БИПАРАТОПНЫЕ FR-АЛЬФА АНТИТЕЛА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ Российский патент 2024 года по МПК C07K14/705 C07K16/28 C07K16/46 A61K39/395 A61K45/06 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Область этого раскрытия в целом относится к бипаратопным антителам и иммуноконъюгатам, которые связываются с человеческим рецептором фолиевой кислоты 1 (FRα).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Рак представляет собой одну из основных причин смерти в развитом мире: только в Соединенных Штатах ежегодно рак диагностируется у более миллиона человек, и ежегодно умирает 500000 человек. В целом, по оценкам, более чем у 1 из 3 человек в течение жизни разовьется какая-либо форма рака.

[0003] Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), состоящие из высокоцитотоксических агентов, конъюгированных с антителами, которые связываются с антигенами, ассоциированными с опухолью, представляют собой многообещающую терапевтическую стратегию для повышения эффективности антител, направленных на опухоль. ADC предлагают возможность сочетать благоприятную фармакокинетику, биораспределение и нацеленность на опухоль антител с мощным механизмом уничтожения клеток, обеспечиваемым присоединенной небольшой молекулой или полезной нагрузкой.

[0004] Рецептор фолиевой кислоты-α (FRα или FOLR1) представляет собой гликозилфосфатидилинозитол-связанный гликопротеин клеточной поверхности, который имеет высокое сродство к фолатам. Его физиологическая роль в нормальных и раковых тканях еще полностью не выяснена. Большинство нормальных тканей не экспрессируют FRα, и транспорт физиологических фолатов в большинство клеток считается опосредованным несколькими другими белками, в первую очередь восстановленным носителем фолиевой кислоты. Высокие уровни FRα были обнаружены при серозном и эндометриоидном эпителиальном раке яичников, аденокарциноме эндометрия и немелкоклеточном раке легкого подтипа аденокарциномы. Важно отметить, что экспрессия FRα сохраняется в метастатических очагах и рецидивирующих карциномах у пациентов с раком яичников, а также после химиотерапии при эпителиальном раке яичников и эндометрия. Эти свойства вместе с сильно ограниченной экспрессией FRα в нормальных тканях делают FRα очень многообещающей мишенью для таргетной терапии, такой как ADC.

[0005] Мирветуксимаб соравтансин (IMGN853), ADC, нацеленный на фолат, который включает нацеленное на FRα антитело, конъюгированное с мощным тубулин-действующим майтанзиноидом, DM4, недавно был протестирован в клинике у пациентов с устойчивым к препаратам платины раком яичников, демонстрирующих средний и высокий уровни FRα. В исследовании FORWARD I фазы 3 было рандомизировано 2:1 среди 366 пациентов, которые получали либо мирветуксимаб соравтансин, либо химиотерапию с одним агентом (пегилированный липосомальный доксорубицин, топотекан или паклитаксел еженедельно). В то время как исследование не достигло своей основной конечной точки улучшения выживаемости без прогрессирования (PFS) (при общем соотношении рисков популяции (HR)=0,98, р=0,897), предварительно заданная субпопуляция с высоким FRα (218/366) показала общий уровень ответа 24% при лечении IMGN853 по сравнению с 10% при стандартной химиотерапии. Кроме того, в предварительно определенной подгруппе с высоким FRα PFS была дольше у пациентов, получавших IMGN853, по сравнению с химиотерапией (HR=0,69, р-значение=0,049), а общая выживаемость была больше у пациентов, получавших IMGN853, по сравнению с химиотерапией (HR=0,62, значение р=0,033). Хотя эти результаты обнадеживают пациентов с высокими уровнями FRα, результаты также продемонстрировали ограничения IMGN853 в улучшении выживаемости без прогрессирования в более широкой популяции пациентов.

[0006] Таким образом, остается потребность в идентификации дополнительных ADC, нацеленных на фолат, которые могут привести к еще более эффективному лечению и более высокой доставке ADC.

СУЩНОСТЬ РАСКРЫТИЯ

[0007] В данном документе предложено бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с человеческим рецептором фолиевой кислоты 1 (FRα), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (а) первый FRα-связывающий домен, который включает первую вариабельную тяжелую цепь (VH) и первую вариабельную легкую цепь (VL), которые связываются с первым эпитопом FRα; и (b) второй FRα-связывающий домен, который содержит вторую VH и вторую VL и который связывается со вторым эпитопом FRα.

[0008] В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен специфически связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 25 и 26, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен специфически связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 57 и 26, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 25 и 26, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 57 и 26, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления второй FRα-связывающий домен специфически связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 22 или 23 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 17 или 18. В некоторых вариантах осуществления второй FRα-связывающий домен конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH из SEQ ID NO: 22 или 23 и аминокислотную последовательность VL из SEQ ID NO: 17 или 18.

[0009] В некоторых вариантах осуществления первая VH содержит VH CDR1-3, содержащие аминокислотные последовательности из (а) SEQ ID NO: 10-12 или (b) SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно, и первая VL содержит VL CDR1-3, содержащие аминокислотные последовательности из SEQ ID NO: 4-6 соответственно. В некоторых вариантах осуществления первая VH содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 25 и 26, и/или первая VL содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 57 и 26, и аминокислотную последовательность VL, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20 и 21. В некоторых вариантах осуществления вторая VH содержит VH CDR1-3, содержащие аминокислотные последовательности (а) SEQ ID NO: 7-9 или (b) SEQ ID NO: 13, 14 и 9 соответственно, и вторая VL содержит VL CDR1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3 соответственно. В некоторых вариантах осуществления вторая VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или 23 и/или вторая VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или 18.

[0010] В некоторых вариантах осуществления первая пара VH и VL и/или вторая пара VH и VL являются мышиными, нечеловеческими, гуманизированными, химерными, поверхностными или человеческими. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим FRα, но не с FOLR2 или FOLR3. В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления scFv первого FRα-связывающего домена имеет пептидную ориентацию VH-линкер-VL. В некоторых вариантах осуществления scFv первого FRα-связывающего домена имеет пептидную ориентацию VL-линкер-VH. В некоторых вариантах осуществления второй FRα-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления scFv второго FRα-связывающего домена имеет пептидную ориентацию VH-линкер-VL. В некоторых вариантах осуществления scFv второго FRα-связывающего домена имеет пептидную ориентацию VL-линкер-VH. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой глицин-сериновый линкер.

[0011] В некоторых вариантах осуществления второй FRα-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27-29.В некоторых вариантах осуществления первый FRα-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 30-32. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытое в данном документе, содержит аминокислотную последовательность из (i) SEQ ID NO: 33 и 34, (ii) SEQ ID NO: 35 и 36, (iii) SEQ ID NO: 37 и 38, или (iv) SEQ ID NO: 39 и 40.

[0012] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности из SEQ ID NO: 41-43.

[0013] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 44-46.

[0014] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой четырехвалентное бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой двухвалентное бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающие домены, выбранные из группы, состоящей из тандемных scFv, диатела, триатела, тетратела и структуры «выступ во впадину». В некоторых вариантах осуществления t бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет структуру «выступ во впадину» (KIH).

[0015] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα связывающий домен, где FRα связывающий домен содержит SEQ ID NO: 1-3, а 7-9 находится на стороне выступа структуры KIH. В некоторых вариантах осуществления FRα связывающий домен содержит SEQ ID NO: 1-3, а 7-9находится на стороне выступа в структуре KIH. В некоторых вариантах осуществления FRα связывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 4-6 и 10-12, находится на стороне выступа структуры KIH. В некоторых вариантах осуществления FRα связывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 4-6 и 10-12, находится на стороне впадины структуры KIH.

[0016] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полноразмерное тело. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит первый FRα-связывающий домен, где первый FRα-связывающий домен представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит второй FRα-связывающий домен, где второй FRα-связывающий домен представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающий фрагмент В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит первый FRα-связывающий домен, где первый FRα-связывающий домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит второй FRα-связывающий домен, где второй FRα-связывающий домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41-43.

[0017] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена комбинация выделенных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрытые в данном документе.

[0018] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен выделенный вектор, содержащий одну из молекул нуклеиновой кислоты, раскрытых в данном документе.

[0019] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрена клетка-хозяин, содержащая комбинацию выделенных молекул нуклеиновой кислоты, как раскрыто в данном документе, или выделенный вектор, как раскрыто в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожжей, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, BW, LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, клетки BMT10, клетки растений, клетки насекомых и клетки человека в культуре ткани.

[0020] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена фармацевтическая композиция, содержащая бипаратопное антитело или антиген, раскрытые в данном документе, комбинацию молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, вектора, раскрытого в данном документе, или клетки-хозяина, раскрытой в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в данном документе, содержит бипаратопное антитело, раскрытое в данном документе, и фармацевтический носитель или наполнитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 1 до 10 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 2 до 5 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 3 до 4 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0021] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предоставляется способ получения бипаратопного антитела, как описано в данном документе, включающий (а) культивирование клетки, экспрессирующей антитело; и (b) выделение антитела из культивируемой клетки. В некоторых вариантах осуществления культивируемая клетка представляет собой эукариотическую клетку.

[0022] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предоставляется иммуноконъюгат, представленный следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

СВ представляет собой любое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе;

L₂ представлен одной из следующих формул:

где:

R^x, R^y, R^x' и R^y' для каждого случая независимо представляют собой Н, -ОН, галоген, -O-(C_1-4 алкил), -SO₃H, -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺ или С_1-4 алкил, необязательно замещенный ОН, галогеном, SO₃H или NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, где R₄₀, R₄₁ и R₄₂ каждый независимо представляет собой Н или С_1-4 алкил;

l и k каждый независимо равны целому числу от 1 до 10;

l1 равен целому числу от 2 до 5;

k1 равен целому числу от 1 до 5; и

s1 указывает сайт, соединенный с агентом связывания клетки СВ, a s3 указывает сайт, присоединенный к группе А;

А представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R¹ и R² каждый независимо представляет собой Н или С_1-3алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

-CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(=O)-

где R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой Н или Me, и фрагмент -С(=O)- в L₁ соединен с D;

D представлен следующей формулой:

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[0023] В некоторых вариантах осуществления все R^x, R^y, R^x' и R^y' иммуноконъюгата представляют собой Н; и l и k каждый независимо представляют собой целое число от 2 до 6. В некоторых вариантах осуществления А иммуноконъюгата представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.

[0024] В некоторых вариантах осуществления А иммуноконъюгата выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, D-Val-Ala, Val-Cit, D-Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N⁹-тозил-Arg, Phe-N⁹-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 54), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 56), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, D-Ala-Pro, и D-Ala-tBu-Gly, где первая аминокислота в каждом пептиде соединена с группой L₂, а последняя аминокислота в каждом пептиде соединена с -NH-CR¹R²-S-L₁-D В некоторых вариантах осуществления R¹ и R² иммуноконъюгата оба представляют собой Н. В некоторых вариантах осуществления L₁ иммуноконъюгата представляет собой -(СН₂)_4-6-С(=O)-.

[0025] В некоторых вариантах осуществления D иммуноконъюгата представлен следующей формулой:

[0026] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

представляет собой любое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе, соединенные с группой L₂ через аминогруппу Lys;

представляет собой любое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе, соединенные с группой L₂ через тиоловую группу Cys;

R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой Н или Me;

m1, m3, n1, r1, s1 и t1 каждый независимо равны целому числу от 1 до 6;

m2, n2, r2, s2 и t2 каждый независимо равны целому числу от 1 до 7;

t3 равен целому числу от 1 до 12;

D₁ представлен следующей формулой:

[0027] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

где:

m1 и m3 каждый независимо равны целому числу от 2 до 4;

m2 равен целому числу от 2 до 5;

r1 равен целому числу от 2 до 6; и

r2 равен целому числу от 2 до 5.

[0028] В некоторых вариантах осуществления А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro, или D-Ala-tBu-Gly, и

[0029] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro, или D-Ala-tBu-Gly, и

D₁ представлен следующей формулой:

[0030] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

где D₁ представлен следующей формулой:

[0031] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

где:

СВА представляет собой любое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе;

q равно целому числу от 1 до 10, например, 1 или 10;

D₁ представлен следующей формулой:

[0032] В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[0033] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

СВА представляет собой бипаратопное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41-43;

D₁ представлен следующей формулой:

q равен целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[0034] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт иммуноконъюгат, имеющий формулу (А)-(L)-(С), где:

(А) представляет собой любое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе;

(L) представляет собой линкер; и

(С) представляет собой цитотоксический агент, где линкер (L) связывает (А) с (С).

[0035] В некоторых вариантах осуществления линкер иммуноконъюгата, описанного в данном документе, выбран из группы, состоящей из расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера, гидрофильного линкера и линкера на основе дикарбоновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления линкер выбран из группы, состоящей из N-(γ малеимидобутрилокси)сульфосукцинимидного сложного эфира (сульфо-GMBS или sGMBS), N-сукцинимидилового сложного эфира γ малеимидомасляной кислоты (GMBS), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноата (сульфо-SPDB); N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноата (SPP) или N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфопентаноата (сульфо-SPP); N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (SPDB), N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC); N-сульфосукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (сульфоSМСС); N-сукцинимидил-4-(иодацетил)аминобензоата (SIAB) и сложного эфира N-сукцинимидил-[(N-малеимидопропионамидо)тетраэтиленгликоля] (NHS-PEG4-малеимид).

[0036] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой сульфо-GMBS.

[0037] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой GMBS.

[0038] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой сульфо-SPDB.

[0039] В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент иммуноконъюгата, описанный в данном документе, выбран из группы, состоящей из майтанзиноида, аналога майтанзиноида, бензодиазепина, таксоида, СС-1065, аналога СС-1065, дуокармицина, аналога дуокармицина, калихеамицина, доластатина, аналога доластатина, ауристатина, производного томаймицина и производного лептомицина или пролекарства агента. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент представляет собой майтанзиноид.

[0040] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат дополнительно содержит второй (С). В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат дополнительно содержит третий (С). В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат дополнительно содержит четвертый (С).

[0041] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена композиция, содержащая по меньшей мере один иммуноконъюгат, как раскрыто в настоящем документе, при этом иммуноконъюгат содержит в среднем 3-4 С на А.

[0042] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноконъюгат, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 1 до 10 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 2 до 5 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 3 до 4 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0043] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в данном документе, иммуноконъюгата, как раскрыто в данном документе, или фармацевтических композиций, как раскрыто в данном документе.

[0044] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлен способ лечения рака. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичника, рак матки, рак брюшины, рак маточной трубы, рак эндометрия, рак легких или рак головного мозга. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичника. В некоторых вариантах осуществления рак яичника представляет собой резистентный к препаратам платины эпителиальный рак яичника. В некоторых вариантах осуществления рак яичника представляет собой рецидивирующий эпителиальный рак яичника.. В некоторых вариантах осуществления рак яичника представляет собой рефракторный к препаратам платины эпителиальный рак яичников. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак матки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак брюшины. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак маточной трубы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак эндометрия. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак головного мозга. В определенных вариантах осуществления рак является резистентным к IMGN853.

[0045] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение стероида.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0046] На ФИГ. 1 показана конкуренция связывания huMov19-биотина с антителами рецептора фолиевой кислоты FR57; FRα-антитело A («FRα-A»); FRα-антитело В («FRα-B»); FRα-антитело С («FRα-C»); и небиотинилированный huMov19 («huMov19») с помощью FACS. (См. Пример 1.)

[0047] На ФИГ. 2 показаны типичные молекулы, характеристики и схемы для обычных моноспецифических антител (таких как huMov19 и FR57), двухвалентных бипаратопных антител типа «выступ во впадину» (KIH) и четырехвалентных бипаратопных (по Моррисону) антител. (См. Пример 1.)

[0048] На ФИГ. 3 показан гель с несколькими коэффициентами трансфекции плазмид тяжелой и легкой цепей, которые использовали для получения молекул на основе асимметричного Fc. L1: трансфекция только с FR57scFv-выступ; L2: трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 4:4:1; L3: трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 6:2:1; L4: трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 6:6:1; L5: трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 9:3:1; L6: трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 2:3:1; L7 трансфекция Mov19LC: Mov19HC-впадина: FR57scFv-выступ при 1:1:1; L8: трансфекция Mov19LC: Mov19-впадина при 3:1; L9: трансфекция изотипа человеческого IgG1. (См. Пример 1.)

[0049] На ФИГ. 4А-4Н показана связывающая активность антител Моррисона или их фрагментов с помощью конкурентной FACS. (См. Пример 2.) В частности, на ФИГ. 4А показана связывающая активность Mov19-G1-FR57scFv1 (M9346A-FR57scFv); на ФИГ. 4В показана связывающую активность FR57-G1-Mov19scFv1 (FR57-M9346AscFv); на ФИГ. 4С показана связывающая активность Mov19-G1-FRα-антитело-A-scFv1 (M9346A-FR-α-A: scFv); на ФИГ. 4D показана связывающая активность FRα-антитело-A-G1-Mov19scFv1 (FR-α-А: M9346AscFv); на ФИГ. 4Е показана связывающая активность FRα-антитело-A-scFv2-G1-Mov19 (FR-α-A: scFv-M9346A); на ФИГ. 4F показана связывающая активность FRα-антитело-B-scFv2-G1-Mov19 (FR-α-B: scFV-M9346A); на ФИГ. 4G показана связывающая активность FRα-Антитело-C-scFv2-G1-Mov19 (FR-α-C: scFv-M9346A); и на ФИГ. 4Н показана связывающая активность FR57scFv2-G1-Mov19 (FR57scFv-M9346A).

[0050] На ФИГ.5 показан гель SDS PAGE трех очищенных препаратов (P1, Р2 и Р3) антитела FR57scFv2-knob-Mov19-hole в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. Антитело FR57scFv2-выступ-Mov19-впадина представляет собой бипаратопное антитело в формате выступ-во-впадину (KIH) с FR57 scFv на стороне выступа антитела и последовательностями антитела huMov19 на стороне впадины антитела. (См. Пример 2.)

[0051] На ФИГ. 6 показано наложение результатов эксклюзионной хроматографии, полученных для образцов на день 0 и день 14 антитела FR57scFv2-выступ-Mov19-впадина. mAU: миллиабсорбционные единицы. (См. Пример 2.)

[0052] На ФИГ. 7А-7F показаны связывание (ФИГ. 7А и 7В), интернализация и обработка (ФИГ. 7С и 7D) и деградация (ФИГ. 7Е и 7F) бипаратопного антитела типа выступ-во-hole (KIH) (ФИГ. 7А, 7С и 7Е) или четырехвалентного бипаратопного антителам (ФИГ 7В, 7D и 7F) по сравнению с антителом huMov19 («родительским»). (См. Пример 2.)

[0053] На ФИГ. 8 показан средний объем опухоли в модели ксенотрансплантата OV-90 после введения носителя, иммуноконъюгата, содержащего четырехвалентное бипаратопное антитело («Тетравалентный-s-SPDB-DM4»), или иммуноконъюгата, содержащего антитело huMov19 («M-s-SPDB-DM4»). (См. Пример 4.)

[0054] На ФИГ. 9 показан средний объем опухоли в модели ксенотрансплантата Igrov-1 после введения носителя, Тетравалентного-s-SPDB-DM4 или M-s-SPDB-DM4. (См. Пример 4.)

[0055] На ФИГ. 10 показан средний объем опухоли в модели ксенотрансплантата OV-90 после введения носителя, иммуноконъюгата, содержащего бипаратопное антитело «выступ во впадину» («KIH-s-SPDB-DM4») или M-s-SPDB-DM4. (См. Пример 4.)

[0056] На ФИГ. 11 показана цитотоксическая активность иммуноконъюгатов, содержащих антитело FR57 (FR57-L-DM21) или антитело huMov19 (M-L-DM21), против клеток KB. (См. Пример 5.)

[0057] На ФИГ. 12А-12Е показаны цитотоксическая активность бипаратопного иммуноконъюгата KIH-DM21, иммуноконъюгата huMov19 M-DM21 и иммуноконъюгата huMov19 M-s-SPDB-DM4 против панели FRα-положительных клеточных линий, включая клетки KB (ФИГ. 12А), клетки Igrov-1 (ФИГ. 12В), клетки JEG-3 (ФИГ. 12С), клетки T47D (ФИГ. 12D) и клетки JHOS-4 (ФИГ. 12Е). (См. Пример 5.)

[0058] На ФИГ. 13A-13D показаны iin vitro убивающую свидетелей активность бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21, иммуноконъюгата huMov19 ML-DM21 и иммуноконъюгата huMov19 M-s-SPDB-DM4 в отрицательных-мишенях клетках Namalwa/luc, смешанных с клетками KB (ФИГ. 13А), клетками Igrov-1 (ФИГ. 13В), клетками JEG-3 (ФИГ. 13С) и клетками T47D (ФИГ. 13D). (См. Пример 5.)

[0059] На ФИГ. 14А и 14В показаны средние объемы опухоли после введения бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21 и иммуноконъюгата huMov19 M-L-DM21 (ФИГ. 14) или бипаратопного иммуноконъюгата KIH-S-SPDB-DM4 и иммуноконъюгата huMov19 M-s-SPDB-DM4 (ФИГ. 14В) к модели ксенотрансплантата ОВ-90. (См. Пример 6.)

[0060] На ФИГ. 15 показан средний объем опухоли после введения бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21, иммуноконъюгата с моделью ксенотрансплантата Ishikawa, по сравнению с носителем, иммуноконъюгатом huMov19 ML-DM21 или иммуноконъюгатом huMov19 M-s-SPDB-DM4 («IMGN853»;). (См. Пример 6.).

[0061] На ФИГ.16 показан средний объем опухоли после введения бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21 в модель ксенотрансплантата Igrov-1 по сравнению с носителем, иммуноконъюгатом huMov19 M-L-DM21 или иммуноконъюгатом huMov19 IMGN853. (См. Пример 6.)

[0062] На ФИГ. 17 показан средний объем опухоли после введения бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21 в модель ксенотрансплантата KB по сравнению с носителем, иммуноконъюгатом huMov19 M-L-DM21 или иммуноконъюгатом huMov19 М-s-SPDB-DM4. (См. Пример 7.)

[0063] На ФИГ. 18А и 18В показана токсичность бипаратопного иммуноконъюгата KIH-sSPDB-DM21 (ФИГ. 18А) и иммуноконъюгата huMov19 M-s-SPDB-DM4 («IMGN853») (ФИГ. 18В) по сравнению с полным антителом (TAb: общее антитело; конъюгированные и неконъюгированные). (См. Пример 7.)

[0064] На ФИГ. 19 показан средний объем опухоли после введения бипаратопного иммуноконъюгата KIH-L-DM21 в модель ксенотрансплантата карциномы шейки матки человека, резистентную к IMGN853, по сравнению с носителем, иммуноконъюгатом huMov19 M9346A-DM21-L или иммуноконъюгатом huMov19 IMGN853. (См. Пример 6.)

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ

I. Определения

[0065] Для облегчения понимания данного раскрытия ниже определен ряд терминов и фраз.

[0066] Термины «рецептор фолиевой кислоты 1 человека», «FRα», «рецептор фолиевой кислоты альфа (FR-α)» или «FOLR1» в контексте данного описания относятся к любому природному FRα полипептиду человека, если не указано иное. Термин «FRα» охватывает «полноразмерный» необработанный полипептид FRα, а также любую форму полипептида FRα, которая является результатом процессинга внутри клетки. Термин также охватывает встречающиеся в природе варианты FRα, например, кодируемые вариантами сплайсинга и аллельными вариантами. Описанные в данном документе FRα полипептиды могут быть выделены из множества источников, таких как типы тканей человека или из другого источника, или получены рекомбинантными или синтетическими методами. Где конкретно указано, «FRα» может использоваться для обозначения нуклеиновой кислоты, которая кодирует FRα полипептид. Последовательности FRα человека известны и включают, например, последовательности, общедоступные в UniProtKB под номером доступа Р15328 (включая изоформы). Используемый в данном документе термин «FRα человека» относится к FRα, содержащей последовательность SEQ ID NO: 53.

[0067] Термин «анти-FRα антитело» или «антитело, которое связывается с FRα» относится к антителу, которое способно связывать FRα с достаточной аффинностью, так что антитело пригодно в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на FRα. В контексте данного документа такие антитела включают, например, биспецифические (например, бипаратопные) антитела. Если не указано иное, степень связывания анти-FRα антитела с неродственным, не-FRα белком составляет менее около 10% связывания антитела с FRα, как измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). Примеры FRα антител известны в данной области и раскрыты в опубликованных заявках США №№2012/0009181 и 2012/0282175, а также в патенте США №9200073 В2 и публикации РСТ WO 2011/106528 А1, каждая из которых включена в полном объеме в качестве ссылки в данный документ. Последовательности типичных анти-FRα антител и их антигенсвязывающих фрагментов представлены в Таблицах 1-8.

[0068] Термин «IMGN853» (также известный как «мирветуксимаб соравтансин») относится к иммуноконъюгату, описанному в данном документе, содержащему антитело huMov19 (или М9346А), линкер сульфо-SPDB и майтанзиноид DM4. Антитело «huMov19» (или «М9346А») представляет собой анти-FRα антитело, содержащее полноразмерную тяжелую цепь SEQ ID NO: 47 (содержащую последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 24, которая подчеркнута в контексте SEQ ID NO: 47 ниже) и полноразмерную легкую цепь SEQ ID NO: 48 (содержащую последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 19, которая подчеркнута в контексте SEQ ID NO: 48 ниже).

[0069] Антитело huMov19 (М9346А) кодируется плазмидами, депонированными в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу: 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, 7 апреля 2010 г. в соответствии с условиями Будапештского договора и имеющими АТСС депозитарные номера РТА-10772 и РТА-10773 или 10774. DM4 относится к N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил) майтанзиноиду. «Сульфо-SPDB» относится к линкеру N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноату).

[0070] Термины «повышенный» FRα, «повышенная экспрессия» FRα или «сверхэкспрессия» FRα в конкретной опухоли, ткани или клеточном образце относятся к FRα (полипептид FRα или нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид), который присутствует в уровень выше, чем тот, который присутствует в здоровой или без хронических заболеваний (нативной, дикого типа) ткани или клетках того же типа или происхождения. Такая повышенная экспрессия или сверхэкспрессия может быть вызвана, например, мутацией, амплификацией гена, повышенной транскрипцией, повышенной трансляцией или повышенной стабильностью белка.

[0071] Экспрессию FRα можно измерить с помощью иммуногистохимии и присвоить «балл интенсивности окрашивания» или «балл однородности окрашивания» по сравнению с калиброванными контролями, показывающими определенные баллы (например, тестируемому образцу присваивается балл интенсивности 3, если интенсивность сопоставима с калиброванным контролем уровня 3 или интенсивность 2 присваивается исследуемому образцу, если интенсивность сравнима с калиброванным контролем уровня 2). Например, оценка 1, 2 или 3, предпочтительно оценка 2 или 3, по данным иммуногистохимии, указывает на повышенную экспрессию FRα. Однородность окрашивания, которая является гетерогенной или гомогенной, также указывает на экспрессию FRα. Показатели интенсивности окрашивания и однородности окрашивания можно использовать отдельно или в комбинации (например, 2 гомо, 2 гетеро, 3 гомо, 3 гетеро и т.д.). Однородность окрашивания также может быть выражена как процент (%) окрашивания клеток с определенной интенсивностью (например, 25% клеток окрашиваются с интенсивностью 1, 2 или 3; 50% клеток окрашиваются с интенсивностью 1, 2 или 3).; 70% клеток окрашиваются с интенсивностью 1, 2 или 3. В другом примере увеличение экспрессии FRα может быть определено путем обнаружения увеличения по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза или по меньшей мере в 5 раз по сравнению с контрольными значениями (например, уровень экспрессии в ткани или клетке от субъекта без рака или с раком, который не имеет повышенных значений FRα). FRα экспрессию можно измерить с помощью иммуногистохимии и получить визуальную оценку, где положительный FRα может относиться к большему или равному 50% опухолевых клеток с окрашиванием мембраны FRα, видимым при объективе микроскопа, меньшем или равном 10Х.

[0072] Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеперечисленного, через по крайней мере один сайт узнавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин «антитело» охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, если антитела проявляют желаемую биологическую активность. В контексте данного документа такие антитела включают, например, биспецифические (например, бипаратопные) антитела. Антитело может быть любого из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) на основе идентичности их константных доменов тяжелой цепи обозначаемые как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют разные и хорошо известные структуры субъединиц и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.

[0073] Термин «фрагмент антитела» или «его фрагмент антитела» относится к части интактного антитела. «Антигенсвязывающий фрагмент» относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать определяющие антиген вариабельные области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела и одноцепочечные антитела. Фрагменты антитела могут быть голыми или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.

[0074] «Моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к популяции гомогенных антител или антигенсвязывающих фрагментов, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это контрастирует с поликлональными антителами, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных антигенных детерминант. Термин «моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт узнавания антигена. Кроме того, «моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к таким антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, полученным любым количеством способов, включая, но не ограничиваясь, гибридомой, фаговой селекцией, рекомбинантной экспрессией и трансгенными животными.

[0075] Термин «гуманизированное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител или антигенсвязывающим фрагментам, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулина, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальное количество нечеловеческих (например, мышиные) последовательности. Обычно гуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), заменены остатками из CDR не относящихся к человеку видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемые специфичность, сродство и способность («привитые CDR») (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками в антителе или фрагменте из не относящихся к человеку видов, которые обладают желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно дополнительно модифицировать заменой дополнительных остатков в каркасной области Fv и/или в замененных нечеловеческих остатках для уточнения и оптимизации специфичности, аффинности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или способности. В общем, гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будет включать практически все из, по меньшей мере, одного, а обычно двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или практически все области CDR, которые соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину, тогда как все или в значительной степени все области FR являются областями консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также может содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Примеры методов, используемых для создания гуманизированных антител, описаны в патенте США №5225539; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 (3): 969-973 (1994), и Roguska et al., Protein Eng. 9 (10): 895-904 (1996). В некоторых вариантах осуществления «гуманизированное антитело» представляет собой антитело с измененной поверхностью.

[0076] «Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR и вместе с CDR из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Существует как минимум два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой изменчивости последовательностей (например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.), «Kabat»); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). Кроме того, комбинации этих двух подходов иногда используются в данной области для определения CDR.

[0077] «Константная» область антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

[0078] Система нумерации Kabat обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) ("Kabat").

[0079] Нумерация аминокислотных положений, как в Kabat, относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи при компиляции антител в Kabat et al. (Sequences of Immunological Interest. 5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), ("Kabat"). При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку одной аминокислоты (остаток 52а по Kabat) после остатка 52 Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. согласно Kabat) после остаток 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной последовательностью по Kabat. Вместо этого Chothia указывает на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли Chothia CDR-H1 при нумерации с использованием соглашения о нумерации Kabat варьируется между Н32 и Н34 в зависимости от длины петли (это потому, что схема нумерации Kabat помещает вставки в Н35А и Н35В; если ни 35А, ни 35В не присутствует, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35А, петля заканчивается на 33; если присутствуют и 35А, и 35В, петли заканчивается на 34) Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями Chothia и используются программой моделирования антител Oxford Molecular's AbM

[0080] Термин «человеческое» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, продуцируемый человеком, или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую полученному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, сделано человеком с использованием любой техники, известной в данной области техники. Это определение человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включает интактные или полноразмерные антитела и их фрагменты.

[0081] Термин «химерные» антитела или их антигенсвязывающие фрагменты относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, в которых аминокислотная последовательность происходит от двух или более видов. Обычно вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител или их антигенсвязывающих фрагментов, происходящих от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т.д.) с желаемой специфичностью, аффинностью и способностью, в то время как константные области гомологичны последовательностям в антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, полученных от другого (обычно человека), чтобы избежать индукции иммунного ответа у этого вида.

[0082] Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, которая способна распознаваться и специфически связываться с конкретным антителом. Когда антиген представляет собой полипептид, эпитопы могут быть образованы как из смежных аминокислот, так и из несмежных аминокислот, наложенных друг на друга посредством третичной укладки белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, обычно сохраняются при денатурировании белка, тогда как эпитопы, образованные в результате третичного фолдинга, обычно теряются при денатурировании белка. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, а чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

[0083] «Аффинность связывания» обычно относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в контексте данного документа «аффинность связывания» относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Сродство молекулы X к ее партнеру Y обычно можно представить константой диссоциации (Kd). Аффинность можно измерить обычными методами, известными в данной области, включая описанные в данном документе. Антитела с низкой аффинностью обычно связывают антиген медленно и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как антитела с высокой аффинностью обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из которых может быть использован для целей данного раскрытия.

[0084] «Или лучше» при использовании в данном документе для обозначения аффинности связывания относится к более сильному связыванию между молекулой и ее партнером по связыванию. «Или лучше» при использовании в данном документе относится к более сильному связыванию, представленному меньшим числовым значением Kd. Например, для антитела, которое имеет сродство к антигену «0,6 нМ или лучше», сродство антитела к антигену составляет <0,6 нМ, то есть 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т.д. или любое значение менее 0,6 нМ.

[0085] Под «специфически связывается» обычно подразумевается, что антитело связывается с эпитопом через свой антигенсвязывающий домен, и что связывание влечет за собой некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, антитело, как говорят, «специфически связывается» с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом через свой антигенсвязывающий домен более легко, чем оно могло бы связываться со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в данном документе для определения относительной аффинности, с помощью которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно считать, что антитело «А» имеет более высокую специфичность к данному эпитопу, чем антитело «В», или можно сказать, что антитело «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем оно имеет для родственного эпитопа «D».

[0086] Под «предпочтительно связывается» подразумевается, что антитело специфически связывается с эпитопом более легко, чем оно могло бы связываться с родственным, подобным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антитело, которое «предпочтительно связывается» с данным эпитопом, с большей вероятностью будет связываться с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже если такое антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом.

[0087] Говорят, что антитело «конкурентно ингибирует» связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом или перекрывающимся эпитопом до такой степени, что оно до некоторой степени блокирует связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым методом, известным в данной области, например, конкурентным анализом ELISA. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.

[0088] Фраза «практически аналогичный» или «практически такой же» в контексте данного документа обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (обычно одно связано с антителом по раскрытию, а другое - с эталонным антителом/антителом сравнения), таким образом, чтобы специалист в данной области техники считал, что разница между двумя значениями имеет небольшую биологическую и или статистическую значимость или не имеет никакой биологической значимости в контексте биологической характеристики, измеренной с помощью указанных значений (например, значений Kd). Разница между указанными двумя значениями может составлять менее около 50%, менее около 40%, менее около 30%, менее около 20% или менее около 10% в зависимости от значения для контрольного антитела/антитела сравнения..

[0089] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться не аминокислотами. Термины также охватывают полимер аминокислоты, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидирование, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции или модификации, такие как конъюгация с метящим компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Понятно, что, поскольку полипептиды данного раскрытия основаны на антителах, в некоторых вариантах осуществления полипептиды могут существовать в виде отдельных цепей или связанных цепей.

[0090] Термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер с помощью ДНК или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если присутствует, модификация нуклеотидной структуры может быть внесена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, например, путем конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, «кэп», замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты, кабаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), содержащие боковые части, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т.д.), с интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), с хелаторами (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), с алкиляторами, с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые гидроксильные группы, обычно присутствующие в сахарах, могут быть заменены, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищены стандартными защитными группами или активированы для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или могут быть конъюгированы с твердыми носителями. 5'- и 3'-концевые ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или фрагментами органической блокирующей группы, содержащей от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть преобразованы в стандартные защитные группы. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и базовые аналоги нуклеозидов, такие как метил рибозид. Одна или несколько сложных фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются ими, варианты осуществления, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), «(O)NR2 («амидат»), P(O)R, P(O)OR', СО или СН2 («формацеталь»), в котором каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий простой эфир (-О-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предыдущее описание применимо ко всем полинуклеотидам, упомянутым в данном документе, включая РНК и ДНК.

[0091] Термин «вектор» означает конструкцию, которая способна доставлять и необязательно экспрессировать один или несколько интересующих генов или последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы, векторы экспрессии голой ДНК или РНК, векторы плазмид, космид или фагов, векторы экспрессии ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

[0092] Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые «выделены», представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые находятся в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что они больше не находятся в той форме, в которой они встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция является по существу чистым.

[0093] Используемый в данном документе термин «по существу чистый» относится к материалу, который имеет чистоту не менее 50% (т.е. не содержит загрязняющих веществ), чистоту не менее 90%, чистоту не менее 95%, чистоту не менее 98% или чистоту не менее 99%..

[0094] Термины «идентичный» или «процент идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков, при сравнении и выравнивании (введение пробелов, если необходимо) для максимального соответствия, без учета каких-либо консервативных аминокислотных замен как части идентичности последовательности. Процент идентичности можно измерить с помощью программного обеспечения или алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального осмотра. В данной области известны различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно использовать для выравнивания аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Одним из таких неограничивающих примеров алгоритма выравнивания последовательностей является алгоритм, описанный в Karlin et al, Proc. Natl. Acad.. Sci., 87:2264-2268 (1990), с изменениями в Karlin et al., Proc. Natl. Acad.. Sci., 90:5873-5877 (1993), и включен в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1991)). В определенных вариантах осуществления Gapped BLAST можно использовать, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Южный Сан-Франциско, Калифорния) или Megalign (DNASTAR) являются дополнительными общедоступными программами, которые можно использовать для выравнивания последовательностей. В определенных вариантах осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяется с использованием программы GAP в программном обеспечении GCG (например, с использованием матрицы NWSgapdna. CMP и веса зазора 40, 50, 60, 70 или 90 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6). В определенных альтернативных вариантах осуществления программа GAP в пакете программного обеспечения GCG, которая включает алгоритм Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), может использоваться для определения процентной идентичности между двумя аминокислотные последовательности (например, с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, и веса зазора 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5). Как альтернативный вариант, в определенных вариантах осуществления процент идентичности между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяется с использованием алгоритма Майерса и Миллера (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Например, процент идентичности можно определить с помощью программы ALIGN (версия 2.0) и использования РАМ 120 с таблицей остатков, штрафом за длину зазора 12 и штрафом за зазор 4. Можно определить соответствующие параметры для максимального выравнивания с помощью конкретного программного обеспечения для выравнивания, специалистом в данной области. В некоторых вариантах осуществления используются параметры программного обеспечения для выравнивания по умолчанию. В определенных вариантах осуществления процент идентичности «X» первой аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности второй рассчитывается как 100 х (Y/Z), где Y - количество аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные совпадения при выравнивании первой и второй последовательностей (выровненных визуальным осмотром или специальной программой выравнивания последовательностей), a Z - общее количество остатков во второй последовательности. Если длина первой последовательности больше, чем длина второй последовательности, процент идентичности первой последовательности второй последовательности будет больше, чем процент идентичности второй последовательности первой последовательности.

[0095] В качестве неограничивающего примера, имеет ли какой-либо конкретный полинуклеотид определенный процент «идентичности последовательностей» (например, является ли он по меньшей мере на 80% идентичным, по меньшей мере на 85% идентичным, по меньшей мере на 90% идентичным и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны) эталонной последовательности в некоторых вариантах осуществления можно определить с помощью программы Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана (Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)), чтобы найти лучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании Bestfit или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентична эталонной последовательности согласно данному раскрытию, параметры устанавливаются таким образом, что процент идентичности рассчитывается по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности и эти зазоры в гомологии до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности допускаются.

[0096] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой один аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена тирозина фенилаланином является консервативной заменой. В некоторых вариантах осуществления консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител по раскрытию не отменяют связывания полипептида или антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном (ами), то есть FRα, с которым полипептид или антитело связываются. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng 12 (10): 879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417(1997)).

[0097] «Биспецифические антитела» относятся к антителам, которые связываются с двумя разными эпитопами Эпитопы могут относиться к одному и тому же антигену-мишени или могут относиться к разным антигенам-мишени.

[0098] «Бипаратопные антитела» представляют собой биспецифические антитела, которые связываются с двумя разными неперекрывающимися эпитопами одного и того же антигена-мишени (например, FRα).

[0099] В некоторых вариантах осуществления антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, представляют собой поливалентные молекулы. Термин «валентный», используемый в настоящей заявке, обозначает присутствие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Например, природное антитело или полноразмерное антитело согласно изобретению имеет два сайта связывания и является «двухвалентным». Термин «четырехвалентный» означает наличие четырех сайтов связывания в антигенсвязывающем белке. Термин «трехвалентный» означает наличие трех сайтов связывания в молекуле антитела. Термин «биспецифический, четырехвалентный», как он используется в данном документе, обозначает антигенсвязывающий белок согласно изобретению, который имеет четыре антигенсвязывающих сайта, из которых по крайней мере один связывается с первым антигеном и по крайней мере один связывается со вторым антигеном или другим эпитопом антиген.

[00100] Термин «иммуноконъюгат» или «конъюгат» в контексте данного документа относится к соединению или его производному, которое связано с агентом, связывающим клетки, и определяется общей формулой: CLA, где С = цитотоксин, L = линкер и А = антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело против FRα или фрагмент антитела). Иммуноконъюгаты также можно определить общей формулой в обратном порядке: A-L-C.

[00101] «Линкер» представляет собой любой химический фрагмент, который способен связывать соединение, обычно лекарство, такое как майтанзиноид, с клеточно-связывающим агентом, таким как анти-FRα-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, стабильным ковалентным образом. Линкеры могут быть восприимчивыми или по существу устойчивыми к расщеплению (например, к кислотно-индуцированному расщеплению, индуцированному светом расщеплению, индуцированному пептидазой расщеплению, индуцированному эстеразой расщеплению или расщеплению дисульфидной связи) в условиях, при которых соединение или антитело остаются активными. Подходящие линкеры хорошо известны в данной области и включают, например, дисульфидные группы и тиоэфирные группы.

[00102] Используемый в данном документе термин «цитотоксический агент» относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает одну или несколько клеточных функций и/или вызывает гибель клеток. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический агент представляет собой майтанзиноид, например, DM21. Иммуноконъюгаты, содержащие DM21, раскрыты в WO 2018/160539 А1, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

[00103] Иммуноконъюгат может содержать сайт-специфическую связь DM21 с "DM21C", представленную следующей структурной формулой:

где D₁ представляет собой:

[00104] Иммуноконъюгат может также содержать связанный с лизином DM21, «L-DM21,», «DM21-L» или «DM21L», которые представлены следующей структурной формулой:

где D₁ показан выше, связанный с антителом с помощью линкера, например, линкера сложного N-сукцинимидилового эфира γ-малеимидомасляной кислоты (GMBS) или сложного N-(γ-малеимидобутрилокси)сульфосукцинимидного эфира (сульфо-GMBS или sGMBS). Линкеры GMBS и сульфо-GMBS (или sGMBS) известны в данной области и могут быть представлены следующей структурной формулой:

[00105] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное ниже обстоятельство может иметь место, а может и не произойти, поэтому заявка включает в себя случаи, когда это обстоятельство имеет место, и случаи, когда не имеет. Например, фраза «необязательно замещенный» означает, что неводородный заместитель может присутствовать или не присутствовать на данном атоме, и, таким образом, заявка включает структуры, в которых присутствует неводородный заместитель, и структуры, в которых неводородный заместитель не присутствует.

[00106] Термины «рак» и «злокачественный» относятся или описывают физиологическое состояние млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают рак маточной трубы, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, рак толстой кишки, колоректальный рак, карцинома эндометрия или матки, рак слюнных желез, рак почки, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени и различные виды рака головы и шеи. Рак может быть раком, который экспрессирует FRα («FRα-экспрессирующий рак»).

[00107] Термины «раковая клетка», «опухолевая клетка» и грамматические эквиваленты относятся к общей популяции клеток, происходящих из опухоли или предракового поражения, включая как неканцерогенные клетки, которые составляют основную часть популяции опухолевых клеток, и онкогенные стволовые клетки (раковые стволовые клетки). Используемый в данном документе термин «опухолевая клетка» будет модифицирован термином «неканцерогенные» применительно только к тем опухолевым клеткам, у которых отсутствует способность обновляться и дифференцироваться, чтобы отличить эти опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.

[00108] «Запущенный» рак представляет собой рак, который распространился за пределы места или органа происхождения в результате местной инвазии или метастазирования. Термин «запущенный» рак включает как местно-распространенное, так и метастатическое заболевание.

[00109] «Метастатический» рак относится к раку, который распространился из одной части тела в другую.

[00110] «Рефрактерный» рак представляет собой рак, который прогрессирует, даже если больному раком проводится противоопухолевое лечение, такое как химиотерапия.

[00111] «Рецидивирующий» рак представляет собой рак, который вновь вырос либо на начальном, либо на удаленном участке после ответа на начальную терапию.

[00112] Пациент «с рецидивом» представляет собой пациента, у которого после ремиссии появляются признаки или симптомы рака. Необязательно, у пациента развился рецидив после адъювантной или неоадъювантной терапии.

[00113] Термин «поддерживающая терапия» относится к терапии, которая проводится для предотвращения рецидива рака после того, как он исчез после начальной терапии.

[00114] Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь ими, людей, нечеловеческих приматов, грызунов и т.п., которое должно быть реципиентом определенного лечения. Обычно термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению к человеку.

[00115] Термин «фармацевтический препарат» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы позволить биологической активности активного ингредиента быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому препарат будет вводиться. Состав может быть стерильным.

[00116] «Эффективное количество» антитела, иммуноконъюгата или другого лекарственного средства, как раскрыто в данном документе, представляет собой количество, достаточное для выполнения конкретно заявленной цели.

[00117] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, иммуноконъюгата или другого лекарственного средства, эффективного для «лечения» заболевания или нарушения у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарства может снизить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли или нагрузку; ингибировать (т.е. замедлять до некоторой степени и в определенном варианте осуществления останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; подавлять (т.е. до некоторой степени замедлять и в определенном варианте останавливать) метастазирование опухоли; подавлять до некоторой степени рост опухоли; облегчить до некоторой степени один или несколько симптомов, связанных с раком; и/или привести к благоприятному ответу, такому как повышенная выживаемость без прогрессирования (PFS), выживаемость без заболевания (DFS) или общая выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR) или, в некоторых случаях, стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), сокращение времени до прогрессирования (ТТР) или любая их комбинация. См. определение термина «лечение» в данном документе. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или убивать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим.

[00118] Такие термины, как «лечить» или «лечение», или «проводить лечение», или «облегчение», или «облегчить» относятся к терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства. Таким образом, в лечении нуждаются те, у кого уже диагностировано заболевание или есть подозрение на его наличие. В определенных вариантах осуществления субъект успешно «лечится» от рака в соответствии со способами данного раскрытия, если у пациента наблюдается одно или несколько из следующего: уменьшение количества или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; подавление или отсутствие метастазирования опухоли; торможение или отсутствие роста опухоли; облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; снижение онкогенности, частоты канцерогенности или канцерогенности опухоли; уменьшение количества или частоты раковых стволовых клеток в опухоли; дифференцировка онкогенных клеток в неканцерогенное состояние; увеличенная выживаемость без прогрессирования (PFS), выживаемость без заболевания (DFS) или общая выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR), стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), сокращенное время до прогрессирования (ВДП) или любая их комбинация.

[00119] Термины «применять», «введение», «прием лекарства» и т.п., используемые в данном документе, относятся к способам, которые можно использовать для обеспечения доставки иммуноконъюгата к желаемому месту биологического действия. Методы введения, которые можно использовать с описанными в данном документе агентами и способами, можно найти, например, в Goodman и Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon; and Remington's, Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Pa. В одном аспекте иммуноконъюгат вводят внутривенно.

[00120] Термин «инструкция» означает предоставление указаний по применяемой терапии, лекарствам, лечению, схемам лечения и т.п. любыми средствами, например, в письменной форме, например, в виде вкладышей в пакеты или других письменных рекламных материалов.

[00121] Термины «предварительное лечение» и «предварительное лечение» относятся к терапевтическим мерам, которые проводятся до введения терапевтического антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или иммуноконъюгата. Например, как более подробно описано в данном документе, стероид (например, кортикостероид) можно вводить в качестве профилактического средства в течение около недели, около пяти дней, около трех дней, около двух дней или около за один день или 24 часа до введение иммуноконъюгата. Стероид также можно вводить перед иммуноконъюгатом в тот же день, что и иммуноконъюгат.

[00122] Если специально не указано или не очевидно из контекста, как он используется в данном документе, термин «около» понимается как в пределах диапазона нормального допуска в данной области, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего. Около можно понимать как в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от заявленного значения. Если иное не ясно из контекста, все числовые значения, представленные в данном документе, модифицированы термином около.

[00123] Перечисление списка химических групп в любом определении переменной в данном документе, включает определения этой переменной как любой отдельной группы или комбинации перечисленных групп. Перечисление варианта осуществления для переменной или аспекта в данном документе включает этот вариант осуществления как любой отдельный вариант осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.

[00124] Как используется в данном раскрытии и формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не диктует иное.

[00125] Понятно, что везде, где варианты осуществления описаны в данном документе на языке «содержащий», также предусмотрены аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий по существу из». В этом раскрытии «содержит», «содержащий», «содержащий» и «имеющий» и т.п. может иметь значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США, и может означать «включает», «включая» и тому подобное; «состоящий по существу из» или «состоит по существу» также имеет значение, приписываемое в Патентном законодательстве США, и этот термин является неограниченным, что допускает наличие большего, чем то, что перечислено, при условии, что основные или новые характеристики того, что перечислено не изменяется из-за наличия чего-то большего, чем указано, но исключает варианты предшествующего уровня техники

[00126] Если специально не указано или не очевидно из контекста, как используется в данном документе, термин «или» следует понимать как включающий. Термин «и/или», используемый в данном документе во фразе, такой как «А и/или В», предназначен для включения как «А, так и В», «А или В», «А» и «Б.» Аналогичным образом, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «А, В и/или С», предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (сам по себе); В (сам по себе); и С (сам по себе).

[00127] Любые композиции или способы, представленные в данном документе, могут быть объединены с одной или несколькими другими композициями и способами, предоставленными в данном документе.

II. Бипаратопные антитела

[00128] В данном документе предусмотрены бипаратопные антитела против FRα и их антигенсвязывающие фрагменты. Эти бипаратопные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать первый FRα-связывающий домен, который связывается с первым эпитопом FRα, и второй FRα-связывающий домен, который связывается со вторым эпитопом FRα. Первый и второй эпитопы -FRα являются неперекрывающимися эпитопами. Эти бипаратопные антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут содержать дополнительные FRα-связывающие домены. Например, четырехвалентное бипаратопное антитело или антигенсвязывающий фрагмент может иметь два FRα-связывающих домена, которые связываются с первым эпитопом, и два FRα-связывающих домена, которые связываются со вторым эпитопом. Типичные бипаратопные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты показаны на ФИГ. 1.

А. FRα-связывающие домены

[00129] В данном документе раскрыты FRα-связывающие домены, которые можно использовать для сборки бипаратопных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. FRα-связывающий домен может содержать шесть определяющих комплементарность областей (CDR), то есть CDR1 вариабельной тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 вариабельной легкой цепи (VL), CDR2 VL и VL. CDR3. FRα-связывающий домен может включать вариабельную тяжелую цепь (VH) и вариабельную легкую цепь (VL). VH и VL могут быть отдельными полипептидами или могут быть частями одного и того же полипептида (например, в scFv).

[00130] Антитела FRα и их антигенсвязывающие фрагменты известны в данной области и раскрыты, например, в публикациях заявок РСТ № WO 2011/106528 A1; WO 2012/135675 A3; WO 2012/138749 A1; WO 2014/036495 A3; и WO 2015/031815 А2; каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки. Дополнительные антитела против FRα раскрыты в патентах США №8557966 В2; 8709432 В2; 9702881 В2; и 9637547 В2; и публикация патентной заявки США №US-2012-0282282 А1, каждая из которых полностью включена в данный документ посредством ссылки. Кроме того, антитело против FRα huMov19 (М9346А) кодируется плазмидами, депонированными в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, 7 апреля 2010 г. в соответствии с условиями Будапештского договора и имеющими АТСС депозитные номера РТА-10772 и РТА-10774 Как предусмотрено в данном документе, FRα-связывающий домен может быть FRα-связывающим доменом (например, шестью CDR или VH и VL) любого из этих антител или их антигенсвязывающих фрагментов.

[00131] В качестве примера, FRα-связывающий домен может содержать последовательности CDR, последовательность VH и/или последовательность VL антитела huMov19 и/или антитела FR57. Последовательности CDR антител huMov19 и FR57 представлены в Таблицах 1 и 2 ниже.

[00132] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен, раскрытый в данном документе, содержит один или несколько полипептидов, содержащих одну или несколько последовательностей CDR, описанных в данном документе. Например, FRα-связывающий домен может содержать одну или несколько последовательностей CDR легкой цепи (т.е. LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3) и/или одну или несколько последовательностей CDR тяжелой цепи (т.е. НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3), показанные ниже в Таблицах 1 и 2.

[00133] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит (а) VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3 соответственно; и (b) VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 7-9 соответственно. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит (а) VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, соответственно; и (b) VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит (а) VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно; и (b) VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 10-12 соответственно. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит (а) VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно; и (b) VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно.

[00134] В качестве примера, FRα-связывающий домен может содержать последовательности CDR, последовательность VH и/или последовательность VL антитела huMov19 и/или антитела FR57. Последовательности CDR huMov19 и FR57 представлены в Таблицах 1 и 2 ниже.

[00135] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен, раскрытый в данном документе, содержит один или несколько полипептидов, содержащих одну или несколько последовательностей CDR, описанных в данном документе. Например, FRα-связывающий домен может содержать одну или несколько последовательностей CDR легкой цепи (т.е. LC CDR1, LC CDR2 и LC CDR3) и/или одну или несколько последовательностей CDR тяжелой цепи (т.е. НС CDR1, НС CDR2 и НС CDR3), показанные ниже в Таблицах 1 и 2.

[00136] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит вариабельные последовательности легкой и/или тяжелой цепи антитела huMov19 и/или антитела FR57. Вариабельные последовательности легкой цепи и вариабельные последовательности тяжелой цепи huMov19 и FR57 представлены в Таблицах 3 и 4 ниже.

[00137] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен включает VL, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17, необязательно где VL содержит последовательности VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 SEQ ID NO: 1-3 соответственно. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VL, имеющую по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, при по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 19, необязательно где VL содержит последовательности VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 SEQ ID NO: 4-6 соответственно.

[00138] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VH, имеющий по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно где VH содержит последовательности VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 SEQ ID NO: 7-9, соответственно, или SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VH, имеющий по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24, необязательно где VH содержит последовательности VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 SEQ ID NO: 10-12, соответственно, или SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно.

[00139] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VL и VH, где (i) VL составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17, необязательно где VL содержит последовательности VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 из SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и (ii) VH составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере, около 90%, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 22, необязательно где VH содержит последовательности VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 7-9, соответственно, или SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно.

[00140] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VL и VH, где (i) VL составляет по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 19, необязательно где VL содержит последовательности VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 SEQ ID NO: 4-6 соответственно, и (ii) VH содержит по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 24, необязательно где VH содержит последовательности VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности SEQ ID NO: 10-12, соответственно, или SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно.

[00141] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит VL и VH. VL и VH могут быть отдельными полипептидами. VL и VH также могут быть частями одного и того же полипептида, например, полипептида, содержащего VL, линкер и VH. Полипептид, содержащий VL, линкер и VH, может иметь ориентацию VL-линкер-VH или ориентацию VH-линкер-VL.

[00142] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен (например, scFv) содержит от N- до С-конца: VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, линкер (например, глицин-сериновый линкер), и VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит от N до С-конца: VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, линкер (например, линкер глицин-серин) и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.

[00143] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен (например, scFv) содержит от N- до С-конца: VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, линкер (например, глицин-сериновый линкер), и VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит от N до С-конца: VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, линкер (например, линкер глицин-серин) и VL, содержащий аминокислоту последовательность SEQ ID NO: 19.

[00144] Линкеры, которые можно использовать для соединения VH и VL, известны в данной области техники. Например, линкер может быть линкером глицин-серин. В некоторых вариантах осуществления линкер может иметь любую длину и может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 или 60 или более аминокислот. В других вариантах осуществления линкер, пригодный для данного раскрытия, содержит по меньшей мере одну аминокислоту и менее 100 аминокислот, менее 90 аминокислот, менее 80 аминокислот, менее 70 аминокислот, менее 60 аминокислот, менее чем 50 аминокислот, менее 40 аминокислот, менее 30 аминокислот, менее 20 аминокислот, менее 19 аминокислот, менее 18 аминокислот, менее 17 аминокислот, менее 16 аминокислот, менее 15 аминокислот кислоты, менее 14 аминокислот, менее 13 аминокислот или менее 12 аминокислот. В одном варианте линкерная последовательность содержит аминокислотные остатки глицина. В других случаях линкерная последовательность включает комбинацию аминокислотных остатков глицина и серина.

[00145] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен содержит линкер, слитый в рамке между VH и VL. В некоторых вариантах осуществления такие глицин/серин линкеры содержат любую комбинацию аминокислотных остатков, включая, помимо прочего, пептид GGGS (SEQ ID NO: 49) или GGGGS (SEQ ID NO: 50) или их повторы, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов этих данных пептидов. Раскрытые в данном документе глицин/серин линкеры содержат аминокислотную последовательность (GS)_n, (GGS)_n, (GGGS)_n, (GGGGS)_n или (GGGGS)_nn, где n равно целому числу 1, 2, 3., 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 51) (также обозначается как (Gly₄Ser)₃). В другом варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой GGGGS GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52) (также обозначается как (Gly₄Ser)₄).

[00146] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен представляет собой scFv. Типичные scFv FRα-связывающие домены представлены в Таблице 5 ниже.

[00147] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен включает scFv, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 75%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мер, около 85%, по меньшей мере, около 90%, по меньшей мер, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 27, 28 или 29, необязательно где scFv содержит VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности из SEQ ID NO: 1-3, соответственно, и VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 последовательности из SEQ ID NO: 7-9, соответственно, или SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно.

[00148] В некоторых вариантах осуществления FRα-связывающий домен включает scFv, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 75%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мере, около 85%, по меньшей мере, около 90%, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 96%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 98%, по меньшей мере, около 99% или 100% идентичности последовательности из SEQ ID NO: 30, 31 или 32, необязательно где scFv содержит VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 последовательности из SEQ ID NO: 4-6, соответственно, и последовательности VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 из SEQ ID NO: 10-12, соответственно, или SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно.

[00149] В определенных вариантах осуществления FRα-связывающий домен связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 22.

[00150] В определенных вариантах осуществления FRα-связывающий домен связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24

[00151] В определенных вариантах осуществления FRα-связывающий домен представляет собой мышиный, химерный или гуманизированный FRα-связывающий домен. В данном контексте гуманизированный FRα-связывающий домен может быть FRα-связывающим доменом с измененной поверхностью.

[00152] В определенных вариантах осуществления FRα-связывающий домен связывается с человеческим FRαHO не с FOLR2 или FOLR3.

В. Форматы бипаратопных антител

[00153] Бипаратопные анти-FRα антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут включать комбинацию FRα-связывающих доменов, описанных выше, где FRα-связывающие домены связываются с неперекрывающимися эпитопами FRα.

[00154] Многие различные типы биспецифических конструкций известны в данной области и могут использоваться в биапаратопных антителах против FRα или их антигенсвязывающих фрагментах, представленных в данном документе.

[00155] Ранние попытки конструирования биспецифических антител использовали либо химическое перекрестное сшивание, либо гибридные гибридомы или квадромы для соединения двух половин двух разных антител вместе. Хотя эти методы работают для получения биспецифических антител, они связаны с производственными проблемами, такими как получение смешанных популяций, содержащих различные комбинации антигенсвязывающих сайтов, трудности в экспрессии белка, необходимость очистки интересующего биспецифического антитела, низкие выходы, затраты производства и др.

[00156] В более поздних подходах использовались генно-инженерные конструкции, которые способны продуцировать гомогенные продукты отдельных биспецифических антител без необходимости обширной очистки для удаления нежелательных побочных продуктов. Такие конструкции включают тандемные scFv, диатела, тандемные диатела, антитела с двумя вариабельными доменами и гетеродимеризацию с использованием мотива, такого как домен Chl/Ck или DNL® (Chames & Baty, 2009, Curr Opin Drag Discov Devel 12:276-83; Chames & Baty, mAbs 1:539-47). BITE® относится к тандемным scFv, к которым присоединен короткий пептидный линкер (Chames & Baty, mAbs 1:539-47). Другие подходы к продукции биспецифических антител включают четырехвалентные слияния IgG-scFv (Dong et al., 2011, MAbs 3:273-88); антитела двойного действия Fab (DAF) (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14); IgG-подобные антитела с двумя вариабельными доменами (DVD-Ig) (Wu et al., 2007, Nat Biotechnol 25:1290-97); и использование динамического обмена между молекулами IgG4 (van der Neut Kolfschoten et al., 2007, Science 317:1554-57).

[00157] Комплекс DOCK-AND-LOCK® (DNL®) (см., например, патенты США №№7521056; 7527787; 7534866; 7550143; 7666400; 7901680; 7906118; 7981398; 8003111) представляют собой другой формат биспецифических антител. Хотя стандартный DNL® комплекс включает тример с двумя молекулами, связанными с DDD, присоединенными к одной молекуле, связанной с AD, вариации в структуре комплекса позволяют образовывать димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры, гексамеры и другие мультимеры.

[00158] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыты бипаратопные конструкции с молекулами асимметричного Fc, в том числе в структурах типа «выступ во впадину». См. Kontermann, MAbs., 4 (2): 182-97 (2012). Технология «выступов во впадины» (KIHs) включает конструирование доменов C_H3 для создания «выступа» или «впадины» в каждой тяжелой цепи, чтобы способствовать гетеродимеризации. Технология KIH описана, например, в Ridgway et al., Protein Engineering 9 (7):617-721 (1996); патент США 5731168; патент США 5807706; патент США 5821333, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки. Метод «CrossMab» дополнительно включает обмен доменов тяжелой и легкой цепей в Fab одной половины биспецифического антитела, в результате чего два плеча настолько различны, что не может возникнуть неправильное спаривание легкой и тяжелой цепей (Schaefer et al., 2011, Proc Natl. Acad Sci USA 108:11187-92). Подход «выступы во впадины» вводит аминокислоты с объемными боковыми цепями в домен СН3 одной тяжелой цепи, которые подходят к соответствующим образом спроектированным полостям в домене СН3 другой тяжелой цепи. Комбинация подходов предотвращает несоответствие взаимодействия тяжелой цепи с тяжелой цепью и взаимодействия тяжелой цепи с легкой цепью, что приводит, прежде всего, к единому продукту.

[00159] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент является бивалентным (см., например, пример «выступ во впадину», показанный на ФИГ. 1). Двухвалентное бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент может включать, например, два FRα-связывающих домена, содержащих scFv, два FRα-связывающих домена, содержащие VH и VL на отдельных полипептидных цепях, или один FRα-связывающий домен, содержащий scFv и один FRα-связывающий домен, который включает VH и VL на отдельных полипептидных цепях.

[00160] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент является трехвалентным.

[00161] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент является четырехвалентным (см., например, пример «Моррисон», показанный на ФИГ. 1). Тетравалентные антитела описаны, например, в М.J. Coloma, S.L. Моррисон, Nat. Biotechnol., 15 (2): 159-63 (1997), которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00162] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который представляет собой scFv. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который включает VH и VL на отдельных полипептидах. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который представляет собой scFv, и FRα-связывающий домен, который содержит VH и VL на отдельных полипептидах.

[00163] В некоторых вариантах осуществления двухвалентное биапаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит один FRα-связывающий домен, который представляет собой scFv, и один FRα-связывающий домен, который содержит VH и VL на отдельных полипептидах. В таких вариантах осуществления scFv может быть слит с константной областью тяжелой цепи, а VH может быть слит с константной областью тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления константные области имеют последовательности «выступ и впадина». Последовательность «выступа» может быть в константной области тяжелой цепи, слитой с scFv, а последовательность «впадины» может быть слита с константной областью, слитой с VH. В альтернативном варианте мутация «впадины» может быть в константной области тяжелой цепи, слитой с scFv, и последовательность «выступа» может быть слита с константной областью, слитой с VH. Последовательности типичных бипаратопных антител против FRα или их антигенсвязывающих фрагментов таких форматов представлены в Таблице 7.

[00164] В некоторых вариантах осуществления четырехвалентное бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит два FRα-связывающих домена, которые представляют собой scFv, и два FRα-связывающих домена, которые содержат цепи VH и VL на отдельных полипептидах. В таких вариантах осуществления scFv могут быть слиты с N- или С-концом полипептида, содержащего VH. ScFv также могут быть слиты с N- или С-концом полипептида, содержащего VL.

[00165] Четырехвалентное бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать два полипептида, где первый полипептид содержит константную область тяжелой цепи, VH и scFv, а второй полипептид содержит константную область легкой цепи и VL. Четырехвалентное бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент также может содержать два полипептида, где первый полипептид содержит константную область тяжелой цепи и VH, а второй полипептид содержит константную область легкой цепи, VL и scFv. Последовательности типичных бипаратопных антител против FRα или их антигенсвязывающих фрагментов таких форматов представлены в Таблице 6.

[00166] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой биспецифическое гетеродимерное диатело, например, тетрамерное биспецифическое гетеродимерное диатело. Используемый в данном документе термин «биспецифическое гетеродимерное диатело» относится к комплексу из двух или более полипептидных цепей или белков, и каждый может содержать по меньшей мере один антитела VL и один антитела VH домен, и где домены VL и VH в каждой полипептидной цепи происходят от разных антител.

[00167] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, содержат один или несколько измененных на поверхность FRα-связывающих доменов. В некоторых вариантах осуществления все FRα-связывающие домены в бипаратопном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте имеют измененную поверхность.

[00168] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), заменены остатками из CDR не относящихся к человеку видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, сродство и способность («привитые CDR») (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)).

[00169] В дополнительном варианте осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитело с привитой CDR или с измененной поверхностью, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 7-9, соответственно, и где указанная вариабельная область легкой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющих аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1-3, соответственно.

[00170] В дополнительном варианте осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитело с привитой CDR или с измененной поверхностью, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно, и где указанная вариабельная область легкой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющих аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1-3, соответственно.

[00171] В дополнительном варианте осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитело с привитой CDR или с измененной поверхностью, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 10-12, соответственно, и где указанная вариабельная область легкой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющих аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

[00172] В дополнительном варианте осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой антитело с привитой CDR или с измененной поверхностью, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющие аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно, и где указанная вариабельная область легкой цепи включает три определяющих комплементарность области, имеющих аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 4-6, соответственно.

[00173] В дополнительном варианте осуществления предоставлены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, имеющие гуманизированную (например, с измененной поверхностью, с привитым CDR) вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 22-26, более предпочтительно 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 22-26, наиболее предпочтительно 100% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 22-26. В конкретных вариантах осуществления антитело включает консервативные мутации в каркасной области за пределами CDR.

[00174] Аналогичным образом предоставляются антитела, имеющие гуманизированную (например, с измененной поверхностью, с привитым CDR) вариабельную область легкой цепи, которая имеет по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 17-21, более предпочтительно, 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 17-21, наиболее предпочтительно 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 17-21. В конкретных вариантах осуществления антитело включает консервативные мутации в каркасной области за пределами CDR.

[00175] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент могут содержать константную область легкой цепи, либо константную область легкой цепи каппа, либо константную область легкой цепи лямбда. В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи каппа.

[00176] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит первый FRα-связывающий домен, содержащий последовательности VL и VH, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19 и 24; 20 и 25; и 21 и 26, соответственно) и второй FRα-связывающий домен, который не конкурирует с huMov19 за связывание с FRα. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против Frαα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит первый FRα-связывающий домен, содержащий последовательности VL и VH SEQ ID NO: 20 и 57 соответственно) и второй FRα-связывающий домен, который не конкурирует с huMov19 для связывания с FRα.

[00177] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит первый FRα-связывающий домен, содержащий последовательности VL и VH, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17 и 22; и 18 и 23, соответственно) и второй FRα-связывающий домен, который не конкурирует с FR57 за связывание с FRα.

[00178] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 22 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 17

[00179] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 19.

[00180] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) первый FRα-связывающий домен, который конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 22 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 17 и (ii) второй FRα-связывающий домен, который конкурентно ингибирует связывание с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 19.

[00181] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 22 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 17.

[00182] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит FRα-связывающий домен, который связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 19.

[00183] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное анти-FRα-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) первый FRα-связывающий домен, который связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 22 и аминокислотная последовательность VL SEQ ID NO: 17 и (ii) второй FRα-связывающий домен, который связывается с тем же эпитопом FRα, что и антитело, содержащее аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 24 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 19.

[00184] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 24, соответственно).

[00185] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 57, соответственно).

[00186] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 26, соответственно).

[00187] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 24, соответственно).

[00188] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 57, соответственно).

[00189] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 26, соответственно).

[00190] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 24, соответственно).

[00191] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00192] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 26, соответственно).

[00193] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 24, соответственно).

[00194] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 57, соответственно).

[00195] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 26, соответственно).

[00196] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 24, соответственно).

[00197] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 57, соответственно).

[00198] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 26, соответственно).

[00199] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 24, соответственно).

[00200] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00201] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 26, соответственно).

[00202] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 24, соответственно).

[00203] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 17 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00204] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 26, соответственно).

[00205] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 24, соответственно).

[00206] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 57, соответственно).

[00207] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 26, соответственно).

[00208] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 24, соответственно).

[00209] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00210] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 26, соответственно).

[00211] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 24, соответственно).

[00212] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 22 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00213] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 19 и/или 26, соответственно).

[00214] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 24, соответственно).

[00215] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 57, соответственно).

[00216] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 20 и/или 26, соответственно).

[00217] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 24, соответственно).

[00218] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 25, соответственно). В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 57, соответственно).

[00219] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты согласно раскрытию содержат вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь FR57 (например, SEQ ID NO: 18 и/или 23 соответственно) и вариабельную легкую цепь и/или вариабельную тяжелую цепь huMOV19 (например, SEQ ID NO: 21 и/или 26, соответственно).

[00220] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против Frαα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) scFv, который связывается с тем же эпитопом, что и FR57, и (ii) scFv, который связывается с тем же эпитопом, что и huMov19. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 32.

[00221] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 32.

[00222] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 32.

[00223] Следует понимать, что последовательности VH и VL для SEQ ID NO: 27-32 могут быть расположены в другом порядке. Например, ориентация N-конца к С-концу, как указано в SEQ ID NO: 27, представляет собой VH-(G4S)₄-VL. Однако здесь раскрыты полипептидные последовательности scFv, в которых последовательности VH и VL обмениваются вокруг глицин-серинового линкера (например, VL-(G4S)₄-VH).

[00224] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 26.

[00225] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 26.

[00226] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) scFv, который связывается с тем же эпитопом, что и FR57, и (ii) FRα-связывающий домен, содержащий VH и VL на отдельных полипептидах, который связывается с тем же эпитопом, что и huMov19. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 26.

[00227] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 26.

[00228] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 26.

[00229] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 26.

[00230] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 26.

[00231] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 26.

[00232] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 26.

[00233] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) scFv, который связывается с тем же эпитопом, что и huMov19, и (ii) FRα-связывающий домен, содержащий VH и VL на отдельных полипептидах, который связывается с тем же эпитопом, что и FR57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 23.

[00234] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23.

[00235] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) scFv, который связывается с тем же эпитопом, что и huMov19, и (ii) FRα-связывающий домен, содержащий VH и VL на отдельных полипептидах, который связывается с тем же эпитопом, что и FR57. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23.

[00236] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 23.

[00237] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 23.

[00238] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против Frαα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23.

[00239] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат полипептидные последовательности, раскрытые в Таблице 6 ниже.

[00240] В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.

[00241].В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат полипептидные последовательности, раскрытые в Таблице 7 ниже.

[00242] В одном варианте осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полипептиды SEQ ID NO: 41-43. В некоторых вариантах осуществления бипаратопные антитела против FRα или их антигенсвязывающие фрагменты содержат SEQ ID NO: 44-46.

[00243] Бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по данному раскрытию могут дополнительно содержать линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер может связывать первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом от N-конца до С-конца. В других вариантах осуществления линкер может связывать второй полипептид с первым полипептидом от N-конца до С-конца.

[00244] В одном варианте осуществления бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат линкерную последовательность, расположенную между первым пептидом, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и вторым пептидом, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Линкер может иметь любую длину и может включать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50 или 60 или более аминокислот. В других вариантах осуществления линкер, пригодный для данного раскрытия, содержит по меньшей мере одну аминокислоту и менее 100 аминокислот, менее 90 аминокислот, менее 80 аминокислот, менее 70 аминокислот, менее 60 аминокислот, менее чем 50 аминокислот, менее 40 аминокислот, менее 30 аминокислот, менее 20 аминокислот, менее 19 аминокислот, менее 18 аминокислот, менее 17 аминокислот, менее 16 аминокислот, менее 15 аминокислот кислоты, менее 14 аминокислот, менее 13 аминокислот или менее 12 аминокислот. В одном варианте линкерная последовательность содержит аминокислотные остатки глицина. В других случаях линкерная последовательность включает комбинацию аминокислотных остатков глицина и серина.

[00245] В некоторых вариантах осуществления такие глицин/серин линкеры могут содержать любую комбинацию аминокислотных остатков, включая, помимо прочего, пептид GGGS (SEQ ID NO: 49) или GGGGS (SEQ ID NO: 50) или их повторы, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов этих данных пептидов. Раскрытые в данном документе глицин/серин линкеры содержат аминокислотную последовательность (GS)_n, (GGS)_n, (GGGS)_n, (GGGGS)_n или (GGGGS)_nn, где n равно целому числу 1, 2, 3., 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 51) (также обозначается как (Gly₄Ser)₃). В другом варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 52) (также обозначается как (Gly₄Ser)₄).

[00246] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα содержит измененную (например, мутированную или модифицированную) область Fc. Например, в некоторых аспектах область Fc была изменена для уменьшения или усиления эффекторных функций антитела, изменения периода полужизни в сыворотке или других функциональных свойств антитела. В некоторых случаях желательно снижение или устранение эффекторной функции, например, в случае антител, механизм действия которых включает блокирование или антагонизм, но не уничтожение клеток, несущих антиген-мишень. Повышенная эффекторная функция обычно желательна, когда направлена на нежелательные клетки, такие как опухолевые и чужеродные клетки, где FcγR экспрессируются на низких уровнях, например, опухолеспецифические В-клетки с низкими уровнями FcγRIIB (например, неходжкинская лимфома, CLL и лимфома Беркитта). Иммуноконъюгаты по изобретению, обладающие такой предоставляемой или измененной активностью эффекторной функции, пригодны для лечения и/или предотвращения заболевания, расстройства или инфекции, при которых желательна повышенная эффективность активности эффекторной функции. В некоторых аспектах область Fc представляет собой изотип, выбранный из IgM, IgA, IgG, IgE или другого изотипа.

[00247] Хотя область Fc бипаратопного антитела против FRα или антигенсвязывающего фрагмента может обладать способностью связываться с одним или несколькими рецепторами Fc (например, FcγR(s)), в некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела содержит вариант области Fc с измененным связыванием с FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD 16а) или FcγRIIIB (CD16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа), например, будет иметь усиленное связывание к активирующему рецептору и/или будет иметь существенно сниженную способность связываться с ингибирующим рецептором (ами) или не иметь способности связываться с ингибирующим рецептором (ами). Таким образом, область Fc бипаратопного антитела против FRα или антигенсвязывающего фрагмента может включать часть или весь домен СН2 и/или часть или весь домен СН3 полной области Fc, или может включать вариант СН2 и/или вариант последовательности СН3 (который может включать, например, одну или несколько вставок и/или одну или несколько делеций по отношению к доменам СН2 или СН3 полной области Fc). Такие области Fc могут содержать части полипептида, отличные от Fc, или могут включать части неприродных полных областей Fc, или могут содержать неприродные ориентации доменов СН2 и/или СН3 (таких как, например, два домена СН2 или два домена СН3 или в направлении от N-конца к С-концу домен СН3, связанный с доменом СН2, и т.д.).

[00248] Модификации области Fc, идентифицированные как изменяющие эффекторную функцию, известны в данной области, включая модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcγRIIA (CD 16А) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcγRIIB (CD32B) (см., например, Stavenhagen, et al., Cancer Res. 57(18):8882-8890 (2007)). В Таблице 8 перечислены примерные одиночные, двойные, тройные, четырехкратные и пятикратные замены (нумерация соответствует индексу EU, как в Kabat, а замены относятся к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 59) типичной модификации, которая увеличивает связывание с активацией рецепторов и/или уменьшает связывание с ингибирующими рецепторами.

[00249] Типичные варианты областей Fc человеческого IgG1 с пониженным связыванием с CD32B и/или повышенным связыванием с CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P396L, при этом нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat. Эти аминокислотные замены могут присутствовать в Fc-области человеческого IgG1 в любой комбинации. В одном варианте осуществления вариантная область Fc человеческого IgG1 содержит замену F243L, R292P и Y300L. В другом варианте осуществления вариантная область Fc человеческого IgG1 содержит замену F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.

[00250] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую модификацию, которая снижает эффекторную функцию (см., например, Idusogie et at, J. Immunol. 166:2571-2575 (2001); Sazinsky et at, PNAS USA 105:20167-20172 (2008); Davis et al., J. Rheumatol. 34:2204-2210 (2007); Bolt et al., Eur. J. Immunol. 23:403-411 (1993); Alegre et al., Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al., Cell Immunol. 200:16-26 (2000); Cole etat, Transplantation 68:563-571 (1999); Hutchins et al.,PNAS USA 92:11980-11984 (1995); Reddy et at, J. Immunol. 164:1925-1933 (2000); W097/11971, и WO07/106585; U.S. Appl. Publ. 2007/0148167A1; McEarchern et al., Blood 109:1185-1192 (2007); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); и Kumagai et al., J. Clin. Pharmacol. 47:1489-1497 (2007), каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

[00251] В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы Fc-область бипаратопного анти-FRα-антитела или антигенсвязывающего фрагмента демонстрировала пониженное (или практически полное отсутствие) связывание с эффекторным рецептором, выбранным из группы, состоящей из: FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A) (аллотипы R131 и Н131), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD 16а) (аллотип V158 и F158) и FcγRIIIB (CD16b) (аллотип Fcγ-NAl и Fcγ-NA2); относительно связывания, проявляемого Fc-областью IgG дикого типа (SEQ ID NO: 59). В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания бипаратопного анти-FRα-антитела или антигенсвязывающего фрагмента варианта эффекторного рецептора области Fc снижена до 1/10 или менее, 1/50 или менее или 1/100 или менее по сравнению с аффинностью связывания соответствующего антитела или связывающего фрагмента антитела, содержащего Fc-область дикого типа соответствующего иммуноглобулина.

[00252] В конкретном варианте осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит область Fc IgG, которая проявляет пониженную эффекторную функцию (например, пониженную ADCC) и включает модификацию в одном или нескольких положениях аминокислот, выбранных из группы, состоящей из 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 295, 296, 297, 298, 300, 324, 325, 327, 328, 329, 331 и 332, где нумерация аминокислотных положений соответствует индексу ЕС, указанному в Kabat. В одном варианте осуществления домен СН2-СН3 бипаратопного антитела против FRα или антигенсвязывающего фрагмента включает любые 1, 2, 3 или 4 замены: L234A, L235A, D265A, N297Q, N297A и N297G, где нумерация соответствует индексу ЕС, как и в Kabat. В другом варианте осуществления домены СН2-СН3 содержат замену N297Q, замену N297A или замены L234A и L235A, поскольку эти мутации отменяют связывание FcR. В качестве альтернативы, бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит домен СН2-CH3 естественного участка Fc, который по своей природе демонстрирует пониженное (или практически полное отсутствие) связывание с FcγRIIIA (CD 16а) и/или пониженную эффекторную функцию (относительно связывания и эффекторной функции, проявляемой Fc-областью IgG1 дикого типа (SEQ ID NO:59). В конкретном варианте осуществления константная область Fc бипаратопного анти-FRα-антитела включает область Fc IgG2 (SEQ ID NO: 60) или область Fc IgG4 (SEQ ID NO: 61). Поскольку замены N297A, N297G, N297Q, L234A, L235A и D265A отменяют эффекторную функцию, в обстоятельствах, при которых желательна эффекторная функция, эти замены предпочтительно не использовать.

[00253] Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и CH3 бипаратопного антитела против FRα, содержащего область Fc, или антигенсвязывающего фрагмента, обладающего пониженной или отмененной эффекторной функцией, включает замены L234A/L235A (показаны подчеркнутыми) (SEQ ID NO: 62):

[00254] Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 бипаратопного антитела против FRα, содержащего область Fc, или антигенсвязывающего фрагмента, у которого снижена или отменена эффекторная функция, включает замену N297A (показана подчеркнутой) (SEQ ID NO: 63):

[00255] Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и СН3 бипаратопного антитела против FRα, содержащего область Fc, или антигенсвязывающего фрагмента, обладающего пониженной или отмененной эффекторной функцией, включает замену N297Q (показана подчеркнутой) (SEQ ID NO: 64):

[00256] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность Fc (иммуноглобулина), выбранную из SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность Fc (иммуноглобулина) со сниженной или отмененной эффекторной функцией (например, содержащую замены, показанные выше в SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 и/или SEQ ID NO: 64) и содержит одну или несколько мутаций типа выступ во впадину, как раскрыто в данном документе. В некоторых вариантах осуществления последовательность Fc содержит мутацию выступа, как раскрыто в данном документе. В некоторых вариантах осуществления последовательность Fc содержит дырочную мутацию, как раскрыто в данном документе.

[00257] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более модификаций, соответствующих: IgG1-C220S, C226S, C229S, P238S; IgG1-C226S, C229S; IgG1-C226S, C229S, Е233Р, L234V, L235A; IgG1-L234A, L235A; IgG1-L234F, L235E, P331S; IgG1-L234F, L235E, P331S; IgG1-H268Q, A330S, P331S; IgG1-G236R, L328R; IgG1-L235G, G236R, IgG1-N297A; IgG1-N325A, L328R; IgG1-N325L, L328R; IgG1-K326W, E333S; IgG2-V234A, G237A; IgG2-E333S; IgG2 H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG4-S228P, L236E; IgG4-F234A, L235A; IgG4-F234A, G237A, E318A; IgG4-L235A, G237A, E318A; IgG4-L236E; последовательность IgG2-EU 118-260; и последовательность IgG4-EU 261-447; при этом нумерация позиций соответствует индексу ЕС, как в Kabat.

[00258] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который имеет пониженную активность CDC. В конкретных аспектах бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи IgG1, содержащую мутацию, которая снижает активность CDC (см, например, WO 1997/11971 и WO 2007/106585; U.S. Appl Publ. 2007/0148167А1; McEarchern et al., Blood 109:1185-1192 (2007); Hayden-Ledbetter et al., Clin. Cancer 15:2739-2746 (2009); Lazar et al., PNAS USA 103:4005-4010 (2006); Bruckheimer et al., Neoplasia 11:509-517 (2009); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); and Sazinsky et al., PNAS USA 105:20167-20172 (2008); каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Примеры модификаций последовательности константного домена тяжелой цепи, которые снижают КЗЦ, включают одну или более модификаций, соответствующих: IgG1-C226S, C229S, Е233Р, L234V, L235A; IgG1-C226S, P230S; IgG1-L234F, L235E, P331S; IgG1-S239D, A330L, I332E; последовательности IgG2 EU 118-260; последовательности IgG4-EU 261-447 и IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S, согласно индексу EU

[00259] В некоторых вариантах осуществления предоставленное бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит одну или более модификаций аминокислоты, увеличивающих период полужизни (например, замен). Многочисленные мутации, способные увеличивать период полужизни молекулы, содержащей Fc-область, известны в данной области и охватываются как компоненты бипаратопного анти-FRα антитела или антигенсвязывающих фрагментов, представленных в данном документе. См., например, патенты США №6277375; 7083784; 7217797 и 8 088376; публикации США №№2002/0147311; и 2007/0148164; и публикации РСТ №WO 1998/23289; WO 2009/058492; и WO 2010/033279, содержание каждой из которых полностью включено в данный документ посредством ссылки.

[00260] Период полужизни в сыворотке белков, содержащих области Fc, может быть увеличен за счет увеличения аффинности связывания области Fc с FcRn. Термин «период полужизни», используемый в данном документе, означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое является мерой средней продолжительности сохранения молекул после их введения. Период полужизни может быть выражен в виде времени, необходимого для элиминации пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из тела субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или его конкретного компартмента, например, при измерении в сыворотке, то есть с периодом полужизни в кровотоке, или в других тканях. Как правило, увеличение периода полужизни приводит к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для введенной молекулы.

[00261] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит замену аминокислоты, увеличивающую период полужизни, в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436, где нумерация аминокислотных положений соответствует индексу ЕС. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более аминокислотных замен аминокислотных остатков в положениях 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, где нумерация аминокислотных положений соответствует индексу ЕС. В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более замен аминокислот в положении 252 Кабата на Tyr, Phe, Trp или Thr; замену аминокислоты в положении 254 Кабата на Thr; замену аминокислоты в положении 256 по Кабату на Ser, Arg, Gln, Glu, Asp или Thr; замену аминокислоты в положении 257 Кабата на Leu; замену аминокислоты в положении 309 Кабата на Pro; замену аминокислоты в положении 311 Кабата на Ser; замену аминокислоты в положении 428 по Кабату на Thr, Leu, Phe или Ser; замену аминокислоты в положении 433 Кабата на Arg, Ser, Iso, Pro или Gin; или замена аминокислоты в положении 434 Кабата на Trp, Met, Ser, His, Phe или Tyr. Более конкретно, бипаратопное антитело против FRα или домен антигенсвязывающего фрагмента может содержать аминокислотные замены относительно константного домена человеческого IgG дикого типа, включая замену аминокислоты в положении 252 Кабата на Tyr, замену аминокислоты в положении 254 Кабата на Thr и замену аминокислоты в положении 256 Кабата на Glu

[00262] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, N434S, N434H, N434Y, H435K и Y436I, при этом нумерация соответствует индексу ЕС, как в Кабате. В дополнительных вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRαα или антигенсвязывающий фрагмент содержит замены, выбранные из: (а) M252Y, S254T и Т256Е; (b) M252Y и S254T; (с) M252Y и Т256Е; (d) T250Q и M428L;(e) T307Q и N434A; (f) A378V и N434A; (g) N434A и Y436I; (h) V308P и N434A; и (i) K288D и H435K.

[00263] В предпочтительном варианте осуществления бипаратопное антитело против -FRα или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариантный участок Fc IgG, содержащий любую 1, 2 или 3 замены: M252Y, S254T и Т256Е. В описании дополнительно предложены бипаратопные антитела против FRα или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие вариантные области Fc, содержащие: (а) одну или несколько мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcγR; и (b) одну или более мутаций, которые увеличивают период полужизни в сыворотке.

III. Продукция бипаратопных антител

[00264] Бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с FRα, могут быть получены любым способом, известным в данной области техники для синтеза антител, например, химическим синтезом или методами рекомбинантной экспрессии. В описанных в данном документе способах используются, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, синтеза и модификации олигонуклеотидов, гибридизации нуклеиновых кислот и смежных областей, которые известны специалистам в данной области техники. Эти методы описаны, например, в ссылках, цитируемых в данном документе, и полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren В et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[00265] Бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как предусмотрено в данном документе, могут быть получены путем химического связывания двух разных моноклональных антител или путем слияния двух линий клеток гибридомы с получением гибридом-гибридомы.

[00266] В конкретном варианте осуществления описанное бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент получают, экспрессируют, создают или выделяют любыми способами, которые включают создание, например, посредством синтеза, генной инженерии последовательностей ДНК. В определенных вариантах осуществления такое бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательности (например, последовательности ДНК или аминокислотные последовательности), которые в природе не существуют в репертуаре зародышевой линии антитела животного или млекопитающего (например, человека) in vivo.

[00267] Способы получения биспецифических, двухвалентных антител или их антигенсвязывающих фрагментов описаны, например, в патентах США №№5731168, 5807706, 5821333 и заявка на патент США. Публ. №№2003/020734 и 2002/0155537; каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Биспецифические четырехвалентные антитела и способы их получения описаны, например, в Межд. заявка. Публ. №№WO02/096948 и WO00/44788, описания которых полностью включены в данный документ посредством ссылки. См. в целом Межд. заявка Публ. №№W093/17715, WO92/08802, WO91/00360 и WO92/05793;Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); Патент США №№4 474 893; 4714681; 4925648; 5573920; и 5601819; и Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992); каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки.

[00268] Один из методов получения биспецифических антител получил название стратегии «выступы-во-впадины» (см., например, Межд.. Публ. WO2006/028936). Неправильное спаривание тяжелых цепей Ig в этой технологии снижается за счет мутации выбранных аминокислот, образующих поверхность раздела доменов СН3 в IgG. В положениях внутри домена СН3, в которых две тяжелые цепи взаимодействуют напрямую, аминокислота с небольшой боковой цепью (впадина) вводится в последовательность одной тяжелой цепи, а аминокислота с большой боковой цепью (выступ) - в аналогичное расположение взаимодействующих остатков на другой тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления композиции по данному изобретению содержат цепи иммуноглобулина, в которых домены CH3 были модифицированы путем мутации выбранных аминокислот, которые взаимодействуют на границе раздела между двумя полипептидами, с тем, чтобы предпочтительно формировать биспецифическое антитело. Биспецифические антитела могут состоять из цепей иммуноглобулина одного и того же подкласса (например, IgG1 или IgG3) или разных подклассов (например, IgG1 и IgG3 или IgG3 и IgG4).

[00269] В одном варианте осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию T366W в «цепи выступов» и мутации T366S, L368A, Y407V в «цепи впадин» и, необязательно, дополнительный межцепочечный дисульфидный мостик между доменами СН3, например, введение мутации Y349C в «цепи выступов» и мутации Е356С или мутации S354C в «цепи впадин»; мутации R409D, K370E в «цепи выступов» и мутации D399K, E357K в «цепи впадин»; мутации T366W в «цепи выступов» и мутации T366S, L368A, Y407V в «цепи впадин»; мутации R409D, K370E в «цепи выступов» и мутации D399K, E357K в «цепи впадин»; мутации Y349C, T366W в одну из цепей и мутации Е356С, T366S, L368A, Y407V в дублирующую цепь; и мутации Y349C, T366W в одной цепи и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в дублирующей цепи (нумерация в соответствии с системой нумерации ЕС).

[00270] Биспецифическое антитело, описанное в данном документе, также может быть получено в соответствии с технологической платформой DuoBody (Genmab A/S), как описано, например, в международных публикациях WO 2011/131746, WO 2011/147986, WO 2008/119353 и WO 2013/060867, и в Labrijn AF et al., (2013) PNAS 110(13): 5145-5150. Технология DuoBody может использоваться для объединения одной половины первого FRα-связывающего домена, содержащего две тяжелые и две легкие цепи, с половиной второго FRα-связывающего домена, содержащего две тяжелые и две легкие цепи. Полученный гетеродимер содержит одну тяжелую цепь и одну легкую цепь из первого FRα-связывающего домена, спаренные с одной тяжелой цепью и одной легкой цепью из второго FRα-связывающего домена.

[00271] Бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты в некоторых случаях содержат IgG4 и IgG1, IgG4 и IgG2, IgG4 и IgG2, IgG4 и IgG3 или гетеродимеры цепей IgG1 и IgG3. Такие гетеродимерные антитела тяжелой цепи могут быть сконструированы рутинно, например, путем модификации выбранных аминокислот, образующих поверхность раздела доменов СН3 в человеческом IgG4 и IgG1 или IgG3, чтобы способствовать образованию гетеродимерных тяжелых цепей.

[00272] В конкретных вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать химерные FRα-связывающие домены или гуманизированные FRα-связывающие домены. В определенных вариантах осуществления бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть фрагментом F(ab')₂. Фрагмент F(ab')₂ содержит два антигенсвязывающих плеча молекулы тетрамерного антитела, связанных дисульфидными связями в шарнирной области.

[00273] Бипаратопные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, могут быть получены любым методом, известным специалистам в данной области. Например, описанные в данном документе фрагменты F(ab')₂ могут быть получены протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием ферментов, таких как пепсин.

[00274] В определенном аспекте в данном документе предоставляется способ получения бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий культивирование клетки или клеток, описанных в данном документе. В определенном аспекте в данном документе предоставляется способ получения бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий экспрессию (например, рекомбинантную экспрессию) антитела или антигенсвязывающего фрагмента с использованием клетки или клетки-хозяина, описанной в данном документе (например, клетки или клетки-хозяина, содержащей полинуклеотиды, кодирующие описанное в данном документе антитело). В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой выделенную клетку. В конкретном варианте осуществления экзогенные полинуклеотиды были введены в клетку. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию очистки антитела или антигенсвязывающего фрагмента, полученного из клетки или клетки-хозяина.

[00275] FRα-связывающие домены могут быть получены, например, из моноклональных антител, с использованием широкого ряда методов, известных в данной области, включая использование технологий гибридом, рекомбинантных и фаговых дисплеев или их комбинации. Например, моноклональные антитела можно получить с использованием гибридомных методов, включая методы, известные в данной области техники и описанные, например, в Harlow Е & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е изд. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). Термин «моноклональное антитело», применяемый в данном документе не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Например, моноклональные антитела могут быть получены рекомбинантно из клеток-хозяев, экзогенно экспрессирующих описанное в данном документе антитело. Моноклональные антитела, описанные в данном документе, можно, например, получить гибридомным методом, как описано в Kohler G & Milstein С (1975) Nature 256: 495, или их можно, например, выделить из фаговых библиотек, используя, например, способы, описанные в данном документе. Другие методы получения клональных клеточных линий и экспрессируемых ими моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, главу 11 в: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., выше).

[00276] Кроме того, описанные в данном документе FRα-связывающие домены также могут быть созданы с использованием различных способов фагового дисплея, известных в данной области. В методах фагового дисплея белки отображаются на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены VH и VL, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, библиотек кДНК человека или мыши пораженных тканей). ДНК, кодирующую домены VH и VL, рекомбинируют вместе с линкером scFv с помощью ПЦР и клонируют в фагмидный вектор. Вектор электропорируют в Е. coli i, и Е. coli заражают фагом-помощником. Фаг, используемый в этих методах, обычно представляет собой нитчатый фаг, включая fd и М13, а домены VH и VL обычно рекомбинантно сливаются либо с геном фага III, либо с геном VIII. Фаг, экспрессирующий антитело или фрагмент, который связывается с конкретным антигеном, может быть выбран или идентифицирован с антигеном, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или захваченного твердой поверхностью или гранулой. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения описанных в данном документе антител, включают методы, раскрытые в Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J. Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR и Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; Заявка PCT №PCT/GB91/001134; Международные публикации №№WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO 97/13844; и патенты США №№5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108.

[00277] Как описано в приведенных выше ссылках, после отбора фага кодирующие области антитела из фага могут быть выделены и использованы для создания FRα-связывающих доменов, включая человеческие FRα-связывающие домены, и экспрессированы в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжи и бактерии, например, как описано ниже. Методы рекомбинантного получения FRα-связывающих доменов, таких как фрагменты Fab, Fab' и F(ab')₂, также могут быть применены с использованием способов, известных в данной области, таких как описанные в публикации PCT №WO 92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12 (6): 864-9;Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; и Better M et al., (1988) Science 240: 1041-1043.

[00278] В одном аспекте для создания FRα-связывающих доменов или антител праймеры ПЦР, включая нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующую последовательность для защиты сайта рестрикции, могут использоваться для амплификации последовательностей VH или VL из матрицы, например, клоны scFv. Используя методы клонирования, известные специалистам в данной области, амплифицированные ПЦР домены VH можно клонировать в векторы, экспрессирующие константную область VH, а амплифицированные ПЦР домены VL можно клонировать в векторы, экспрессирующие константную область VL, например, каппа человека или области констант лямбда. Домены VH и VL также можно клонировать в один вектор, экспрессирующий необходимые константные области.. Затем векторы конверсии тяжелой цепи и векторы конверсии легкой цепи котрансфицируют в клеточные линии для получения стабильных или временных клеточных линий, которые экспрессируют антитела, например, IgG, с использованием методов, известных специалистам в данной области.

IV. Полинуклеотиды, кодирующие бипаратопные антитела

[00279] В некоторых вариантах осуществления раскрытие охватывает полинуклеотиды, содержащие нуклеиновую кислоту, которая кодирует бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, или домен такого антитела или фрагмента, например, VH, VL, VH с VL (например, в scFv), тяжелой цепи, легкой цепи, тяжелой цепи с scFv, легкой цепи с scFv, константной области или константной области с scFv.

[00280] Соответственно, в настоящем документе представлены полинуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO: 17-40. Также в данном документе представлены композиции, содержащие комбинации полинуклеотидов, кодирующих любое бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент (например, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 17, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 22, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 18, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 23, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 19, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 24, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 20, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 25, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 21, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 26, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 33, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 34, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 35, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 36, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 37, полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 38, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 39, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 40, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 41, полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 42, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 43, или композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 44, полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 45, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 46.) Также в данном документе представлены композиции, содержащие комбинации полинуклеотидов, кодирующих любое бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент (например, композиция, содержащая полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 20, и полинуклеотид, кодирующий SEQ ID NO: 57).

[00281] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент кодируется плазмидами, депонированными в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу: Университетский бульвар 10801, Манассас, штат Вирджиния, 20110, в соответствии с условиями Будапештского договора и имеющими АТСС Депозитные номера РТА-10774 (депонирован 7 апреля 2010 г.), РТА-125915 («Mov19-Fc-hole»; депонирован в АТСС 29 апреля 2019 г. и получен АТСС 30 апреля 2019 г.) и РТА-125916 («FR57scFv2-Fc-knob»; депонирован в АТСС 29 апреля 2019 г. и получен АТСС 30 апреля 2019 г.).

[00282] Полинуклеотиды по изобретению могут быть в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК; и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и, если одноцепочечная, может быть кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой кДНК или ДНК, лишенную еще одного эндогенного интрона.

[00283] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой не встречающийся в природе полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид получают рекомбинантно.

[00284] В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды выделены. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды являются по существу чистыми.. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды выделяют из природных компонентов.

[00285] В некоторых вариантах осуществления предлагаемый в данном документе полинуклеотид представляет собой кодон, оптимизированный для экспрессии в конкретном хозяине (замените кодоны в мРНК человека на те, которые предпочитает бактериальный хозяин, такой как E.coli).

V. Клетки и векторы

[00286] Также предусмотрены векторы и клетки, содержащие полинуклеотиды, описанные в данном документе.

[00287] В определенных аспектах в данном документе представлены клетки (например, клетки-хозяева), экспрессирующие (например, рекомбинантно) антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, которые специфически связываются с FRα и содержат родственные полинуклеотиды и векторы экспрессии. Представленные в данном документе векторы (например, векторы экспрессии), представляют собой векторы, содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела против FRα или их фрагменты, для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, предпочтительно в клетках млекопитающих. В данном документе также представлены клетки-хозяева, содержащие такие векторы для рекомбинантной экспрессии антител против FRα или их антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе. В конкретном аспекте в данном документе представлены способы получения антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, включающие экспрессию такого антитела или его антигенсвязывающих фрагментов в клетке-хозяине.

[00288] Рекомбинантная экспрессия антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанная в данном документе, включает конструирование вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело или его фрагмент (например, тяжелую или легкую цепь), слитый белок, содержащий тяжелую или легкую цепь (например,, тяжелая или легкая цепь, слитая с одним или несколькими вариабельными доменами (например, scFv)), вариабельный домен, полипептид, содержащий VH и VL (например, scFv), константный домен и/или гибридный белок, содержащий константный домен (например, константный домен, слитый с одним или несколькими вариабельными доменами (например, ScFv)). После получения полинуклеотида, кодирующего описанное в данном документе антитело или его фрагмент, вектор для продукции антитела или его фрагмента может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием методик, хорошо известных в данной области. Таким образом, в данном документе описаны способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антитело или его фрагмент. Способы, хорошо известные специалистам в данной области, можно использовать для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности для антитела или его фрагмента и соответствующих сигналов контроля транскрипции и трансляции. Эти методы включают, например, методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Также предусмотрены реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, функционально связанную с промотором. Такие векторы могут, например, включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, международные публикации №№WO 86/05807 и WO 89/01036; и патент США №5122464), и вариабельные домены антитела можно клонировать в такой вектор для экспрессии всей тяжелой цепи, всей легкой цепи или всей тяжелой и легкой цепей. Нуклеотидная последовательность, кодирующая дополнительный вариабельный домен или FRα-связывающий домен (например, scFv), также может быть клонирована в такой вектор для экспрессии слитых белков, содержащих тяжелую или легкую цепь, слитую с FRα-связывающим доменом или его фрагментом (например, VH или VL).

[00289] Вектор экспрессии может быть перенесен в клетку (например, клетку-хозяин) обычными методами, и полученные клетки затем можно культивировать обычными методами для получения антитела или фрагмента (например, тяжелой или легкой цепи, слитого белка, содержащего тяжелую или легкая цепь (например, тяжелая или легкая цепь, слитая с одним или несколькими вариабельными доменами (например, scFv), вариабельный домен, полипептид, содержащий VH и VL (например, scFv), константный домен и/или слитый белок, содержащий константный домен (например, константный домен, слитый с одним или несколькими вариабельными доменами (например, ScFv), описанными в данном документе. Таким образом, в данном документе представлены клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, функционально связанный с промотором для экспрессии таких последовательностей в клетке-хозяине.

[00290] В определенных вариантах осуществления для экспрессии многоцепочечных антител векторы, кодирующие все цепи по отдельности, могут совместно экспрессироваться в клетке-хозяине для экспрессии всей молекулы иммуноглобулина.

[00291] В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вектор, содержащий полинуклеотиды, кодирующие все цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит несколько различных векторов, кодирующих все цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе.

[00292] Вектор или комбинация векторов могут содержать полинуклеотиды, кодирующие два полипептида, которые взаимодействуют с образованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе: например, первый полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий тяжелую цепь и scFv со вторым полинуклеотидом, кодирующим легкую цепь; первый полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий легкую цепь и scFv, со вторым полинуклеотидом, кодирующим тяжелую цепь; первый полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий тяжелую цепь и VH со вторым полинуклеотидом, кодирующим слитый белок, содержащим легкую цепь и VL, и т.д. Если два полипептида кодируются полинуклеотидами в двух отдельных векторах, векторы можно трансфицировать в клетку-хозяина при соотношении 3 полинуклеотидов, кодирующих слитый белок, содержащий тяжелую цепь: 1 полинуклеотиду, кодирующему слитый белок, содержащий легкую цепь.

[00293] Вектор или комбинация векторов могут содержать полинуклеотиды, кодирующие три полипептида, которые взаимодействуют с образованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе: например, первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, второй полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, и третий полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий константный домен тяжелой цепи, VH и VL (необязательно, где VH и VL представляют собой scFv). Если три полипептида кодируются полинуклеотидами в трех отдельных векторах, векторы можно трансфицировать в клетку-хозяин при соотношении 6 полинуклеотидов, кодирующих тяжелую цепь: 3 полинуклеотида, кодирующих легкую цепь: 1 полинуклеотид, кодирующий слитый белок

[00294] Вектор или комбинация векторов могут содержать полинуклеотиды, кодирующие четыре полипептида, которые взаимодействуют с образованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе: например, первый полинуклеотид, кодирующий первую тяжелую цепь, второй полинуклеотид, кодирующий вторую тяжелую цепь, третий полинуклеотид, кодирующий первую легкую цепь и четвертый полинуклеотид, кодирующий вторую легкую цепь.

[00295] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вектор или комбинацию векторов, описанных выше. В других вариантах осуществления две клетки-хозяин, три клетки-хозяин или четыре клетки-хозяин содержат вектор или комбинацию векторов, описанных выше.

[00296] Различные системы вектора экспрессии хозяина можно использовать для экспрессии молекул антител или их фрагментов (например, тяжелой или легкой цепи, слитого белка, содержащего тяжелую или легкую цепь (например, тяжелую или легкую цепь, слитую с одним или несколькими вариабельными доменами (например, scFv), вариабельный домен, полипептид, содержащий VH и VL (например, scFv), константный домен и/или слитый белок, содержащий константный домен (например, константный домен, слитый с одним или более вариабельными доменами (например, ScFv), описанными в данном документе. Такие системы экспрессии хозяина представляют собой носители, с помощью которых могут быть получены и впоследствии очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, но также представляют собой клетки, которые при трансформации или трансфекции подходящими кодирующими последовательностями нуклеотидов могут экспрессировать антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, in situ. Они включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli и В. subtilis), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или векторами экспрессии космидной ДНК, содержащими кодирующие последовательности антитела; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими кодирующие последовательности антитела; системы клеток насекомых, инфицированные векторами экспрессии рекомбинантного вируса (например, бакуловируса), содержащими кодирующие последовательности антитела; системы растительных клеток например, зеленые водоросли, такие как Chlamydomonas reinhardtii, инфицированные векторами экспрессии рекомбинантного вируса (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные векторами экспрессии рекомбинантных плазмид (например, Ti плазмид), содержащими кодирующие антитела последовательности; или клеточные системы млекопитающих (e.g., COS (e.g., COS1 or COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa, и NIH 3Т3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1. 1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 и BMT10 клетки), несущие рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7.5K вируса осповакцины). В конкретном варианте осуществления клетки для экспрессии описанных в данном документе антител или их антигенсвязывающего фрагмента представляют собой клетки СНО, например клетки СНО из системы CHO GS System™ (Lonza). В конкретном варианте осуществления экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих описанные в данном документе антитела, которые иммуноспецифически связываются с FRα (например, FRα человека), регулируется конститутивным промотором, индуцибельным промотором или тканеспецифическим промотором.

[00297] После того, как описанная в данном документе молекула антитела или ее фрагмент (например, тяжелая или легкая цепь, вариабельный домен и/или полипептид, содержащий VH и VL (например, scFv)), была получена путем рекомбинантной экспрессии, она может быть очищена любым способом, известным в данной области техники для очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ионным обменом, аффинностью, особенно по аффинности к специфическому антигену после протеина А и калибровочной колоночной хроматографией), центрифугированием, дифференциальной растворимостью, или любым другим стандартным методом очистки белков. Кроме того, описанные в данном документе антитела могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом известными в данной области, для облегчения очистки. VI. Иммуноконъюгаты, содержащие бипаратопные антитела

[00298] В одном аспекте данное раскрытие относится к иммуноконъюгатам, содержащим бипаратопный FRα-связывающий агент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент), описанный в данном документе, и цитотоксический агент. Цитотоксический агент может быть связан или конъюгирован либо непосредственно с FRα-связывающим агентом, либо косвенно, через линкер с использованием методов, известных в данной области, для получения «иммуноконъюгата», «конъюгата» или «ADC». А. Примеры иммуноконъюгатов

[00299] В первом варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, включает бипаратопное антитело FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в данном документе, ковалентно связанный с майтанзиноидным соединением, описанным в данном документе, через ε-аминогруппу одного или нескольких остатков лизина, расположенных на бипаратопном антителе FRα или его антигенсвязывающем фрагменте. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат представлен формулой (I):

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

СВ представляет собой бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент;

L₂ представлен одной из следующих формул:

или где:

R^x, R^y, R^x' и R^y' для каждого случая независимо представляют собой Н, -ОН, галоген, -О-(C_1-4 алкил), -SO₃H, -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺ или С_1-4 алкил, необязательно замещенный ОН, галогеном, SO₃H или NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, где R₄₀, R₄₁ и R₄₂ каждый независимо представляет собой Н или C_1-4 алкил;

1 и k каждый независимо равны целому числу от 1 до 10;

l1 равен целому числу от 2 до 5;

k1 равен целому числу от 1 до 5; и

s1 указывает сайт, соединенный с агентом связывания клетки СВ, a s3 указывает сайт, присоединенный к группе А;

А представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R¹ и R² каждый независимо представляет собой Н или C_1-3алкил;

L₁ представлен следующей формулой: -CR₃R₄-(CH₂)_1-8-C(=O)-где R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой Н или Me, и фрагмент -С(=O)- в L₁ соединен с D;

D представлен следующей формулой:

и

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[00300] В 1^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где R^x, R^y, R^x' и R^y' все представляют собой Н; и l и k каждый независимо равны целому числу от 2 до 6; а остальные переменные такие же, как описано выше для формулы (I).

[00301] Во 2^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где А представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков; а остальные переменные такие же, как описано выше для формулы (I) в первом варианте осуществления или 1^-ом конкретном варианте осуществления. В некоторых вариантах осуществления А представляет собой пептид, расщепляемый протеазой. В некоторых вариантах осуществления пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани. В некоторых вариантах осуществления А представляет собой пептид, имеющий аминокислоту, ковалентно связанную с NH-CR₁R₂-S-L₁-D, выбранную из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, селино-Cys, Gln., Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, каждая независимо как L- или D-изомер. В некоторых вариантах осуществления аминокислота, соединенная с NH-CR₁R₂-S-L₁-D, представляет собой L-аминокислоту.

[00302] В 3^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где А выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, D-Val-Ala, Val-Cit, D-Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N9-тозил-Arg, Phe-N9-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 54), p-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:55), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:56), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, D-Ala-Pro, и D-Ala-tBu-Gly, где первая аминокислота в каждом пептиде соединена с группой L₂, а последняя аминокислота в каждом пептиде соединена с -NH-CR₁R₂-S-L₁-D; а остальные переменные такие же, как описано для формулы (I) в первом варианте осуществления или в 1^-ом конкретном варианте осуществления..

[00303] В 4^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где R₁ и R₂ оба представляют собой Н; а остальные переменные такие же, как описано для формулы (I) в первом варианте осуществления или в 1^-ом, 2^-ом или 3^-ом конкретном варианте осуществления.

[00304] В 5^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где L₁ представляет собой -(СН₂)_4-6-С(=O)-; а остальные переменные такие же, как описано для формулы (I) в первом варианте осуществления или в 1^-ом, 2^-ом, 3^-ом или 4^-ом конкретном варианте осуществления.

[01] В 6^-ом конкретном варианте осуществления первого варианта осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен формулой (I), описанной выше, где D представлен следующей формулой:

а остальные переменные такие же, как описано для формулы (I) в первом варианте осуществления или в 1^-ом, 2^-ом, 3^-ом, 4^-ом или 5^-ом конкретном варианте осуществления.

[00305] В 7^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

или

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

представляет собой бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, соединенный с группой L₂ через аминогруппу Lγs;

представляет собой бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, соединенный с группой L₂ через тиоловую группу Cys; R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой Н или Me;

m1, m3, n1, r1, s1 и t1 каждый независимо равны целому числу от 1 до 6; m2, n2, r2, s2 и t2 каждый независимо равны целому числу от 1 до 7; t3 равен целому числу от 1 до 12; D₁ представлен следующей формулой:

и

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4. В более конкретном варианте осуществления D₁ представлен следующей формулой:

[00306] В 8^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

или

где:

ml и m3 каждый независимо равны целому числу от 2 до 4;

m2 равен целому числу от 2 до 5;

r1 равно целому числу от 2 до 6;

r2 равен целому числу от 2 до 5; и

7^-ом конкретном варианте осуществления.

[00307] В 9^-ом конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгатов, описанных в 7^-ом или 8^-ом конкретном варианте осуществления, А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro, или D-Ala-tBu-Gly. В более конкретном варианте осуществления для иммуноконъюгатов, описанных в 7^-ом или 8^-ом конкретном варианте осуществления, А представляет собой L-Ala-D-Ala-L-Ala.

[00308] В 10^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

или

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro, или D-Ala-tBu-Gly, и

D₁ представлен следующей формулой:

и остальные переменные такие, как описано в 7^-ом, 8^-ом или 9^-ом конкретном варианте осуществления. В более конкретном варианте осуществления А представляет собой L-Ala-D-Ala-L-Ala. В более конкретном варианте осуществления D₁ представлен следующей формулой:

[00309] В 11^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

где D₁ представлен следующей формулой:

В более конкретном варианте осуществления D₁ представлен следующей формулой:

[00310] В 12^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

где:

СВА представляет собой бипаратопное анти-FRα-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает (i) определяющие комплементарность области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1-3 и определяющие комплементарность области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7-9, и (ii) определяющие комплементарность области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 4-6, и определяющие комплементарность области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 10-12, соответственно; q равно 1 или 2;

D₁ представлен следующей формулой:

[00311] В определенных вариантах осуществления для иммуноконъюгата формулы (I-4) или (I-6) бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[00312] В 13^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, представлен следующей формулой:

где:

СВА представляет собой бипаратопное анти-FRα-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает (i) определяющие комплементарность области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1-3 и определяющие комплементарность области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 7-9 и (ii) определяющие комплементарность области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO 4-6, и определяющие комплементарность области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 10-12, соответственно;

q равно целому числу от 1 до 10, например, 1 или 10; и

D₁ представлен следующей формулой:

[00313] В определенных вариантах осуществления для иммуноконъюгата формулы (I-2) бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления для иммуноконъюгата формулы (I-2) бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 41, 42 и 43.

[00314] В 14^-ом варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, включает бипаратопное антитело против FRα, связанное с майтанзиноидным соединением DM21C (также называемым Mal-LDL-DM или MalC5-LDL-DM или соединением 17а), представленное следующей структурной формулой:

где бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23, соответственно, и (ii) а вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24, соответственно; a D₁ представлен следующей формулой:

[00315] В одном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей структурной формулой:

где:

СВА представляет собой бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23, соответственно, и (ii) а вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24, соответственно; и q равно 1 или 2.

[00316] В определенных вариантах осуществления для композиций (например, фармацевтических композиций), содержащих иммуноконъюгаты 14^-го конкретного варианта осуществления, DAR находится в диапазоне от 1,5 до 2,2, от 1,7 до 2,2 или от 1,9 до 2,1. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 или 2,1.

[00317] В 15^-ом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат, представленный в данном документе, содержит бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, связанный с майтанзиноидным соединением DM21 (также называемым DM21L, LDL-DM или соединением 14с), представленным следующей структурной формулой:

через линкер N-сукцинимидилового сложного эфира γ-малеимидомасляной кислоты (GMBS) или N-(γ-малеимидобутрилокси)сульфосукцинимидного сложного эфира (сульфо-GMBS или sGMBS). Бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 23, соответственно, и (ii) вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 24 соответственно.

[00318] Линкеры GMBS и сульфо-GMBS (или sGMBS) известны в данной области и могут быть представлены следующей структурной формулой:

[00319] В одном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей структурной формулой:

где:

СВА представляет собой бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 18 и SEQ IN NO: 23, соответственно, и (ii) а вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ IN NO: 19 и SEQ IN NO: 24, соответственно; и

q равно целому числу от 1 до 10, например, 1 или 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[00320] В определенных вариантах осуществления для иммуноконъюгатов 15^-го конкретного варианта осуществления бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ IN NO: 41, 42 и 43.

[00321] В некоторых вариантах осуществления для композиций (например, фармацевтических композиций), содержащих иммуноконъюгаты 15^-го конкретного варианта осуществления, DAR находится в диапазоне от 3,0 до 4,0, от 3,2 до 3,8, от 3,1 до 3,7 или от 3,4 до 3,7. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,5, 3,7, или 3,8. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 3,5.

[00322] В определенных вариантах осуществления для композиций, содержащих конъюгаты лизина, DAR находится в диапазоне от 1,5 до 3,1. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет около 2,0.

[00323] В определенных вариантах осуществления для композиций (например, фармацевтических композиций), содержащих иммуноконъюгаты первого варианта осуществления или 1^-го, 2^-го, 3^-го, 4^-го, 5^-го, 6^-го, 7^-го, 8^-го, 9^-го, 10^-го, 11^-го, 12^-го, 13^-го, 14^-го или 15^-го в конкретном варианте осуществления среднее количество цитотоксического агента на молекулу антитела (т.е., среднее значение q), также известное как соотношение лекарственное средство-антитело (DAR) в композиции, находится в диапазоне от 1,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 1,0 до 5,0, от 1,0 до 4,0, от 1,5 до 4,0, от 2,0 до 4,0, от 2,5 до 4,0, от 1,0 до 3,4, от 1,0 до 3,0, от 3,0 до 4,0, от 3,1 до 3,5, от 3,1 до 3,7, от 3,4 до 3,6, от 1,5 до 2,5, от 2,0 до 2,5, от 1,7 до 2,3 или от 1,8 до 2,2. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет менее 4,0, менее 3,8, менее 3,6, менее 3,5, менее 3,0 или менее 2,5. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 3,1 до 3,7. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 3,1 до 3,4. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 3,3 до 3,7. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 3,5 до 3,9. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 или 3,8. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 3,5. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 1,8 до 2,0. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 1,7 до 1,9. В некоторых вариантах осуществления DAR находится в диапазоне от 1,9 до 2,1. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 1,9, 2,0 или 2,1. В некоторых вариантах осуществления для иммуноконъюгатов по данному изобретению, содержащих бипаратопное антитело против FRα или его антигенсвязывающий фрагмент, связанный с майтанзиноидным соединением через одну или несколько тиоловых групп цистеина, DAR находится в диапазоне от 1,5 до 2,5, 1,8 до 2.2, от 1.1 до 1.9 или от 1.9 до 2.1. В некоторых вариантах осуществления DAR составляет 1,8, 1,9, 2,0 или 2,1.

В. Линкеры

[00324] Любые подходящие линкеры, известные в данной области, можно использовать при получении иммуноконъюгатов по данному изобретению. В некоторых вариантах осуществления линкеры представляют собой бифункциональные линкеры. Используемый в данном документе термин «бифункциональный линкер» относится к модифицирующим агентам, которые обладают двумя реакционноспособными группами; одна из которых способна реагировать с агентом, связывающим клетки, в то время как другая реагирует с соединением майтанзиноида, связывая два фрагмента вместе. Такие бифункциональные сшивающие агенты хорошо известны в данной области (см., например, Isalm и Dent в Bioconjugation chapter 5, р 218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999). Например, бифункциональные сшивающие агенты, которые обеспечивают связывание через тиоэфирную связь, включают N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) для введения малеимидогрупп или с N-сукцинимидил-4-(йодацетил)-аминобензоатом (SIAB) для введения йодацетильных групп. Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые вводят малеимидо-группы или галогенацетильные группы в связывающий клетки агент, хорошо известны в данной области (см. публикации патентов США №№2008/0050310, 20050169933, доступные от Pierce Biotechnology Inc., РО Box 117, Rockland, IL 61105, США) и включают, но не ограничиваются ими, бисмалеимидополиэтиленгликоль (ВМРЕО), ВМ (РЕО)₂, ВМ(РЕО)₃, N-(β-малеимидопропилокси) сукцинимидный сложный эфир (BMPS), N-сукцинимидиловый сложный эфир γ-малеимидомасляной кислоты (GMBS), сложный эфир N-гидроксисукцинимида ε-малеимидокапроновой кислоты (EMCS), NHS 5-малеимидовалериановой кислоты, HBVS, N-сукцинимидил-4- (N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбокси- -(6-амидокапроат), который представляет собой «длинноцепочечный» аналог SMCC (LC-SMCC), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида (MBS), гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)-масляной кислоты или соль HCl (МРВН), N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP), N-сукцинимидил иодацетат(SIA), N-сукцинимидиловый сложный эфир κ-малеимидоундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидил 4- (п-малеимидофенил)-бутират (SMPB), сукцинимидил-6- (β-малеимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил- (4-винилсульфонил)бензоат (SVSB), дитиобис-малеимидоэтан (DTME), 1,4-бис-малеимидобутан (ВМВ), 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бис-малеимидогексан (ВМН), бис-малеимидоэтан (ВМОЕ), сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфосукцинимидил (4-йод-ацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-MBS), N-(γ-малеимидобутрилокси) сложный эфир сульфосукцинимида (сульфо-GMBS или sGMBS), N-(ε-малеимидокапроилокси) сульфосукцимидо сложный эфир (сульфо-EMCS), N-(κ-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидный сложный эфир (сульфо-KMUS) и сульфосукцинимидил 4-(п-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB).

[00325] Гетеробифункциональные сшивающие агенты представляют собой бифункциональные сшивающие агенты, имеющие две разные реакционноспособные группы. Гетеробифункциональные сшивающие агенты, содержащие как амино-реактивную N-гидроксисукцинимидную группу (NHS-группу), так и карбонил-реактивную гидразиновую группу, также могут быть использованы для связывания цитотоксических соединений, описанных в данном документе, с клеточно-связывающим агентом (например, антителом). Примеры таких коммерчески доступных гетеробифункциональных сшивающих агентов включают сукцинимидил-6-гидразиноникотинамид ацетон гидразон (SANH), гидрохлорид сукцинимидил-4-гидразидотерефталата (SHTH) и гидрохлорид никотината сукцинимидилгидразиния (SHNH). Конъюгаты, несущие неустойчивую к кислотам связь, также могут быть получены с использованием производного бензодиазепина, содержащего гидразин, по данному раскрытию. Примеры бифункциональных сшивающих агентов, которые можно использовать, включают сукцинимидил-п-формилбензоат (SFB) и сукцинимидил-п-формилфеноксиацетат (SFPA).

[00326] Бифункциональные сшивающие агенты, которые обеспечивают связывание связывающего клетки агента с цитотоксическими соединениями через дисульфидные связи, известны в данной области и включают N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB или sSPDB) для введения дитиопиридильных групп Другие бифункциональные сшивающие агенты, которые можно использовать для введения дисульфидных групп, известны в данной области и раскрыты в патентах США 6913748, 6716821 и патентных публикациях США 2009/0274713 и 2010/0129314, каждый из которых полностью включен в данное описание посредством ссылки. В качестве альтернативы также могут использоваться сшивающие агенты, такие как 2-иминотиолан, гомоцистеин тиолактон или S-ацетилянтарный ангидрид, которые вводят тиольные группы.

С. Цитотоксические агенты

[00327] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены цитотоксические агенты, которые можно использовать для получения иммуноконъюгатов согласно данному раскрытию Цитотоксический агент, используемый в иммуноконъюгатах, представленных в данном документе, может быть любым соединением, которое приводит к гибели клетки или индуцирует гибель клеток, или некоторым образом снижает жизнеспособность клеток, и включает, например, майтанзиноиды и аналоги майтанзиноидов, бензодиазепины, таксоиды, аналоги СС-1065 и СС-1065, дуокармицины и аналоги дуокармицина, енедиины, такие как калихеамицины, доластатин и аналоги доластатина, включая ауристатины, производные томаймицина, производные лептомицина, метотрексат, цисплатин, карбоплатин, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил и морфолинодоксорубицин. В некоторых вариантах осуществления цитотоксические агенты представляют собой майтанзиноиды и аналоги майтанзиноидов.

[00328] Примеры подходящих майтанзиноидов включают сложные эфиры майтанзинола и аналоги майтанзинола. Включены любые лекарственные препараты, которые ингибируют образование микротрубочек и которые являются высокотоксичными для клеток млекопитающих, а также майтанзинол и аналоги майтанзинола.

[00329] Типичные цитотоксические агенты были описаны ранее в WO 2018/160539 А1 и WO 2011/106528, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки.

[00330] Предлагаемые в данном документе иммуноконъюгаты могут содержать майтанзиноидное соединение, представленное следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

L₂' представлен следующими структурными формулами:

где:

R^x, R^y, R^x' и R^y' для каждого случая независимо представляют собой Н, -ОН, галоген, -O-(C_1-4 алкил), -SO₃H, -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, или C_1-4 алкил, необязательно замещенный ОН, галогеном, SO₃H или NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, где R₄₀, R₄₁ и R₄₂ каждый независимо представляет собой Н или C_1-4 алкил;

1 и k каждый независимо равны целому числу от 1 до 10;

J_CB' представляет собой -С(=O)ОН или -СОЕ, где -СОЕ представляет собой реакционноспособный сложный эфир;

А представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;

R¹ и R² каждый независимо представляет собой Н или С_1-3алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

где R³ и R⁴ каждый независимо представляют собой Н или Me, и фрагмент - С(=O)- в L₁ соединен с D;

D представлен следующей формулой:

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[00331] В некоторых вариантах осуществления майтанзиноид по данному изобретению представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

А' представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот (т.е., A-NH₂);

R¹ и R² каждый независимо представляет собой Н или С_1-3алкил;

L₁ представляет собой -CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(=O)-; R³ и R⁴ каждый независимо представляет собой Н или Me;

D представлен следующей формулой:

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[00332] В некоторых вариантах осуществления майтанзиноид по данному изобретению представлен следующей формулой:

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

R^x' и R^y' для каждого случая независимо представляют собой Н, -ОН, галоген, -O-(C_1-4 алкил), -SO₃H, -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, или C_1-4 алкил, необязательно замещенный ОН, галогеном, SO₃H или NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, где R₄₀, R₄₁ и R₄₂ каждый независимо представляет собой Н или C_1-4 алкил;

k равно целому числу от 1 до 10;

А представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R¹ и R² каждый независимо представляет собой Н или С_1-3алкил;

L₁ представляет собой -CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(=O)-; R³ и R⁴ каждый независимо представляет собой Н или Me;

D представлен следующей формулой:

q равен целому числу от 1 до 20. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления q равно целому числу от 3 до 4.

[00333] В некоторых вариантах осуществления для майтанзиноидных соединений формул (II), (III) или (IV) переменные такие, как описано в первом варианте осуществления или в 1^ом, 2^ом 3^ем, 4^ом, 5^ом, 6^ом, 7^ом, 8^ом, 9^ом, 10^ом или 11^ом конкретном варианте осуществления в первом варианте осуществления.

[00334] В конкретном варианте осуществления соединение майтанзиноида представлено следующей формулой:

[00335] Дополнительные примеры подходящих сложных эфиров майтанзинола включают те, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, и те, которые имеют модификации в других положениях. Такие подходящие майтанзиноиды раскрыты в патентах США №№4424219; 4256746; 4294757; 4307016; 4313946; 4315929; 4331598; 4361650; 4362663; 4364866; 4450254; 4322348; 4371533; 5208020; 5416064; 5475092; 5585499; 5846545; 6333410; 7276497 и 7473796. Кроме того, несколько описаний получения таких конъюгатов антитело-майтанзиноид предоставлено в патентах США №№6333410, 6441163, 6716821 и 7368565, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки.

[00336] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат содержит N^2'-деацетил-N^2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин (DM1), N^2'-деацетил-N-^2'-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин (называемый DM3), N^2'-деацетил-N^2'-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил) майтанзин (DM4), оба из которых были ранее описаны в публикации заявки РСТ № WO 2011/106528 А1 и патент США №8557966 В2, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки.

D. Конъюгация лекарственного средства

[00337] Иммуноконъюгаты, содержащие бипаратопное FRα-связывающее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанный с цитотоксическим агентом (например, майтанзиноидом), описанным в данном документе, могут быть получены любыми подходящими способами, известными в данной области.

[00338] В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгаты по первому варианту могут быть получены первым способом, включающим стадии реакции бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (II), описанным во втором варианте.

[00339] В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгаты по первому варианту могут быть получены вторым способом, включающим стадии:

(а) взаимодействие майтанзиноидного соединения формулы (III) или (IV) с линкерным соединением, описанным в данном документе, с образованием цитотоксического агента-соединения майтанзиноида, имеющего амино-реактивную группу или связанную с ним тиол-реактивную группу (например, соединение формулы (II)), которое может быть ковалентно связано с бипаратопным FRα-связывающим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; и

(b) взаимодействие бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с соединением майтанзиноид-линкер с образованием иммуноконъюгата.

[00340] В определенных вариантах осуществления иммуноконъюгаты по первому варианту могут быть получены третьим способом, включающим стадии:

(a) взаимодействие бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с линкерным соединением, описанным в данном документе, с образованием модифицированного бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего амино-реактивную группу или связанную тиол-реактивную группу к нему, который может быть ковалентно связан с соединением майтанзиноида формулы (III) или (IV); и

(b) взаимодействие модифицированного бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (III) или (IV) с образованием иммуноконъюгата.

[00341] В некоторых вариантах осуществления для второго, третьего или четвертого способов, описанных выше, линкерное соединение представлено любой из формул (a1L)-(a10L):

где X представляет собой галоген; J_D-SH или -SSR^d; R^d представляет собой фенил, нитрофенил, динитрофенил, карбоксинитрофенил, пиридил или нитропиридил; R^g представляет собой алкил; и U представляет собой -Н или SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль.

[00342] В одном варианте осуществления линкерное соединение представляет собой GMBS или сульфо-GMBS (или sGMBS), представленное формулой (a9L), где U представляет собой -Н или SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль.

[00343] В конкретном варианте иммуноконъюгат по данному изобретению представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат может быть получен вторым, третьим или четвертым способом, описанным выше, где линкерное соединение представляет собой GMBS или сульфо-GMBS, представленный формулой (a9L), где U представляет собой Н или SO₃H, или его фармацевтически приемлемую соль; и соединение майтанзиноида представлено формулой (D-1), описанной выше. В более конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I-1) получают путем взаимодействия майтанзиноидного соединения формулы (D-1) с линкерным соединением GMBS или сульфо-GMBS с образованием соединения майтанзиноид-линкер с последующим взаимодействием бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с соединением майтанзиноид-линкер. В еще более конкретном варианте осуществления соединение майтанзиноидного линкера не очищается перед взаимодействием с бипаратопным FRα-связывающим антителом или его антигенсвязывающий фрагментом.

[00344] В другом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат может быть получен вторым, третьим или четвертым способом, описанным выше, где линкерное соединение представляет собой GMBS или сульфо-GMBS, представленный формулой (a9L), где U представляет собой -Н или SO₃H или его фармацевтически приемлемую соль; и соединение майтанзиноида представлено формулой (D-2), описанной выше. В более конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат формулы (I-2) получают путем взаимодействия майтанзиноидного соединения формулы (D-2) с линкерным соединением GMBS или сульфо-GMBS с образованием соединения майтанзиноид-линкер с последующим взаимодействием бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с соединением майтанзиноид-линкер. В еще более конкретном варианте осуществления соединение майтанзиноидного линкера не очищается перед взаимодействием с бипаратопным FRα-связывающим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

[02] В другом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат получают согласно первому способу, описанному выше, путем взаимодействия бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (D-3), описанным выше.

[00345] В другом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат получают согласно первому способу, описанному выше, путем взаимодействия бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (D-4), описанным выше.

[00346] В другом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат получают согласно первому способу, описанному выше, путем взаимодействия антитела против FRα или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (D-5), описанным выше.

[00347] В другом конкретном варианте осуществления иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

и иммуноконъюгат получают согласно первому способу, описанному выше, путем взаимодействия бипаратопного FRα-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с майтанзиноидным соединением формулы (D-6), описанным выше.

[00348] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгаты, представленные формулами с I-3 по I-6, описанными выше, получают в соответствии со способами, описанными в предварительной заявке США 62/821707, поданной 21 марта 2019 г., и связанной с ней заявке США №16/825127.

[00349] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгаты, полученные любыми способами, описанными выше, подлежат стадии очистки. В этом отношении иммуноконъюгат может быть очищен от других компонентов смеси с использованием тангенциальной проточной фильтрации (TFF), неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, селективного осаждения или любого другого подходящего процесса очистки, а также их комбинаций.

[00350] В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат очищают с использованием одной стадии очистки (например, TFF). Предпочтительно конъюгат очищают и заменяют на соответствующий состав с использованием единственной стадии очистки (например, TFF). В других вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат очищают с использованием двух последовательных стадий очистки. Например, иммуноконъюгат можно сначала очистить селективным осаждением, адсорбционной фильтрацией, абсорбционной хроматографией или неабсорбционной хроматографией с последующей очисткой с помощью TFF. Обычный специалист в данной области поймет, что очистка иммуноконъюгата позволяет выделить стабильный конъюгат, содержащий связывающий клетки агент, химически связанный с цитотоксическим агентом.

[00351] Для очистки можно использовать любые подходящие системы TFF, включая систему типа Pellicon (Millipore, Billerica, Массачусетс), систему кассет Sartocon (Sartorius AG, Эджвуд, штат Нью-Йорк) и систему типа Centrasette (Pall Corp., East Hills, Нью-Йорк)

[00352] Для очистки можно использовать любую подходящую смолу для адсорбционной хроматографии. Предпочтительные смолы для адсорбционной хроматографии включают хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию с индукционным гидрофобным зарядом (HCIC), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию в смешанном режиме, аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом (IMAC), хроматографию с красителем лигандом, хроматографию с обращенной фазой, хроматографию с обращенной фазой и их комбинации. Примеры подходящих гидроксиапатитовых смол включают керамический гидроксиапатит (СНТ Тип I и Тип II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif), гидроксиапатит НА Ultrogel (Pall Corp., East Hills, N.Y.) и керамический фторапатит (CFT Тип I и Тип II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif). Примером подходящей смолы HCIC является смола МЕР Hypercel (Pall Corp., East Hills, N.Y.). Примеры подходящих HIC-смол включают бутил-сефарозу, гексил-сефарозу, фенил-сефарозу и октил-сефарозу (все от GE Healthcare, Piscataway, N.J), а также смолы Macro-Pre Methyl и Macro-Prep t-Butyl (Biorad Лаборатории, Hercules, Calif.). Примеры подходящих ионообменных смол включают смолы SP-Sepharose, CM-Sepharose и Q-Sepharose (все от GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих ионообменников смешанного режима включают смолу Bakerbond АВх (JT Baker, Phillipsburg N.J.). Примеры подходящих смол IMAC включают смолу с хелатирующей сефарозой (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Примеры подходящих смол с красителями-лигандами включают смолу Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) и смолу Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих аффинных смол включают смолу с протеином А-сефарозой (например, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), где связывающим клетки агентом является антитело, и смолы с лектиновой аффинностью, например смолу с лектин-сефарозой чечевицы (GE Healthcare, Piscataway, NJ), где связывающий клетки агент несет соответствующие сайты связывания лектина. В качестве альтернативы можно использовать антитело, специфичное к агенту, связывающему клетки. Такое антитело можно иммобилизовать, например, на смоле Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, N.J.). Примеры подходящих смол с обращенной фазой включают смолы С4, С8 и С18 (Grace Vydac, Hesperia, CA).

[00353] Для очистки можно использовать любую подходящую смолу для неадсорбционной хроматографии. Примеры подходящих смол для неадсорбционной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, смолы SEPHADEX ТМ G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL ТМ (например, S-200 и S-300), смолы SUPERDEX ТМ (например, SUPERDEX ТМ 75 и SUPERDEXTM 200), смолы BIO-GEL® (например, Р-6, Р-10, Р-30, Р-60 и Р-100) и другие, известные специалистам в данной области.

VII. Композиция и комплекты

[00354] В данном документе представлены композиции, содержащие описанный в данном документе иммуноконъюгат, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие желаемую степень чистоты в физиологически приемлемом носителе, наполнителе или стабилизаторе (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания). Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

[00355] Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретного пути введения субъекту. Например, фармацевтическая композиция может быть составлена для парентерального, например, внутривенного введения. Композиции, используемые для введения in vivo могут быть стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через, например, стерильные фильтрующие мембраны.

[00356] Описанные в данном документе фармацевтические композиции в одном из вариантов осуществления предназначены для применения в качестве лекарственного средства. Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут быть пригодны при лечении такого состояния, как рак. Примеры рака, который можно лечить, как описано в данном документе, включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают рак маточной трубы, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, рак толстой кишки, колоректальный рак, карцинома эндометрия или матки, рак слюнных желез, рак почки, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карцинома печени и различные виды рака головы и шеи. Рак может быть FRα-экспрессирующим раком.

[00357] Предлагаемая в данном документе фармацевтическая композиция может содержать иммуноконъюгаты, и фармацевтическая композиция (иммуноконъюгаты в фармацевтической композиции) может содержать в среднем от 1 до 20 лекарственных средств на бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 1 до 10 лекарственных средств на бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 2 до 5 лекарственных средств на бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит в среднем от 3 до 4 лекарственных средств на одно бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

VIII. Методы и применение

[00358] Бипаратопные анти-FRα-антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты по данному раскрытию пригодны во множестве применений, включая, но не ограничиваясь ими, способы терапевтического лечения, такие как лечение рака. В некоторых вариантах осуществления агенты полезны для ингибирования роста опухоли и/или уменьшения объема опухоли. Способы применения могут быть in vitro или in vivo способами.

[00359] В данном раскрытии представлены способы лечения рака, включающие введение терапевтически эффективного количества бипаратопного антитела против FRα, его антигенсвязывающего фрагмента или иммуноконъюгата субъекту (например, субъекту, нуждающемуся в лечении). В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак, включая, но не ограничиваясь этим, рак маточной трубы, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Более конкретные примеры таких видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшной полости, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди (например, тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC)), рак толстой кишки, колоректальный рак, карцинома эндометрия или матки, рак слюнной железы, рак почки, рак печени, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, гепатокарциному и различные виды рака головы и шеи.

[00360] Более конкретные примеры таких видов рака включают рак яичников, эпителиальный рак яичников, первичный рак брюшины яичников или рак маточной трубы. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников. В определенных вариантах осуществления рак яичников представляет собой эпителиальный рак яичников (ЕОС). В некоторых вариантах осуществления рак яичников (например, ЕОС) является резистентным к платине, рецидивирующим или рефрактерным. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак брюшины. В определенных вариантах осуществления рак брюшины представляет собой первичный рак брюшины. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак эндометрия. В определенных вариантах осуществления рак эндометрия представляет собой серозный рак эндометрия. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В определенных вариантах осуществления рак легких представляет собой немелкоклеточный рак легких (NSCLC). В определенных вариантах осуществления рак легкого представляет собой рак легкого, представляет собой аденокарциному или бронхиолоальвеолярную карциному. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак матки.

[00361] В определенных вариантах осуществления рак является невосприимчивым к препаратам платины. В определенных вариантах осуществления рак является первично резистентным к препаратам платины. В определенных вариантах осуществления рак чувствителен к препаратам платины.

[00362] В определенных вариантах осуществления рак является устойчивым к IMGN853.

[00363] В определенных вариантах осуществления рак представляет собой метастатический или запущенный рак.

[00364] В определенных вариантах осуществления рак экспрессирует рецептор фолиевой кислоты, с которым связывается FRα-связывающий агент или антитело. В некоторых вариантах осуществления рак сверхэкспрессирует человеческий FRα

[00365] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα, его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноконъюгат или фармацевтическую композицию, содержащую его, вводят пациенту с повышенным уровнем экспрессии FRα, например, как описано в опубликованной заявке США №2012/0282175 или международной опубликованной заявке №WO 2012/135675, обе из которых полностью включены в данный документ посредством ссылки. Типичные антитела, анализы и наборы для обнаружения FRα представлены в WO 2014/036495 и WO 2015/031815, которые во всей своей полноте включены в данный документ посредством ссылки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления экспрессия белка FRα измеряется с помощью иммуногистохимии (IHC) и дается оценка интенсивности окрашивания и/или оценка однородности окрашивания по сравнению с контролями (например, калиброванными контролями), демонстрирующими определенные баллы (например, оценка интенсивности 3 дается испытуемому образцу, если интенсивность сравнима с калиброванным контролем уровня 3 или интенсивность 2 (умеренная) присваивается испытуемому образцу, если интенсивность сравнима с калиброванным контролем уровня 2). Равномерность окрашивания, которая является «гетерогенной» (т.е. окрашено не менее 25% и менее 75% клеток) или «гомогенной» (т.е. окрашено не менее 75% клеток) вместо «очаговой» (т.е. более 0% и менее 25% окрашенных клеток) также указывает на повышенную экспрессию FRα. Показатели интенсивности окрашивания и однородности окрашивания можно использовать отдельно или в комбинации (например, 2 гомо, 2 гетеро, 3 гомо, 3 гетеро и т.д.). В другом примере увеличение экспрессии FRα может быть определено путем обнаружения увеличения по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3 или по меньшей мере в 5 раз относительно контрольных значений (например, уровня экспрессии в ткани или клетки от субъекта без рака или с раком, который не имеет повышенных значений FRα). В некоторых вариантах осуществления показатель однородности окрашивания основан на процентном содержании окрашенных клеток.

[00366] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак, который экспрессирует FRα на уровне 1 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак, который экспрессирует FRα на уровне 2 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак, который экспрессирует FRα на уровне 3 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легкого, который экспрессирует FRα на уровне 2 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легкого, который экспрессирует FRα на уровне 3 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников, который экспрессирует FRα на уровне 2 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников, который экспрессирует FRα на уровне 3 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак эндометрия, который экспрессирует FRα на уровне 2 гетеро или выше по IHC. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой эндометриоидный рак, который экспрессирует FRα на уровне 1 гетеро или выше по IHC.

[00367] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна клетка в образце, полученном от пациента, имеет показатель FRα, равный по меньшей мере 1. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна клетка в образце, полученном от пациента, имеет показатель FRα, равный по меньшей мере 2 (умеренный). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна клетка в образце, полученном от пациента, имеет показатель Frαα по меньшей мере 3.

[00368] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 33% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 66% клеток в образце, полученном от пациента имеют показатель FRα IHC составляет по меньшей мере 1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 75% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 1.

[00369] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC, равный по меньшей мере 2 (средний). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 33% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 2 (средний). В некоторых вариантах осуществления 25-75% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 2 (средний). В некотпациентаорых вариантах осуществления по меньшей мере 50% клеток в образце, полученном от, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 2 (средний). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 66% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 2 (средний). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 75% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 2 (средний).

[00370] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 25% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC, по меньшей мере 3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 33% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC по меньшей мере 3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 66% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC, по меньшей мере 3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 75% клеток в образце, полученном от пациента, имеют показатель FRα IHC, по меньшей мере 3.

[00371] В некоторых вариантах осуществления экспрессию FRα можно измерить с помощью иммуногистохимии и получить визуальную оценку, где положительный FRα может относиться к более чем или равному 50% опухолевых клеток с окрашиванием мембраны FRα, видимым при менее чем или равном 10-кратному объективу микроскопа. В некоторых вариантах осуществления экспрессию FRα можно измерить с помощью иммуногистохимии и получить визуальную оценку, где положительный FRα может относиться к более чем или равному 66% опухолевых клеток с окрашиванием мембраны FRα, видимым при менее чем или равном 10-кратному объективу микроскопа. В некоторых вариантах осуществления экспрессию FRα можно измерить с помощью иммуногистохимии и получить визуальную оценку, где положительный FRα может относиться к более чем или равному 75% опухолевых клеток с окрашиванием мембраны FRα, видимым при менее чем или равном 10-кратному объективу микроскопа.

[00372] В определенных вариантах осуществления субъектом является человек.

[00373] В данном описании также представлены способы ингибирования роста опухоли с использованием бипаратопных aHTH-FRα-антител, их антигенсвязывающих фрагментов и иммуноконъюгатов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления способ ингибирования роста опухоли включает контактирование опухоли с бипаратопными анти-FRα-антителами, их антигенсвязывающими фрагментами и иммуноконъюгатами, представленными в данном документе iin vitro. Например, иммортализованная клеточная линия или линия раковых клеток, экспрессирующая FRα, культивируется в среде, в которую добавлены бипаратопные анти-FRα-антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты для ингибирования роста опухоли. В некоторых вариантах осуществления опухолевые клетки выделяют из образца пациента, такого как, например, биопсия ткани, плевральный выпот или образец крови, и культивируют в среде, в которую добавлены бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты для подавления роста опухоли.

[00374] В некоторых вариантах осуществления способ ингибирования роста опухоли включает контактирование опухоли или опухолевых клеток с бипаратопными антителами против FRα, их антигенсвязывающими фрагментами и иммуноконъюгатами in vivo. В определенных вариантах осуществления приведение опухоли или опухолевой клетки в контакт с бипаратопными антителами против FRα, их антигенсвязывающими фрагментами и иммуноконъюгатами проводят на животной модели. Например, бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты можно вводить в ксенотрансплантаты, экспрессирующие одну или несколько опухолей, которые были выращены у мышей с ослабленным иммунитетом (например, мышей NOD/SCID), для подавления роста опухоли. В некоторых вариантах осуществления раковые стволовые клетки выделяют из образца пациента, такого как, например, биопсия ткани, плевральный выпот или образец крови, и вводят мышам с ослабленным иммунитетом, которым затем вводят бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты для подавления роста опухолевых клеток.

[00375] В определенных вариантах осуществления способ ингибирования роста опухоли включает введение субъекту терапевтически эффективного количества бипаратопных антител против FRα, их антигенсвязывающих фрагментов и иммуноконъюгатов. В определенных вариантах осуществления субъектом является человек. В определенных вариантах осуществления у субъекта есть опухоль или опухоль была удалена.

[00376] Введение может быть парентеральным, включая внутривенное, введением.

[00377] Количество бипаратопного иммуноконъюгата, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, которое будет эффективным при лечении состояния, будет зависеть от природы заболевания. Точная доза, используемая в композиции, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания.

[00378] В некоторых вариантах осуществления в данном документе представлены бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноконъюгаты или фармацевтические композиции, содержащие их, для использования в качестве лекарственного средства. В некоторых аспектах в данном документе представлены бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноконъюгаты или фармацевтические композиции для использования в способе лечения рака. В некоторых аспектах в данном документе представлены бипаратопные антитела против FRα, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноконъюгаты или фармацевтические композиции для использования в способе лечения рака у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества бипаратопного антитела против FRα, их антигенсвязывающих фрагментов, иммуноконъюгатов или фармацевтических композиций, представленных в данном документе.

[00379] В одном аспекте бипаратопные анти-FRα-антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и иммуноконъюгаты согласно данному описанию применимы для обнаружения присутствия FRα, например, в биологическом образце. Используемый в данном документе термин «обнаружение» охватывает количественное или качественное обнаружение. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает клетку или ткань. В некоторых вариантах осуществления такие ткани включают нормальные и/или раковые ткани, которые экспрессируют FRα на более высоких уровнях по сравнению с другими тканями. В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия FRα определяет наличие рака яичников, рака легких, рака головного мозга, рака груди, рака матки, рака почек или рака поджелудочной железы.

[00380] В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения присутствия FRα в биологическом образце включает контактирование биологического образца с бипаратопным анти-FRα антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или иммуноконъюгатом в условиях, допускающих связывание бипаратопного анти-FRα антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или иммуноконъюгата, и определение того, образуется ли комплекс между бипаратопным анти-FRα-антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или иммуноконъюгатом и FRα

[00381] В некоторых вариантах осуществления бипаратопное антитело против FRα, его антигенсвязывающий фрагмент или иммуноконъюгат помечены. Метки включают, но не ограничиваются ими, метки или фрагменты, которые обнаруживаются напрямую (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые обнаруживаются косвенно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия.

[00382] Варианты осуществления данного раскрытия могут быть дополнительно определены ссылкой на следующие неограничивающие примеры, которые подробно описывают получение определенных антител данного раскрытия и способы использования антител данного раскрытия. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что многие модификации, как материалов, так и способов, могут быть осуществлены на практике, не выходя за пределы объема данного раскрытия.

ПРИМЕРЫ

[00383] Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и объем данной заявки.

Пример 1. Получение бипаратопных антител.

Экспрессия биспецифических антител

[00384] Как описано ранее, панель мышиных антител против FRα получали с помощью стандартной гибридомной технологии и гуманизировали с использованием метода восстановления поверхности (см., например, WO 2011/106528 А1). Антитела были разделены на две группы в зависимости оттого, конкурируют ли они с Mov19 за связывание (корзина 1) или нет (корзина 2: FRα-антитело А, FRα-антитело В, FRα-антитело С и FR57) с использованием конкурентного анализа FACS. Вкратце, М9346А-биотинилированное антитело в концентрации 1,5×10^-9М смешивали с Frα антителом A, Frα антителом В, Frα антителом С и FR57 в диапазоне концентраций, обычно от 5×10^-8 М до 5×10^-11 М. В качестве контроля конкуренции полного связывания, использовали небиотинилированное антитело М9346А. Смесь добавляли в 96-луночные планшеты, содержащие 20000 FRα-положительных клеток KB на лунку, и планшеты инкубировали на льду в течение одного часа. Затем клетки промывали холодным фосфатно-солевым буфером/1% бычьим сывороточным альбумином, и связанный huM9346A-биотин детектировали с помощью реагента стрептавидин-РЕ. Образцы анализировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur. Как показано на ФИГ. 1, только контрольное антитело М9346А конкурировало с huM9346A-биотином за связывание; ни одно из четырех проанализированных FR-антител не мешало связыванию huM9346A-биотина.

[00385] Используя вариабельные области (VH и VL) Bin1 и Bin 2 антител, были сконструированы несколько бипаратопных молекул с использованием двух различных форматов: формата Моррисона и асимметричного Fc. Вкратце, для молекул на основе формата Моррисона последовательности, соответствующие областям VH и VL антител Bin1 или Bin2, были соединены линкером (G4S)4 для создания одноцепочечного фрагмента (scFv), который затем был слит с С или N-концом тяжелой цепи или Bin 2 или Bin1 IgG1 с использованием линкера (G4S)3. Бипаратопные молекулы на основе асимметричного Fc были созданы с FR57scFv и Mov19 Fab с использованием технологии Knobs-in-hole (выступы во впадины) Protein Eng. 1996 Jul; 9(7):617-21.'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Ridgway JB, Presta LC, Carter, P). Вкратце, FR1-57scFv был слит с сконструированной областью Fc, содержащей C220S (мутация непарного цистеина в серии) и мутацию «выступа» (T366W); и Fab-область Movl9 к сконструированному Fc, содержащему «впадина» мутацию (T366S, L368A и Y407V). Если не указано иное, все нумерации основаны на системе ЕС. На ФИГ. 2 показаны различные форматы антител, оцененные в последующих экспериментах.

[00386] Последовательности определенных сконструированных молекул представлены в Таблицах 6-7. Гены, соответствующие этим биспецифическим антителам, были оптимизированы по кодонам, синтезированы и клонированы в плазмиды с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Соотношение плазмид легкой и тяжелой цепей для трансфекций сохранялось 1:3 для молекул на основе Моррисона; и 9:3:1 (Mov19LC:Mov19 НС-впадина: FR57scFv-выступ) для молекул на основе асимметричного Fc. Как показано на ФИГ. 3, несколько соотношений трансфекций плазмид тяжелой и легкой цепей были исследованы для получения молекул на основе асимметричного Fc с соотношением 9:3:1, показывающих минимальное количество гомодимеров.

[00387] Все молекулы биспецифических антител временно продуцировались в 293Т. Вкратце, для трансфекций 293Т экспрессионные конструкции временно получали в адаптированных к суспензии клетках HEK-293Т с использованием PEI в качестве реагента для трансфекций во встряхиваемых колбах. Временные трансфекций PEI выполняли, как описано ранее (Durocher et al., Nucleic Acids Res. 30 (2): E9 (2002)), за исключением того, что клетки НЕК-293Т выращивали в Freestyle 293, а объем культуры оставляли неразбавленным после добавления комплексов PEI-ДНК. Трансфекций инкубировали в течение недели и собирали.

Очистка антител

[00388] Отфильтрованный супернатант очищали с использованием схемы, которая по существу состоит из двух стадий хроматографии: сродства к белку А и керамического гидроксиапатита (СНТ). Вкратце, отфильтрованный супернатант загружали в колонку с протеином А, которую предварительно уравновешивали 1X PBS (рН 7,3±0,1). Колонку промывали 1X PBS (рН 7,3±0,1) для уменьшения неспецифических белков клетки-хозяина. Связанное антитело элюировали 25 мМ уксусной кислотой, содержащей 50 мМ хлорида натрия (рН 3,2), и немедленно нейтрализовали 1 М трис-основанием до рН 7,0±0,2. Нейтрализованный пул разбавляли 1:10 в буфере для связывания СНТ (15 мМ фосфат натрия, рН 7,0±0,1) и наносили на колонку СНТ типа II (размер частиц 40 мкм), предварительно уравновешенную буфером для связывания СНТ. Связанный белок элюировали с использованием линейного градиента (от 15 мМ до 160 мМ фосфата натрия в 10 объемах колонки), и представляющие интерес фракции (высокий процент мономеров по эксклюзионной хроматографии, SEC) объединяли, диализовали против IX PBS (рН 7,3±0,1) и стерилизовали фильтром. Конечную концентрацию антител определяли путем измерения оптической плотности при 280 нм и коэффициента экстинкции 1,44 мл мг^-1 см^-1.

[00389] Все эксперименты по очистке проводились в системе очистки АКТА, которая была оборудована встроенными УФ-датчиками, датчиками проводимости и рН. SEC-анализ выполняли с использованием системы Agilent HPLC 1100 путем введения 40 мкг образца в колонку TSKgel G3000SWXL (7,8×300 мм), которая также имела встроенную защитную колонку (6,0×40 мм) для продления срока службы колонки. Подвижная фаза содержала 50 мМ натрий-фосфатного буфера и 400 мМ перхлората натрия, скорость потока составляла 1,0 мл/мин, аэлюирование изократично.

Пример 2. Влияние формата бипаратопных антител на продукцию, стабильность и функциональную активность антител.

Характеристики связывания родительских антител (Bin 1 и Bin 2)

[00390] В Таблице 10 приведены кинетические параметры связывания антител Bin1 и Bin 2 с рекомбинантным антигеном FRα. Значения KD были получены с помощью интерферометрии биослоя, выполненной на системе Octet96 (Fortebio), в основном в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем. Вкратце, сенсоры против человеческого или мышиного -Fc предварительно замачивали в 1X кинетическом буфере (Fortebio) в течение 10 минут и инкубировали с 5 мкг/мл IgG Bin 1 или Bin 2 в течение 5 минут. Затем датчики последовательно перемещали в 1X кинетический буфер на 5 минут для определения исходного уровня, серийные разведения антигена для ассоциации (10 минут) и 1X кинетический буфер для диссоциации (10 минут). Необработанные данные были собраны, обработаны и подогнаны к простой модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения для анализа Fortebio для определения кинетических параметров Kon и Koff.

Стабильность бипаратопных антител

[00391] Бипаратопные антитела были созданы путем объединения антитела Mov19 с антителом, распознающим другой неперекрывающийся эпитоп. В частности, IgG на основе формата Моррисона были созданы путем слияния scFv одного из Bin IgG с C или N-концом IgG из другого бункера. В Таблице 11 перечислены все исследованные комбинации. ScFv, слитые с С-концом, имели ориентацию VH-VL; и те, которые слились с N-концом, были в ориентации VL-VH. Mov19 исследовали как scFv только на С-конце в обеих VH-VL и VL-VH ориентациях с и без дисульфид-стабилизирующими мутациями Бринкмана VH44-VL100 (PNAS 1993 August; 90 (16): 7538-754. A recombinant immunotoxin containing а disulfide-stabilized Fv fragment. U Brinkmann, Y Reiter, S H Jung, В Lee, and I Pastan).

[00392] Как показано в Таблице 9, значительное количество бипаратопных молекул на основе формата Моррисона имело низкий процент мономеров после аффинной очистки протеина А. Поскольку масштабируемость или технологичность могут быть проблемой для конструкций с низким процентным содержанием мономера или титра, для дальнейшей оценки были отобраны восемь конструкций (обозначенных звездочками в Таблице 9), которые показали более высокие титры и процентное содержание мономеров более 70. Эти восемь конструкций были дополнительно тщательно почищены с помощью хроматографии на керамическом гидроксиапатите до чистоты более 95% и подвергнуты дальнейшей характеризации. Чтобы учесть влияние общей конформации молекулы или возможных структурных изменений плеч scFv на связывание бипаратопных плеч, эффективность связывания каждого плеча восьми конструкций Моррисона оценивали с помощью конкурентного анализа FACS. Вкратце, FRα-положительные клетки T47D инкубировали с 0,8 нМ антитела Моррисона, смешанного с соответствующим мышиным родительским антителом, в диапазоне концентраций, обычно от 50 нМ до 0,2 нМ. После инкубации на льду в течение 2 часов клетки отмывали от несвязавшихся антител, и связанное антитело Моррисона выявляли с помощью вторичного антитела, меченного FITC человека. Уменьшение связывания антитела Моррисона в присутствии возрастающей концентрации родительского антитела указывает на влияние на связывание второго набора плеч. Как показано на ФИГ. 4А-4Н и Таблица 12, пять из восьми антител Моррисона имели либо полностью неактивные, либо частично пораженные руки. Среди трех антител Моррисона, имеющих оба набора функциональных плеч, два антитела (FRα-Антитело-A-scFv2-Mov19-IgG1 и FRα-Антитело-C-scFv2-Mov19-IgG1) проявляли проблемы со стабильностью. На основании этих данных для дальнейшей оценки был выбран FR57scFv2-Mov19-IgG1 («Тетравалентный»).

[00393] В отдельном эксперименте также экспрессировались две бипаратопные молекулы на основе формата асимметричного Fc (FR57scFv2-выступ-Mov19-впадина и FR57scFv3wt-выступ-Mov19-впадина). FR57scFv2-выступы-Mov19-впадина («KIN») показал более высокий % мономера и титр и был выбран для дальнейшей оценки. Как показано на ФИГ. 5, эта молекула работает как одна полоса (соответствует ~ 125 кДа) при гель-электрофорезе в невосстанавливающих условиях и распадается на 3 полосы (одна соответствует легкой цепи (~ 25 кДа), а две - тяжелым цепям (FR57scFv- Fc-выступ и Моу19-НС-впадина) аналогичного размера (~ 50 кДа каждая)) в восстанавливающих условиях. Эти результаты предполагают, что FR57scFv2-выступ-Mov19-впадина правильно собирается в культуре клеток и не распадается во время очистки.

[00394] Затем стабильность молекулы FR57scFv2-выступ-Mov19-впадина оценивали путем нагревания молекулы при 40°С (концентрация: 10 мг/мл в 1X PBS) в течение 2 недель и выполнения анализа SEC, по существу, с использованием процедур, описанных в Примере 1. На ФИГ. 6 показано наложение SEC для образца дня 0 и дня 14. В частности, не наблюдали агрегации или расщепления, что свидетельствует о хорошей стабильности молекулы.

Связывание и обработка антител

[00395] Влияние формата антитела на связывание и процессинг антитела оценивали in vitro с использованием 3 [Н]-антител. Вкратце, FRα-положительные клетки KB подвергали воздействию насыщающей концентрации родительского, бипаратопного KIH или антитела Моррисона в течение 30 минут при 37°С, промывали PBS для удаления любого несвязанного антитела, ресуспендировали в свежей культуральной среде и инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 6% CO2 в течение 22 часов. Количество свободной от белка радиоактивности (процессированное антитело) и связанной с белком радиоактивности (необработанное антитело) оценивали после экстракции ацетоном и подсчета жидкостной сцинтилляции, и данные использовали для расчета сайтов связывания антитела на клетку (АВС),% обработанного антитела и количество обработанного антитела. Предварительный эксперимент показал, что процессинг родительских антител М9346А и huFR57 был аналогичным. Соответственно, в дальнейших экспериментах использовали только одно родительское антитело (М9346А).

[00396] Оба бипаратопных формата (KIH и четырехвалентный) показали повышенное количество обработанного антитела по сравнению с исходным антителом (ФИГ. 7С и 7D). Что интересно, механизмы улучшенной доставки/обработки двух бипаратопных форматов были разными. Бипаратопное антитело KIH имело более высокий ABC и эффективность интернализации, аналогичную моноспецифическому родительскому антителу (ФИГ. 7А-7D), тогда как четырехвалентное антитело Моррисона показало улучшенную эффективность интернализации со значениями ABC, сравнимыми с исходным антителом (ФИГ. 7С и 7D). Количество разрушенного антитела для двух бипаратопных форматов было одинаковым (ФИГ. 7Е и 7F).

Пример 3. Получение бипаратопных иммуноконъюгатов, нацеленных на FRα.

Получение конъюгатов FR57scfv-huMov19-сульфо-SPDB-DM4

[00397] Молярную концентрацию FR57scfv-huMov19, сульфо-SPDB и DM4 рассчитывали согласно закону Бера с использованием значений поглощения УФ/видимого света при 280, 343 и 412 нм и коэффициентов экстинкции соответственно. Концентрацию линкера определяли взаимодействием линкера с 25 мМ DTT в 50 мМ калий-фосфатном буфере, 50 мМ хлорида натрия с 2 мМ EDTA при рН 7,5 и измерением высвобождения тиопиридина при 343 нм. Концентрацию лекарственного средства определяли взаимодействием DM4 с 10 мМ DTNB [5,5-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)] в 50 мМ калий-фосфатном буфере, 50 мМ хлорида натрия с 2 мМ EDTA при рН 7,5 и измерением оптической плотности при 412 нм..

[00398] Перед конъюгацией антител смесь сульфо-SPDB-DM4 in situ была приготовлена путем взаимодействия 1,5 мМ сульфо-SPDB с 1,95 мМ DM4 в 30% водном [15 мМ фосфате калия рН 7,6) и 70% органическом [(N-N-диметилацетамид, DMA, SAFC)] при 25°С в течение 90 мин. Во время реакции конъюгации раствор 2,5 мг/мл антитела реагировал с 8-8,5-кратным молярным избытком сульфо-SPDB-DM4 над антителом в 15 мМ фосфате калия рН 7,6 с 10% DMA (об./об.) в течение 15-20 часов при 25°С. Реакционную смесь очищали в 10 мМ ацетата, 9% сахарозы, 0,01% Tween 20, буфера для рецептуры рН 5,0 с использованием обессоливающих колонок Sephadex 25 на AKTA и фильтровали через шприц-фильтр с PVDF-мембраной 0,22 мкм.

[00399] Молярное соотношение DM4, конъюгированного с антителом (DAR), и процент неконъюгированных видов майтанзиноидов определяли, как описано ниже. Очищенный конъюгат, как было обнаружено, содержал, 3,4 моль ОМ4/моль антитела по данным УФ-видимого излучения, 99,8% мономера по данным SEC и менее 2% свободного лекарственного средства по данным колоночного анализа HPLC Hisep.

[00400] DAR определяли путем измерения поглощения УФ/видимой области при 252 и 280 нм и расчета концентрации Ab и концентрации DM4 с использованием биномиальных уравнений, которые учитывают вклад каждого компонента. Количество несвязанного майтанзиноида, присутствующего в конечном образце конъюгата FR57scfv-huMovl9-сульфо-DM4, рассчитывали из результирующих площадей пиков, наблюдаемых в образцах, проанализированных с помощью колонки HISEP (25 см × 4,6 мм, 5 мкм). Процент свободного майтанзиноида (% FM), присутствующего в образце конъюгата, был рассчитан с использованием следующего уравнения:% свободного майтанзиноида = (РА 252 в обратной фазе из-за DM4)/(PA 252 в обратной фазе из-за DM4 + поток через РА 252 из-за к DM4) × 100%.

Получение конъюгата выступ во впадину (KIH)-FR57scfv-huMov19-сульфо-SPDB-DM4

[00401] Перед конъюгацией антител смесь сульфо-SPDB-DM4 in situ была приготовлена путем взаимодействия 1,5 мМ сульфо-SPDB с 1,95 мМ DM4 в 30% водном [15 мМ фосфате калия рН 7,6) и 70% органическом [(N-N-диметилацетамид, DMA, SAFC)] при 25°С в течение 90 мин. Во время реакции конъюгации раствор 3,0 мг/мл антитела реагировал с 10-кратным молярным избытком сульфо-SPDB-DM4 над антителом в 15 мМ фосфате калия рН 7,6 с 11% DMA (об./об.) в течение 15-20 часов при 25°С. Реакционную смесь дважды очищали в 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% твина 20, буфера для рецептуры с рН 5,5 с использованием обессоливающих колонок NAP и фильтровали через шприц-фильтр с PVDF-мембраной 0,22 мкм. Очищенный конъюгат, как было обнаружено, имел 2,9 моль DM4/моль антитела по данным УФ-видимого излучения, 90,6% мономера по данным SEC и менее 1% свободного лекарственного средства по данным колоночного анализа HPLC Hisep.

Получение конъюгатов FR57scfv-huMov19-DM21

[00402] Молярную концентрацию FR57scfv-huMov19, сульфо-GMBS и DM21 рассчитывали в соответствии с законом Бера с использованием значений поглощения УФ/видимого света при 280, 343 и 412 нм и коэффициентов экстинкции соответственно. Концентрацию линкера определяли взаимодействием линкера с 50 мМ DTT в 25 мМ DTT в 50 мМ калий-фосфатном буфере, 50 мМ хлорида натрия с 2 мМ EDTA при рН 7,5 и измерением высвобождения тиопиридина при 343 нм. Концентрацию лекарства определяли взаимодействием DM21 с 10 мМ DTNB [5,5-дитиобис-(2-нитробензойная кислота)] в 50 мМ калий-фосфатном буфере, 50 мМ хлорида натрия с 2 мМ EDTA при рН 7,5 и измерением оптической плотности при 412 нм.

[00403] Перед конъюгацией смесь сульфо-GMBS-DM21 in-situ получали взаимодействием 1,5 мМ сульфо-GMBS с 1,95 мМ DM21 в 60/40 (об./об.) DMA и сукцинатном буфере рН 5,0 соответственно. Конъюгацию проводили с 6,5 линкерным избытком сульфо-GMBS-DM21 над антителом при 2,5 мг мл в 60 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоте (EPPS) рН 8,0 с 10% DMA (об./об.). После 20-22-часовой инкубации при 25°С реакционную смесь очищали в 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твина 20, рН 5,5 с использованием колонок для обессоливания NAP и фильтровали через мембранный фильтр из PVDF 0,22 мкм.

[00404] Молярное соотношение DM21, конъюгированного с антителом (DAR), и процент неконъюгированных видов майтанзиноидов определяли, как описано ниже. Очищенный конъюгат, как было установлено, содержал 3,7 моль DM21/моль антитела по данным УФ-видимого излучения, 98% мономера по данным SEC и менее 2% свободного лекарственного средства по данным колоночного анализа HPLC Hisep.

[00405] Молярное соотношение DM21, конъюгированного с антителом (DAR), определяли путем измерения поглощения УФ/видимого света при 252 и 280 нм и расчета концентрации Ab и концентрации DM21 с использованием биномиальных уравнений, которые учитывают вклад каждого компонента. Количество несвязавшегося майтанзиноида, присутствующего в конечном образце конъюгата FR57scfv-huMov19-GMBS-DM21L, рассчитывали из результирующих площадей пиков, наблюдаемых в образцах, проанализированных с помощью колонки HISEP (25 см × 4,6 мм, 5 мкм). Процент свободного майтанзиноида (% FM), присутствующего в образце конъюгата, рассчитывали с использованием следующего уравнения: % Свободного майтанзиноида = (РА 252 в обратной фазе из-за DM21)/(PA 252 в обратной фазе из-за DM21 + поток через РА 252 из-за DM21)×100%.

Получение конъюгата выступ во впадину (KIH)-FR575scfv-huMov19-сульфо-GMBS-DM21L

[00406] Первоначальные партии KIH-FR57scfv-huMov19-GMBS-DM21L были приготовлены с использованием более низких концентраций лекарственного средства и линкера в смеси in-situ и более низкой концентрации антител во время процесса конъюгации. Вкратце, перед конъюгацией смесь сульфо-GMBS-DM21 in-situ получали взаимодействием 1,5 мМ сульфо-GMBS с 1,95 мМ DM21 в 60/40 (об.об.) DMA и сукцинатном буфере, рН 5,0, соответственно. Конъюгацию проводили с 7,5 линкерным избытком сульфо-GMBS-DM21 над антителом при 2,5 мг мл в 60 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоте (EPPS) рН 8,0 с 10% DMA (об./об.). После 20-22-часовой инкубации при 25°С реакционную смесь дважды очищали в 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твина 20, рН 5,5 с использованием колонок для обессоливания NAP и фильтровали через мембранный фильтр из PVDF 0,22 мкм. Было обнаружено, что очищенный конъюгат содержит 3,1 моль DM21/моль антитела по данным УФ-видимого излучения, 99,1% мономера по данным SEC и менее 2% свободного лекарственного средства по данным колоночного анализа HPLC Hisep.

[00407] Более поздние партии KIH-FR57scfv-huMov19-GMBS-DM21L для использования в исследованиях фармакокинетики и эффективности были приготовлены с использованием более высоких концентраций лекарственного средства и линкера в смеси in-situ и более высоких концентраций антител в процессе конъюгации. Вкратце, перед конъюгацией смесь сульфо-GMBS-DM21 in-situ получали взаимодействием 3 мМ сульфо-GMBS с 3,9 мМ DM21 в 60/40 (об.об.) DMA и сукцинатном буфере, рН 5,0, соответственно. Конъюгацию проводили с 6,5-7 линкерным избытком сульфо-GMBS-DM21 над антителом при 5,7-6 мг/мл в 60 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновой кислоте (EPPS) рН 8,0 с 10% DMA. (об./об). После 20-22-часовой инкубации при 25°С реакционную смесь очищали в 10 мМ сукцината, 250 мМ глицина, 0,5% сахарозы, 0,01% Твина 20, рН 5,5 с использованием колонок для обессоливания Sephadex-25 на АКТА и фильтровали через мембранный фильтр из PVDF 0,22 мкм. Было обнаружено, что очищенный конъюгат содержит 3,1 моль DM21/моль антитела по данным УФ-видимого излучения, 98,7% мономера по данным SEC и менее 2% свободного лекарственного средства по данным колоночного анализа HPLC Hisep.

[00408] Композиция, содержащая конструкцию KIH-FR57scfv-huMov19-GMBS-DM21L с DAR 3,5, обозначается как «IMGN151»

Пример 4. Влияние формата бипаратопных антител на эффективность иммуноконъюгата.

In vitro цитотоксичность бипаратопных иммуноконъюгатов

[00409] Влияние формата бипаратопных антител на цитотоксичность иммуноконъюгатов оценивали in vitro с использованием клеток KB, Igrov-1 и T47D. Сульфо-SPDB-DM4 конъюгаты родительских, KIH и антител Моррисона получали в соответствии со способами, описанными в Примере 3. Конъюгаты разводили в соответствующей культуральной среде и добавляли в лунки 96-луночных планшетов с плоским дном, содержащих 1×103 кл./лунку. Планшеты инкубировали при 37°С, 6% CO₂ в течение 5 дней. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа WST-8 в соответствии с протоколом производителя, а С₅₀ получали с использованием сигмоидальной кривой нелинейной регрессии (GraphPad Software Inc.) по сигмоидальной зависимости от дозы (переменный наклон).

[00410] Оба бипаратопных конъюгата сульфо-SPDB-DM4 были более активными, чем конъюгат родительского антитела, против двух из трех протестированных линий клеток, экспрессирующих FRα от умеренного до низкого уровня (Igrov-1 и T47D). Единственной клеточной линией, в равной степени чувствительной к трем конъюгатам, была KB, которая имеет очень высокий уровень целевой экспрессии. Конъюгат KIHN продемонстрировал более высокую цитотоксическую активность, чем конъюгат формата Моррисона, против линии клеток T47D (т.е. клеток с самым низким уровнем целевой экспрессии). Однако как конъюгат КШ, так и конъюгат формата Моррисона были одинаково активны в отношении двух других проанализированных линий.

In v/уопротивоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90

[00411] Влияние формата четырехвалентного бипаратопного антитела на терапевтическую эффективность иммуноконъюгата оценивали in vivo с использованием модели ксенотрансплантата OV-90. Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 7 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для состава, тетравалентный s-SPDB-DM4 в дозах 2,5 и 5 мг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозах 2,5 и 5 мг/кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 80 день после инокуляции.

[00412] Объем опухолей измеряли два раза в неделю в трех измерениях с помощью штангенциркуля. Объем выражали в мм3 по формуле (длина × ширина × высота) (Cancer Chemother. Pharmacol. 1989 (24): 148-154. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. MM Tomayko и CP Reynolds Массу тела измеряли два раза в неделю в качестве приблизительного показателя токсичности тестируемого агента. Активность оценивали, как описано в Cancer Res. 1991, Sept. (51): 4845-4852. Experimental Antitumor Activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a Taxol Analogue. M Bissery, D Guenard, F Gueritte-Voegelein, et al.

[00413] Результаты исследования показаны на ФИГ. 8 и Таблице 14. Тетравалентный-s-SPDB-DM4 коньюгат был активен как при дозах 2,5, так и при 5 мг/кг, с Т/С 13% и 11% соответственно. Доза 2,5 мг/кг имела Т-С 32 дня, LCK 1,25 (активный), 2/6 PR и 0/6 CR. Доза 5 мг/кг имела Т-С 47 дней, LCK 1,84 (активный), 2/6 PR, 2/6 CR и 1/6 TFS. Конъюгат M-s-SPDB-DM4 был активен при дозе 2,5 мг/кг с Т/С 26% и высокоактивен при дозе 5 мг/кг с Т/С 3%. Доза 2,5 мг/кг имела Т-С 25 дней, LCK 0,98 (неактивный) и без регрессов. Т-С и LCK не могли быть определены для группы 5 мг/кг из-за некроза при малых объемах опухоли. Однако в группе было 4/6 PR, 3/6 CR и 3/6 TFS. На 13-й день после инокуляции во всех группах исследования наблюдалась минимальная потеря массы тела 2-5% с крайним упадком сил. Результаты этого исследования показывают, что четырехвалентный формат ADC не обеспечивает улучшения активности по сравнению с родительским конъюгатом.

In vivo противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека IGROV-1

[00414] Влияние формата четырехвалентного бипаратопного антитела на терапевтическую эффективность иммуноконъюгата оценивали in vivo с использованием модели ксенотрансплантата IGROV-1. Мышей рандомизировали на группы (n=8 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 11 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для композиции, тетравалентный-s-SPDB-DM4 в дозе 100 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозе 100 мкг/кг. Для учета возможной недостаточной дозировки четырехвалентного конъюгата из-за различий в молекулярной массе между четырехвалентным антителом и родительским антителом (то есть разницы в 50 кДа) в этом исследовании и во всех последующих исследованиях дозы были нормализованы по полезной нагрузке. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 81 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано в подразделе выше («Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90»).

[00415] Результаты исследования показаны на ФИГ. 9 и Таблице 15. Конъюгаты тетравалентный-s-SPDB-DM4 и родительский M-s-SPDB-DM4 были активны при 100 мкг/кг с Т/С 21% и 15% соответственно. Т-С и LCK не могли быть определены для группы из-за некроза при малых объемах опухоли. Четырехвалентный конъюгат имел 2/8 PR, 1/8 CR и 0/8 TFS, тогда как M-s-SPDB-DM4 имел 3/8 PR, 1/8 CR и 0/8 TFS. В большинстве групп в исследовании наблюдалась минимальная потеря веса, за исключением четырехвалентного ADC 100 мкг/кг, у которого потеря веса составила 8% при потере сил на 14 день после инокуляции. Опять же, результаты этого исследования показывают, что четырехвалентный формат ADC не обеспечивает улучшения активности по сравнению с родительским конъюгатом.

In vivo противоопухолевая активность бипаратопного ADC KIH у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90

[00416] Влияние формата бипаратопного антитела KIH на терапевтическую эффективность иммуноконъюгата оценивали in vivo с использованием модели ксенотрансплантата OV-90. Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 7 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для состава, KIH-s-SPDB-DM4 в дозах 40, 20 и 10 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозе 20 мкг/кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 80 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано в подразделе («Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90»).

[00417] Результаты исследования показаны на ФИГ. 10 и Таблице 16. Конъюгат KIH-s-SPDB-DM4 был высокоактивным при 40 мкг/кг, активным при 20 мкг/кг и неактивным при 10 мкг/кг, с Т/С 6%, 12% и 83% соответственно. Группа с дозой 40 мкг/кг имела Т-С 29 дней, LCK 1,84 (активный), 3/6 PR, 2/6 CR и 0/6 TFS. Группа с дозой 20 мкг/кг имела Т-С 38 дней, LCK 1,32 (активный) и без регрессии. Группа 10 мкг/кг имела Т-С 2 дня, LCK 0,09 (неактивный) и без регрессии. Родительский конъюгат M-s-SPDB-DM4 был неактивным при 20 мкг/кг с Т/С 81% и без регрессии. Т-С и LCK не могут быть определены для этой группы из-за некроза при малых объемах опухоли. В этом исследовании не наблюдалось потери массы тела. В отличие от исследований, проведенных с четырехвалентным конъюгатом, было показано, что KIH-s-SPDB-DM4 значительно более активен, чем M-s-SPDB-DM4. По результатам этих исследований формат KIH был выбран вместо четырехвалентного для дальнейшей оценки.

Пример 5. In vitro активность бипаратопного антитела типа "выступ во впадину", конъюгированного с DM21.

In vitro цитотоксичность бипаратопного антитела типа "выступ во впадину", конъюгированного с DM21.

[00418] Цитотоксичность in vitro бипаратопного антитела KIH, конъюгированного с DM21, оценивали на множестве клеточных линий в соответствии с протоколом, описанным в Примере 4 («Цитотоксичность бипаратопных иммуноконъюгатов in vitro»). В более раннем исследовании было показано, что активность двух родительских конъюгатов DM21 (M-DM21 и huFR57-DM21) очень похожа (ФИГ. 11). Во всех дальнейших исследованиях активность KIH-DM21 сравнивали с конъюгатами родительского М-антитела (M-s-SPDB-DM4 и M-DM21) для оценки вклада бипаратопного формата и полезной нагрузки DM21 в общую цитотоксичность KIH-DM21.

[00419] KIH-DM21 был заметно более активен, чем два родительских конъюгата, против трех из пяти протестированных линий клеток (Igrov-1, T47D и JHOS-4). (Фиг. 12А-12Е.) Кроме того, два конъюгата с линкером/полезной нагрузкой DM21 (KIH-DM21 и M-DM21) были одинаково активны против клеток Jeg-3, тогда как конъюгат M-s-SPDB-DM4 продемонстрировал меньшую активность против этой клеточной линии. Только одна клеточная линия (KB), которая демонстрирует самый высокий уровень экспрессии FRα, была одинаково чувствительна ко всем трем конъюгатам. Соответственно, эти результаты показывают, что KIH-DM21 проявляет повышенную активность против большинства протестированных клеточных линий по сравнению с конъюгатами родительского антитела (M-s-SPDB-DM4 и M-DM21).

[00420] Кроме того, связывание, интернализацию и процессинг KIH-DM21 и исходных моноспецифических антител сравнивали с использованием 3Н-антител. В опухолевых клетках со средней (JHOS-4) и высокой (KB) экспрессией FRα KIH-DM21 усиливал события связывания антител и процессинг на 100% и 170% соответственно.

Активность бипаратопного антитела типа "выступ во впадин", конъюгированного с DM21, по уничтожению свидетелей.

[00421] Способность KIH-DM21 убивать FRα-клетки в смешанной культуре клеток оценивали in vitro с использованием нескольких клеточных линий. В соответствии с другими экспериментами по цитотоксичности in vitro конъюгаты родительских антител М-DM21 и M-s-SPDB-DM4 использовали в качестве контролей. Смешанные культуры клеток с положительной мишенью (KB, Igrov-1, Jeg-3 или T47D) и клеток с отрицательной мишенью Namalwa/luc (т.е. клеток Namalwa, экспрессирующих люциферазу) подвергали воздействию 0,5 нМ конъюгатов. Эта концентрация конъюгата не токсична для отрицательных-мишеней клеток, когда клетки инкубируются по отдельности. Затем были протестированы различные процентные доли позитивных клеток в смешанных культурах (от 9% до 50%). После 5-дневного воздействия ингибирование клеточной пролиферации отрицательных-мишеней клеток в смеси определяли One Glo (Promega) в соответствии с протоколом производителя.

[00422] Во всех протестированных смешанных культурах KIH-DM21 имел самую высокую активность стороннего наблюдателя, за ним следовал M-DM21. M-s-SPDB-DM4 был наименее активным конъюгатом, как показано на ФИГ. 13А - 13D и Таблице 17.

[00423] В совокупности эти данные показывают, что бипаратопный формат KIH в сочетании с линкером/полезной нагрузкой DM21 приводит к повышению эффективности in vitro по сравнению с исходным антителом, конъюгированным с DM21 или s-SPDB-DM4.

Пример 6. In vivo эффективность бипаратопного иммуноконъюгата KIH

In vivo противоопухолевая активность бипаратопного ADC KIH у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90

[00424] Эффективность KIH-DM21 in vivo оценивали и сравнивали с KIH-s-SPDB-DM4 на модели ксенотрансплантата OV-90 с низкой экспрессией FRα (Н-оценка 30). Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 7 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для состава, KIH-s-SPDB-DM4 при 40, 20 и 10 мкг/кг, KIH-DM21 при 40, 20 и 10 мкг/кг, M-DM21 при 20 мкг/кг и Ms-SPDB-DM4 в концентрации 20 мкг/ кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 80 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано Примере 4, подраздел («Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90»).

[00425] Результаты исследования показаны на ФИГ. 14А-14В и Таблице 18. Группа KIH-s-SPDB-DM4 с дозой 40 мкг/кг имела Т-С 29 дней, LCK 1,84 (активный), 3/6 PR, 2/6 CR и 0/6 TFS. Группа с дозой 20 мкг/кг имела Т-С 38 дней, LCK 1,32 (активный) и без регрессии. Группа 10 мкг/кг имела Т-С 2 дня, LCK 0,09 (неактивный) и без регрессии. Родительский конъюгат M-s-SPDB-DM4 был неактивным при 20 мкг/кг с Т/С 81% и без регрессии. Т-С и LCK не могут быть определены для этой группы из-за некроза при малых объемах опухоли. Конъюгат KIH-DM21 был высокоактивным при всех дозах, с Т/ С 1% для дозы 40 мкг/кг, 7% для дозы 20 мкг/кг и 9% для дозы 10 мкг/ кг. Доза 40 мкг/кг имела Т-С 53 день, LCK 2,49 (активный), 5/6 PR, 5/6 CR и 3/6 TFS. Доза 20 мкг/кг имела Т-С 42 дня, LCK 1,98 (активный), 3/6 PR, 2/6 CR и 1/6 TFS. Доза 10 мкг/кг имела 2/6 PR и 0/6 CR. Т-С и LCK не могут быть определены для этой группы из-за некроза при малых объемах опухоли. Конъюгат M-DM21 был активен при 20 мкг/кг с Т/С 22%, Т-С 30 дней, LCK 1,41 (активный) и без регрессии. В этом исследовании не наблюдалось потери массы тела. Таким образом, конъюгаты DM21 были более активными, чем конъюгаты s-SPDB-DM4 как в исходном, так и в бипаратопном формате KIH в этом исследовании. Кроме того, бипаратопные конъюгаты KIH были более активными, чем их родительские аналоги при соответствующих дозах 20 мкг/кг в том же формате линкер/полезная нагрузка. На основании этих результатов KIH-DM21 был выбран для оценки в дополнительных моделях ксенотрансплантата.

In vivo противоопухолевая активность бипаратопного ADC KIH у мышей SCID. несущих ксенотрансплантаты аденокарциномы эндометрия человека Ishikawa

[00426] Эффективность in vivo бипаратопного антитела KIH, конъюгированного с DM21, оценивали на модели ксенотрансплантата Ishikawa со средней экспрессией FRα (Н-оценка 100).

[00427] Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 11 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для состава, KIH-DM21 в дозах 100, 50 и 25 мкг/кг, M-DM21 в дозах 100 и 50 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозах 100 мкг/кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 90 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано Примере 4, подраздел («Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90»).

[00428] Результаты исследования показаны на ФИГ. 15 и Таблице 19. Конъюгат KIH-DM21 был высокоактивным при 100 и 50 мкг/кг, но неактивным при 25 мкг/кг, с Т/С 0%, 9% и 78% соответственно. Доза 100 мкг/кг имела Т-С>63 дня, LCK>3,33 (высокоактивный), 6/6 PR, 5/6 CR и 4/6 TFS. Доза 50 мкг/кг имела 3/6 PR и 0/6 CR Т-С и LCK не могут быть определены для этой группы из-за некроза при малых объемах опухоли. Доза 25 мкг/кг имела Т-С 2 дня, LCK 0,11 (неактивный) и без регрессии.. Конъюгат М-DM21 был высокоактивным при 130 мкг/кг и активным при 70 мкг/кг, с Т/С 0% и 11%, соответственно. Доза 130 мкг/кг имела Т-С>63 дня, LCK>3,33 (высокоактивный), 6/6 PR, 6/6 CR и 0/6 TFS. Доза 50 мкг/кг имела Т-С 27 дней, LCK 1,43 (активный), 4/6 PR, 2/6 CR и 0/6 TFS. Конъюгат M-s-SPDB-DM4 в дозе 100 мкг/кг был высокоактивным с Т/С 1%, 6/6 PR и 3/6 CR. Т-С и LCK не могут быть определены для этой группы из-за некроза при малых объемах опухоли. Во всех исследуемых группах была минимальная потеря массы тела от 1 до 5%. Таким образом, KIH-DM21 был заметно более активен, чем исходные конъюгаты M-DM21 и M-s-SPDB-DM4 при дозировке 100 мкг/кг. Хотя все три конъюгата были высокоактивными при 100 мкг/кг, продолжительность ответа была намного больше для бипаратопного ADC KIH, чем для конъюгатов исходных антител.

In vivo противоопухолевая активность KIH бипаратопного ADC у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека IGROV-1

[00429] Эффективность in vivo KIH бипаратопного антитела, конъюгированного с DM21, оценивали на модели ксенотрансплантата IGROV-1 со средней экспрессией FRα (Н-показатель 140). Мышей рандомизировали на группы (n=8 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 10 день после инокуляции. Группы включали контрольную группу, получавшую буфер для состава, KIH-DM21 в дозах 100 и 50 мкг/кг, M-DM21 в дозах 130 и 70 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозах 100 и 50 мкг/кг. Г Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 120 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано в Примере 4, подраздел «Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90».

[00430] Результаты исследования показаны на ФИГ. 16 и Таблице 20. Конъюгат KIH-DM21 был активен как при 100, так и при 50 мкг/кг, с Т/С 19% и 12% соответственно. Доза 100 мкг/кг имела Т-С>99 дней, LCK>2,87 (высокоактивный), 7/8 PR, 6/8 CR и 0/8 TFS. Доза 50 мкг/кг имела Т-С 53 дня, LCK 1,53 (активный), 5/8 PR, 3/8 CR и 0/8 TFS. Конъюгат M-DM21 был активен как при 130 мкг/кг, так и при 70 мкг/кг, с Т/С 13% и 16%, соответственно. Доза 130 мкг/кг имела Т-С>99 дней, LCK>2,87 (высокоактивный), 8/8 PR, 7/8 CR и 2/8 TFS. Доза 70 мкг/кг имела Т-С 36 дней, LCK 1,04 (активный), 3/8 PR, 2/8 CR и 0/8 TFS. Конъюгат M-s-SPDB-DM4 был активен как при дозах 100, так и при 50 мкг/кг, с Т/С 17% и 34% соответственно. Доза 100 мкг/кг имела Т-С 23 дня, LCK 0,67 (неактивный), 3/8 PR, 2/8 CR и 0/8 TFS. Доза 50 мкг/кг имела Т-С 17 дней, LCK 0,49 (неактивный) и без регрессий. В большинстве групп наблюдалась минимальная потеря массы тела 1-5%, за исключением M-DM21 в дозе 50 мкг/кг (6%) и M-S-SPDB-DM4 в дозе 50 мкг/кг (7%) в надире на 16 день после инокуляции. Таким образом, исходный конъюгат M-s-SPDB-DM4 проявлял меньшую эффективность in vivo, чем конъюгаты DM21. Кроме того, KIH-DM21 и исходный M-DM21 были одинаково активны в двух испытанных дозах.

In vivo противоопухолевая активность KIH бипаратопного ADC у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты KB карциномы шейки матки человека

[00431] Эффективность in vivo бипаратопного антитела KIH, конъюгированного с DM21, оценивали на модели ксенотрансплантата KB с высокой экспрессией FRα (Н-показатель 300). Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 6 день после инокуляции, когда опухоли достигли ~ 100 мм3. Группы включали контрольную группу, получавшую буфер для состава, KIH-DM21 в дозах 50 и 25 мкг/кг, M-DM21 в дозах 50 и 25 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозах 50 и 25 мкг/кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 120 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано Примере 4, подраздел («Противоопухолевая активность четырехвалентного бипаратопного ADC in vivo у мышей SCID, несущих ксенотрансплантаты карциномы яичников человека OV-90»).

[00432] Результаты исследования показаны на ФИГ. 17 и Таблице 21. Конъюгат KIH-DM21 был высокоактивен как при 50, так и при 25 мкг/кг, с Т/С 0%, Т-С>100 дней и LCK>6,41 (высокоактивный) для обеих доз. Доза 100 мкг/кг имела 6/6 PR, 6/6 CR и 6/6 TFS, тогда как доза 25 мкг/кг имела 6/6 PR, 5/6 CR и 5/6 TFS. Конъюгат M-DM21 был высокоактивным как при 50 мкг/кг, так и при 25 мкг/кг, с Т/С 0% и 2%, соответственно. Обе дозы имели Т-С>100 дней и LCK>6,41 (высокая активность). Доза 50 мкг/кг имела 6/6 PR, 6/6 CR и 6/6 TFS, тогда как доза 25 мкг/кг имела 5/6 PR, 4/6 CR и 4/6 TFS. Конъюгат M-s-SPDB-DM4 был высокоактивен как при 50, так и при 25 мкг/кг, с Т/С 0% и 8%, соответственно. Доза 50 мкг/кг имела Т-С>100 дней, LCK>6,41 (высокоактивный), 6/6 PR, 6/6 CR и 5/6 TFS. Доза 25 мкг/кг имела Т-С 24 дня, LCK 1,54 (активный), 3/6 PR, 1/6 CR и 1/6 TFS. В группах М-DM21 и M-s-SPDB-DM4 наблюдалась минимальная потеря массы тела 2-4% в надире на 8 день после инокуляции. Таким образом, ответ M-s-SPDB-DM4 при 25 мкг/кг был временным, в то время как введение M-s-SPDB-DM4 при 50 мкг/кг приводило к длительной полной регрессии у большинства мышей. Введение M-DM21 и KIH-DM21 как в дозах 25 мкг/кг, так и в дозах 50 мкг/кг привело к длительной полной регрессии у большинства мышей.

[00433] В совокупности описанные в данном документе исследования эффективности in vivo показывают, что KIH-DM21 был наиболее активным конъюгатом в большинстве протестированных моделей ксенотрансплантатов, за которым следовали M-DM21 и M-s-SPDB-DM4.

In vivo противоопухолевая активность бипаратопного ADC KIH у мышей SCID, несущих устойчивые к IMGN853 ксенотрансплантаты KB карциномы шейки матки человека

[00434] In vivo эффективность бипаратопного антитела KIH, конъюгированного с DM21, оценивали на модели ксенотрансплантата KB, устойчивой к IMGN853. Родительские клетки KB выращивали в присутствии 1 нМ DM1-Ме. После создания стабильно выращиваемой культуры клетки субклонировали и клоны выращивали, характеризовали и замораживали. Для этого исследования был выбран субклон 6А, и мыши были инокулированы подкожно. Мышей рандомизировали на группы (n=6 на группу) по объему опухоли и впоследствии им вводили дозу на 5 день после инокуляции, когда опухоли достигли ~ 100 мм³. Группы включали контрольную группу, которой вводили буфер для состава, KIH-L-DM21 в дозах 40 и 20 мкг/кг, M-L-DM21 в дозах 40 и 20 мкг/кг и M-s-SPDB-DM4 в дозах 40 и 20 мкг/кг. Всем мышам вводили однократную внутривенную дозу вышеуказанных соединений. Исследование было прекращено на 78 день после инокуляции. Измерения и расчеты опухолей проводили, как описано выше в экспериментах с ксенотрансплантатами карциномы яичников человека OV-90.

[00435] Результаты исследования показаны на ФИГ. 19 и Таблице 22. Конъюгат KIH-L-DM21 был высокоактивным как при 40, так и при 20 мкг/кг, с Т/С 0%. Группа с дозой 40 мкг/кг имела Т-С>60 дней, LCK>3,41 (высокоактивный), 6/6 PR, 6/6 CR и 6/6 TFS. Группа дозирования 20 мкг кг имела Т-С 46 дней, LCK 2,61 (активный), 6/6 PR, 4/6 CR и 1/6 TFS. Конъюгат M-L-DM21 был высокоактивным как при 40 мкг/кг, так и при 20 мкг/кг, с Т/С 0% и 2%, соответственно. Группа с дозой 40 мкг/кг имела Т-С>60 дней, LCK>3,41 (высокоактивный), 6/6 PR, 6/6 CR и 6/6 TFS. Группа с дозой 20 мкг/кг имела Т-С 28 дней, LCK 1,59 (активный), 5/6 PR, 2/6 CR и 2/6 TFS. Конъюгат M-s-SPDB-DM4 был высокоактивным при 40 мкг/кг, но неактивным при 20 мкг/кг, с Т/С 0% и 63% соответственно. Доза 40 мкг/кг имела Т-С 41 день, LCK 2,33 (активный), 6/6 PR, 6/6 CR и 0/6 TFS Доза 20 мкг/кг имела Т-С 6 дней, LCK 0,34 (неактивный), 0/6 PR, 0/6 CR и 0/6 TFS. В группе KIH-L-DM21 с дозой 20 мкг/кг наблюдалась минимальная потеря массы тела с потерей 3% в надире на 8-й день после инокуляции. Таким образом, KIH-L-DM21 был сравнительно эффективнее M-L-DM21, и как KIH-L-DM21, так и M-L-DM21 были более эффективными, чем M-s-SPDB-DM4 в этой модели.

Пример 7. Фармакокинетика и переносимость бипаратопного иммуноконъюгата

[00436] Токсичность и токсикокинетический профиль бипаратопного иммуноконъюгата, нацеленного на FRα, оценивали на яванских макаках после однократной дозы. Вкратце, KIH-DM21 вводили в виде 10-минутной медленной болюсной инфузии при уровнях доз 10 или 13 мг/кг двум самцам обезьян/уровень дозы. За животными наблюдали в течение 28 дней после введения дозы для оценки восстановления, стойкости или прогрессирования любых эффектов. Оценивали массу тела, клинические наблюдения и потребление пищи, а также собирали образцы крови для определения параметров клинической патологии (гематология, химический состав сыворотки и коагуляция) и токсикокинетических параметров, параметров.

[00437] Все животные выжили до конца исследования. Связанного с KIH-DM21 воздействия на массу тела, гематологию или химические параметры сыворотки не наблюдалось. Клинические наблюдения, связанные с KIH-DM21, отмеченные у одного животного в группе 10 мг/кг, включали покраснение задних конечностей на 8 и 12 дни, без каких-либо клинических проявлений в течение оставшейся части периода без введения препарата. Связанные с KIH L DM21 более высокие значения фибриногена были отмечены на 4 и 8 дни в обеих группах дозирования. К концу периода без введения дозы (день 29) значения были аналогичны значениям до лечения.

[00438] KIH-DM21 ADC демонстрирует двухфазную фармакокинетику после однократного внутривенного введения обезьянам. Среднее время терминальной фазы t1/2 ADC составило 156 часов при дозе 10 мг/кг. Среднее значение t1/2 для общего антитела (TAb) было больше, чем для ADC (184 часа при дозе 10 мг/кг). Сравнение временного профиля концентрации ADC и TAb показало, что иммуноконъюгат KIH-DM21 был более стабильным, чем IMGN853 при дозе 10 мг/кг. KIH-DM21 имеет более длительный период полувыведения в терминальной фазе и более высокие показатели воздействия (значение AUC∞), чем IMGN853 при дозе 10 мг/кг.

[00439] Как показано на ФИГ. 18А и 18В, бипаратопный иммуноконъюгат FRα и IMGN853 оба хорошо переносились при дозе 10 и мг/кг, а бипаратопный иммуноконъюгат аналогичным образом хорошо переносился при дозе 13 мг/кг. Кроме того, как показано в Таблице 23, бипаратопный иммуноконъюгат FRα был более стабильным, чем IMGN853 при дозе 10 мг/кг. В частности, бипаратопный иммуноконъюгат показал конечный период полувыведения на ~ 60 часов дольше, чем IMGN853, и общую экспозицию на ~ 40% выше, чем IMGN853.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ImmunoGen, Inc.

<120> БИПАРАТОПНЫЕ АНТИТЕЛА К FR-АЛЬФА И ИММУНОКОНЪЮГАТЫ

<130> 2921.108PC03/EKS/CLD/SGM

<150> US 62/840 297

<151> 29.04.2019

<150> US 62/879 864

<151> 29.07.2019

<160> 64

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1 FR57

<400> 1

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn Leu His

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2 FR57

<400> 2

Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3 FR57

<400> 3

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Tyr Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19 VL-CDR1

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2 huMov19

<400> 5

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19 VL-CDR3

<400> 6

Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1 FR57

<400> 7

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2 FR57

<400> 8

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3 FR57

<400> 9

Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1 huMov19

<400> 10

Gly Tyr Phe Met Asn

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2 huMov19

<400> 11

Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3 huMov19

<400> 12

Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1 FR57

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2 FR57

<400> 14

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1 huMov19

<400> 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2 huMov19

<400> 16

Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe

1 5 10

<210> 17

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность легкой цепи FR57

<400> 17

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность легкой цепи FR57, F83E, Q101C

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность легкой цепи huMov19

<400> 19

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность легкой цепи huMov19G104C

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19A87E; вариабельная последовательность легкой цепи G104C

<400> 21

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи FR57

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи FR57, E6Q, G44C

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи huMov19

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи huMov19 S44C

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

100 105

<210> 26

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи huMov19, A16E, S44C

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 246

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv1

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Gln Ser

180 185 190

Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Gly Met Tyr

210 215 220

Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Tyr Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 28

<211> 246

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv2

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 29

<211> 246

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv3wt

<400> 29

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 30

<211> 249

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19scFv1

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Pro Ala Ile Ile Ser

145 150 155 160

Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His

165 170 175

Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg

180 185 190

Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp

210 215 220

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245

<210> 31

<211> 249

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19scFv2

<400> 31

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys

130 135 140

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu

165 170 175

Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn

180 185 190

Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn

195 200 205

Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 32

<211> 249

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19scFv3

<400> 32

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys

130 135 140

Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu

165 170 175

Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn

180 185 190

Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn

195 200 205

Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 33

<211> 711

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mov19-IgG1-FR57scFv-HC

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

450 455 460

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

465 470 475 480

Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

485 490 495

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

500 505 510

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

515 520 525

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu Leu

530 535 540

Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

545 550 555 560

Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

565 570 575

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

595 600 605

Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys

610 615 620

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

625 630 635 640

Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val

645 650 655

Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

660 665 670

Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe

675 680 685

Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr

690 695 700

Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

705 710

<210> 34

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19LC

<400> 34

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 714

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57-IgG1-mov19scFv1-HC

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

450 455 460

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser

465 470 475 480

Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Phe

485 490 495

Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly

500 505 510

Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

515 520 525

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His Met

530 535 540

Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

545 550 555 560

Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

565 570 575

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

580 585 590

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser

595 600 605

Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys

610 615 620

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His Trp

625 630 635 640

Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala

645 650 655

Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

660 665 670

Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala

675 680 685

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly

690 695 700

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

705 710

<210> 36

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57LC

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 37

<211> 708

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv2-mov19-IgG1-HC

<400> 37

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

260 265 270

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

275 280 285

Thr Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln

290 295 300

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe

305 310 315 320

Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

325 330 335

Ser Asn Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe

340 345 350

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

355 360 365

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

370 375 380

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

385 390 395 400

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

405 410 415

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

420 425 430

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

435 440 445

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

450 455 460

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

465 470 475 480

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

485 490 495

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

500 505 510

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

515 520 525

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

530 535 540

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

545 550 555 560

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

565 570 575

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

580 585 590

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

595 600 605

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

610 615 620

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

625 630 635 640

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

645 650 655

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

660 665 670

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

675 680 685

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

690 695 700

Leu Ser Pro Gly

705

<210> 38

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19LCv1-6

<400> 38

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 39

<211> 708

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv3wt-mov19-IgG1-HC

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

260 265 270

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

275 280 285

Thr Phe Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln

290 295 300

Ser Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe

305 310 315 320

Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

325 330 335

Ser Asn Thr Ala His Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe

340 345 350

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr

355 360 365

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

370 375 380

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

385 390 395 400

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

405 410 415

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

420 425 430

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

435 440 445

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

450 455 460

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

465 470 475 480

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

485 490 495

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

500 505 510

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

515 520 525

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

530 535 540

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

545 550 555 560

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

565 570 575

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

580 585 590

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

595 600 605

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

610 615 620

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

625 630 635 640

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

645 650 655

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

660 665 670

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

675 680 685

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

690 695 700

Leu Ser Pro Gly

705

<210> 40

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> huMov19LCv1-6

<400> 40

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 41

<211> 479

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv2-Fc-выступ (C220S, T366W)

<400> 41

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

245 250 255

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 42

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19-Fc-впадина (T366S, L368A, Y407V)

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 43

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19-LC

<400> 43

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 44

<211> 479

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FR57scFv3wt-Fc-выступ (C220S, T366W)

<400> 44

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Val Ser Gln Ser Val Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

130 135 140

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

145 150 155 160

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

165 170 175

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val

180 185 190

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Leu

195 200 205

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

210 215 220

Ala Arg Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

245 250 255

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475

<210> 45

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19-Fc-впадина (T366S, L368A, Y407V)

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 46

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Mov19-LC

<400> 46

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 47

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полноразмерная тяжелая цепь huMov19

<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 48

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> полноразмерная легкая цепь huMov19

<400> 48

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg

85 90 95

Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 49

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> глицин/серин линкер

<400> 49

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 50

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> глицин/серин линкер

<400> 50

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 51

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> глицин/серин линкер

<400> 51

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 52

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> глицин/серин линкер

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 53

<211> 257

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 53

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

195 200 205

Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu

245 250 255

Ser

<210> 54

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 54

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 55

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> бета-Ala

<400> 55

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 56

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> пептид

<400> 56

Gly Phe Leu Gly

1

<210> 57

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариабельная последовательность тяжелой цепи huMov19 S44C

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<400> 58

000

<210> 59

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область Fc дикого типа IgG

<400> 59

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 60

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область Fc IgG2

<400> 60

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

1 5 10 15

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

20 25 30

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln

65 70 75 80

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

85 90 95

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro

100 105 110

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

115 120 125

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

130 135 140

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

145 150 155 160

Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

165 170 175

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

180 185 190

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

195 200 205

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 61

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> область Fc IgG4

<400> 61

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 62

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CH2 и CH3 IgG1 (L234A/L235A)

<400> 62

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 63

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CH2 и CH3 IgG1 (N297A)

<400> 63

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 64

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CH2 и CH3 IgG1 (N297Q)

<400> 64

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыты: бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают человеческий рецептор 1 фолиевой кислоты (FRα), и способ его получения, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный вектор для экспрессии бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция для лечения FRα-экспрессирующего рака. Также представлены иммуноконъюгаты, которые специфически связывают человеческий рецептор 1 фолиевой кислоты (FRα), и их применение для лечения рака, фармацевтическая композиция для лечения FRα-экспрессирующего рака, содержащая иммуноконъюгат. Изобретение применяется для лечения расстройств, таких как рак, путем введения бипаратопного антитела, которое специфически связывается с FRα и модулирует активность FRα. 10 н. и 31 з.п. ф-лы, 19 ил., 23 табл., 7 пр.

1. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связывают человеческий рецептор 1 фолиевой кислоты (FRα), причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(a) первый связывающий FRα домен, который содержит первую вариабельную тяжелую цепь (VH) и первую вариабельную легкую цепь (VL) и который связывается с первым эпитопом FRα; и

(b) второй связывающий FRα домен, который содержит вторую VH и вторую VL и который связывается со вторым эпитопом FRα, где

первая VH содержит VH CDR l-3, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 10-12 или (b) SEQ ID NO: 15, 16 и 12, соответственно;

первая VL содержит VL CDR l-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-6, соответственно;

вторая VH содержит VH CDR l-3, содержащие аминокислотные последовательности (a) SEQ ID NO: 7-9 или (b) SEQ ID NO: 13, 14 и 9, соответственно; и

вторая VL содержит VL CDR l-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1-3, соответственно.

2. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, в которых первая VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и первая VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.

3. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, в которых вторая VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 и вторая VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

4. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, в которых первый или второй FRα-связывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

5. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, в которых scFv первого или второго FRα-связывающего домена имеет пептидную ориентацию VH-линкер-VL или VL-линкер-VH.

6. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, в которых линкер представляет собой глицин-сериновый линкер.

7. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, которые имеют структуру «выступ во впадину» (KIH).

8. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7, в которых FRα-связывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 1-3 и 7-9, находится на стороне выступа структуры KIH.

9. Бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 7 или 8, в которых FRα-связывающий домен, содержащий SEQ ID NO: 4-6 и 10-12, находится на стороне впадины структуры KIН.

10. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп. 1-9.

11. Выделенный вектор для экспрессии бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 10.

12. Клетка-хозяин для экспрессии бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 10 или выделенный вектор по п. 11.

13. Клетка-хозяин по п. 12, которая выбрана из группы, состоящей из E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожжей, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, клетки BMT10, клетки растений, клетки насекомых и клетки человека в культуре ткани.

14. Фармацевтическая композиция для лечения FRα-экспрессирующего рака, содержащая бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, молекулу нуклеиновой кислоты по п. 10, вектор по п. 11 или клетку-хозяин по п. 12 или 13 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

15. Способ получения бипаратопного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, включающий (а) культивирование клетки, экспрессирующей указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и (b) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из указанной культивированной клетки.

16. Способ по п. 15, в котором указанная клетка является эукариотической клеткой.

17. Иммуноконъюгат, который специфически связывает человеческий рецептор 1 фолиевой кислоты (FRα), представленный следующей формулой:

(I)

или его фармацевтически приемлемой солью, в которых:

CB представляет собой бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9;

L₂ представлен одной из следующих формул:

(L2a),

(L2b),

(L2c),

(L2d) или

(L2e);

где

R^x, R^y, R^x’ и R^y’ для каждого случая независимо представляют собой H, -OH, галоген, -O-(C_1-4 алкил), -SO₃H, -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺ или C_1-4 aлкил, необязательно замещенный -ОН, галогеном, SO₃H или -NR₄₀R₄₁R₄₂⁺, где R₄₀, R₄₁ и R₄₂ каждый независимо представляет собой H или C_1-4 алкил;

l и k, каждый, независимо равны целому числу от 1 до 10;

l1 равен целому числу от 2 до 5;

k1 равен целому числу от 1 до 5; и

s1 указывает сайт, соединенный с агентом связывания клетки CB, а s3 указывает сайт, присоединенный к группе A;

A представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;

R¹ и R² каждый независимо представляет собой H или C_1-3алкил;

L₁ представлен следующей формулой:

–CR³R⁴-(CH₂)_1-8-C(=O)-

где R³ и R⁴, каждый, независимо представляют собой H или Me, и фрагмент –C(=O)- в L₁ соединен с D;

D представлен следующей формулой:

;

q равен целому числу от 1 до 20.

18. Иммуноконъюгат по п. 17, в котором D представлен следующей формулой:

19. Иммуноконъюгат по п. 17, причем иммуноконъюгат представлен следующей формулой:

,

где

CBA представляет собой бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-14;

q равно целому числу от 1 до 10;

D₁ представлен следующей формулой:

20. Иммуноконъюгат, который специфически связывает человеческий рецептор 1 фолиевой кислоты (FRα), имеющий формулу (A) - (L) - (C), где

(A) представляет собой бипаратопное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9;

(L) представляет собой линкер; и

(C) представляет собой цитотоксический агент, где указанный линкер (L) связывает (A) с (C).

21. Иммуноконъюгат по п. 20, в котором указанный линкер выбран из группы, состоящей из расщепляемого линкера, нерасщепляемого линкера, гидрофильного линкера и линкера на основе дикарбоновой кислоты.

22. Иммуноконъюгат по п. 21, в котором указанный линкер выбран из группы, состоящей из N-(γ-малеимидобутрилокси) сульфосукцинимидного сложного эфира (сульфо-GMBS или sGMBS), γ-малеимидомасляной кислоты N-сукцинимидилового сложного эфира (GMBS), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноата (сульфо-SPDB); N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноата (SPP) или N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)-2-сульфопентаноата (сульфо-SPP); N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (SPDB), N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC); N-сульфосукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (сульфоSMCC); N-сукцинимидил 4-(иодоацетил)-аминобензоата (SIAB) и сложного эфира N-сукцинимидил-[(N-малеимидопропионамидо)-тетраэтиленгликоля] (NHS-PEG4-малеимид).

23. Иммуноконъюгат по любому из пп. 20-22, в котором указанный цитотоксический агент представляет собой майтанзиноид.

24. Иммуноконъюгат по п. 23, в котором указанный майтанзиноид представляет собой DM21.

25. Иммуноконъюгат по любому из пп. 20-24, в котором иммуноконъюгат содержит 3 или 4 C.

26. Фармацевтическая композиция для лечения FRα-экспрессирующего рака, содержащая иммуноконъюгат по любому из пп. 17-25 и фармацевтически приемлемый носитель.

27. Фармацевтическая композиция по п. 26, причем фармацевтическая композиция содержит в среднем от 3 до 4 лекарственных средств на одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

28. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, иммуноконъюгата по любому из пп. 17-25 или фармацевтической композиции по пп. 14, 26 или 27 для лечения FRα-экспрессирующего рака.

29. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак яичника, рак матки, рак брюшины, рак маточной трубы, рак эндометрия, рак легких или рак головного мозга.

30. Применение по п. 29, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак яичника.

31. Применение по п. 30, в котором рак яичника представляет собой резистентный к препаратам платины эпителиальный рак яичника.

32. Применение по п. 30, в котором рак яичника представляет собой рецидивирующий эпителиальный рак яичника.

33. Применение по п. 30, в котором рак яичника представляет собой рефракторный к препаратам платины эпителиальный рак яичника.

34. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак матки.

35. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак брюшины.

36. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак маточной трубы.

37. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак эндометрия.

38. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак легкого.

39. Применение по п. 28, в котором FRα-экспрессирующий рак представляет собой рак головного мозга.

40. Применение по любому из пп. 28-39, в котором FRα-экспрессирующий рак является резистентным к IMGN853.

41. Применение по любому из пп. 28-40, которое дополнительно включает введение стероида.