарагина, глутамата, глутамина, глицина, лизина, орнитина, пролина, серина и треонина. В некоторых вариантах осуществления пептид включает по меньшей мере один аспартат или глутамат.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления W представляет собой -C(O)NR'-, и азот в W является азотом N-концевой аминокислоты в пептиде.

В некоторых вариантах осуществления пептид ковалентно связывает оксим линкера с полиэтиленгликолевым звеном линкера.

В некоторых вариантах осуществления пептид включает 2-20 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления линкер ковалентно связан с Ат тиоэфирной связью, и тиоэфирная связь включает атом серы цистеина Ат. В некоторых вариантах осуществления Ат включает аминокислотный мотив, предпочтительно на C-конце Ат, который распознает изопреноид-трансфераза; и

тиоэфирная связь включает атом серы цистеина в аминокислотном мотиве.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотный мотив является последовательностью CYYX;

C представляет собой цистеин;

Y, независимо для каждого случая, представляет собой алифатическую аминокислоту, такую как аланин, изолейцин, лейцин, метионин или валин;

X, независимо для каждого случая, представляет собой глутамин, глутамат, серин, цистеин, метионин, аланин или лейцин; и

тиоэфирная связь включает атом серы цистеина в аминокислотном мотиве.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотный мотив является последовательностью CVIM или CVLL.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна из семи аминокислот, предшествующих аминокислотному мотиву, является глицином. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три из семи аминокислот, предшествующих аминокислотному мотиву, независимо выбраны из глицина и пролина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три из семи аминокислот, предшествующих аминокислотному мотиву, независимо выбраны из глицина, аспарагиновой кислоты, аргинина и серина. В некоторых вариантах осуществления каждая одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот, предшествующих аминокислотному мотиву, являются глицином. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления L включает аминокислотную последовательность GGGGGGGCVIM, предпочтительно на C-конце.

В некоторых вариантах осуществления L включает по меньшей мере одно звено производного изопренила, представленное Формулой III, которое распознает изопреноид-трансфераза:

В некоторых вариантах осуществления L является 3-50 гетероалкиленом, включающим оксим, где: атом кислорода оксима находится на стороне L, которая соединена с W, и атом углерода оксима находится на стороне L, которая соединена с Ат; или

атом углерода оксима находится на стороне L, которая соединена с W, и атом кислорода оксима находится на стороне L, которая соединена с Ат.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления L включает оксим, и по меньшей мере одно изопренильное звено ковалентно связывает оксим с Ат. В некоторых вариантах осуществления L включает:

или . В некоторых вариантах осуществления L включает:

. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления L включает:

.

В некоторых вариантах осуществления L дополнительно включает соединительное звено, представленное Формулой VIII или IX:

V представляет собой одинарную связь, -O-, -S-, -NR²¹-, -C(O)NR²²-, -NR²³C(O)-, -NR²⁴SO₂- или -SO₂NR²⁵-;

X представляет собой -O-, C_1-8 алкилен или -NR²¹-;

каждый R²¹ к R²⁵ независимо представляет собой водород, C_1-6 алкил, C_1-6 алкил C_6-20 арил или C_1-6 алкил C_3-20 гетероарил;

r является целым числом от 1 до 10;

p является целым числом от 0 до 12;

q является целым числом от 1 до 20; и

w является целым числом от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления q является целым числом от 4 до 20. В некоторых вариантах осуществления q является целым числом от 2 до 12. В некоторых вариантах осуществления q является целым числом от 6 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно 2, 5 или 11. В некоторых вариантах осуществления r равно 2. В некоторых вариантах осуществления p равно 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления V представляет собой -O-. В некоторых вариантах осуществления r равно 2; p равно 2; q равно 2, 5 или 11; и V представляет собой -O-. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления X представляет собой -O-.

В некоторых вариантах осуществления w является целым числом от 6 до 20. В некоторых вариантах осуществления L включает по меньшей мере одно звено полиэтиленгликоля, представленное или . В некоторых вариантах осуществления L включает 1-12 звеньев -OCH₂CH₂-. В некоторых вариантах осуществления L включает 3-12 звеньев -OCH₂CH₂-. В некоторых вариантах осуществления L включает 5-12 звеньев -OCH₂CH₂-. В некоторых вариантах осуществления L включает 6 или 12 звеньев -OCH₂CH₂-. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления L включает 3 звена -OCH₂CH₂-.

В некоторых вариантах осуществления L включает оксим, и по меньшей мере одно звено полиэтиленгликоля ковалентно связывает оксим с действующим веществом. В некоторых вариантах осуществления L включает связывающее звено, образованное в реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения, гетеро-реакции Дильса-Альдера, реакции нуклеофильного замещения, реакции карбонильной химии неальдольного типа, реакции присоединения к углерод-углеродной кратной связи, реакции окисления или реакции клик-химии.

Реакции клик-химии проводят в мягких условиях, что позволяет легко применять их для белков. Реакция клик-химии показывает высокую специфичность реакции. Следовательно, даже в том случае, если белок содержит другие функциональные группы (например, остаток боковой цепи на C- или N-конце), эти функциональные группы не подвергаются влиянию реакции клик-химии. Например, может проходить реакция клик-химии между азидной группой и ацетиленовой группой белка, при этом реакция клик-химии не влияет на другие функциональные группы белка. Кроме того, реакция клик-химии может проходить, в частности, независимо от типа задействованного лиганда. В некоторых случаях лиганд может быть выбран так, чтобы повышать общую эффективность реакции. Например, азид-ацетиленовая реакция клик-химии может давать триазол с высоким выходом (см. публикации Rhiannon K. Hia et al, Chem. Rev. 2009, 109, 5620; Morten Meldal and Christian Wenzel Tomoe, Chem Rev., 2008, 108, 2952; Hartmuth C. Kolb et al, Angew. Chemie Int. Ed. Engl., 2001, 40, 2004, которые включены в настоящий документ посредством отсылки).

В некоторых вариантах осуществления связывающее звено образуется в реакции между ацетиленом и азидом или в реакции между альдегидной или кетоновой группой и гидразином или алкоксиамином.

В некоторых вариантах осуществления L дополнительно включает связывающее звено, представленное Формулой IV, V, VI или VII:

L¹ представляет собой одинарную связь или C_1-30 алкилен; и

R¹¹ представляет собой водород или C_1-10 алкил.

В некоторых вариантах осуществления L¹ представляет собой одинарную связь. В других вариантах осуществления L¹ представляет собой C₁₁ алкилен.

В других вариантах осуществления L¹ представляет собой C₁₂ алкилен.

В некоторых вариантах осуществления L включает:

или

V представляет собой одинарную связь, -O-, -S-, -NR²¹-, -C(O)NR²²-, -NR²³C(O)-NR²⁴SO₂- или -SO₂NR²⁵-, предпочтительно -O-;

каждый R²¹ - R²⁵ независимо представляет собой водород, C_1-6 алкил, C_1-6 алкил C_6-20 арил или C_1-6 алкил C_3-20 гетероарил;

r является целым числом от 1 до 10;

p является целым числом от 0 до 10;

q является целым числом от 1 до 20; и

L₁ представляет собой одинарную связь.

В некоторых вариантах осуществления r равно 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления p равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления q равно 1-6. В некоторых вариантах осуществления r равно 2 или 3; p равно 1 или 2; и q равно 1-6.

В некоторых вариантах осуществления линкер включает:

где Ат представляет собой антитело против CD19; B представляет собой действующее вещество; и n является целым числом от 1 до 20.

В других вариантах осуществления линкер включает:

где Ат представляет собой антитело против CD19; B представляет собой действующее вещество; и n является целым числом от 1 до 20.

В других вариантах осуществления линкер включает:

где Ат представляет собой антитело против CD19; B представляет собой действующее вещество; и n является целым числом от 0 до 20.

В других вариантах осуществления линкер включает:

где Ат представляет собой антитело против CD19; B представляет собой действующее вещество; и n является целым числом от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления изопреноид-трансфераза является фарнезил-протеинтрансферазой (ФТазой) или геранилгеранил-трансферазой (ГГТазой).

В некоторых вариантах осуществления L дополнительно включает . В некоторых вариантах осуществления является связывающей группой.

В некоторых вариантах осуществления L включает один или более разветвленных линкеров, ковалентно связанных с Ат, где:

i) каждый разветвленный линкер включает разветвляющее звено (BR), ковалентно связанное с Ат первичным линкером (PL);

ii) каждый разветвленный линкер включает первую ветвь (B1), соединяющую первое действующее вещество с разветвляющим звеном, и включает вторичный линкер (SL) и расщепляемую группу (CG); и

iii) каждый разветвленный линкер дополнительно включает вторую ветвь (B2), где a) второе действующее вещество ковалентно связано с разветвляющим звеном вторичным линкером (SL) и расщепляемой группой (CG); или b) полиэтиленгликолевая группа ковалентно связана с разветвляющим звеном, и

где каждая расщепляемая группа может подвергаться гидролизу с высвобождением действующего вещества из конъюгата антитела.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно разветвляющее звено имеет структуру где каждый L², L³, L⁴ независимо является прямой связью или -C_nH_2n-, где n является целым числом от 1 до 30, где каждый G¹, G², G³ независимо является прямой связью, где R³⁰ представляет собой водород или C_1-30 алкил; и где R⁴⁰⁵-COOR⁵⁰, где L⁵ является прямой связью или C_1-10 алкиленом, и R⁵⁰ представляет собой водород или C_1-30 алкил.

В других вариантах осуществления линкер включает:

где:

B и B' представляют собой действующие вещества, которые могут быть одинаковыми или разными;

n, независимо для каждого случая, представляет собой целое число от 0 до 30;

f, независимо для каждого случая, представляет собой целое число от 0 до 30; и

L представляет собой связь с Ат.

В некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления n является целым числом от 4 до 20.

В некоторых вариантах осуществления расщепляемая группа способна расщепляться в клетке-мишени. В некоторых вариантах осуществления расщепляемая группа способна высвобождать одно или более действующих веществ. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела включает Ат; по меньшей мере один разветвленный линкер, ковалентно связанный с Ат; и по меньшей мере два действующих вещества, ковалентно связанных с разветвленным линкером. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разветвленных линкера связаны с Ат, причем каждый разветвленный линкер связан по меньшей мере с двумя действующими веществами. В некоторых вариантах осуществления три разветвленных линкера связаны с Ат. В других вариантах осуществления четыре разветвленных линкера связаны с Ат. В других вариантах осуществления ровно один разветвленный линкер связан с Ат. В других вариантах осуществления каждый разветвленный линкер связаны ровно с двумя действующими веществами. В некоторых вариантах осуществления конъюгат включает по меньшей мере два разных действующих вещества. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один разветвленный линкер связан с двумя разными действующими веществами.

В некоторых вариантах осуществления каждое действующее вещество связано с разветвленным линкером через расщепляемую (например, гидролизуемую) связь. В некоторых вариантах осуществления каждый разветвленный линкер включает разветвляющее звено, причем каждое действующее вещество связано с разветвляющим звеном через вторичный линкер, и разветвляющее звено связано с антителом против CD19 первичным линкером. В некоторых вариантах осуществления разветвляющее звено является атомом азота, например, амина или амида. В некоторых вариантах осуществления разветвляющее звено является амидом, и первичный линкер включает карбонил амида. В некоторых вариантах осуществления разветвляющее звено является амидом, и вторичный линкер включает карбонил амида. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления разветвляющее звено является лизиновым звеном.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления B является действующим веществом. В некоторых вариантах осуществления действующее вещество независимо выбрано из химиотерапевтических веществ и токсинов. В некоторых вариантах осуществления действующее вещество является иммуномодулирующим соединением, противоопухолевым средством, противовирусным средством, антибактериальным средством, противогрибковым средством, противопаразитарным средством или их комбинацией.

В некоторых вариантах осуществления каждое действующее вещество независимо выбрано из следующих:

(a) эрлотиниб, бортезомиб, фулвестрант, сутент, летрозол, иматиниба мезилат, PTK787/ZK 222584, оксалиплатин, 5-фтороурацил, лейковорин, рапамицин, лапатиниб, лонафарниб, сорафениб, гефитиниб, AG1478, AG1571, тиотепа, циклофосфамид, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, этиленимин, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, топотекан, бриостатин, каллистатин, CC-1065, адозелезин, карзелезин, бизелезин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, KW-2189, CB1-TM1, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, калихеамицин гамма 1, калихеамицин омега 1, динемицин, динемицин A, клодронат, эсперамицин, хромофор неокарциностатина, аклациномицины, актиномицин, антимицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин, липосомальный доксорубицин, дезоксидоксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин, 5-фторурацил, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фолиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефосфамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, этоглюцид, галлия нитрат, гидроксимочевина, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцины, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, 2-этилгидразид, прокарбазин, полисахарид-k, разоксан, ризоксин, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, 2,2',2''-трихлортриэтиламин, T-2 токсин, верракурин A, роридин A и ангидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид, циклофосфамид, тиотепа, паклитаксел, композиция стаблизированных альбумином наночастиц паклитаксела, доксетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, карбоплатин, винбластин, платина, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, Кселода, ибандронат, CPT-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин, ретиноевая кислота, капецитабин или фармацевтически приемлемые соли, сольваты или кислоты любого из указанных выше;

(b) монокин, лимфокин, традиционный полипептидный гормон, паратиреоидный гормон, тироксин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновый гормон, фолликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, лютеинизирующий гормон, фактора роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухоли α, фактор некроза опухоли β, мюллерова ингибирующая субстанция, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов, тромбопоэтин, эритропоэтин, остеоиндуктивный фактор, интерферон, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, колониестимулирующий фактор ("КСФ"), КСФ макрофагов, КСФ гранулоцитов-макрофагов, КСФ гранулоцитов, интерлейкин ("IL"), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, фактор некроза опухоли, ФНО-α, ФНО-β, полипептидный фактор, LIF, лиганд kit или комбинация любого из указанных выше;

(c) дифтерийный токсин, ботулинический токсин, столбнячный токсин, дизентерийный токсин, холерный токсин, аманитин, производные аманитина, α-аманитин, пирролобензодиазепин, производные пирролобензодиазепина, тетродотоксин, бреветоксин, цигуатоксин, рицин, цигуатоксин, AM токсин, ауристатин, тубулизин, гелданамицин, майтанзиноид, калихеамицин, дауномицин, доксорубицин, метотрексат, виндезин, SG2285, доластатин, аналог доластатина, криптофицин, камптотецин, производные и метаболиты камптотецина, ризоксин, производное ризоксина, CC-1065, аналог или производное CC-1065, дуокармицин, ендииновый антибиотик, эсперамицин, эпотилон, азонафид, аплидин, токсоид или комбинация любого из указанных выше;

(d) аффинный лиганд, где аффинный лиганд является субстратом, ингибитором, стимулирующим средством, нейромедиатором, радиоизотопом или комбинацией любого из указанных выше;

(e) радиоактивная метка, ³²P, ³⁵S, флуоресцентный краситель, электронно-плотный реагент, фермент, биотин, стрептавидин, диоксигенин, гаптен, иммуногенный белок, молекула нуклеиновой кислоты с комплементарной к мишени последовательностью или комбинации любого из указанных выше;

(f) иммуномодулирующее соединение, противоопухолевое средство, противовирусное средство, антибактериальное средство, противогрибковое средство и инсектицидное средство или комбинация любого из указанных выше;

(g) тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен,

LY117018, онапристон, или торемифен;

(h) 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат, эксеместан, летрозол или анастрозол;

(i) флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид, гозерелин, или троксацитабин;

(j) ингибитор ароматазы;

(k) ингибитор протеинкиназы;

(l) ингибитор липидкиназы;

(m) антисмысловой олигонуклеотид;

(n) рибозим;

(o) вакцина; и

(p) антиангиогенное средство.

В некоторых вариантах осуществления Ат является антителом против CD19;

действующее вещество является димером пирролбензодиазепина;

линкер соединяет Ат с N10 или N'10 положением димера пирролбензодиазепина; и y является целым числом от 1 до 20.

В некоторых вариантах осуществления действующим веществом является димером пирролбензодиазепина;

димер пирролбензодиазепина замещен X в положении N10 или замещен X' в положении N'10, где X или X' присоединяют димер пирролбензодиазепина к линкеру;

каждый X и X' независимо выбраны из -C(O)O-*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NR^X-*, -S(O)₂NR^X-*, -(P(O)R')NR^X-*, -S(O)NR^X-* или -PO₂NR^X-*;

R^X представляет собой H, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_3-20 гетероарил или C_5-20 арил;

R^X' представляет собой OH, N₃, CN, SH, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарил, C_5-20 арил или амино; и

* представляет собой положение соединения между димером пирролбензодиазепина и линкером.

В некоторых вариантах осуществления каждый X и X' независимо выбран из -C(O)O-*, -C(O)-* или -C(O)NR^X-*.

В некоторых вариантах осуществления, где димер пирролбензодиазепина представлен Формулой X или Формулой XI:

где:

пунктирные линии обозначают необязательное присутствие двойной связи между C1 и C2 или между C2 и C3; и между C'1 и C'2 или между C'2 или C'3;

R^X1 и R^X1' независимо выбраны из H, OH, =O, =CH₂, CN, R^m, OR^m, =CH-R^m' =C(R^m')₂, O-SO₂-R^m, CO₂R^m, COR^m, галогена и дигалогена,

R^m' независимо выбран из R^m, CO₂R^m, COR^m, CHO, CO₂H и галогена,

каждый R^m независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила;

каждый R^X2, R^X2', R^X3, R^X3', R^X5 и R^X5' независимо выбран из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^m₂, NO₂, Me₃Sn и галогена;

R^X4 и R^X4' независимо выбраны из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^m₂, NO₂, Me₃Sn, галогена, C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-12 арила, 5-7-членного гетероарила, -CN, -NCO, -ORⁿ, -OC(O)Rⁿ, -OC(O)NRⁿRⁿ', -OS(O)Rⁿ, -OS(O)₂Rⁿ, -SRⁿ, -S(O)Rⁿ, -S(O)₂Rⁿ, -S(O)NRⁿRⁿ', -S(O)₂NRⁿRⁿ', -OS(O)NRⁿRⁿ', -OS(O)₂NRⁿRⁿ', -NRⁿRⁿ', -NRⁿC(O)R^O, -NRⁿC(O)OR^O, -NRⁿC(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)R^O, -NRⁿS(O)₂R^O, -NRⁿS(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)₂NR^OR^O', -C(O)Rⁿ, -C(O)ORⁿ и -C(O)NRⁿRⁿ';

R^X и R^X' независимо выбраны из H, OH, N₃, CN, NO₂, SH, NH₂, ONH₂, NHNH₂, галогена, C_1-8 алкила, C_3-8 циклоалкила, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарила, C_5-20 арила или моно- или ди-C_1-8 алкиламино;

Y и Y' независимо выбраны из O, S и N(H);

R^X6 представляет собой C_3-12 алкилен, C_3-12 алкенилен или C_3-12 гетероалкилен;

R^X7 и R^X7' независимо выбраны из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_6-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -OR^r, -OC(O)R^r, -OC(O)NR^rR^r', -OS(O)R^r, -OS(O)₂R^r, -SR^r, -S(O)R^r, -S(O)₂R^r, -S(O)NR^rR^r', -S(O)₂NR^rR^r', -OS(O)NR^rR^r', -OS(O)₂NR^rR^r', -NR^rR^r', -NR^rC(O)R^s, -NR^rC(O)OR^s, -NR^rC(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)R^s, -NRR^s(O)₂R^s, -NRR^s(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)₂NR^sR^s, -C(O)R^r, -C(O)OR^s или -C(O)NR^rR^r';

каждый R^r, R^r', R^s и R^s' независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила и 5-7-членного гетероарила;

каждый R^X8 и R^X8' независимо выбран из H, C_1-6алкила, C_2-6алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 гетероалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -S(O)R^m, -S(O)₂R^m, -S(O)NR^mR^m', -S(O)₂NR^mR^m', -NR^mR^m', -NR^mC(O)R^m, -NR^mC(O)ORⁿ, -NR^mC(O)NRⁿRⁿ', -NR^mS(O)Rⁿ, -NR^mS(O)₂Rⁿ, -NR^mS(O)NRⁿRⁿ', -NR^mS(O)₂NRⁿRⁿ', -C(O)R^m, -C(O)OR^m и -C(O)NR^mR^m',

Z^a выбран из OR^X12a, NR^X12aR^X12a или SR^X12a;

Z^b выбран из OR^X13a, NR^X13aR^X13a или SR^X13a;

Z^a' выбран из OR^X12a, NR^X12aR^X12a или SR^X12a;

Z^b' выбран из OR^X13a', NR^X13a'R^X13a' или SR^X13a';

каждый из R^X12a, R^X12a', R^X13a' и R^X13a' независимо отсутствует или выбран из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -C(O)R^X15a, -C(O)OR^X15a и -C(O)NR^X15aR^X15a'; и

каждый R^X15a и R^X15a' независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила;

где R^X13a и R^X14a, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, необязательно объединяются с образованием 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила или 3-7-членного гетероарила; и R^X13a' и R^X14a', взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, необязательно объединяются с образованием 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила или 3-7-членного гетероарила; и

где каждый Rⁿ, Rⁿ', R^O, R^O', R^p и R^p' независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10арила и 5-7-членного гетероарила.

В некоторых вариантах осуществления каждый R^m независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила, где R^m необязательно замещен одним или более C_1-12 алкилом, C_2-12 алкенилом, C_2-12 алкинилом, C_5-20 арилом, C_5-20 гетероарилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом или 5-7-членным гетероарилом.

В некоторых вариантах осуществления R^X4 и R^X4' независимо выбраны из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^mR^m', NO₂, Me₃Sn, галогена, C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-12 арила, 5-7-членного гетероарила, -CN, -NCO, -ORⁿ, -OC(O)Rⁿ, -OC(O)NRⁿRⁿ', -OS(O)Rⁿ, -OS(O)₂Rⁿ, -SRⁿ, -S(O)Rⁿ, -S(O)₂Rⁿ, -S(O)NRⁿRⁿ', -S(O)₂NRⁿRⁿ', -OS(O)NRⁿRⁿ', -OS(O)₂NRⁿRⁿ', -NRⁿRⁿ', -NRⁿC(O)R^O, -NRⁿC(O)OR^O, -NRⁿC(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)R^O, -NRⁿS(O)₂R^O, - NRⁿS(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)₂NR^OR^O', -C(O)Rⁿ, -C(O)ORⁿ и -C(O)NRⁿRⁿ',

где в том случае, когда R^X4 или R^X4' является C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_5-12 арилом, 5-7-членным гетероарилом, он необязательно замещен одним или более C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C₃-C₆ циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_5-10 арилом, 5-7-членным гетероарилом, -OR^p, -OC(O)R^p, -OC(O)NR^pR^p', -OS(O)R^p, -OS(O)₂R^p, -SR^p, -S(O)R^p, -S(O)₂R^p, -S(O)NR^pR^p', -S(O)₂NR^pR^p', -OS(O)NR^pR^p', -OS(O)₂NR^pR^p', -NR^pR^p', -NR^pC(O)R^q, -NR^pC(O)OR^q, -NR^pC(O)NR^qR^q', -NR^pS(O)R^q, -NR^pS(O)₂R^q, -NR^pS(O)NR^qR^q', -NR^pS(O)₂NR^qR^q', -C(O)R^p, -C(O)OR^p или -C(O)NR^pR^p.

В некоторых вариантах осуществления R^X7 и R^X7' независимо выбраны из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_6-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -OR^r, -OC(O)R^r, -OC(O)NR^rR^r', -OS(O)R^r, -OS(O)₂R^r, -SR^r, -S(O)R^r, -S(O)₂R^r, -S(O)NR^rR^r', -S(O)₂NR^rR^r', -OS(O)NR^rR^r', -OS(O)₂NR^rR^r', -NR^rR^r', -NR^rC(O)R^s, -NR^rC(O)OR^s, -NR^rC(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)R^s, -NRR^s(O)₂R^s, -NRR^s(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)₂NR^sR^s, -C(O)R^r, -C(O)OR^s или -C(O)NR^rR^r',

где в том случае, когда R^X7 или R^X7' является C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_6-10 арилом, 5-7-членным гетероарилом, он необязательно замещен одним или более C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_6-10 арилом, 5-7-членным гетероарилом, -OR^t, -OC(O)R^t, -OC(O)NR^tR^t', -OS(O)R^t, -OS(O)₂R^t, -SR^t, -S(O)R^t, -S(O)₂R^t, - S(O)NR^tR^t', -S(O)₂NR^tR^t', -OS(O)NR^tR^t', -OS(O)₂NR^tR^t', -NR^tR^t', -NR^tC(O)R^u, -NR^tC(O)OR^u, -NR^tC(O)NR^uR^u', -NR^tS(O)R^u, -NR^tS(O)₂R^u, -NR^tS(O)NR^uR^u', -NR^tS(O)₂NR^uR^u', -C(O)R^t, -C(O)R^t или -C(O)NR^tR^t',

где каждый R^r, R^r', R^s, R^s, R^t, R^t', R^u и R^u' независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила и 5-7-членного гетероарила.

В некоторых вариантах осуществления R^X1 и R^X1' независимо выбраны из R^m; и R^m выбран из C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_5-7 арила и C_3-6 гетероарила.

В некоторых вариантах осуществления R^X2, R^X2', R^X3, R^X3', R^X5 и R^X5' независимо выбраны из H или OH.

В некоторых вариантах осуществления R^X4 и R^X4' независимо выбраны из R^m; и R^m представляет собой C_1-6 алкокси. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления R^X4 и R^X4' независимо выбраны из метокси, этокси или бутокси. В некоторых вариантах осуществления Y и Y' представляют собой O.

В некоторых вариантах осуществления R^X6 является C_3-12 алкиленом, C_3-12 алкениленом, C_3-12 гетероалкиленом, где:

R^X6 замещен -NH₂, -NHR^m, -NHC(O)R^m, -NHC(O)CH₂-[OCH₂CH₂]_n-R^XX или -[CH₂CH₂O]_n-R^XX;

где R^XX выбран из H, OH, N₃, CN, NO₂, SH, NH₂, ONH₂, NHNH₂, галогена, C_1-8 алкила, C_3-8 циклоалкила, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарила, C_5-20 арила или моно- или ди-C_1-8 алкиламино; и

n является целым числом от 1 до 6.

В некоторых вариантах осуществления действующее вещество является димером пирролбензодиазепина, представленным Формулой XII или Формулой XIII:

где:

X^a и X^a' независимо выбраны из связи или C_1-6 алкилена;

каждый Z^X' и Z^X независимо выбран из водорода, C_1-8 алкила, галогена, циано, нитро, , или -(CH₂)_m-OCH₃;

каждый R⁸⁰, R⁹⁰ и R¹⁰⁰ независимо выбран из водорода, C_1-8 алкила, C_2-6 алкенила и C_1-6 алкокси; и

m является целым числом от 0 до 12.

В некоторых вариантах осуществления каждый Z^X' и Z^X независимо выбран из водорода, , и -(CH₂)_m-OCH₃;

каждый R⁸⁰, R⁹⁰ и R¹⁰⁰ независимо выбран из водорода, C_1-3 алкила и C_1-3 алкокси; m является целым числом от 1 до 6.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления действующим веществом является:

,

,

X может быть соединен с Ат через связывающую группу, которая может быть образована в реакции двух отдельных связывающих групп. Например, связывающая группа может быть образована в реакции амина или гидроксиламина с электрофилом, с получением, например, амидной или N-C связи. В некоторых вариантах осуществления X включает связывающую группу и соединен с Ат через связывающую группу (например, амин, амид, гидроксиламин, триазол, алкин, дисульфид или тиоэфир). Триазол может быть образован в реакции азида с алкином. Сукцинимид может быть образован в реакции тиола с малеимидом. Дисульфид может быть образован в реакции тиола с малеимидом.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один X включает группу, образованную из одной из следующих структурных формул. Следует понимать, что связывающие группы в структурах ниже изображены в виде структурно полных формул, при этом связывающие группы в них соединены с Ат посредством подходящих реакций. Например, -NH₂ группы, изображенные ниже, как очевидно, охватывают -N(H)- группы, связанные с фрагментом Ат. Аналогичным образом, азидные или этинильные группы, как будет очевидно, охватывают триазолы:

В другом аспекте настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, включающие конъюгат антитела-лекарственного средства, как описано в настоящем документе, необязательно дополнительно включающие терапевтически эффективное количество химиотерапевтического средства.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения рака, включающие введение конъюгата антитела-лекарственного средства согласно изобретению или его фармацевтической композиции. В некоторых таких вариантах осуществления рак выбран из лейкоза, лимфомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичника, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, глиомы, рака легкого, рака бронхов, рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака печени, рака мочевого пузыря, рака почки, рака почечной лоханки, рака ротовой полости, рака глотки, рака тела матки или меланомы.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, включающие введение конъюгата антитела-лекарственного средства согласно изобретению или его фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание или воспалительное заболевание выбрано из опосредованных B-клетками аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, например, системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), гипергаммаглобулинемии Вальденстрема, синдрома Шегрена, рассеянного склероза (РС) или волчаночного нефрита.

АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD19

Примерные антитела против CD19 включают антитела, указанные в настоящем документе как 5F5, 7F11, 9G8, F6, 7F1 и 10D8, или их любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или биспецифичные варианты. Аналогичным образом антитело против CD19 может быть антителом или его любым фрагментом, вариантом, мультимерной версией или биспецифичным вариантом, который связывается с тем же эпитопом, что и 5F5, 7F11, 9G8, F6, 7F1 и 10D8. Эти антитела или их любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или биспецифичные варианты соответственно именуются в настоящем документе антителами к "huCD19". Антитела к huCD19 согласно изобретению включают полностью человеческие моноклональные антитела, а также гуманизированные моноклональные антитела и химерные антитела или их любые фрагменты, варианты, мультимерные версии или биспецифичные варианты. Такие антитела демонстрируют специфичность к человеческому CD19, причем было показано, что они модулируют, например блокируют, ингибируют, снижают, антагонистически воздействуют, нейтрализуют или иным образом нарушают, по меньшей мере одну биологическую функцию или активность CD19.

Биологическая функция или активность CD19 включает, в качестве неограничивающего примера, функционирование в качестве B-клеточного корецептора с CD21 и/или CD81, связывание, в активированном фосфорилированном состоянии, с одной или более киназами семейства Src; и/или рекрутинг PI-3 киназы. Считается, что антитела полностью модулируют, блокируют, ингибируют, снижают, антагонистически воздействуют, нейтрализуют или иным образом нарушают по меньшей мере одну функциональную активность CD19, если уровень функциональной активности CD19 в присутствии антитела снижается по меньшей мере на 95%, например, на 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по сравнению с уровнем функциональной активности CD19 в отсутствие связывания с антителом, описанным в настоящем документе. Считается, что антитела частично модулируют, блокируют, ингибируют, снижают, антагонистически воздействуют, нейтрализуют или иным образом нарушают по меньшей мере одну функциональную активность CD19, если уровень функциональной активности CD19 в присутствии антитела снижается меньше чем на 95%, например, на 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% или 90%, по сравнению с уровнем функциональной активности CD19 в отсутствие связывания с антителом, описанным в настоящем документе.

Каждое из моноклональных антител к huCD19 или их любой фрагмент, вариант, мультимерная версия или биспецифичный вариант, описанные в настоящем документе, включают вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), как показано в аминокислотных последовательностях и соответствующих последовательностях нуклеиновых кислот, перечисленных ниже. CDR-последовательности, согласно IMGT, выделены рамками в каждой из последовательностей VH и VL ниже.

Антитело 5F5 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 2), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 4), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 3:

>5F5_VH

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGISGIYNLHGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)

>5F5_VH

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGTATAAGTGGGATCTACAATTTACACGGTTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 1)

>5F5_VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASLDSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:4)

>5F5_VL

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGCGAGCTTGGACAGCCCGTTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 3)

Антитело 7F11 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 6), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 8), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 7:

>7F11_VH

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGVSGIYNLHGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)

>7F11_VH

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGTGTAAGTGGGATCTACAATTTACACGGTTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 5)

>7F11_VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGMWDNPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 8)

>7F11_VL

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGGCATGTGGGACAACCCGTTCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 7)

Антитело 9G8 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 6), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 39, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 10), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 9:

>9G8_VH

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGVSGIYNLHGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)

>9G8_VH

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGTGTAAGTGGGATCTACAATTTACACGGTTTCGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 39)

>9G8_VL

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGRFGSPFTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 10)

>9G8_VL

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGGGCAGGTTCGGGTCCCCGTTCACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 9)

Антитело F6 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 12), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 14), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 13:

>F6_VH

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVWYYDFWSGADAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)

>F6_VH

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGTCTGGTATTACGATTTTTGGAGTGGGGCCGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 11)

>F6_VL

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQGSLEAPQTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)

>F6_VL

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGGGCAGCTTGGAGGCGCCGCAGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 13)

Антитело 7F1 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 16), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 18), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 17:

>7Fl_VH

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGDYWTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)

>7F1_VH

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGGTGATTATTGGACTGGTTTGCTTAT

TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 15)

>7F1_VL

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDLGWNSVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 18)

>7F1_VL

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATCTGGGCTGGAACTCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 17)

Антитело 10D8 включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) (SEQ ID NO: 20), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (VL) (SEQ ID NO: 22), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO: 21:

>10D8_VH

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYDYVWGSYRYGAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20)

>10D8_VH

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCGGGGGTATGATTACGTTTGGGGGAGTTATCGTTATGGTGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 19)

>10D8_VL

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYDVWVPHMVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 22)

>10D8_VL

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGAGGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATGATGTCTGGGTCCCGCACATGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 21)

В некоторых вариантах осуществления последовательности антител к CD19, представленные в настоящем документе, или их антигенсвязывающие фрагменты применяются для получения моновалентного антитела. Моновалентные антитела согласно настоящему изобретению включают обычную последовательность тяжелой цепи, одно плечо, которое специфично распознает CD19, и второе плечо, именуемое в настоящем документе имитирующим плечом. Имитирующее плечо включает аминокислотную последовательность, которая не связывается или каким-либо иным образом не вступает в перекрестную реакцию с человеческим белком. В некоторых вариантах осуществления имитирующее плечо включает аминокислотную последовательность, которая не связывается или каким-либо иным образом не вступает в перекрестную реакцию с человеческим белком, который присутствует в цельной крови. В некоторых вариантах осуществления имитирующее плечо включает аминокислотную последовательность, которая не связывается или каким-либо иным образом не вступает в перекрестную реакцию с человеческим белком, который присутствует в солидной ткани. Предпочтительно моновалентные антитела являются специфичными, по меньшей мере, к CD19 человека. В некоторых вариантах осуществления моновалентные антитела, которые распознают CD19 человека, также обладают перекрестной реактивностью по меньшей мере с одним другим, нечеловеческим белком CD19, таким как, в качестве неограничивающего примера, CD19 не относящегося к человеку примата, например CD19 яванского макака, и/или CD19 грызуна.

В некоторых вариантах осуществления последовательность антитела против CD19 или его антигенсвязывающего фрагмента используется со второй последовательностью антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают другую мишень, отличную от CD19, для получения биспецифичного антитела, именуемого в настоящем документе "биспецифичным антителом против CD19".

Хотя приведенные ниже последовательности антител представлены в настоящем документе в качестве примеров, следует понимать, что эти последовательности могут использоваться для получения биспецифичных антител с применением любого из множества известных в данной области способов. Примеры биспецифичных форматов включают, без ограничения ими, полностью человеческие биспецифичные антитела, которые включают обычную тяжелую цепь, легкую цепь каппа-типа и легкую цепь лямбда-типа (публикация РСТ WO 2012/023053), биспецифичный IgG, полученный на основе обмена Fab-плечами (Gramer et al., 2013 MAbs. 5(6)); формат CrossMab (Klein C et al., 2012 MAbs 4(6)); множество форматов, основанных на методах принудительной гетеродимеризации, таких как технология SEED (Davis JH et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23(4):195-202), электростатическое наведение (Gunasekaran K et al., J Biol Chem. 2010 285(25):19637-46.) или "выступ-во-впадину" (Ridgway JB et al., Protein Eng. 19969(7):617-21), или другие наборы мутаций, препятствующие образованию гомодимера (Von Kreudenstein TS et al., 2013 MAbs. 5(5):646-54.); биспецифичные форматы на основе фрагментов, такие как тандемный scFv (такие как BiTE) (Wolf E et al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44); биспецифичные четырехвалентные антитела (Portner LM et al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75); перенаправляющие молекулы с двойной аффинностью (Moore PA et al., 2011 Blood. 117(17):4542-51), диатела (Kontermann RE et al., Nat Biotechnol. 1997 15(7):629-31).

Определения:

Если в настоящем документе не определено иное, научно-технические термины, используемые в данной заявке, должны иметь значения, которые обычно известны средним специалистам в данной области. Как правило, номенклатура, используемая в отношении, а также методики, химии, культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, цитологии и онкобиологии, нейробиологии, нейрохимии, вирусологии, иммунологии, микробиологии, фармакологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, являются известными и широко используются в данной области.

Способы и технологии согласно настоящему изобретению обычно применяют, если не указано иное, согласно стандартным методам, хорошо известным в уровне техники и описанным в различных общих и более конкретных ссылках, цитируемых и обсуждаемых по всему тексту настоящего описания. См., например, "Principles of Neural Science", McGraw-Hill Medical, New York, N.Y. (2000); Motulsky, "Intuitive Biostatistics", Oxford University Press, Inc. (1995); Lodish et al., "Molecular Cell Biology, 4th ed.", W.H. Freeman & Co., New York (2000); Griffiths et al., "Introduction to Genetic Analysis, 7th ed.", W.H. Freeman & Co., N.Y. (1999); and Gilbert et al., "Developmental Biology, 6th ed.", Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (2000).

Если иное не следует из контекста, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. Как правило, номенклатуры, используемые в отношении, а также методики, культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, а также химии белков и олиго- или полинуклеотидов и гибридизации, описанные в настоящем документе, хорошо известны и широко используются в данной области. Стандартные методики используются для рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов, культивирования и трансформации тканей (например, электропорации, липофекции). Ферментные реакции и методы очистки проводят в соответствии с методиками производителя или в соответствии с общепринятой практикой в данной области, или как описано в настоящем документе. Указанные выше технологии и методики обычно применяют в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Номенклатура, используемая в отношении лабораторных методик и методов аналитической химии, химии органического синтеза, а также медицинской и фармацевтической химии, описанных в настоящем документе, хорошо известна и широко используется в данной области. Стандартные методики используются для химического синтеза, химического анализа, изготовления фармацевтических препаратов, композиций и их доставки, а также лечения пациентов.

При использовании в соответствии с настоящим изобретением следует понимать, что следующие термины, если не указано иное, имеют следующие значения:

При использовании в настоящем документе термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов и к иммунологически активным фрагментам молекул иммуноглобулинов (Ig), т.е. к молекулам, которые содержат антигенсвязывающий участок, который специфично связывается (иммунологически взаимодействует) с антигеном. Под "специфично связывается" или "иммунологически взаимодействует", или "иммуноспецифично связывает" подразумевается, что антитело взаимодействует с одной или более антигенными детерминантами требуемого антигена и не взаимодействует с другими полипептидами или связывается с намного более низкой аффинностью (K_d>10^-6). Антитела включают, без ограничения ими, поликлональные, моноклональные, химерные, dAb (доменные антитела), одноцепочечные, F_ab, F_ab' и F_(ab'₎₂ фрагменты, scFv и F_ab экспрессионную библиотеку. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или соответствующим подклассам (изотипам) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), на основе идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют разные и хорошо известные структуры и трехмерные конфигурации субъединиц. Термин "антитело" не относится к молекулам, которые не обладают гомологией с иммуноглобулиновой последовательностью. Например, термин "антитело" при использовании в настоящем документе не включает "репетела".

Как известно, основная структурная единица антитела включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-концевой участок каждой цепи включает вариабельную область приблизительно из 100-110 или больше аминокислот, которые в основном отвечают за распознавание антигена. C-концевой участок каждой цепи определяет константную область, которая в основном ответственна за эффекторную функцию. Как правило, молекулы антител, полученные у человека, относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, которые отличаются друг от друга свойствами тяжелой цепи, присутствующей в молекуле. Некоторые классы также имеют подклассы, такие как IgG1, IgG2 и другие. Кроме того, у человека легкая цепь может быть каппа-цепью или лямбда-цепью.

Термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела и относится к определяющим антигенные свойства вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fd и Fv фрагменты, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифичные антитела, полученные из фрагментов антител.

Термин "моноклональное антитело" (мАт) или "композиция моноклонального антитела" при использовании в настоящем документе относится к популяции молекул антитела, содержащих молекулу антитела только одного молекулярного типа, состоящую из уникального продукта гена легкой цепи и уникального продукта гена тяжелой цепи. В частности, определяющие комплементарность области (CDR-области) моноклонального антитела, идентичны во всех молекулах популяции. МАт содержат антигенсвязывающий участок, способный иммунологически взаимодействовать с конкретным эпитопом антигена и характеризующийся уникальной аффинностью связывания с ним. Термин "моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это отличается от поликлональных антител, которые, как правило, включают разные антитела, направленные против множества различных антигенных детерминант. Термин "моноклональное антитело" включает фрагменты антитела (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, включающую участок распознавания антигена, а также интактные и полноразмерные моноклональные антитела, но не ограниченные этим. Кроме того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, которые получены любыми различными методами, включающими, без ограничения, гибридому, отбором с помощью фагового дисплея, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.

Термин "антигенсвязывающий участок" или "связывающая часть" относится к фрагменту молекулы иммуноглобулина, который участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий участок образован аминокислотными остатками N-концевых вариабельных ("V") областей тяжелой ("H") и легкой ("L") цепей. Три высокоизменчивых участка в V-областях тяжелой и легкой цепей, называемые "гипервариабельными участками", включены между более консервативными фланкирующими участками, известными как "каркасные области" или "FR-области". Таким образом, термин "FR" относится к аминокислотным последовательностям, которые в иммуноглобулинах обычно находятся между гипервариабельными областями и примыкают к ним. В молекуле антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены относительно друг друга в трехмерном пространстве так, что они формируют антигенсвязывающую поверхность. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связываемого антигена, и три гипервариабельных области каждой из тяжелых и легкой цепей называются "определяющими комплементарность областями" или "CDR-областями". Определение аминокислот, отноящихся к каждому домену, производят в соответствии с определениями в Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)) или Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Антитело "специфично связывается" с эпитопом или антигенной молекулой, что означает то, что антитело взаимодействует или связывается более часто, быстрее, с большей продолжительностью, с большей аффинностью или с некоторой комбинацией указанного выше с эпитопом или антигенной молекулой, чем альтернативные вещества, включая нерелевантные белки. В конкретных вариантах осуществления термин "специфично связывается" означает, например, что антитело связывается с белком с K_D приблизительно 0,1 мМ или меньше, но обычно меньше чем приблизительно 1 мкМ. В конкретных вариантах осуществления "специфично связывается" означает, что антитело связывается с белком в некоторых случаях с K_D приблизительно 0,1 мМ или меньше, а в других случаях с K_D приблизительно 0,01 мкМ или меньше. Вследствие идентичности последовательностей между гомологичными белками разных видов, специфичное связывание может включать антитело, распознающее конкретный белок больше чем у одного вида. Следует понимать, что антитело или связывающий остаток, который специфично связывается с первой мишенью, может специфично связываться или не связываться специфично со второй мишенью. Как описано выше, "специфичное связывание" не требует обязательно (хотя может включать) исключительное связывание, то есть связывание с одной мишенью. Обычно, но не обязательно, термин связывание, используемый в настоящем документе, означает специфичное связывание.

Термин "гуманизированное антитело" относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические иммуноглобулиновые цепи, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальные нечеловеческие (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменены остатками из CDR не относящихся к человеку видов (например, мыши, крысы, кролика и хомяка), обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и связывающей способностью (см., например, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях остатки Fv каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками антитела из не относящихся к человеку видов, обладающими требуемой специфичностью, аффинностью и/или связывающей способностью. Гуманизированное антитело может быть дополнительно модифицировано путем замены дополнительных остатков в Fv каркасной области и/или в заменяемых нечеловеческих остатках для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности и/или связывающей способности антитела. Обычно гуманизированное антитело включает практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или по существу все CDR-области, которые соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину, тогда как все или по существу все каркасные области (FR) имеют консенсусную последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может включать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для получения гуманизированных антител, описаны в патенте США 5,225,539, который включен в настоящее описание посредством отсылки.

Термин "человеческое антитело" при использовании в настоящем документе относится к антителу, кодируемому нуклеотидной последовательностью человека, или антителу, имеющему аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, вырабатываемому у человека, при использовании любой подходящей методики. Данное определение человеческого антитела включает интактные полноразмерные антитела и/или их фрагменты.

Термин "химерное антитело" относится к антителу, где аминокислотная последовательность молекулы иммуноглобулина получена из двух или более биологических видов, один из которых предпочтительно является человеком. Как правило, вариабельные области легких и тяжелых цепей соответствуют вариабельным областям антител, полученным из одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с требуемой специфичностью, аффинностью и связывающей способностью, тогда как константные области гомологичны последовательностям в антителах, полученных из другого вида (обычно человека), например, чтобы избежать развитие иммунного ответа у этого вида.

Антитела, в том числе их фрагменты/производные и моноклональные антитела, могут быть получены с помощью любого подходящего метода (см., например, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 21:2265-2266 (1993); Morimoto et al., J Biochemical & Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science 229:81(1985); Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kilpatrick et al., Hybridoma 16(4):381-389 (1997); Wring et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 19(5):695-707 (1999); Bynum et al., Hybridoma 18(5):407-411 (1999), Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year Immuno. 7:33 (1993); Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992), патенты США 4,816,567, 5,514,548, 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669, 5,545,807; публикация заявки на патент PCT WO 97/17852, которые настоящим включены посредством отсылок во всей своей полноте).

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело не связывается специфично с CD19 или EGFR (рецептором эпидермального фактора роста). В других вариантах осуществления антитело может быть антителом против CD19 или EGFR.

Когда антитело включает по меньшей мере одну легкую цепь и по меньшей мере одну тяжелую цепь, по меньшей мере одна легкая цепь антитела и/или по меньшей мере одна тяжелая цепь антитела могут включать аминокислотную область, содержащую аминокислотный мотив, который может распознаваться изопреноид-трансферазой. Поскольку антитело может включать четыре полипептидных цепи (например, две тяжелых цепи и две легких цепи), антитело может включать четыре аминокислотных мотива, каждый из которых может использоваться для конъюгирования действующего вещества с антителом через линкер. Таким образом, конъюгат антитела-лекарственного средства может включать 4 линкера, каждый из которых конъюгирован с действующим веществом, например, каждый конъюгирован с С-концом другой цепи антитела. Таким образом, конъюгат антитела-лекарственного средства может включать по меньшей мере один линкер и по меньшей мере одно действующее вещество. Конъюгат антитела-лекарственного средства может включать по меньшей мере два линкера, при этом конъюгат антитела-лекарственного средства может включать по меньшей мере два действующих вещества. Конъюгат антитела-лекарственного средства может включать множество линкеров. Конъюгат антитела-лекарственного средства может включать множество действующих веществ. В конъюгате антитела-лекарственного средства, который включает 2 или более действующих веществ, все действующие вещества могут быть одинаковыми, могут быть разными или могут присутствовать в любой смеси или отношении.

При использовании в настоящем документе термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, которая может специфично связываться с иммуноглобулином, scFv или T-клеточным рецептором. Термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, которая может специфично связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно имеют определенные пространственные структурные характеристики, а также определенные зарядовые характеристики. Например, могут быть получены антитела против N-концевых или C-концевых пептидов полипептида.

При использовании в настоящем документе термины "иммунологическое связывание" и "иммунологические связывающие свойства" относятся к нековалентным взаимодействиям такого типа, которые наблюдаются между молекулой иммуноглобулина и антигеном, к которому специфичен иммуноглобулин. Сила или аффинность взаимодействий при иммунологическом связывании может быть выражена через константу диссоциации (K_d) такого взаимодействия, где меньшая K_d означает более высокую аффинность. Иммунологические связывающие свойства выбранных полипептидов можно количественно оценивать с помощью любых подходящих способов. Один из таких способов включает измерение скоростей образования и диссоциации комплекса антигенсвязывающего участка/антигена, причем эти скорости зависят от концентраций компонентов комплекса, аффинности взаимодействия и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Таким образом, как "константу скорости ассоциации" (K_on), так и "константу скорости диссоциации" (K_off) можно определить путем вычисления концентраций и фактических скоростей ассоциации и диссоциации (см. Nature 361: 186-87 (1993)). Отношение K_off/K_on позволяет исключить все параметры, не связанные с аффинностью, и равно константе диссоциации Kd (см., в общем, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Антитело согласно настоящему изобретению специфично связывается со своей мишенью, когда равновесная константа связывания (K_d) составляет ≤1 мМ, например, ≤100 нМ, предпочтительно ≤10 нМ и более предпочтительно ≤1 нМ, при измерении с помощью подходящих анализов, таких как анализы связывания радиолиганда или аналогичные анализы, известные специалистам в данной области.

Термин "выделенный полинуклеотид" при использовании в настоящем документе должен означать полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения, или их некоторую комбинацию, при этом в силу своего происхождения "выделенный полинуклеотид": (1) не ассоциирован со всем полинуклеотидом или его частью, с которым "выделенный полинуклеотид" находится в природе, (2) функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе как часть более протяженной последовательности. Полинуклеотиды согласно изобретению включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы тяжелых цепей иммуноглобулина, и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие молекулы легких цепей иммуноглобулина, описанные в настоящем документе.

Термин "выделенный белок", указанный в настоящем документе, означает белок, полученный с кДНК, рекомбинантной РНК, или синтетического происхождения, или их некоторую комбинацию, при этом в силу своего происхождения или источника получения "выделенный белок": (1) не ассоциирован с белками, встречающимися в природе, (2) не содержит других белков из того же источника, (3) экспрессируется клеткой организма другого вида или (4) не встречается в природе.

Термин "полипептид" используется в настоящем документе в качестве общего термина для обозначения нативного белка, фрагментов или аналогов полипептидной последовательности. Следовательно, фрагменты и аналоги нативного белка являются разновидностями, входящими в понятие "полипептид". Полипептиды согласно изобретению включают молекулы тяжелых цепей иммуноглобулинов и молекулы легких цепей иммуноглобулинов, описанные в настоящем документе, а также молекулы антител, образованные комбинациями, включающими молекулы тяжелых цепей иммуноглобулинов с молекулами легких цепей иммуноглобулинов, такими как молекулы легких каппа-цепей иммуноглобулинов, и наоборот, а также их фрагменты и аналоги.

Термин "функционально связанный" при использовании в настоящем документе относится к положениям компонентов, описываемых таким образом, которые находятся в отношении, позволяющем им функционировать предназначенным им образом. Регуляторная последовательность, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с регуляторными последовательностями.

Термин "регуляторная последовательность" при использовании в настоящем документе относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина - у прокариот такие регуляторные последовательности обычно включают промотор, участок связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции, у эукариот такие регуляторные последовательности обычно включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает как минимум все компоненты, присутствие которых существенно для экспрессии и процессинга, и также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности и слитые последовательности партнеры. Указанный в настоящем документе термин "полинуклеотид" означает полимерный ряд нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов, или модифицированную форму нуклеотида каждого типа. Термин включает одноцепочечные или двухцепочечные формы ДНК.

При использовании в настоящем документе двадцать обычных аминокислот и их сокращенные обозначения соответствуют общепринятому применению. См. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α,α-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для полипептидов согласно настоящему изобретению. Примеры нестандартных аминокислот включают: 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N, N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие аналогичные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемой в настоящем документе записи последовательности полипептида левостороннее направление является N-концевым направлением, а правостороннее направление является С-концевым направлением, в соответствии со стандартным применением и практикой.

В отношении полипептидов термин "существенная идентичность" означает, что две пептидные последовательности при их оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, при использовании значений штрафа за введение пропуска по умолчанию, обладают по меньшей мере 80 процентами идентичности последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90 процентами идентичности последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 95 процентами идентичности последовательности и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99 процентами идентичности последовательности.

Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих аналогичные боковые цепи. Например, в группу аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, входят глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; в группу аминокислот, имеющих алифатические-гидроксильные боковые цепи, входят серин и треонин; в группу аминокислот, имеющих амид-содержащие боковые цепи, входят аспарагин и глутамин; в группу аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, входят фенилаланин, тирозин и триптофан; в группу аминокислот, имеющих основные боковые цепи, входят лизин, аргинин и гистидин; и в группу аминокислот, имеющих серосодержащие боковые цепи, входят цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая-аспарагиновая кислоты и аспарагин-глутамин.

Как обсуждается в настоящем документе, предполагается, что незначительные изменения аминокислотных последовательностей молекул антител или иммуноглобулинов включены в настоящее изобретение при условии, что изменения аминокислотной последовательности сохраняют по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, 90%, 95%, и наиболее предпочтительно 99%. В частности, предусмотрены консервативные аминокислотные замены. Консервативными заменами являются замены, которые происходят в рамках семейства аминокислот, которые являются родственными по своим боковым цепям. Генетически кодируемые аминокислоты, как правило, подразделяются на следующие семейства: (1) кислотными аминокислотами являются аспартат и глутамат; (2) основными аминокислотами являются лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярными аминокислотами являются аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан, и (4) незаряженными полярными аминокислотами являются глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Гидрофильные аминокислоты включают аргинин, аспарагин, аспартат, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серин и треонин. Гидрофобные аминокислоты включают аланин, цистеин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин и валин. Другие семейства аминокислот включают: (i) серин и треонин, которые представляют семейство алифатических гидроксиаминокислот; (ii) аспарагин и глутамин, которые представляют семейство амидосодержащих аминокислот; (iii) аланин, валин, лейцин и изолейцин, которые представляют алифатическое семейство; и (iv) фенилаланин, триптофан и тирозин, которые представляют ароматическое семейство. Например, разумно ожидать, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или аналогичная замена аминокислоты структурно близкой аминокислотой не будет оказывать большого влияния на связывание или свойства получаемой в результате молекулы, в особенности если замена не затрагивает аминокислоту в каркасном участке. Приведет ли аминокислотная замена к функциональному пептиду, можно легко определить путем анализа удельной активности полипептидного производного. В настоящем документе подробно описаны такие анализы. Фрагменты или аналоги молекул антител или иммуноглобулинов могут быть легко получены средними специалистами в данной области. Предпочтительные N- или С-концы фрагментов или аналогов расположены вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных таких нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей с общедоступными или закрытыми базами данных последовательностей. Предпочтительно для идентификации мотивов последовательностей или предсказанных конформационных доменов белков, которые присутствуют в других белках с известной структурой и/или функцией, используются компьютерные способы сравнения. Известны многие способы идентификации белковых последовательностей, которые сворачиваются в известные трехмерные структуры. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Таким образом, представленные выше примеры демонстрируют, что специалисты в данной области сумеют установить мотивы последовательностей и структурные конформации, которые могут использоваться для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с изобретением.

Предпочтительные аминокислотные замены являются такими заменами, которые: (1) снижают склонность к протеолизу, (2) снижают склонность к окислению, (3) изменяют аффинности связывания при образовании белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и (5) придают или модифицируют физикохимические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины с последовательностью, отличающейся от природной пептидной последовательности. Например, единичные или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны в природной последовательности (предпочтительно на участке полипептида вне домена(ов), формирующего межмолекулярные контакты). Консервативная аминокислотная замена по существу не должна изменять структурных свойств исходной последовательности (например, замещающая аминокислота не должна приводить к нарушению спирали, которая присутствует в исходной последовательности, или нарушать другие типы вторичной структуры, которые характеризуют исходную последовательность). Примеры известных в уровне техники вторичных и третичных полипептидных структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton et al., Nature 354:105 (1991).

Химические термины, используемые в настоящем документе, если в настоящем документе не определено иное, используются согласно стандартному применению в данной области, как проиллюстрировано в словаре "The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms", Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985).

Термин "средство" используется в настоящем документе для обозначения химического соединения (такого как органическое или неорганическое соединение, смесь химических соединений), биологической макромолекулы (такой как нуклеиновая кислота, антитело, включая его части, а также гуманизированные, химерные и человеческие антитела, и моноклональные антитела, белок или его часть, например, пептид, липид, углевод) или экстракта, полученного из биологических материалов, таких как бактерии, растения, грибы или клетки или ткани животных (в частности, млекопитающих). Средства включают, например, вещества, структура которых известна, и вещества, структура которых не известна. Способность таких средств ингибировать АР или вызвать деградацию АР может делать их подходящими в качестве "терапевтических средств" в способах и композициях согласно данному изобретению.

"Пациент", "субъект" или "индивид" используются попеременно и относятся к человеку или животному, не относящемуся к человеку. Эти термины включают млекопитающих, таких как люди, приматы, сельскохозяйственные животные (включая коров, свиней и т.д.), домашние животные (например, псовые, кошачьи и т.д.) и грызуны (например, мыши и крысы).

"Лечение" состояния или пациента относится к мероприятиям, которые предпринимают для получения полезных или требуемых результатов, включая клинические результаты. При использовании в настоящем документе, и как известно в уровне техники, "лечение" является подходом для получения полезных или требуемых результатов, включая клинические результаты. Полезные или требуемые клинические результаты могут включать, без ограничения, облегчение или уменьшение тяжести одного или более симптомов или состояний, облегчение степени заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) патологического состояния, предотвращение распространения заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение тяжести или облегчение патологического состояния и ремиссию (частичную или полную), поддающиеся или не поддающиеся обнаружению. "Лечение" также может означать продление выживаемости по сравнению с выживаемостью, ожидаемой без получения лечения.

При использовании в настоящем документе терапевтическое средство, которое "предупреждает" нарушение или состояние, относится к соединению, которое в статистической выборке уменьшает возникновение нарушения или состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом, или задерживает начало или уменьшает тяжесть одного или более симптомов нарушения или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом. Термин "предупреждение" известен в уровне техники и, при использовании в отношении состояния, такого как локальный рецидив (например, боль), заболевания, такого как рак, комплексного синдрома, такого как сердечная недостаточность, или любого другого заболевания, хорошо известен в уровне техники и включает введение композиции, которая снижает частоту или задерживает появление симптомов заболевания у субъекта по сравнению с субъектом, который не получает композицию. Таким образом, предупреждение рака включает, например, снижение числа поддающихся обнаружению злокачественных образований в совокупности пациентов, проходящих профилактическое лечение, по сравнению с не подвергавшейся лечению контрольной совокупностью и/или задержку появления поддающихся обнаружению злокачественных образований в получавшей лечение совокупности в сравнении с не подвергавшейся лечению контрольной совокупностью, например, на статистически и/или клинически значимую величину.

"Введение" вещества, соединения или средства субъекту могут осуществлять любым подходящим способом или путем. Например, соединение или средство могут вводить внутривенно, артериально, внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно, в глаза, подъязычно, перорально (внутрь), интраназально (ингаляцией), интраспинально, интрацеребрально и чрескожно (путем абсорбции, например, через кожные протоки). Соединение или средство также можно соответствующим образом вводить с помощью перезаряжаемых или биоразлагаемых полимерных устройств или других устройств, например, пластырей и насосов, или составов, которые обеспечивают пролонгированное, замедленное или контролируемое высвобождение соединения или средства. Введение также могут осуществлять, например, один раз, много раз и/или в течение одного или больше длительных периодов.

Подходящие способы введения вещества, соединения или средства субъекту также будут зависеть, например, от возраста и/или физического состояния субъекта, а также химических и биологических свойств соединения или средства (например, растворимости, усваиваемости, биодоступности, стабильности и токсичности). В некоторых вариантах осуществления соединение или средство вводят перорально, например, субъекту внутрь. В некоторых вариантах осуществления перорально вводимое соединение или средство находится в составе с пролонгированным высвобождением или замедленным высвобождением или вводится с использованием устройства для такого медленного или пролонгированного высвобождения.

При использовании в настоящем документе фраза "совместное введение" относится к любой форме введения двух или более различных терапевтических средств таким образом, что второе средство вводят, пока ранее введенное терапевтическое средство все еще действует в организме (например, два средства одновременно действуют у пациента, что может включать синергическое действие двух средств). Например, различные терапевтические соединения могут вводить либо в одной и той же композиции или в отдельных композициях, параллельно или последовательно. Таким образом, индивид, получающий такое лечение, может извлечь пользу от комбинированного действия различных терапевтических средств.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает однократную дозу или композицию, вводимую по схеме с многократными дозами и эффективную для лечения или предупреждения заболевания или нарушения. Термин "терапевтически эффективное количество" в отношении рака или опухоли означает количество, которое может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер раковых клеток; ингибировать внедрение раковых клеток в периферические системы или уменьшать инвазию; ингибировать распространение раковых клеток в другие системы или уменьшать распространение; ингибировать рост раковых клеток; и/или облегчать по меньшей мере один симптом, связанный с раком. При лечении рака эффективность лекарственного средства можно оценивать по времени до прогрессирования опухоли (TTP) и/или проценту случаев объективного ответа (RR).

Термин "фармацевтически приемлемые соли", используемый в настоящем документе, включает органические соли и неорганические соли. Соответствующие примеры включают гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, гидрофосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат (то есть 1,1'-метиленбис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Фармацевтически приемлемая соль может включать другую молекулу (например, ацетатные ионы, сукцинатные ионы и/или другие противоионы).

При использовании в настоящем документе термины "необязательный" или "необязательно" означают, что описываемое далее событие или обстоятельство может произойти или может не произойти, и что описание включает в себя случаи, когда событие или обстоятельство происходит, а также случаи, в которых оно не происходит. Например, "необязательно замещенный алкил" относится к алкилу, который может быть замещенным, а также к случаю, когда алкил не замещен.

Следует понимать, что заместители и схемы замещения в соединениях настоящего изобретения могут быть выбраны средним специалистом в данной области для получения химически стабильных соединений, которые можно легко синтезировать любым подходящим способом, таким как способы, представленные ниже, из легкодоступных исходных соединений. Если заместитель сам замещен больше чем одной группой, необходимо понимать, что это множество групп может находиться на одном и том же атоме углерода или на разных атомах углерода, при условии, что в результате образуется стабильная структура.

При использовании в настоящем документе термин "необязательно замещенный" относится к замене от одного до шести водородных радикалов в данной структуре радикалом указанного заместителя, включающего, без ограничения: гидроксил, гидроксиалкил, алкокси, галоген, алкил, нитро, силил, ацил, ацилокси, арил, циклоалкил, гетероциклил, амино, аминоалкил, циано, галогеналкил, галогеналкокси, -OCO-CH₂-O-алкил, -OP(O)(O-алкил)₂ или -CH₂-OP(O)(O-алкил)₂. Предпочтительно "необязательно замещенный" относится к замене от одного до четырех водородных радикалов в данной структуре указанными выше заместителями. Более предпочтительно заместителями, указанными выше, заменяют от одного до трех водородных радикалов. Следует понимать, что заместитель может быть дополнительно замещен.

Термин "ацил" известен в уровне техники и относится к группе, представленной общей формулой гидрокарбилC(O)-, предпочтительно алкилC(O)-.

Термин "ациламино" известен в уровне техники и относится к аминогруппе, замещенной ацильной группой, и может быть представлен, например, формулой гидрокарбилC(O)NH-.

Термин "ацилокси" известен в уровне техники и относится к группе, представленной общей формулой гидрокарбилC(O)O-, предпочтительно алкилC(O)O-.

Термин "алкокси" относится к алкильной группе, предпочтительно низшей алкильной группе, к которой присоединен кислород. Репрезентативные алкоксигруппы включают метокси, трифторметокси, этокси, пропокси, трет-бутокси и т.п.

Термин "алкоксиалкил" относится к алкильной группе, замещенной алкоксигруппой, и может быть представлен общей формулой алкил-O-алкил.

Термин "алкенил" при использовании в настоящем документе относится к алифатической группе, содержащей по меньшей мере одну двойную связь, и, как предусмотрено, включает "незамещенные алкенилы" и "замещенные алкенилы", где последние относятся к алкенильным группам, имеющим заместители, заменяющие водород на одном или более углеродах алкенильной группы. Такие заместители могут присутствовать на одном или более углеродах, которые включены или не включены в одну или более двойных связей. Кроме того, такие заместители включают все заместители, предусмотренные для алкильных групп, как обсуждается ниже, за исключением случаев, когда нарушается стабильность. Например, предусмотрена замена алкенильных групп одной или более алкильной, карбоциклильной, арильной, гетероциклильной или гетероарильной группами.

"Алкильная" группа или "алкан" представляет собой полностью насыщенный нормальный или разветвленный неароматический углеводород. Как правило, нормальная или разветвленная алкильная группа содержит от 1 до приблизительно 20 атомов углерода, предпочтительно от 1 до приблизительно 10, если не определено иное. Примеры нормальных и разветвленных алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил, пентил и октил. C₁-C₆ нормальная или разветвленная алкильная группа также называется "низшей алкильной" группой.

Кроме того, предполагается, что термин "алкил" (или "низший алкил") при использовании по всему тексту описания, примеров и формулы изобретения включает как "незамещенные алкилы", так и "замещенные алкилы", последние из которых относятся к алкильным группам, имеющим заместители, заменяющие водород на одном или более атомах углерода основной углеводородной цепи. Такие заместители, если не определено иное, могут включать, например, галоген (например, фтор), гидроксил, карбонил (такой как карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (такой как тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкокси, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино, амидо, амидин, имин, цианистое, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматическую или гетероароматическую группу. В предпочтительных вариантах осуществления заместители на замещенных алкилах выбраны из C_1-6 алкила, C_3-6 циклоалкила, галогена, карбонила, циано или гидроксила. В более предпочтительных вариантах осуществления заместители на замещенных алкилах выбраны из фтора, карбонила, циано или гидроксила. Специалистам в данной области будет очевидно, что группы, замещенные на углеводородной цепи, сами могут быть замещены, в соответствующих случаях. Например, заместители замещенного алкила могут включать замещенные и незамещенные формы амино, азидо, имино, амидо, фосфорильных (включая фосфонат и фосфинат), сульфонильных (включая сульфат, сульфонамидо, сульфамоил и сульфонат) и силильных групп, а также эфиры, алкилтиогруппы, карбонилы (включая кетоны, альдегиды, карбоксилаты и сложные эфиры), -CF₃, -CN и т.п. Примеры замещенных алкилов описаны ниже. Циклоалкилы могут быть также замещены алкилами, алкенилами, алкоксигруппами, алкилтиогруппами, аминоалкилами, карбонил-замещенными алкилами, -CF₃, -CN и т.п.

Подразумевается, что термин "C_x-y", при использовании в сочетании с химической группой, такой как ацил, ацилокси, алкил, алкенил, алкинил или алкокси, включает группы, содержащие от x до y атомов углерода в цепи. Например, термин "алкил C_x-y" относится к замещенным или незамещенным насыщенным углеводородным группам, включающим нормальные алкильные и разветвленные алкильные группы, содержащие от x до y атомов углерода в цепи, включая галогеналкильные группы. Предпочтительные галогеналкильные группы включают трифторметил, дифторметил, 2,2,2-трифторэтил, и пентафторэтил. C₀ алкил обозначает водород, когда группа находится в концевом положении, и связь в случае внутреннего положения. Термины "C_2-y алкенил" и "C_2-y алкинил" относятся к замещенным или незамещенным ненасыщенным алифатическим группам, аналогичным по длине и возможным замещением алкилами, описанными выше, но которые содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь соответственно.

Термин "алкиламино" при использовании в настоящем документе относится к аминогруппе, которая замещена по меньшей мере одной алкильной группой.

Термин "алкилтио" при использовании в настоящем документе относится к тиольной группе, которая замещена алкильной группой, и может быть представлена общей формулой алкилS-.

Термин "алкинил" при использовании в настоящем документе относится к алифатической группе, содержащей по меньшей мере одну тройную связь, и предусматривает включение "незамещенных алкинилов" и "замещенных алкинилов", последние из которых относятся к алкинильным группам, имеющим заместители, заменяющие водород на одном или более атомов углерода алкинильной группы. Такие заместители могут присутствовать на одном или более углеродах, которые включены или не включены в одну или более тройных связей. Кроме того, такие заместители включают все заместители, предусмотренные для алкильных групп, как обсуждается выше, за исключением случаев, когда нарушается стабильность. Например, предусмотрена замена алкинильных групп одной или более алкильной, карбоциклильной, арильной, гетероциклильной или гетероарильной группами.

Термин "амид" при использовании в настоящем документе, относится к группе:

,

где каждый R^A независимо представляет собой водород или гидрокарбильную группу, или два R^A взяты вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуя гетероцикл, содержащий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре.

Термины "амин" и "амино" известны в уровне техники и относятся к незамещенным и замещенным аминам, а также их солям, например, группе, которая может быть представлена следующим:

где каждый R^A независимо представляет собой водород или гидрокарбильную группу, или два R^A взяты вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуя гетероцикл, содержащий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре.

Термин "аминоалкил" при использовании в настоящем документе относится к алкильной группе, замещенной аминогруппой.

Термин "аралкил" при использовании в настоящем документе, относится к алкильной группе, замещенной арильной группой.

Термин "арил" при использовании в настоящем документе включает замещенные или незамещенные ароматические группы, содержащие одно кольцо, в которых каждый атом кольца является углеродом. Предпочтительно кольцо является 6- или 10-членным кольцом, более предпочтительно 6-членным кольцом. Термин "арил" также включает полициклические кольцевые системы, имеющие два или более циклических кольца, в которых два или больше атомов углерода являются общими для двух смежных колец, где по меньшей мере одно из колец является ароматическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами, гетероарилами и/или гетероциклилами. Арильные группы включают бензол, нафталин, фенантрен, фенол, анилин и т.п.

Термин "карбамат" известен в уровне техники и относится к группе:

где каждый R^A независимо представляет собой водород или гидрокарбильную группу, такую как алкильная группа, или оба R^A, взятые вместе с промежуточным атомом(ами), образуют гетероцикл, содержащий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре.

Термины "карбоцикл" и "карбоциклический" при использовании в настоящем документе относятся к насыщенному или ненасыщенному кольцу, в котором каждый атом кольца является углеродом. Термин карбоцикл включает ароматические карбоциклы и неароматические карбоциклы. Неароматические карбоциклы включают как циклоалкановые кольца, в которых все атомы углерода насыщенные, так и циклоалкеновые кольца, содержащие по меньшей мере одну двойную связь. "Карбоцикл" включает 5-7 членные моноциклические и 8-12 членные бициклические кольца. Каждое кольцо бициклического карбоцикла может быть выбрано из насыщенных, ненасыщенных и ароматических колец. Карбоцикл включает бициклические молекулы, в которых два или три, или больше атомов являются общими для двух колец. Термин "конденсированный карбоцикл" относится к бициклическому карбоциклу, в котором каждое из колец делит два соседних атома с другим кольцом. Каждое кольцо конденсированного карбоцикла может быть выбрано из насыщенных, ненасыщенных и ароматических колец. В примере осуществления ароматическое кольцо, например фенил, может быть конденсировано с насыщенным или ненасыщенным кольцом, например, циклогексан, циклопентан или циклогексен. Любая комбинация насыщенных, ненасыщенных и ароматических бициклических колец, если позволяет валентность, включена в определение карбоциклических. Примеры "карбоциклов" включают циклопентан, циклогексан, бицикло[2.2.1]гептан, 1,5-циклооктадиен, 1,2,3,4-тетрагидронафталин, бицикло[4.2.0]окт-3-ен, нафталин и адамантан. Примеры конденсированных карбоциклов включают декагидронафталин, нафталин, 1,2,3,4-тетрагидронафталин, бицикло[4.2.0]октан, 4,5,6,7-тетрагидро-1H-инден и бицикло[4.1.0]гепт-3-ен. "Карбоциклы" могут быть замещены в любом одном или более положениях, способных нести атом водорода.

"Циклоалкильная" группа представляет собой циклический углеводород, который является полностью насыщенным. "Циклоалкил" включает моноциклические и бициклические кольца. Как правило, моноциклическая циклоалкильная группа содержит от 3 до приблизительно 10 атомов углерода, обычно 3-8 атомов углерода, если не определено иное. Второе кольцо бициклического циклоалкила может быть выбрано из насыщенных, ненасыщенных и ароматических колец. Циклоалкил включает бициклические молекулы, в которых два или три, или более атомов являются общими для двух колец. Термин "конденсированный циклоалкил" относится к бициклическому циклоалкилу, в котором каждое из колец делит два соседних атома с другим кольцом. Второе кольцо конденсированного бициклического циклоалкила может быть выбрано из насыщенных, ненасыщенных и ароматических колец. "Циклоалкенильная" группа является циклическим углеводородом, содержащим одну или более двойных связей.

Термин "карбоциклилалкил" при использовании в настоящем документе относится к алкильной группе, замещенной карбоциклильной группой.

Термин "карбонат" известен в уровне техники и относится к группе -OCO₂-R^A, где R^A представляет собой гидрокарбильную группу.

Термин "карбокси" при использовании в настоящем документе относится к группе, представленной формулой -CO₂H.

Термин "сложный эфир" при использовании в настоящем документе относится к группе -C(O)OR^A, где R^A представляет собой гидрокарбильную группу.

Термин "простой эфир" при использовании в настоящем документе относится к гидрокарбильной группе, связанной через кислород с другой гидрокарбильной группой. Соответственно, эфирным заместителем гидрокарбильной группы может быть гидрокарбил-O-. Эфиры могут быть симметричными или несимметричными. Примеры простых эфиров включают, без ограниченения, гетероцикл-O-гетероцикл и арил-O-гетероцикл. Простые эфиры включают "алкоксиалкильные" группы, которые могут быть представлены общей формулой алкил-O-алкил.

Термин "галоген" при использовании в настоящем документе означает галоген и включают хлор, фтор, бром и иод. Термин "дигалоген" в отношении замещения относится к двум галогенам, связанным с одним атомом углерода.

Термины "гетаралкил" и "гетероаралкил" при использовании в настоящем документе относятся к алкильной группе, замещенной гетероарильной группой.

Термин "гетероалкил" при использовании в настоящем документе относится к насыщенной или ненасыщенной цепи атомов углерода и по меньшей мере одного гетероатома. В некоторых вариантах осуществления в гетероалкиле два гетероатома не являются смежными.

Термины "гетероарил" и "гетарил" включают замещенные или незамещенные ароматические структуры, содержащие одно кольцо, предпочтительно 5-7-членные кольца, более предпочтительно 5-6-членные кольца, кольцевые структуры которых включают по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно от одного до четырех гетероатомов, более предпочтительно один или два гетероатома. Термины "гетероарил" и "гетарил" также включают полициклические кольцевые системы, имеющие два или больше циклических кольца, в которых два или более атомов углерода являются общими для двух смежных колец, где по меньшей мере одно из колец является гетероароматическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами, гетероарилами и/или гетероциклилами. Гетероарильные группы включают, например, пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, пиразол, пиридин, пиразин, пиридазин и пиримидин, и т.п.

Термин "гетероатом" при использовании в настоящем документе означает атом любого элемента кроме углерода или водорода. Предпочтительными гетероатомами являются азот, кислородом и сера.

Термины "гетероциклил", "гетероцикл" и "гетероциклический" относятся к замещенным или незамещенным неароматическим кольцевым структурам, предпочтительно 3-10-членным кольцам, более предпочтительно 3-7-членным кольцам, кольцевые структуры которых включают по меньшей мере один гетероатом, предпочтительно от одного до четырех гетероатомов, более предпочтительно один или два гетероатома. Термины "гетероциклил" и "гетероциклический" также включают полициклические кольцевые системы, имеющие два или больше циклических колец, в которых два или больше атомов углерода являются общими для двух смежных колец, где по меньшей мере одно из колец является гетероциклическим, например, другие циклические кольца могут быть циклоалкилами, циклоалкенилами, циклоалкинилами, арилами, гетероарилами и/или гетероциклилами. Гетероциклильные группы включают, например, пиперидин, пиперазин, пирролидин, тетрагидропиран, тетрагидрофуран, тетрагидрооксазин, лактоны, лактамы и т.п.

Термин "гетероциклилалкил" при использовании в настоящем документе относится к алкильной группе, замещенной гетероциклильной группой.

Термин "гидрокарбил" при использовании в настоящем документе относится к группе, которая связана через атом углерода, который не имеет =O или =S заместителя, и, как правило, имеет по меньшей мере одну углерод-водородную связь и изначально углеродную основную цепь, но необязательно может включать гетероатомы. Таким образом, такие группы, как метил, этоксиэтил, 2-пиридил и трифторметил считаются гидрокарбилом в рамках настоящей заявки, а такие заместители, как ацетил (который имеет =O заместитель на связывающем углероде) и этокси (который связан через кислород, а не углерод) - нет. Гидрокарбильные группы включают, без ограничения, арил, гетероарил, карбоцикл, гетероциклил, алкилом, алкенил, алкинил и их комбинации.

Термин "гидроксиалкил" при использовании в настоящем документе относится к алкильной группе, замещенной гидроксигруппой.

Подразумевается, что термин "низший" при использовании в сочетании с химической группой, такой как ацил, ацилокси, алкил, алкенил, алкинил или алкокси, включает группы, в которых содержится десять или меньше неводородных атомов в заместителе, предпочтительно шесть или меньше. "Низший алкил", например, относится к алкильной группе, содержащей десять или меньше атомов углерода, предпочтительно шесть или меньше. В некоторых вариантах осуществления такие заместители, как ацил, ацилокси, алкил, алкенил, алкинил или алкокси, определенные в настоящем документе, являются соответственно низшим ацилом, низшим ацилокси, низшим алкилом, низшим алкенилом, низшим алкинилом или низшим алкокси, где они появляются отдельно или в комбинации с другими заместителями, такими как в перечислениях гидроксиалкил и аралкил (в данном случае, например, атомы в арильной группе не посчитывают при подсчете атомов углерода в алкильном заместителе).

Термины "полициклил", "полицикл" и "полициклический" относятся к двум или более кольцам (например, циклоалкилам, циклоалкенилам, циклоалкинилам, арилам, гетероарилам и/или гетероциклилам), в которых два или больше атомов являются общими для двух смежных колец, например, кольца являются "конденсированными кольцами". Каждое из колец полицикла может быть замещено или не замещено. В некоторых вариантах осуществления каждое кольцо полицикла содержит от 3 до 10 атомов в кольце, предпочтительно от 5 до 7.

Термин "силил" относится к кремниевой группе, к которой присоединены три гидрокарбильных группы.

Термин "замененный" относится к группам, имеющим заместители, заменяющие водород на одном или более атомах углерода основной цепи. Следует понимать, что "замещение" или "замещенный" включает неявно подразумеваемое условие, что такое замещение соответствует допустимой валентности замещаемого атома и заместителя, и что замещение приводит к образованию стабильного соединения, которое, например, не подвергается самопроизвольному превращению, такому как перегруппировка, циклизация, элиминирование и т.д. При использовании в настоящем документе термин "замещенный" подразумевает включение всех допустимых заместители органических соединений. В широком аспекте допустимые заместители включают ациклические и циклические, разветвленные и неразветвленные, карбоциклические и гетероциклические, ароматические и неароматические заместители органических соединений. Допустимые заместители могут быть одним или более и одинаковыми или разными для соответствующих органических соединений. В рамках настоящего описания гетероатомы, такие как азот, могут иметь водородные заместители и/или любые допустимые заместители органических соединений, описанных в настоящем документе, которые соответствуют валентностям гетероатомов. Заместители могут включать любые заместители, описанные в настоящем документе, например, галоген, гидроксил, карбонил (такой как карбоксил, алкоксикарбонил, формил или ацил), тиокарбонил (такой как тиоэфир, тиоацетат или тиоформиат), алкокси, фосфорил, фосфат, фосфонат, фосфинат, амино, амидо, амидин, имин, циано, нитро, азидо, сульфгидрил, алкилтио, сульфат, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, сульфонил, гетероциклил, аралкил или ароматическую или гетероароматическую группу. В предпочтительных вариантах осуществления заместители в замещенных алкилах выбраны из C_1-6 алкила, C_3-6 циклоалкила, галогена, карбонила, циано или гидроксила. В более предпочтительных вариантах осуществления заместители на замещенных алкилах выбраны из фтора, карбонила, циано или гидроксила. Специалистам в данной области будет очевидно, что могут быть замещены сами заместители, если это необходимо. Если отсутствует прямое указание "незамещенный", подразумевается, что ссылки на химические фрагменты в настоящем документе включают замещенные варианты. Например, ссылка на "арильную" группу или фрагмент в неявной форме включает как замещенные, так и незамещенные варианты.

Термин "сульфат" известен в уровне техники и относится к группе -OSO₃H или ее фармацевтически приемлемой соли.

Термин "сульфонамид" известен в уровне техники и относится к группе, представленной общими формулами:

где каждый R^A независимо представляет собой водород или гидрокарбил, такой как алкил, или оба R^A, взятые вместе с промежуточным атомом(ами), образуют гетероцикл, содержащий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре.

Термин "сульфоксид" известен в уровне техники и относится к группе -S(O)-R^A, где R^A представляет собой гидрокарбил.

Термин "сульфонат" известен в уровне техники и относится к группе SO₃H или ее фармацевтически приемлемой соли.

Термин "сульфон" известен в уровне техники и относится к группе -S(O)₂R^A, где R^A представляет собой гидрокарбил.

Термин "тиоалкил" при использовании в настоящем документе относится к алкильной группе, замещенной тиольной группой.

Термин "сложный тиоэфир" при использовании в настоящем документе относится к группе -C(O)SR^A или -SC(O)R^A, где R^A представляет собой гидрокарбил.

Термин "тиоэфир" при использовании в настоящем документе эквивалентен эфиру, в котором кислород заменен серой.

Термин "мочевина" известен в уровне техники и может быть представлен общей формулой:

где каждый R^A независимо представляет собой водород или гидрокарбил, такой как алкил, или при любом появлении R^A, взятый вместе с другим и промежуточным атомом(ами), образует гетероцикл, содержащий от 4 до 8 атомов в кольцевой структуре.

"Защитная группа" относится к группе атомов, которая в случае присоединения к реакционноспособной функциональной группе в молекуле маскирует, снижает или блокирует реакционную способность функциональной группы. Как правило, защитную группу можно селективно удалять, при необходимости, в ходе синтеза. Примеры защитных групп можно найти в Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3rd Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY и Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY. Репрезентативные защитные группы азота включают, без ограничения, формильную, ацетильную, трифторацетильную, бензильную, бензилоксикарбонильную ("CBZ"), трет-бутоксикарбонильную ("Boc"), триметилсилильную ("TM"), 2-триметилсилил-этансульфонильную ("TES"), тритильную и замещенную тритильную группы, аллилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил ("FMOC"), нитро-вератрилоксикарбонил ("NVOC") и т.п. Репрезентативные защитные группы гидроксила включают, без ограничения, защитные группы, в которых гидроксильная группа либо ацилирована (этерифицирована) или алкилирована, такие как бензиловые и тритиловые эфиры, а также алкиловые эфиры, тетрагидропираниловые эфиры, триалкилсилиловые эфиры (например, TMS или TIPS группы), гликолевые эфиры, такие как производные этиленгликоля и пропиленгликоля, и аллиловые эфиры.

Термин "модулировать" при использовании в настоящем документе включает ингибирование или супрессию функции или активности (такой как пролиферация клеток), а также улучшение функции или активности.

Фраза "фармацевтически приемлемый" известна в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления термин включает композиции, вспомогательные вещества, адъюванты, полимеры и другие материалы и/или лекарственные формы, которые, в рамках здравого медицинского суждения, подходят для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соизмеримых с разумным отношением выгоды/риска.

"Фармацевтически приемлемая соль" или "соль" используется в настоящем документе для обозначения соли присоединения кислоты или соли присоединения основания, которая подходит или совместима с лечением пациентов.

Термин "фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты" при использовании в настоящем документе означает любую нетоксичную органическую или неорганическую соль любых основных соединений. Иллюстративные неорганические кислоты, образующие подходящие соли, включают соляную, бромоводородную, серную и фосфорную кислоты, а также соли металлов, такие как моногидро-ортофосфат натрия и гидросульфат калия. Иллюстративные органические кислоты, образующие подходящие соли, включают моно -, ди- и трикарбоновые кислоты, такие как гликолевую, молочную, пировиноградную, малоновую, янтарную, глутаровую, фумаровую, яблочную, винную, лимонную, аскорбиновую, малеиновую, бензойную, фенилуксусную, коричную и салициловую кислоту, а также сульфокислоты, такие как п-толуолсульфоновую и метансульфоновую кислоту. Могут образовываться одно или двухосновные соли, причем такие соли могут существовать в гидратированно, сольватированной или по существу в безводной форме. Как правило, соли присоединения кислот лучше растворяются в воде и различных гидрофильных органических растворителях, и обычно демонстрируют более высокую температуру плавления по сравнению с соответствующими формами свободного основания. Выбор подходящей соли будет известен специалисту в данной области. Другие фармацевтически неприемлемые соли, например оксалаты, могут использоваться, например, при выделении соединений для лабораторного применения, или для последующего преовращения в фармацевтически приемлемую соль присоединения кислоты.

Термин "фармацевтически приемлемая соль присоединения основания" при использовании в настоящем документе означает любую нетоксичную соль присоединения органического или неорганического основания любых кислотных соединений. Иллюстративные неорганические основания, образующие подходящие соли, включают гидроксид лития, натрия, калия, кальция, магния или бария. Иллюстративные органические основания, образующие подходящие соли, включают алифатические, алициклические или ароматические органические амины, такие как метиламин, триметиламин и пиколин, или аммиак. Выбор подходящей соли будет известен специалисту в данной области.

Многие из соединений, применяемых в способах и композициях согласно изобретению, имеют в своей структуре по меньшей мере один стереогенный центр. Этот стереогенный центр может присутствовать в R или S конфигурации, указанные обозначения R и S используются в соответствии с правилами, описанными в Pure Appl. Chem. (1976), 45, 11-30. В изобретении предусмотрены все стереоизомерные формы, такие как энантиомерные и диастереоизомерные формы соединений, солей, пролекарств или их смеси (включая все возможные смеси стереоизомеров). См., например, WO 01/062726.

Кроме того, некоторые соединения, содержащие алкенильные группы, могут существовать в виде Z (zusammen) или E (entgegen) изомеров. В каждом случае изобретение включает как смесь, так и отдельные индивидуальные изомеры.

Некоторые соединения также могут существовать в таутомерных формах. Предусмотрено, что такие формы, несмотря на то, что они не представлены в явном виде в формулах, описанных в настоящем документе, включены в рамки настоящего изобретения.

"Пролекарство" или "фармацевтически приемлемое пролекарство" относятся к соединению, которое метаболизируется, например гидролизуется или окисляется, в организме реципиента после введения с образованием биологически активной молекулы. Типичные примеры пролекарств включают соединения, имеющие биологически лабильные или расщепляемые (защитные) группы на функциональной части активного соединения. Пролекарства включают соединения, которые могут быть окислены, восстановлены, аминированы, дезаминированы, гидроксилированы, дегидроксилированы, гидролизированы, дегидролизированы, алкилированы, деалкилированы, ацилированы, деацилированы, фосфорилированы или дефосфорилированы с получением активного соединения. Примеры пролекарств с использованием сложного эфира или фосфорамидата в качестве биологически лабильных или расщепляемые (защитные) групп раскрыты в патентах США 6,875,751, 7,585,851 и 7,964,580, описания которых включены в настоящий документ посредством отсылки. Настоящее изобретение включает в рамках своего объема пролекарства действующих веществ, описанных в настоящем документе. Стандартные процедуры выбора и получения подходящих пролекарств описаны, например, в "Design of Prodrugs" Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 19855.

Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" при использовании в настоящем документе означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или инкапсулирующий материал, подходящие для изготовления лекарственного средства для медицинского или терапевтического применения. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в смысле его совместимости с другими компонентами композиции и не причинять вреда пациенту. Некоторые примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактозу, глюкозу и сахарозу; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрия карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу и ацетат целлюлозы; (4) порошок трагаканта; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и воски для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический раствор хлорида натрия; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатные буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических композициях.

Термины "Log растворимости", "LogS" или "logS", используемые в настоящем документе, используются в данной области для количественной оценки растворимости соединения в воде. Растворимость соединения в воде существенно влияет на его показатели абсорбции и распределения. Часто низкая растворимость сопровождается плохой абсорбцией. Значение LogS представляет разделенный логарифм единиц (основание 10) растворимости, измеряемой в молях/литр.

При использовании в настоящем документе "по существу чистый" означает, что рассматриваемое соединение является преобладающим присутствующим соединением (т.е. на молярной основе оно является более представленным, чем любое другое отдельное соединение в композиции), и предпочтительно по существу очищенная фракция представляет собой композицию, в которой рассматриваемое соединение составляет по меньшей мере приблизительно 50 процентов (на молярной основе) от всех присутствующих макромолекулярных соединений.

Как правило, по существу чистая композиция будет включать больше чем приблизительно 80% всех макромолекулярных соединений, присутствующих в композиции, более предпочтительно больше чем приблизительно 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно рассматриваемое соединение очищен до существенной гомогенности (примеси невозможно обнаружить в композиции с помощью стандартных методов обнаружения), при этом композиция состоит по существу из одного макромолекулярного соединения.

АНТИТЕЛА, РАСПОЗНАЮЩИЕ ИЗОПРЕНОИД-ТРАНСФЕРАЗУ

Антитела, описанные в настоящем документе, могут включать аминокислотный мотив, предпочтительно на C-конце антитела, например, который распознается изопреноид-трансферазой; и тиоэфирная связь может включать атом серы цистеина аминокислотного мотива. Аминокислотный мотив может быть последовательностью, выбранной из CXX, CXC, XCXC, XXCC и CYYX, где C представляет собой цистеин; Y, независимо для каждого случая, представляет собой алифатическую аминокислоту; и X, независимо для каждого случая, представляет собой глутамин, глутамат, серин, цистеин, метионин, аланин или лейцин. В предпочтительных вариантах осуществления тиоэфирная связь включает атом серы цистеина аминокислотного мотива.

В некоторых вариантах осуществления аминокислотный мотив представляет собой последовательность CYYX, и Y, независимо для каждого случая, представляет собой аланин, изолейцин, лейцин, метионин или валин. Например, аминокислотным мотивом может быть CVIM или CVLL.

В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере одна из семи аминокислот, расположенных перед аминокислотным мотивом, является глицином. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере три из семи аминокислот, расположенных перед аминокислотным мотивом, независимо выбраны из глицина и пролина. В некоторых вариантах осуществления каждая из одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти аминокислот, расположенных перед аминокислотным мотивом, является глицином, предпочтительно семь. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере три из семи аминокислот, расположенных перед аминокислотным мотивом, независимо выбраны из глицина, аспарагиновой кислоты, аргинина и серина.

В некоторых вариантах осуществления антитело включает аминокислотную последовательность GGGGGGGCVIM, предпочтительно на C-конце.

В предпочтительных вариантах осуществления антитело включает аминокислотный мотив, который может распознавать изопреноид-трансфераза. Например, по меньшей мере один C-конец антитела может включать аминокислотный мотив, который может распознавать изопреноид-трансфераза (например, в качестве субстрата, например, до образования конъюгата антитела-лекарственного средства, или в качестве продукта изопреноид-трансферазы, например, после образования конъюгата антитела-лекарственного средства). Антитело может дополнительно включать спейсер, такой как аминокислоту или последовательность аминокислот, которая соединяет пептидную цепь антитела с аминокислотным мотивом. Спейсер может состоять из 1-20 последовательных аминокислот, предпочтительно 7-20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления глицин и пролин являются предпочтительными аминокислотами для спейсера и могут использоваться в любой комбинации, такой как ряд из по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 глицинов, или ряд из приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 глицинов. В других вариантах осуществления каждый аминокислотный мотив независимо выбран из глицина, аспарагиновой кислоты, аргинина и серина. Антитело может включать добавление или делецию на C-конце, например, относительно формы антитела, не включенного в ADC.

Примеры изопреноид-трансфераз включают фарнезил-протеинтрансферазу (ФТазу) и геранилгеранил-трансферазу (ГГТаза), которая может катализировать перенос фарнезильной или геранил-геранильной группы по меньшей мере на один C-концевой цистеин белка-мишени. ГГТазу можно отнести к классу ГГТазы I или ГГТазы II. ФТаза и ГГТаза I могут распознавать мотив CAAX, а ГГТаза II может распознавать мотив XXCC, XCXC или CXX, где C представляет собой цистеин, A представляет собой алифатическую аминокислоту (например, изолейцин, валин, метионин, лейцин), и каждый X независимо представляет собой, например, глутамин, глутамат, серин, цистеин, метионин, аланин или лейцин (см. публикации Nature Rev. Cancer, 5(5):405-12 (2005); Nature Chemical Biology 17:498-506 (2010); Lane KT, Bees LS, J. Lipid Research, 47:681-699 (2006); Kasey PJ, Seabra MC, J. Biological Chemistry, 271(10):5289-5292 (1996), каждая из которых настоящим включена посредством отсылки во всей своей полноте).

Конъюгаты антитела-лекарственного средства согласно настоящему изобретению могут включать аминокислотный мотив, такой как CYYX, XXCC, XCXC или CXX, предпочтительно CYYX (где C представляет собой цистеин, Y представляет собой алифатическую аминокислоту, такую как лейцин, изолейцин, валин и/или метионин, и X представляет собой аминокислоту, которая определяет субстратную специфичность изопреноид-трансферазы, такую как глутамин, глутамат, серин, цистеин, метионин, аланин и/или лейцин).

Могут использоваться изопреноид-трансферазы из различных источников. Например, изопреноид-трансфераза может быть получена у человека, животного, растения, бактерий, вируса или другого источника. В некоторых вариантах осуществления используется природная изопреноид-трансфераза. В некоторых вариантах осуществления может использоваться природно модифицированная или искусственно модифицированная изопреноид-трансфераза. Например, изопреноид-трансфераза может содержать одну или больше аминокислотных замен, добавлений и/или делеций, и/или изопреноид-трансфераза может быть модифицирована путем присоединения по меньшей мере одной из гистидиновой метки, GST, GFP, MBP, CBP, Isopeptag, BCCP, Myc-метки, кальмодулиновой метки, FLAG-метки, HA-метки, метки из мальтозо-связывающего белка, Nus-метки, метки из глутатион-S-трансферазы, метки из зеленого флуоресцентного белка, тиоредоксиновой метки, S-метки, Softag 1, Softag 3, Strep-метки, SBP-метки, Ty-метки и т.п.

Изопреноид-трансферазы распознают изосубстрат и/или субстрат. Термин изосубстрат относится к аналогу субстрата, включающему химическую модификацию. Изопреноид-трансферазы могут алкилировать специфический аминокислотный мотив (например, мотив CAAX) на С-конце антитела (см., например, публикации Duckworth, BP et al., ChemBioChem, 8:98 (2007); Uyen TT et al., ChemBioChem, 8:408 (2007); Labadie, GR et al., J. Org. Chem., 72(24):9291 (2007); Wollack, JW et al., ChemBioChem, 10:2934 (2009), каждая из которых настоящим включена посредством отсылки). Функционализированное антитело может быть получено с использованием изопреноид-трансферазы и изосубстрата, что может приводить к алкилированию C-концевого цистеина.

Изосубстрат может быть, например, соединением формулы:

Цистеин C-концевого мотива CAAX может быть связан с изосубстратом при использовании изопреноид-трансферазы. В некоторых вариантах осуществления часть мотива, например AAX, можно впоследствии удалять протеазой, например, оставляя только цистеин, к которому связан изопреноид. Цистеин может быть необязательно метилирован на C-конце, например, при использовании фермента (см., например, публикацию Bell, IM, J. Med. Chem., 47(8):1869 (2004), которая настоящим включена посредством отсылки).

Конъюгаты антитела-лекарственного средства согласно изобретению могут быть получены с применением любого подходящего метода, включая методы молекулярной биологии и цитологии. Например, могут применяться методы транзиентной или стабильной трансфекции. Генетические последовательности, кодирующие конкретный аминокислотный мотив, который может распознаваться изопреноид-трансферазой, могут встраивать в плазмидный вектор, причем множество таких подходящих векторов известно, при использовании стандартных технологий ПЦР и/или лигирования, для экспрессии антитела, имеющего специфический аминокислотный мотив на своем C-конце. Таким образом, антитело, имеющее по меньшей мере один аминокислотный мотив, который может распознаваться изопреноид-трансферазой, может быть экспрессировано в подходящем хозяине, например, в клетке СНО или в E. coli.

При использовании в настоящем документе термины "метка" или "меченый" относятся к включению детектируемого маркера, например, путем включения аминокислоты, меченной радиоизотопной меткой, или присоединения к полипептиду биотинильных фрагментов, которые могут быть обнаружены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментную активность, которая может быть обнаружена оптическими или калориметрическими методами). В некоторых ситуациях метка или маркер также могут быть терапевтическими. Различные методы мечения полипептидов и гликопротеинов известны из уровня техники, при этом может использоваться любой подходящий метод. Примеры меток для полипептидов включают, без ограничения перечисленным, следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, лантаноидные люминофоры), ферментные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные, биотинильные группы, установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых молний, сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки присоединяют при использовании спейсерных плеч разной длины для уменьшения потенциальных стерических затруднений. Термин "фармацевтическое или лекарственное средство" при использовании в настоящем документе относится химическому соединению или композиции, которые способны вызывать требуемый терапевтический эффект при правильном введении пациенту.

Действующее вещество может быть лекарственным средством, токсином, аффинным лигандом, детектирующим зондом или комбинацией любых из указанных выше. Действующее вещество может быть иммуномодулирующим соединением, противоопухолевым средством, противовирусным средством, антибактериальным средством, противогрибковым средством, противопаразитарным средством или их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления действующим веществом могут быть химиотерапевтические средства и токсины, как раскрыто в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах осуществления действующим веществом может быть аманитин, ауристатин, калихеамицин, камптотецин, криптофицин, дауномицин, доластатин, доксорубицин, дуокармицин, эпотилон, эсперамицин, гелданамицин, майтанзиноид, метотрексат, монометилауристатин E ("MMAE"), монометилауристатин F ("MMAF"), пирролобензодиазепин, ризоксин, SG2285, тубулизин, виндезин, токсоид или производное любого из указанных выше. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одним действующим веществом может быть талтобулин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одним действующим веществом может быть азонафид. В некоторых вариантах осуществления действующим веществом может быть димер пирролобензодиазепина, как раскрыто в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления действующее вещество является химиотерапевтическим средством или токсином. Действующее вещество может быть выбрано из эрлотиниба; бортезомибо; фулвестранто; сутента; летрозола; иматиниба мезилата; PTK787/ZK 222584; оксалиплатина; 5-фторурацила; лейковорина; рапамицина (Сиролимуса); лапатиниба; лонафамиба; сорафениба; гефитиниба; AG1478; AG1571; алкилирующих средств (например, тиотепы или циклофосфамида); алкилсульфоната (например, бусульфана, импросульфана или пипосульфана); азиридина (например, бензодопы, карбоквона, метуредопы или уредопы); этиленимина, метилмеламина, алтретамина, триэтиленмеламина, триэтиленфосфорамида, триэтилентиофосфорамида, триметилолмеламина; ацетогенинов (например, буллатацина или буллатацинона); камптотецина; производного или метаболита камптотецина (например, SN-38); топотекана; бриостатина; каллистатина; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин или бизелезин); криптофицинов (например, криптофицина 1 или криптофицина 8); доластатина; дуокармицина (включая синтетические аналоги, например, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробина; панкратистатина; саркодиктиина; спонгистатина; азотистого иприта (например, хлорамбуцила, хломафазина, хлорфосфамида, эстрамустина, ифосфамида, мехлорэтамина, мехлорэтаминоксида гидрохлорида, мелфалана, новэмбихина, фенестерина, преднимустина, трофосфамида или урамустина); нитрозомочевины (например, кармустина, хлорозотоцина, фотемустина, ломустина, нимустина или ранимустина); антибиотиков (например, ендииновых антибиотиков, таких как калихеамицин, выбранный из калихеамицина гамма II и калихеамицина омега II, или динемицин, включая динемицин A); бисфосфоната (например, клодроната; эсперамицина, хромофора неокарциностатина или хромофоров родственных хромопротеин ендииновых антибиотиков, аклациномицинов, актиномицина, антрамицина, азасерина, блеомицинов, кактиномицина, карабицина, карниномицина, кацинофилина, хромомицинов, дактиномицина, даунорубицина, деторубицина, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина, доксорубицина (например, морфолинодоксорубицина, цианоморфолинодоксорубицина, 2-пирролино-доксорубицина, липосомального доксорубицина или дезоксидоксорубицина), эпирубицина, эзорубицина, марцелломицина, митомицинов (например, митомицина C, микофеноловой кислоты, ногаламицина, оливомицинов, пепломицина, потфиромицина, пуромицина, квеламицина, родорубицина, стрептонигрина, стрептозоцина, туберцидина, убенимекса, циностатина или зорубицина); антиметаболитов (например, 5-фторурацила); аналогов фолиевой кислоты (например, деноптерина, метотрексата, птероптерина или триметрексата); аналогов пуринов (например, флударабина, 6-меркаптопурина, тиамиприна или тигуанина); аналогов пиримидинов (например, анцитабина, азацитидина, 6-азауридина, кармофура, цитарабина, дидезоксиуридина, доксифлуридина, эноцитабина или флоксуридина); андрогенов (например, калустерона, дромостанолона пропионата, эпитиостанола, мепитиостана) или тестолактона); адренолитиков (например, аминоглутетимид, митотан или трилостан); средств, восполняющих уровень фолиевой кислоты (например, фолиевой кислоты); ацеглатона; альдофосфамида гликозида; аминолевулиновой кислоты; энилурацила; амсакрина; бестрабуцила; бисантрена; эдатраксата; дефофамина; демеколцина; диазиквона; эфлорнитина; эллиптиния ацетата; эпотилона; этоглюцида; галлия нитрата; гидроксимочевины; лентинана; лонидамина; майтанзиноидов (например, майтанзина или ансамитоцинов); трихотеценов (в особенности Т-2 токсина, верракурина A, роридина A или ангидина); митогуазона; митоксантрона; мопиданмола; нитраэрина; пентостатина; фенамета; пирарубицина; лозоксантрона; 2-этилгидразида; прокарбазина; полисахаридного комплекса K; разоксана; ризоксина; сизофирана; спирогермания; тенуазоновой кислоты; триазиквона; 2,2',2''-трихлортриэтиламина; трихотеценов (в частности, Т-2 токсина, верракурина А, роридина А и ангидина); уретана; виндезина; дакарбазина; манномустина; митобронитола; митолактола; пипобромана; гацитозина; арабинозида; циклофосфида; таксоидов (например, паклитаксела), Абраксана™, не содержащего Cremophor, композиции альбумин-модифицированных наночастиц паклитаксела, доксетаксела; хлорамбуцила; гемцитабина; 6-тиогуанина; меркаптопурина; аналога платины (например, цисплатина или карбоплатина); винбластина; платины; этопозида, ифосфамида; митоксантрона; винкристина; винорелбина; новантрона; тенипозида; эдатрексата; дауномицина; аминоптерина; кселоды; ибандроната; СРТ-11; ингибитора топоизомеразы (RFS 2000); дифторметилорнитина; ретиноида кислота (например, ретиноевой кислоты), капецитабина и их фармацевтически приемлемых солей, сольватов, кислот или производных, но не должны обязательно ограничиваться ими.

Действующее вещество может быть выбрано из: (i) антигормональных средств, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, таких как антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, включающие, например, тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен; (ii) ингибиторов ароматазы, ингибирующих фермент ароматазу, который регулирует продукцию эстрогенов в надпочечниках, например, 4(5)-имидазолов, аминоглутетимида, мегестрола ацетата, эксеместана, летрозола и анастрозола; (iii) антиандрогенов, таких как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; а также троксацитабина (1,3-диоксолан аналога нуклеозида цитозина); (iv) ингибиторов ароматазы; (v) ингибиторов протеинкиназы; (vi) ингибиторов липидкиназы; (vii) антисмысловых олигонуклеотидов, в особенности таких, которые ингибируют экспрессию генов в сигнальных путях, активных в адгерентных клетках, например, PKC-альфа, Raf, H-Ras; (viii) рибозима, например, ингибитора VEGF, такого как рибозим и ингибиторы экспрессии HER2; (ix) вакцин, таких как вакцина для генотерапии; вакцины ALLOVECTIN®, вакцины LEUVECTIN, вакцины VAXID; PROLEUKIN®rlL-2; ингибитора топоизомеразы LURTOTECAN® 1; ABARELIX® rmRH; (x) антиангиогенного средства, такого как бевацизумаб; (xi) аффинного лиганда, где аффинный лиганд является субстратом, ингибитором, стимулятором, нейромедиатором, радиоизотопом или комбинацией любых из предыдущих; (xii) радиоактивной метки, ³²P, ³⁵S, флуоресцентного красителя, электронно-плотного реагента, фермента, биотина, стрептавидина, дигоксигенина, гаптена, иммуногенного белка, молекулы нуклеиновой кислоты с последовательностью, комплементарной мишени, или комбинации любых из предыдущих; (xii) иммуномодулирующего соединения, противоопухолевого средства, противовирусного средства, антибактериального средства, противогрибкового средства и инсектицидного средства или комбинации любых из предыдущих; (xiv) тамоксифена, ралоксифена, дролоксифена, 4-гидрокситамоксифена, триоксифена, кеоксифена, LY117018, онапристона или торемифена; (xv) 4(5)-имидазолов, аминоглутетимида, мегестрола ацетата, эксеместана, летрозола или анастрозола; (xvi) флутамида, нилутамида, бикалутамида, лейпролида, гозерелина или троксацитабина; (xvii) ингибитора ароматазы; (xvii) ингибитора протеинкиназы; (xix) ингибитора липидкиназы; (xx) антисмыслового олигонуклеотида; (xxi) рибозима; (xxii) вакцины; (xxiii) антиангиогенного средства; и (xxiv) их фармацевтически приемлемых солей, сольватов, кислот или производных.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одним действующим веществом является талтобулин или азонафид.

В некоторых вариантах осуществления действующим веществом является аманитин, ауристатин, калихеамицин, камптотецин, производные и метаболиты камптотецина (SN-38), криптофицин, дауномицин, доластатин, доксорубицин, дуокармицин, эпотилон, эсперамицин, гелданамицин, майтанзиноид, метотрексат, монометилауристатин E ("MMAE"), монометилауристатин F ("MMAF"), пирролбензодиазепин, ризоксин, SG2285, тубулизин, виндезин, токсоид или производное любого из предыдущих. В некоторых вариантах осуществления действующим веществом является аманитин, MMAE или MMAF или производное любого из предыдущих.

Кроме того, в качестве действующего вещества могут применяться цитокины. Цитокины представляют собой малые клеточные сигнальные белковые молекулы, которые секретируются многими клетками и являются классом сигнальных молекул, широко используемых в межклеточной коммуникации. Цитокины включают монокины, лимфокины, традиционные полипептидные гормоны и т.п. Примеры цитокинов включают гормон роста (например, гормон роста человека, N-метионил гормон роста человека или гормон роста коров); паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновый гормон (например, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) или лютеинизирующий гормон (ЛГ)); фактор роста гепатоцитов; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли-α, фактор некроза опухоли-β; мюллерова ингибирующая субстанция; мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин, тромбопоэтин (TPO); фактор роста нервов (например, NGF-β); фактор роста тромбоцитов; трансформирующий фактор роста (TGF) (например, TGF-α или TGF-β); инсулиноподобный фактор роста-I, инсулиноподобный фактор роста-II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивный фактор; интерферон (например, интерферон-α, интерферон-β или интерферон-γ); колониестимулирующий фактор (КСФ) (например, КСФ макрофагов (М-КСФ), КСФ гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) или КСФ гранулоцитов (Г-КСФ)); интерлейкин (IL) (например, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 или IL-12); фактор некроза опухоли (ФНО) (например, ФНО-α или ФНО-β); и полипептидный фактор (например, LIF или kit-лиганд), но не ограничены ими. Кроме того, термин "цитокин" также включает цитокины из природных источников или культур рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов, имеющих нативную последовательность.

Термин "токсин" относится к веществам, которые ядовиты для живых клеток или организмов. Токсины могут быть малыми молекулами, пептидами или белками, способными вызывать дисфункцию клеток или гибель клеток после абсорбции или контакта с тканью тела, например, при взаимодействии с одной или более биологическими макромолекулами, такими как ферменты или клеточные рецепторы. Токсины включают токсины растений и токсины животных. Примеры токсинов животных включают дифтерийный токсин, ботулотоксин, столбнячный токсин, дизентерийный токсин, холерный токсин, тетродотоксин, бреветоксин и цигуатоксин, но не ограничены ими. Примеры токсинов растений включают рицин и AM-токсин, но не ограничены ими.

Примеры низкомолекулярных токсинов включают ауристатин, тубулизин, гелданамицин (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):78l-784), майтанзиноид (EP 1391213, ACR2008, 41, 98-107), калихеамицин (патентная публикация США 2009/0105461, Cancer Res. 1993, 53, 3336-3342), дауномицин, доксорубицин, метотрексат, виндезин, SG2285 (Cancer Res. 2010, 70(17), 6849-6858), доластатин, доластатин аналоги, ауристатин (патент США 5,635,483), криптофицин, камптотецин, производное или метаболит камптотецина (например, SN-38), производное ризоксина, аналог или производное CC-1065, дуокармицин, ендииновый антибиотик, эсперамицин, эпотилон, производные пирролбензодиазепин (PBD), аманитин, производные аманитина, α-аманитин, аплидин, азонафид и токсоид, но не ограничены ими. Токсины могут проявлять цитотоксическое действие и ингибирующую рост клеток активность путем связывания тубулина, связывания ДНК, ингибирования топоизомеразы и т.п.

"Детектируемая молекула" или "метка" относятся к композиции, поддающейся обнаружению с помощью спектральных, фотохимических, биохимических, иммунохимических, радиоактивных или химических средств. Например, подходящие метки включают ³²P, ³⁵S, флуоресцентные красители, электронно-плотные реагенты, ферменты (например, ферменты, обычно используемые в ИФА), биотин-стрептавидин, дигоксигенин, гаптены и белки, для которых доступны антисыворотка или моноклональные антитела, или молекулы нуклеиновых кислот с последовательностью, комплементарной мишени. Детектируемая молекула часто генерирует измеряемый сигнал, такой как радиоактивный, хромогенный или флуоресцентный сигнал, который может использоваться для количественного определения связанной детектируемой молекулы в образце. Количественная оценка сигнала может быть выполнена, например, с помощью сцинтилляционного счета, денситометрии, проточной цитометрии, ИФА или прямого масс-спектрометрического анализа интактных или расщепляемых затем пептидов (могут быть оценены один или более пептидов).

Термин "зонд" при использовании в настоящем документе относится к материалу, который может: (i) обеспечивать детектируемый сигнал, (ii) взаимодействовать с первым зондом или вторым зондом, изменяя детектируемый сигнал первого или второго зонда, например, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), (iii) стабилизировать взаимодействие с антигеном или лигандом или повышать аффинность связывания; (iv) изменять электрофоретическую подвижность или активность проникновения в клетку при изменении физического параметра, такого как заряд, гидрофобность и т.д., или (v) регулировать аффинность лиганда, связывание антигена-антитела или образование ионного комплекса.

Действующее вещество может быть иммуномодулирующим соединением, противоопухолевым средством, противовирусным средством, антибактериальным средством, противогрибковым средством, инсектицидным средством или их комбинацией.

Иммуномодулирующее соединение может быть выбрано из аминокапроновой кислоты, азатиоприна, бромокриптина, хлорамбуцила, хлорохина, циклофосфамида, циклоспорина, циклоспорина A, даназола, дегидроэпиандростерона, дексаметазона, этанерцепта, гидрокортизона, гидроксихлорохина, инфликсимаба, мелоксикама, метотрексата, микофенолата мофетила, преднизона, сиролимуса и такролимуса. Противоопхолевое средство может быть выбрано из иона 1-метил-4-фенилпиридиния, 5-этинил-1-бета-D-рибофуранозилимидазол-4-карбоксамида (EICAR), 5-фторурацила, 9-аминокамптотецина, актиномицина D, аспарагиназы, бикалутамида, бис-хлорэтилнитрозомочевины (BCNU), блеомицина, блеомицина A2, блеомицина B2, бусульфана, камптотецина, производного или метаболита камптотецина, например SN-38, карбоплатина, кармустина, CB1093, хлорамбуцила, цисплатина, криснатола, циклофосфамида, цитарабина, цитозин-арабинозида, цитоксана, дакарбазина, дактиномицина, даунорубицина, декарбазина, дефероксамина, деметоксигипокреллина A, доцетаксела, доксифлуридина, доксорубицина, EB1089, эпирубицина, этопозида, флоксуридина, флударабина, флутамида, гемцитабина, гозерелина, гидроксимочевины, идарубицина, ифосфамида, интерферона-α, интерферона-γ, иринотекана, KH1060, лейпролида ацетата, ломустина, ловастатина, мегестрола, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митомицина, митомицина C, митоксантрона, микофеноловой кислоты, азотистого иприта, нитрозомочевины, паклитаксела, пепломицина, фотосенсибилизатора Pe4, фталоцианина, пирарубицина, пликамицина, прокарбазина, ралоксифена, ралтитрекседа, ревлимида, рибавирина, стауроспорина, тамоксифена, тенипозида, талидомида, тапсигардина, тиогуанина, тиазофурина, топотекана, треосульфана, триметрексата, фактора некроза опухоли, велкейда, верапамила, вертепорфина, винбластина, винкристина, винорелбина и зорубицина. Противовирусное средство может быть выбрано из пенцицикловира, валацикловира, ганцицикловира, фоскарнета, рибавирина, идоксуридина, видарабина, трифлуридина, ацикловира, фамцицикловира, амантадина, римантадина, цидофовира, антисмыслового олигонуклеотида, иммуноглобулина и интерферона. Антибактериальное средство может быть выбрано из хлорамфеникола, ванкомицина, метронидазола, триметоприма, сульфаметазола, хинупристина, далфопристина, рифампицина, спектиномицина и нитрофурантоина. Противогрибковое средство может быть выбрано из амфотерицина B, кандицидина, филипина, хамицина, натамицина, нистатина, римоцидина, бифоназола, бутоконазола, клотримазола, эконазола, фентиконазола, изоконазола, кетоконазола, луликоназола, миконазола, омоконазола, оксиконазола, сертаконазола, сульконазола, тиоконазола, альбаконазола, флуконазола, изавуконазола, итраконазола, позаконазола, равуконазола, терконазола, вориконазола, абафунгина, аморолфина, бутенафина, нафтифина, тербинафина, анидулафунгина, каспофунгина, микафунгина, бензойной кислоты, циклопирокса, флуцитозина, гризеофульвина, галопрогина, толнафтата, ундециленовой кислоты, кристаллического фиолетового, перуанского бальзама, циклопирокса оламина, пироктона оламина, цинка пиритиона и сульфида селена. Противопаразитарное средство может быть выбрано из мебендазола, пирантела памоата, тиабендазола, диэтилкарбамазина, ивермектина, никлозамида, празиквантела, альбендазола, рифампицина, амфотерицина B, меларсопрола, эфлорнитина, метронидазола, тинидазола и милтефозина.

Антитело может включать аминокислотный мотив, выбранный из Ат-HC-(G)_zCVIM, Ат-HC-(G)_zCVLL, Ат-LC-(G)_zCVIM и Ат-LC-(G)_zCVLL, Ат-HC-(G)_zCVIM/LC-(G)_zCVIM, Ат-HC-(G)_zCVLL/LC-(G)_zCVIM, Ат-HC-(G)_zCVIM/LC-(G)_zCVLL и Ат-HC-(G)_zCVLL/LC-(G)_zCVLL, где Ат представляет собой антитело (например, как раскрыто в настоящем документе), Ат-HC- представляет собой тяжелую цепь антитела (например, тяжелые цепи, раскрытые в настоящем документе), Ат-LC- представляет собой легкую цепь антитела (например, легкие цепи, раскрытые в настоящем документе), G представляет собой глицин, C представляет собой цистеин, V представляет собой валин, I представляет собой изолейцин, M представляет собой метионин, L представляет собой лейцин, и z является целым числом от 0 до 20, предпочтительно от 1 до 10.

ОБЩИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ

Различные методики, известные в уровне техники, могут использоваться для получения поликлональных или моноклональных антител, направленных против данной мишени, такой как, например, CD19, опухолеассоцированный антиген, или другой мишени, или против их производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, включенный в настоящий документ посредством отсылки).

Антитела могут быть очищены известными способами, такими как афинная хроматография с использованием белка A или белка G, которая дает, прежде всего, IgG фракцию иммунной сыворотки. Затем или в качестве альтернативы специфический антиген, который является мишенью иммуноглобулина, являющегося предметом поиска, или его эпитоп может быть иммобилизован на колонке с целью очистки иммуноспецифичного антитела с помощью иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, в публикации D. Wilkinson (The Scientist, опубликовано в The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), стр. 25-28).

В некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению являются моноклональными антителами. Моноклональные антитела получают, например, при использовании методик, изложенных в Примерах, представленных в настоящем документе. Антитела также получают, например, при иммунизации мышей BALB/c комбинациями клеток-трансфектантов, экспрессирующих высокие уровни данной мишени на своей поверхности. Затем гибридомы, получаемые в результате слияния миеломных клеток/B-клеток, проверяют на реактивность в отношении выбранной мишени.

Моноклональные антитела получают, например, с использованием методов гибридом, таких как методы, описанные Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). В методе гибридом мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируют иммунизирующим агентом для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфично связываться с иммунизирующим агентом. В альтернативе лимфоциты можно иммунизировать in vitro.

Иммунизирующий агент обычно включает белковый антиген, его фрагмент или его слитый белок. Обычно используют лимфоциты периферической крови, если требуется получить клетки человеческого происхождения, либо используют клетки селезенки или клетки лимфатических узлов, если источниками являются не относящиеся к человеку млекопитающие. Затем лимфоциты подвергают слиянию с иммортализованной клеточной линией при использовании подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), стр. 59-103). Иммортализованные клеточные линии обычно представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности клетки миеломы грызунов, коров и человека. Обычно используют линии клеток миеломы крысы или мыши. Клетки гибридомы можно культивировать в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых иммортализованных клеток. Например, если в исходных клетках отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("среда HAT"), которые препятствуют росту HGPRT-дефицитных клеток.

Предпочтительные иммортализованные клеточные линии являются линиями, которые эффективно подвергаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела выбранными антителопродуцирующими клетками и чувствительны к среде, такой как среда HAT. Более предпочтительные иммортализованные клеточные линии являются линиями миеломы мышей, которые могут быть получены, например, из Центра дистрибьюции клеток Института Солка, Сан-Диего, Калифорния и Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы человека-мыши также были описаны для получения моноклональных антител (см. Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)).

Среда культивирования, в которой культивируют клетки гибридомы, можно затем исследовать на присутствие моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или иммуноферментный анализ (ИФА). Такие методы и анализы известны в уровне техники. Аффинность связывания моноклонального антитела можно определить, например, с помощью анализа Скэтчарда, описанного в публикации Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Более того, при терапевтических применениях моноклональных антител важно идентифицировать антитела, обладающие высокой степенью специфичности и высокой аффинностью связывания по отношению к антигену-мишени.

После идентификации требуемых клеток гибридом нужные клоны можно субклонировать при использовании методик серийного разведения и выращивать стандартными методами (см. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Подходящие культуральные среды для этой цели включают, например, среду Игла в модификации Дульбекко и среду RPMI-1640. В альтернативе гибридомные клетки можно выращивать in vivo в асцитной жидкости у млекопитающего.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть выделены или очищены из среды культивирования или асцитной жидкости с помощью стандартных методик очистки иммуноглобулинов, таких как, например, сефароза с белком A, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или афинная хроматография.

Моноклональные антитела также могут быть получены методами рекомбинантных ДНК, такими как описанные в патенте США 4,816,567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела согласно изобретению, может быть легко выделена и секвенирована при использовании стандартных методик (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител грызунов семейства мышиных). Клетки гибридомы согласно изобретению служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК можно ввести в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в иных условиях не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных последовательностей мышиных (см. патент США 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Такой неиммуноглобулиновый полипептид может заменять константные домены антитела согласно изобретению или может заменять вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела согласно изобретению с получением химерного бивалентного антитела.

Моноклональные антитела согласно изобретению включают гуманизированные антитела или человеческие антитела. Такие антитела подходят для введения человеку, не вызывая иммунный ответ человека против введенного иммуноглобулина. Гуманизированные формы антител представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые в основном состоят из иммуноглобулиновой последовательности человека и содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизацию проводят, например, согласно методу Уинтера с сотрудниками (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены CDR-областями или CDR-последовательностями грызунов соответствующих последовательностей в антителах человека (см. также патент США 5,225,539). В некоторых случаях каркасные остатки Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Гуманизированные антитела также содержат, например, остатки, которых нет ни в реципиентном антителе, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях. Как правило, гуманизированное антитело включает практически все из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или почти все CDR-области соответствуют CDR-областям иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, а все или почти все каркасные области соответствуют консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело в оптимальном варианте также включает, по меньшей мере, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; и Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).

Полностью человеческие антитела являются молекулами антител, в которых полная последовательность легкой цепи и тяжелой цепи, включая CDR-области, получена из генов человека. Такие антитела в настоящем документе называются "человеческими антителами" или "полностью человеческими антителами". Моноклональные антитела могут быть получены при использовании технологии триом; технологии гибридом на основе B-клеток человека (см. Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72); и технологии ВЭБ гибридом для получения моноклональных антител (см. Cole, et al., 1985, в: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96). Моноклональные антитела могут применяться и могут быть получены при использовании гибридом человека (см. Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) или путем трансформации B-клеток человека вирусом Эпштейна-Барр in vitro (см. Cole , et al., 1985 в: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96).

Кроме того, человеческие антитела также могут быть получены при использовании дополнительных технологий, включая библиотеки фагового дисплея (см. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). Аналогичным образом, человеческие антитела могут быть получены путем введения локусов иммуноглобулинов человека трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. При стимуляции наблюдается продукция человеческих антител, которые во всех отношениях очень похожи на антитела, которые наблюдаются у человека, включая перестройку генов, сборку и репертуар антител. Данный подход описан, например, в патентах США 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, а также в публикациях Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).

Человеческие антитела могут быть дополнительно получены при использовании трансгенных, не относящихся к человеку, животных которые модифицированы для продукции полностью человеческих антител, а не эндогенных антител животного в ответ на стимуляцию антигеном (см. публикацию РСТ WO 94/02602). После того как эндогенные гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов у не относящегося к человеку хозяина, были выключены, активные локусы, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов человека, встраивают в геном хозяина. Гены человека вводят, например, при использовании искусственных дрожжевых хромосом, содержащих нужные сегменты ДНК человека. Затем животное, которое предоставляет все требуемые модификации, получают как потомство при скрещивании промежуточных трансгенных животных, содержащих меньше, чем полный набор модификаций. Примером такого не относящегося к человеку животного является мышь, называемая Xenomouse™, как описано в публикациях РСТ WO 96/33735 и WO 96/34096. Это животное вырабатывает B-клетки, которые секретируют полностью человеческие иммуноглобулины. Антитела могут быть получены непосредственно у животного после иммунизации представляющим интерес иммуногеном, в виде, например, препарата поликлонального антитела или, в альтернативе, из иммортализованных B-клеток, полученных у животного, таких как гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела. Кроме того, гены, кодирующие иммуноглобулины с человеческими вариабельными областями, могут быть выделены и экспрессированы для получения антител непосредственно или могут быть дополнительно модифицированы для получения аналогов антител, таких как, например, одноцепочечные молекулы Fv (scFv).

Пример способа получения не относящегося к человеку хозяина, примером которого является мышь, у которой отсутствует экспрессия эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина, раскрыт в патенте США 5,939,598. Ее можно получить способом, который включает делецию генов J-сегмента, по меньшей мере, из одного эндогенного локуса тяжелой цепи в эмбриональной стволовой клетке для предотвращения перестройки локуса и предотвращения образования транскрипта перестроенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем делецию осуществляют с помощью направляющего вектора, содержащего ген, кодирующий селективный маркер; и получение из эмбриональной стволовой клетки трансгенной мыши, соматические и половые клетки которой содержат ген, кодирующий селективный маркер.

Один способ получения представляющего интерес антитела, такого как человеческое антитело, раскрыт в патенте США 5,916,771. Этот способ включает введение вектора экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, в одну хозяйскую клетку млекопитающего в культуре, введение вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, в другую хозяйскую клетку млекопитающего и слияние двух клеток с образованием гибридной клетки. Гибридная клетка экспрессирует антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь.

В другом усовершенствованном варианте этой процедуры способ идентификации клинически релевантного эпитопа на иммуногене и соответствующий способ отбора антитела, которое специфично связывается с соответствующим эпитопом с высокой аффинностью, раскрыты в публикации РСТ WO 99/53049.

Антитело может экспрессироваться с вектора, содержащего сегмент ДНК, кодирующий одноцепочечное антитело, описанное выше.

Они могут включать векторы, липосомы, голую ДНК, ДНК с адъювантом, генную пушку, катетеры и т.д. Векторы включают химические конъюгаты, такие как описанные в WO 93/64701, которые содержат направляющий фрагмент (например, лиганд к рецептору клеточной поверхности) и фрагмент, связывающий нуклеиновую кислоту (например, полилизин), вирусный вектор (например, ДНК или РНК вирусный вектор), слитые белки, такие как описанные в PCT/US 95/02140 (WO 95/22618), которые представляют собой слитый белок, содержащий направляющую группу (например, антитело, специфичное к клетке-мишени), и фрагмент, связывающий нуклеиновую кислоту (например, протамин), плазмиды, фаг и т.д. Векторы могут быть хромосомными, нехромосомными или синтетическими.

Предпочтительные векторы включают вирусные векторы, слитые белки и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирусы мышиного лейкоза Молони. Предпочтительными являются ДНК вирусные векторы. Такие векторы включают поксвирусные векторы, такие как векторы на основе ортопоксвирусов или авипоксвирусов, герпесвирусные векторы, такие как вектор на основе вируса простого герпеса I (HSV) (см. Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., в DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A.T, et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)), аденовирусные векторы (см. LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)) и векторы на основе аденоассоциированного вируса (см. Kaplitt, MG et al., Nat. Genet. 8:148 (1994).

Поксвирусные векторы вводят ген в цитоплазму клеток. Авипоксвирусные векторы приводят только к кратковременной экспрессии нуклеиновой кислоты. Векторы на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса и вируса простого герпеса (HSV) являются предпочтительными для введения нуклеиновой кислоты в нервные клетки. Аденовирусный вектор дает более короткий срок экспрессии (около 2 месяцев), чем аденоассоциированный вирус (около 4 месяцев), который, в свою очередь, короче, чем HSV векторы. Конкретный выбираемый вектор будет зависеть от клетки-мишени и состояния, подвергаемого лечению. Введение может быть выполнено с помощью стандартных методов, например, инфицирования, трансфекции, трансдукции или трансформации. Примеры методов переноса гена включают, например, голую ДНК, преципитацию с CaPO₄, ДЭАЭ-декстран, электропорацию, слияние протопластов, липофекцию, микроинъекцию клеток и вирусные векторы.

Вектор может использоваться для направленного воздействия практически на любую требуемую клетку-мишень. Например, стереотаксическая инъекция может использоваться для направления векторов (например, аденовируса, HSV) в нужный участок. Кроме того, частицы можно доставлять путем интрацеребровентрикулярной (icv) инфузии при использовании инфузионной системы с мининасосом, такой как инфузионная система SynchroMed. Метод, основанный на объемном потоке, называемый конвекцией, также подтвердил свою эффективность при доставке больших молекул в обширные области мозга и может применяться для доставки вектора в клетку-мишень (см. Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)). Другие методы, которые могут использоваться, включают катетеры, внутривенные, парентеральные, внутрибрюшинные и подкожные инъекции, а также пероральный или другие подходящие пути введения.

Биспецифичные антитела являются антителами, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных антигенов. В данном случае одна из специфичностей связывания относится к мишени, такой как CD19 или любой его фрагмент. Вторая мишень связывания представляет собой любой другой антиген и предпочтительно является белком клеточной поверхности, рецептором или субъединицей рецептора.

Из уровня техники известно много способов получения биспецифичных антител. Традиционно рекомбинантное получение биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелой цепи/легкой цепи иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают разной специфичностью (Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Из-за случайной перестройки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из десяти разных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифичную структуру. Очистку правильной молекулы обычно производят с помощью стадий аффинной хроматографии. Подобные методики описаны в WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993 года, и в публикации Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Биспецифичные и/или моновалентные антитела согласно изобретению могут быть получены при использовании любого из множества известных в данной области способов, включая способы, раскрытые в заявке WO 2012/023053, поданной 16 августа 2011 года, содержание которой настоящим включено посредством отсылки во всей полноте. Способы, описанные в WO 2012/023053, позволяют получать биспецифичные антитела, идентичные по структуре иммуноглобулину человека. Молекула данного типа состоит из двух копий уникального полипептида тяжелой цепи, первой вариабельной области легкой цепи, слитой с константным каппа доменом, и второй вариабельной области легкой цепи, слитой с константным лямбда доменом. Каждый антигенсвязывающий участок проявляет разную антигенную специфичность, которую обеспечивают как тяжелая, так и легкая цепь. Вариабельные области легкой цепи могут относится к семейству лямбда или каппа и предпочтительно слиты с константными лямбда и каппа доменами соответственно. Это желательно для того, чтобы избежать образования неприродных полипептидных соединений. Однако биспецифичные антитела согласно изобретению также можно получать путем слияния вариабельного домена легкой каппа цепи с константным лямбда доменом для первой специфичности и слияния вариабельного домена легкой лямбда цепи с константным каппа доменом для второй специфичности. Биспецифичные антитела, описанные в WO 2012/023053, называются IgGκλ антителами или "κλ телами", новым полностью человеческим биспецифическим форматом IgG. Этот формат κλ-тел позволяет производить аффинную очистку биспецифичных антител, которые не отличаются от стандартной молекулы IgG, со свойствами, которые не отличаются от стандартных моноклональных антител, и, следовательно, является предпочтительным по сравнению с предыдущими форматами.

Важным этапом способа является идентификация двух Fv областей антитела (каждая из которых состоит из вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи), обладающих разной антигенной специфичностью, которые имеют одинаковый вариабельный домен тяжелой цепи. Были описаны многочисленные способы получения моноклональных антител и их фрагментов (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, включенный в настоящий документ посредством отсылки). Полностью человеческие антитела представляют собой молекулы антител, в которых последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, включая CDR 1 и 2, происходят из генов человека. Область CDR3 может быть человеческого происхождения или может быть получена синтетически. Такие антитела называются в настоящем документе "человеческими антителами" или "полностью человеческими антителами". Человеческие моноклональные антитела могут быть получены при использовании технологии триом; технологии гибридом на основе B-клеток человека (см. Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72); и технологии ВЭБ гибридом для получения моноклональных антител (см. Cole, et al., 1985, в: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут применяться и могут быть получены при использовании гибридом человека (см. Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030) или путем трансформации B-клеток человека вирусом Эпштейна-Барр in vitro (см. Cole , et al., 1985 в: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., стр. 77-96).

Моноклональные антитела получают, например, путем иммунизации животного антигеном-мишенью или его иммуногенным фрагментом, производным или вариантом. В альтернативе животное иммунизируют клетками, трансфицированными вектором, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген-мишень, таким образом, чтобы антиген-мишень экспрессировался и был связан с поверхностью трансфицированных клеток. Различные подходящие технологии получения ксеногенных животных, не относящихся к человеку, хорошо известны в уровне техники. Например, см. патент США 6,075,181 и 6,150,584, которые полностью включены в настоящий документ посредством отсылки.

В альтернативе антитела получают при скрининге библиотеки, содержащей последовательности антитела или антигенсвязывающего домена, на связывание с антигеном-мишенью. Такую библиотеку получают, например, в бактериофаге в виде белка или пептида, слитых с белком оболочки бактериофага, которые экспрессируются на поверхности собранных фаговых частиц, при этом кодирующие последовательности ДНК содержатся внутри фаговых частиц (т.е. "библиотека фагового дисплея").

Гибридомы, полученные в результате слияния клеток миеломы/B-клеток, затем подвергают скринингу на реактивность в отношении антигена-мишени. Моноклональные антитела получают, например, при использовании методов гибридом, таких как описанные в публикации Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). В методе гибридом мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируют иммунизирующим агентом для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфично связываться с иммунизирующим агентом. В альтернативе лимфоциты можно иммунизировать in vitro.

Хотя это и не является совсем невозможным, случайная идентификация различных антител, имеющих один и тот же вариабельный домен тяжелой цепи, но направленных против разных антигенов, крайне маловероятна. На самом деле, в большинстве случаев тяжелая цепь в значительной степени определяет антигенсвязывающую поверхность, а также является наиболее вариабельной по последовательности. В частности, CDR3 тяжелой цепи представляет собой CDR с наиболее разнообразной последовательностью, длиной и структурой. Таким образом, два антитела, специфичных к разным антигенам, почти всегда будут нести разные вариабельные домены тяжелой цепи.

Способы, раскрытые в заявке WO 2012/023053, позволяют преодолеть это ограничение и в значительной мере облегчают выделение антител, имеющих один и тот же вариабельный домен тяжелой цепи, при использовании библиотек антител, в которых вариабельный домен тяжелой цепи является одинаковым для всех членов библиотеки и, следовательно, разнообразие ограничено вариабельным доменом легкой цепи. Такие библиотеки описаны, например, в заявках WO 2010/135558 и WO 2011/084255, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством отсылки. Впрочем, поскольку вариабельный домен легкой цепи экспрессируется вместе с вариабельным доменом тяжелой цепи, оба домена могут способствовать связыванию антигена. Для дополнительного упрощения процесса библиотеки антител, содержащие один и тот же вариабельный домен тяжелой цепи и разнообразие либо вариабельных легких лямбда цепей, либо вариабельных легких каппа цепей, могут использоваться параллельно для отбора антител против различных антигенов in vitro. Этот подход позволяет идентифицировать два антитела, имеющих одинаковую тяжелую цепь, причем одно из них несет вариабельный домен легкой лямбда цепи, а другое - вариабельный домен легкой каппа цепи, которые можно использовать в качестве строительных блоков для создания биспецифичного антитела в формате полного иммуноглобулина согласно изобретению. Биспецифичные антитела согласно изобретению могут иметь разные изотипы, и их Fc-фрагмент может быть модифицирован с целью изменения свойств связывания с разными Fc-рецепторами и, таким образом, модификации эффекторных функций антитела, а также его фармакокинетических свойств. Были описаны многочисленные способы модификации Fc-фрагмента, которые могут применяться к антителам согласно изобретению (см., например, Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685-91; патент США 6,528,624; PCT/US2009/0191199, поданный 9 января 2009 года). Способы согласно изобретению также могут применяться для создания биспецифичных антител и смесей антител в формате F(ab')2, которые не имеют Fc-фрагмента.

Общая тяжелая цепь и две разные легкие цепи экспрессируются совместно в одной клетке, обеспечивая сборку биспецифичного антитела согласно изобретению. Если все полипептиды экспрессируются на одинаковом уровне и в равной мере хорошо собираются с образованием молекулы иммуноглобулина, то соотношение моноспецифичных (одинаковые легкие цепи) и биспецифичных (две разные легкие цепи) должно составлять 50%. Впрочем, вероятно, что разные легкие цепи будут экспрессироваться на разных уровнях и/или не будут собираться с одинаковой эффективностью. Таким образом, способы модулирования относительной экспрессии различных полипептидов используют для компенсации характерных для них показателей экспрессии или разной способности к сборке с общей тяжелой цепью. Такое модулирование можно обеспечивать посредством силы промотора, использования участков внутренней посадки рибосомы (IRES) с различной эффективностью или других типов регуляторных элементов, которые могут действовать на уровне транскрипции или трансляции, а также влиять на стабильность мРНК. Различные промоторы разной силы могут включать CMV (предранний промотор цитомегаловируса); EF1-1α (промотор 1α-субъединицы фактора элонгации трансляции человека); Ubc (промотор убиквитина C человека); SV40 (промотор вируса обезьян 40). Также описаны различные IRES млекопитающих и вирусов (см., например, Hellen CU and Sarnow P. Genes Dev 2001 15:1593-612). Такие IRES могут существенно различаться по длине и эффективности рекрутирования рибосом. Кроме того, активность можно также регулировать, вводя несколько копий IRES (Stephen et al., 2000 Proc Natl Acad Sci USA 97:1536-1541). Модулирование экспрессии также можно обеспечивать путем многократных последовательных трансфекций клеток с увеличением числа копий отдельных генов, экспрессирующих ту или иную легкую цепь, и, таким образом, изменять их относительную экспрессию. Приведенные в настоящем описании примеры демонстрируют, что контроль относительной экспрессии различных цепей важен для максимального повышения эффективности сборки и общего выхода биспецифичного антитела.

Коэкспрессия тяжелой цепи и двух легких цепей дает смесь трех различных антител в супернатанте культуры клеток: двух моноспецифичных бивалентных антител и одного биспецифичного бивалентного антитела. Последнее требуется очистить из смеси, чтобы получить представляющую интерес молекулу. Описанный в настоящем документе способ значительно облегчает такую процедуру очистки благодаря применению сред для аффинной хроматографии, которые специфично взаимодействуют с константными доменами легкой каппа или лямбда цепи, таких как аффинные матрицы CaptureSelect Fab Kappa и CaptureSelect Fab Lambda (BAC BV, Holland). Данный подход к очистке с помощью многостадийной аффинной хроматографии является эффективным и обычно может применяться к антителам согласно изобретению. Это резко отличается от специфических методов очистки, которые нужно разрабатывать и оптимизировать для каждого биспецифичного антитела, получаемого из квадром или других клеточных линий, экспрессирующих смеси антител. Фактически, если биохимические характеристики различных антител в смесях сходные, их разделение с использованием стандартных методов хроматографии, таких как ионообменная хроматография, может быть крайне сложным или вообще невозможным.

Другие подходящие способы очистки включают способы, раскрытые в US 2013/0317200, содержание которой настоящим включено посредством отсылки во всей полноте.

В других вариантах получения биспецифических антител вариабельные домены антитела с требуемыми специфичностями связывания (антигенсвязывающие участки антитела) могут быть слиты с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Слияние предпочтительно производят с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирной области, CH2 и CH3 областей. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одной из слитых конструкций. ДНК, кодирующие слитые конструкции тяжелой цепи иммуноглобулина и, при необходимости, легкую цепь иммуноглобулина, встраивают в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Для получения дополнительной информации по поводу создании биспецифичных антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Согласно другому подходу, описанному в WO 96/27011, поверхность контакта между парой молекул антител может быть сконструирована таким образом, чтобы максимально повышать процент гетеродимеров, выделяемых из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительный интерфейс включает, по меньшей мере, часть области CH3 константного домена антитела. В этом способе одна или больше небольших боковых цепей аминокислот в области контакта первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие "полости", имеющие размер, идентичный или аналогичный более крупной боковой цепи(-ям), создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены больших боковых цепей аминокислот менее объемными (например, аланином или треонином). Это обеспечивает механизм повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител были описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела можно получать при использовании химического связывания. Полученные биспецифичные антитела можно использовать в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.

Также были описаны различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифичные антитела были получены при использовании лейциновых молний (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). Пептиды лейциновых молний из белков Fos и Jun были присоединены к Fab'-фрагментам двух разных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с образованием мономеров, а затем повторно окисляли с образованием гетеродимеров антител. Этот метод также может использоваться для получения гомодимеров антител. Технология "диател", описанная в публикации Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), предоставила альтернативный механизм получения фрагментов биспецифичных антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) линкером, который является слишком коротким для спаривания двух доменов в одной цепи. Соответственно, V_H и V_L домены одного фрагмента будут вынуждены спариваться с комплементарными V_L и V_H доменами другого фрагмента, образуя в результате два антигенсвязывающих участка. Также сообщали о другой стратегии получения фрагментов биспецифичных антител при использовании одноцепочечных Fv димеров (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

Предусмотрены антитела с валентностью больше двух. Например могут быть получены триспецифичные антитела (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).

Примерные биспецифичные антитела могут связываться с двумя разными эпитопами, по меньшей мере один из которых происходит из белкового антигена согласно изобретению. В альтернативе антигенсвязывающее плечо молекулы иммуноглобулина может быть объединено с плечом, которое связывается с инициирующей молекулой на лейкоците, такой как молекула T-клеточного рецептора (например, CD2, CD3, CD28 или B7) или Fc-рецепторы в случае IgG (FcγR), такого как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), направляя клеточные защитные механизмы на клетку, экспрессирующую конкретный антиген. Биспецифичные антитела также могут применяться для направления цитотоксических средств к клеткам, которые экспрессируют конкретный антиген. Эти антитела обладают антигенсвязывающим плечом и плечом, которое связывает цитотоксическое средство или хелатор радионуклидов, такой как EOTUBE, DPTA, DOTA или TETA. Другое представляющее интерес биспецифичное антитело связывает белковый антиген, описанный в настоящем документе, и также связывает тканевой фактор (ТФ).

Гетероконъюгированные антитела также включены в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела, например, были предложены для направления клеток иммунной системы на нежелательные клетки (см. патент США 4,676,980) и для лечения ВИЧ-инфекции (см. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Предусмотрено, что антитела могут быть получены in vitro при использовании химии синтеза белков, включая способы синтеза, которые включают применение сшивающих агентов. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы при использовании реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат, а также реагенты, раскрытые, например, в патенте США 4,676,980.

Может потребоваться модифицировать антитело согласно изобретению в отношении эффекторной функции, для повышения, например, эффективности антитела при лечении рака и/или других заболеваний и нарушений, связанных с нарушением экспрессии и/или активности CD19. Например, остаток(и) цистеина может быть введен в Fc-область, что обеспечивает образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной комплемент-опосредованной цитотоксичностью и антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) (см. Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) и Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)). В альтернативе может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные Fc-области и, таким образом, может вызывать усиленный комплемент-опосредованный лизис и обладать повышенной активностью ADCC (см. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)).

КОНЪЮГИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА

Изобретение также относится к конъюгированным антителам, также именуемым в настоящем документе иммунокоъюгатами, включающим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированный с цитотоксическим средством, таким как токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат).

В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой ингибитор микротрубочек или его производное. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой доластатин или его производное. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой ауристатин E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF или DMAE. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой майтанзиноид или производное майтанзиноида. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой DM1 или DM4. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой токсин, повреждающий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой дуокармицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления токсин представляет собой калихеамицин или его производное. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой пирролобензодиазепин или его производное.

Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые могут использоваться, включают цепь A дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь A экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, неомицин и трихотецены. Для получения радиоконъюгатов антител доступно множество радионуклидов. Примеры включают ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re.

Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть получены с использованием различных бифункциональных, связывающих белки, агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметил-адипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)-гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) является типичным хелатообразующим соединением для конъюгирования радионуклеотида с антителом (см. WO 94/11026).

Специалистам в данной области будет очевидно, что большое количество возможных фрагментов может быть присоединено к антителам, получаемым согласно изобретению (см., например, публикацию "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse and R.E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989), полное содержание которой включено в настоящий документ посредством отсылки).

Присоединение может быть выполнено с помощью любой химической реакции, которая приведет к связыванию двух молекул, при условии, что антитело и другая молекула сохранят свои соответствующие активности. Такая связь может включать многие химические механизмы, например, ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркаляцию, координационное связывание и комплексообразование. Впрочем, предпочтительным связыванием является ковалентное связывание. Ковалентное связывание может быть достигнуто либо путем прямой конденсации существующих боковых цепей, либо путем включения внешних мостиковых молекул. Многие двухвалентные или поливалентные сшивающие агенты могут применяться для связывания белковых молекул, таких как антитела согласно настоящему изобретению, с другими молекулами. Например, репрезентативные связывающие агенты могут включать органические соединения, такие как сложные тиоэфиры, карбодиимиды, сложные сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, глутаральдегид, диазобензолы и гексаметилендиамины. Этот список не следует считать исчерпывающим для различных классов связывающих агентов, известных в данной области, и скорее является примером наиболее распространенных связывающих агентов (см. Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); и Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).

Подходящие линкеры описаны в литературе (см., например, публикацию Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984), в которой описано применение MBS (сложного эфира M-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида). Также см. патент США 5,030,719, в котором описано применение галогенированного производного ацетилгидразида, связанного с антителом посредством олигопептидного линкера. Наиболее предпочтительные линкеры включают: (i) EDC гидрохлорид (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида; (ii) SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуол (Pierce Chem. Co., номер по кат. (21558G)); (iii) SPDP (сукцинимидил-6[3-(2-пиридилдитио)-пропионамидо]гексаноат (Pierce Chem. Co., номер по кат. 21651G); (iv) сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинимидил-6[3-(2-пиридилдитио)-пропианамид]гексаноат (Pierce Chem. Co., номер по кат. 2165-G); и (v) сульфо-NHS (N-гидроксисульфо-сукцинимид: Pierce Chem. Co., номер по кат. 24510), конъюгированный с EDC.

Описанные выше линкеры содержат компоненты, которые обладают различными свойствами, что приводит к получению конъюгатов с различными физико-химическими показателями. Например, сульфо-NHS сложные эфиры алкилкарбоксилатов более стабильные, чем сульфо-NHS сложные эфиры ароматических карбоксилатов. Линкеры, содержащие NHS-эфиры, имеют меньшую растворимость, чем сульфо-NHS сложные эфиры. Кроме того, линкер SMPT содержит стерически затрудненную дисульфидную связь и может образовывать конъюгаты с повышенной стабильностью. Дисульфидные связи, как правило, менее стабильные, чем другие связи, потому что дисульфидная связь расщепляется in vitro, что приводит к меньшему количеству доступного конъюгата. Сульфо-NHS, в частности, может повышать стабильность карбодиимидных связей. Карбодиимидные связи (такие как EDC) при использовании в сочетании с сульфо-NHS, образуют сложные эфиры, которые более устойчивы к гидролизу, чем получаемые только в реакции связывания карбодиимидом.

Антитела, раскрытые в настоящем документе, могут также быть включены в иммунолипсомы. Липосомы, содержащие антитело, могут быть получены любыми подходящими способами, такими, как описано в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); и патентах США 4,485,045 и 4,544,545. Липосомы с увеличенным периодом циркуляции раскрыты в патенте США 5,013,556.

Особенно полезные липосомы могут быть получены методом обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-производное фосфатидилэтаноламина (ПЭГ-ФЭ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор, получая липосомы требуемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с липосомами, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982), при использовании реакции дисульфидного обмена.

ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛ ПРОТИВ CD19

Следует понимать, что введение терапевтических соединений в соответствии с изобретением будут производить с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими средствами, которые включают в композиции для обеспечения улучшенного переноса, доставки, переносимости и т.п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), особенно в Главе 87 за авторством Blaug, Seymour. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (такие как Lipofectin™), ДНК конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типов масло в воде и вода в масле, эмульсии карбовакс (полиэтиленгликолей различной молекулярной массы), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из перечисленных выше смесей может подходить для лечения и терапии в соответствии с настоящим изобретении при условии, что действующее вещество в составе не инактивируется составом, и состав является физиологически совместимым и переносимым с путем введения. См. также Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998), и ссылки в них для получения дополнительной информации, относящейся к соединениям, вспомогательным веществам и носителям, хорошо известным химикам-фармацевтам.

Терапевтические композиции согласно изобретению, которые включают конъюгат согласно изобретению, применяются для лечения или облегчения симптома, связанного с раком, таким как, в качестве неограничивающего примера, лейкозы, лимфомы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичника, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, глиома, рак легкого и бронхов, рак толстой и прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак печени, рак мочевого пузыря, рак почки и почечной лоханки, рак полости рта и глотки, рак тела матки и/или меланома. В настоящем описании также предложены способы лечения или облегчения симптома, связанного с раком. Терапевтическая схема может включать идентификацию субъекта, например, пациента-человека, страдающего раком (или подверженного риску развития рака), например, с помощью стандартных методов.

Терапевтические композиции согласно изобретению, которые включают конъюгат согласно изобретению, который распознает CD19 и, необязательно, вторую мишень, могут применяться для лечения или облегчения симптома, связанного с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, таким как, например, опосредованные B-клетками аутоиммунные заболевания и/или воспалительные заболевания, в том числе, в качестве неограничивающего примера, системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит (РА), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), гипергаммаглобулинемия Вальденстрема, синдром Шегрена, рассеянный склероз (РС) и/или волчаночный нефрит.

Эффективность лечения можно определить в сочетании с любым подходящим методом диагностики или лечения конкретного иммунно-ассоциированного нарушения. Облегчение одного или более симптомов иммунно-ассоциированного нарушения указывает, что конъюгат обладает клинической эффективностью.

Конъюгаты, направленные против мишени, такой как CD19, опухолеассоциированный антиген или другой антиген, могут применяться в способах, которые относятся к определению локализации и/или количественному определению этих мишеней, например, для применения при измерении уровней этих мишеней в соответствующих физиологических образцах, для применения в диагностических методах, для применения в визуализации белка и т.п. Например, конъюгаты, специфичные к любой из этих мишеней, или их производное, фрагмент, аналог или гомолог, которые содержат полученный из антитела антигенсвязывающий домен, могут применяться в качестве фармакологически активных соединений (именуемых в дальнейшем "терапевтическими средствами").

Конъюгат согласно изобретению может применяться для выделения конкретной мишени с использованием стандартных методик, таких как иммуноаффинность, хроматография или иммунопреципитация. Конъюгаты согласно изобретению могут применяться диагностически для мониторирования уровней белка в ткани как часть процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данной схемы лечения. Обнаружению может способствовать связывание (т.е. физическое соединение) антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемым веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин, и примеры подходящего радиоактивного материала включают ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S или ³H.

Конъюгаты согласно изобретению могут применяться в качестве терапевтических средств. Такие средства обычно применяют для лечения или предупреждения заболевания или патологии, ассоциированной с нарушением экспрессии или активации данной мишени у субъекта. Препарат конъюгата, предпочтительно конъюгата, обладающего высокой специфичностью и высоким сродством к своему антигену-мишени, вводят субъекту, и при этом он обычно оказывает действие в результате своего связывания с мишенью. Введение конъюгата может блокировать, ингибировать или нарушать сигнальную функцию мишени. Введение конъюгата может блокировать, ингибировать или нарушать связывание мишени с эндогенным лигандом, с которым она обычно связывается.

Терапевтически эффективное количество конъюгата согласно изобретению обычно относится к количеству, требуемому для достижения терапевтической цели. Как отмечено выше, это может быть связывающее взаимодействие между антителом и его антигеном-мишенью, которое в некоторых случаях препятствует функционированию мишени и/или эффекту действующего вещества, конъюгированного с антителом. Количество, требуемое для введения, также будет зависеть от аффинности связывания антитела с его специфическим антигеном и/или активности действующего вещества, а также будет зависеть от скорости, с которой введенное антитело выводится из свободного объема другого субъекта, которому его вводят. Обычные диапазоны терапевтически эффективных доз конъюгата согласно изобретению могут составлять, в качестве неограничивающего примера, от приблизительно 0,1 мг/кг массы тела до приблизительно 50 мг/кг массы тела. Обычная частота введения доз может изменяться, например, от двух раз в день до одного раза в неделю.

Конъюгаты согласно изобретению могут вводить для лечения различных заболеваний и нарушений в форме фармацевтических композиций. Принципы и особенности получения таких композиций, а также руководств по выбору компонентов, приведены, например, в Remington: The Science And Practice Of Pharmacy l9th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; и Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.

Состав также может содержать больше одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно действующие вещества с дополняющими активностями, которые не оказывают негативного влияния друг на друга. В альтернативе или дополнительно композиция может включать средство, которое усиливает ее функцию, такое как, например, цитотоксическое средство, цитокин, химиотерапевтическое средство или средство, ингибирующее рост. Такие молекулы предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.

Действующие вещества также могут быть заключены в микрокапсулы, изготовленные, например, методами коацервации или поверхностной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовым микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях.

Композиции, применяемые для введения in vivo, предпочтительно являются стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, где матрицы имеют форму изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Тогда как полимеры, такие как этилен-винилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, позволяют высвобождать молекулы в течение больше чем 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.

Конъюгат согласно изобретению может применяться в качестве средства для обнаружения присутствия данной мишени (или ее белкового фрагмента) в образце. В некоторых вариантах осуществления конъюгат содержит детектируемую метку. Антитела могут быть поликлональными или, более предпочтительно, моноклональными. Может использоваться интактное антитело или его фрагмент (например, F_ab, scFv или F_(ab)2). Предполагается, что термин "биологический образец" включает ткани, клетки и биологические жидкости, выделенные у субъекта, а также ткани, клетки и жидкости, присутствующие в организме субъекта. Таким образом, в понятие "биологический образец" входит кровь и фракция или компонент крови, в том числе сыворотка крови, плазма крови или лимфа. Таким образом, способ обнаружения согласно изобретению может применяться для обнаружения анализируемой мРНК, белка или геномной ДНК в биологическом образце in vitro, а также in vivo. Например, методики обнаружения анализируемой мРНК in vitro включают Нозерн-гибридизацию и гибридизацию in situ. Методики обнаружения анализируемого белка in vitro включают иммуноферментные анализы (ИФА), Вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и иммунофлуоресценцию. Методы обнаружения анализируемой геномной ДНК in vitro включают Саузерн-гибридизацию. Процедуры проведения иммуноанализов описаны, например, в " ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J.R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; и "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Кроме того, методики обнаружения анализируемого белка in vivo включают введение субъекту меченого конъюгата против аналита. Например, антитело может быть помечено радиоактивным маркером, присутствие и локализация которого у субъекта могут быть обнаружены с помощью стандартных методик визуализации.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Конъюгат антитела-лекарственного средства может применяться для переноса действующего вещества в клетку-мишень субъекта для лечения субъекта при использовании любого подходящего способа изготовления композиции. В некоторых аспектах изобретение относится к композиции (например, фармацевтической композиции), включающей конъюгат антитела-лекарственного средства, как описано в настоящем документе.

Композиции и способы согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения индивида, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления индивид является млекопитающим, таким как человек или не относящееся к человеку млекопитающее. При введении животному, такому как человек, композицию или соединение предпочтительно вводят в виде фармацевтической композиции, включающей, например, соединение согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители известны в данной области и включают, например, водные растворы, такие как воду или физиологически буферизованный раствор хлорида натрия или другие растворители или носители, такие как гликоли, глицерин, масла, такие как оливковое масло, или органические сложные эфиры, пригодные для инъекций. В предпочтительных вариантах осуществления, когда такие фармацевтические композиции предназначены для введения человеку, в частности для инвазивных путей введения (т.е. таких путей, как инъекция или имплантация, которые обходят транспорт или диффузию через эпителиальный барьер), водный раствор является апирогенным или по существу апирогенным. Вспомогательные вещества могут быть выбраны, например, чтобы обеспечивать задержку высвобождения вещества или селективно воздействовать на одну или более клеток, тканей или органов. Фармацевтическая композиция может быть представлена в стандартной лекарственной форме, такой как таблетка, капсула (включая вскрываемую капсулу с гранулами и желатиновую капсулу), гранула, лиофилизированная форма для восстановления, порошок, раствор, сироп, суппозиторий, форма для инъекций и т.п. Композиция также может присутствовать в трансдермальной системе доставки, например, трансдермальном пластыре. Композиция также может присутствовать в растворе, подходящем для наружного применения, таком как лосьон, крем или мазь.

Фармацевтически приемлемый носитель может содержать физиологически приемлемые вещества, которые действуют, например, чтобы стабилизировать, повышать растворимость или увеличивать всасывание соединения, такого как соединение согласно изобретению. Такие физиологически приемлемые вещества включают, например, углеводы, такие как глюкозу, сахарозу или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновую кислоту или глутатион, хелатообразователи, белки с низкой молекулярной массой или другие стабилизаторы или вспомогательные вещества. Выбор фармацевтически приемлемого носителя, включая физиологически приемлемое вещество, зависит, например, от пути введения композиции. Препарат или фармацевтическая композиция может быть самоэмульгирующейся системой доставки лекарственного средства или самомикроэмульгирующейся системой доставки лекарственного средства. Фармацевтическая композиция (препарат) также может быть липосомой или другой полимерной матрицей, которая может включать в себе, например, соединение согласно изобретению. Липосомы, например, которые включают фосфолипиды или другие липиды, являются нетоксичными, физиологически приемлемыми и метаболизируемыми носителями, которые относительно просты в изготовлении и введении.

Фраза "фармацевтически приемлемый" используется в настоящем документе в отношении таких соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые, в рамках здравого медицинского суждения, подходят для применения в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соризмеримых с разумным отношением выгоды/риска.

Фармацевтическую композицию (препарат) могут вводить субъекту любым из ряда путей введения, в том числе, например, перорально (например, в жидких формах для приема внутрь в виде водных или неводных растворов или суспензий, таблетках, капсулах (включая вскрываемые капсулы и желатиновые капсулы), болюсах, порошках, гранулах, пастах для нанесения на язык); путем всасывания через слизистую оболочку полости рта (например, подъязычно); подкожно; трансдермально (например, в виде пластыря, наносимого на кожу); и наружно (например, в виде крема, мази или спрея, наносимого на кожу). Соединение также может быть включено в состав для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления соединение может быть просто растворено или суспендировано в стерильной воде. Дополнительную информацию по поводу подходящих путей введения и композиций, подходящих для этого, можно найти, например, в патентах США 6,110,973, 5,763,493, 5,731,000, 5,541,231, 5,427,798, 5,358,970 и 4,172,896, а также в патентах, цитируемых в них.

Композиции для удобства могут быть представлены в виде стандартной лекарственной формы и могут быть изготовлены любым подходящим способом из области фармации. Количество действующего вещества, которое может быть объединено с материалом-носителем с получением единичной лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от реципиента, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения. Количество действующего вещества, которое может быть объединено с материалом-носителем с получением единичной лекарственной формы, обычно будет таким количеством соединения, которое оказывает терапевтическое действие. Как правило, из ста процентов, такое количество будет находиться в пределах от приблизительно 1 процента до приблизительно девяноста девяти процентов действующего вещества, предпочтительно от приблизительно 5 процентов до приблизительно 70 процентов, наиболее предпочтительно от приблизительно 10 процентов до приблизительно 30 процентов.

Способы получения этих составов или композиций включают этап объединения действующего вещества, такого как соединение согласно изобретению, с носителем и, необязательно, одним или более вспомогательными компонентами. Как правило, составы изготавливают путем однородного и тщательного объединения соединения согласно настоящему изобретению с жидкими носителями и/или тонко измельченными твердыми носителями, с последующим формованием продукта при необходимости.

Составы согласно изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть в форме капсул (включая вскрываемые капсулы и желатиновые капсулы), облаток, пилюль, таблеток, таблеток для рассасывания (с использованием ароматизированной основы, обычно сахарозы и гуммиарабика или трагаканта), лиофилизированной формы, порошков, гранул, или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии типа масло в воде или вода в масле, или в виде настойки или сиропа, или в виде пастилок (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и гуммиарабик), и/или в виде ополаскивателей для полости рта и т.п., каждый из которых содержит заданное количество соединения согласно настоящему изобретению в качестве действующего вещества. Композиции или соединения также можно вводить в виде болюса, электуария или пасты.

Для изготовления твердых лекарственных форм для перорального введения (капсул (включая вскрываемые капсулы и желатиновые капсулы), таблеток, пилюль, драже, порошков, гранул и т.п.), действующее вещество смешивают с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или любое из следующего: (1) наполнители или разбавители, такие как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) связующие, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или гуммиарабик; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие вещества, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия; (5) вещества, задерживающие растворение, такие как парафин; (6) ускорители абсорбции, такие как соединения четвертичного аммония; (7) смачивающие вещества, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) абсорбенты, такие как каолин и бентонитовая глина; (9) смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; (10) комплексообразователи, такие как модифицированные и немодифицированные циклодекстрины; и (11) красители. В случае капсул (включая вскрываемые капсулы и желатиновые капсулы), таблеток и пилюль фармацевтические композиции также могут содержать буферные вещества. Твердые композиции подобного типа также могут использоваться в качестве наполнителей в мягких и твердых желатиновых капсулах с использованием таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочные сахара, а также полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой и т.п.

Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или более вспомогательными компонентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены с использованием связующего вещества (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающего вещества, инертного разбавителя, консерванта, разрыхлителя (например, крахмалгликолята натрия или сшитой карбоксиметилцеллюлозы натрия), поверхностно-активного или диспергирующего вещества. Формованные таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящем аппарате смеси порошкообразного соединения, увлажненной инертным жидким разбавителем.

Таблетки и другие твердые лекарственные формы фармацевтических композиций, такие как драже, капсулы (включая вскрываемые капсулы и желатиновые капсулы), пилюли и гранулы, необязательно могут иметь насечки или могут быть изготовлены с покрытиями и оболочками, такими как кишечнорастворимые покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области фармацевтики. Они также могут быть изготовлены таким образом, чтобы обеспечивать медленное или контролируемое высвобождение действующего вещества в них, при использовании, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в различных пропорциях для обеспечения требуемого профиля высвобождения, других полимерных матриц, липосом и/или микросфер. Их можно стерилизовать, например, путем фильтрации через задерживающий бактерии фильтр или путем включения стерилизующих веществ в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять в стерильной воде или какой-либо другой стерильной среде для инъекций непосредственно перед применением. Такие композиции необязательно также могут содержать замутняющие вещества и могут иметь состав, который обеспечивает высвобождение действующего вещества (веществ) только, или предпочтительно, в определенной части желудочно-кишечного тракта, необязательно с задержкой. Примеры композиций, которые могут использоваться, включают полимерные вещества и воски. Действующее вещество также может быть в микроинкапсулированной форме, в случае необходимости, с одним или более из описанных выше наполнителей.

Жидкие лекарственные формы, подходящие для перорального введения, включают фармацевтически приемлемые эмульсии, лиофилизированные формы для восстановления, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и настойки. В дополнение к действующему веществу жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как, например, воду или другие растворители, циклодекстрины и их производные, солюбилизирующие вещества и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные сорбитановые эфиры жирных кислот и их смеси.

Помимо инертных разбавителей композиции для перорального применения также могут включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые добавки, красители, ароматические и консервирующие вещества.

Суспензии в дополнение к действующим веществам могут содержать суспендирующие вещества, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтилированный сорбит и сложные сорбитановые эфиры, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, а также их смеси.

Лекарственные формы для наружного или трансдермального применения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингляционные формы. Действующее соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут требоваться.

Мази, пасты, кремы и гели могут содержать, в дополнение к действующему соединению, вспомогательные вещества, такие как животные и растительные жиры, масла, воски, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, кремневую кислоту, тальк и оксид цинка или их смеси.

Порошки и спреи могут содержать, в дополнение к действующему соединению, вспомогательные вещества, такие как лактозу, тальк, кремневую кислоту, гидроксид алюминия, силикаты кальция и порошок полиамида или смеси этих веществ. Спреи дополнительно могут содержать стандартные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.

Трансдермальные пластыри обладают дополнительным преимуществом обеспечения контролируемой доставки соединения согласно настоящему изобретению в организм. Такие лекарственные формы могут быть получены путем растворения или диспергирования действующего соединения в подходящей среде. Вещества, улучшающие всасывание, также могут использоваться для увеличения потока соединения через кожу. Скорость такого потока можно регулировать либо с помощью регулирующей скорость мембраны, либо при диспергировании соединения в полимерной матрице или геле.

Фразы "парентеральное введение" и "вводимый парентерально" при использовании в настоящем описании означают способы введения кроме энтерального и наружного, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутриглазную (например, интравитреальную), внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, включают одно или более действующих соединений в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые могут быть восстановлены в стерильные растворы или дисперсии для инъекций непосредственно перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические вещества, растворенные вещества, которые делают состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента, или суспендирующие вещества или загустители.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях согласно изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и органические сложные эфиры, пригодные для инъекций, такие как этилолеат. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, при использовании материалов для получения покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и при использовании поверхностно-активных веществ.

Эти композиции могут также содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгирующие вещества и диспергирующие вещества. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может потребоваться включить в композиции изотонические вещества, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно обеспечивать путем включения веществ, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

В некоторых случаях, чтобы продлить действие лекарственного средства, желательно замедлять всасывание лекарственного средства из подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть достигнуто при использовании жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала, имеющего плохую растворимость в воде. Скорость всасывания лекарственного средства при этом будет зависить от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В альтернативе отсроченное всасывание лекарственной формы, вводимой парентерально, достигается при растворении или суспендировании лекарственного средства в масляном носителе.

Депо-формы для инъекций изготавливают путем получения микроинкапсулированных матриц рассматриваемых соединений в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также природы конкретного используемого полимера, скорость высвобождения лекарственного средства можно регулировать. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо-композиции для инъекций также получают путем захвата лекарственного средства в липосомах или микроэмульсиях, которые совместимы с тканями тела.

Для применения в способах согласно изобретению действующие соединения могут вводить в чистом виде или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,1 до 99,5% (более предпочтительно от 0,5 до 90%) действующего вещества в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Способы введения также можно обеспечивать с помощью перезаряжаемых или биоразлагаемых устройств. Различные полимерные устройства с замедленным высвобождением были разработаны и испытаны in vivo в последние годы для контролируемой доставки лекарственных средств, включая белковые биофармацевтические средства. Различные биосовместимые полимеры (включая гидрогели), включая как биоразлагаемые, так и неразлагаемые полимеры, могут использоваться для формирования имплантата для замедленного высвобождения соединения в конкретном целевом участке.

Фактические уровни дозы действующих веществ в фармацевтических композициях могут изменяться так, чтобы можно было получить количество действующего вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсических проявлений у пациента.

Выбранный уровень дозы будет зависеть от различных факторов, включающих активность конкретного используемого соединения или комбинации соединений, или их сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости экскреции конкретного используемого соединения(й), продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретным используемым соединением(ями), возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, подвергаемого лечению, а также подобных факторов, известных в области медицины.

Врач или ветеринар, обладающий средней квалификацией в данной области, может легко определить и назначить терапевтически эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начинать введение доз фармацевтической композиции или соединения с уровней, более низких, чем требуется для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока не будет достигнут желаемый эффект. Под "терапевтически эффективным количеством" подразумевается концентрация соединения, достаточная для достижения желаемого терапевтического эффекта. Обычно подразумевается, что эффективное количество соединения будет изменяться в зависимости от веса, пола, возраста и анамнеза пациента. Другие факторы, которые влияют на эффективное количество, могут включать, без ограничения перечисленными, тяжесть состояния пациента, нарушение, подвергаемое лечению, стабильность соединения и, в случае необходимости, другой тип терапевтического средства, вводимого с соединением согласно изобретению. Более высокая суммарная доза может быть доставлена при многократном введении средства. Множество способов определения эффективности и дозы известно специалистам в данной области (Isselbacher et al. (1996) Harrison's Principles of Internal Medicine 13 ed. , 1814-1882, включенный в настоящий документ посредством отсылки).

Как правило, подходящая суточная доза действующего соединения, применяемого в композициях и способах согласно изобретению, будет соответствовать такому количеству соединения, которое является наименьшей эффективной дозой, оказывающей терапевтическое действие. Такая эффективная доза обычно будет зависеть от факторов, описанных выше.

При необходимости эффективную суточную дозу действующего соединения могут вводить в одной, двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдозах, вводимых раздельно с соответствующими интервалами в течение дня, необязательно в стандартных лекарственных формах. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения действующее соединение могут вводить два или три раза в день. В предпочтительных вариантах осуществления активное соединение вводят один раз в день.

Пациент, получающий такое лечение, является любым животным, нуждающимся в этом, в том числе приматами, в частности человеком; и другими млекопитающими, такими как лошади, рогатый скот, свинья, овца, кошка и собака; сельскохозяйственная птица; и домашние животные в общем.

В некоторых вариантах осуществления соединения согласно изобретению могут применять отдельно или вводить совместно с другим типом терапевтического средства.

Настоящее изобретение включает применение фармацевтически приемлемых солей соединений согласно изобретению в композициях и способах согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные соли согласно изобретению включают, без ограничения, соли алкил, диалкил, триалкил или тетраалкиламмония. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные соли согласно изобретению включают, без ограничения, соли L-аргинина, бенетамина, бензатина, бетаина, гидроксида кальция, холина, деанола, диэтаноламина, диэтиламина, 2-(диэтиламино)этанола, этаноламина, этилендиамина, N-метилглюкамина, гидрабамина, 1H-имидазола, лития, L-лизина, магния, 4-(2-гидроксиэтил)морфолина, пиперазина, калия, 1-(2-гидроксиэтил)пирролидина, натрия, триэтаноламина, трометамина и цинка. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные соли согласно изобретению включают, без ограничения перечисленными, соли Na, Ca, K, Mg, Zn или других металлов. В некоторых вариантах осуществления предусмотренные соли согласно изобретению включают, без ограничения перечисленными, соли 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты, 2,2-дихлоруксусной кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, 2-оксоглутаровой кислоты, 4-ацетамидобензойной кислоты, 4-аминосалициловой кислоты, уксусной кислоты, адипиновой кислоты, 1-аскорбиновой кислоты, 1-аспарагиновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, (+)-камфорной кислоты, (+)-камфор-10-сульфоновой кислоты, каприновой кислоты (декановой кислоты), капроновой кислоты (гексановой кислоты), каприловой кислоты (октановой кислоты), угольной кислоты, коричной кислоты, лимонной кислоты, цикламовой кислоты, додецилсерной кислоты, этан-1,2-дисульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, муравьиной кислоты, фумаровой кислоты, галактаровой кислоты, гентизиновой кислоты, d-глюкогептоновой кислоты, d-глюконовой кислоты, d-глюкуроновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутаровой кислоты, глицерофосфорной кислоты, гликолевой кислоты, гиппуровой кислоты, бромоводородной кислоты, соляной кислоты, изомасляной кислоты, молочной кислоты, лактобионовой кислоты, лауриновой кислоты, малеиновой кислоты, 1-яблочной кислоты, малоновой кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, нафталин-1,5-дисульфоновой кислоты, нафталин-2-сульфоновой кислоты, никотиновой кислоты, азотной кислоты, олеиновой кислоты, щавелевой кислоты, пальмитиновой кислоты, памовой кислоты, фосфорной кислоты, пропионовой кислоты, 1-пироглутаминовой кислоты, салициловой кислоты, себациновой кислоты, стеариновой кислоты, янтарной кислоты, серной кислоты, 1-винной кислоты, тиоциановой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты и ундециленовой кислоты.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты также могут существовать в виде различных сольватов, например, с водой, метанолом, этанолом, диметилформамидом и т.п. Также могут быть получены смеси таких сольватов. Источником такого сольвата может быть растворитель кристаллизации, присутствующий в растворителе при получении или кристаллизации, или случайно содержащийся в таком растворителе.

В композициях также могут присутствовать смачивающие вещества, эмульгаторы и смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные вещества, вещества для получения покрытия, подсластители, вкусовые и ароматические вещества, консерванты и антиоксиданты.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновую кислоту, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) металлохелаторы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

Композиции могут быть изготовлены в форме для инъекций либо в виде жидкого раствора, либо в виде суспензии. Твердые формы, подходящие для инъекции, также могут быть изготовлены, например, в виде эмульсий или с конъюгатом антитела-лекарственного средства, инкапсулированным в липосомы. Конъюгаты антитела-лекарственного средства можно комбинировать с фармацевтически приемлемым носителем, который включает любой носитель, который не вызывает продукцию антител, опасных для субъекта, получающего носитель. Подходящие носители обычно включают большие макромолекулы, которые медленно метаболизируются, например белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты и т.п.

Композиции также могут содержать разбавители, например воду, физиологический раствор, глицерин и этанол. Также в нем могут присутствовать вспомогательные вещества, например смачивающие или эмульгирующие вещества, pH-буферные вещества и т.п. Композиции могут вводить парентерально путем инъекции, при этом такая инъекция может быть подкожной или внутримышечной. В некоторых вариантах осуществления композицию могут вводить в опухоль. Композицию могут помещать (например, путем инъекции) в опухоль. Дополнительные составы подходят для других форм введения, таких как суппозиторий, или перорального введения. Композиции для перорального введения могут вводить в виде раствора, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы или состава с замедленным высвобождением.

Композиции могут вводить способом, который совместим с дозой и составом. Композиция предпочтительно включает терапевтически эффективное количество конъюгата антитела-лекарственного средства. Доза может изменяться в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, состояния здоровья и физического состояния субъекта, требуемой степени защиты и других соответствующих факторов. Точное количество действующего вещества (например, конъюгата антитела-лекарственного средства) может зависеть от решения врача. Например, терапевтически эффективное количество конъюгата антитела-лекарственного средства или содержащей его композиции могут вводить пациенту, страдающему раком или опухолью, для лечения рака или опухоли.

Конъюгат антитела-лекарственного средства согласно настоящему изобретению или содержащую его композицию могут вводить в форме его фармацевтически приемлемой соли или сольвата. В некоторых вариантах осуществления конъюгат антитела-лекарственного средства согласно настоящему изобретению или содержащую его композицию могут вводить с фармацевтически приемлемым носителем, фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом и/или фармацевтически приемлемой добавкой. Эффективное количество и тип фармацевтически приемлемой соли или сольвата, вспомогательного вещества и добавки можно определить при использовании стандартных методов (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th Edition, 1990).

Примеры сольватов, которые могут использоваться в качестве фармацевтически приемлемых сольватов конъюгатов антитела-лекарственного средства, описанных в настоящем документе, включают воду, изопропанол, этанол, метанол, диметилсульфоксид, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, включающему введение субъекту фармацевтической композиции, включающей конъюгат антитела-лекарственного средства, как описано в настоящем документе. В предпочтительных вариантах осуществления субъектом является млекопитающее. Например, субъект может быть выбран из грызунов, зайцеобразных, кошачьих, псовых, свиней, овец, коров, лошадей и приматов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления субъектом является человек.

Конъюгаты согласно изобретению (также именуемые в настоящем описании "активными соединениями") и их производные, фрагменты, аналоги и гомологи могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции обычно включают конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" предназначен для включения любых вохможных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, изотонических веществ и веществ, замедляющих всасывание, и т.п., совместимых с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартном справочном тексте в данной области, который включен в настоящий документ посредством отсылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, без ограничения перечисленными, воду, раствор хлорида натрия, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Также могут использоваться липосомы и неводные носители, такие как жирные масла. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какая-либо стандартная среда или вещество несовместимы с действующим соединением, их применение предусмотрено в композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные действующие соединения.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению имеет такой состав, который соответствует предполагаемому пути введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, ингаляционное), трансдермальное (то есть наружное), чрескожное и ректальное, введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как воду для инъекций, раствор хлорида натрия, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновую кислоту или бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и вещества для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстрозу. pH можно регулировать с использование кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, шприцы одноразового применения или флаконы с множеством доз, изготовленные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения путем инъекций, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатированную воду, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и жидкой в такой степени, чтобы обеспечивать возможность легкого введения шприцем. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должен быть предохранена от контаминирующего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, при использовании покрытия, такого как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и при использовании поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов можно обеспечивать при использовании различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические вещества, например сахара, многоатомные спирты, такие как манит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может достигаться путем включения в композицию вещества, которое задерживает абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения действующего соединения в нужном количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией компонентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии приготавливают путем включения действующего соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые компоненты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают порошок действующего компонента плюс любого дополнительного требуемого компонента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.

Композиции для перорального применения обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для перорального терапевтического введения действующее соединение может быть включено со вспомогательными веществами и может использоваться в форме таблеток, троше или капсул. Композиции для перорального применения также могут быть изготовлены с использованием жидкого носителя для применения в качестве ополоскивателя для полости рта, где соединение в жидком носителе применяют в полости рта и полощут и сплевывают или глотают. Фармацевтически совместимые связующие вещества и/или вспомогательные материалы могут быть включены в качестве части композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, троше и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакант или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновая вкусовая добавка.

Для введения путем ингаляции соединения доставляют в форме аэрозоля из контейнера под давлением или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера.

Системное введение также можно осуществлять чресслизистым или чрескожным способом. Для чресслизистого или чрескожного введения в составе используют пенетранты, подходящие для барьера, который требуется преодолеть. Такие пенетранты обычно известны в данной области и включают, например, в случае чресслизистого введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Чресслизистое введение можно осуществлять с помощью назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения действующие соединения могут быть включены в мази, бальзамы, гели или кремы, как общеизвестно в данной области.

Соединения также могут быть изготовлены в форме суппозиториев (например, со стандартными суппозиторными основами, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживаемыми растворами для ректальной доставки.

В одном варианте осуществления действующие соединения изготавливают с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого выведения из организма, например, состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут использоваться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы изготовления таких составов будут очевидны специалистам в данной области. Материалы также могут быть получены коммерчески в Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомные суспензии (включающие липосомы, направленные против инфицированных клеток, с моноклональными антителами к вирусным антигенам) также могут использоваться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены подходящими способами, например, как описано в патенте США 4,522,811.

Особенно предпочтительно изготавливать композиции для перорального или парентерального применения в виде стандартной лекарственной формы для удобства введения и однородности дозировки. Стандартная лекарственная форма при использовании в настоящем документе относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъекта, подлежащего лечению; каждая единица содержит заданное количество действующего соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм согласно изобретению продиктована и напрямую зависит от уникальных свойств действующего соединения и конкретного терапевтического эффекта, который требуется получить, а также от ограничений, характерных в области изготовления композиций такого действующего соединения для лечения пациентов.

Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями по применению.

Все указанные выше и любые другие публикации, патенты и опубликованные заявки на патенты, указанные в данной заявке, прямо включены в настоящий документ посредством отсылки. В случае конфликта настоящее описание, включая конкретные определения в нем, будет иметь преимущественную силу.

Далее изобретение будет описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанного в формуле изобретения.

В дальнейшем конфигурации настоящего изобретения будут подробно описаны посредством Примеров, при этом следующие Примеры предназначены исключительно для помощи в понимании настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения не ограничивается этим. Кроме того, если прямо не указано иное, реагент, растворитель и исходное вещество, описанные в настоящем описании, могут быть легко получены от коммерческого поставщика.

РАЗДЕЛ ПРИМЕРОВ

В Таблице ниже перечислены сокращения, используемые по всему тексту следующих Примеров:

Сокращение Определение Ac ацетил AcOH уксусная кислота водн. водный Bn бензил солевой раствор насыщенный водный раствор хлорида натрия Boc т-бутоксикарбонил Cbz бензилоксикарбонил DBU l,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен ДХМ дихлорметан DIC N,N'-диизопропилкарбодиимид DIPEA N, N-диизопропилэтиламин DMAP 4-(диметиламино)пиридин ДМФА N,N-диметилформамид ДМСО диметилсульфоксид EDC N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид Et этил Et20 диэтиловый эфир EtOAc этилацетат EtOH этанол HBTU гексафторфосфат O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония Hex н-гексан HOBt 1-гидроксибензотриазол ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография Me Метил MeCN ацетонитрил MeOH метанол MMAE монометилауристатин E MMAF монометилауристатин F MMAF-OMe монометилауристатина F сложный метиловый эфир i-PrOH изопропанол PyBOP гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония TBAF Фторид тетрабутиламмония TBS т-бутилдиметилсилил ТГФ тетрагидрофуран ТФУ трифторуксусная кислота Ts п-толуолсульфонил в вес

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез конъюгатов антитела-лекарственного средства

Пример 2: Конъюгаты антитела-лекарственного средства, раскрытые в настоящем документе, могут быть получены любым подходящим способом, включая способы, известные в уровне техники. Например, см.: i) WO 2018/182341, в которой описано получение димеров пирролбензодиазепина и, таким образом, конъюгатов антитела-лекарственного средства; ii) WO 2015/182984, в которой описано получение конъюгатов антитела-лекарственного средства, включающих молекулы глюкуроновой кислоты; и iii) WO 2018/083535, в которой описано получение некоторых антител против CD-19. Содержание каждой из вышеуказанных публикаций настоящим включено посредством отсылки во всей их полноте. Анализ связывания лимфоцитов антителами против CD19

Оценивали способность различных антител против CD19 согласно изобретению связывать различные клеточные линии B-лимфоцитов человека. В частности, человеческие IgG1 антитела против CD19, 5F5, 7F11, 9G8, F6, 7F1 и 10D8, оценивали на способность связывать: (i) шесть клеточных линий B-лимфоцитов человека: Raji, Ramos, Nalm6, Su-DHL6, Su-DHL4 и Mec2, (ii) линию В-клеток с сайленсингом CD19: Raji миРНК; и отрицательную клеточную линию (Jurkat). Все инкубирования подготавливали в буфере FACS (PBS, 2% BSA) при 4°C. Fc-рецепторы на B-клетках блокировали 10% мышиной сывороткой. Были протестированы четыре дозы hIgG1: 10, 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл. Связанный на клеточной поверхности hIgG1 детектировали мышиными мАт антителами к Fc IgG человека -ФЭ. Результаты этого исследования показаны на ФИГ. 1A-1F.

Как показано на ФИГ. 1A-1F, все протестированные антитела против CD19 связываются со всеми шестью различными В-лимфоцитами, хотя и с разными профилями и/или разной аффинностью. Например, 7F1 и 10D8 лучше связываются с Nalm6, чем с клетками Raji, тогда как другие антитела демонстрируют противоположный профиль связывания. Все протестированные антитела четко специфичны к CD19, и все протестированные антитела теряют способность связывать CD19 в линии клеток Raji миРНК с сайленсингом CD19. Ни одна из клеточных линий не связывалась с отрицательной клеточной линией.

Пример 3: Анализ перекрестной реактивности антител против CD19

Оценивали способность антител против CD19 связать CD19 человека и/или яванского макака.

В частности, человеческие IgG1 антитела против CD19, 5F5, 7F11, 9G8, F6, 7F1 и 10D8, оценивали на способность связывать линию клеток CHO, трансфицированную CD19 яванского макака, и клеточную линию отрицательного контроля (CHO). Все инкубирования подготавливали в буфере FACS (PBS, 2% BSA) при 4°C. Fc-рецепторы на B-лимфоцитах блокировали 10% мышиной сывороткой. Были протестированы четыре дозы hIgG1: 10, 1, 0,1 и 0,01 мкг/мл. Результаты этого исследования показаны на ФИГ. 2.

Антитело против CD19, 9G8, обладает явной перекрестной реактивностью с CD19 яванского макака. Антитела против CDl9, 5F5, 7F11 и F6, также обладают небольшой перекрестной реактивностью с яванским макаком, как наблюдали на наложении кривых FACS на ФИГ. 2. Антитела против CD19, 7F1 и 10D8, не связывалися с трансфицированными cynoCD19 клетками CHO.

Пример 4: Анализ связывания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) антителами против CD19

Способность различных антител против CD19 согласно изобретению связывать различные мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Тестировали МКПК человека и яванского макака из замороженных аликвот в цитратном буфере. Тестировали две дозы 30 мкг/мл и 3 мкг/мл следующих человеческих IgG1 антител против CD19: 5F5, 7F11, 9G8, F6, 10D8, 7F1, Mdx в качестве положительного контроля и антитело против IP-10, называемое NI-0801, в качестве отрицательного контроля. МКПК метили моноклональным антителом-ФЭ (мАт) против CD20, мАт-ФИТЦ против CD14 и мАт-PerCP против CD3 с перекрестной реактивностью к человеку и яванскому макаку. Связанные с клеточной поверхностью hIgG1 деетктировали мышиным мАт-АФЦ против Fc IgG человека. FACS гейтирование проводили с мАт против CD20 для популяции B-лимфоцитов, с антителом против CD3 для популяции T-лимфоцитов и с антителом против CD14 для популяции моноцитов. Результаты этих исследований показаны на ФИГ. 3A-3F.

Как показано на ФИГ. 3C, ни одно из протестированных антител против CD19 не связывалось с CD3+ МКПК человека в высокой дозе 30 мкг/мл. Все протестированные антитела продемонстрировали одинаковый уровень связывания на моноцитах, как наблюдали при связывании с отрицательным контролем NI-0801 из-за присутствия на клеточной поверхности Fc-рецепторов. Как показано на ФИГ. 3A, все протестированные антитела против CD19 связывались с CD20+ МКПК человека, причем небольшие различия в аффинности можно было наблюдать при 3 мкг/мл. На ФИГ. 3C продемонстрирована перекрестная реактивность всех антител против CD19. Связывание на МКПК человека было до десяти раз выше, чем на МКПК яванского макака, что находится в том же диапазоне, как наблюдали в случае положительного контроля Mdx.

Пример 5: Примерное исследование на ксенотрансплантатах с антителом против CD19 9G8

Противоопухолевая эффективность ADC против CD19 (9G8) в ксенотрансплантатной модели неходжкинской лимфомы Raji

Противоопухолевую активность конъюгата антитела-лекарственного средства против CD19 (9G8) оценивали на иммунодефицитных мышах CB17SCID с подкожным трансплантатом клеток лимфомы Беркитта Raji.

Мышам CB17-SCID (Charles River) возрастом 7 недель подкожно (п/к) имплантировали в правый бок 5×10⁶ клеток Raji (полученных из ATCC). Объемы опухоли (TV, вычисленные при использовании формулы TV=(0,5×[длина×ширина²]) измеряли с помощью цифрового штангенциркуля через 4 дня (D4) после имплантации и распределяли мышей в разные группы (см. таблицу, представленную ниже) с получением однородного среднего объема опухоли в когортах (n=7-8 мышей в группе. Средний объем опухоли в D4: hIgG1 контроль 6 мг/кг: 180 мм³±63; ADC против CD19 0,3 мг/кг: 187 мм³±61; ADC против CD19 1 мг/кг: 200 мм³±49; ритуксимаб 6 мг/кг: 194 мм³±63). В тот же день мышам в/в вводили в хвостовую вену однократную дозу контрольного hIgG1 (6 мг/кг), ADC против CD19 в дозе 0,3 или 1 мг/кг или ритуксимаба (6 мг/кг). Затем у мышей контролировали массу тела 2 раза в неделю и рост опухоли 3 раза в неделю до конечного показателя в эксперименте (объем опухоли=1500 мм³). Виварий и эксперименты были одобрены комитетом по исследованию животных кантона Женева, и эксперименты проводили в соответствии с рекомендациями Федерального ветеринарного ведомства Швейцарии. Мыши, получавшие ADC против CD19 9G8, продемонстрировали регрессию роста опухоли (ФИГ. 4A-4H).

Противоопухолевая эффективность ADC против CD19 (9G8) в ксенотрансплантатной модели неходжкинской лимфомы Ramos

Противоопухолевую активность конъюгата антитела-лекарственного средства против CD19 (9G8) оценивали на иммунодефицитных мышах CB-17 scid, которым подкожно имплантировали клетки лимфомы Беркитта Ramos.

Мышам CB17-SCID (Charles River) возрастом 7 недель подкожно (п/к) имплантировали в правый бок 5×10⁶ клеток Ramos (полученных из ATCC). Объемы опухоли (вычисляли при использовании формулы TV=(0,5×[длина×ширина²]) измеряли с помощью цифрового штангенциркуля 3 раза в неделю и начинали лечение мышей, когда объемы опухоли достигали 200-250 мм³. Мышей распределяли в разные группы (см. таблицу, приведенную ниже) с получением однородных средних объемов опухоли в когортах (n=7-8 мышей в группе. Средний объем опухоли: hIgG1 контроль 1 мг/кг, 1 инъек.: 243 мм³±26; CaaX антитело против CD19 1 мг/кг, 1 инъек.: 233 мм³±18; ADC hIgG1 1 мг/кг, 1 инъек.: 224 мм³±20; ADC против CD19 0,33 мг/кг, 1 инъек.: 242 мм³±28; ADC против CD19 0,66 мг/кг, 1 инъек.: 234 мм³±23; ADC против CD19 1 мг/кг, 1 инъек.: 234 мм³±31; ADC против CD19 0,33 мг/кг 1 инъек./неделя в течение 3 недель: 251 мм³±25; ритуксимаб 6 мг/кг, 1 инъек.: 242 мм³±31). Однократную дозу или многократные дозы (только для когорты, получавшей 0,33 мг/кг ADC против CD19 1×/неделя, 3 недели) при лечении в/в вводили в хвостовую вену. Затем у мышей контролировали массу тела 3 раза в неделю и рост опухоли 3 раза в неделю до конечного показателя в эксперименте (объем опухоли=1500 мм³). Виварий и эксперименты были одобрены комитетом по исследованию животных кантона Женева, и эксперименты проводили в соответствии с рекомендациями Федерального ветеринарного ведомства Швейцарии.

Группа Лечение N Доза Частота инъекций 1 человеческий IgG1 изотипического контроля 8 1 мг/кг однократная 2 CaaX антитело против CD19 9G8 8 1 мг/кг однократная 3 неспецифичный к опухоли человеческий IgG1 ADC против HER2 8 1 мг/кг однократная 4 9G8 ADC против CD19 8 1 мг/кг однократная 5 9G8 ADC против CD19 8 0,66 мг/кг однократная 6 9G8 ADC против CD19 8 0,33 мг/кг однократная 7 9G8 ADC против CD19 8 0,33 мг/кг 3 инъекции (1×/неделя) 8 ритуксимаб 8 6 мг/кг однократная

Группы, получавшие ADC 9G8 против CD19, демонстрировали регрессию опухоли до дня 70, при этом на день 70 выживали все мыши (ФИГ. 5A-5B). Группы, получавшие hIgG1 изотипического контроля, 9G8-Caax Ат против CD19 и неспецифичный к опухоли ADC (против Her2) демонстрировали рост опухоли, при этом все мыши в этих группах достигали конечного показателя по размеру опухоли. Ни одно животное не выживало до дня 70. В группе, получавшей ритуксимаб, четыре из семи мышей достигали конечного показателя, при этом три мыши выживали до дня 70. Никакие отрицательные побочные эффекты, связанные с введением ADC 9G8 против CD19, не наблюдали.

Пример 6: Примерное исследование in vitro с антителом против CD19 9G8

Противоопухолевую активность конъюгата антитела-лекарственного средства против CD19 (9G8) in vitro оценивали в антипролиферативном тесте. Использовали 6 доступных в продаже линий раковых клеток B-клеточной лимфомы DOHH-2 (DSMZ, #ACC 47), NALM-6 (DSMZ, #ACC 58), Ramos (ECACC, №85030802), SU-DHL-6 (ATCC, #CRL-2959), WSU-DLCL2 (DSMZ, #ACC 575) и WSU-NHL (DSMZ, #ACC 58). SG2057 использовали в качестве лекарственного средства, свободного токсина. Каждую из линий раковых клеток сеяли в 96-луночный планшет при плотности 2000-10000 в лунке для группы 96-часового лечения, инкубировали в течение 2 часов и затем обрабатывали лекарственным средством и ADC в концентрации от 0,00025 до 100 нМ (5-кратные серийные разведения). Через 96 часов количество живых клеток определяли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega-G7573). Степень ингибирования (IR) лекарственного средства и ADC определяли по следующей формуле: IR(%)=(1-(RLU соединения - RLU пустого образца)/(RLU контроля - RLU пустого образца))*100%. Ингибирование различных доз образцов вычисляли в файле Excel, а затем использовали для построения кривой ингибирования и оценки связанных параметров, таких как Низкий (%), Высокий (%) и Относительная IC50. Данные были интерпретированы с помощью GraphPad Prism и показаны на ФИГ. 6. Вычисляли IC50 для каждого эксперимента и обработки (см. таблицу ниже). Процент ингибирования ADC против CD19 9G8 была сравним с процентом ингибирования свободного dPBD токсина (SG2057).

Тестируемые образцы IC₅₀ (нМ) Ramos SU-DHL-6 WSU-DLCL2 DOHH2 WSU-NHL NALM6 Свободный dPBD (SG2057) 0,15 0,05 0,004 0,0054 0,013 0,0035 ADC против CD19 0,30 0,50 0,080 0,056 0,15 0,021

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ОТСЫЛКИ

Все публикации и патенты, указанные в настоящем документе, включены посредством отсылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация или патент были прямо и индивидуально указаны как включенные посредством отсылки. В случае конфликта настоящая заявка, включая любые определения в настоящем документе, будет иметь преимущественную силу.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Хотя обсуждались конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, представленное выше описание является иллюстративным и неограничивающим. Многие вариации изобретения станут очевидными для специалистов в данной области после ознакомления с этим описанием и представленной ниже формулой изобретения. Полный объем изобретения должен определяться при отсылке к формуле изобретения вместе с полным объемом эквивалентов и описанию вместе с такими вариациями.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЛЕГОКЕМ БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК.

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К КОНЪЮГАТАМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

С АНТИТЕЛАМИ ПРОТИВ CD19

<130> LCH-00925 (33138.00925)

<140>

<141>

<150> 62/669,183

<151> 2018-05-09

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 1

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

cttcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaggtata 300

agtgggatct acaatttaca cggttttgat atctggggcc agggaaccct ggtcacagtc 360

tcgagc 366

<210> 2

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ile Ser Gly Ile Tyr Asn Leu His Gly Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 3

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag gcgagcttgg acagcccgtt gaccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 4

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Ser Leu Asp Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 5

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

cttcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaggtgta 300

agtgggatct acaatttaca cggttttgat atctggggcc agggaaccct ggtcacagtc 360

tcgagc 366

<210> 6

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Ser Gly Ile Tyr Asn Leu His Gly Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 7

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag ggcatgtggg acaacccgtt caccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 8

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Met Trp Asp Asn Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 9

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag ggcaggttcg ggtccccgtt caccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 10

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Phe Gly Ser Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 11

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 11

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

cttcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagagtctgg 300

tattacgatt tttggagtgg ggccgatgct tttgatatct ggggccaggg aaccctggtc 360

acagtctcga gc 372

<210> 12

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Trp Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Ala Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 13

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag ggcagcttgg aggcgccgca gaccttcggc 300

caagggacca aggtggaaat caaa 324

<210> 14

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 14

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Leu Glu Ala Pro

85 90 95

Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 15

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaggtgat 300

tattggactg gttttgctta ttggggccag ggaaccctgg tcacagtctc gagc 354

<210> 16

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 17

<211> 327

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 17

cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggatc tgggctggaa ctcggtgttc 300

ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327

<210> 18

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 18

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Leu Gly Trp

85 90 95

Asn Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 19

<211> 381

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 19

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

gggtatgatt acgtttgggg gagttatcgt tatggtgcct ttgatatctg gggccaggga 360

accctggtca cagtctcgag c 381

<210> 20

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Asp Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Arg Tyr Gly

100 105 110

Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 21

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 21

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180

tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatatg atgtctgggt cccgcacatg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 22

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 22

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Val Trp

85 90 95

Val Pro His Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 23

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 23

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 24

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr

1 5

<210> 25

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 25

Ala Arg Gly Ile Ser Gly Ile Tyr Asn Leu His Gly Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 26

Ala Arg Gly Val Ser Gly Ile Tyr Asn Leu His Gly Phe Asp Ile

1 5 10 15

<210> 27

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 27

Ala Arg Val Trp Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Ala Asp Ala Phe Asp

1 5 10 15

Ile

<210> 28

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 28

Ala Arg Gly Asp Tyr Trp Thr Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 29

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 30

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala

1 5

<210> 31

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 31

Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Asp Tyr Val Trp Gly Ser Tyr Arg Tyr Gly

1 5 10 15

Ala Phe Asp Ile

20

<210> 32

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 32

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 33

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 33

Ala Ala Ser

1

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 34

Gln Gln Ala Ser Leu Asp Ser Pro Leu Thr

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 35

Gln Gln Gly Met Trp Asp Asn Pro Phe Thr

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 36

Gln Gln Gly Arg Phe Gly Ser Pro Phe Thr

1 5 10

<210> 37

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 37

Gln Ser Val Ser Ser Asn

1 5

<210> 38

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 38

Gly Ala Ser

1

<210> 39

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 39

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

cttcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaggtgta 300

agtgggatct acaatttaca cggtttcgat atctggggcc agggaaccct ggtcacagtc 360

tcgagc 366

<210> 40

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 40

Gln Gln Gly Ser Leu Glu Ala Pro Gln Thr

1 5 10

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 41

Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr

1 5

<210> 42

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 42

Asp Asn Asn

1

<210> 43

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 43

Gly Thr Trp Asp Leu Gly Trp Asn Ser Val

1 5 10

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 44

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 45

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 45

Glu Val Ser

1

<210> 46

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 46

Ser Ser Tyr Asp Val Trp Val Pro His Met Val

1 5 10

<210> 47

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 47

Cys Val Ile Met

1

<210> 48

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 48

Cys Val Leu Leu

1

<210> 49

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 49

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Val Ile Met

1 5 10

<210> 50

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (1)..(20)

<223> Эта область может включать 0-20 остатков

<400> 50

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Cys Val Ile Met

20

<210> 51

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<220>

<221> ПРОЧИЕ_ПРИЗНАКИ

<222> (1)..(20)

<223> Эта область может включать 0-20 остатков

<400> 51

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gly Cys Val Leu Leu

20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности конъюгату антитела для направленного взаимодействия c CD19, а также к фармацевтической композиции, его содержащей. Изобретение эффективно для лечения заболевания, связанного с патологической экспрессией CD19. 5 н. и 58 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Конъюгат антитела для направленного взаимодействия c CD19, представленный Формулой I, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват:

где Ab представляет собой антитело против CD19 или его антигенсвязывающий фрагмент,

где Ab содержит

определяющую комплементарность область вариабельной области тяжелой цепи 1 (CDRH1),

определяющую комплементарность область вариабельной области тяжелой цепи 2 (CDRH2),

определяющую комплементарность область вариабельной области тяжелой цепи 3 (CDRH3),

определяющую комплементарность область вариабельной области легкой цепи 1 (CDRL1),

определяющую комплементарность область вариабельной области легкой цепи 2 (CDRL2) и

определяющую комплементарность область вариабельной области легкой цепи 3 (CDRL3); где

(a)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32,

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34;

(b)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35;

(c)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:32;

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:36;

(d)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37;

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:40;

(e)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:23;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:24;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:41;

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:42; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:43; или

(f)(i) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29;

(ii) CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30;

(iii) CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31;

(iv) CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:44;

(v) CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45; и

(vi) CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46;

каждый X независимо является химической группой, содержащей одно или более действующих веществ и линкер,

где линкер соединяет Ab с действующим веществом(ами); и

y равно целому числу от 1 до 20.

2. Конъюгат антитела по п.1, где Ab содержит комбинацию вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 6, 12, 16 или 20, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, 8, 10, 14, 18 или 22.

3. Конъюгат антитела по п.1, где Ab содержит комбинацию последовательности вариабельной области тяжелой цепи и последовательности вариабельной области легкой цепи, выбранную из:

(a) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;

(b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8;

(c) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10;

(d) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;

(e) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18; и

(f) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, и

вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22.

4. Конъюгат антитела по любому из предыдущих пунктов, где конъюгат антитела представлен Формулой II:

G представляет собой молекулу глюкуроновой кислоты или ,

где R³ представляет собой водород или защитную группу карбоксила, и

каждый R⁴ независимо представляет собой водород или защитную группу гидроксила;

B представляет собой действующее вещество;

каждый R¹ и R² независимо представляет собой водород, алкил C_1-8 или C_3-8 циклоалкил; или

W представляет собой -C(O)-, -C(O)NR'-, -C(O)O-, -SO₂NR'-, -P(O)R"NR'-, -SONR'- или -PO₂NR'-,

где C, S или P непосредственно связан с фенильным кольцом, и

каждый R' и R'' независимо представляет собой водород, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, моно- или ди-C_1-8 алкиламино, C_3-20 гетероарил или C_6-20 арил;

в каждом случае Z независимо представляет собой C_1-8 алкил, галоген, циано или нитро;

n равно целому числу от 0 до 3; и

L представляет собой линкер, соединяющий Ab и W.

5. Конъюгат антитела по п.4, где L представляет собой C_1-50 алкилен или гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов.

6. Конъюгат антитела по п.4 или 5, где L удовлетворяет по меньшей мере одно из следующих условий:

(i) L содержит по меньшей мере одну ненасыщенную связь;

(ii) два атома в L замещены двухвалентным заместителем таким образом, что заместитель, с атомами, которые он соединяет, образует гетероарилен;

(iii) L представляет собой гетероалкилен, содержащий 1-50 атомов; или

(iv) алкилен замещен одним или более C_1-20 алкилами.

7. Конъюгат антитела по любому из пп.4-6, где L содержит по меньшей мере одно звено производного изопренила, представленное Формулой III, которое распознает изопреноид-трансфераза:

8. Конъюгат антитела по любому из пп.4-7, где:

G представляет собой ;

R³ представляет собой водород или защитную группу карбоксила; и

каждый R⁴ независимо представляет собой водород или защитную группу гидроксила.

9. Конъюгат антитела по любому из пп.4-8, где R³ представляет собой водород, и каждый R⁴ представляет собой водород.

10. Конъюгат антитела по любому из пп.4-9, где каждый R¹ и R² представляет собой водород.

11. Конъюгат антитела по любому из пп.4-10, где каждый Z независимо представляет собой C_1-8 алкил, галоген, циано или нитро.

12. Конъюгат антитела по любому из пп.4-11, где n равно 0.

13. Конъюгат антитела по любому из пп.4-12, где W представляет собой -C(O)NR'-.

14. Конъюгат антитела по любому из пп.4-13, где L содержит пептид, и пептид содержит по меньшей мере одну гидрофильную аминокислоту, предпочтительно, аминокислоту c боковой цепью, содержащую группу, которая несет заряд при нейтральном pH в водном растворе.

15. Конъюгат антитела по п.14, где пептид содержит 2-20 аминокислот.

16. Конъюгат антитела по любому из предыдущих пунктов, где линкер ковалентно связан с Ab тиоэфирной связью, и тиоэфирная связь содержит атом серы цистеина в Ab.

17. Конъюгат антитела по п.16, где:

Ab содержит аминокислотный мотив, который распознает изопреноид-трансфераза; и

тиоэфирная связь содержит атом серы цистеина аминокислотного мотива.

18. Конъюгат антитела по п.17, где:

аминокислотный мотив является последовательностью CYYX;

C представляет собой цистеин;

Y, независимо для каждого случая, представляет собой алифатическую аминокислоту;

X, независимо для каждого случая, представляет собой глутамин, глутамат, серин, цистеин, метионин, аланин или лейцин; и

тиоэфирная связь содержит атом серы цистеина аминокислотного мотива.

19. Конъюгат антитела по п.17 или 18, где:

аминокислотный мотив является последовательностью CYYX; и

Y, независимо для каждого случая, представляет собой аланин, изолейцин, лейцин, метионин или валин.

20. Конъюгат антитела по любому из пп.17-19, где аминокислотный мотив является последовательностью CVIM или CVLL.

21. Конъюгат антитела по любому из пп.17-20, где по меньшей мере одна из семи аминокислот, предшествующих аминокислотному мотиву, является глицином.

22. Конъюгат антитела по любому из пп.17-21, где L содержит аминокислотную последовательность GGGGGGGCVIM, предпочтительно на C-конце.

23. Конъюгат антитела по любому из пп.4-22, где L представляет собой 3-50 гетероалкилен, содержащий оксим, где:

атом кислорода оксима находится на стороне L, которая соединена с W, и атом углерода оксима находится на стороне L, которая соединена с Ab; или

атом углерода оксима находится на стороне L, которая соединена с W, и атом кислорода оксима находится на стороне L, которая соединена с Ab.

24. Конъюгат антитела по любому из пп.4-23, где L содержит:

или .

25. Конъюгат антитела по любому из пп.10-24, где L содержит соединительное звено, представленное Формулой VIII или IX:

V представляет собой одинарную связь, -O-, -S-, -NR²¹-, -C(O)NR²²-, -NR²³C(O)-, -NR²⁴SO₂- или -SO₂NR²⁵-;

X представляет собой -O-, C_1-8 алкилен или -NR²¹-;

каждый R²¹-R²⁵ независимо представляет собой водород, C_1-6 алкил, C_1-6 алкил C_6-20 арил или C_1-6 алкил C_3-20 гетероарил;

r является целым числом от 1 до 10;

p является целым числом от 0 до 12;

q является целым числом от 1 до 20; и

w является целым числом от 1 до 20.

26. Конъюгат антитела по п.25, где:

r равно 2;

p равно 2;

q равно 2, 5 или 11; и

V представляет собой -O-.

27. Конъюгат антитела по п.25 или 26, где X представляет собой -O-, и w является целым числом от 6 до 20.

28. Конъюгат антитела по любому из пп.4-27, где L содержит связывающее звено, представленное Формулой IV, V, VI или VII:

L₁ представляет собой одинарную связь или C_1-30 алкилен; и

R¹¹ представляет собой водородом или C_1-10 алкил.

29. Конъюгат антитела по любому из пп.4-28, где L содержит:

или

V представляет собой одинарную связь, -O-, -S-, -NR²¹-, -C(O)NR²²-, -NR²³C(O)-, -NR²⁴SO₂- или -SO₂NR²⁵-, предпочтительно -O-;

каждый R²¹-R²⁵ независимо представляет собой водород, C_1-6 алкил, C_1-6 алкил C_6-20 арил или C_1-6 алкил C_3-20 гетероарил;

r является целым числом от 1 до 10;

p является целым числом от 0 до 10;

q является целым числом от 1 до 20; и

L₁ представляет собой одинарную связь.

30. Конъюгат антитела по п.4, содержащий структуру:

,

,

, или

; и

где Ab представляет собой антитело против CD19;

B представляет собой действующее вещество; и

n является целым числом от 1 до 20.

31. Конъюгат антитела по любому из пп.4-30, где L содержит один или больше разветвленных линкеров, ковалентно связанных с Ab, где:

i) каждый разветвленный линкер содержит разветвляющее звено (BR), ковалентно связанное с Ab первичным линкером (PL);

ii) каждый разветвленный линкер содержит первую ветвь (B1), которая связывает первое действующее вещество с разветвляющим звеном и содержит вторичный линкер (SL) и расщепляемую группу (CG); и

iii) каждый разветвленный линкер дополнительно содержит вторую ветвь (B2), где:

a) второе действующее вещество ковалентно связано с разветвляющим звеном вторичным линкером (SL) и расщепляемой группой (CG); или

b) полиэтиленгликолевая группа ковалентно связана с разветвляющим звеном, и

где каждая расщепляемая группа может подвергаться гидролизу с высвобождением действующего вещества из конъюгата антитела.

32. Конъюгат антитела по п.31, где по меньшей мере одно разветвляющее звено имеет структуру

где каждый L², L³, L⁴ независимо представляет собой прямую связь или -C_nH_2n-,

где n является целым числом от 1 до 30,

где каждый G¹, G², G³ независимо является прямой связью,

где R³⁰ представляет собой водород или C_1-30 алкил; и

R⁴⁰ представляет собой водород или C_1-10 алкилен.

33. Конъюгат антитела по п.31, содержащий структуру:

где:

B и B' представляют собой действующие вещества, которые могут быть одинаковыми или различными;

n, независимо для каждого случая, представляет собой целое число от 0 до 30;

f, независимо для каждого случая, представляет собой целое число от 0 до 30; и

L представляет собой связь с Ab.

34. Конъюгат антитела по п.33, где n является целым числом от 1 до 10.

35. Конъюгат антитела по любому из пп.31-34, где один, два, три или четыре разветвленных линкера связаны с Ab.

36. Конъюгат антитела по любому из пп.31-35, где каждый разветвленный линкер связан с двумя действующими веществами.

37. Конъюгат антитела по любому из пп.4-36, где действующее вещество представляет собой химиотерапевтическое средство или токсин.

38. Конъюгат антитела по п.37, где действующее вещество является химиотерапевтическим средством.

39. Конъюгат антитела по любому из пп.4-36, где действующее вещество является иммуномодулирующим соединением, противоопухолевым средством, противовирусным средством, антибактериальным средством, противогрибковым средством, противопаразитарным средством или их комбинацией.

40. Конъюгат антитела по любому из пп.4-39, где действующее вещество независимо выбрано из следующего:

(a) эрлотиниб, бортезомиб, фулвестрант, сутент, летрозол, иматиниба мезилат, PTK787/ZK 222584, оксалиплатин, 5-фтороурацил, лейковорин, рапамицин, лапатиниб, лонафарниб, сорафениб, гефитиниб, AG1478, AG1571, тиотепа, циклофосфамид, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодопа, карбоквон, метуредопа, уредопа, этиленимин, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, буллатацин, буллатацинон, камптотецин, топотекан, бриостатин, каллистатин, CC-1065, адозелезин, карзелезин, бизелезин, криптофицин 1, криптофицин 8, доластатин, дуокармицин, KW-2189, CB1-TM1, элеутеробин, панкратистатин, саркодиктиин, спонгистатин, хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин, калихеамицин, калихеамицин гамма 1, калихеамицин омега 1, динемицин, динемицин A, клодронат, эсперамицин, хромофор неокарциностатина, аклациномицины, актиномицин, антимицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин, липосомальный доксорубицин, дезоксидоксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, марцелломицин, митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин, 5-фторурацил, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон, аминоглутетимид, митотан, трилостан, фолиновая кислота, ацеглатон, альдофосфамид гликозид, аминолевулиновая кислота, энилурацил, амсакрин, бестрабуцил, бисантрен, эдатраксат, дефосфамин, демеколцин, диазиквон, элфорнитин, эллиптиния ацетат, этоглюцид, галлия нитрат, гидроксимочевина, лентинан, лонидамин, майтанзин, ансамитоцины, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, лозоксантрон, 2-этилгидразид, прокарбазин, полисахарид-k, разоксан, ризоксин, сизофиран, спирогерманий, тенуазоновая кислота, триазиквон, 2,2',2"-трихлортриэтиламин, T-2 токсин, верракурин A, роридин A и ангидин, уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, гацитозин, арабинозид, циклофосфамид, тиотепа, паклитаксел, композиция стаблизированных альбумином наночастиц паклитаксела, доксетаксел, хлорамбуцил, гемцитабин, 6-тиогуанин, меркаптопурин, цисплатин, карбоплатин, винбластин, платина, этопозид, ифосфамид, митоксантрон, винкристин, винорелбин, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, Кселода, ибандронат, CPT-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторметилорнитин, ретиноевая кислота, капецитабин или фармацевтически приемлемые соли, сольваты или кислоты любого из указанных выше;

(b) монокин, лимфокин, традиционный полипептидный гормон, паратиреоидный гормон, тироксин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновый гормон, фолликулостимулирующий гормон, тиреотропный гормон, лютеинизирующий гормон, фактора роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухоли α, фактор некроза опухоли β, мюллерова ингибирующая субстанция, мышиный гонадотропин-ассоциированный пептид, ингибин, активин, фактор роста эндотелия сосудов, тромбопоэтин, эритропоэтин, остеоиндуктивный фактор, интерферон, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, колониестимулирующий фактор ("КСФ"), КСФ макрофагов, КСФ гранулоцитов-макрофагов, КСФ гранулоцитов, интерлейкин ("IL"), IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, фактор некроза опухоли, ФНО-α, ФНО-β, полипептидный фактор, LIF, лиганд kit или комбинация любого из указанных выше;

(c) дифтерийный токсин, ботулинический токсин, столбнячный токсин, дизентерийный токсин, холерный токсин, аманитин, производные аманитина, α-аманитин, пирролобензодиазепин, производные пирролобензодиазепина, тетродотоксин, бреветоксин, цигуатоксин, рицин, AM токсин, ауристатин, тубулизин, гелданамицин, майтанзиноид, калихеамицин, дауномицин, доксорубицин, метотрексат, виндезин, SG2285, доластатин, аналог доластатина, криптофицин, камптотецин, производные и метаболиты камптотецина, ризоксин, производное ризоксина, CC-1065, аналог или производное CC-1065, дуокармицин, ендииновый антибиотик, эсперамицин, эпотилон, азонафид, аплидин, токсоид или комбинация любого из указанных выше;

(d) аффинный лиганд, где аффинный лиганд является субстратом, ингибитором, стимулирующим средством, нейромедиатором, радиоизотопом или комбинацией любого из указанных выше;

(e) радиоактивная метка, ³²P, ³⁵S, флуоресцентный краситель, электронно-плотный реагент, фермент, биотин, стрептавидин, диоксигенин, гаптен, иммуногенный белок, молекула нуклеиновой кислоты с комплементарной к мишени последовательностью или комбинация любого из указанных выше;

(f) иммуномодулирующее соединение, противоопухолевое средство, противовирусное средство, антибактериальное средство, противогрибковое средство и инсектицидное средство или комбинация любого из указанных выше;

(g) тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон, или торемифен;

(h) 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат, эксеместан, летрозол или анастрозол;

(i) флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид, гозерелин, или троксацитабин;

(j) ингибитор ароматазы;

(k) ингибитор протеинкиназы;

(l) ингибитор липидкиназы;

(m) антисмысловой олигонуклеотид;

(n) рибозим;

(o) вакцина; и

(p) антиангиогенное средство.

41. Конъюгат антитела по любому из пп.4-40, где:

Ab является антителом против CD19;

действующее вещество является димером пирролбензодиазепина;

линкер соединяет Ab с положением N10 или N'10 димера пирролбензодиазепина; и y является целым числом от 1 до 20.

42. Конъюгат антитела по пп.4-41, где:

действующим веществом является димер пирролбензодиазепина;

димер пирролбензодиазепин в положении N10 замещен X или в положении N'10 замещен X', где X или X' соединяют димер пирролбензодиазепина с линкером;

каждый X и X' независимо выбран из -C(O)O-*, -S(O)O-*, -C(O)-*, -C(O)NR^X-*, -S(O)₂NR^X-*, -(P(O)R')NR^X-*, -S(O)NR^X-* или -PO₂NR^X-*;

R^X представляет собой H, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_3-20 гетероарил или C_5-20 арил;

R^X' представляет собой ОH, N₃, CN, SH, C_1-8 алкил, C_3-8 циклоалкил, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарил, C_5-20 арил или амино; и

* представляет собой положение присоединения димера пирролбензодиазепина к линкеру.

43. Конъюгат антитела по п.42, где:

каждый X и X' независимо выбран из -C(O)O -*, -C(O)-* или -C(O)NR^X-*.

44. Конъюгат антитела по п.42 или 43, где димер пирролбензодиазепина представлен Формулой X или Формулой XI:

где:

пунктирные линии обозначают необязательное присутствие двойной связи между C1 и C2 или между C2 и C3; и между C'1 и C'2 или между C'2 или C'3;

R^X1 и R^X1' независимо выбраны из H, OH, =O, =CH₂, CN, R^m, OR^m, =CH-R^m' =C(R^m')₂, O-SO₂-R^m, CO₂R^m, COR^m, галогена и дигалогена,

R^m' независимо выбран из R^m, CO₂R^m, COR^m, CHO, CO₂H и галогена,

каждый R^m независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила;

каждый R^X2, R^X2', R^X3, R^X3', R^X5 и R^X5' независимо выбран из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^m₂, NO₂, Me₃Sn и галогена;

R^X4 и R^X4' независимо выбраны из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^m₂, NO₂, Me₃Sn, галогена, C_1-6 алкила, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-12 арила, 5-7-членного гетероарила, -CN, -NCO, -ORⁿ, -OC(O)Rⁿ, -OC(O)NRⁿR^n', -OS(O)Rⁿ, -OS(O)₂Rⁿ, -SRⁿ, -S(O)Rⁿ, -S(O)₂Rⁿ, -S(O)NRⁿRⁿ, -S(O)₂NRⁿR^n', -OS(O)NRⁿR^n', -OS(O)₂NRⁿR^n', -NRⁿR^n', -NRⁿC(O)R^O, -NRⁿC(O)OR^O, -NRⁿC(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)R^O, -NRⁿS(O)₂R^O, -NRⁿS(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)₂NR^OR^O', -C(O)Rⁿ, -C(O)ORⁿ и -C(O)NRⁿR^n';

R^X и R^X' независимо выбраны из H, OH, N₃, CN, NO₂, SH, NH₂, ONH₂, NHNH₂, галогена, C_1-8 алкила, C_3-8 циклоалкила, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарила, C_5-20 арила или моно- или ди-C_1-8 алкиламино;

Y и Y' независимо выбраны из O, S и N(H);

R^X6 представляет собой C_3-12 алкилен, C_3-12 алкенилен или C_3-12 гетероалкилен;

R^X7 и R^X7' независимо выбраны из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_6-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -OR^r, -OC(O)R^r, -OC(O)NR^rR^r', -OS(O)R^r, -OS(O)₂R^r, -SR^r, -S(O)R^r, -S(O)₂R^r, -S(O)NR^rR^r', -S(O)₂NR^rR^r', -OS(O)NR^rR^r', -OS(O)₂NR^rR^r', -NR^rR^r', -NR^rC(O)R^s, -NR^rC(O)OR^s, -NR^rC(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)R^s, -NRR^s(O)₂R^s, -NRR^s(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)₂NR^sR^s, -C(O)R^r, -C(O)OR^s или -C(O)NR^rR^r';

каждый R^r, R^r', R^s и R^s независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила и 5-7-членного гетероарила;

каждый R^X8 и R^X8' независимо выбраны из H, C_1-6алкила, C_2-6алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 гетероалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -S(O)R^m, -S(O)₂R^m, -S(O)NR^mR^m', -S(O)₂NR^mR^m', -NR^mR^m', -NR^mC(O)R^m, -NR^mC(O)ORⁿ, -NR^mC(O)NRⁿR^n', -NR^mS(O)Rⁿ, -NR^mS(O)₂Rⁿ, -NR^mS(O)NRⁿR^n', -NR^mS(O)₂NRⁿR^n', -C(O)R^m, -C(O)OR^m и -C(O)NR^mR^m',

Z^a выбран из OR^X12a, NR^X12aR^X12a или SR^X12a;

Z^b выбран из OR^X13a, NR^X13aR^X13a или SR^X13a;

Z^a' выбран из OR^X12a, NR^X12aR^X12a или SR^X12a;

Z^b' выбран из OR^X13a', NR^X13a'R^X13a' или SR^X13a';

каждый из R^X12a, R^X12a', R^X13a' и R^X13a' независимо выбран из отсутствия, H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -C(O)R^X15a, -C(O)OR^X15a и -C(O)NR^X15aR^X15a'; и

каждый R^X15a и R^X15a' независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила;

где R^X13a и R^X14a, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, необязательно объединяются с образованием 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила или 3-7-членного гетероарила; и R^X13a и R^X14a, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, необязательно объединяются с образованием 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила или 3-7-членного гетероарила; и

где каждый Rⁿ, R^n', R^O, R^O', R^p и R^p' независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10арила и 5-7-членного гетероарила.

45. Конъюгат антитела по п.44, где каждый R^m независимо выбран из C_1-12 алкила, C_2-12 алкенила, C_2-12 алкинила, C_5-20 арила, C_5-20 гетероарила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклила, 3-7-членного гетероциклоалкила и 5-7-членного гетероарила,

где в случае, когда R^m необязательно замещен одним или более C_1-12 алкилом, C_2-12 алкенилом, C_2-12 алкинилом, C_5-20 арилом, C_5-20 гетероарилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом или 5-7-членным гетероарилом.

46. Конъюгат антитела по п.44 или 45, где R^X4 и R^X4' независимо выбраны из H, R^m, OH, OR^m, SH, SR^m, NH₂, NHR^m, NR^mR^m', NO₂, Me₃Sn, галогена, C_1-6 алкила, C_1-6алкокси, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-12 арила, 5-7-членного гетероарила, -CN, - NCO, -ORⁿ, -OC(O)Rⁿ, -OC(O)NRⁿR^n', -OS(O)Rⁿ, -OS(O)₂Rⁿ, -SRⁿ, -S(O)Rⁿ, -S(O)₂Rⁿ, -S(O)NRⁿR^n', -S(O)₂NRⁿR^n', -OS(O)NRⁿR^n', -OS(O)₂NRⁿR^n', -NRⁿR^n', -NRⁿC(O)R^O, -NRⁿC(O)OR^O, -NRⁿC(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)R^O, -NRⁿS(O)₂R^O, -NRⁿS(O)NR^OR^O', -NRⁿS(O)₂NR^O', -C(O)Rⁿ, -C(O)ORⁿ и -C(O)NR^n',

где в случае, когда R^X4 или R^X4' представляет собой C_1-6 алкил, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенил, C_2-6 алкинил, C_3-6 циклоалкил, 3-7-членный гетероциклоалкил, C_5-12 арил, 5-7-членный гетероарил, он необязательно замещен одним или более C_1-6 алкилом, C_1-6 алкокси, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C₃-C₆ циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_5-10 арилом, 5-7-членным гетероарилом, -OR^p, -OC(O)R^p, -OC(O)NR^pR^p', -OS(O)R^p, -OS(O)₂R^p, -SR^p, -S(O)R^p, -S(O)₂R^p, -S(O)NR^pR^p', -S(O)₂NR^pR^p', - OS(O)NR^pR^p', -OS(O)₂NR^pR^p', -NR^pR^p', -NR^pC(O)R^q, -NR^pC(O)OR^q, -NR^pC(O)NR^qR^q', -NR^pS(O)R^q, -NR^pS(O)₂R^q, -NR^p S(O)NR^qR^q', -NR^pS(O)₂NR^q', -C(O)R^p, -C(O)OR^p или -C(O)NR^p.

47. Конъюгат антитела по любому из пп.44-46, где R^X7 и R^X7' независимо выбраны из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_2-6 алкинила, C_3-6 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_6-10 арила, 5-7-членного гетероарила, -OR^r, -OC(O)R^r, -OC(O)NR^rR^r', -OS(O)R^r, -OS(O)₂R^r, -SR^r, -S(O)R^r, -S(O)₂R^r, -S(O)NR^rR^r', -S(O)₂NR^rR^r', -OS(O)NR^rR^r', -OS(O)₂NR^rR^r', -NR^rR^r', -NR^rC(O)R^s, -NR^rC(O)OR^s, -NR^rC(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)R^s, -NRR^s(O)₂R^s, -NRR^s(O)NR^sR^s, -NRR^s(O)₂NR^sR^s, -C(O)R^r, -C(O)OR^s или -C(O)NR^rR^r',

где в случае, когда R^X7 или R^X7' представляет собой C_1-6 алкил, C_2-6 алкенил, C_2-6 алкинил, C_3-6 циклоалкил, 3-7-членный гетероциклоалкил, C_6-10 арилов, 5-7-членный гетероарил, он необязательно замещен одним или более C_1-6 алкилом, C_2-6 алкенилом, C_2-6 алкинилом, C_3-6 циклоалкилом, 3-7-членным гетероциклоалкилом, C_6-10 арилом, 5-7-членным гетероарилом, -OR^t, -OC(O)R^t, -OC(O)NR^tR^t', -OS(O)R^t, -OS(O)₂R^t, -SR^t, -S(O)R^t, -S(O)₂R^t, -S(O)NR^tR^t', -S(O)₂NR^tR^t', -OS(O)NR^tR^t', -OS(O)₂NR^tR^t', -NR^tR^t', -NR^tC(О)R^u, -NR^tC(O)OR^u, -NR^tC(O)NR^uR^u', -NR^tS(О)R^u, -NR^tS(O)₂R^u, -NR^tS(O)NR^uR^u', -NR^tS(O)₂NR^u', -C(O)R^t, -C(O)OR^t или -C(O)NR^tR^t',

где каждый R^r, R^r', R^s, R^s, R^t, R^t', R^u и R^u' независимо выбран из H, C_1-7 алкила, C_2-7 алкенила, C_2-7 алкинила, C_3-13 циклоалкила, 3-7-членного гетероциклоалкила, C_5-10 арила и 5-7-членного гетероарила.

48. Конъюгат антитела по любому из пп.44-47, где:

R^X1 и R^X1' независимо выбраны из R^m; и

R^m выбран из C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила, C_5-7 арила и C_3-6 гетероарила.

49. Конъюгат антитела по любому из пп.44-48, где R^X2 R^X2', R^X3, R^X3', R^X5 и R^X5' независимо выбраны из H или OH.

50. Конъюгат антитела по любому из пп.44-49, где:

R^X4 и R^X4' независимо выбраны из R^m; и

R^m представляет собой C_1-6 алкокси.

51. Конъюгат антитела по любому из пп.44-50, где R^X4 и R^X4' независимо выбраны из метокси, этокси или бутокси.

52. Конъюгат антитела по любому из пп.44-51, где Y и Y' представляют собой O.

53. Конъюгат антитела по любому из пп.44-52, где:

R^X6 представляет собой C_3-12 алкилен, C_3-12 алкенилен, C_3-12 гетероалкилен, где:

R^X6 замещен -NH₂, -NHR^m, -NHC(O)R^m, -NHC(O)CH₂-[OCH₂CH₂]_n-R^XX, или -[CH₂CH₂O]_n-R^XX;

где R^XX выбран из H, OH, N₃, CN, NO₂, SH, NH₂, ONH₂, NHNH₂, галогена, C_1-8 алкила, C_3-8 циклоалкила, C_1-8 алкокси, C_1-8 алкилтио, C_3-20 гетероарила, C_5-20 арила или моно- или ди-C_1-8 алкиламино; и

n является целым числом от 1 до 6.

54. Конъюгат антитела по любому из пп.4-53, где действующее вещество является димером пирролбензодиазепина, представленным Формулой XII или Формулой XIII:

где:

X^a и X^a' независимо выбраны из связи или C_1-6 алкилена;

каждый Z^X' и Z^X независимо выбран из водорода, C_1-8 алкила, галогена, циано, нитро, , и -(CH₂)_m-OCH₃;

каждый R⁸⁰, R⁹⁰ и R¹⁰⁰ независимо выбран из водорода, C_1-8 алкила, C_2-6 алкенила, C_1-6 алкокси, алкоксиалкила и -(CH₂CH₂O)_m-(CH₂)_m2CH₃; и

m равно целому числу от 0 до 12 и

m2 равно целому числу от 1 до 12.

55. Конъюгат антитела по п.4, где каждый Z^X' и Z^X независимо выбран из водорода, , и -(CH₂)_m-OCH₃;

каждый R⁸⁰, R⁹⁰ и R¹⁰⁰ независимо выбран из водорода, C_1-3 алкила и C_1-3 алкокси; m является целым числом от 1 до 6.

56. Конъюгат антитела по любому из пп.4-55, где действующим веществом является:

,

,

57. Конъюгат антитела по любому из пп.4-56, где L содержит .

58. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с патологической экспрессией CD19, выбранного из рака, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания, содержащая конъюгат антитела, которое связывается с СD19, по любому из предыдущих пунктов и вспомогательное вещество.

59. Применение конъюгата антитела по любому из пп.1-57 для лечения заболевания, связанного с патологической экспрессией CD19, выбранного из рака, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания.

60. Применение по п.59, где конъюгат предназначен для лечения рака и рак выбран из лейкоза, лимфомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака яичника, рака мочевого пузыря, рака предстательной железы, глиомы, рака легкого, рака бронхов, рака толстой и прямой кишки, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака печени, рака мочевого пузыря, рака почки, рака почечной лоханки, рака ротовой полости, рака глотки, рака тела матки или меланомы.

61. Применение по п.59, где конъюгат предназначен для лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания и где аутоиммунные заболевания или воспалительное заболевание выбраны из опосредованных B-клетками аутоиммунных заболеваний или воспалительных заболеваний, например, системной красной волчанки (СКВ), ревматоидного артрита (РА), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ИТП), гипергаммаглобулинемии Вальденстрема, синдрома Шегрена, рассеянного склероза (РС) или волчаночного нефрита.

62. Применение конъюгата антитела по любому из пп.1-57 для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с патологической экспрессией CD19, выбранного из рака, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания.

63. Способ лечения заболевания, связанного с патологической экспрессией CD19, выбранного из рака, аутоиммунного заболевания и воспалительного заболевания, включающий введение конъюгата антитела по любому из пп.1-57.