КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ И НАРУШЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФАКТОРОМ ФОН ВИЛЛЕБРАНДА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/4745 A61K31/7088 A61K31/713 A61K9/00 A61K9/10 A61P7/02 A61P7/06 C07H21/02 C07H21/04 C12N15/115 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с временной заявкой на патент США № 62/508530, поданной 19 мая 2017 г., озаглавленной "Compositions and Methods for the Treatment of Complications and Disorders Relating to Von Willebrand Factor", и временной заявкой на патент США № 62/638579, поданной 5 марта 2018, озаглавленной "Compositions and Methods for the Treatment of Complications and Disorders Relating to Von Willebrand Factor", содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка подается вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла под именем 20591002PCT_SL.txt, созданного 18 мая 2018 года, размер которого составляет 40942 байта. Информация в электронном формате списка последовательностей полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области терапевтических способов, используемых в лечении осложнений и расстройств, связанных с фактором фон Виллебранда.

Уровень техники

Фактор фон Виллебранда (VWF) имеет важное значение для первого этапа в поддержании гемостаза, то есть, для остановки кровоизлияния на участках, где произошло нарушение целостности сосудистой системы. VWF создает молекулярный мостик между структурным коллагеновым матриксом, который лежит в основе эндотелия сосудов, и циркулирующими тромбоцитами, позволяя тромбоцитам прикрепляться к местам повреждения сосудов и инициировать образование тромба для остановки кровоизлияния. Эта важная функция VWF осуществляется с помощью высокомолекулярных мультимеров отдельных молекул VWF, и эти мультимеры активируются для связывания тромбоцитов, когда они подвергаются гемодинамическим сдвиговым усилиям (аналогично разматыванию веревки). Было показано, что активация VWF происходит через двухстадийный конформационный переход: поток-зависимое удлинение с последующим напряжение-зависимым локальным переходом в состояние с высоким сродством к GpIbα тромбоцитов (Fu H, et al., Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nat Commun. 2017 Aug 23;8(1):324). В то же время "раскручивание", которое активирует мультимеры VWF, также подвергает их разрушению путем протеолиза, тем самым обеспечивая "петлю обратной связи", что предотвращает чрезмерное образование тромбов. Совсем недавно было обнаружено, что VWF участвует в ряде процессов в сосудистой системе, включая регуляцию образования новых кровеносных сосудов. (Randi AM, et al., Von Willebrand Factor, Angiodysplasia and Angiogenesis. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2013;5(1): e2013060; eCollection 2013).

Последние достижения в разработке медицинского устройства, известного как вспомогательное желудочковое устройство ("VAD"), улучшили характеристики VAD и поддержку кровообращения, которую такие устройства могут оказать пациентам с тяжелой сердечной недостаточностью. Одним из таких достижений было внедрение систем с непрерывным (в отличие от пульсирующих) потоком, примером которых являются такие устройства, как HeartWare HVAD® или Thoratec HEARTMATE®. Однако, одним из главных недостатков механически поддерживающего кровотока является тот факт, что кровь подвергается локальному воздействию нефизиологических условий кровотока, таких как высокое давление и резкие перепады скорости. Таким образом, пациенты с VAD VWF (и другие компоненты крови) постоянно подвергаются воздействию высокого усилия сдвига, создаваемого самим VAD. Гемодинамические сдвиговые усилия, создаваемые конструкцией насоса с непрерывным потоком, могут вызвать нарушение функции коагуляционной системы, известной как приобретенный синдром фон Виллебранда (aVWS), и, в результате, возникает значительное количество случаев сильных кровотечений, в частности из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). У этих пациентов также наблюдается патологическое образование кровеносных сосудов, что способствует кровотечению. (Suarez J, et al., Mechanisms of bleeding and approach to patients with axial-flow left ventricular assist devices. Circ. Heart Fail. 2011 4:779-84 и приведенные в ней ссылки).

Эффект этого механического сдвигового усилия дополнительно усиливается посредством прикрепления находящихся в кровообращении тромбоцитов, когда мультимер VWF начинает раскручиваться и экспонировать свои участки связывания тромбоцитов (участки, которые биохимически обозначаются как "А1 домены"). То есть, поскольку тромбоциты, переносимые током крови, связываются с А1 доменами, экспонированными к частично раскрученному мультимеру VWF, связанные тромбоциты прилагают усилие и полностью вытягивают мультимерную цепь. После полного удлинения, мультимер VWF наиболее подвержен протеолитической деградации. Эта патофизиологическая парадигма предполагает, что у пациентов с VAD будет наблюдаться уменьшение количества полностью функциональных мультимеров с высокой молекулярной массой VWF, что действительно имеет место быть. Для обеспечения долгосрочной коррекции проблемы, введение экзогенного VWF или стимуляция секреции эндогенных резервов VWF не могут быть спрогнозированы, поскольку дополнительный VWF также будет вскоре протеолитически деградировать аналогичным образом.

Еще об одном недостатке вспомогательных желудочковых устройств, в частности левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (LVAD), как следствии высоких сдвиговых усилий, недавно сообщали Starling et al., которые наблюдали увеличение частоты возникновения тромбозов в аппарате VAD среди пациентов с установленным HeartMate II^TM LVAD. Starling RC, et al., Unexpected Abrupt Increase in Left Ventricular Assist Device Thrombosis Thrombosis, 2014, N. Engl. J Med., 370:33-40. Другие сообщили об аналогичных данных исследований с LVAD. Capoccia M, et al., Recurrent Early Thrombus Formation in Heartmate II Left Ventricular Assist Device, 2013, J. Inv. Med., 1:DOI:10, 1177/2324709613490676; Meyer AL, et al., Thrombus Formation in a Heartmate II Left Ventricular Assist Device, 2008, J. Thorac Cardiovasc Surg, 135:203-204. Высокая скорость сдвига с VAD активирует VWF, вызывая локальное образование тромба на входе VAD и системное уменьшение количества VWF, приводящее к aVWS.

Как рассмотрено выше, агрегация тромбоцитов в местах повреждения сосудов играет основную роль в остановке и контроле кровотечения, а также в последующем восстановлении сосудов; однако чрезмерная реакция агрегации тромбоцитов в местах повреждения сосудов или разрыв атеросклеротической бляшки может привести к развитию окклюзивного тромбоза сосудов. Исследования показали, что взаимодействия VWF-тромбоцит обеспечивают образование окклюзирующих тромбов при очень высоких скоростях сдвига. Le Behot A, et al., GpIbα-VWF blockade restores vessel patency by dissolving platelet aggregates formed under very high shear rate in mice. Blood, 2013: Feb 19, 2014; DOI 10.1182/blood-2013-12-543074. Таким образом, повышенные уровни сдвигового напряжения в VAD связаны как с aVWS (в результате образования мультимера VWF и последующего разрушения в результате протеолиза), так и с образованием тромба (в результате реакции агрегации VWF-тромбоцитов).

Развитие тромбоза в коронарных и церебральных артериях является наиболее распространенной причиной смертности и заболеваемости во всем мире, вызывая такие заболевания, как инфаркт миокарда и ишемический инсульт, соответственно. Текущие тромболитические препараты нацелены только на один компонент тромба, фибрин, и, следовательно, только частично эффективны в растворении артериальных и тромбоцитарных тромбов. Кроме того, хотя лечение, направленное на нарушение взаимодействия тромбоцитов и фибрина (т.е. ингибиторы GpIIb/IIIa тромбоцитов), эффективно для предотвращения начального образования тромба и растворения свежих агрегатов тромбоцитов, такое нарушение в значительной степени не предотвращает образование тромба в предокклюдированных артериях с очень высокой скоростью сдвига или оказывают существенное влияние на проходимость предокклюдированных артерий (сосудов, которые окклюдированы, по меньшей мере, на 50%). Тем не менее более поздние исследования показали, что блокирование взаимодействия между VWF (доменом А1) и его родственным лигандом на тромбоцитах (GpIb) замедляет скорость образования окклюзирующего тромба при очень высоких скоростях сдвига и растворяет уже сформированные окклюзионные тромбы, тем самым эффективно повышая проходимость окклюдированных артерий.

Другое расстройство, связанное с взаимодействиями VWF, представляет собой серповидно-клеточную анемию.

Серповидно-клеточная анемия возникает в результате наследования мутантного аллеля β-глобина (Glu6Val) либо в виде 2 копий, либо с аллелем, определяющим недостающий или дефектный β-глобин, с образованием жестких, адгезивных, подверженных лизису эритроцитов. Эти свойства объясняют клинические проявления серповидно-клеточной анемии, включая хроническую гемолитическую анемию и эпизодическую вазоокклюзию, поражающую многие органы. Пациенты с наиболее высоким гемолитическим уровнем подвержены риску синдрома, состоящего из гипертонии легочной артерии, приапизма и язв нижних конечностей. Несколько адгезивных молекул были вовлечены в вазоокклюзию серповидных клеток, включая VWF. Острые активированные эндотелиальные клетки могут выделять значительное количество очень больших и сверхадгезивных молекул VWF, которые способны спонтанно связывать эритроциты, в частности, серповидные клетки.

Существует большое количество медицинской литературы, описывающей феномен VAD-ассоциированного синдрома фон Виллебранда (aVWS); тем не менее, в настоящее время, отсутствуют соответствующие лекарственные средства (см.: Suarez J, et al., Mechanisms of Bleeding and Approach to Patients with Axial-Flow Left Ventricular Assist Devices. Circulation: Heart Failure 2011; 4(6):779-784). Существующие способы лечения включают введение дополнительных факторов свертывания или концентрированного VWF, каждый из которых несет значительный риск.

Кроме того, существует современная литература, описывающая наблюдение тромбоза в VAD-аппарате у пациентов, которые получали лечение с использованием VAD и, в частности, лечение с использованием LVAD. Такой тромбоз указывается в настоящем документе как "VAD-ассоциированный тромбоз насоса". См., например, фиг. 2 в Starling RC, et al., Unexpected Abrupt Increase in Left Ventricular Assist Device Thrombosis, 2014, N. Engl. J Med., 370:33-40, где показано образование тромба в LVAD. На сегодняшний день, однако, не было предложено или принято каких-либо методов лечения для предотвращения случаев тромбоза, помимо антикоагулянтной терапии.

Следовательно, сохраняется потребность в лекарственных средствах или биотерапевтических средствах, которые нацелены на VWF-взаимодействия. В частности, сохраняется потребность в фармакологических антагонистах процессов, посредством которых мультимеры VWF разрушаются у пациентов с VAD, и которые являются антагонистами тромбов, образующихся при очень высоких скоростях сдвига, например, которые обнаруживаются у пациентов с VAD, а также в предокклюдированных сосудах (которые могут присутствовать как у субъектов с аппаратом VAD, так у субъектов без VAD). Также остается потребность в антагонистах образования тромба в аппаратах VAD. В каждом из этих различных условий такие средства могут противодействовать связывающему взаимодействию между A1 доменом VWF и его когнатным лигандом на тромбоцитах, эритроцитах и/или GpIb, тем самым стабилизируя мультимеры VWF и/или замедляя их разрушение. Использование таких соединений или композиций в качестве терапевтического средства у пациентов с VAD для лечения aVWS является совершенно алогичным, поскольку оно влечет за собой введение средства против свертывания (которое усиливает кровотечение) с устранением проблемы кровотечения. Терапевтическое обоснование, однако, является обоснованным в том, что сохранение высокомолекулярных VWF-мультимеров у пациентов с VAD будет предотвращать нисходящий каскад, который в конечном итоге приводит к протеолизу VWF. Такие средства могут также противодействовать взаимодействию связывания между А1 доменом VWF и его когнатным лигандом на тромбоцитах и/или GpIb, тем самым устраняя и/или замедляя формирование окклюзирующих тромбов.

Также сохраняется потребность в средствах, которые противодействуют агрегации тромбоцитов или поперечному сшиванию во время закрытия (окклюзии) просвета сосуда (т.е. при очень высоких скоростях сдвига, которые обнаруживаются у пациентов с VAD и/или субъектов с предокклюдированными сосудами), и средствах, которые способны дезагрегировать или разрушать уже сформированные окклюзирующие тромбы в сосуде. Такие средства могут противодействовать взаимодействию между VWF и тромбоцитами, тем самым восстанавливая проходимость сосудов после окклюзивного тромбоза путем дезагрегации существующих тромбов. Такие средства используются для лечения сердечно-сосудистых и коронарных болезней сердца, таких как инфаркт миокарда и ишемический инсульт. Такие средства также могут быть использованы для предотвращения образование окклюзирующих тромбов во время лечения VAD.

Также сохраняется потребность в терапевтическом вмешательстве при осложнениях и расстройствах, возникающих в результате других взаимодействий мультимеров VWF с эритроцитами, в частности в случае аберрантного связывания VWF с эритроцитами при серповидно-клеточной анемии. Такие средства могут модулировать связывание VWF с эритроцитами при серповидно-клеточной анемии.

Как было указано, сохраняется потребность в терапевтических средствах для лечения осложнений и расстройств, связанных с аппаратом вспомогательного кровообращения (VAD), таких как aVWS и окклюзивный тромбоз, и расстройств, возникающих в результате взаимодействий мультимеров VWF с эритроцитами, например взаимодействие, которое возникает между мультимерами VWF и эритроцитами при серповидно-клеточной анемии. Кроме того, сохраняется потребность в терапевтических средствах, которые противодействуют агрегации тромбоцитов во время окклюзии просвета сосуда или во время образования тромба при лечении с помощью аппарата VAD, и средств, которые способны дезагрегировать или разрушать уже сформированные окклюзирующие тромбы в сосуде или уже сформированные тромбы в насосе VAD для лечения сердечно-сосудистых и/или коронарных заболеваний, таких как инсульт.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, среди прочего, к антагонистам взаимодействия VWF с тромбоцитами и взаимодействия VWF с эритроцитами, которые могут происходить при состояниях, таких как серповидно-клеточная анемия, либо независимо, либо в сочетании с лечением с использованием VAD, и которые могут происходить при состояниях агрегации тромбоцитов в процессе окклюзивного тромбоза у пациентов с VAD, или в процессе закрытия просвета сосуда, которое может возникнуть при любом количестве состояний, таких как, например, ишемический инсульт. Такие антагонисты могут использоваться в качестве VWF защитных средств. Такие антагонисты могут также использоваться в качестве терапевтических средств для регуляции и модуляции гемостаза, терапевтических средств для лечения осложнений и расстройств, связанных с аппаратом вспомогательного кровообращения (VAD), таких как aVWS и окклюзивный тромбоз, и терапевтических средств для лечения расстройств, возникающих вследствие взаимодействия мультимеров VWF с эритроцитами, например, при серповидно-клеточной анемии. Кроме того, такие средства могут использоваться в качестве терапевтических средств при лечении сердечно-сосудистых и цереброваскулярных расстройств, таких как инфаркт миокарда и инсульт.

Изобретение также относится к защитным средствам VWF, содержащим синтетические полинуклеотиды, содержащие по меньшей мере 21 непрерывный нуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 1, имеющие двухцепочечный участок, имеющий по меньшей мере 6 пар оснований. VWF защитные средства, имеющие двухцепочечную область по меньшей мере из 6 пар оснований, могут иметь большую термостабильность при более высоких температурах, и таким образом, большее сродство к VWF и повышенную функциональность по сравнению с защитными средствами с более короткой двухцепочечной областью из 5 пар оснований или меньше. Более короткие двухцепочечные области могут привести к распутыванию структуры типа "стебель - петля" при более высоких температурах и ассоциированной утрате сродства и функциональности.

В некоторых вариантах осуществления, синтетический полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь длину, составляющую 25-30 нуклеотидов. Двухцепочечная область может содержать от приблизительно 6 до приблизительно 9 пар оснований. Кроме того, двухцепочечная область образована 6, или больше, 3' и 5' нуклеотидами на конце или рядом с ним.

Синтетические полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть химически модифицированы. Каждый нуклеотид может содержать по меньшей мере одну химическую модификацию. Такая химическая модификация может быть в сахаре, нуклеоосновании или межнуклеозидном линкере синтетического полинуклеотида. Модификации сахара могут включать 2'-O-метильную модификацию.

Терминальные кэп-структуры также могут быть включены в 3'- и/или 5'-концы. Такие структуры включают, но ими не ограничиваются, по меньшей мере один инвертированный дезокситимидин или аминогруппу (NH₂). В одном из аспектов, 3'-терминальная кэп-структура содержит инвертированный дезокситимидин, и 5'-терминальная кэп-структура содержит аминогруппу (NH₂). В одном из аспектов, синтетический полинуклеотид соответствует SEQ ID NO: 2.

Защитные средства VWF, содержащие аптамеры на основе нуклеиновых кислот, могут быть модифицированы любым количеством конъюгатов. Одним из таких конъюгатов является фрагмент PEG (полиэтиленгликоль). Такие фрагменты могут иметь любой размер или конфигурацию ветвей. В одном из аспектов, фрагмент PEG может быть конъюгирован с 5'-концом аптамера нуклеиновой кислоты. В другом аспекте, фрагмент ПЭГ может быть конъюгирован с 3'-концом аптамера нуклеиновой кислоты. В одном из аспектов, синтетический полинуклеотид соответствует SEQ ID NO: 3.

Кроме того, изобретение относится к комплементарным синтетическим полинуклеотидам, которые способны гибридизоваться или связываться, полностью или частично, с любыми VWF защитными средствами, описанными выше. В одном из аспектов, комплементарный синтетический полинуклеотид может содержать по меньшей мере последовательность 12 нуклеотидов SEQ ID NO: 4. В другом аспекте комплементарный синтетический полинуклеотид может содержать по меньшей мере последовательность 15 нуклеотидов SEQ ID NO: 4. В еще одном аспекте комплементарный синтетический полинуклеотид может содержать по меньшей мере последовательность 18-22 нуклеотидов SEQ ID NO: 4.

Комплементарные синтетические полинуклеотиды могут быть химически модифицированы. Химические модификации могут быть осуществлены по меньшей мере в одном нуклеотиде комплементарного синтетического полинуклеотида. В некоторых аспектах каждый из нуклеотидов содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. Химическая модификация может представлять собой 2'-O-метил модификацию нуклеотидного сахара. Комплементарные синтетические полинуклеотиды могут дополнительно содержать 3'-концевую кэп-структуру. В одном аспекте, 3'-концевая кэп-структура может представлять собой инвертированный дезокситимидин.

В некоторых вариантах осуществления комплементарный синтетический полинуклеотид содержит SEQ ID NO: 5.

Кроме того, изобретение относится к способам предотвращения диссоциации мультимеров VWF в образце, таком как цельная кровь или плазма, или в медицинском или хирургическом устройстве, которое подвергается воздействию гемодинамического тока. Хотя диссоциация мультимеров может частично не затрагивать функциональные формы VWF, в некоторых случаях диссоциация может приводить к снижению функции. Таким образом, VWF защитные средства могут функционировать с целью ослабления этого нарушения или снижения функции.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к применениям синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или осложнения, связанного с VWF. В одном аспекте расстройство представляет собой тромботическое расстройство. В одном аспекте тромботическое расстройство представляет собой ишемический инсульт.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения ассоциированного с VAD осложнения или расстройства. В одном из аспектов осложнение или расстройство могут представлять собой приобретенный синдромом Виллебранда (aVWS), ангиодисплазию, окклюзионный тромбоз или VAD-ассоциированный тромбоз насоса.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения осложнения или расстройства, которое включает аберрантное связывание VWF с эритроцитами. В одном из аспектов осложнением или расстройством может быть серповидно-клеточная анемия.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения осложнения или расстройства, связанного с желудочно-кишечным (ЖК) кровотечением, связанным с ангиодисплазией.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для восстановления проходимости сосудов у пациента, имеющего один или несколько сосудов, окклюдированных по меньшей мере одним окклюзирующим тромбом, при этом сосуд(ы) окклюдирован(ы) по меньшей мере на 50%, причем способ включает контактирование указанного пациента с VWF защитным средством с восстановлением проходимости сосуда.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для дезагрегации одного или нескольких окклюзирующих тромбов у пациента, имеющего по меньшей мере один сосуд, который окклюдирован по меньшей мере на 50%. Такой способ включает контактирование пациента с VWF защитным средством таким образом, что один или несколько окклюзионных тромбов дезагрегируются.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, средство дезагрегирует внешний слой окклюзирующих тромбов. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, окклюзирующие тромбы образуются в условиях скоростей сдвига, составляющих 10000 с-¹ или выше. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, окклюзирующие тромбы устойчивы к фибринолизу и/или антитромботическим средствам. Заболевания или расстройства, возникающие в результате окклюзивного тромбоза, могут включать острый коронарный синдром, острый окклюзивный тромбоз и ишемический инсульт.

Кроме того, изобретение относится к применению любых синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для предотвращения агрегации тромбоцитов у пациента, имеющего тромботическое расстройство или осложнение. Синтетический полинуклеотид можно вводить путем внутривенной инъекции или подкожной инъекции. В одном из аспектов, биодоступность подкожной инъекции составляет по меньшей мере 85% относительно внутривенной инъекции. В другом аспекте биодоступность подкожной инъекции составляет по меньшей мере 95% относительно внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления синтетический полинуклеотид можно вводить в дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела пациента. Синтетический полинуклеотид может иметь период полураспада в плазме от приблизительно 70 часов до приблизительно 100 часов. В некоторых вариантах осуществления синтетический полинуклеотид может не функционировать в качестве антикоагулянта. Синтетический полинуклеотид может не увеличивать время свертывания и/или изменять синтез тромбина. В одном из аспектов тромботическое расстройство или осложнение представляет собой инфаркт миокарда. В другом аспекте тромботическое расстройство или осложнение представляет собой ишемический инсульт.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения тромботических расстройств и их осложнений, включающим контактирование пациента с диагнозом указанного расстройства или осложнения с любым из защитных агентов VWF по изобретению. В одном из аспектов тромботическое расстройство представляет собой ишемический инсульт.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения связанного с VAD осложнения или расстройства, таких как, например, aVWS и окклюзивный тромбоз, включающим контактирование пациента с диагнозом указанного осложнения или расстройства с любым из VWF защитных средств по изобретению. В некоторых вариантах осуществления тромбоз возникает в аппарате VAD. В других вариантах осуществления окклюзивный тромбоз возникает в просвете сердечно-сосудистого или цереброваскулярного сосуда у пациента с VAD или у пациента без VAD. В некоторых случаях также может быть необходимо устранить или титровать эффекты существующих защитных средств VWF. В этом случае настоящее изобретение предусматривает определенные средства обратного действия.

В других вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения заболеваний или расстройств, возникающих в результате аберрантных взаимодействий VWF с эритроцитами, с использованием VWF-защитных средств. В некоторых вариантах осуществления эритроциты представляют собой серповидные клетки. Лечение таких заболеваний или расстройств может осуществляться в комбинации с лечением VAD или независимо от лечения VAD.

В других вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения осложнения или расстройства, которое включает желудочно-кишечное кровотечение, связанное с ангиодисплазией, с помощью VWF защитного средства, в комбинации с лечением VAD или независимо от лечения VAD.

В других вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения осложнения или расстройства, которое включает тромбоз, связанный с лечением VAD посредством VWF защитного средства. В одном из вариантов осуществления окклюзивный тромбоз может происходить в одном или нескольких сосудах у пациента. В другом варианте осуществления образование тромба может происходить в самом устройстве VAD. Кроме того, изобретение относится к способам дезагрегации одного или нескольких тромбов у пациента с VAD, включающие контакт пациента с VAD с VWF защитным средством. Кроме того, изобретение относится к способам снижения частоты тромбозов у пациента с VAD, включающим контактирование пациента с VAD с VWF защитным средством, в результате чего скорость тромбоза снижается относительно скорости тромбоза у неподвергавшегося лечению VAD пациента.

В других вариантах осуществления изобретение относится к способам лечения осложнения или расстройства, которое включает образование окклюзирующего тромба, связанного с очень высокой скоростью сдвига (>10000 с-¹), такой как скорость сдвига, обнаруженная в окклюдированном сосуде с помощью защитного агента VWF. Окклюзивный тромбоз может происходить в одном или нескольких сосудах пациента.

Кроме того, изобретение относится к способам восстановления проходимости сосудов у пациента с одним или несколькими окклюдированными сосудами, включающим контактирование указанного пациента с VWF защитным средством. Изобретение также относится к способам дезагрегации окклюзирующих тромбов в одном или нескольких окклюдированных сосудах, включающим контактирование пациента, имеющего по меньшей мере один окклюдированый сосуд, с VWF защитным средством. Кроме того, изобретение относится к способам снижения скорости окклюзии сосуда у пациента, включающим контакт указанного пациента с VWF защитным средством, в результате чего скорость окклюзии сосуда уменьшается относительно скорости окклюзии сосуда у неподвергавшегося лечению пациента.

В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, один или более сосудов окклюдированы по меньшей мере на 50%. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, средство дезагрегирует внешний слой окклюзирующих тромбов. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, окклюзирующие тромбы образуются в условиях скоростей сдвига, которые составляют 10000 с-¹ или выше. В некоторых вариантах осуществления любого из вышеуказанных способов, относящихся к окклюзивному тромбозу, окклюзирующие тромбы устойчивы к фибринолизу и/или антитромботическим средствам.

Дополнительно изобретение относится к способам лечения заболеваний или расстройств, возникающих в результате окклюзивного тромбоза в сосуде. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой острый окклюзивный тромбоз или острый коронарный синдром, включая, например, инфаркт миокарда и нестабильную стенокардию. В других вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой ишемический инсульт.

В других вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения тромбоза сосудов центральной нервной системы (ЦНС), связанного с тяжелой и/или церебральной малярией.

В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к применениям любого из синтетических полинуклеотидов или комплементарных синтетических полинуклеотидов, описанных в настоящей заявке, для получения лекарственного средства для лечения желудочно-кишечного кровотечения (ЖКТ), связанного с синдромом Хейда.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеуказанные и другие цели, признаки и эффекты будут очевидны из следующего описания конкретных вариантов осуществления изобретения, как показано в прилагаемых чертежах. Чертежи не обязательно выполнены в масштабе, при этом внимание уделено иллюстрации принципов различных вариантов осуществления изобретения.

На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая три аптамерные конструкции. BT-100 (SEQ ID NO: 2) по настоящему изобретению показана для сравнения с соединениями предшествующего уровня техники ARC15105 (SEQ ID NO: 6) и ARC1779 (SEQ ID NO: 7).

На фиг. 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая средство обратного действия BT-100. На фиг. 2 представлены по порядку SEQ ID NO: 3 и 12 соответственно.

На фиг. 3 показан гель, содержащий мультимеры фактора фон Виллебранда, и влияние BT-100 на защиту мультимеров в плазме человека от протеолитической деградации, вызванной условиями высокого сдвига.

На фиг. 4 представлен схематический чертеж, изображающий последовательные стадии образования тромба. На фиг. 4А показана начальная стадия образования тромба при окклюзии <50% при физиологическом напряжении сдвига с тромбоцит-тромбоцит поперечным сшиванием, включающим, в основном, взаимодействие GpIIb/IIIa. На фиг. 4В показана следующая стадия образования тромба при окклюзии >50% при очень высоком напряжении сдвига с поперечным сшиванием тромбоцитов, включающим, в основном, взаимодействие GpIbα-VWF. На фиг. 4С показана следующая стадия полностью окклюзивного тромбоза (100% окклюзия), который на ранних стадиях устойчив к ингибиторам GpIIb/IIIa и восприимчив к ингибиторам взаимодействия GpIbα-VWF.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя консенсус, достигнутый специалистами в данной области, заключается в том, что механической причиной феномена является гемодинамическое сдвиговое усилие, создаваемое осевыми насосами, воздействующими на VWF, только жидкостного сдвигового усилия, создаваемого VAD, не достаточно, чтобы вызвать обширный протеолиз VWF. (Siediecki CA, et al., Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood 1996; 88(8):2939-2950; Schneider SW, et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences 2007; 104(19):7899-7903; Selgrade BP and Truskey GA. Computational fluid dynamics analysis to determine shear stresses and rates in a centrifugal left ventricular assist device. Artif Organs 2012; 36(4):E89-E96; Zheng Y, et al., Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 2015 Jul 30;6:7858; содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью).

Например, хорошо известно, что прикрепление тромбоцитов к A1 домену VWF усиливает "разматывание" в условиях сдвига и усиливает протеолиз VWF, и что лекарственные или биотерапевтические средства, которые связываются с A1 доменом, противодействуют взаимодействию VWF с тромбоцитами. (Shim K, et al., Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood 2008; 111(2):651-657; Nishio K, et al., Binding of platelet glycoprotein Ibα to von Willebrand factor domain A1 stimulates the cleavage of the adjacent domain A2 by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101(29):10578-10583; Huang RH, et al., A structural explanation for the antithrombotic activity of ARC1172, a NA aptamer that binds von Willebrand factor domain A1. Structure 2009; 17(11):1476-1484; Siller-Matula JM, et al., ARC15105 Is a Potent Antagonist of Von Willebrand Factor Mediated Platelet Activation and Adhesion. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2012; 32(4):902-909; и Diener JL, et al., Inhibition of von Willebrand factor-mediated platelet activation and thrombosis by the anti-von Willebrand factor A1-domain aptamer ARC1779. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009; 7(7):1155-1162; содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью). Кроме того, было известно, что взаимодействия VWF - тромбоцит обеспечивают образование окклюзирующих тромбов при очень высоких скоростях сдвига, например скоростях сдвига, наблюдаемых при лечении с помощью VAD. Блокирование взаимодействия между VWF (доменом А1) и его лигандом на тромбоцитах (GpIb) замедляет скорость образования окклюзирующих тромбов при очень высоких скоростях сдвига, и разрушает уже образованные окклюзирующие тромбы. Le Behot A, et al., GpIbα-VWF blockade restores vessel patency by dissolving platelet aggregates formed under very high shear rate in mice, Blood, 2013: Feb 19, 2014; DOI 10.1182/blood-2013-12-543074; Starling RC, et al., Unexpected Abrupt Increase in Left Ventricular Assist Device Thrombosis, 2014, N. Engl. J Med., 370:33-40; Capoccia M, et al., Recurrent Early Thrombus Formation in Heartmate II Left Ventricular Assist Device, 2013, J. Inv. Med., 1:DOI:10, 1177/2324709613490676; Meyer AL, et al., Thrombus Formation in a Heartmate II Left Ventricular Assist Device, 2008, J. Thorac Cardiovasc Surg, 135:203-204; содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью.

Исходя из этого, авторы настоящего изобретения выдвинули гипотезу о том, что введение антагониста VWF должно предотвращать и/или ослаблять ассоциированные с VAD осложнения и/или нарушения или побочные эффекты, такие как aVWS и окклюзивный тромбоз.

Терапевтическое применение антагонистов фактора фон Виллебранда было продемонстрировано при заболеваниях, относящихся к чрезмерной активации связывания VWF - тромбоцит. Одним из таких примеров является тромботическое расстройство, известное как тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (TTP), при котором нарушение протеолиза высокомолекулярных мультимеров VWF приводит к их накоплению, что, в свою очередь, может вызвать диссеминированный внутрисосудистый тромбоз. Было показано, что введение антагониста VWF пациентам с TTP устраняет тромбоцитопению, являющуюся характерным признаком этого заболевания, а также проводятся клинические исследования с целью демонстрации улучшения клинических результатов применения этого способа.

Другим примером терапевтического применения антагонизма VWF является лечение редкого наследственного расстройства, известного как болезнь фон Виллебранда типа 2b (VWD типа 2b). Пациенты с этим заболеванием имеют мутацию в А1 домене VWF, что делает его конститутивно активным, устраняя нормальную потребность в активации VWF посредством гемодинамического сдвигового усилия. В результате этой нерегулируемой активации VWF и связывания тромбоцитов, у этих пациентов развивается тромбоцитопения, а также снижаются уровни высокомолекулярных мультимеров VWF, и они склонны к спонтанному слизисто-кожному кровотечению (в частности носовому кровотечению или меноррагии).

Было показано, что введение антагониста VWF пациентам с VWD типа 2b устраняет у них тромбоцитопению и нормализует высокомолекулярную VWF мультимерную массу (см. Jilma-Stohlawetz P, et al., A dose ranging phase I/II trial of the von Willebrand factor inhibiting aptamer ARC1779 in patients with congenital thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost 2011; 106(3); Jilma-Stohlawetz P, et al., Inhibition of von Willebrand factor by ARC1779 in patients with acute thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost 2011; 105(3):545-552; US Publication 2009/0203766; International Publication WO2010/091396 and Jilma-Stohlawetz P, et al., The anti-von Willebrand factor aptamer ARC1779 increases von Willebrand factor levels and platelet counts in patients with type 2B von Willebrand disease. Thromb Haemost 2012; 108(2), содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью).

Тем не менее, учитывая все вышеизложенное, до сих пор не существует удовлетворительного лечения приобретенного синдрома фон Виллебранда (aVWS), который наблюдается у пациентов после имплантации VAD. Теоретически можно предположить, что введение экзогенного VWF, полученного из концентратов донорской плазмы, которые содержат VWF, или из рекомбинантных источников (пока не являющихся коммерчески доступными) может временно восстановить уровни высокомолекулярного мультимера VWF. Однако введение экзогенного VWF не устраняет основную проблему, возникающую в результате причинно-следственной цепочки, начиная с механически индуцированного повышенного сдвигового усилия, вызывающего несоответствующую активацию VWF, что, в свою очередь, вызывает чрезмерное связывание тромбоцитов с VWF, что в свою очередь, вызывает воздействие VWF на протеолиз, что приводит к дефициту функциональных мультимеров VWF. Помимо удаления источника сдвигового усилия (то есть VAD), от которого зависит поддержка кровообращения у пациентов, следующим лучшим способом прерывания этой причинно-следственной цепочки было бы сохранение самих мультимеров, что предусмотрено в настоящем изобретении, любым из нескольких способов, включая, но этим не ограничиваясь, блокирование связывания тромбоцитов с активируемыми сдвиговым усилием и частично размотанными мультимерами VWF.

Специалист может также предположить, что соединения, которые могут использоваться при тромботической тромбоцитопенической пурпуре или болезни фон Виллебранда типа 2b (VWD типа 2b), такие как ARC1779 или ARC15105, указанные выше, могут быть эффективными. Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что это не соответствует действительности.

Было установлено, что серповидно-клеточная анемия на исходном уровне связана с высокими концентрациями гиперактивного VWF, что тесно коррелирует со скоростью гемолиза (Chen J, et al. The rate of hemolysis in sickle cell disease correlates with the quantity of von Willebrand factor in the plasma. Blood 2011, 117, 3680-3683; содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью). Таким образом, VWF представляет собой терапевтическую мишень для улучшения гемолиза при серповидно-клеточной анемии, либо в комбинации с лечением с помощью VAD, либо независимо от лечения с помощью VAD.

Наряду со своей ролью в поддержании гемостаза (то есть, остановки кровотечения), VWF участвует в ряде процессов в сосудистой сети, включая воспаление сосудов и пролиферацию клеток гладких мышц. Также известно, что VWF является негативным регулятором ангиогенеза. Используемый в настоящей заявке термин "ангиогенез" определяется как образование новых кровеносных сосудов. Было обнаружено, что VWF действует в качестве "тормоза", ограничивая ангиогенез посредством контроля передачи сигналов VEGFR2 (Starke RD, et al., Endothelial von Willebrand factor regulates angiogenesis. Blood, 2011, 117:1071-80; содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью).

Известно, что кровотечение из желудочно-кишечного тракта у пациентов с VAD вызывается ангиодисплазией (Islam S, et al., Left ventricular assist devices and gastrointestinal bleeding: a narrative review of case reports and case series. Clin Cardiol. 2013, 36:190-200 and Suarez J, Patel CB, Felker GM, Becker R, Hernandez AF, Rogers JG. Mechanisms of bleeding and approach to patients with axial-flow left ventricular assist devices. Circ. Heart Fail. 2011 4:779-84 и приведенные в ней ссылки; содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью). Используемый в настоящей заявке термин "ангиодисплазия" определяется как сосудистые мальформации в желудочно-кишечном тракте, которые связаны с нарушенным ангиогенезом.

Не желая ограничиваться какой-либо теорией, системное истощение VWF посредством протеолиза мультимеров VWF, вызванное воздействием гемодинамических сдвиговых усилий, может привести к снижению количества VWF в эндотелии сосудов желудочно-кишечного тракта и привести к ангиодисплазии у пациентов с VAD. Таким образом, благодаря своей роли в поддержании гемостаза и/или ограничении ангиогенеза, функциональный VWF может иметь решающее значение для поддержания здорового эндотелия сосудов в желудочно-кишечном тракте.

Настоящее изобретение относится к композициям VWF средств и способам с применением VWF средств, которые предотвращают сокращение количества VWF в эндотелии сосудов. В некоторых вариантах осуществления эти композиции предотвращают образование сосудистых мальформаций в желудочно-кишечном тракте и кровотечений в желудочно-кишечном тракте у пациентов с VAD. В прямых сравнительных исследованиях, описанных в настоящей заявке, авторы изобретения показывают, что защита мультимеров VWF обеспечивается аптамером, отличным от тех, которые известны в данной области техники.

Известно, что взаимодействия между гликопротеином IIb/IIIa (GpIIb/IIIa) тромбоцитов и белками плазмы обеспечивают сшивание тромбоцитов в артериальных тромбах. Тем не менее, прошлые исследования показывают, что ингибиторы GpIIb/IIIa не оказывают существенного влияния на проходимость предокклюдированных артерий, не способных разрушать агрегаты тромбоцитов после инфаркта миокарда или ишемического инсульта. (Mehilli J, et al., Abciximab in patients with acute ST-segment- elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention after clopidogrel loading: a randomized double-blind trial. Circulation. 2009;119(14):1933-1940; Kleinschnitz C, et al., Targeting platelets in acute experimental stroke: impact of glycoprotein Ib, VI, and IIb/IIIa blockade on infarct size, functional outcome, and intracranial bleeding. Circulation. 2007;115(17):2323-2330; Adams HP Jr, et al.; AbESTT-II Investigators, Emergency administration of abciximab for treatment of patients with acute ischemic stroke: results of an international phase III trial: Abciximab in Emergency Treatment of Stroke Trial (AbESTT-II). Stroke. 2008;39(1):87-99; Kellert L, et al., Endovascular stroke therapy: tirofiban is associated with risk of fatal intracerebral hemorrhage and poor outcome. Stroke. 2013; 44(5): 1453-1455; содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью.

С другой стороны, исследования показали, что блокада взаимодействия между GpIbα и VWF приводит к реперфузии после фототромбоз-индуцированного инсульта у морских свинок (при этом ингибиторы GpIIb/IIIa являются неэффективными). Momi S, et al., Reperfusion of cerebral artery thrombosis by the GPIb-VWF blockade with the Nanobody ALX-0081 reduces brain infarct size in guinea pigs. Blood. 2013;121(25):5088-5097; содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью. Кроме того, дополнительные исследования показали положительный эффект GpIbα-VWF нацеливания посредством ингибирования пост-реперфузионной тромбовоспалительной реакции в моделях с временным механическим инсультом. Kleinschnitz C, et al., Deficiency of von Willebrand factor protects mice from ischemic stroke. Blood. 2009;113(15):3600-3603; Pham M, et al., Sustained reperfusion after blockade of glycoprotein-receptor-Ib in focal cerebral ischemia: an MRI study at 17.6 Tesla. PLoS One. 2011;6(4):e18386; Stoll G, et al., The role of glycoprotein Ibalpha and von Willebrand factor interaction in stroke development. Hamostaseologie. 2010;30(3):136-138; Kleinschnitz C, et al., Targeting platelets in acute experimental stroke: impact of glycoprotein Ib, VI, and IIb/IIIa blockade on infarct size, functional outcome, and intracranial bleeding. Circulation. 2007;115 (17):2323-2330; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

В последнее время компьютерное моделирование гидродинамики (CFD) кровотока в средней мозговой артерии на разных стадиях развития, а также модели тромботического инсульта in vivo, показали, что сшивание тромбоцитов во время закрытия просвета сосуда зависит от GpIbα-VWF взаимодействия, и нарушение GpIbα-VWF взаимодействия восстанавливает проходимость сосудов путем специфической дезагрегации внешнего слоя окклюзионных тромбов, который содержит агрегаты тромбоцитов, образованных при очень высоких скоростях сдвига (10000 с^-1 или выше). Le Behot A, et al., GpIbα-VWF blockade restores vessel patency by dissolving platelet aggregates formed under very high shear rate in mice. Blood, 2013: Feb 19, 2014; DOI 10.1182/blood-2013-12-543074; содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Также было продемонстрировано, что образование окклюзирующего тромба происходит на трех разных стадиях развития, при этом каждая стадия подвергается различным локальным скоростям сдвига и регулируется различными механизмами, что дает следующие три различные области окклюзирующего тромба: (1) основание тромба, который подвергается скорости сдвига ниже 1500 с^-1 в течение всего тромботического процесса (фибрин); (2) ядро тромба, соответствующее части тромба, сформированной на первых стадиях развития (окклюзивный тромбоз от 0% до <50%) при скоростях сдвига от приблизительно 1500 с^-1 до приблизительно 10000 с^-1 (см. фиг. 4А); и (3) внешний слой тромба, который формируется во время последней стадии (стадий) образования тромба (окклюзивный тромбоз от >50% до 100%) при очень высоких скоростях сдвига (10000 с^-1 или выше) (см. фиг. 4B) и отвечает за закрытие просвета сосуда (см. фиг. 4C). Ядро тромба в основном состоит из тромбоцитов, сшитых посредством GpIIb/IIIa-зависимых взаимодействий, при этом формирование внешнего слоя тромба зависит от Gp1bα-VWF взаимодействий. Le Behot A, et al., Blood, 2013: Feb 19, 2014; DOI 10.1182/blood-2013-12-543074.

Зависимый от сдвига тромбогенез, вызванный взаимодействиями GpIbα-VWF, возникает в стенозированных коронарных артериях или в разрывах атеросклеротических бляшек (Sadler JE. Biochemistry and genetics of von Willebrand factor. Annu Rev Biochem. 1998;67:395-424; содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Уровни VWF также повышены у пациентов, которые испытали неблагоприятные кардиальные события, которые связаны с неблагоприятным прогнозом (Collet JP, et al., Acute release of plasminogen activator inhibitor-1 in ST-segment elevation myocardial infarction predicts mortality. Circulation. 2003; 108:391-394; Fuchs I, et al., Platelet function in patients with acute coronary syndrome (ACS) predicts recurrent ACS. J Thromb Haemost. 2006;4:2547-2552; Thompson SG, et al., Hemostatic factors and the risk of myocardial infarction or sudden death in patients with angina pectoris. European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities Angina Pectoris Study Group. N Engl J Med. 1995;332:635-641; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Обычная терапия инфаркта миокарда ослабляет активацию и агрегацию тромбоцитов, но в основном направлена на рецепторы и мишени, не относящиеся к VWF. Ориентируясь на начальные стадии адгезии, при антагонизации связывание GpIb или коллагена может быть очень сильным при разработке антитромбоцитарных препаратов, тем более, когда можно обнаружить небольшую избыточность для этих взаимодействий. Кроме того, вследствие специфического требования взаимодействия GpIb-VWF в условиях высокого сдвига, артериальная стенка может быть целью без вмешательства в венозную систему, поэтому, вероятно, снижается риск возникновения кровотечений, что является наиболее заметным побочным эффектом использумых в настоящее время антитромбоцитарных препаратов. Кроме того, препараты, которые препятствуют адгезии тромбоцитов, имели бы дополнительный эффект, заключающийся в снижении активации и секреции тромбоцитов, что может оказаться эффективным в профилактике рестеноза. (De Meyer SF, et al., Antiplatelet drugs. British Journal of Haematology, 142, 515-528; содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Настоящее изобретение относится к VWF средствам, композициям и способам, которые дезагрегируют окклюзирующие тромбы, образованные при очень высоких скоростях сдвига, например при скоростях сдвига, обнаруженных в предокклюдированных сосудах или при лечении с помощью VAD. В частности, VWF средства растворяют окклюзирующие тромбы, содержащие агрегаты тромбоцитов, образованные при скоростях сдвига 10000 с^-1 или выше, то есть при скоростях, которые обнаружены во внешнем слое окклюзирующего тромба. Эти средства и композиции восстанавливают проходимость сосудов у пациентов с острым окклюзивным тромбозом или острым коронарным синдромом, включая, например, инфаркт миокарда и нестабильную стенокардию. В других вариантах осуществления, средства и композиции восстанавливают проходимость сосудов у пациентов, перенесших ишемический инсульт. В других вариантах осуществления средства и композиции восстанавливают проходимость сосудов у пациентов с VAD. В других вариантах осуществления, средства и композиции дезагрегируют один или более тромбов в аппарате VAD.

Настоящее изобретение также относится к VWF средствам, композициям и способам, которые замедляют развитие окклюзирующих тромбов, образующихся при очень высоких скоростях сдвига, таких как скорости сдвига, определенные в предокклюдированных сосудах или при лечении с помощью VAD. В частности, VWF средства замедляют развитие окклюзирующих тромбов, содержащих агрегаты тромбоцитов, образованных при скоростях сдвига 10000 с^-1 или выше, то есть скоростях, которые определены во внешнем слое окклюзионных тромбов. В других вариантах осуществления средства и композиции замедляют развитие тромбов в аппарате VAD.

Настоящее изобретение также относится к VWF средствам, композициям и способам для снижения скорости окклюзии сосуда у пациента, имеющего один или более сосудов, которые по меньшей мере на 50% окклюдированы одним или несколькими окклюзирующими тромбами, причем способ включает контактирование пациента с VWF защитным средством, в результате чего скорость окклюзии сосуда снижается по сравнению со скоростью окклюзии в необработанном сосуде, который окклюдирован по меньшей мере на 50%.

В дополнительных вариантах осуществления VWF средства, композиции и способы по настоящему изобретению могут использоваться для лечения или профилактики орфанной болезни или показаний, связанных с VWF, таких как, но ими не ограничиваясь, тяжелая и/или церебральная малярия и синдром Хейда.

Тяжелая малярия представляет собой опасное для жизни состояние, вызываемое инфекцией Plasmodium falciparum, где инфекция осложняется серьезным нарушением функций основных органов организма. Иногда тяжелая малярия связана с комой и известна как церебральная малярия. В плазме пациентов с церебральной малярией были определены повышенные уровни VWF, VWF пропептида (маркеры хронической и острой активации эндотелиальных клеток соответственно) и активированного VWF (Hollestelle MJ, et al., von Willebrand factor propeptide in malaria: evidence of acute endothelial cell activation. Br J Haematol. 2006; 133(5):562-9; de Mast Q, et al., Thrombocytopenia and release of activated von Willebrand Factor during early Plasmodium falciparum malaria. J Infect Dis. 2007; 196(4):622-8; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Это подтверждается дополнительными исследованиями, показывающими, что тяжелая малярия также связана с дефицитом расщепляющей VWF протеазы, ADAMTS13 и накоплением гиперреактивных сверхбольших мультимеров VWF (de Mast Q, et al. ADAMTS13 deficiency with elevated levels of ultra-large and active von Willebrand factor in P. falciparum and P. vivax malaria. Am J Trop Med Hyg. 2009; 80(3):492-8; Larkin D, et al. Severe Plasmodium falciparum malaria is associated with circulating ultra-large von Willebrand multimers and ADAMTS13 inhibition. PLoS Pathog. 2009; 5(3):e1000349; Löwenberg EC, et al. Severe malaria is associated with a deficiency of von Willebrand factor cleaving protease, ADAMTS13. Thromb Haemost. 2010;103(1):181-7; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Последнее исследование также показало, что VWF играет активную роль в модулировании патогенеза малярии, вероятно путем секвестрации тромбоцитов, рекрутинга инфицированных малярией эритроцитов, индуцирования повышенной проницаемости эндотелиальных клеток и, в конечном итоге, вызывает тромбоз сосудов центральной нервной системы (ЦНС). (O'Regan N, et al. A novel role for von Willebrand factor in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. Blood. 2016; 127(9):1192-201; Montgomery, R.R., The heads and the tails of malaria and VWF. Blood, 2016. 127(9): p. 1081-2; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). В соответствии с этими результатами, авторы настоящего изобретения ожидают, что нарушение взаимодействия VWF с тромбоцитами с использованием VWF средств по настоящему изобретению может предотвратить образование тромба или дезагрегировать насыщенные тромбоцитами тромбы при церебральной малярии.

Синдром Хейда представляет собой синдром желудочно-кишечного кровотечения в результате ангиодисплазии с аортальным стенозом. Сокращение высокомолекулярных мультимеров VWF определялось как связь между желудочно-кишечным кровотечением и аортальным стенозом (Warkentin TE, et al. Aortic stenosis and bleeding gastrointestinal angiodysplasia: is acquired von Willebrand's disease the link? Lancet. 1992;340(8810):35-7), и, как сообщалось, присутствует у 67-92% пациентов с тяжелым аортальным стенозом (Vincentelli A, et al. Acquired von Willebrand syndrome in aortic stenosis. N Engl J Med. 2003 Jul 24; 349(4):343-9; содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, активность VWF значительно коррелирует с тяжестью стеноза и частотой кровотечений (Blackshear JL, et al. Indexes of von Willebrand factor as biomarkers of aortic stenosis severity (from the Biomarkers of Aortic Stenosis Severity [BASS] study). Am J Cardiol. 2013;111(3):374-81; содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Считается, что высокое сдвиговое напряжение, вызванное обструкцией клапана, приводит к изменениям в структуре мультимеров VWF, увеличивая их протеолиз посредством протеазы ADAMTS13 (Vaz A, et al. Heyde syndrome--the link between aortic stenosis and gastrointestinal bleeding. Rev Port Cardiol. 2010 Feb; 29(2):309-14; Loscalzo J. From clinical observation to mechanism--Heyde's syndrome. N Engl J Med. 2012;367(20):1954-6; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Это подтверждается тем фактом, что замена клапана аорты устраняет VWF патологии и уменьшает частоту возникновения кровотечений из желудочно-кишечного тракта. Также наблюдается повышенное взаимодействие между тромбоцитами и VWF с образованием микроагрегатов тромбоцитов, которые ассоциированы с повышенной деградацией и клиренсом мультимеров VWF. В соответствии с настоящим описанием, VWF средства, описанные в настоящей заявке, могут предотвратить сокращение мультимеров VWF и/или противодействовать взаимодействию VWF с тромбоцитами, тем самым предотвращая кровотечение желудочно-кишечного тракта у пациентов с синдромом Хейда.

I. Композиции по изобретению

Изобретение относится к соединениям, композициям (включая фармацевтические композиции) и способам разработки, получения, применения и производства соединений, которые предотвращают и/или уменьшают интенсивность состояний, ассоциировнных с применением, или побочными эффектами применения желудочковых вспомогательных устройств (VAD, включая левожелудочковый аппарат вспомогательного кровообращения или LVAD), таких как LVAD-ассоциированная ангиодисплазия, приобретенный синдром фон Виллебранда (aVWS), VWD типа 2 и другие сердечно-сосудистые и цереброваскулярные нарушения, такие как, например, острый коронарный синдром, острый окклюзионный тромбоз, инсульт, аневризма и ишемические события, а также серповидно-клеточная анемия, тяжелая и/или церебральная малярия и синдром Хейда, либо в комбинации с лечением с помощью VAD, либо независимо от лечения с помощью VAD.

В некоторых вариантах осуществления, VWF защитное средство можно использовать для лечения желудочно-кишечного кровотечения, ассоциированного с ангиодисплазией. В некоторых вариантах осуществления, VWF защитное средство можно использовать для лечения пациента с VAD с кровотечением из желудочно-кишечного тракта.

Как таковые, соединения и/или композиции по настоящему изобретению взаимодействуют с мономерами или мультимерами VWF или связываются с ними таким образом, чтобы сохранять, защищать или предотвращать сокращение, уменьшение или разрушение мультимеров VWF и/или противодействовать взаимодействию мультимеров VWF с эритроцитами, например, серповидными эритроцитами. Соединения и/или композиции могут также противодействовать взаимодействию мономеров и/или мультимеров VWF с тромбоцитами с дезагрегацией окклюзирующих тромбов в предокклюдированных сосудах. В рамках изобретения, такие защитные соединения или композиции называются "VWF мультимерными защитными средствами" или "VWF защитными средствами".

В некоторых вариантах осуществления, VWF защитное средство может взаимодействовать с мономерами или мультимерами VWF или связываться с ними таким образом, чтобы сохранять, защищать от или предотвращать потерю, уменьшение количества или разрушение мультимеров VWF с восстановлением VWF-опосредованного ограничения в отношении ангиогенеза в эндотелиальных клетках сосудов и предотвращения неоваскуляризации у пациента с VAD.

В других вариантах осуществления, VWF защитное средство можно использовать для восстановления проходимости сосудов у пациента, имеющего один или более предокклюдированных сосудов, например у пациентов с острым окклюзионным тромбозом или острым коронарным синдромом, включая, например, инфаркт миокарда и нестабильную стенокардию или ишемический инсульт. В этих условиях, соединения и/или композиции взаимодействуют с VWF или связываются с VWF таким образом, чтобы противодействовать взаимодействию VWF с тромбоцитами, в результате чего окклюзирующие тромбы в предокклюдированных сосудах (сосуды, которые окклюдированы по меньшей мере на 50%) дезагрегируются. В некоторых вариантах осуществления, VWF защитное средство дезагрегирует внешний слой окклюзирующих тромбов. В некоторых вариантах осуществления, окклюзирующие тромбы, которые дезагрегированы, образуются при скоростях сдвига 10000 с^-1 или выше (то есть окклюзирующие тромбы содержат агрегаты тромбоцитов, образованные при очень высоких скоростях сдвига 10000 с^-1 или выше). В некоторых вариантах осуществления, окклюзирующие тромбы устойчивы к фибринолизу и/или антитромботическим средствам. В других вариантах осуществления, VWF защитные средства можно использовать для восстановления проходимости сосудов у пациента, подвергающегося лечению с помощью VAD.

В других вариантах осуществления, VWF защитное средство можно использовать для уменьшения скорости окклюзии сосуда у пациента, включая контакт указанного пациента с VWF защитным средством, в результате чего скорость окклюзии сосуда уменьшается относительно скорости окклюзии сосуда в необработанном сосуде. В других вариантах осуществления, VWF защитные средства могут быть использованы для снижения скорости окклюзии сосуда у пациента, подвергающегося лечению с помощью VAD.

Используемый в настоящей заявке термин "окклюзирующий тромб" относится к тромбу или тромбсодержащим агрегатам тромбоцитов, образованным при очень высоких скоростях сдвига (10000 с^-1 или выше). Такие окклюзирующие тромбы образуются в процессе закрытия просвета сосуда, то есть когда просвет окклюдирован по меньшей мере на 50%. Используемый в настоящей заявке термин "предокклюдированный(ые) сосуд(ы)" или "окклюдированный(ые) сосуд(ы)" относится к сосуду(ам), который(ые) окклюдирован(ы) по меньшей мере на 50% и может включать полностью окклюдированный(ые) сосуд(ы). Термин "полностью окклюдированный(ые) сосуд(ы)" относится к сосуду(ам), который(ые) на 100% окклюдирован(ы), или, другими словами, к сосуду с закрытым просветом.

Используемый в настоящей заявке термин "тромботическое расстройство" относится к любому заболеванию или расстройству, характеризующемуся патологическим образованием тромба. В одном из вариантов осуществления, патологическое образование тромба, характеризующее расстройство, представляет собой образование одного или нескольких окклюзирующих тромбов. Неограничивающие примеры тромботических нарушений включают болезнь фон Виллебранда, ишемический инсульт, острый коронарный синдром, инфаркт миокарда, транзиторную ишемическую атаку, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру и тромботические микроангиопатии. Тромботическое расстройство может возникать либо совместно с лечением с помощью VAD, либо независимо от лечения с помощью VAD. В одном из вариантов осуществления, тромботическое расстройство представляет собой ишемический инсульт.

В дополнительных вариантах осуществления VWF защитное средство можно использовать для лечения орфанной болезни, ассоциированной с VWF патологией, например, но ими не ограничиваясь, тяжелой и/или церебральной малярии и синдрома Хейда.

В одном из вариантов осуществления VWF защитное средство можно использовать для противодействия взаимодействию VWF с тромбоцитами у пациента с тяжелой и/или церебральной малярией, в результате чего предотвращается или уменьшается образование тромбов в сосудах ЦНС.

В другом варианте осуществления VWF защитное средство можно использовать для лечения желудочно-кишечного кровотечения, ассоциированного с синдромом Хейда. VWF защитное средство может предотвращать или уменьшать сокращение мультимеров VWF и/или противодействовать взаимодействию VWF с тромбоцитами, тем самым предотвращая кровотечение желудочно-кишечного тракта у пациента с синдромом Хейда.

VWF защитные средства: Аптамеры

В некоторых вариантах осуществления, VWF защитные средства по изобретению содержат аптамер.

Используемый в настоящей заявке термин "аптамер" представляет собой биомолекулу, которая связывается с конкретной молекулой-мишенью и модулирует активность, структуру или функцию мишени. Аптамер по настоящему изобретению может быть на основе нуклеиновой кислоты или аминокислоты. Аптамеры на основе нуклеиновых кислот обладают специфической аффинностью связывания с молекулами путем взаимодействия, отличного от классического спаривания оснований по Уотсону-Крику. Аптамеры на основе нуклеиновой кислоты, такие как пептиды, генерируемые посредством фагового дисплея или моноклональными антителами (mAb), способны специфически связываться с выбранными мишенями и, путем связывания, блокировать способность мишеней функционировать. В некоторых случаях, аптамеры также могут быть пептидными аптамерами. Используемый в настоящей заявке термин "аптамер" относится, в частности, к аптамеру на основе нуклеиновой кислоты или пептидному аптамеру.

Аптамеры, часто называемые "химическими антителами", имеют аналогичные характеристики с антителами. Типичный аптамер на основе нуклеиновой кислоты имеет размер приблизительно 10-15 кДа (20-45 нуклеотидов), связывает свою мишень с субнаномолярной аффинностью и различает близкородственные мишени.

Аптамеры могут быть как одновалентными, так и многовалентными. Аптамеры могут быть мономерными, димерными, тримерными, тетрамерными или другими высшими мультимерными аптамерами. Отдельные мономеры аптамера могут быть связаны с образованием молекул слияния мультимерных аптамеров. В качестве неограничивающего примера, связывающий олигонуклеотид (то есть линкер) может быть сконструирован таким образом, чтобы он содержал последовательности, комплементарные как 5'-плечевым, так и 3'-плечевым областям рандомизированных аптамеров с образованием димерных аптамеров. Для тримерных или тетрамерных аптамеров будет разработана небольшая тримерная или тетрамерная (то есть, подобная структуре Холлидея) наноструктура ДНК, включающая последовательности, комплементарные к области 3'-плеча рандомизированных аптамеров, осуществляя, таким образом, слияние мультимерных аптамеров путем гибридизации. Кроме того, от 3 до 5 или от 5 до 10 дт-обогащенные нуклеотидов могут быть встроены в линкерные полинуклеотиды в виде одноцепочечной области между аптамер-связывающими мотивами, что обеспечивает гибкость и подвижность множественных аптамеров для координации и синергии многовалентных взаимодействий с клеточными лигандами или рецепторами. Альтернативно, мультимерные аптамеры также могут быть получены путем смешивания биотинилированных аптамеров со стрептавидином.

Используемый в настоящей заявке термин "мультимерный аптамер" или "многовалентный аптамер" относится к аптамеру, который содержит несколько мономерных звеньев, где каждое из мономерных звеньев может представлять собой аптамер сам по себе. Поливалентные аптамеры имеют поливалентные характеристики связывания. Мультимерный аптамер может быть гомомультимером или гетеромультимером. Термин "гомомультимер" относится к мультимерному аптамеру, который содержит несколько единиц связывания одного и того же типа, то есть каждая единица связывается с одним и тем же сайтом связывания одной и той же молекулы-мишени. Термин "гетеромультимер" относится к мультимерному аптамеру, который содержит множество единиц связывания разных видов, то есть каждая единица связывания связывается с различным сайтом связывания одной и той же молекулы-мишени, или каждая единица связывания связывается с сайтом связывания на другой молекуле-мишени. Таким образом, гетеромультимер может относиться к мультимерному аптамеру, который связывается с одной молекулой-мишенью на разных сайтах связывания, или к мультимерному аптамеру, который связывается с разными молекулами-мишенями. Гетеромультимер, который связывается с различными молекулами-мишенями, также может называться мультиспецифичным мультимером.

Аптамеры нуклеиновой кислоты включают ряд связанных нуклеозидов или нуклеотидов.

Термин "нуклеиновая кислота", в самом широком смысле, включает любое соединение и/или вещество, которое содержит полимер из нуклеотидов. Эти полимеры обычно называются полинуклеотидами. Типичные молекулы нуклеиновых кислот или полинуклеотиды по изобретению включают, но ими не ограничиваются, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), треозные нуклеиновые кислоты (ТНК), гликолевые нуклеиновые кислоты (ГНК), пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), замкнутые нуклеиновые кислоты (ЗНК, включая ЗНК, имеющую β-D-рибо-конфигурацию, α-ЗНК, имеющую α-L-рибо-конфигурацию (диастереомер ЗНК), 2'-амино-ЗНК, имеющую 2'-амино функционализацию, и 2'-амино-α-ЗНК, имеющую 2'-аминофункционализацию) или их гибриды.

Специалисту в данной области понятно, что термин "молекула РНК" или "молекула рибонуклеиновой кислоты" охватывает не только молекулы РНК, которые экспрессируются или обнаруживаются в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или более аналогов или производных рибонуклеотида/рибонуклеозида, как описано в настоящей заявке или как известно в данной области. Строго говоря, "рибонуклеозид" включает нуклеозидное основание и сахар рибозу, а "рибонуклеотид" представляет собой рибонуклеозид с одним, двумя или тремя фосфатными группами. Однако термины "рибонуклеозид" и "рибонуклеотид" можно считать эквивалентными при использовании в настоящей заявке. РНК может быть модифицирована в структуре нуклеинового основания, рибофуранозильном кольце или в рибозофосфатном скелете.

Аптамерами нуклеиновой кислоты могут быть рибонуклеиновая кислота, дезоксирибонуклеиновая кислота или смесь рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты. Аптамерами могут быть: одноцепочечная рибонуклеиновая кислота, дезоксирибонуклеиновая кислота или смесь рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления VWF защитное средство может представлять собой аптамер или его соль.

В одном из вариантов осуществления, VWF защитное средство может представлять собой аптамер или его соль, которая может содержать синтетические полинуклеотиды. Синтетические полинуклеотиды могут содержать по меньшей мере последовательность 21 нуклеотидов по SEQ ID NO: 1. Кроме того, синтетические полинуклеотиды могут иметь двухцепочечную область, имеющую по меньшей мере 6 пар оснований. Не желая быть связанными какой-либо теорией, более короткие двухцепочечные области из 5 пар оснований или меньше могут привести к распутыванию структур типа "стебель - петля" при более высоких температурах и соответствующему сокращению сродства и функциональности защитных средств.

В одном из вариантов осуществления, VWF защитное средство может представлять собой аптамер или его соль, которая может содержать синтетические полинуклеотиды, где синтетические полинуклеотиды содержат по меньшей мере последовательность 21 нуклеотидов по SEQ ID NO: 1, и где синтетические полинуклеотиды содержат двухцепочечный участок, имеющий по меньшей мере 6 пар оснований. Не желая быть связанными какой-либо теорией, VWF защитные средства, имеющие двухцепочечную область по меньшей мере из 6 пар оснований, могут обладать большей термостабильностью при более высоких температурах. Эта повышенная термостабильность при более высоких температурах может обеспечить большее сродство к VWF и повышенную функциональность по сравнению с защитными средствами, которые имеют более короткую двухцепочечную область из 5 пар оснований или меньше.

В одном из вариантов осуществления, двухцепочечная область из 6 или более пар оснований находится на конце или около (например, в пределах 1-10 нуклеотидов) конца синтетического полинуклеотида.

В некоторых вариантах осуществления, аптамеры нуклеиновых кислот содержат по меньшей мере одну химическую модификацию. Модификации могут быть использованы для повышения стабильности аптамера, например, путем увеличения его устойчивости к деградации посредством рибонуклеаз (РНКазы), присутствующих в клетке, тем самым вызывая увеличение его периода полураспада в клетке. Модификации могут также или альтернативно использоваться для уменьшения вероятности или степени, в которой аптамер, введенный в клетку, вызывает врожденные иммунные ответы. Такие ответы, которые были хорошо охарактеризованы в контексте РНК-интерференции (РНКi), включая малые интерферирующие РНК (siРНК), как описано в данной области, обычно связаны с уменьшенным периодом полураспада РНК и/или элиситацией цитокинов или других факторов, связанных с иммунными реакциями.

Потенциальные модификации включают, но ими не ограничиваются, например, (а) концевые модификации, например, 5'-концевые модификации (фосфорилирование, дефосфорилирование, конъюгация, инвертированные связи и т.д.), 3'-концевые модификации (конъюгация, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т.д.), (b) модификации сахара (например, в положении 2' или 4') или замена сахара, (c) модификации основания, например замена на модифицированные основания, стабилизирующие основания, дестабилизирующие основания или основания, которые связывают пары с расширенным репертуаром партнеров или конъюгированные основания, а также (d) модификации межнуклеозидных связей, включая модификацию или замену фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры модифицированных аптамерных композиций, используемых в описанных в настоящей заявке способах, включают, но ими не ограничиваются, молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие модифицированные или неприродные межнуклеозидные связи. Модифицированный аптамер, имеющий модифицированные межнуклеозидные связи, включает, в числе прочего такие, которые не имеют атома фосфора в межнуклеозидной связи. В других вариантах осуществления, модифицированный аптамер имеет атом фосфора в своей межнуклеозидной связи (связях).

В некоторых вариантах осуществления химическая модификация выбрана из химической замены нуклеиновой кислоты в положении сахара, химической замены в положении фосфата и химической замены в положении основания. В других вариантах осуществления, химическая модификация выбрана из включения модифицированного нуклеотида; 3' кэппинга; 5' кэппинга; конъюгирования с высокомолекулярным неиммуногенным соединением; конъюгирования с липофильным соединением; и включения фосфоротиоата в фосфатный скелет.

В одном из вариантов осуществления каждый нуклеотид аптамеров на основе нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере одну химическую модификацию. Такая химическая модификация может быть в сахаре, нуклеоосновании или межнуклеозидном линкере синтетического полинуклеотида. Модификации сахара могут включать 2''-метильную модификацию.

В соответствии с аптамерами на основе нуклеиновых кислот, представленными в настоящем описании, терминальные кэп-структуры также могут быть включены в 3' и/или 5' конец. Такие структуры включают, но ими не ограничиваются по меньшей мере одну инвертированную дезокситимидиновую или аминогруппу (NH₂).

В одном из вариантов осуществления 3'-кэп представляет собой инвертированный дезокситимидин.

В другом варианте 3'-кэп представляет собой аминогруппу (NH₂).

В одном варианте осуществления 5'-кэп представляет собой инвертированный дезокситимидин.

В другом варианте осуществления 5'-кэп представляет собой аминогруппу (NH₂).

В одном из вариантов осуществления VWF защитные средства по настоящему изобретению могут быть модифицированы любым количеством конъюгатов. В качестве неограничивающего примера, конъюгаты могут представлять собой неиммуногенные соединения с высокой молекулярной массой.

В одном из вариантов осуществления высокомолекулярное неиммуногенное соединение представляет собой полиалкиленгликоль и более предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль (PEG).

В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент конъюгирован с 5'-концом аптамера на основе нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления PEG-фрагмент конъюгирован с 3'-концом аптамера на основе нуклеиновой кислоты.

В качестве неограничивающих примеров, аптамер на основе нуклеиновой кислоты может также включать по меньшей мере один модифицированный рибонуклеозид, включая, но ими не ограничиваясь, 2'-O-метил-модифицированный нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5'-фосфоротиоатную группу, концевой нуклеозид, связанный с холестериновым производным или бисдециламидной группой додекановой кислоты, блокированный нуклеозид (например, β-D-рибо-конфигурация, α-ЗНК, имеющая α-L--рибо-конфигурацию (диастереомер ЗНК), 2'-амино-ЗНК, имеющая 2'-амино-функционализацию и 2'-амино-α-ЗНК, имеющая 2'-амино-функционализацию), нуклеозид с удаленным азотистым основанием, инвертированный дезоксинуклеозид или инвертированный рибонуклеозид, 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированный нуклеозид, 2'-амино-модифицированный нуклеозид, 2'-алкил-модифицированный нуклеозид, 2'-O-алкил-модифицированный нуклеозид, 2'-O-алкил-O-алкил-модифицированный нуклеозид, 2'-фтор-модифицированный нуклеозид, 2'-фтор-модифицированный нуклеозид, морфолино нуклеозид, фосфорамидат или неприродное основание, содержащее нуклеозид, или любое их сочетание. Альтернативно, аптамер на основе нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или больше, вплоть до полной длины молекулы. Модификации не обязательно должны быть одинаковыми для каждого из такого множества модифицированных дезокси- или рибонуклеозидов в молекуле нуклеиновой кислоты.

Аптамеры на основе нуклеиновых кислот, описанные в настоящей заявке, могут также содержать одно из следующих веществ в положении 2': Н (дезоксирибоза); ОН (рибоза); F; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-O-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенным или незамещенным C₁-C₁₀ алкилом или C₂-C₁₀ алкенилом и алкинилом. Примеры модификаций включают O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nONH₂ и O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, где n и m равны от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления аптамеры на основе нуклеиновых кислот включают одно из следующих веществ в положении 2': С₁-С₁₀ низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкил, гетероциклоалкил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, репортерная группа, интеркалятор, группа для улучшение фармакокинетических свойств аптамера или группа для улучшения фармакодинамических свойств аптамера на основе нуклеиновой кислоты и другие заместители, имеющие аналогичные свойства. В некоторых вариантах осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-CH₂CH₂OCH₃, также известный как 2'-O-(2-метоксиэтил) или 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) то есть алкокси-алкокси группа. Другой типичной модификацией является 2'-диметиламинооксиэтокси, то есть группа O(CH₂)₂ON(CH₃)₂, также известная как 2'-DMAOE, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известная в данной области как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), то есть 2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂.

Аналогичные модификации могут быть также сделаны в других положениях на аптамере, в частности в 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде и 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. Аптамеры также могут иметь сахарные миметики, такие как циклобутилы, вместо пентофуранозильной группы. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают, но ими не ограничиваются, патент США №4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, некоторые из которых, обычно, принадлежат настоящей заявке, и каждая из которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

VWF защитные средства, которые основаны на нуклеиновых кислотах, могут включать модификации или замещения нуклеооснования (часто называемые в данной области просто "основанием"). Используемые в настоящей заявке "немодифицированные" или "природные" нуклеооснования включают пуриновые основания - аденин (A) и гуанин (G), и пиримидиновые основания - тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеиновые основания включают другие синтетические и природные нуклеооснования, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы, и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-даазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Другие нуклеооснования включают нуклеооснования, которые описаны в патенте США № 3687808, которые описаны в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; которые описаны в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, которые описаны Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и которые описаны Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993; содержание каждого из которых включено в настоящий документ с помощью ссылок полностью.

Было показано, что ряд модификаций нуклеотидов и нуклеозидов делает олигонуклеотид, в который они включены, более устойчивым к расщеплению нуклеазой, чем нативный олигонуклеотид; эти модифицированные олигонуклеотиды остаются интактными в течение более длительного времени, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Конкретные примеры модифицированных олигонуклеотидов включают модифицированные олигонуклеотиды, которые содержат модифицированные основные цепи, например, фосфоротиоаты, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные межсахарные связи или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические межсахарные связи. Некоторые олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды с фосфоротиоатными цепями и олигонуклеотиды, которые имеют гетероатомные основные цепи, в частности CH₂-NH-O-CH₂, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂ (известные как метилен(метилимино) или MMI-основные цепи), CH₂-O-N(CH₃)-CH₂, CH₂ -N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂ и O-N(CH₃)-CH₂-CH₂ основные цепи (где нативная фосфодиэфирная основная цепь представлена в виде O-P-O-CH₂-), амидные основные цепи [см. De Mesmaeker et al., Ace. Chem. Res., 28:366-374 (1995); который включен в качестве ссылки полностью]; морфолино структуры основной цепи (см. Summerton and Weller, патент США № 5034506); основная цепь пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК) (где фосфодиэфирная основная цепь олигонуклеотида заменена полиамидной основной цепью, причем нуклеотиды связаны прямо или косвенно с азаатомами азота полиамидной основной цепи, см. Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497; который включен в качестве ссылки полностью). Фосфорсодержащие связи включают, но ими не ограничиваются, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, содержащие 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их аналоги с 2'-5'-связями, и те, которые имеют обратную полярность, причем соседние пары нуклеозидных звеньев связаны 3'-5' с 5'-3' или 2'-5' с 5'-2'; см. патенты США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; и 5625050; содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Олигомерные соединения на основе морфолино описаны в Braasch and David Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002); Genesis, Volume 30, Issue 3, (2001); Heasman, Dev. Biol., 243: 209-214 (2002); Nasevicius et al., Nat. Genet., 26:216-220 (2000); Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9591-9596 (2000); и патенте США № 5034506, выданном 23 июля 1991 г., каждый из которых включен в качестве ссылки полностью.

Миметики олигонуклеотидов циклогексенил нуклеиновых кислот описаны в Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000), которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки. Модифицированные олигонуклеотидные основные цепи, которые не включают атом фосфора, имеют основные цепи, которые образованы короткоцепными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными межнуклеозидными связями с гетероатомом и алкилом или циклоалкилом, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают те, которые имеют морфолино-связи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые основные цепи; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые основные цепи; формацетильные и тиоформацетильные основные цепи; метиленформацетильные и тиоформацетильные основные цепи; алкенсодержащие основные цепи; сульфаматные основные цепи; метиленимино и метиленгидразино основные цепи; сульфонатные и сульфонамидные основные цепи; амидные основные цепи; и другие, имеющие смешанные N, O, S и CH₂ составляющие части; см. патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых полностью включен в качестве ссылки.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к аптамерам на основе нуклеиновых кислот, в которых группа P(O)O заменена на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), P(O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталь") или 3'-амин (-NH-CH₂-CH₂-), где каждый R или R' представляет собой независимо H или замещенный или незамещенный алкил. Связывающие группы могут быть присоединены к соседнему нуклеотиду через -O-, -N- или -S- связь. Не все связи в аптамерах на основе нуклеиновых кислот должны быть идентичными.

Дополнительные модификации, которые могут быть использованы в аптамерах на основе нуклеиновых кислот по изобретению, включают модификации, которые описаны, например, в международной публикации PCT/US2012/058519, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Подходящая длина аптамера находится в диапазоне от приблизительно 15 до приблизительно 100 нуклеотидов (нт) и в различных других предпочтительных вариантах осуществления 15-30 нт, 20-25 нт, 30-100 нт, 30-60 нт, 25-70 нт 25-60 нт, 40-60 нт, 25-40 нт, 30-40 нт, любое из следующих количеств 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нт или 40-70 нт в длину. Однако последовательность может быть составлена с достаточной гибкостью с тем, чтобы было соответствие между взаимодействиями аптамеров и двумя мишенями на расстояниях, предусмотренных в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления, аптамер на основе нуклеиновой кислоты содержит одну или несколько областей двухцепочечного характера. Такие двухцепочечные области могут возникать в результате внутренней самокомплементарности или комплементарности со второй или дополнительной молекулой аптамера. В некоторых вариантах осуществления, двухцепочечная область может иметь длину 4-12, 4-10, 4-8 пар оснований. В некоторых вариантах осуществления, двухцепочечная область может представлять собой 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 пар оснований. В некоторых вариантах осуществления, двухцепочечная область может образовывать стеблевую область. Такие удлиненные стеблевые области, имеющие двухцепочечный характер, могут использоваться для стабилизации аптамера на основе нуклеиновой кислоты. Удлиненные стеблевые области по меньшей мере из 6 пар оснований могут способствовать большей термостабильности при более высоких температурах и, таким образом, большему сродству к VWF и повышенной общей функциональности по сравнению с более короткими стеблевыми областями из 5 пар оснований или меньше. Более короткие стеблевые области могут привести к распаду структуры типа "стебель - петля" при более высоких температурах и ассоциированной утрате сродства и общей функциональности.

Используемый в настоящей заявке термин "двухцепочечный характер" означает, что в пределах любой длины двух молекул нуклеиновой кислоты, их последовательности образуют пары оснований (стандартные или нестандартные) более 50 процентов длины. Вторичная структура аптамеров, описанных в настоящей заявке, может быть подтверждена с помощью расчетных моделей, известных в данной области техники, которые прогнозируют фолдинг нуклеиновой кислоты на основе вычислений свободной энергии, таких как Mfold.

Специалистам в данной области техники понятно, что композиция олигонуклеотида может оказывать влияние на активацию комплемента. Например, количество фосфоротиоатных замещений напрямую связано с относительной степенью активации комплемента. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, аптамеры, используемые в фармацевтических композициях, лекарственных формах и способах, представленных в настоящей заявке, имеют нуклеотидную последовательность, которая включает не более четырех, не более трех, не более двух или не более одной модификации фосфоротиоатной основной цепи. В некоторых вариантах осуществления, аптамер на основе нуклеиновой кислоты не содержит фосфоротиоатных модификаций.

Аптамеры по настоящему изобретению могут быть модифицированы для повышения термостабильности. Термостабильность аптамеров на основе нуклеиновых кислот является важным фактором, который контролирует структуру, гибридизацию и функции аптамеров. В качестве неограничивающих примеров, модификации, которые могут быть использованы для усиления термостабильности аптамера, включают 2'-O-метилнуклеозиды, 2'-фторнуклеозиды, блокированные нуклеиновые кислоты (ЗНК), 2,6-диаминопурин (2-амино-dA), 5-метил dC и Super T (5-гидроксибутин-2'-дезоксиуридин). Присутствие 2'-O-метилнуклеозидов в цепях ДНК или РНК повышает термостабильность двойных спиралей, и этот эффект более выражен в двойных спиралях РНК:РНК, чем в двойных спиралях РНК:ДНК. Модификация 2'-дезоксирибозы посредством 2'-фтора повышает термостабильность двойной спирали ДНК-ДНК на 1,3°C на одну вставку. ЗНК-основания имеют модификацию основной цепи рибозы, которая блокирует основание в C3'-эндо положении, что подерживает геометрию двойной спирали РНК A-типа. ЗНК-модификация значительно повышает T_m и также является в значительной степени устойчивой к нуклеазам.

Термостабильность аптамеров на основе нуклеиновых кислот характеризуется температурой плавления (T_m), при которой половина молекул ДНК или РНК находится в двухцепочечной форме, тогда как другая половина молекул представлена одноцепочечной формой. T_m можно определить любым методом, известным в данной области техники, таким как измерение УФ-поглощения, спектроскопия кругового дихроизма и тепловое измерение. На величину T_m может оказывать влияние ряд факторов, таких как концентрация аптамера, pH, концентрация одновалентных катионов (Na⁺, K⁺) или концентрация двухвалентных катионов (Mg²⁺). В соответствии с настоящим изобретением, аптамеры имеют T_m выше 37°C и сохраняют интактные структуры типа "стебель - петля" in vivo.

Для защиты аптамеров от деградации нуклеазами и других ферментативных активностей, аптамеры могут быть дополнительно модифицированы. Аптамерная последовательность может быть модифицирована любыми подходящими способами, известными в данной области техники. Например, в основную цепь может быть включен фосфоротиоат, и 5'-модифицированный пиримидин может быть включен в 5'-конец одноцепочечной ДНК для ДНК-аптамеров. Для РНК-аптамеров модифицированные нуклеотиды, такие как замещения групп 2'-OH основной цепи рибозы, например, 2'-дезокси-NTP или 2'-фтор-NTP, могут быть включены в молекулу РНК с использованием РНК-полимеразных мутантов T7. 2'-O-Метилнуклеозиды и ЗНК также могут способствовать устойчивости к нуклеазам. Устойчивость этих модифицированных аптамеров к нуклеазе может быть оценена путем их инкубирования либо с очищенными нуклеазами, либо с нуклеазой, полученной из мышиной сыворотки, а целостность аптамеров может быть оценена посредством гель-электрофореза.

В некоторых вариантах осуществления, такие модифицированные аптамеры на основе нуклеиновых кислот могут быть синтезированы полностью из модифицированных нуклеотидов или с субпопуляцией модифицированных нуклеотидов. Модификации могут быть одинаковыми или разными. Все нуклеотиды могут быть модифицированы, и все могут содержать одну и ту же модификацию. Все нуклеотиды могут быть модифицированы, но содержать разные модификации, например, все нуклеотиды, содержащие одно и то же основание, могут иметь один тип модификации, тогда как нуклеотиды, содержащие другие основания, могут иметь разные типы модификации. Например, все пуриновые нуклеотиды могут иметь один тип модификации (или являться немодифицированными), при этом все пиримидиновые нуклеотиды имеют другой тип модификации (или являются немодифицированными). Таким образом, олигонуклеотиды или библиотеки олигонуклеотидов синтезируются с использованием любой комбинации модификаций, как описано в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления VWF аптамер представляет собой аптамер или его соль, содержащую последовательность 5'GCCAGGGACCUAAGACACAUGUCCCUGGC-3' (SEQ ID NO: 1).

В некоторых вариантах осуществления VWF аптамер представляет собой аптамер или его соль, содержащую структуру: NH₂-mGmCmCmAmGmGmGmAmCmCmUmAmAmGmAmCmAmCmAmUmGmUmCmCmCmUmGmGmC-idT (SEQ ID NO: 2) (BT-100), где "NH" представляет собой 5'-гексиламиновый линкер фосфорамидит, "idT" представляет собой инвертированный дезокситимидин, "mN" представляет собой 2'-O-метилсодержащий остаток.

В некоторых вариантах осуществления VWF аптамер представляет собой аптамер или его соль, содержащую структуру: PEG40K-NH-mGmCmCmAmGmGmGmAmCmCmUmAmAmGmAmCmAmCmAmUmGmUmCmCmCmUmGmGmC-idT (SEQ ID NO: 3) (BT-200), где "NH" представляет собой 5'-гексиламиновый линкер фосфорамидит, "idT" представляет собой инвертированный дезокситимидин, "mN" представляет собой 2'-O-метилсодержащий остаток и "PEG" представляет собой полиэтиленгликоль и PEG40K представляет собой группу для пегилирования, имеющую молекулярную массу около 40 кДа. Следует понимать, что присутствие группы PEG является необязательным, но в случае, когда она присутствует, она может иметь различный размер.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к средствам обратного действия.

Согласно настоящему изобретению, "средство обратного действия" представляет собой средство, которое изменяет, ослабляет или обращает действие VWF защитного средства. В некоторых вариантах осуществления средства обратного действия основаны на нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления средства обратного действия представляют собой конкурентно связывающиеся молекулы. В некоторых вариантах осуществления средства обратного действия связывают VWF защитные средства. В некоторых вариантах осуществления средства обратного действия гибридизуются с частью VWF защитного средства. В случае VWF защитных средств на основе нуклеиновой кислоты, таких как аптамеры, средства обратного действия могут гибридизоваться с целым, с частью, с областью защитного аптамера. Средства обратного действия могут содержать какие-либо или все модификации, описанные в настоящей заявке. Пример представлен на фиг. 2.

В некоторых вариантах осуществления средство обратного действия включает по меньшей мере 15 нуклеотидов последовательности 5'-ACAUGUGUCUUAGGUCCCUGGC-3' (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления средство обратного действия содержит последовательность по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотида SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах осуществления средство обратного действия содержит по меньшей мере последовательность 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотида, которые комплементарны или связаны с SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления, последовательность по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотида, которые комплементарны или связаны с SEQ ID NO: 1, может быть химически модифицирована. В некоторых вариантах по меньшей мере один из нуклеотидов содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. В некоторых вариантах осуществления, каждый из нуклеотидов содержит по меньшей мере одну химическую модификацию. В качестве неограничивающего примера, химическая модификация может представлять собой 2'-O-метильную модификацию нуклеотидного сахара. Кроме того, последовательность по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотида, которые комплементарны или связаны с SEQ ID NO: 1, может дополнительно включать 3'-терминальный кэп. В одном из вариантов осуществления, 3''-терминальный кэп может представлять собой инвертированный.

В некоторых вариантах осуществления средством обратного действия является BT-201, имеющий последовательность 5'mAmCmAmUmGmUmGmUmCmUmUmAmGmGmUmCmCmCmUmGmGmC-idT 3' (SEQ ID NO: 5), где "IdT" представляет собой инвертированный дезокситимидин, "mN" представляет собой 2'-O-метилсодержащий остаток.

В некоторых вариантах осуществления VWF аптамер может содержать последовательность PEG40K-NH-mGmGmGmAmCmCmUmAmAmGmAmCmAmCmAmUmGmUmCmCmC-idT (ARC15105) (SEQ ID NO: 6) или PEG20K-NH-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmGsdTmGdCdGdGdTmG mCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmCidT (ARC1779)(SEQ ID NO:7), где "NH" представляет собой 5'-гексиламиновый линкерный фосфорамидит, "idT" представляет собой инвертированный дезокситимидин, "mN" представляет собой 2'-O-метилсодержащий остаток, "dN" представляет собой дезоксинуклеотидный остаток, "sdT" представляет собой фосфоротиоат-дезокситимидиновый остаток, и "PEG" представляет собой полиэтиленгликоль, и PEG20K представляет собой пегилирующий фрагмент с молекулярной массой около 20 кДа.

[01] В некоторых вариантах осуществления VWF аптамер, при использовании в способах лечения VAD расстройств, может содержать последовательность PEG40K-NH-mGmGmGmAmCmCmUmAmAmGmAmCmAmCmAmUmGmUmCmCmC-idT (ARC15105)(SEQ ID NO: 6) или PEG20K-NH-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmGsdTmGdCdGdGdTmG mCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmCidT (ARC1779)(SEQ ID NO:7), где "NH" представляет собой 5'-гексиламиновый линкер фосфорамидит, "idT" представляет собой инвертированный дезокситимидин, "mN" представляет собой 2'-O-метилсодержащий остаток, "dN" представляет собой дезоксинуклеотидный остаток, "sdT" представляет собой фосфоротиоат-дезокситимидиновый остаток и "PEG" представляет собой полиэтиленгликоль, и PEG20K представляет собой пегилирующий фрагмент, имеющий молекулярную массу около 20 кДа

В некоторых вариантах осуществления BT-200 сохраняет одну или несколько характеристик и/или свойств BT-100. В других вариантах осуществления, BT-200 имеет одну или несколько улучшенных или измененных характеристик и/или свойств по сравнению с BT-100. В одном из аспектов, BT-200 имеет более длительный период полураспада в плазме, чем BT-100. В другом аспекте, BT-200 имеет большую продолжительность действия, чем BT-100.

В некоторых вариантах осуществления BT-200 сохраняет одну или несколько характеристик и/или свойств ARC15105 или ARC1779. В некоторых вариантах осуществления, BT-200 имеет одну или несколько улучшенных или измененных характеристик и/или свойств по сравнению с ARC15105 или ARC1779. В одном из аспектов, BT-200 имеет более длительный период полураспада в плазме, чем ARC15105 или ARC1779. В другом аспекте, BT-200 имеет более длительную продолжительность действия, чем ARC15105 или ARC1779. В другом аспекте, BT-200 обладает более высокой подкожной биодоступностью. В другом аспекте, BT-200 обладает большей эффективностью по сравнению с ARC15105 или ARC1779 в качестве VWF защитного средства.

Варианты VWF защитных средств

В настоящем изобретении рассматриваются несколько типов VWF защитных средств, которые основаны на нуклеиновых кислотах, включая варианты и производные. К ним относятся замещающие, инсерционные, делеционные и ковалентные варианты и производные. Также в объем настоящего изобретения входят VWF защитные средства, содержащие замены, вставки и/или добавления, делеции и ковалентные модификации.

Термин "производное" используется как синоним термина "вариант" и относится к молекуле, которая была модифицирована или изменена каким-либо образом относительно эталонной молекулы или исходной молекулы.

Термин "полинуклеотидный вариант" относится к молекулам, которые по своей последовательности нуклеиновой кислоты отличаются от эталонной последовательности. Варианты последовательности нуклеиновой кислоты могут иметь замены, делеции и/или вставки в определенных положениях в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с эталонной последовательностью. Обычно варианты будут обладать по меньшей мере около 50% идентичностью (гомологией) с эталонной последовательностью, и предпочтительно они будут по меньшей мере около на 80%, более предпочтительно по меньшей мере около на 90% идентичны (гомологичны) эталонной последовательности.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к "вариативным имитаторам". Используемый в настоящей заявке термин "вариативный имитатор" представляет собой термин, который включает одну или несколько нуклеиновых кислот, которые имитируют эталонную последовательность. Последовательности нуклеиновых кислот VWF защитных средств по изобретению могут включать встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты. Альтернативно, VWF защитные средства могут содержать как природные, так и не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты.

Обычно варианты будут по меньшей мере приблизительно на 70% гомологичны контрольной последовательности, и предпочтительно они будут по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, гомологичны контрольной последовательности.

"Гомология", применительно к последовательностям нуклеиновых кислот, определяется как процент остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам в последовательности второй последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, для достижения максимального процента гомологии. Методы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области техники. Понятно, что гомология зависит от вычисления процента идентичности, но может отличаться по значению благодаря гэпам и штрафам, введенным в вычисление.

Подразумевается, что термин "аналоги" включает полинуклеотидные варианты, которые отличаются одной или несколькими изменениями нуклеиновой кислоты, соответственно, например, заменами, добавлениями или делециями остатков, которые все еще сохраняют свойства исходного полипептида или полинуклеотида.

"Вариантами замещения" являются варианты, у которых по меньшей мере один нуклеозид (или нуклеотид) в исходной последовательности удален, а другой нуклеозид (или нуклеотид) вставлен на его место в том же положении. Замещения могут быть единичными, где только один нуклеозид (или нуклеотид) в молекуле был замещен, или они могут быть множественными, где два или более нуклеозидов (или нуклеотидов) были замещены в одной и той же молекуле.

"Варианты вставки" представляют собой варианты вставки с одним или несколькими нуклеозидами (или нуклеотидами), вставленными непосредственно рядом с нуклеозидом (или нуклеотидом) в определенном положении исходной последовательности. "Непосредственно рядом" с нуклеозидом (или нуклеотидом) означает непосредственно с 5' или 3' положением настоящего нуклеозида или нуклеотида в полинуклеотиде.

"Варианты делеции" представляют собой варианты с одним или несколькими удаленными нуклеозидами (или нуклеотидами) в исходной последовательности. Обычно варианты делеции будут иметь один или более удаленных нуклеозидов (или нуклеотидов) в конкретной области молекулы.

Ковалентные модификации обычно вводят путем взаимодействия целевых нуклеозидных (или нуклеотидных) остатков молекулы с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными атомами или остатками. Такие модификации известны специалистам в данной области техники и осуществляются без проведения излишних экспериментов.

Ковалентные производные включают, в частности, слитые молекулы, в которых нуклеиновые кислоты по изобретению ковалентно связаны с небелковым полимером. Небелковый полимер обычно представляет собой гидрофильный синтетический полимер, то есть полимер, не встречающийся в природе. Однако используются полимеры, которые существуют в природе и получают рекомбинантными методами или методами in vitro, а также полимеры, выделенные из природных продуктов. Гидрофильные поливиниловые полимеры включены в объем настоящего изобретения, например, поливиниловый спирт и поливинилпирролидон. В частности, используются поливинилалкиленовые эфиры, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль. VWF защитные средства могут быть связаны с различными небелковыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, способом, опсанным в патенте США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337; содержание, которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

"Особенности" определяются как отдельные компоненты молекулы на основе нуклеозидной (или нуклеотидной) последовательности. Особенности VWF защитных средств по настоящему изобретению включают поверхностное проявление, локальную конформационную форму, укладки, петли, полупетли, домены, полудомены, сайты, концы или любое их сочетание.

Используемый в настоящей заявке термин "поверхностное проявление" относится к компоненту полинуклеотида, появляющемуся на внешней поверхности.

Используемый в настоящей заявке термин "локальная конформационная форма" означает структурное проявление, которое находится в определимом пространстве полинуклеотида.

Используемый в настоящей заявке термин "укладка" означает результирующую конформацию нуклеозидной (или нуклеотидной) последовательности при минимизации энергии. Укладка может возникать на вторичном или третичном уровне процесса укладки.

Используемый в настоящей заявке термин "изгиб" означает изгиб, который изменяет направление основной цепи полинуклеотида и может включать один, два, три или более нуклеозидных (или нуклеотидных) остатка.

Используемый в настоящей заявке термин "петля" относится к структурной особенности полинуклеотида, которая меняет направление основной цепи последовательности и содержит четыре или более нуклеозидных (или нуклеотидных) остатка.

Используемый в настоящей заявке термин "домен" относится к мотиву полинуклеотида, имеющего одну или несколько идентифицируемых структурных или функциональных характеристик или свойств (например, способность связывания), используемых в качестве сайта для молекулярных взаимодействий.

Используемый в настоящей заявке термин "сайт", поскольку он относится к вариантам на основе нуклеозидов (или нуклеотидов), используется в качестве синонима "остатка нуклеиновой кислоты". Сайт представляет собой положение в полинуклеотиде, которое может быть модифицировано, обработано, преобразовано, дериватизировано или изменено в молекулах на основе полинуклеотида по настоящему изобретению.

Используемый в настоящей заявке термин "конец" относится к концу полинуклеотида. Такой конец не ограничивается только первым или конечным сайтом полинуклеотида, но может включать дополнительные нуклеозиды (или нуклеотиды) в концевых областях. Молекулы на основе полинуклеотидов по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы как имеющие 5'-конец и 3'-конец.

После того как любая из характеристик идентифицируется или определяется как компонент молекулы по изобретению, любая из нескольких манипуляций и/или модификаций этих характеристик может быть выполнена путем перемещения, замены, инвертирования, делеции, рандомизации или дублирования. Кроме того, понятно, что манипуляция характеристиками может привести к тому же результату, что и модификация молекул по изобретению. Например, манипуляция, которая включает удаление домена, может привести к изменению длины молекулы, подобно модификации нуклеиновой кислоты для кодирования, которая меньше, чем у полноразмерной молекулы.

Модификации и манипуляции могут быть выполнены способами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез. Затем полученные модифицированные молекулы могут быть исследованы на активность с использованием анализов in vitro или in vivo, таких как, например, описанные в настоящей заявке, или любого другого подходящего скринингового анализа, известного в данной области техники.

Изотопные вариации

VWF Защитные средства по настоящему изобретению могут содержать один или более атомов, которые являются изотопами. Используемый в настоящей заявке термин "изотоп" относится к химическому элементу, который имеет один или более дополнительных нейтронов. В одном из вариантов осуществления, соединения по настоящему изобретению могут быть дейтерированы. Используемый в настоящей заявке термин "дейтерированный" относится к веществу, в котором один или более атомов водорода заменены на изотопы дейтерия. Изотопы дейтерия представляют собой изотопы водорода. Ядро водорода содержит один протон, тогда как ядра дейтерия содержат как протон, так и нейтрон. VWF защитные средства могут быть дейтерированы для изменения физических свойств соединения, таких как стабильность, или для того, чтобы соединения могли использоваться в диагностических и экспериментальных целях.

Конъюгаты и комбинации

Настоящее изобретение предполагает, что VWF защитные средства по настоящему изобретению могут быть связаны в комплекс, конъюгированы или объединены с одной или несколькими гомологичными или гетерологичными молекулами. Используемый здесь термин "гомологичная молекула" означает молекулу, которая аналогична по меньшей мере одной из структур или функций относительно исходной молекулы, тогда как "гетерологичная молекула" представляет собой молекулу, которая отличается по меньшей мере одной структурой или функцией относительно исходной молекулы. Соответственно, структурные гомологи представляют собой молекулы, которые по существу являются структурно аналогичными. Они могут быть идентичными. Функциональные гомологи представляют собой молекулы, которые по существу являются функционально аналогичными. Они могут быть идентичными.

VWF защитные средства по изобретению могут содержать конъюгаты. Такие конъюгаты по изобретению могут включать встречающееся в природе вещество или лиганд, такой как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL), липопротеин высокой плотности (HDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота); или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота, олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли L-аспарагиновую кислоту, поли L-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер поли(L-лактид-со-гликолид), сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, N-(2-гидроксипропил)метакриламидный сополимер (HMPA), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловая кислота), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Пример полиаминов включает: полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидомиметический полиамин, полиаминовый дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или альфа-спиральный пептид.

VWF защитные средства по настоящему изобретению могут быть синтезированы таким образом, чтобы они были конъюгированы с другими полинуклеотидами, красителями, интеркалирующими агентами (например, акридины), сшивающими агентами (например, псорален, митомицин C), порфиринами (TPPC4, техсафирин, сапфирин), репортерными молекулами, полициклическими ароматическими углеводородами (например, феназин, дигидрофеназин), искусственными эндонуклеазами (например, ЭДТА), алкилирующими агентами, фосфатами, амино, меркапто, ПЭГ (например, PEG-40К), MPEG, [MPEG]₂, полиамино, алкилом, замещенным алкилом, радиоактивными маркерами, ферментами, гаптенами (например, биотин), стимуляторами транспорта/абсорбции (например, аспирин, витамин Е, фолиевая кислота), синтетическими рибонуклеазами, белками, например, гликопротеинами, или пептидами, например молекулами, имеющими специфическое сродство к колиганду, или антителами, например антителом, которое связывается с указанным типом клеток, таким как злокачественная клетка, эндотелиальная клетка или остеоцит, гормонами и рецепторами гормонов, непептидными видами, такими как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы или лекарство.

Конъюгаты могут также включать нацеливающие группы, например, нацеливающий на клетки или ткани агент или группу, например, лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, которое связывается с указанным типом клеток, таким как почечная клетка. Нацеливающей группой может быть тиротропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, сурфактантный белок А, муцининовый углевод, многовалентная лактоза, многовалентная галактоза, N-ацетил-гулукозамин, многовалентная манноза, многовалентная фукоза, гликозилированные полиаминокислоты, многовалентная галактоза, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчная кислота, фолат, витамин B12, биотин, пептид RGD, миметик RGD-пептида или аптамер.

Нацеливающие группы могут представлять собой белки, например, гликопротеины или пептиды, например молекулы, имеющие специфическое сродство к колиганду, или антитела, например антитело, которое связывается с указанным типом клеток, таким как злокачественная клетка, эндотелиальная клетка или остеоцит. Нацеливающие группы могут также включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать непептидные виды, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, многовалентная лактоза, многовалентная галактоза, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилгулукозамин, многовалентная манноза, многовалентная фукоза или аптамеры.

Нацеливающая группа может быть любым лигандом, который способен нацеливаться на конкретный рецептор. Примеры включают, без ограничения, фолат, GalNAc, галактозу, маннозу, маннозу-6Р, аптамеры, лиганды интегринового рецептора, лиганды хемокинового рецептора, трансферрин, биотин, лиганды серотониновых рецепторов, PSMA, эндотелин, GCPII, соматостатин, LDL и HDL лиганды. В конкретных вариантах осуществления, нацеливающая группа представляет собой аптамер. Аптамер может быть немодифицированным или иметь любое сочетание модификаций, описанных в настоящей заявке.

В других вариантах осуществления, VWF защитное средство ковалентно конъюгировано с проникающим в клетку полипептидом. Проникающий в клетку пептид также может включать сигнальную последовательность. Конъюгаты по изобретению могут быть синтезированы таким образом, чтобы иметь повышенную стабильность; повышенную клеточную трансфекцию; и/или измененное биораспределение (например, направленное на конкретные ткани или типы клеток).

VWF защитные средства по настоящему изобретению могут быть синтезированы таким образом, чтобы они были конъюгированы с любым количеством конъюгатов. В качестве неограничивающего примера, конъюгаты могут представлять собой неиммуногенные соединения с высокой молекулярной массой.

Конъюгирующие фрагменты могут добавляться к VWF защитным средствам, в результате чего они позволяют метить или маркировать VWF для очистки. Такие молекулы для мечения/маркирования включают, но ими не ограничиваются, убиквитин, флуоресцентные молекулы, гемагглютинин гриппа человека (HA), c-myc (10-аминокислотный сегмент протоонкогена myc человека с последовательностью EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 10)), гистидин (His), FLAG (короткий пептид последовательности DYKDDDDK (SEQ ID NO: 11)), глутатион-S-трансфераза (GST), V5 (эпитоп парамиксовируса обезьяны 5), биотин, авидин, стрептавидин, пероксидаза хрена (HRP) и дигоксигенин.

В некоторых вариантах осуществления, VWF защитные средства могут сочетаться с другими VWF защитными средствами или другими молекулами при лечении заболевания или состояния.

VWF защитные средства могут использоваться в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими, профилактическими, диагностическими или визуализирующими агентами. Фраза "в комбинации с" не подразумевает, что агенты должны вводиться одновременно и/или объединяться в композиции для совместной доставки, хотя эти способы доставки включены в объем настоящего изобретения. Композиции можно вводить одновременно, до или после одной или нескольких других необходимых терапевтических или медицинских процедур. Обычно каждый агент будет вводиться в дозе и/или в соответствии с графиком, определенным для этого агента. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение охватывает доставку фармацевтических, профилактических, диагностических или визуализирующих композиций в комбинации с агентами, которые могут улучшать их биодоступность, уменьшать и/или модифицировать их метаболизм, ингибировать их выведение и/или модифицировать их распределение в организме.

В некоторых вариантах осуществления, комбинация может включать терапевтическое средство, такое как цитотоксин, радиоактивный ион, химиотерапевтический или другой терапевтический агент. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает любое средство, которое может оказывать негативное воздействие на клетки. Примеры включают, но ими не ограничиваются, таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенипозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, майтанзиноиды, например майтанзинол (см. патент США № 5208202, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки), рахельмицин (CC-1065, см. патенты США № 5475902, 5585499 и 5846545, каждый из которых полностью включен в настоящее описание посредством ссылки), и их аналоги или гомологи. Радиоактивные ионы включают, но ими не ограничиваются, иод (например, иод 125 или иод 131), стронций 89, фосфор, палладий, цезий, иридий, фосфат, кобальт, иттрий 90, самарий 153 и празеодим. Другие терапевтические средства включают, но ими не ограничиваются, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиотепа хлорамбуцил, рахельмицин (CC-1065), мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, диброманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические средства (например, винкристин, винбластин, таксол и майтанзиноиды).

В некоторых вариантах осуществления комбинация может включать детектируемый агент, например различные органические малые молекулы, неорганические соединения, наночастицы, ферменты или субстраты фермента, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества (например, люминол), биолюминесцентные вещества (например, люцифераза, люциферин и экворин), хемилюминесцентные вещества, радиоактивные вещества (например, ¹⁸F, ⁶⁷Ga, ^81mKr, ⁸²Rb, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹³³Xe, ²⁰¹Tl, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, ³H, или ^99mTc (например, пертехнетат (технетат (VII), TcO₄)) и контрастные вещества (например, золото (например, наночастицы золота), гадолиний (например, хелатированный Gd), оксиды железа (например, суперпарамагнитный оксид железа (SPIO), наночастицы монокристаллического оксида железа (MION) и сверхмалый суперпарамагнитный оксид железа (USPIO)), хелаты марганца (например, Mn-DPDP), сульфат бария, йодсодержащие контрастные вещества (иогексол), микропузырьки или перфторуглероды). Такие оптически детектируемые метки включают, например, без ограничения, 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостилбен-2,2'-дисульфоновую кислоту; акридин и его производные (например, акридин и изотиоцианат акридина); 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновая кислота (EDANS); 4-амино-N-[3-винилсульфонил)фенил]нафталимид-3,5-дисульфонат; N-(4-анилино-л-нафтил)малеимид; антраниламид; BODIPY; бриллиантовый желтый; кумарин и его производные (например, кумарин, 7-амино-4-метилкумарин (AMC, кумарин 120) и 7-амино-4-трифторметилкумарин (кумарин 151)); цианиновые красители; цианозин; 4',6-диаминидино-2-фенилиндол (DAPI); 5'5"-дибромопирогаллолсульфонафталеин (бромпирогаллоловый красный); 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин; диэтилентриаминпентаацетат; 4,4'-диизотиоцианатодигидро-стильбен-2,2'-дисульфоновая кислота; 4,4'-диизотиоцианатостилбен-2,2'-дисульфоновая кислота; 5-[диметиламино]нафталин-1-сульфонилхлорид (DNS, дансилхлорид); 4-диметиламинофенилазофенил-4'-изотиоцианат (DABITC); эозин и его производные (например, эозин и изотиоцианат эозина); эритрозин и его производные (например, эритрозин В и изотиоцианат эритрозина); этидий; флуоресцеин и его производные (например, 5-карбоксифлуоресцеин (FAM), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил)аминофлуоресцеин (DTAF), 2',7'-диметокси-4'5'-дихлор-6-карбоксифлуоресцеин, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, X-родамин-5-(и-6)-изотиоцианат(QFITC или XRITC) и флуорескамин); 2-[2-[3-[[1,3-дигидро-1,1-диметил-3-(3-сульфопропил)-2Н-бенз[е]индол-2-илиден]этилиден]-2-[4-(этоксикарбонил)-1-пиперазинил]-1-циклопентен-1-ил]этенил]-1,1-диметил-3-(3-сульфорпропил)-1Н-бенз[е]индолия гидроксид, внутренняя соль, соединение с N, N-диэтилэтанамином (1:1) (IR144); 5-хлор-2-[2-[3-[(5-хлор-3-этил-2(3H)бензотиазол-илиден)этилиден]-2-(дифениламино)-1-циклопентен-1-ил]этенил]-3-этилбензотиазолия перхлорат (IR140); малахитовый зеленый изотиоцианат; 4-метилумбеллиферон ортокрезолфталеин; нитротирозин; парарозанилин; феноловый красный; В-фикоэритрин; о-фталевый альдегид; пирен и его производные (например, пирен, пиренбутират и сукцинимидил-1-пирен); бутиратные квантовые точки; реакционноспособный красный 4 (CIBACRONTM бриллиантовый красный 3B-A); родамин и его производные (например, 6-карбокси-X-родамин (ROX), 6-карбоксиродамин (R6G), лиссамин родамин B сульфонилхлорид родарнин (Rhod), родамин B, родамин 123, родамин X изотиоцианат, сульфородамин B, сульфородамин B, сульфонилхлоридное производное сульфородамина 101 (техасский красный), N, N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), тетраметил родамин и изотиоцианат родамин тетраметил (TRITC)); рибофлавин; розоловая кислота; хелатные производные тербия; цианин-3 (Cy3); цианин-5 (Cy5); цианин-5.5 (Cy5.5), цианин-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta голубой; фталоцианин; и нафталоцианин.

В некоторых вариантах осуществления, детектируемый агент может представлять собой не детектируемый прекурсор, который становится детектируемым при активации (например, флуорогенные тетразин-флуорофорные конструкции (например, тетразин-BODIPY FL, тетразин-Oregon Green 488 или тетразин-BODIPY TMR-X) или активируемые ферментом флуорогенные агенты (например, PROSENSE® (VisEn Medical)). Анализы in vitro, в которых могут быть использованы меченые ферментом композиции, включают, но ими не ограничиваются, иммуноферментные анализы (ELISA), иммунопреципитационные анализы, иммунофлуоресценция, иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммуноанализ (RIA) и вестерн-блоттинг.

II. Цели изобретения: VWF мономеры или мультимеры

Настоящее изобретение относится к аптамерам (самим по себе мономерам или мультимерам), которые связываются с мономерами или мультимерами фактора Виллебранда (VWF). Эти аптамеры обозначаются в настоящей заявке как "аптамеры VWF". Как указано выше, аптамеры VWF могут быть на основе нуклеиновых кислот или аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления, целью VWF защитных средств является VWF белок или белковые мультимеры. В некоторых вариантах осуществления, VWF защитные средства могут быть предназначены для связывания или ассоциации с белками или другими биомолекулами, которые сами ассоциируются с VWF белком.

мРНК фактора Виллебранда человека в настоящей заявке соответствует SEQ ID NO: 8 (NM_000552; 8833 нт), а белок соответствует SEQ ID NO: 9 (NP_000543; 2813 аминокислот).

Последовательность VWF мРНК человека представлена в настоящей заявке: >gi|89191867|ref|NM_000552.3| Фактор Виллебранда человека (VWF), мРНК: AGCTCACAGCTATTGTGGTGGGAAAGGGAGGGTGGTTGGTGGATGTCACAGCTTGGGCTTTATCTCCCCCAGCAGTGGGGACTCCACAGCCCCTGGGCTACATAACAGCAAGACAGTCCGGAGCTGTAGCAGACCTGATTGAGCCTTTGCAGCAGCTGAGAGCATGGCCTAGGGTGGGCGGCACCATTGTCCAGCAGCTGAGTTTCCCAGGGACCTTGGAGATAGCCGCAGCCCTCATTTGCAGGGGAAGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTTGCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCCGATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATGTACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAAACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCCTCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGTACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGGGCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCTATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTGTCAGACAGATACTTCAACAAGACCTGCGGGCTGTGTGGCAACTTTAACATCTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACCCTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGTGAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAATGCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGTTTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGTGAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGCCCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACGGCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAGTATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACATCAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGGGACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGCGTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTGCAACACCTGCATTTGCCGAAACAGCCAGTGGATCTGCAGCAATGAAGAATGTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACAGGTCAATCACACTTCAAGAGCTTTGACAACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGATTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTGATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGCCTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGATGGCCAGGACGTCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGCATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATGGACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGCCGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACGACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGGAACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAGCGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGTGCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGCCCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGACGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCGCGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTGAACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCTGACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCCTGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGACTGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCAGCCAGAAGACATCTTCTCAGACCATCACACCATGTGCTACTGTGAGGATGGCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGACGCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCAAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGTCGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTGCTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGTAACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGATGGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGTCTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCTGCTTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGAGGACATCTCGGAACCGCCGTTGCACGATTTCTACTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATGGCTCCTCCAGGCTGTCCGAGGCTGAGTTTGAAGTGCTGAAGGCCTTTGTGGTGGACATGATGGAGCGGCTGCGCATCTCCCAGAAGTGGGTCCGCGTGGCCGTGGTGGAGTACCACGACGGCTCCCACGCCTACATCGGGCTCAAGGACCGGAAGCGACCGTCAGAGCTGCGGCGCATTGCCAGCCAGGTGAAGTATGCGGGCAGCCAGGTGGCCTCCACCAGCGAGGTCTTGAAATACACACTGTTCCAAATCTTCAGCAAGATCGACCGCCCTGAAGCCTCCCGCATCACCCTGCTCCTGATGGCCAGCCAGGAGCCCCAACGGATGTCCCGGAACTTTGTCCGCTACGTCCAGGGCCTGAAGAAGAAGAAGGTCATTGTGATCCCGGTGGGCATTGGGCCCCATGCCAACCTCAAGCAGATCCGCCTCATCGAGAAGCAGGCCCCTGAGAACAAGGCCTTCGTGCTGAGCAGTGTGGATGAGCTGGAGCAGCAAAGGGACGAGATCGTTAGCTACCTCTGTGACCTTGCCCCTGAAGCCCCTCCTCCTACTCTGCCCCCCGACATGGCACAAGTCACTGTGGGCCCGGGGCTCTTGGGGGTTTCGACCCTGGGGCCCAAGAGGAACTCCATGGTTCTGGATGTGGCGTTCGTCCTGGAAGGATCGGACAAAATTGGTGAAGCCGACTTCAACAGGAGCAAGGAGTTCATGGAGGAGGTGATTCAGCGGATGGATGTGGGCCAGGACAGCATCCACGTCACGGTGCTGCAGTACTCCTACATGGTGACTGTGGAGTACCCCTTCAGCGAGGCACAGTCCAAAGGGGACATCCTGCAGCGGGTGCGAGAGATCCGCTACCAGGGCGGCAACAGGACCAACACTGGGCTGGCCCTGCGGTACCTCTCTGACCACAGCTTCTTGGTCAGCCAGGGTGACCGGGAGCAGGCGCCCAACCTGGTCTACATGGTCACCGGAAATCCTGCCTCTGATGAGATCAAGAGGCTGCCTGGAGACATCCAGGTGGTGCCCATTGGAGTGGGCCCTAATGCCAACGTGCAGGAGCTGGAGAGGATTGGCTGGCCCAATGCCCCTATCCTCATCCAGGACTTTGAGACGCTCCCCCGAGAGGCTCCTGACCTGGTGCTGCAGAGGTGCTGCTCCGGAGAGGGGCTGCAGATCCCCACCCTCTCCCCTGCACCTGACTGCAGCCAGCCCCTGGACGTGATCCTTCTCCTGGATGGCTCCTCCAGTTTCCCAGCTTCTTATTTTGATGAAATGAAGAGTTTCGCCAAGGCTTTCATTTCAAAAGCCAATATAGGGCCTCGTCTCACTCAGGTGTCAGTGCTGCAGTATGGAAGCATCACCACCATTGACGTGCCATGGAACGTGGTCCCGGAGAAAGCCCATTTGCTGAGCCTTGTGGACGTCATGCAGCGGGAGGGAGGCCCCAGCCAAATCGGGGATGCCTTGGGCTTTGCTGTGCGATACTTGACTTCAGAAATGCATGGTGCCAGGCCGGGAGCCTCAAAGGCGGTGGTCATCCTGGTCACGGACGTCTCTGTGGATTCAGTGGATGCAGCAGCTGATGCCGCCAGGTCCAACAGAGTGACAGTGTTCCCTATTGGAATTGGAGATCGCTACGATGCAGCCCAGCTACGGATCTTGGCAGGCCCAGCAGGCGACTCCAACGTGGTGAAGCTCCAGCGAATCGAAGACCTCCCTACCATGGTCACCTTGGGCAATTCCTTCCTCCACAAACTGTGCTCTGGATTTGTTAGGATTTGCATGGATGAGGATGGGAATGAGAAGAGGCCCGGGGACGTCTGGACCTTGCCAGACCAGTGCCACACCGTGACTTGCCAGCCAGATGGCCAGACCTTGCTGAAGAGTCATCGGGTCAACTGTGACCGGGGGCTGAGGCCTTCGTGCCCTAACAGCCAGTCCCCTGTTAAAGTGGAAGAGACCTGTGGCTGCCGCTGGACCTGCCCCTGCGTGTGCACAGGCAGCTCCACTCGGCACATCGTGACCTTTGATGGGCAGAATTTCAAGCTGACTGGCAGCTGTTCTTATGTCCTATTTCAAAACAAGGAGCAGGACCTGGAGGTGATTCTCCATAATGGTGCCTGCAGCCCTGGAGCAAGGCAGGGCTGCATGAAATCCATCGAGGTGAAGCACAGTGCCCTCTCCGTCGAGCTGCACAGTGACATGGAGGTGACGGTGAATGGGAGACTGGTCTCTGTTCCTTACGTGGGTGGGAACATGGAAGTCAACGTTTATGGTGCCATCATGCATGAGGTCAGATTCAATCACCTTGGTCACATCTTCACATTCACTCCACAAAACAATGAGTTCCAACTGCAGCTCAGCCCCAAGACTTTTGCTTCAAAGACGTATGGTCTGTGTGGGATCTGTGATGAGAACGGAGCCAATGACTTCATGCTGAGGGATGGCACAGTCACCACAGACTGGAAAACACTTGTTCAGGAATGGACTGTGCAGCGGCCAGGGCAGACGTGCCAGCCCATCCTGGAGGAGCAGTGTCTTGTCCCCGACAGCTCCCACTGCCAGGTCCTCCTCTTACCACTGTTTGCTGAATGCCACAAGGTCCTGGCTCCAGCCACATTCTATGCCATCTGCCAGCAGGACAGTTGCCACCAGGAGCAAGTGTGTGAGGTGATCGCCTCTTATGCCCACCTCTGTCGGACCAACGGGGTCTGCGTTGACTGGAGGACACCTGATTTCTGTGCTATGTCATGCCCACCATCTCTGGTCTACAACCACTGTGAGCATGGCTGTCCCCGGCACTGTGATGGCAACGTGAGCTCCTGTGGGGACCATCCCTCCGAAGGCTGTTTCTGCCCTCCAGATAAAGTCATGTTGGAAGGCAGCTGTGTCCCTGAAGAGGCCTGCACTCAGTGCATTGGTGAGGATGGAGTCCAGCACCAGTTCCTGGAAGCCTGGGTCCCGGACCACCAGCCCTGTCAGATCTGCACATGCCTCAGCGGGCGGAAGGTCAACTGCACAACGCAGCCCTGCCCCACGGCCAAAGCTCCCACGTGTGGCCTGTGTGAAGTAGCCCGCCTCCGCCAGAATGCAGACCAGTGCTGCCCCGAGTATGAGTGTGTGTGTGACCCAGTGAGCTGTGACCTGCCCCCAGTGCCTCACTGTGAACGTGGCCTCCAGCCCACACTGACCAACCCTGGCGAGTGCAGACCCAACTTCACCTGCGCCTGCAGGAAGGAGGAGTGCAAAAGAGTGTCCCCACCCTCCTGCCCCCCGCACCGTTTGCCCACCCTTCGGAAGACCCAGTGCTGTGATGAGTATGAGTGTGCCTGCAACTGTGTCAACTCCACAGTGAGCTGTCCCCTTGGGTACTTGGCCTCAACTGCCACCAATGACTGTGGCTGTACCACAACCACCTGCCTTCCCGACAAGGTGTGTGTCCACCGAAGCACCATCTACCCTGTGGGCCAGTTCTGGGAGGAGGGCTGCGATGTGTGCACCTGCACCGACATGGAGGATGCCGTGATGGGCCTCCGCGTGGCCCAGTGCTCCCAGAAGCCCTGTGAGGACAGCTGTCGGTCGGGCTTCACTTACGTTCTGCATGAAGGCGAGTGCTGTGGAAGGTGCCTGCCATCTGCCTGTGAGGTGGTGACTGGCTCACCGCGGGGGGACTCCCAGTCTTCCTGGAAGAGTGTCGGCTCCCAGTGGGCCTCCCCGGAGAACCCCTGCCTCATCAATGAGTGTGTCCGAGTGAAGGAGGAGGTCTTTATACAACAAAGGAACGTCTCCTGCCCCCAGCTGGAGGTCCCTGTCTGCCCCTCGGGCTTTCAGCTGAGCTGTAAGACCTCAGCGTGCTGCCCAAGCTGTCGCTGTGAGCGCATGGAGGCCTGCATGCTCAATGGCACTGTCATTGGGCCCGGGAAGACTGTGATGATCGATGTGTGCACGACCTGCCGCTGCATGGTGCAGGTGGGGGTCATCTCTGGATTCAAGCTGGAGTGCAGGAAGACCACCTGCAACCCCTGCCCCCTGGGTTACAAGGAAGAAAATAACACAGGTGAATGTTGTGGGAGATGTTTGCCTACGGCTTGCACCATTCAGCTAAGAGGAGGACAGATCATGACACTGAAGCGTGATGAGACGCTCCAGGATGGCTGTGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGGTCACAGGCTGCCCACCCTTTGATGAACACAAGTGTCTGGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCCAGGCACCTGCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGTCAAGGTGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATCCACTACTGCCAGGGCAAATGTGCCAGCAAAGCCATGTACTCCATTGACATCAACGATGTGCAGGACCAGTGCTCCTGCTGCTCTCCGACACGGACGGAGCCCATGCAGGTGGCCCTGCACTGCACCAATGGCTCTGTTGTGTACCATGAGGTTCTCAATGCCATGGAGTGCAAATGCTCCCCCAGGAAGTGCAGCAAGTGAGGCTGCTGCAGCTGCATGGGTGCCTGCTGCTGCCTGCCTTGGCCTGATGGCCAGGCCAGAGTGCTGCCAGTCCTCTGCATGTTCTGCTCTTGTGCCCTTCTGAGCCCACAATAAAGGCTGAGCTCTTATCTTGCAAAAGGC (SEQ ID NO: 8). Следует отметить, что в указанной мРНК, уридин представлен тимидином.

Изобретение относится к белковой последовательности: >gi|89191868|ref|NP_000543.2| препропротеин фактора Виллебранда [Homo sapiens].

MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSMYSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNGTVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLLSDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWCERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALCEKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGMEYRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPCVHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFDNRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPGLHNSLVKLKHGAGVAMDGQDVQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQMDWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFGNAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVSPLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCELNCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGDCVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPDAVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGLVVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDMMERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLLGVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANIGPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPAGDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVTCQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAECHKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCAMSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVPEEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKVNCTTQPCPTAKAPTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTNPGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVNSTVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDVCTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACEVVTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCPQLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVCTTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACTIQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKVNERGEYFWEKRVTGCPPFDEHKCLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYCQGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSVVYHEVLNAMECKCSPRKCSK. (SEQ ID NO: 9).

Следует понимать, что все или любой фрагмент (от 5 аминокислот до полной длины) VWF белка можно использовать для получения VWF защитных средств, как описано в настоящей заявке. Мутантные версии или варианты SEQ ID NO: 9 могут также использоваться для разработки VWF защитных средств.

В соответствии с настоящим изобретением, без ограничения какой-либо теорией, VWF защитные средства могут полностью или частично ингибировать деградацию VWF мономера или мультимера путем частичного или полного блокирования способности VWF связываться с тромбоцитами или эритроцитами. Полагают, что VWF аптамеры полностью ингибируют деградацию VWF, когда уровень защиты мономера или мультимеров, по меньшей мере 2 мономеров, составляет по меньшей мере 95%, например на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с уровнем интактного мономера или мультимера при отсутствии VWF защитного средства.

Считается, что VWF аптамеры частично ингибируют деградацию VWF, когда уровень защиты мономера или мультимеров, по меньшей мере 2 мономеров, составляет по меньшей мере 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% или 90% по сравнению с уровнем интактного мономера или мультимеров при отсутствии VWF защитного средства.

В других вариантах осуществления, в которых по меньшей мере один сосуд у пациента частично (по меньшей мере на 50%) окклюдирован или полностью окклюдирован окклюзивными тромбами, VWF защитные средства могут полностью или частично дезагрегировать окклюзирующие тромбы путем частичного или полного блокирования способности VWF связываться с тромбоцитами. Полагают, что VWF аптамеры полностью дезагрегируют окклюзирующие тромбы в случае, когда окклюзирующие тромбы дезагрегированы по меньшей мере на 95%, например, дезагрегированы на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по сравнению с уровнем окклюзирующих тромбов при отсутствии VWF защитного средства.

Считается, что VWF аптамеры частично дезагрегируют окклюзирующие тромбы в случае, когда окклюзирующие тромбы дезагрегированы по меньшей мере на 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% или 90% по сравнению с уровнем окклюзирующих тромбов в отсутствие VWF защитного средства.

VWF защитное средство, которое представляет собой аптамер на основе нуклеиновой кислоты, может содержать константу диссоциации для домена А1 фактора фон Виллебранда человека или его варианта, составляющую меньше 100 мкМ, меньше 1 мкМ, меньше 500 нМ, меньше 100 нМ предпочтительно 50 нМ или меньше, предпочтительно 10 нМ или меньше, предпочтительно 5 нМ или меньше, предпочтительно 1 нМ или меньше и более предпочтительно 500 пМ или меньше.

III. VWF Защитные средства: Терапевтические средства

Аптамеры имеют ряд желаемых характеристик для использования в качестве терапевтических средств, включая высокую специфичность и сродство к молекулярным мишеням, биологическую эффективность и превосходные фармакокинетические свойства. Кроме того, они предлагают определенные конкурентные преимущества по сравнению с другими биологическими препаратами, например:

Скорость и контроль. Аптамеры могут быть получены полностью in vitro. Селекция in vitro позволяет строго контролировать специфичность и сродство аптамера и позволяет создавать варианты как против токсичных, так и против неиммуногенных мишеней. Аптамеры также могут быть получены синтетически или посредством химического синтеза, такого как твердофазный синтез или ферментативный синтез, с использованием полимеразных ферментов, таких как РНК-полимераза Т7.

Токсичность и иммуногенность. Аптамеры, как класс, продемонстрировали незначительную токсичность или иммуногенность или их отсутствие. Такая иммуногенность может также контролироваться путем включения химических модификаций, которые подавляют или уменьшают интенсивность таких иммунных ответов. Такие изменения описаны в международной публикации PCT/US2012/058519, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылок полностью.

Введение. Поскольку все одобренные в настоящее время средства для лечения антител вводят путем внутривенной инфузии (обычно в течение 2-4 часов), аптамеры можно вводить путем подкожной инъекции или другими способами. Биодоступность аптамера при подкожном введении, как было показано, составляет >80% в исследованиях на обезьянах. В некоторых вариантах осуществления, подкожное введение VWF защитных средств пациенту может обеспечить биодоступность по меньшей мере около 50%, около 70%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95% или около 98% или около 99% по сравнению с внутривенным введением.

Масштабируемость и стоимость. Аптамеры химически или ферментативно синтезируются и, соответственно, могут легко быть масштабированы, при необходимости, для удовлетворения производственных потребностей.

Стабильность. Аптамеры могут быть адаптированы для восстановления активности после воздействия тепла, денатурирующих веществ и т.д. и могут храниться в течение длительных периодов времени (>1 года).

Комбинированная терапия. Один из вариантов осуществления изобретения включает композицию VWF защитного средства по изобретению, используемую в комбинации с одним или несколькими другими способами лечения коагуляции, кровотечения или VAD-ассоциированных расстройств. В другом варианте осуществления, композицию VWF защитного средства можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими способами лечения острого коронарного синдрома или острого окклюзивного тромбоза, включая, например, аспирин, тромболитики (то есть тканевой активатор плазминогена, альтеплаза) нитроглицерин, бета-блокаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACE), блокаторы рецепторов ангиотензина (ARB), блокаторы Ca²⁺ каналов, препараты, снижающие уровень холестерина (т.е. тканевой активатор плазминогена (tPA), альтеплаза) и препараты, предотвращающие образование тромбов (т.е., клопидогрел и прасугрел). В другом варианте осуществления, композицию VWF защитного средства можно использовать в комбинации с одной или несколькими другими терапевтическими средствами, используемыми для дезагрегации агрегатов тромбоцитов, такими как, например, тромболитические средства, нацеленные на фибрин, и терапевтическими средствами, которые стремятся нарушить взаимодействие тромбоцитов с фибрином, т.е. ингибиторы pGpIIb/IIIa тромбоцитов, такие как абциксимаб, эптифибатид, тирофибан). В другом варианте осуществления композицию VWF защитного средства можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, используемыми для лечения ишемического инсульта, такими как, например, антикоагулянты, тромболитики (tPA, альтеплаза), антитромбоцитарное средство (например, аспирин, дабигатран, клопидогрель, дипиридамол) и варфарин. Композиция VWF защитного средства по изобретению может содержать, например, более одного аптамера. В некоторых вариантах осуществления композицию VWF защитного средства по изобретению, содержащую один или более аптамеров, вводят в комбинации с другой применяемой композицией или лекарственным средством. В другом варианте осуществления лекарственные формы аптамера используются в комбинации с немедикаментозной терапией или лечением, таким как хирургические процедуры. В целом, подходящие в настоящее время лекарственные формы известных терапевтических агентов и применения немедикаментозной терапии, для использования в таких сочетаниях, будут подходящими.

"Комбинированная терапия" (или "котерапия") включает введение композиции VWF защитного средства по изобретению и по меньшей мере второго агента или лекарственного средства как часть конкретной схемы лечения, предназначенной для обеспечения положительного эффекта от совместного действия этих терапевтических агентов или лекарственных средств. Благоприятный эффект комбинации включает, но ими не ограничивается, фармакокинетическое или фармакодинамическое взаимодействие, возникающее в результате сочетания терапевтического агента или лекарственных средств. Введение этих терапевтических агентов или лекарственных средств в комбинации, обычно, осуществляется в течение определенного периода времени (обычно минуты, часы, дни или недели, в зависимости от выбранного сочетания).

Комбинированная терапия может включать, но обычно не включает введение двух или более указанных терапевтических агентов или лекарственных средств в качестве части отдельных схем монотерапии, которые случайно и произвольно обеспечивают сочетания по настоящему изобретению. Комбинированная терапия включает введения этих терапевтических агентов или лекарственных средств последовательно, то есть когда каждый терапевтический агент или лекарственное средство вводятся в разное время, а также введение этих терапевтических агентов или лекарственных средств или по меньшей мере двух из этих терапевтических агентов или лекарственных средств, по существу, одновременно. Практически одновременное введение может быть осуществлено, например, путем введения пациенту однократной инъекции, содержащей фиксированное количество каждого терапевтического агента, или в виде нескольких однократных инъекций для каждого из терапевтических агентов.

На последовательное или по существу одновременное введение каждого терапевтического агента или лекарственного средства может оказывать влияние любой подходящий способ введения, включая, но ими не ограничиваясь, местные, пероральные, внутривенные, подкожные, внутримышечные способы введения и прямое всасывание через ткани слизистой оболочки. Терапевтические агенты или лекарственные средства можно вводить одним и тем же способом или разными способами. Например, первый терапевтический агент или лекарственное средство выбранного сочетания можно вводить посредством инъекции, тогда как другие терапевтические агенты или лекарственные средства сочетания можно вводить подкожно. Альтернативно, например, все терапевтические агенты или лекарственные средства можно вводить подкожно или все терапевтические агенты или средства можно вводить путем инъекции. Последовательность, в которой вводят терапевтические агенты или лекарственные средства, не является критической, если не указано иное.

Комбинированная терапия также может включать введение терапевтического агента или лекарственых средств, как описано выше, в дополнительном сочетании с другими биологически активными ингредиентами. Когда комбинированная терапия включает немедикаментозное лечение, немедикаментозное лечение может осуществляться в любое подходящее время, пока достигается положительный эффект от совместного действия сочетания терапевтического агента и немедикаментозного лечения. Например, в соответствующих случаях, положительный эффект все еще достигается в случае, когда немедикаментозное лечение временно исключается из введения терапевтического агента, возможно, на несколько дней или даже недель.

Фармакокинетические или фармакодинамические свойства. Для улучшения фармакокинетических или фармакодинамических свойств, таких как период полувыведения и/или продолжительность действия, аптамеры могут быть модифицированы. Используемый в настоящей заявке термин "период полураспада" или "период полужизни в плазме" относится к периоду времени, в течение которого половина введенного количества аптамера выводится из кровотока. "Длительность действия" относится к отрезку времени, в течение которого аптамер является эффективным. Продолжительность действия аптамеров может зависеть от нескольких параметров, таких как период полувыведения из плазмы, введенная доза, фармацевтический препарат и влияние заболевания на выведение из организма лекарственного средства. (Carruthers SG. Duration of drug action. Am Fam Physician. 1980 Feb;21(2):119-26, которая включена в настоящий документ посредством ссылки полностью). Модификация аптамеров, например изменение стеблевой области или присоединение аптамеров к полимерам (например, PEG), может изменить период полураспада и/или продолжительность действия.

В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению могут иметь период полураспада в плазме, составляющий от приблизительно 20 часов до приблизительно 40 часов, от приблизительно 30 часов до приблизительно 50 часов, от приблизительно 40 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 50 часов до приблизительно 70 часов, от приблизительно 55 часов до приблизительно 75 часов, от приблизительно 60 часов до приблизительно 80 часов, от приблизительно 70 часов до приблизительно 85 часов, от приблизительно 75 часов до приблизительно 90 часов, от приблизительно 85 до приблизительно 100 часов или по меньшей мере 100 часов после введения пациенту.

В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению могут иметь продолжительность действия, составляющую по меньшей мере 8 часов по меньшей мере 16 часов по меньшей мере 24 часа по меньшей мере 36 часов по меньшей мере 48 часов по меньшей мере 72 часа, от приблизительно 72 часов до приблизительно 96 часов, от приблизительно 90 часов до 120 часов, от приблизительно 110 часов до приблизительно 135 часов, от приблизительно 120 часов до 150 часов, от приблизительно 135 часов до 168 часов, от приблизительно 150 часов до 180 часов, от приблизительно 180 часов до приблизительно 210 часов, от приблизительно 210 часов до приблизительно 240 часов, от приблизительно 240 часов до 300 часов, от приблизительно 300 часов до 360 часов или по меньшей мере 360 часов.

Антикоагуляция и свертывание. В некоторых вариантах осуществления, аптамеры по настоящему изобретению не функционируют как антикоагулянты и/или изменяют функцию свертывания. Используемый в настоящей заявке термин "антикоагулянт" относится к химическому веществу, которое предотвращает или уменьшает коагуляцию крови, продлевая время свертывания. Коагуляцию крови можно анализировать методами и способами, описанными в настоящей заявке, и методами, известными в данной области техники, такими как анализ активированного парциального тромбопластинового времени (aPTT), анализ времени свертывания крови (PT), определение тромбинового времени, фибриноген-тест, анализы на анти-Ха, метод ротационной тромбеластометрии и тесты генерации тромбина (например, калиброванная автоматизированная тромбограмма).

В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению не увеличивают время свертывания. В некоторых вариантах осуществления, аптамеры по настоящему изобретению не пролонгируют активированное парциальное тромбопластиновое время. В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению не продлевают частичное тромбопластиновое время. В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению не увеличивают тромбиновое время. В некоторых вариантах осуществления аптамеры по настоящему изобретению не изменяют концентрацию фибриногена. В некоторых вариантах осуществления, аптамеры по настоящему изобретению не изменяют синтез тромбина.

IV. Лекарственные формы, дозирование и введение

Фармацевтические композиции и лекарственные формы

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одно VWF защитное средство в качестве активного ингредиента. В некоторых вариантах осуществления композиции являются подходящими для внутреннего применения и включают эффективное количество фармакологически активного соединения по изобретению, отдельно или в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Соединения, в частности, эффективны в том, что обладают очень низкой токсичностью, если таковая присутствует.

Лекарственные формы, которые могут соответствовать фармацевтическим композициям по настоящему изобретению, в частности, композициям на основе нуклеиновых кислот, описаны в международной публикации WO2013/090648 (заявка PCT/US2012/069610), содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Лекарственные формы могут содержать любое количество аптамеров по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли. Используемый в настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солевым формам активного соединения, которые получают с противоионами, которые нетоксичны в условиях применения и совместимы со стабильной композицией. Примеры фармацевтически приемлемых солей аптамеров включают соли натрия, гидрохлориды, сульфаты, фосфаты, ацетаты, фумараты, малеаты и тартраты. Лекарственные формы могут содержать любой аптамер или сочетание аптамеров, которые связываются по всей длине полипептида или его вариантом или фрагментом. Полипептид может быть получен от любого биологического вида, но предпочтительно получен от человека.

Лекарственные формы также содержат фармацевтически приемлемый растворитель. Используемый в настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемый растворитель" означает совместимость с другими ингредиентами композиции и отсутствие вреда для своего реципиента. Фармацевтически приемлемые растворители хорошо известны в данной области техники. Примеры фармацевтически приемлемых растворителей можно найти, например, в последнем издании Goodman and Gillmans, The Pharmacological Basis of Therapeutics, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылок полностью. Предпочтительно фармацевтически приемлемый растворитель выбран из группы, состоящей из 0,9% солевого раствора (также известного как физиологический солевой раствор или стерильный изотонический солевой раствор) или забуференного фосфатом солевого раствора. Наиболее предпочтительно, фармацевтически приемлемый растворитель представляет собой 0,9% физиологический раствор.

Лекарственные формы могут содержать любое количество фармацевтически приемлемого растворителя.

Различные варианты осуществления лекарственных форм могут, необязательно, включать одно или несколько из следующих веществ: буфер, регулятор рН, вещество, регулирующее тоничность, сорастворитель или фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления, лекарственные формы могут дополнительно содержать буфер. Буфером является любое вещество, которое при добавлении в раствор способно нейтрализовать как кислоты, так и основания без заметного изменения кислотности или щелочности раствора. Примеры буферов включают, но ими не ограничиваются, фармацевтически приемлемые соли и кислоты: ацетат, глутамат, цитрат, тартрат, бензоат, лактат, гистидин или другие аминокислоты, глюконат, фосфат, малат, сукцинат, формиат, пропионат и карбонат.

В некоторых вариантах осуществления, лекарственные формы могут дополнительно содержать регулятор рН. Регулятор pH используется для контроля pH композиции. Подходящие регуляторы рН обычно включают по меньшей мере кислоту или ее соль и/или основание или его соль. Кислоты и основания могут добавляться, при необходимости, для достижения желаемого рН. Например, если значение pH больше желаемого, может быть использована кислота для снижения значения pH до желаемого значения. Примеры кислот включают, но ими не ограничиваются, соляную кислоту, фосфорную кислоту, лимонную кислоту, аскорбиновую кислоту, уксусную кислоту, серную кислоту, угольную кислоту и азотную кислоту. В качестве другого примера, если значения pH меньше желаемого, можно использовать основание для доведения значения pH до желаемого значения. Примеры оснований включают, но ими не ограничиваются, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, карбонат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия и гидроксид магния.

В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы могут дополнительно содержать вещество, регулирующее тоничность. Вещество, регулирующее тоничность используется для регулировки осмоляльности лекарственных форм, чтобы приблизить их к осмотическому давлению жидкостей организма, таких как кровь или плазма. Примеры вещества, регулирующего тоничность, включают, но ими не ограничиваются, безводные или водные формы хлорида натрия, декстрозы, сахарозы, ксилита, фруктозы, глицерина, сорбита, маннита, хлорида калия, маннозы, хлорида кальция, хлорида магния и других неорганических солей.

В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы могут дополнительно содержать сорастворитель. Сорастворитель представляет собой растворитель, который добавляется к водной композиции в количестве, меньшем, чем количество воды, и способствует растворению аптамера. Примеры сорастворителей включают, но ими не ограничиваются, гликоли, этанол и многоатомные спирты.

В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к совместимости с другими ингредиентами композиции и отсутствию вреда для своего реципиента. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники. Примеры фармацевтически приемлемых носителей можно найти, например, в последнем издании Goodman and Gillmans, The Pharmacological Basis of Therapeutics.

Описанные в настоящей заявке лекарственные формы являются стабильными. Термин "стабильный", используемый в настоящей заявке, означает пребывание в форме или состоянии, подходящем для введения пациенту.

Лекарственные формы предпочтительно являются по существу чистыми. Используемый в настоящей заявке термин "по существу чистый" означает, что активный ингредиент (аптамер) является преобладающим присутствующим веществом (то есть в молярном отношении он является более распространенным, чем любые другие отдельные виды в композиции), и предпочтительно по существу очищенная фракция представляет собой композицию, в которой активный ингредиент включает по меньшей мере около 50 процентов (в молярном отношении) всех присутствующих макромолекулярных частиц. Обычно, по существу чистая композиция будет содержать более 80% всех макромолекулярных частиц, присутствующих в композиции, более предпочтительно, более 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно, активный ингредиент очищают до высокой степени гомогенности (загрязняющие вещества не могут быть обнаружены в композиции обычными методами обнаружения), причем композиция состоит по существу из одного макромолекулярного соединения.

Дозирование

Композиции в соответствии с изобретением обычно составляют в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозы. Понятно, однако, что суммарный суточный прием композиций по настоящему изобретению может быть определен лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный терапевтически эффективный, профилактически эффективный или соответствующий визуальный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая расстройство, подлежащее лечению, и тяжесть расстройства; активность конкретного применяемого соединения; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; время введения, способ введения и скорость выведения конкретного используемого соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства, используемые в комбинации или одновременно с конкретным применяемым соединением; и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

В некоторых вариантах осуществления, композиции в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться в дозах, достаточных для доставки от приблизительно 0,0001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,005 мг/кг до приблизительно 0,05 мг/кг, от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 0,005 мг/кг, от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 0,5 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела пациента в сутки, один или более раз в сутки, для получения желаемого терапевтического, диагностического, профилактического или визуального эффекта. Желаемая доза может доставляться три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, через день, каждый третий день, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления желаемая доза может доставляться с использованием нескольких введений (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать или более введений).

В некоторых вариантах осуществления общую дозу аптамеров вводят таким образом, чтобы достичь и затем поддерживать устойчивую концентрацию в крови, равную по меньшей мере значению показателя ЕС₉₀, который представляет собой концентрацию лекарственного средства, обеспечивающую 90% максимальный ответ. Альтернативно, общую дозу аптамеров вводят таким образом, чтобы достичь и затем поддерживать постоянную концентрацию в крови, равную по меньшей мере значению показателя ЕС₈₀, который представляет собой концентрацию лекарственного средства, обеспечивающую 80% максимальный ответ. которая представляет собой концентрацию лекарственного средства, которая приводит к максимальному ответу на 80%.

Суммарная доза может вводиться в виде одной дозы, нескольких доз, повторных доз, в виде непрерывной дозы или их комбинации.

В одном случае лекарственные формы вводят в насыщающей дозе, поддерживающей дозе и постепенно снижающейся дозе.

Режим дозирования с использованием соединений выбирают в соответствии с различными факторами, включая тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть состояния, подлежащего лечению; способ введения; почечная и печеночная функция пациента; и конкретное используемое соединение или его соль. Рядовой врач или ветеринар может легко определить и назначить эффективное количество лекарственного средства, необходимое для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования состояния.

Дозы для перорального введения по настоящему изобретению, когда они используются для получения указанных эффектов, будут находиться в интервале приблизительно от 0,05 до 1000 мг/день перорально. Композиции предпочтительно представлены в форме таблеток с насечкой, содержащих 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 и 1000,0 мг активного ингредиента. Эффективные уровни соединений по настоящему изобретению в плазме варьируют от 0,002 до 50 мг на кг массы тела в сутки.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в однократной суточной дозе, или суммарную суточную дозу можно вводить в разделенных дозах два, три или четыре раза в сутки.

Описанные в настоящей заявке лекарственные формы и дозировки предназначены для максимизации клинической эффективности лечения VAD-опосредованных заболеваний и нарушений, возникающих в результате взаимодействия мультимеров VWF с эритроцитами, таких как взаимодействие, которое происходит между мультимерами VWF и эритроцитами при серповидно-клеточной анемия, а также лечение заболеваний и расстройств, возникающих в результате взаимодействия мономеров или мультимеров VWF с тромбоцитами во время окклюзивного тромбоза, возникающего при закрытии просвета сосуда и/или при очень высоких скоростях сдвига (10000 с-¹ или выше) (например расстройства относящиеся к острым коронарным синдромам, острый окклюзионный тромбоз и ишемический инсульт), при одновременном уменьшении или минимизации побочных эффектов, без необходимости применения антидота.

Введение

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, может быть объединена в составе лекарственной формы, описанной в настоящей заявке, такой как местная, интраназальная, интратрахеальная или инъецируемая (например, внутривенная, внутриглазная, интравитреальная, внутримышечная, интракардиальная, внутрибрюшинная, подкожная).

Лекарственные формы аптамера, представленные в настоящей заявке, вводят пациентам, предпочтительно человеку, в количестве, эффективном для предотвращения, уменьшения или лечения тромботических расстройств, таких как ишемический инсульт, заболевания или расстройства, связанные с желудочковыми вспомогательными устройствами, и расстройства, возникающие в результате взаимодействий мультимеров VWF с эритроцитами, например взаимодействие, которое происходит между мультимерами VWF и эритроцитами при серповидно-клеточной анемии.

Для перорального введения в форме таблетки или капсулы (например, желатиновой капсулы), активный лекарственный компонент может быть скомбинирован с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и тому подобное. Кроме того, при желании или необходимости, подходящие связующие, смазывающие вещества, разрыхлители и красители также могут быть включены в смесь. Подходящие связующие вещества включают крахмал, алюмосиликат магния, крахмальную пасту, желатин, метилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, натуральные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, кукурузные подсластители, натуральные и синтетические смолы, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, воски и тому подобное. Смазывающие вещества, используемые в этих лекарственных формах, включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, диоксид кремния, тальк, стеариновую кислоту, ее магниевую или кальциевую соль, и/или полиэтиленгликоль и тому подобное. Дезинтеграторы включают, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановые крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, или шипучие смеси и тому подобное. Разбавители включают, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин.

Соединения по изобретению также можно вводить в таких пероральных лекарственных формах, как таблетки или капсулы с замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, настойки, суспензии, сиропы и эмульсии.

Инъецируемые композиции предпочтительно представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории предпочтительно получают из жирных эмульсий или суспензий. Композиции могут быть стерилизованными и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, промоторы растворов, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически необходимые вещества. Композиции получают в соответствии с традиционными методами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно и содержат приблизительно от 0,1 до 75%, предпочтительно приблизительно от 1 до 50% активного ингредиента.

Жидкие, в частности, инъецируемые композиции, могут, например, быть получены растворением, диспергированием и т.д. Активное соединение растворяют или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким как, например, вода, физиологический раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, получая, таким образом, инъецируемый раствор или суспензию. Кроме того, могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения в жидкости перед инъекцией. Инъецируемые композиции предпочтительно представляют собой водные изотонические растворы или суспензии. Композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие вещества, промоторы раствора, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически необходимые вещества.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить во внутривенной (как болюсной, так и инфузионной), внутрибрюшинной, подкожной или внутримышечной форме, причем все используемые формы хорошо известны специалистам в области фармацевтики. Инъецируемые препараты могут быть получены в обычных формах, в виде жидких растворов или суспензий. В частности, вещества по настоящему изобретению можно доставлять в глазную полость способами, описанными ниже. Кроме того, вещества по настоящему изобретению можно вводить пациентам способами, хорошо известными в данной области, как описано ниже.

Парентеральное инъекционное введение обычно используется для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Кроме того, один из способов парентерального введения предусматривает имплантацию систем с медленным или пролонгированным высвобождением, которая поддерживает постоянный уровень дозы, в соответствии с патентом США №3710795, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

Кроме того, предпочтительные соединения по настоящему изобретению можно вводить в интраназальной форме посредством местного применения подходящих интраназальных носителей или трансдермальными способами, с использованием форм трансдермальных кожных пластырей, хорошо известных специалистам в данной области техники. Для введения в форме системы трансдермальной доставки, введение дозы, безусловно, будет непрерывным, а не прерывистым, в течение всего режима дозирования. Другие предпочтительные средства для местного применения включают кремы, мази, лосьоны, аэрозольные спреи и гели, где концентрация активного ингредиента будет составлять от 0,1 до 15% масса/масса или масса/объем.

Для твердых композиций, вспомогательные вещества могут включать фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, карбоната магния и тому подобное. Активное соединение, определенное выше, также может быть объединено в составе лекарственной формы - суппозиториев - с использованием, например, полиалкиленгликолей, например, пропиленгликоля, в качестве носителя. В некоторых вариантах осуществления, суппозитории предпочтительно получают из жировых эмульсий или суспензий.

Соединения по настоящему изобретению также можно вводить в форме систем доставки липосом, таких как маленькие однослойные везикулы, крупные однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть образованы из множества фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.

Соединения по настоящему изобретению также могут быть связаны с растворимыми полимерами в качестве носителей лекарственных средств для направленной доставки. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, пирановый сополимер, полигидроксипропилметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут быть связаны с классом биоразлагаемых полимеров, используемых для достижения контролируемого высвобождения лекарственного средства, например, полимолочной кислоты, полиэпсилон-капролактона, полигидрокси-масляной кислоты, полиортоэфиров, полиацеталей, полидигидропиранов, полицианоакрилатов и поперечно-сшитых или амфипатических блок-сополимеров гидрогелей.

При необходимости, фармацевтическая композиция для введения может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные агенты и другие вещества, такие как, например, ацетат натрия, триэтаноламинолеат и т.д.

Лекарственные формы могут вводиться в комбинации с другими препаратами или лекарственными средствами.

Биодоступность

Используемый в настоящей заявке термин "биодоступность" относится к системной доступности данного количества VWF защитного средства, вводимого пациенту. Биодоступность может быть оценена путем измерения площади под кривой (AUC) или максимальной концентрации в сыворотке или плазме (C_max) неизмененной формы соединения после введения соединения пациенту. AUC соответствует площади под кривой, изображающей концентрацию соединения в сыворотке или плазме, отложенной по оси ординат (ось Y), в зависимости от времени, отложенного по оси абсцисс (ось X). Обычно, значение AUC для конкретного соединения может быть вычислено с использованием методов, известных специалистам в данной области техники и описанных в G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Значение C_max представляет собой максимальную концентрацию соединения, достигаемую в сыворотке или плазме пациента после введения соединения пациенту. Значение C_max для конкретного соединения может быть измерено с использованием способов, известных специалистам в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления, VWF защитные средства по настоящему изобретению объединены в композиции со средством доставки/вспомогательным веществом или носителем, как описано в настоящем окументе, для повышения биодоступности. Используемые в настоящей заявке фразы "повышение биодоступности" или "улучшение фармакокинетики" означают, что системная доступность VWF защитного средства, измеряемая с использованием показателей AUC, C_max или C_min, выше у пациента при совместном введении со средством доставки, описанным в настоящей заявке, чем когда такое совместное введение не применяется. В некоторых вариантах осуществления, биодоступность VWF защитного средства может повышаться по меньшей мере приблизительно на 2%, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 55%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 65%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% или приблизительно на 100%.

V. Наборы, устройства и упаковка

Наборы и устройства

Соединения и композиции VWF защитного средства по настоящему изобретению могут быть скомбинированы с другими ингредиентами или реагентами, или получены в качестве компонентов наборов или других розничных продуктов для коммерческой продажи или распространения.

Набор содержит соединение или композицию вместе с инструкциями относительно введения и/или применения набора. Набор также может содержать один или более из следующих элементов: шприц, пакет или сосуд для внутривенного вливания, аналогичное лекарственное средство в другой лекарственной форме или другое лекарственное средство. Например, набор может содержать как внутривенный препарат, так и подкожный препарат по настоящему изобретению. Альтернативно, набор может содержать лиофилизированный антитромбиновый аптамер и пакет для внутривенного вливания с раствором. Форма набора является в частности предпочтительной, когда отдельные компоненты должны вводиться в разных лекарственных формах (то есть парентерально и перорально) или вводиться с разными интервалами между введением лекарственного средства.

Предпочтительно, наборы хранят при 5 ± 3°С. Наборы также можно хранить при комнатной температуре или замораживать при температуре -20°C.

Композиции по настоящему изобретению, которые представляют собой VWF защитные средства, могут использоваться в комбинации с одним или несколькими терапевтическими устройствами. Такие устройства включают аппарат вспомогательного кровообращения (VAD), стенты или любое устройство, применяемое для регулирования или управления гемодинамическим током, например, связанным с кровотоком в тканях или органах. VWF защитные средства могут использоваться в качестве покрытий на твердых поверхностях или в качестве лекарственного средства, когда фармацевтические композиции добавляются в твердой или жидкой форме до, во время или после применения устройства, используемого для регулирования или управления гемодинамическим током. Например, аптамеры VWF могут быть получены для добавления в кровоток или поток плазмы во время хирургических процедур, таких как трансплантация, ангиопластика и установка стента, или во время длительного ухода, например, за пациентами, у которых имплантированы внутренние устройства VAD или LVAD.

Упаковка

Лекарственные формы и/или композиции VWF защитных средств по настоящему изобретению могут быть упакованы для применения в различных фармацевтически приемлемых контейнерах с использованием любой фармацевтически приемлемой укупорки контейнера, поскольку лекарственные формы совместимы с контейнерами, содержащими ПВХ и не содержащими ПВХ, и укупорками контейнеров. Примеры фармацевтически приемлемых контейнеров включают, но ими не ограничиваются, ампулы, предварительно заполненные шприцы, пакет для внутривенного вливания, бутыли для внутривенного вливания и пакеты для смешивания. Например, лекарственная форма может представлять собой водную композицию, содержащую как антитромбиновый аптамер, так и фармацевтически приемлемый растворитель.

В качестве альтернативы, лекарственная форма может содержать лиофилизированный аптамер в одном из отделений пакета для смешивания и фармацевтически приемлемый растворитель в отдельном отделении пакета для смешивания, так что эти два отделения могут смешиваться вместе перед введением пациенту. Фармацевтически приемлемые контейнеры хорошо известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Предпочтительно, лекарственные формы хранят в стеклянном флаконе типа 1 с бутилкаучуковой пробкой. Лекарственные формы в жидком виде должны храниться в охлажденной среде. Предпочтительно, жидкие лекарственные формы хранят при 2-8°С. Альтернативно, лиофилизированные лекарственные формы могут храниться при комнатной температуре, либо быть охлажденными или заморенными.

Предпочтительно, лекарственные формы являются стерильными. "Стерильная" композиция, как используется в данном документе, означает лекарственную форму, которая была доведена до состояния стерильности и которая впоследствии не подвергалась микробиологическому загрязнению, то есть целостность контейнера, содержащего стерильную композицию, не нарушалась. Производители фармацевтической продукции производят стерильные композиции, обычно, в соответствии с Текущими правилами организации производства и контроля качества лекарственных средств ("cGMP") Управления США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов

Процедуры заполнения фармацевтических лекарственных форм в фармацевтически приемлемые контейнеры и их последующая обработка известны в данной области техники. Эти процедуры могут быть использованы для производства стерильных фармацевтических лекарственных препаратов, обычно необходимых в сфере здравоохранения. См., например, Center for Drug Evaluation and Research (CDER) and Center for Veterinary Medicine (CVM), "Guidance for Industry for the Submission Documentation for Sterilization Process Validation in Applications for Human and Veterinary Drug Products" (November 1994). Примеры подходящих способов получения стерильных фармацевтических лекарственных препаратов включают, но ими не ограничиваются, конечную стерилизацию паром, окисью этилена, излучением (то есть гамма излучение и поток электронов) и методы асептической обработки. Любая из этих процедур стерилизации может быть использована для получения стерильных фармацевтических лекарственных форм, описанных в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления стерильные фармацевтические лекарственные формы могут быть получены с применением методов асептической обработки. Стерильность поддерживается с использованием стерильных материалов и контролируемых условий обработки. Все контейнеры и устройства, перед заполнением, стерилизуются, предпочтительно путем тепловой стерилизации. Затем контейнер заполняется в асептических условиях, таких как пропускание композиции через фильтр и заполнение форм. Соответственно, лекарственные формы могут быть стерильно заполнены в контейнер с целью избежать теплового напряжения и конечной стерилизации.

В некоторых вариантах осуществления лекарственные формы окончательно стерилизуются с использованием пара. Терминальная стерилизация может быть использована для уничтожения всех жизнеспособных микроорганизмов в конечном герметически закрытом контейнере, содержащем фармацевтическую композицию. Автоклав обычно используется для окончательной термической стерилизации лекарственных препаратов в их конечной упаковке. Типичные циклы автоклавной обработки в фармацевтической промышленности для достижения терминальной стерилизации конечного продукта соответствуют 121°С в течение по меньшей мере 10 минут.

Эквиваленты и область применения

Специалисты в данной области техники определят или смогут установить, используя только обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления в соответствии с изобретением, описанным в настоящей заявке. Объем настоящего изобретения не ограничивается вышеприведенным описанием, но определяется прилагаемой формулой изобретения.

В пунктах формулы изобретения формы существительного в единственном числе включают формы множественного числа, если иное не указано или иное не следует из контекста. В пунктах формулы изобретения или описании, которые включают "или" между одним или несколькими членами группы, рассматриваются как удовлетворительные, если один член, более одного члена или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу, если иное не указано или иное не следует из контекста. Изобретение включает варианты осуществления, в которых только один член группы присутствует, занят или иным образом относится к данному продукту или процессу. Изобретение включает варианты осуществления, в которых более одного члена или все члены группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу.

Также следует отметить, что термин "содержащий" предполагает возможность расширения и допускает, но не требует, включение дополнительных элементов или стадий. При использовании термина "содержащий" в настоящей заявке, термин "состоящий из", таким образом, также охватывается и раскрывается.

В случае, когда приведены диапазоны, то включены предельные значения. Кроме того, следует понимать, что, если иное не указано или иное не следует из контекста и понимания специалиста в данной области техники, значения, которые выражены в виде диапазонов, могут принимать любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов в различных вариантах осуществления изобретения с точностью до десятой доли нижнего предела диапазона, если в контексте явно не указано иное.

В случае, когда используется термин "приблизительно", подразумевается, что он соответствует ±10% от приведенного значения.

Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который относится к предшествующему уровню техники, может быть явным образом исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными для специалиста в данной области техники, они могут быть исключены, даже если это исключение явным образом не описано в настоящей заявке. Любой конкретный вариант осуществления композиций по изобретению (например, любая нуклеиновая кислота; любой способ получения; любой способ применения и т.д.) может быть исключен из любого одного или нескольких пунктов формулы изобретения по любой причине, независимо от того, связан он или нет с существованием предшествующего уровня техники.

Все цитируемые источники, например, ссылки, публикации, базы данных, записи базы данных и статьи, цитируемые в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки, даже если это прямо не указано в цитировании. В случае противоречивых утверждений из цитируемого источника и настоящей заявки, утверждение в настоящей заявке имеет преимущественную силу.

Заголовки разделов и таблиц не являются ограничивающими.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение аптамеров на основе нуклеиновых кислот

Аптамеры нуклеиновой кислоты синтезировали с помощью ÄKTA Oligopilot (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), используя стандартную твердофазную химию с фосфорамидитом. Фосфорамидиты, приобретенные у компании Hongene Biotechnology Limited, Shanghai, P.R. China. BT-100 (SEQ ID NO: 2), синтезировали с использованием свободной аминогруппы, присоединенной к 5'-концу через шестиуглеродный линкер.

Для получения BT-200 (SEQ ID NO: 3), BT-100 сначала очищали с помощью анионообмена и ультрафильтрации, а затем растворяли в 100 мМ буфере бикарбоната натрия (pH 8,0) при концентрации 10 мг/мл. Далее очищенный BT-100 смешивали с NHS активированным разветвленным 40K-PEG (каталожный номер Y-NHS-40K, JenKem Technology USA Inc, Plano, TX) при молярном соотношении BT-100 и NHS активированного разветвленного 40K-PEG - 1:2. Реакция протекала в течение ночи при комнатной температуре. Затем полученный продукт очищали с помощью анионообмена и ультрафильтрации с удалением неконъюгированных 40К-PEG и ВТ-100, и получали ВТ-200.

ARC15105 (пегилированный) (SEQ ID NO: 6) получали способом, описанным ранее в Siller-Matula JM, Merhi Y, Tanguay JF et al. ARC15105 Is a Potent Antagonist of Von Willebrand Factor Mediated Platelet Activation and Adhesion. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2012; 32(4):902-909, содержание которых включено в настоящи документ посредством ссылки полностью.

Было спрогнозировано, что синтезированный BT-100 или BT-200 естественным образом образуют структуры типа "стебель - петля" (как показано на фиг. 1) при растворении в водном основном буферном растворе. Это было подтверждено несколькими вторичными моделями структурного прогнозирования, такими как Mfold.

Пример 2. Анализ контура аппарата вспомогательного кровообращения (VAD): мультимеры VWF

У людей-добровольцев отбирали кровь, которую разделяли на две аликвоты, чтобы два экстракорпоральных контура могли проходить параллельно, что позволило бы проводить, помимо межсубъектных сравнений, внутрисубъектное сравнение.

Экстракорпоральные контуры in vitro создавали с использованием левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (HEARTWARE®) и силиконовых трубок с входами и выходами для крови. Скоростью насоса варьировали от 1800 до 3500 циклов в минуту (об/мин), а объем циркулирующей крови доводили до приблизительно 5 литров в минуту, чтобы соответствовать нормальным физиологическим параметрам человека. Антикоагулированную кровь оставляли циркулировать в течение 1-4 часа в экстракорпоральных контурах.

Параллельные контуры LVAD работали в течение 2 часов, и использовали минимум два образца из каждого контура (базовый уровень, затем через 2 ч). Контуры работали при 37°С. Данные приведены на фиг. 3.

Мультимеры фактора фон Виллебранда анализировали способом, описанным ранее (Jilma-Stohlawetz P, et al., The anti-von Willebrand factor aptamer ARC1779 increases von Willebrand factor levels and platelet counts in patients with type 2B von Willebrand disease. Thromb Haemost. 2012 Aug;108(2):284-90, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Количественное определение мультимеров VWF проводили посредством электрофореза в двухслойном геле с натрия додецилсульфатом-агарозой (1,2%) с последующим вестерн-блоттингом и последующим количественным анализом с помощью люминесцентного анализатора изображений. (LAS-3000, Raytest GmbH, Berlin, Germany) (Reiter RA, et al., Changes in ADAMTS13 (von-Willebrand-factor-cleaving protease) activity after induced release of von Willebrand factor during acute systemic inflammation. Thromb Haemost. 2005 Mar;93(3):554-8, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Окончательный анализ проводили с использованием программного обеспечения AIDA Image Analyzer версии 4.11.

На фигуре, треки 1 и 10 соответствуют нормальной плазме (George King Bio-Medical Inc.).

Анализ плотности гелей показал, что снижение на 6 мер соответствует снижению с 24,9 единиц до 5,3 или 3,3 единиц, или 87% в целом.

При прямом сравнении BT-100 (непегилированный) и ARC15105 (пегилированная молекула), плотность геля снизилась с 23 до 5 (на 78%; сравните треки 9 и 8) при ARC15105 (пегилированный) по сравнению с исходным уровнем, и от 12,6 до 11,5 (на 8%; сравните треки 7 и 6) с BT-100, что указывает на то, что BT-100 способен сохранить 92% высокомолекулярной мультимерной структуры.

У второго добровольца плотность на геле снизилась с 10,0 до 3,6 (на 64%; сравните треки 5 и 4) с ARC15105 (пегилированным) по сравнению с контрольной группой, и с 13,8 до 10,8 (на 22%; сравните треки 3 и 2) с BT-100. Из этих данных ясно, что BT-100 способен подавлять сокращение HMW (высокомолекулярных) VWF соединений.

Краткие выводы

Экстракорпоральные контуры ex vivo доказали концепцию потенциальной терапевтической роли BT-100 у пациентов с левожелудочковым аппаратом вспомогательного кровообращения (LVAD) и синдромами дефицита VWF. Циркуляция крови в экстракорпоральных контурах вызывает быстрое снижение VWF:RCo и сокращение высокомолекулярных мультимеров VWF, аналогично патофизиологическим событиям, которые происходят при имплантации LVAD человеку.

В гелях зрительно наблюдали до 14-15 мер, которые сокращались вследствие высокого напряжения сдвига максимум на 6-7-8 мер. Это сокращение высокомолекулярных мультимеров значительно затруднялось BT-100, тогда как эквимолярные концентрации ARC15105 не снижали максимальное сокращение мультимеров.

Пример 3. Ристоцетин-кофакторный анализ фактора Виллебранда [vWF:RCo]

Ристоцетин-кофакторный анализ для оценки фактора Виллебранда [vWF:RCo] измеряет способность плазмы пациента агглютинировать тромбоциты в присутствии антибиотика -ристоцетина. Скорость агглютинации, вызванной ристоцетином, связана с концентрацией и функциональной активностью фактора Виллебранда в плазме.

Активность ристоцетинового кофактора VWF в плазме (VWF:RCo; основной конечный показатель) анализировали при 37°С с помощью турбидиметрии.

Плазму предварительно инкубировали с BT-100 или ARC15105 (пегилированный) при 37°C приблизительно за 10 минут до добавления активирующего реагента, ристоцетина. Осуществляли анализ. (BC von Willebrand reagent; Dade Behring/Siemens, Marburg, Germany) (Reiter RA, et al., Desmopressin antagonizes the in vitro platelet dysfunction induced by GPIIb/IIIa inhibitors and aspirin. Blood 2003; 102: 4594-4599, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Во втором эксперименте, агрегацию цельной крови определяли с помощью многоэлектродной агрегометрии (MEA) на агрегаторе импеданса нового поколения. (Multiplate Analyzer; Dynabyte) (Derhaschnig U, Jilma B. Assessment of platelets and the endothelium in patients presenting with acute coronary syndromes--is there a future? Thromb Haemost 2009; 102: 1144-1148, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Система обнаруживает изменение электрического импеданса вследствие адгезии и агрегации тромбоцитов на двух независимых электродных поверхностях в испытательной кювете. Площадь под кривой агрегации (AUC) выражает реакцию агрегации за измеренное время (AU × мин), что может спрогнозировать неблагоприятный исход для пациентов и даже кровотечение (Sibbing D, et al., Antiplatelet effects of clopidogrel and bleeding in patients undergoing coronary stent placement. J Thromb Haemost 2010; 8: 250-256; и Siller-Matula JM et al., Cross validation of the Multiple Electrode Aggregometry. A prospective trial in healthy volunteers. Thromb Haemost 2009; 102: 397-403, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Доступен ряд специфических тестовых реагентов Multiplate (ASPItest, COLtest, TRAPtest, ADPtest, RISTOtest), которые позволяют определять роль различных рецепторов/путей передачи сигнала (арахидоновая кислота [AA], рецептор тромбина, рецептор ADP, рецептор коллагена, гликопротеин Ib-IX) в активации тромбоцитов.

Цельную кровь антикоагулировали гирудином (200 ед/мл, Dynabyte) в соответствии с рекомендациями производителя и хранили при комнатной температуре (22°С) в течение 30 минут (мин). Затем смеси 1:2 0,9% NaCl и гирудин-антикоагулированная кровь перемешивали при 37°С в течение 3 минут в аналитических кюветах. Цельную кровь предварительно инкубировали с BT-100 или ARC15105 (пегилированный) при 37°С приблизительно за 10 минут до добавления активирующего реагента, ристоцетина. После этого, для построения кривых концентрация-эффект, к отдельным образцам добавляли ристоцетин (0,77 мг/мл). Увеличение электрического сопротивления регистрировали непрерывно в течение 6 мин. Средние значения двух независимых определений выражали в виде AUC трассировки агрегации. Аппарат MEA позволяет представить AUC двумя способами: в виде условных единиц агрегации (AU × мин) или в виде единиц (U). Десять AU × мин соответствуют 1 U. AUC измеряли в U, следуя существующей рекомендации производителя и многим недавним исследованиям, и выражали агрегацию тромбоцитов в виде относительного увеличения или уменьшения по сравнению с исходными значениями. Данные приведены в таблицах 1 и 2.

Данные показывают, что оба аптамера (BT-100 и ARC15105 (пегилированный)) ингибировали активность ристоцетинового кофактора фактора фон Виллебранда. В эквимолярных концентрациях BT-100 проявлял большую активность ингибирования VWF:RCo как в варианте до, так и после блокады артерий.

Таблица 1: Анализ Multiplate

Обработка A B C D Multiplate RISTO
исходный уровень RISTO
BT-100 25 нМ RISTO
BT-100 100 нМ RISTO
ARC15105 25 нМ RISTO
ARC15105
100 нМ Образец № 1 до блокирования артерий
AUC (площадь под кривой) 87 5 2 56 56 Образец № 1 после блокирования артерий
AUC (площадь под кривой) 105 20 4 56 50

Таблица 2: Сравнение доз

Пациент 1 Пациент 2 Пациент 3 BT-100 ARC15105 BT-100 ARC15105 BT-100 ARC15105 Исходный уровень 87 87 88 88 107 107 25 нМ ND ND ND ND 14 115 50 нМ 5 56 4 83 8 101 100 нМ 2 50 5 69 4 94 200 нМ ND ND 2 61 ND ND

* данные представляют площадь под кривой агрегации.

При индуцированной ристоцетином агрегации тромбоцитов в цельной крови, концентрации BT-100 в 25-50 нМ вызывали 90% ингибирование, при этом для достижения 90% ингибирования (p<0,05) были необходимы в 16 раз более высокие концентрации ARC15105 (пегилированный). Неожиданно, эти данные демонстрируют, что BT-100 более эффективен, чем ARC15105.

Сравнения между BT-100 и ARC15105 показывают, что BT-100 более чем в 25 раз более эффективен, с общим средним значением в 10 раз (сравните колонки обработки A - C и B - D).

Пример 4. Анализатор функции тромбоцитов (PFA-100)

Анализатор PFA-100 (Dade Behring, Marburg, Germany) использовался для измерения функции тромбоцитов при высоких скоростях сдвига (5000-6000 с-¹). Образцы крови объемом 4,5 мл собирали в пробирки для сбора крови, содержащие 3,8% цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат натрия=9:1). PFA-100 определяет время, необходимое для окклюзии просвета тромбоцитарными пробками, которое определяется как время свертывания (CT). Аппарат аспирирует образец крови в постоянном вакууме из резервуара для образца через капилляр и микроскопическое отверстие (147 мкм) в мембране, что приводит к образованию тромбоцитарной пробки, индуцированному большим усилием сдвига (Jilma et al., 2001). Мембрана покрыта коллаген/аденозиндифосфатом (CADP), которые очень чувствительны к уровням фактора Виллебранда. Это относится к дефициту VWF, их блокированию анти-VWF аптамерами, а также к выводу VWF, например, посрелством десмопрессина или эндотоксина (Jilma B. Platelet function analyzer (PFA-100): a tool to quantify congenital or acquired platelet dysfunction. J Lab Clin Med 2001; 138: 152-163; Jilma-Stohlawetz et al. 2012; Reiter et al. 2003; Homoncik M, Blann AD, Hollenstein U, Pernerstorfer T, Eichler HG, Jilma B. Systemic inflammation increases shear stress-induced platelet plug formation measured by the PFA-100. Br J Haematol. 2000 Dec;111(4):1250-2; and Homoncik M, Jilma B, Hergovich N, Stohlawetz P, Panzer S, Speiser W. Monitoring of aspirin (ASA) pharmacodynamics with the platelet function analyzer PFA-100. Thromb Haemost. 2000 Feb;83(2):316-21, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Поскольку существует хорошая корреляция между уровнями VWF и измерениями посредством PFA-100, анализ является прогностическим для будущих тромбоэмболических случаев у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Frossard M, Fuchs I, Leitner JM, et al. Platelet function predicts myocardial damage in patients with acute myocardial infarction. Circulation 2004; 110: 1392-1397; Fuchs I, Frossard M, Spiel A, et al. Platelet function in patients with acute coronary syndrome (ACS) predicts recurrent ACS. J Thromb Haemost 2006; 4: 2547-2552, содержание которых полностью включено посредством ссылки полностью).

В этом эксперименте, образцы крови предварительно инкубировали при 37°С в течение 10 минут с повышающимися концентрациями (в диапазоне 1-400 нМ) ARC15105 (пегилированный) или BT-100. Оба анти-VWF аптамера, в зависимости от концентрации, увеличивали индуцированное коллагеном аденозиндифосфатом время закрытия в PFA-100, но значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) были в 3-8 раз выше для ARC15105 (пегилированного) по сравнению с BT-100 (p<0,05). Аналогично, значения IC₁₀₀ были в 2-16 раз выше для ARC15105 (пегилированный) по сравнению с BT-100 (р<0,05). Данные приведены в таблицах 3-6.

В этих экспериментах однозначно установлена более высокую эффективность ВТ-100 над ARC15105 (пегилированным) при эквимолярных концентрациях.

Таблица 3. PFA результаты

PFA 100 0 нМ 5 нМ 10 нМ 25 нМ 50 нМ 100 нМ BT-100 139 135 205 301 301 301 ARC15105 139 94 99 104 128 162

Таблица 4. PFA результаты

Эксперимент A Доза BT-100 ARC15105 нативный 0 нМ 128 2 нМ 184 ND 5 нМ 156 ND 10 нМ 123 129 15 нМ 277 ND 20 нМ 301 152 25 нМ 301 ND 50 нМ ND 204

Таблица 5. PFA результаты

Эксперимент B Доза BT-100 ARC15105 нативный 0 нМ 112 1 нМ 91 88 2.5 нМ 97 103 5 нМ ND ND 10 нМ 117 96 15 нМ 226 118 20 нМ 301 100 25 нМ 276 112 50 нМ 301 301 100 нМ 208 236

Таблица 6. PFA результаты

Эксперимент C Доза BT-100 ARC15105 нативный 0 нМ 90 1 нМ 95 82 5 нМ 111 ND 10 нМ 169 83 15 нМ 183 91 20 нМ 284 96 25 нМ 301 109 50 нМ 301 161 75 нМ ND 223 100 нМ ND 301

В таблицах время закрытия (в секундах) указано для каждой процедуры. Количественно определяли агрегацию путем измерения времени закрытия просвета с максимальным временем окклюзии 300 секунд. "Нативный" относится к нормальным донорским образцам, которые не были обработаны, что устанавливает "нормальный" контрольный уровень результата исследования; "ND" означает "не исследованный".

Пример 5. Нарушение связывания GpIb и фактора Виллебранда

Полностью автоматизированный анализ связывания GpIb и VWF INNOVANCE® (VWF:Ac; Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany) измеряет активность фактора фон Виллебранда в образце плазмы пациента на основе связывания VWF с рекомбинантным GpIb. В отличие от анализа vWF:RCO, описанного в примере 3, анализ VWF:Ac не требует использования ристоцетина, поскольку рекомбинантный GpIb имеет две мутации с приобретением функции. Увеличение экстинкции по турбидиметрическим измерениям связано с увеличением связывания и агглютинации VWF. Lawrie AS, et al., A comparative evaluation of a new automated assay for von Willebrand factor activity. Haemophilia 2013 Mar;19(2):338-342; de Maistre E, et al., Performance of two new automated assays for measuring von Willebrand activity: HemosIL AcuStar and Innovance. Throm Haemost. 2014(4), содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Образцы крови отбирали у людей-добровольцев. Образцы предварительно инкубировали при 37°C в течение 30 минут с повышением концентрации BT-100 или ARC15105.

VWF:Ac измеряли с использованием набора INNOVANCE® VWF Activity на анализаторе Sysmex CS2000i (Sysmex UK Ltd) в соответствии с инструкциями производителя.

Оба аптамера были способны снижать активность связывания VWF и GpIb при высоких концентрациях, но BT-100 продемонстрировал повышенную эффективность по сравнению с AC15105, как показано в таблице 7.

Таблица 7. Активность связывания, выраженная в процентах (%)

Доза BT-100 ARC15105 8 нМ 100 100 10 нМ 100 100 30 нМ 92 100 80 нМ 81 98 100 нМ 63 95 300 нМ 40 90 800 нМ 20 85

Пример 6. Блокирование взаимодействия тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов с фактором Виллебранда

В этом примере, VWF аптамер исследуют на способность блокировать взаимодействие тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов с цепями фактора фон Виллебранда (VWF), которые секретируются активированными эндотелиальными клетками. В эксперименте используются человеческие компоненты недавно описанной микрососудистой системы in vitro (In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 9342-9347, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки), которая демонстрирует образование очень длинных толстых VWF цепей и нитей из активированных эндотелиальных клеток. Эти VWF цепи способны связывать тромбоциты и другие клетки крови в зависимости от приложенных сдвиговых напряжений. Эксперимент предоставляет модель микрососудистой окклюзии при тромботических микроангиопатиях, таких как тромбоцитопеническая тромбогемолитическая пурпура и серповидно-клеточная анемия, и анализирует способность анти-VWF аптамера противодействовать этим процессам.

Пример 7. Предупреждение желудочно-кишечного кровотечения, вызванного ангиодисплазией

В этом эксперименте VWF аптамер исследуется в моделях in vitro и in vivo на способность предотвращать или ингибировать усиление ангиогенеза, которое вызывает ангиодисплазию и приводит к кровотечению в желудочно-кишечном тракте.

VWF аптамер контактирует с эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) и оценивается его способность ингибировать ангиогенез. Делаются оценки формирования сосудистой сети, миграции клеток, пролиферации и адгезии клеток. Методы этих оценок представлены, например, в Starke RD, et al., Endothelial von Willebrand factor regulates angiogenesis. Blood, 2011, 117:1071-80, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

Для оценки влияния VWF аптамера на общий ангиогенный процесс, HUVEC, контактирующие с VWF аптамером, подвергают образованию трубочек in vitro в анализе Matrigel, который демонстрирует способность VWF аптамера противодействовать формированию сети. Одним из аспектов ангиогенеза является клеточная миграция. Для оценки способности аптамера ингибировать миграцию используют анализ методом зарастания царапины в комбинации с цейтраферной микроскопией. В этом анализе, клетки HUVEC, контактирующие с аптамером, оцениваются на предмет снижения скорости и направленности миграции. Другим аспектом ангиогенеза является пролиферация. Сниженная пролиферация HUVEC, контактирующих с одним или несколькими VWF аптамерами, определяется как уменьшение количества клеток по сравнению с необработанным контролем. Еще одним аспектом ангиогенеза является адгезия эндотелиальных клеток, которая измеряется в анализе адгезии. Используя коммерчески доступный набор (Invitrogen), ингибирующий эффект VWF аптамера в отношении миграции клеток может быть измерен по сниженной флуоресценции связанных клеток в лунках.

ЭК, полученные из циркулирующих клеток-предшественников, называемых эндотелиальными клетками роста крови (BOEC), от здоровых людей и пациентов с болезнью фон Виллебранда (VWD) выделяют в соответствии с методами, описанными в Starke RD, et al., Endothelial von Willebrand factor regulates angiogenesis. Blood, 2011, 117:1071-80 and Ingram DA, et al., Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood 2004 104:2752-60, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. BOEC используются для оценки способности VWF аптамера оказывать влияние на уменьшение или устранение повышенного ангиогенеза, наблюдаемого в BOEC от пациентов с VWD, что определяется с помощью матричного анализа, анализа миграции, пролиферации и адгезии, наблюдаемого в BOEC от пациентов с VWD по сравнению с BOEC от здоровых пациентов контрольной группы.

Мышиные модели ангиогенеза (рассмотрено в Couffinhal et al., Mouse models to study angiogenesis, vasculogenesis and arteriogenesis in the context of cardiovascular diseases. Frontiers in Bioscience; 2009; 14:3310-25, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки) включают ишемические модели, такие как ишемия нижних конечностей, модели ишемии сердца и кожи, и неишемические модели, такие как анализы матригелевых пробок, анализы дисков, анализы сетчатки глаза и роговицы, модели заживления ран и яичников. Эти модели используются для оценки влияния доставки VWF аптамера на ангиогенез in vivo. В модели пробок матригеля, мышам вводят только матригель или содержащий VWF аптамер, и модель может быть использована так, как описано в Couffinhal et al, 2009 and Starke et al, 2011, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки, для оценки влияния аптамера на образование кровеносных сосудов в матригелевой пробке.

Пример 8. Профилактика интрацеребральных окклюзионных тромбов (образование богатого фибрином сгустка)

Эксперименты проводили на взрослых самцах мышей линии Swiss в возрасте 2 месяцев. N=5-8 животных в группе, включая следующие группы: контроль-тромбин (физиологический раствор) и аптамер-тромбин. Мышей помещали в камеру с контролируемой температурой с циклом 12 часов свет/12 часов темнота с кормом и водой в неограниченном количестве. Животных подвергали глубокой анестезии 5% изофлураном и после этого ее поддерживали 2,5% изофлураном в смеси 70%/30% NO₂/O₂. Катетер вводили в хвостовую вену для внутривенного введения (200 мкл) физиологического раствора или аптамера. Микропипетку заполняли 1 мкл очищенного мышиного альфа-тромбина (приблизительно 1000 единиц NIH/мг; Sigma-Aldrich). Мышей помещали в стереотаксическое устройство, рассекали кожу между правым глазом и правым ухом, и отводили височную мышцу. Выполняли небольшую краниотомию, иссекали твердую мозговую оболочку и обнажали среднюю мозговую артерию (MCA). В просвет MCA вводили 1 мкл очищенного мышиного альфа-тромбина (0,75 UI), чтобы вызвать образование сгустка in situ. Пипетку удаляли через 10 минут после введения альфа-тромбина для стабилизации сгустка. Для индуцирования тромболизиса, через 20 минут после введения альфа-тромбина в хвостовую вену внутривенно вводили аптамер. Контрольная группа получала аналогичный объем физиологического раствора в аналогичных условиях.

Церебральный кровоток (CBF) определяли лазерной доплеровской флоуметрией с использованием волоконно-оптического зонда (Oxford Optronix), приклеенного к черепу на участке MCA. CBF измеряли до введения альфа-тромбина (100% исходный уровень) и на протяжении всего эксперимента. CBF в MCA измеряли в присутствии или в отсутствие аптамера через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин и 60 мин после введения аптамера или физиологического раствора. Показано, что полная окклюзия происходит позднее в присутствии аптамера в отличие от контроля физиологическим раствором, демонстрирует, что аптамер замедляет скорость окклюзии в MCA. То, что полная окклюзия не происходит в течение 60 минут, указывает на то, что аптамер предотвращает образование окклюзионных тромбов.

Кроме того, магнитно-резонансную ангиографию осуществляли с использованием последовательностей 2D-TOF для измерения кровотока (Gaubert et al., J. Thromb Haemost., 2013, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Кроме того, ишемическое поражение головного мозга в области MCA можно оценить с помощью магнитно-резонансной томографии (MRI) через 6 часов и 24 часа после полной окклюзии. MRI осуществляли на системе Pharmascan 7 T/12 см с использованием поверхностных катушек для определения размера поражения, которое количественно определяется на T2-взвешенном изображении с использованием программного обеспечения ImageJ. Уменьшение размера поражения у мышей, получавших аптамер, по сравнению с размером поражения у мышей, получавших физиологический раствор, указывает на то, что аптамер предотвращает или замедляет образование окклюзирующих тромбов.

Пример 9. Профилактика интрацеребральных окклюзирующих тромбов (образование тромбоцитарных сгустков)

Эксперименты проводили на взрослых самцах мышей линии Swiss в возрасте 2 месяцев, N=5-8 животных на группу. Мышей анестезировали 5% изофлураном (Baxter, Paris, France), помещали в стереотаксическое устройство и поддерживали анестезию до 2 часов 2% изофлураном в 70%/30% смеси N₂O/O₂. Жевательную мышцу иссекали через кожный разрез между правым глазом и ухом, и выполняли небольшую краниотомию (диаметр 1 мм) теменной кости с обнажением правой средней мозговой артерии (MCA). Индуцирование тромба достигали путем помещения фрагмента полоски фильтровальной бумаги WHATMAN™, пропитанной свежеприготовленным FeCl₃ (от 5% до 20%, Sigma Aldrich, Lisle d'Abeau, France), на неповрежденную твердую мозговую оболочку, сверху MCA в течение 4 мин. Предыдущие исследования на мышах показали, что 5% FeCl₃ не вызывает тромбоза, в то время как 10% FeCl₃ индуцирует частичный тромбоз (образует "ядро" тромба, сформированное при скоростях сдвига ниже 10000 с^-1), и 20% FeCl₃ приводит к стабильному и полностью окклюзионному тромбу (образуется при скоростях сдвига 10000 с^-1 или выше). Церебральный кровоток (CBF) на участке MCA определяется с помощью лазерной доплеровской флоуметрии (Oxford Optronix), которая измеряет движения крови в исследуемой ткани. CBF непрерывно измеряли до окклюзии MCA и в течение всего процесса окклюзии, ишемии и тромболиза. Время окклюзии определяли как время между применением FeCl₃ и снижением CBF ниже 20% от исходного уровня.

Мышам вводили 20% FeCl₃, чтобы вызвать тромбоз. Приблизительно через 4-5 минут (когда церебральный кровоток снижается ниже 50% от исходного уровня, то есть после частичной окклюзии) мышам вводят либо аптамер, либо физиологический раствор (контроль). CBF в MCA (определенный методом доплеровской флоуметрии) используется для измерения степени окклюзии с течением времени в присутствии или отсутствии аптамера (то есть окклюзию измеряли через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин и 60 мин после введения аптамера или физиологического раствора). Показано, что полная окклюзия происходит позднее в присутствии аптамера по сравнению с контролем физиологическим раствором, демонстрирует, что аптамер замедляет скорость окклюзии в MCA. То, что полная окклюзия не происходит в течение 60 минут, указывает на то, что аптамер предотвращает образование окклюзионных тромбов после фазы адгезии тромбоцитов.

Кроме того, магнитно-резонансную ангиографию осуществляли способом, описанным в примере 8. Кроме того, ишемическое поражение головного мозга в MCA оценивали с использованием магнитно-резонансной томографии (MRI) через 6 часов и 24 часа после полной окклюзии, как описано в примере 8. Уменьшение размера поражение у мышей, получавших аптамер, по сравнению с размером поражения у мышей, получавших физиологический раствор, указывает на то, что аптамер предотвращает или уменьшает образование окклюзирующих тромбов после фазы адгезии тромбоцитов. Примеры используемых положительных контролей (которые можно использовать в любом из примеров 8-12) включают ауринтрикарбоновую кислоту ("АТА", 20 мг/кг; Sigma-Aldrich), поликарбоксилированное соединение, которое связывается с А1 доменом VWF, предотвращая, таким образом, связывание VWF с GpIbα тромбоцитом, и фрагмент моноклонального антитела или антитела к A1 домену VWF, который предотвращает связывание с GpIbα тромбоцитом, т.е. Fab фрагменты моноклонального антитела Xia.B2 (2,5 мг/кг, Emfret Analytics, Würzburg, Germany). Примеры используемых отрицательных контролей включают тригидрохлорид GR144053 ("GR", 10 мг/кг; R&D Systems, Lille, France), непептидный ингибитор GpIIb/IIIa и фрагмент моноклонального антитела или антитела к GpIIb/IIIa, то есть Fab фрагменты моноклонального антитела Leo.H4 (2,5 мг/кг, Emfret Analytics, Würzburg, Germany). Перед введением, ATA и GR растворы пропускали через фильтры с ячейкой 0,22 мкм и затем вводили в виде быстрого болюса (200 мкл). Контрольный IgG (крысиный) может быть приобретен у Jackson Immunoresearch. Fab-фрагменты получали с использованием набора Pierce Fab Preparation Kit (Fisher Scientific, Illkirch, France) в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 10. Дезагрегация интрацеребральных окклюзирующих тромбов

Ингибирование взаимодействий GpIbα-VWF должно деактивировать VWF, который сшивает тромбоциты в обогащенной VWF части тромба, восстанавливая, таким образом, проходимость сосудов. Мышиную модель тромбоза MCA, описанную в примере 9, использовали для демонстрации дезагрегации окклюзирующих тромбов в присутствии аптамера. Полностью окклюзирующие тромбы у мышей формировали с использованием 20% FeCl₃, как описано в примере 9. Солевой раствор (контроль) или аптамер вводили мышам внутривенно через 10 минут после полной окклюзии, определяемой по мозговому кровотоку (CBF) в MCA, измеряемому посредством лазерной допплеровской флоуметрии (снижение CBF ниже 20% от исходного уровня считается полной окклюзией). Осуществляли иммуногистологические анализы тромбов у мышей, подвергнутых эвтаназии через 10 минут после введения аптамера (например, через 20 минут после полной окклюзии), с использованием флуоресцентно меченных антител против VWF и CD41 (маркер тромбоцитов) и ядерного окрашивания DAPI MCA. Наблюдение меньшего количества VWF и CD41 в MCA (что определено флуоресцентным окрашиванием) у мышей, получавших аптамер, по сравнению с контрольными мышами, указывало на дезагрегацию тромбов в присутствии аптамера. Кроме того, у других тестируемых мышей, может быть повторно вскрыта MCA и исследована для определения размера тромба у мышей, получавших аптамер, по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Примеры используемых положительных контролей включают ATA и Xia.B2. Примеры используемых отрицательных контролей включают тригидрохлорид GR144053 и фрагмент моноклонального антитела или антитела к GpIIb/IIIa.

Пример 11: Восстановление проходимости сосуда

Модель мышиного тромбоза MCA, описанная в примере 9, использовали для демонстрации восстановления проходимости сосудов в присутствии аптамера. Полностью окклюзирующие тромбы у мышей формировали с использованием 20% FeCl₃, как описано в примере 9. Солевой раствор (контроль) или аптамер вводили мышам внутривенно или подкожно через 20 минут после полной окклюзии. Для определения мозгового кровотока (CBF) в MCA использовали допплеровскую флоуметрию, при этом наблюдаемое увеличение CBF у мышей, получавших аптамер, по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор, демонстрировало восстановление проходимости сосудов. Также выполняли магнитно-резонансную ангиографию с использованием последовательностей 2D-TOF для измерения кровотока, и оценивали ишемическое повреждение головного мозга в области MCA с помощью магнитно-резонансной томографии (MRI) через 6 часов и 24 часа после окклюзии. МРТ проводили способом, описанным в примере 9. Уменьшение размера поражения у мышей, получавших аптамер, по сравнению с размером поражения у мышей, получавших физиологический раствор, указывало на восстановление проходимости сосудов. Подобные методы могут быть использованы для определения восстановления проходимости в более крупных артериях, таких как сонная артерия, с использованием модели тромбоза, индуцированного FeCl₃, и мониторинга посредством доплеровской флоуметрии, MRI и иммуногистологического анализа, как описано выше.

Пример 12. Фотохимически индуцированная окклюзия средней мозговой артерии у нечеловекоподобного примата

Эксперименты проводили на взрослых самцах нечеловекоподобных приматов (NHP, т.е. яванский макак, беличья обезьяна или макак-резус) в возрасте 7-13 лет. N=2-3 животных на группу, включая следующие группы: контроль (физиологический раствор) и группу, получавшую аптамер (BT-100). NHP размещали в комнате с контролируемой температурой с циклом 12 часов света/12 часов темнота с кормом и водой в неограниченном количестве. Животных подвергали легкой анестезии путем внутримышечной инъекции 10 мг/кг гидрохлорида кетамина, интубации и анестезии с использованием 0,5-1,5% изофлурана в 30% O₂. Температуру организма постоянно контролировали, и значение температуры поддерживали равным 37-39°C с помощью электрогрелки. В бедренную вену вводили катетер для обеспечения возможности внутривенного введения розового бенгальского, солевого раствора или аптамера BT-100. Трансорбитальный доступ к правой MCA выполняли способом, описанным в Maeda M, Moriguchi A, Mihara K, Aoki T, Takamatsu H et al. FK419, a nonpeptide platelet glycoprotein IIb/IIIa antagonist, ameliorates brain infarction associated with thrombotic focal cerebral ischemia in monkeys: comparison with tissue plasminogen activator. J Cereb Blood Flow Metab. 2005 Jan;25:108-118, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. Выполняли орбитальную краниотомию, позволяющую визуализировать правую MCA с сохранением интактной твердой мозговой оболочки. Затем область облучали зеленым светом (длина волны 540 нм) в течение 10 минут, включая 6 минут внутривенного введения бенгальского розового (20 мг/кг). Обработку (физиологический раствор или аптамер) осуществляли в конце фотооблучения.

Церебральный кровоток (CBF) измеряли с помощью лазерной доплеровской флоуметрии с использованием волоконно-оптического зонда (Oxford Optronix), размещенного на MCA. CBF измеряли перед фотооблучением и в течение 3 часов после введения аптамера. CBF в MCA измеряли в присутствии или в отсутствие аптамера BT-100 через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин и 180 мин после введения BT-100 аптамера или солевого раствора. Показано, что полная окклюзия происходит позднее в присутствии аптамера BT-100 по сравнению с контролем солевым раствором, демонстрируя, что аптамер замедляет скорость окклюзии в MCA. То, что полная окклюзия не происходит в течение 60 минут, указывает на то, что аптамер предотвращает образование окклюзирующих тромбов. То, что присутствие аптамера BT-100, в сравнении с контролем солевым раствором, сокращает период реперфузии и/или предотвращает повторную окклюзию после реперфузии, указывает на способность BT-100 дезагрегировать окклюзирующие тромбы.

Через 24 часа после фототромбоза, нечеловекоподобных приматов исследовали на предмет неврологического дефицита. Улучшение неврологических показателей у NHP, обработанных аптамером BT-100, по сравнению с физиологическим раствором, предполагает более быструю или более эффективную дезагрегацию окклюзирующих тромбов.

Пример 13. Конструкция аптамера для продления продолжительности действия

Аптамеры оптимизировали для улучшения одной или нескольких желаемых характеристик или свойств аптамера. Такие характеристики или свойства включают улучшения аффинности связывания, фармакокинетических или фармакодинамических свойств, термостабильности, активности или любых других характеристик или свойств, известных специалисту в данной области техники.

В одном из примеров, аптамеры оптимизированы путем изменения стебля. Длина стебля может быть увеличена или уменьшена. В одном из вариантов осуществления, длина стебля увеличена и сделана длиннее. Двойная спиральная область стебля может быть изменена, чтобы сделать ее короче, длиннее или изменить симметрию или асимметрию. К стеблю аптамера могут быть добавлены ветви.

В одном из примеров, аптамеры оптимизированы путем добавления или изменения одного или нескольких конъюгатов и/или терминальных кэп-структур. Конъюгат может представлять собой полиэфиргликолевый (PEG) фрагмент или любой другой конъюгат или терминальный кэп, известный в данной области. Один или более конъюгатов добавляют к аптамеру для улучшения желаемых характеристик или свойств. Кроме того, конъюгат(ы) могут находиться на 5 'или 3' конце аптамера.

В одном из примеров, аптамеры оптимизированы для повышения термостабильности за счет увеличения двухцепочечной области стебля до более чем 6 пар оснований.

Оптимизированные аптамеры могут быть исследованы любым способом, известным в данной области техники, для оценки желаемой характеристики и/или свойства, включая описанные в настоящей заявке. Оптимизированные аптамеры должны превосходить характеристики эквивалентного, но неоптимизированного аптамера по меньшей мере по одной характеристике и/или свойству.

Пример 14. Оптимизация ARC15105 для синтеза BT-200

ARC15105 оптимизировали для синтеза BT-200. Оптимизация заключалась в улучшении термостабильности и фармакокинетических и фармакодинамических свойств, таких как период полураспада и/или продолжительность действия. Двойную спиральную стеблевую область ARC15105 удлиняли с дуплекса с 5 парами оснований до дуплекса с 9 парами оснований. Расширение стеблевой области повышало термостабильность BT-200 и стабилизировало целостность аптамера, делая его менее восприимчивым к расщеплению нуклеазой и увеличивая период полувыведения и/или продолжительность действия аптамера in vivo. 40kD PEG определяли для BT-200. Характеристики и/или свойства BT-200 исследовали любым из способов, известных в данной области техники и/или описанных в настоящей заявке. При прямом сравнении, оптимизированный аптамер BT-200 будет превосходить по характеристикам оригинальный аптамер ARC15105.

Пример 15. Оптимизация BT-100 для синтеза BT-200

BT-100 оптимизировали для синтеза BT-200. 40kD PEG сопрягали с 5'-концом BT-100. При увеличении молекулярной массы аптамера и защиты его от нуклеаз, пегилирование улучшает фармакокинетические и фармакодинамические свойства, такие как период полураспада и/или продолжительность действия. Характеристики и/или свойства BT-200 исследовали любым из способов, известных в данной области техники и/или описанных в настоящей заявке.

Пример 16. Анализ активности VWF in vitro (REAADS).

BT-200 оценивали на предмет ингибирования активности VWF in vivo. для измерения функционального VWF в образцах плазмы использовали набор REAADS® Willebrand Factor Activity Test Kit (Diapharma, Catalog #: K10826, West Chester, Ohio). Анализ приспосабливали для оценки ингибирования активности VWF посредством BT-200. Аналитический набор представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), в котором используется очищенное мышиное моноклональное анти-VWF антитело для обнаружения А1 домена VWF.

Цельную кровь отбирали у трех яванских макак (Xishan Zhongke Laboratory Animal Co., Suzhou, China) в пробирки для забора крови, содержащие 3,2% цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат натрия=9:1). Плазму отделяли центрифугированием при 3000 об/мин. Исходный раствор BT-200 подготавливали в виде 1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS). В образцы плазмы добавляли BT-200 до конечных концентраций 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 и 30000 нг/мл. Анализ REAADS проводили в соответствии с инструкцией производителя при комнатной температуре. Активность VWF выражали в процентах (%) от нормы относительно калибратора, который стандартизировали по третьему международному стандарту для фактора VIII и фактора фон Виллебранда в плазме (91/666). Для определения значений IC₅₀, активность VWF наносили на график в зависимости от концентрации BT-200.

Результаты анализа REAADS in vitro представлены в таблице 8. Данные показывали дозозависимое ингибирование активности A1 домена VWF посредством BT-200 в плазме обезьяны. Значения IC₅₀, определенные для каждого животного, составляли 1618 нг/мл (R²=0,998), 1633 нг/мл (R²=0,999) и 1606 нг/мл (R²=0,997) соответственно. Исследование подтверждало, что BT-200 ингибирует активность VWF, блокируя A1 домен VWF.

Таблица 8. Активность VWF

Концентрация BT-200 (нг/мл) Процент (%) от нормы Животное A Животное B Животное C 30000 0,6 0,6 0,6 10000 4,7 5,6 4,5 3000 28,6 31,2 22,3 1000 72,4 72,4 74,3 300 98,7 98,4 94,9 100 105,8 104,5 104,5 30 101,9 109,0 97,5 10 110,0 111,2 103,5 0 111,2 109,8 105,9

Пример 17. Анализ блокирования активности VWF In vivo (REAADS).

Для оценки ингибирования BT-200 активности VWF у обезьян проводили эксперимент in vivo. Трем взрослым яванским макакам вводили 3 мг/кг BT-200 путем внутривенной инъекции (I.V.), 1 мг/кг и 3 мг/кг BT-200 путем подкожной инъекции (S.C.) соответственно. Активность VWF анализировали через 1 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч, 168 ч, 240 ч и 336 ч после инъекции с использованием набора для анализа REAADS. Для определения активности A1 домена VWF проводили анализ REAADS способом, описанным в примере 16.

Результаты анализа REAADS представлены в таблице 9. Ингибирование BT-200 активности VWF продолжалось более 336 часов при дозе 3 мг/кг, вводимой либо внутривенно, либо подкожно. BT-200 блокировал активность VWF в течение более 168 часов при дозе 1 мг/кг путем подкожного введения инъекцией. Эти данные указывают на высокое сродство между BT-200 и А1 доменом VWF in vivo.

Таблица 9. Активность VWF

Время замера Процент (%) от нормы Животное A
3 мг/кг внутривенное введение Животное B
1 мг/кг подкожное введение Животное C
3 мг/кг подкожное введение 0 111,2 109,8 105,9 1 ч 0,2 62,6 94,0 4 ч 0,1 13,3 16,4 8 ч 0,1 4,4 4,0 24 ч 0,2 3,0 0,5 48 ч 0,4 5,7 0,4 96 ч 1,9 6,1 0,4 168 ч 9,1 60,6 4,3 240 ч 33,0 122,7 21,6 336 ч 79,9 122,3 62,3

Пример 18. Анализ функции тромбоцитов in vitro (PFA-200).

BT-200 оценивали на способность ингибировать активность VWF in vitro посредством анализа с использованием PFA, как описано в примере 4. Использовали как образцы плазмы донора человека, так и образцы плазмы яванского макака. Образцы плазмы подготавливали путем забора 4,5 мл цельной крови в пробирки для забора крови, содержащие 3,2% цитрата натрия (соотношение кровь:цитрат натрия=9:1). Исходный раствор BT-200 подготавливали в виде 1 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS). BT-200 добавляли в образцы человека до конечных концентраций 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,06, 0,1, 0,2, 0,3, 1,0, 3,0, 10,0 и 30,0 мкг/мл. В образцах обезьян концентрации BT-200 доводили до 0,01, 0,1, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 3,0 и 10,0 мкг/мл. После инкубации при 37°C в течение 15 минут, определяли образование тромбоцитарной пробки по времени закрытия, индуцированного коллагеном/аденозиндифосфатом (CADP-CT), с использованием анализатора функции тромбоцитов, PFA-200 (Siemens, Marburg, Germany). В качестве отрицательного контроля использовали физиологический раствор. Максимальное CT, измеренное посредством PFA-200, составляло 5 минут и, в случае превышения этого времени, прибор предоставлял результат >300 с. Данные наносили на график в зависимости от концентрации BT-200 и аппроксимировали посредством программы GraphPad Prism 5 (San Diego, CA) с получением значений средней эффективной дозы (ED₅₀).

Для человеческих образцов, данные собирали от 14 здоровых добровольцев, зачисленных в университет Suzhou University, China. Анализировали время закрытия образцов после инкубации с BT-200. Дисперсионный анализ (ANOVA) показал, что концентрация BT-200, превышающая 0,2 мкг/мл, значительно увеличивает CADP-CT (P<0,01). BT-200 вызывал зависимое от концентрации увеличение CADP-CT. Было определено, что ED₅₀ составляет 0,187 мкг/мл с 95% доверительным интервалом, составляющим 0,086-0,408 мкг/мл (R²=0,940). Данные приведены в таблице 10.

Таблица 10. Время закрытия у людей-добровольцев

BT-200 (мкг/мл) Время закрытия (с) H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 30,0 300 300 300 300 300 300 300 - - - - - - - 10,0 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 3,0 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 1,0 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 0,3 275 300 300 267 300 300 300 243 191 300 258 300 300 300 0,2 - - - - - 164 258 145 108 260 128 137 201 237 0,1 110 127 237 111 190 109 174 99 86 165 91 134 182 158 0,06 - - - - - - - 91 77 145 83 115 157 113 0,01 74 109 122 102 127 82 104 85 73 121 77 112 133 103 0,003 85 85 130 83 106 83 121 77 85 117 68 84 103 93 0,001 77 101 98 101 113 69 92 73 79 113 80 95 100 95 Холостая проба 77 81 113 87 126 79 117 70 63 112 69 84 111 103

Для образцов обезьян данные получали от 16 обезьян-яванских макак (Xishan Zhongke Laboratory Animal Co. (Suzhou, China)). Анализировали время закрытия образцов после инкубации с BT-200. Результаты ANOVA показали, что концентрация BT-200 свыше 0,6 мкг/мл значительно увеличивает CADP-CT (P <0,01). BT-200 вызывал зависимое от концентрации увеличение CADP-CT. Было определено, что ED₅₀ составляет 0,697 мкг/мл с интервалом вероятности 95%, составляющим 0,135-3,599 мкг/мл (R²=0,852). Данные приведены в таблице 11.

Таблица 11. Время закрытия у яванских макак

BT-200 (мкг/мл) Время закрытия (с) M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 10,00 300 300 300 300 300 300 300 300 3,00 - - 300 300 300 300 300 300 1,00 215 300 300 300 300 300 300 300 0,80 - - 179 105 300 300 300 176 0,60 65 152 109 96 130 300 101 130 0,40 56 86 73 57 90 88 68 104 0,10 - 55 56 53 63 54 59 75 0,01 52 59 51 46 50 54 49 63 Холостая проба 55 55 54 53 57 50 50 75 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 10,00 300 300 300 300 300 300 300 300 3,00 300 300 - - - - - - 1,00 300 212 300 300 300 300 300 300 0,80 300 141 300 300 80 158 300 300 0,60 170 82 - 300 75 72 153 106 0,40 91 78 133 137 60 53 79 72 0,10 61 58 - - - - - - 0,01 76 63 58 73 53 40 49 50 Холостая проба 66 56 58 73 53 40 49 50

В обоих наборах образцов BT-200 индуцировал зависимое от концентрации ингибирование активности VWF. Среднее значение ED₅₀ для увеличения CADP-CT у человека или яванского макака составляло 0,158 ± 0,105 мкг/мл (n=14) и 0,576 ± 0,390 мкг/мл (n=16) соответственно. Сродство связывания BT-200 с VWF человека было в 3,72 раза выше, чем с VWF обезьян.

Пример 19. Анализ in vivo посредством PFA-200

BT-200 оценивали на способность ингибировать активность VWF in vivo У обезьян - яванских макак. Отбирали шестнадцать взрослых обезьян и распределяли в четыре группы для обработки в зависимости от пола и веса тела. Обезьяны мели массу от 2,6 до 3,9 кг, а возраст составлял от 3 до 5 лет. Каждая группа включала четырех животных, двух самцов и двух самок, а средний вес каждой группы составлял около 3,2 кг. BT-200 дозирующие растворы подготавливали в 0,9% солевом растворе до конечной концентрации 10 мг/мл. Группам 1-4 вводили 3 мг/кг BT-200 посредством внутривенной инъекции (I.V.), 3,0 мг/кг, 1,0 мг/кг и 5,0 мг/кг BT-200 посредством подкожной инъекции (S.C.) соответственно. Образцы крови собирали за 30 минут до инъекции (-30 минут), через 1 час, 4 часа, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 96 часов, 168 часов и 240 часов после инъекции. Образцы плазмы подготавливали способом, описанным выше. Измерение CADP-CT проводили с использованием PFA-200 непосредственно после сбора образцов.

Время закрытия у яванского макака до или после введения BT-200 выражали как среднее ± стандартное отклонение (SD) (см. таблицу 12) соответственно. Результаты анализа ANOVA показали, что BT-200 значительно увеличивает CADP-CT во всех 4 группах через 1 ч после инъекции (P<0,01). Ингибирование BT-200 в VWF in vivo сохраняется по меньшей мере до 240 ч. Результаты ANOVA показали, что через 1 ч после инъекции, CADP-CT из 4 групп не имели существенных отличий. Более того, данные свидетельствуют о том, что BT-200 имеет длительный период полураспада, и биодоступность BT-200 при подкожных инъекциях аналогична внутривенной инъекции.

Таблица 12. Время закрытия (с) в разные моменты времени

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение -30 мин 73,5 ± 3,0 79,5 ± 2,4 73,8 ± 2,4 86,0 ± 5,8 1 ч 300 ± 0,0 255,0 ± 52,6 271,3 ± 57,5 300,0 ± 0,0 4 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 8 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 24 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 48 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 96 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 168 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 240 ч 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0 300,0 ± 0,0

Пример 20. Функция коагуляции

Параметры коагуляции, включая активированное парциальное тромбопластиновое время (aPTT), частичное тромбопластиновое время (PT), тромбиновое время (TT) и фибриноген (FIB), анализировали с помощью автоматического коагулометра (Stago, France) за 30 мин до инъекции (до введения дозы), через 15 мин, 1 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч, 168 ч и 240 ч после инъекции тем же самым 16 обезьянам, что и в примере 19.

BT-200 значительно увеличивал aPTT через 1 час после внутривенной инъекции, которое сохранялось до 48 часов. Подкожная инъекция BT-200 увеличивала aPTT позже, чем внутривенная инъекция. Результаты ANOVA показали, что через 24 часа после 1 мг/кг подкожной инъекции BT-200, aPTT значительно увеличивалось (P=0,03) и возвращалось к исходному уровню через 48 часов. Через 8 ч после подкожной инъекции BT-200 в дозе 3 мг/кг, aPTT значительно увеличивалось (P<0,05) и сохранялось до 96 ч после инъекции. При введении 5 мг/кг BT-200, aPTT продлевалсь с 8 ч после инъекции и сохранялось до 240 ч. Значения PT, TT и FIB не изменились после инъекции BT-200. Результаты показывают, что BT-200 не оказывает влияния на эти факторы коагуляции, за исключением aPTT. Однако увеличение aPTT является артефактом, как показано в примере 21.

Параметры коагуляции каждой группы в разные моменты времени представлены в таблицах 13-16. В таблицах значения aPTT, PT, TT и FIB представлены в виде среднего значения ± SD (n=4); * указывает на очень значительную разницу (P<0,01); и # указывает на значительную разницу (0,01<P<0,05).

Таблица 13. Активированное парциальное тромбопластиновое время (aPTT) (с)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение -30 мин 31,2 ± 3,0 31,6 ± 2,4 29,4 ± 2,4 30,3 ± 5,8 1 ч 60,3 ± 2,9* 34,7 ± 4,6 28,1 ± 4,7 29,7 ± 4,7 4 ч 61,4 ± 6,8* 39,7 ± 8,2 29,1 ± 5,1 39,5 ± 10,4 8 ч 59,7 ± 3,5* 47,1 ± 10,8* 34,3 ± 3,5 53,3 ± 9,4* 24 ч 60,7 ± 7,4* 58,8 ± 9,4* 36,0 ± 2,8^# 48,6 ± 6,0* 48 ч 54,7 ± 3,9* 54,4 ± 7,2* 34,0 ± 5,2 48,6 ± 6,0* 96 ч 37,5 ± 4,8 42, 8 ± 4,9^# 30,7 ± 4,6 44,6 ± 4,4* 168 ч 32,6 ± 6,9 38,1 ± 7,6 27,1 ± 4,3 45,3 ± 4,8* 240 ч 26,7 ± 4,4 29,9 ± 6,2 27,6 ± 4,7 40,7 ± 8,9^#

Таблица 14, Частичное тромбопластиновое время (PT) (с)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение -30 мин 16,6 ± 5,7 12,8 ± 0,7 13,3 ± 0,5 12,9 ± 1,1 1 ч 13,3 ± 0,7 15,1 ± 2,5 12,7 ± 0,9 12,2 ± 0,5 4 ч 14,2 ± 1,8 13,2 ± 1,0 12,7 ± 0,9 12,1 ± 0,6 8 ч 14,3 ± 1,3 15,9 ± 4,2 12,4 ± 0,2 11,9 ± 0,5 24 ч 13,9 ± 1,2 12,8 ± 1,6 11,4 ± 0,5 11,3 ± 0,4 48 ч 13,1 ± 0,7 12,7 ± 1,7 11,1 ± 0,2 11,1 ± 0,5 96 ч 11,5 ± 0,4 11,1 ± 0,3 11,3 ± 0,2 11,3 ± 0,7 168 ч 12,7 ± 0,7 11,5 ± 0,7 11,6 ± 0,2 11,6 ± 0,9 240 ч 12,9 ± 0,8 11,7 ± 0,1 11,7 ± 0,2 12,2 ± 1,0

Таблица 15. Тромбиновое время (TT) (с)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение -30 мин 19,4 ± 2,8 20,6 ± 1,7 18,3 ± 0,4 19,1 ± 3,1 1 ч 18,9 ± 1,2 23,3 ± 2,5 18,4 ± 0,6 20,7 ± 2,9 4 ч 22,5 ± 4,1 20,9 ± 1,8 19,5 ± 3,1 21,5 ± 2,7 8 ч 19,8 ± 1,0 25,2 ± 3, 19,2 ± 2,6 23,0 ± 2,9 24 ч 19,7 ± 1,8 21,1 ± 3,0 20,4 ± 1,0 22,9 ± 4,1 48 ч 20,1 ± 3,2 21,5 ± 4,3 20,5 ± 0,5 20,9 ± 0,7 96 ч 22,1 ± 1,6 21,7 ± 1,5 20,5 ± 0,8 20,7 ± 0,6 168 ч 22,1 ± 2,8 21,4 ± 1,4 20,4 ± 1,0 20,5 ± 0,5 240 ч 21,4 ± 1,1 21,7 ± 0,8 20,9 ± 0,6 21,0 ± 0,5

Таблица 16. Концентрации фибриногена (г/л)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение -30 min 2,80 ± 1,75 3,57 ± 0,78 2,76 ± 0,82 2,48 ± 0,69 1 ч 2,88 ± 1,94 2,60 ± 0,38 2,38 ± 0,41 2,91 ± 0,43 4 ч 2,73 ± 0,82 3,38 ± 0,84 2,41 ± 0,59 2,62 ± 0,39 8 ч 2,38 ± 1,11 2,62 ± 0,64 3,42 ± 0,90 3,08 ± 0,58 24 ч 2,64 ± 1,33 3,22 ± 0,22 3,28 ± 0,77 3,01 ± 0,73 48 ч 2,85 ± 1,45 2,84 ± 0,42 2,97 ± 0,57 2,85 ± 0,44 96 ч 3,40 ± 1,17 3,35 ± 0,30 3,07 ± 0,45 2,87 ± 0,53 168 ч 3,28 ± 1,70 3,40 ± 1,10 3,00 ± 1,13 2,89 ± 0,63 240 ч 3,14 ± 1,53 3,32 ± 0,78 2,62 ± 0,97 2,82 ± 0,27

Пример 21. Дополнительные исследования коагуляции

A. Исследования aPTT

Поскольку ранее не было показано, что BT-200 является антикоагулянтом, не ожидалось, что он увеличит время свертывания. Дополнительно исследовали наблюдаемое увеличенное aPTT в примере 20. Анализ aPTT повторяли с использованием реагентов aPTT Actin-FS (Siemens, Marburg, Germany) и антикоагулянта aPTT-lupus (LA) (Stago, France) с диоксидом кремния или эллаговой кислотой в качестве активатор свертывания. Actin-FS является наиболее чувствительным реагентом для умеренного снижения факторов VIII, IX и XI. Результаты показали, что ложный aPTT эффект специфичен для реагента (см. таблицу 17). В то время как aPTT реагенты с диоксидом кремния в качестве активатора показали повышенные значения aPTT в присутствии BT-200, aPTT Actin-FS с эллаговой кислотой показал аналогичное значение aPTT при всех концентрациях ВТ-200.

Таблица 17. Исследования aPTT

Концентрация BT-200 (мкг/мл) 0 3 10 30 100 Активатор Производитель aPTT (с) 40,1 48,6 65,1 77,3 83,2 диоксид кремния Stago aPTT Actin-FS (с) 40,9 41,1 40,9 40,2 40,3 эллаговая кислота Stago aPTT-LA (с) 40,9 44,8 65,7 82,5 98,7 диоксид кремния Stago

Влияние ВТ-200 на факторы свертывания также оценивали с помощью эллаговой кислоты в качестве активатора. Результаты представлены в таблице 18. Как ожидалось, BT-200 не снижает активность фактора VIII или фактора XI.

Таблица 18. Активность фактора

Концентрация BT200 (мкг/мл) 0 3 10 30 100 Активатор Производитель Анти-Xa (гепарин) (МЕ/мл) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Активность фактора VIII (%) 59 58 58 60 60 эллаговая кислота Siemens Активность фактора XI (%) 80 79 81 79 80 эллаговая кислота Siemens

B. Ротационная тромбеластометрия (ROTEM)

Хотя анализы коагуляции, такие как PT и aPTT, широко применяются, известно, что они имеют внутренние ограничения. Например, эти анализы оценивают каскад свертывания крови изолированно и поэтому не являются физиологическими. В результате они обычно показывают слабую корреляцию с клиническим фенотипом, то есть PT или aPTT могут быть пролонгированными, но это не обязательно прогнозирует фенотип кровотечения. Кроме того, эти анализы, обычно, мало чувствительны к протромботическим состояниям. Также в анализах PT и aPTT, в качестве конечных результатов исследования, используется образование фибринового сгустка, и известно, что это происходит, когда образуется только менее 5% от общего количества тромбина.

Ротационная тромбоэластометрия (ROTEM) представляет собой метод измерения свертывания цельной крови или плазмы с или без активаторов после повторной кальцификации образцов. Основным результатом ROTEM является кривая реакции, которая показывает эластичность во времени в процессе образования или растворения сгустка. Параметры измерения включают время свертывания (CT), время формирования сгустка (CFT), максимальную плотность сгустка (MCF), амплитуду на 5 минуте после CT (A5), индекс лизиса через 30 минут (LI 30) и максимальный лизис (ML; процент уменьшения по амплитуде через 60 мин после MCF). CT соответствует времени задержки от начала добавления исходного реагента в кровь до начала формирования сгустка. CFT соответствует времени, от окончания CT до достижения плотности сгустка соответствующей амплитуде 20 миллиметров. MCF соответствует наибольшей вертикальной амплитуде на тромбоэластограмме. Время свертывания обычно увеличивается с помощью антикоагулянтов.

Влияние BT-200 на время свертывания оценивали с использованием анализа ROTEM на анализаторе гемостаза ROTEM® delta (Tem Innovations GmbH, Germany). Выполняли тест EXTEM, который является скрининг-тестом для системы внешнего гемостаза. Результаты представлены в таблице 19. Время свертывания было практически одинаковым при всех концентрациях ВТ-200, предполагая, что ВТ-200 не оказывает влияния на свертывание, что согласуется с предыдущим наблюдением. Для сравнения, фармакологические концентрации прямого ингибитора фактора II - дабигатрана - увеличивают время свертывания в 10 раз, а прямого ингибитора фактора Х - ривароксабана - в 4 раза (Schoergenhofer C, et al., The use of frozen plasma samples in thromboelastometry. Clin Exp Med, DOI 10.1007/s10238-017-0454-5, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Таблица 19. Исследование ROTEM

Концентрация BT-200 (мкг/мл) CT (с) CFT (с) MCF (мм) 30 73 540 22 10 76 325 24 2 80 493 23 0 77 360 23

C. Анализ образования тромбина

Образование тромбина отражает общую способность плазмы вырабатывать тромбин. Анализ калиброванной автоматической тромбограммы (CAT) является стандартным тестом, используемым для измерения образования тромбина. Этот анализ показывает концентрацию тромбина в плазме свертывания как функцию времени, отслеживая расщепление флуорогенного субстрата и сравнивая его с текущей известной активностью тромбина в параллельном образце без свертывания. Параметры тромбограммы включают время ожидания, высоту пика, эндогенный потенциал тромбина (ETP) (рассчитывается как площадь под кривой), максимальная крутизна подъема и время достижения пика (Hemker HC, et al., Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost. 2006 Nov;96(5):553-61, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). Ингибиторы коагуляции, такие как ривароксабан, снижают ETP и/или пик и удлиняют время достижения пика.

Влияние ВТ-200 на образование тромбина оценивали посредством CAT-анализа с использованием реагентов для использования с обедненной по тромбоцитам плазмой (PPP) типа LOW или HIGH (Thrombinoscope BV, Netherlands). PPP-реагент используется в качестве триггера, который добавляется в обедненную по тромбоцитам плазму для инициирования выработки тромбина. Показания определяли на микропланшетном флуориметре Fluoroskan ASCENT™ (Thermo Scientific, Waltham, MA). Результаты представлены в таблицах 20 и 21. Эти результаты подтвердили, что BT-200 не изменяет образование тромбина.

Таблица 20. CAT с реагентом PPP (Low)

Концентрация BT-200 (мкг/мл) 0 3 10 30 100 Время задержки (мин) 2,33 2,33 2 2 2 ETP (нМ×мин) 609 599 557 561 553 Пик (нМ) 100 98,1 94,3 98,7 98,2 Время достижения пика (мин) 5,0 5,0 5,0 4,8 4,7

Таблица 21. CAT с реагентом PPP (High)

Концентрация BT-200 (мкг/мл) 0 3 10 30 100 Время задержки (мин) 1 1 1 1 1 ETP (нМ×мин) 577 581 579 570 553 Пик (нМ) 138 139 134 139 135 Время достижения пика (мин) 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7

Пример 22. Гематологический тест

Параметры гематологии, включая концентрацию гемоглобина, гематокрит, количество лейкоцитов (WBC) и количество тромбоцитов, анализировали до введения дозы, через 1 неделю и 2 недели после инъекции BT-200 тем же самым 16 обезьянам, что и в примере 19. Гематологические тесты осуществляли с помощью Sysmex XP-100, 3-компонентного дифференциально-гематологического анализатора (Sysmex, Japan). По сравнению с предварительной дозой значения гемоглобина и гематокрита несколько снизились, без существенной разницы. Количество WBC и тромбоцитов не изменилось после введения BT-200.

Гематологические параметры представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (n=4) в таблицах 22-25.

Таблица 22. Концентрации гемоглобина (г/л)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение До введения дозы 138,3 ± 11,3 138,5 ± 8,4 133,8 ± 16,3 132,5 ± 12,5 1 неделя после дозирования 108,3 ± 23,3 95,3 ± 32,6 116,8 ± 13,5 111,0 ± 13,6 2 недели после дозирования 113,3 ± 18,9 100,5 ± 26,6 126,0 ± 4,3 114,0 ± 9,8

Таблица 23. Гематокрит (%)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение До введения дозы 43,7 ± 2,5 45,5 ± 1,7 43,7 ± 3,8 43,0 ± 2,8 1 неделя после дозирования 36,5 ± 5,2 32,0 ± 9,5 39,2 ± 3,6 37,3 ± 3,0 2 недели после дозирования 37,7 ± 4,7 34,5 ± 7,7 41,6 ± 0,6 38,1 ± 3,1

Таблица 24. Количество лейкоцитов (×10⁹/л)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение До введения дозы 15,3 ± 1,2 13,7 ± 3,7 15,2 ± 2,3 15,2 ± 2,3 1 неделя после дозирования 15,1 ± 3,3 13,6 ± 5,9 15,0 ± 0,9 13,6 ± 2,4 2 недели после дозирования 14,5 ± 4,4 15,2 ± 2,6 17,2 ± 4,1 14,0 ± 3,9

Таблица 25. Число тромбоцитов (×10⁹/л)

Время замера 3 мг/кг
внутривенное введение 3 мг/кг
подкожное введение 1 мг/кг
подкожное введение 5 мг/кг
подкожное введение До введения дозы 476,8 ± 111,2 484,0 ± 79,6 473,8 ± 141,1 454,5 ± 123,1 1 неделя после дозирования 555,0 ± 43,7 516,8 ± 137,7 463,5 ± 50,3 512,3 ± 110,6 2 недели после дозирования 528,3 ± 47,0 503,8 ± 160,9 444,8 ± 57,9 483,0 ± 93,7

Пример 23. Патологически усиленный фармакодинамический эффект

Частичный дефицит фактора Виллебранда, как при болезни Виллебранда типа 1, обычно имеет очень слабый клинический фенотип и обычно проходит без постановки диагноза. Следует отметить, что у почти 1% населения в целом будет поставлен диагноз VWD типа 1, основанный исключительно на результатах лабораторного анализа случайных образцов крови (Nichols WL, et al., von Willebrand disease (VWD): evidence-based diagnosis and management guidelines, the National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Expert Panel report (USA). Haemophilia. 2008 Mar;14(2):171-232, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). С другой стороны, серьезный дефицит фактора Виллебранда, как в случае болезни Виллебранда типа 3, может быть связан с клиническим фенотипом, проявляющимся как кожно-слизистое кровотечение, кровотечение в результате травмы или местное кровотечение на участках стоматологических или хирургических процедур. Существует непрерывный спектр циркулирующих в крови уровней фактора Виллебранда даже в субпопуляции болезни Виллебранда типа 3, и, обычно, среди этих пациентов наблюдается тенденция к увеличению частоты возникновения симптомов кровотечения при самых низких уровнях VWF. (Schneppenheim R., et al. Genetic heterogeneity of severe von Willebrand disease type III in the German population. Hum Genet. 1994 Dec;94(6):640-52; Zhang Z, Lindstedt M, Blombäck M, Anvret M. Effects of the mutant von Willebrand factor gene in von Willebrand disease. Hum Genet. 1995 Oct;96(4):388-94; и Nichols WL et al., Haemophilia. 2008 Mar;14(2):171-232, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

Корреляция между генотипом и фенотипом, описанная в клинической эпидемиологии болезни Виллебранда, предполагает, что введение фармакологического ингибитора фактора Виллебранда нормальному хозяину может привести к минимальному риску фенотипа кровотечения, за исключением случаев, когда этот ингибитор способен вызвать полное устойчивое ингибирование. Этот прогноз подтверждался опытом применения аптамера первого поколения - ингибитора фактора фон Виллебранда - ARC1779, который вводили нечеловекоподобным приматам, нормальным людям-добровольцам и даже пациентам с тромбоцитопенией или пациентам, принимающим антикоагулянты, однако никаких проявлений кровотечения не наблюдалось. (Gilbert JC, et al., First-in-human evaluation of anti von Willebrand factor therapeutic aptamer ARC1779 in healthy volunteers. Circulation. 2007 Dec 4;116(23):2678-86; Diener JL, et al., Inhibition of von Willebrand factor-mediated platelet activation and thrombosis by the anti-von Willebrand factor A1-domain aptamer ARC1779. J Thromb Haemost. 2009 Jul; 7(7):1155-62; Knöbl P, et al., Anti-von Willebrand factor aptamer ARC1779 for refractory thrombotic thrombocytopenic purpura. Transfusion. 2009 Oct;49(10):2181-5; Jilma-Stohlawetz P, et al., A dose ranging phase I/II trial of the von Willebrand factor inhibiting aptamer ARC1779 in patients with congenital thrombotic thrombocytopenic purpura. Thromb Haemost. 2011 Sep;106(3):539-47, содержание каждого из которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки).

BT-200 конструировали с тем, чтобы быть более мощным, иметь более продолжительное действие и иметь лучшую подкожную биодоступность, чем предшествующие аптамерные ингибиторы фактора фон Виллебранда, такие как ARC1779 и ARC15105. Эти цели, по-видимому, были полностью достигнуты, основываясь на результатах PK/PD исследований ВТ-200 на обезьянах - яванских макаках. У большинства животных, получавших дозы препарата, в этом исследовании наблюдалось кожно-слизистое кровотечение, в основном возникающее из конечностней и/или в грудном отделе под кожей. У этих животных впервые наблюдали слизисто-кожное кровотечение, типичное для болезни фон Виллебранда 3 типа, никогда не наблюдавшееся даже при самых высоких дозах ARC1779, применяемых в токсикологических исследованиях на нечеловекоподобном примате, и ARC15105, применяемых в исследованиях на обезьянах с дозами до 20 мг/кг. Это кровотечение представляет собой "патологически усиленный фармакодинамический эффект", не неизбирательную токсичность, и он может быть устранен путем простого снижения дозы до уровней, при которых функция фактора фон Виллебранда все еще ингибировалось, и можно было бы ожидать антитромботический эффект, но при которых кровотечение больше не наблюдалось.

Это подтверждалось последующим исследованием, когда дозу снижали до 0,3 мг/кг или 0,1 мг/кг у обезьян - яванских макак. При этом наблюдали полное ингибирование функции фактора фон Виллебранда посредством PFA-200 анализа (см. таблицу 26), и не наблюдали кровотечение.

Таблица 26. Время закрытия (с) по PFA-200

Время замера 0,3 мг/кг подкожное введение 0,1 мг/кг подкожное введение Самец Самка Самец Самка До введения дозы 86 66 70 76 1 ч 112 201 106 103 8 ч 300 300 300 300 24 ч 300 300 253 300

Пример 24. Фармакокинетическое исследование

Фармакокинетический (PK) анализ BT-200 проводили на образцах плазмы от тех же самых 16 обезьян, описанных в примере 19. Образцы крови отбирали до введения дозы (-30 минут), через 1 ч, 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч, 168 ч, 240 ч и 336 ч после введения дозы. В каждый момент времени в пробирки, содержащие 1,5% К₂-ЭДТА, собирали около 0,5 мл цельной крови. Образцы центрифугировали при 3000 об/мин с получением плазмы. До проведения анализа, все образцы плазмы хранили при -80°С. Концентрацию ВТ-200 в плазме определяли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с использованием Agilent 1260 Infinity System (Agilent, Santa Clara, CA) с колонкой ДНК PAC200, 4*250 мм. PK-параметры, включая период полураспада (T_1/2), время наблюдаемой максимальной концентрации (T_max), начальную концентрацию (C₀), максимальную концентрацию (C_max), AUC до последней измеряемой концентрации (AUC_last), AUC от 0 до бесконечности (AUC_Inf) и биодоступность (F), определяли с использованием программного обеспечения Phoenix WinNonlin (Certara, Princeton, NJ).

Средние значения PK-параметров представлены в таблице 27. Период полураспада BT-200 в плазме обезьяны (T_1/2) составлял от 76,4 до 85,7 ч. Для подкожного введения дозы 1:3,0:5,0, воздействие относительно уровня дозы, измеренного по C_max, составляло 1:2,8:5,3, и по AUC_inf составляло 1:2,9:5,5. T_max для подкожного введения составляло от 24 до 42 ч. Биодоступность при введении подкожного введения составляла от 115% до 133% (время первого сбора проб составляло 1 ч для внутривенного введения). Не наблюдали каких-либо существенных межполовых различий. Наконец, BT-200 обладает превосходной биодоступностью при подкожном введении и длительным периодом полураспада, что делает его замечательным препаратом-кандидатом.

Таблица 27. PK-параметры

Обработка T_1/2 (ч) T_max (ч) C₀/C_max (мкг/мл) AUC_last (ч*мкг/мл) AUC_Inf (ч*мкг/мл) F (%) 3 мг/кг внутривенное введение 85,7 1 74,6 4213 4473 NA 1 мг/кг подкожное введение 76,4 24 13,2 1602 1785 120 3 мг/кг подкожное введение 83,9 42 37,0 4798 5139 115 5 мг/кг подкожное введение 79,3 30 69,4 9294 9906 133

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BAND THERAPEUTICS, LLC

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ И НАРУШЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФАКТОРОМ

ФОН ВИЛЛЕБРАНДА

<130> 2059.1002PCT

<140> PCT/US2018/XXXXXX

<141> 2018-05-18

<150> 62/508,530

<151> 2017-05-19

<150> 62/638,579

<151> 2018-03-05

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 1

gccagggacc uaagacacau gucccuggc 29

<210> 2

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<223> Описание объединенной ДНК/РНК молекулы: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(29)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (30)..(30)

<223> Инвертированный нуклеотид

<400> 2

gccagggacc uaagacacau gucccuggct 30

<210> 3

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<223> Описание объединенной ДНК/РНК молекулы: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(29)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (30)..(30)

<223> Инвертированный нуклеотид

<400> 3

gccagggacc uaagacacau gucccuggct 30

<210> 4

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 4

acaugugucu uaggucccug gc 22

<210> 5

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<223> Описание объединенной ДНК/РНК молекулы: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(22)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (23)..(23)

<223> Инвертированный нуклеотид

<400> 5

acaugugucu uaggucccug gct 23

<210> 6

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<223> Описание объединенной ДНК/РНК молекулы: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(21)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (22)..(22)

<223> Инвертированный нуклеотид

<400> 6

gggaccuaag acacaugucc ct 22

<210> 7

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<223> Описание объединенной ДНК/РНК молекулы: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(4)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (8)..(18)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (20)..(20)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> прочий признак

<222> (20)..(21)

<223> Фосфоротиоатная связь

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (22)..(22)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (27)..(28)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (30)..(30)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (33)..(34)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (36)..(39)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (40)..(40)

<223> Инвертированный нуклеотид

<400> 7

gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40

<210> 8

<211> 8833

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

agctcacagc tattgtggtg ggaaagggag ggtggttggt ggatgtcaca gcttgggctt 60

tatctccccc agcagtgggg actccacagc ccctgggcta cataacagca agacagtccg 120

gagctgtagc agacctgatt gagcctttgc agcagctgag agcatggcct agggtgggcg 180

gcaccattgt ccagcagctg agtttcccag ggaccttgga gatagccgca gccctcattt 240

gcaggggaag atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt 300

gccagggacc ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct 360

tttcggaagt gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg 420

cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca 480

gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt 540

tgtcaatggt accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg 600

gctgtatcta gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt 660

ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa 720

gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga 780

agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga 840

acagtggtgt gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat 900

gcagaagggc ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg 960

ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg 1020

tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca 1080

ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc 1140

tggtatggag tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat 1200

caatgaaatg tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct 1260

ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta 1320

ccctcccggc acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg 1380

gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa 1440

gagctttgac aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga 1500

ttgccaggac cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga 1560

cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa 1620

actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa 1680

aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga 1740

cctgcagatg gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc 1800

cgggaagacc tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac 1860

cccctctggg ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg 1920

ggactgccag gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac 1980

caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg 2040

tgccgtcagc ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga 2100

cggccgcgag tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg 2160

cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt 2220

gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga 2280

ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga 2340

gaggggggac tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca 2400

gccagaagac atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca 2460

ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct 2520

gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc 2580

cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct 2640

ggagtgcatg agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca 2700

tgagaacaga tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc 2760

ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa 2820

ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac 2880

cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta 2940

ctgcggcagt aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc 3000

ctcagtgaaa tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt 3060

tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga 3120

gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca 3180

cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg 3240

gaattttgat ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga 3300

ccctgtggac tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt 3360

gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga 3420

ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc 3480

cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg 3540

cgcctgcttc tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt 3600

ggtgacctgg aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga 3660

gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg 3720

tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg 3780

ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc 3840

agtgtgtgag gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag 3900

tgaccctgag cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg 3960

ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct 4020

gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga 4080

cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa 4140

ggcctttgtg gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc 4200

cgtggtggag taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc 4260

gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac 4320

cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc 4380

ctcccgcatc accctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt 4440

tgtccgctac gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg 4500

gccccatgcc aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc 4560

cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct 4620

ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc cccgacatgg cacaagtcac 4680

tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct 4740

ggatgtggcg ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag 4800

caaggagttc atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt 4860

cacggtgctg cagtactcct acatggtgac tgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc 4920

caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa 4980

cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg 5040

ggagcaggcg cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa 5100

gaggctgcct ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca 5160

ggagctggag aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct 5220

cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat 5280

ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga 5340

tggctcctcc agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt 5400

catttcaaaa gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag 5460

catcaccacc attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct 5520

tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc 5580

tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa aggcggtggt 5640

catcctggtc acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc 5700

caacagagtg acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg 5760

gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct 5820

ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag 5880

gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga 5940

ccagtgccac accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt 6000

caactgtgac cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga 6060

agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca 6120

catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt 6180

tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc 6240

aaggcagggc tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca 6300

cagtgacatg gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa 6360

catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca 6420

catcttcaca ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt 6480

tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat 6540

gctgagggat ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca 6600

gcggccaggg cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc 6660

ccactgccag gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc 6720

cacattctat gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat 6780

cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga 6840

tttctgtgct atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc 6900

ccggcactgt gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg 6960

ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg 7020

cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc 7080

ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc 7140

cacggccaaa gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga 7200

ccagtgctgc cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt 7260

gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa 7320

cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc 7380

gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa 7440

ctgtgtcaac tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaactg ccaccaatga 7500

ctgtggctgt accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat 7560

ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga 7620

ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg 7680

tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc 7740

tgcctgtgag gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt 7800

cggctcccag tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa 7860

ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg 7920

cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga 7980

gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat 8040

cgatgtgtgc acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct 8100

ggagtgcagg aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac 8160

aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca 8220

gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa 8280

ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga 8340

tgaacacaag tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga 8400

cacatgtgag gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg 8460

aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa 8520

agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac 8580

acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga 8640

ggttctcaat gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt gaggctgctg 8700

cagctgcatg ggtgcctgct gctgcctgcc ttggcctgat ggccaggcca gagtgctgcc 8760

agtcctctgc atgttctgct cttgtgccct tctgagccca caataaaggc tgagctctta 8820

tcttgcaaaa ggc 8833

<210> 9

<211> 2813

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr

20 25 30

Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly

35 40 45

Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu

85 90 95

Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro

100 105 110

Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys

115 120 125

Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln

165 170 175

Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala

180 185 190

Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln

210 215 220

Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu

225 230 235 240

Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu

245 250 255

Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala

260 265 270

Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His

275 280 285

Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys

290 295 300

Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met

305 310 315 320

Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu

325 330 335

Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His

340 345 350

Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn

355 360 365

Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys

370 375 380

Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp

385 390 395 400

Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg

405 410 415

Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys

420 425 430

Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu

435 440 445

Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val

450 455 460

Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu

465 470 475 480

Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu

485 490 495

Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu

500 505 510

Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn

515 520 525

Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro

530 535 540

Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln

545 550 555 560

Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met

565 570 575

Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe

580 585 590

Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys

595 600 605

Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly

610 615 620

Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val

625 630 635 640

Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln

645 650 655

Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu

660 665 670

Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe

675 680 685

Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys

690 695 700

Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp

705 710 715 720

Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met

725 730 735

His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val

740 745 750

Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg

755 760 765

Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu

770 775 780

Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met

785 790 795 800

Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg

805 810 815

His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln

820 825 830

Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr

835 840 845

Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp

850 855 860

Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly

865 870 875 880

Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp

885 890 895

Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys

900 905 910

Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu

915 920 925

Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys

930 935 940

Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg

945 950 955 960

Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg

965 970 975

His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val

980 985 990

Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr

995 1000 1005

Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn

1010 1015 1020

Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro

1025 1030 1035

Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln

1040 1045 1050

Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe

1055 1060 1065

Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val

1070 1075 1080

Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala

1085 1090 1095

Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln

1100 1105 1110

His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln

1115 1120 1125

Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu

1130 1135 1140

Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln

1145 1150 1155

His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys

1160 1165 1170

His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln

1175 1180 1185

Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly

1190 1195 1200

Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp

1205 1210 1215

Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr

1220 1225 1230

Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr

1235 1240 1245

Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser

1250 1255 1260

Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu

1265 1270 1275

Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe

1280 1285 1290

Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg

1295 1300 1305

Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp

1310 1315 1320

Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser

1325 1330 1335

Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln

1340 1345 1350

Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile

1355 1360 1365

Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Thr Leu Leu

1370 1375 1380

Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val

1385 1390 1395

Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro

1400 1405 1410

Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile

1415 1420 1425

Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val

1430 1435 1440

Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys

1445 1450 1455

Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met

1460 1465 1470

Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu

1475 1480 1485

Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu

1490 1495 1500

Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys

1505 1510 1515

Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp

1520 1525 1530

Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val

1535 1540 1545

Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln

1550 1555 1560

Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr

1565 1570 1575

Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser

1580 1585 1590

Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr

1595 1600 1605

Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile

1610 1615 1620

Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu

1625 1630 1635

Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp

1640 1645 1650

Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

1655 1660 1665

Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala

1670 1675 1680

Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly

1685 1690 1695

Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe

1700 1705 1710

Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr

1715 1720 1725

Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val

1730 1735 1740

Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val

1745 1750 1755

Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala

1760 1765 1770

Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala

1775 1780 1785

Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val

1790 1795 1800

Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn

1805 1810 1815

Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala

1820 1825 1830

Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val

1835 1840 1845

Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu

1850 1855 1860

Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile

1865 1870 1875

Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp

1880 1885 1890

Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly

1895 1900 1905

Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu

1910 1915 1920

Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu

1925 1930 1935

Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser

1940 1945 1950

Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu

1955 1960 1965

Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp

1970 1975 1980

Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg

1985 1990 1995

Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser

2000 2005 2010

Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu

2015 2020 2025

Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr

2030 2035 2040

Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile

2045 2050 2055

Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser

2060 2065 2070

Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys

2075 2080 2085

Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val

2090 2095 2100

Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg

2105 2110 2115

Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val

2120 2125 2130

Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala

2135 2140 2145

Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys

2150 2155 2160

Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala

2165 2170 2175

Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp

2180 2185 2190

Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val

2195 2200 2205

Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn

2210 2215 2220

Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro

2225 2230 2235

Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala

2240 2245 2250

Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu

2255 2260 2265

Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys

2270 2275 2280

Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr

2285 2290 2295

Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg

2300 2305 2310

Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp

2315 2320 2325

Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly

2330 2335 2340

Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe

2345 2350 2355

Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro

2360 2365 2370

Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys

2375 2380 2385

Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val

2390 2395 2400

Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys

2405 2410 2415

Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His

2420 2425 2430

Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys

2435 2440 2445

Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu

2450 2455 2460

Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg

2465 2470 2475

Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2480 2485 2490

Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly

2495 2500 2505

Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser

2510 2515 2520

Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu

2525 2530 2535

Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu

2540 2545 2550

Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser

2555 2560 2565

Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met

2570 2575 2580

Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp

2585 2590 2595

Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser

2600 2605 2610

Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro

2615 2620 2625

Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg

2630 2635 2640

Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile

2645 2650 2655

Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr

2660 2665 2670

His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys

2675 2680 2685

Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala

2690 2695 2700

Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr

2705 2710 2715

Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr

2720 2725 2730

Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His

2735 2740 2745

Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp

2750 2755 2760

Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg

2765 2770 2775

Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val

2780 2785 2790

Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro

2795 2800 2805

Arg Lys Cys Ser Lys

2810

<210> 10

<211> 10

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 10

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 8

<212> белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 11

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 12

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<220>

<221> модифицированное основание

<222> (1)..(22)

<223> 2'-O-Метильный нуклеотид

<400> 12

acaugugucu uaggucccug gc 22

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым синтетическим полинуклеотидам, и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает синтетический полинуклеотид, способный специфическим образом связываться с фактором фон Виллебранда (VWF). Изобретение может быть применимо при получении лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или осложнения, связанного с дисфункцией VWF. 13 н. и 37 з.п. ф-лы, 24 пр., 27 табл., 4 ил.

1. Синтетический полинуклеотид, имеющий длину от 25 до 30 нуклеотидов и способный связываться с фактором фон Виллебранда (VWF), причем указанный синтетический полинуклеотид содержит:

(i) по меньшей мере 21 последовательный нуклеотид последовательности SEQ ID NO: 1,

(ii) двухцепочечную область, содержащую от 6 до 9 пар оснований, и

(iii) необязательно 3' и/или 5' концевой кэп.

2. Синтетический полинуклеотид по п.1, в котором двухцепочечная область образована 6-9 3' и 5' нуклеотидами на конце или рядом с ним.

3. Синтетический полинуклеотид по п.1, включающий по меньшей мере одну химическую модификацию.

4. Синтетический полинуклеотид по п.1, в котором каждый нуклеотид содержит по меньшей мере одну химическую модификацию.

5. Синтетический полинуклеотид по п.3 или 4, в котором химическая модификация осуществляется в одной из групп, выбранной из сахара, нуклеооснования или межнуклеозидного линкера синтетического полинуклеотида.

6. Синтетический полинуклеотид по п.5, в котором модификация осуществляется в сахаре, и модификация включает 2'–O–метильную модификацию.

7. Синтетический полинуклеотид по п.1, в котором 3' и/или 5' концевой кэп является инвертированным дезокситимидином.

8. Синтетический полинуклеотид по п.7, в котором 3' и/или 5' концевой кэп является аминогруппой (NH₂).

9. Синтетический полинуклеотид по п.1, в котором 3'–концевой кэп содержит инвертированный дезокситимидин, а 5'–концевой кэп содержит аминогруппу (NH₂).

10. Синтетический полинуклеотид по п.9, который представляет собой SEQ ID NO: 2 (BT-100).

11. Конъюгат синтетического полинуклеотида, который связывается с фактором фон Виллебранда (VWF), содержащий синтетический полинуклеотид по п.1 и группу полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенную к 5'–концу указанного полинуклеотида.

12. Конъюгат по п.11, в котором группа полиэтиленгликоля имеет молекулярную массу приблизительно 40 кДа.

13. Конъюгат синтетического полинуклеотида, который связывается с фактором фон Виллебранда (VWF), состоящий из PEG40K-NH-mGmCmCmAmGmGmGmAmCmCmUmAmAmGmAmCmAmCmAmUmGmUmCmCmC mUmGmGmC-idT.

14. Синтетический полинуклеотид, который способен полностью или частично связываться с любым из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–12 и необязательно содержит 3'-концевой кэп.

15. Синтетический полинуклеотид по п.14, содержащий по меньшей мере 12 последовательных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 4.

16. Синтетический полинуклеотид по п.15, содержащий по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 4.

17. Синтетический полинуклеотид по п.15, содержащий 18–22 последовательных нуклеотидов последовательности SEQ ID NO: 4.

18. Синтетический полинуклеотид по п.14, в котором по меньшей мере один нуклеотид содержит химическую модификацию.

19. Синтетический полинуклеотид по п.14, в котором каждый из нуклеотидов содержит по меньшей мере одну химическую модификацию.

20. Синтетический полинуклеотид по п.18, в котором по меньшей мере одна химическая модификация представляет собой 2'–O–метильную модификацию нуклеотидного сахара.

21. Синтетический полинуклеотид по п.14, в котором 3'–концевой кэп представляет собой инвертированный дезокситимидин.

22. Синтетический полинуклеотид по п.20, содержащий SEQ ID NO: 5 (BT-201).

23. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1-22 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или осложнения, связанного с фактором фон Виллебранда (VWF).

24. Применение по п.23, в котором расстройство представляет собой тромботическое расстройство.

25. Применение по п.24, в котором тромботическим расстройством является ишемический инсульт.

26. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 для получения лекарственного средства для лечения VAD–ассоциированного осложнения или расстройства.

27. Применение по п.26, в котором осложнение или расстройство выбрано из приобретенного синдрома фон Виллебранда (aVWS), ангиодисплазии, окклюзивного тромбоза и VAD–ассоциированного тромбоза насоса.

28. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 для получения лекарственного средства для лечения осложнения или расстройства, которое включает аберрантное связывание VWF с эритроцитами.

29. Применение по п.28, в котором осложнением или расстройством является серповидно–клеточная анемия.

30. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 в получении лекарственного средства для лечения осложнения или расстройства, связанного с желудочно–кишечным (ЖК) кровотечением, ассоциированным с ангиодисплазией.

31. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 в получении лекарственного средства для восстановления проходимости сосудов у пациента, имеющего один или более сосудов, окклюдированных по меньшей мере одним окклюзирующим тромбом, где сосуд(ы) окклюдирован(ы) по меньшей мере на 50%.

32. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 в получении лекарственного средства для дезагрегации одного или нескольких окклюзирующих тромбов у пациента, имеющего по меньшей мере один сосуд, который по меньшей мере на 50% окклюдированы.

33. Применение по п.31 или 32, в котором внешний слой окклюзирующих тромбов дезагрегирован.

34. Применение по п.31 или 32, в котором окклюзирующие тромбы образуются в условиях скоростей сдвига, составляющих 10000 с^–1 или выше.

35. Применение по п.31 или 32, в котором окклюзирующие тромбы устойчивы к фибринолизу и/или антитромботическим средствам.

36. Применение по п.31 или 32, в котором у пациента имеется состояние, выбранное из острого коронарного синдрома, острого окклюзивного тромбоза и ишемического инсульта.

37. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 для получения лекарственного средства для предотвращения агрегации тромбоцитов у пациента, имеющего тромботическое расстройство или осложнение.

38. Применение по п.37, в котором синтетический полинуклеотид вводят посредством внутривенной инъекции.

39. Применение по п.37, в котором синтетический полинуклеотид вводят посредством подкожной инъекции.

40. Применение по п.39, в котором биодоступность подкожной инъекции составляет по меньшей мере 85% относительно внутривенной инъекции.

41. Применение по п.39, в котором биодоступность подкожной инъекции составляет по меньшей мере 95% относительно внутривенной инъекции.

42. Применение по п.38, в котором синтетический полинуклеотид вводят в дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела пациента.

43. Применение по п.37, в котором синтетический полинуклеотид имеет период полураспада в плазме от приблизительно 70 часов до приблизительно 100 часов.

44. Применение по п.37, в котором синтетический полинуклеотид не является антикоагулянтом.

45. Применение по п.44, в котором синтетический полинуклеотид не увеличивает время свертывания.

46. Применение по п.44, в котором синтетический полинуклеотид не изменяет образование тромбина.

47. Применение по п.37, в котором тромботическое расстройство или осложнение представляет собой инфаркт миокарда.

48. Применение по п.37, в котором тромботическое расстройство или осложнение представляет собой ишемический инсульт.

49. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 для получения лекарственного средства для лечения тромбоза сосудов центральной нервной системы (ЦНС), связанного с тяжелой и/или церебральной малярией.

50. Применение любого из синтетических полинуклеотидов по пп. 1–22 для получения лекарственного средства для лечения желудочно–кишечного кровотечения (ЖК), связанного с синдромом Хейда.