Способ биодеградации гидроксилированных бензойных кислот с использованием штамма Rhodococcus ruber P25 Российский патент 2023 года по МПК B09C1/10 C02F3/34 C02F101/34 C02F103/34 C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к разрушению гидроксилированных бензойных кислот с помощью микроорганизмов.

Гидроксибензойные кислоты, а именно 4-гидроксибензойная кислота, 3,4-дигидроксибензойная кислота и 2,5-дигидроксибензойная кислота являются продуктами разложения ароматических и гидроксиароматических соединений, в том числе синтетических стойких органических загрязнителей, бактериями, растениями и грибами [Gibson F., Pittard J. Pathways of biosynthesis of aromatic amino acids and vitamins and their control in microorganisms // Bacteriol. Rev.1968ю Vol. 32. P. 465-492]. 3,4-гидроксибензойная и 2,5- дигидроксибензойная кислоты используются в косметологической и фармацевтической промышленности, в следствии чего являются загрязнителями окружающей среды антропогенного происхождения [Cha J.W., Piao M.J., Kim K.C., Zheng J., Yao C.W., Hyun C.L., Kang H.K., Yoo E.S., Koh Y.S., Lee N.H., Ko M.H., Hyun J.W. Protective effect of 3,4-dihydroxybenzoic acid isolated from Cladophora wrightiana Harvey against ultraviolet B radiation-induced cell damage in human HaCaT keratinocytes //Appl. Biochem. Biotechnol. 2014. Vol. 172. P. 582-592; Патент EP 1945614 A1Process for preparation of chiral amlodipine gentisate; Soni M.G., Carabin I.G., Burdock G.A. Safety assessment of esters of phydroxybenzoic acid (parabens) // Food Chem. Toxicol. 2005. Vol. 43. P. 985-1015; Bais H.P., Vepachedu R., Vivanco J.M. Root specific elicitation and exudation of fluorescent beta-carbolines in transformed root cultures of Oxalis tuberosa //Plant Physiol. Biochem. 2003. Vol. 41. P. 345-353]. Также следует отметить, что 4-гидроксибензойная кислота выступает как токсин для растений, животных и человека [паспорт безопасности в соотв. ГОСТ 30333-2007 https://www.carlroth.com]. Таким образом, накопление гидроксибензойных кислот как природного так и антропогенного происхождения в окружающей среде оказывает негативное воздействие на компоненты экосистемы.

Для решения проблемы очистки природных компонентов от гидроксибензойных кислот предпочтение отдается технологиям, основанным на использовании метаболического потенциала природных микроорганизмов, в частности аэробных бактерий. Среди описанных биодеструкторов гидроксибензойных кислот есть представители бактериальных родов Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Microbacterium, Rhodococcus, Pseudomonas [Solyanikova I.P., Emelyanova E.V., Shumkova E.S., Egorova D.O., Korsakova E.S., Plotnikova E.G., Golovleva L.A. Peculiarities of the degradation of benzoate and its chloro- and hydroxy-substituted analogs by actinobacteria // International Biodeterioration & Biodegradation. – 2015. – V.100. – 155–164. Егорова Д. О., Корсакова Е. С., Демаков В.А., Плотникова Е. Г. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis KT112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Прикладная биохимия и микробиология. – 2013. – Том 49, № 3. – С. 267–278; Solyanikova I.P., Travkin V.M., Rybkina D.O., Plotnikova E.G., Golovleva L.A. Varyability of enzyme system of Nocardioform bacteria as a basis of their metabolic activity // J. Environmental Science and Health. Part B. 2008. V.43. p. 241-252; патент CN115322926 (A) – 2022-11-11 Rhodococcus pyridines and application thereof in remediation of continuous cropping soil; патент CN113444660 (A) – 2021-09-28 Bacillus amyloliquefaciens strain LXBA.1 and application thereof; патент CN113652375 (A) – 2021-11-16 Alcaligenes family aerobic new bacterium T-4 and application thereof; патент CN106698678 (A) – 2017-05-24 Application of Bacillus in degrading aromatic compounds; патент CN108753641 (a) – 2018-11-06 Germ capable of efficiently degrading autotoxin p-hedroxybenzoic acid and application of germ; патент CN111575216 (A) – 2020-08-25 Pseudomonas putida capable of degrading phenolic acid autotoxins and application of pseudomonas putida; патент CN110408567 (A) – 2019-11-05 Saline-alkaline tolerant bacillus methylophilus, and live bacterial preparation and application thereof]. Для большинства известных штаммов описана способность использовать гидроксибензойные кислоты как источник углерода для роста бактериальных культур, однако нет сведений с какой скоростью и при каких начальных концентрациях происходит деструкция гидроксибензойных кислот, а также возможна ли одновременная деградация трех, наиболее часто встречающихся, гидроксибензойных кислот известными штаммами бактерий. Кроме того, представителя ряда описанных родов бактерий-деструкторов гидроксибензойных кислот обладают патогенными свойствами в отношении человека и животных. В связи с этим актуален поиск новых непатогенных микроорганизмов, проявляющих высокую деструктивную активность к гидроксибензойным кислотам.

Штамм Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) известен как активный деструктор хлорированных бифенилов [Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Демаков В.А. Штамм бактерий Rhodococcus ruber – деструктор полихлорированных бифенилов. Патент RU 2262531 С2. 2005. Бюл. №29; Egorova D.O., Gorbunova T.I., Pervova M.G., Kir’yanova T.D., Demakov V.A., Saloutin V.I., Chupakhin O.N. Biodegradability of hydroxylated derivatives of commercial polychlorobiphenyls mixtures by Rhodococcus-strains // Journal of Hazardous Materials. – 2020. – V. 400. – Article 123328; Gorbunova T.I., Egorova D.O., Pervova M.G., Kyrianova T.D., Demakov V.A., Saloutin V.I., Chupakhin O.N. Biodegradation of trichlorobiphenyls and their hydroxylated derivatives by Rhodococcus-strains // Journal of Hazardous Materials. – 2021. – V. 409. – Article 124471; Егорова Д. О., Горбунова Т. И., Кирьянова Т. Д., Первова М. Г., Плотникова Е. Г. Моделирование структуры α-субъединицы бифенил диоксигеназы штаммов рода Rhodococcus и особенности их деградативной активности к хлорированным- и гидроксилированным бифенилам при различных температурах // Прикладная биохимия и микробиология. – 2021. – Т. 57, № 6. – С. 571–582; Плотникова Е.Г., Соляникова И.П., Егорова Д.О., Шумкова Е.С., Головлева Л.А. Особенности разложение 4-хлорбифенила и 4- хлорбензойной кислоты штаммом Rhodococcus ruber Р25 // Микробиология. – 2012. – Т. 81, №2. – С.159–170.], запрещенных к применению в связи с ограничениями, наложенными Стокгольмской конвенцией на соединения группы СОЗ (стойких органических загрязнителей). Показано, что данный штамм проявляет деградативную активность и к гидроксилированным бензойным кислотам. Штамм не обладает патогенными свойствами, характеризуется набором ферментов, проявляющих активность к широкому спектру ароматических соединений, что делает его перспективным для разработки основы биопрепарата, направленного на разложение гидроксибензойных кислот.

Цель настоящего изобретения – разработка способа эффективной биодеструкции гидроксибензойных кислот (4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот) в относительно высокой концентрации (1000 мг/л) с использованием бактериального штамма Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896).

Техническим результатом описываемого изобретения является обеспечение полной биодеструкции гидроксибензойных кислот (4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот) с помощью штамма рода Rhodococcus на основе разработанной технологии и подобранных оптимальных условий осуществления процесса биодеградации, при этом концентрация гидроксибензойных кислот 1000мг/л и температура культивирования +28°С являются предпочтительными.

Данный технический результат достигается посредством реализации способа биодеградации гидроксибензойных кислот, который предусматривает взаимодействие гидроксибензойных кислот с клетками Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896). Процесс осуществляют в минеральной среде, содержащей источники азота, фосфора и минеральные соли. Применение заявленного способа обеспечивает полную биодеградация 1000мг/л гидроксибензойных кислот, присутствующих в среде как индивидуально, так и в смеси, клетками Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) за 5-7 суток.

В способе используется штамм Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) деструктор полихлорированных бифенилов (патент RU2262531 С2), представленный в Региональной специализированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации культур 768, www.iegmcol.ru).

Изобретение осуществляется следующим образом.

Периодическое культивирование Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) осуществляют в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл при объеме минеральной среды 100 мл в условиях постоянного перемешивания (140 об/мин) при 28°С или 32°С. Для культивирования используют минеральную среду К1 следующего состава (г/л): K2HPO4 × 3H2O – 4.0, NaH2PO4 × 2H2O – 0.4, (NH4)2SO4 – 0.5, Ca(NO3)2 – 1.0, MgSO4 × 7H2O – 0.15, NaMoO4 × 2H2O – 0.04, рН среды 7.3 [Tsoi, T.V. Cloning and expression of the Arthrobacter globiformis KZT1 fcbA gene encoding dehalogenase (4-chlorobenzoate-4-hydroxylase) in Escherichia coli / T.V. Tsoi [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. – 1991. – V. 81. – P. 165–170]. Бактерии, выращенные на агаризованной минеральной среде К1 (для создания плотной среды вносили агар в концентрации 1,5%) с внесением в качестве источника углерода бензойной кислоты в концентрации 0,5 г/л в течение 72 часов, суспендированные в физиологическом растворе, вносят в среду культивирования до конечной концентрации 1.0×104 клеток/мл. Гидроксибензойные кислоты (4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот) (99,5%, «Sigma-Aldrich», США) вносят индивидуально или в смеси в концентрации 1000мг/л в виде водного раствора, при необходимости уравновешенного гидроксидом натрия до нейтрального значения рН (рН 7.0). В качестве контроля используют стерильный раствор гидроксибензойных кислот в минеральной среде К1 для оценки абиотической деградации. Продолжительность процесса биодеструкции гидроксибензойных кислот составляет 5-7 сут. Оптическую плотность (ОП) суспензии клеток определяют с помощь спектрофотометра Bio-Spec-mini («Shimadzu», Япония) при длине волны 600 нм, длине оптического пути кварцевой кюветы 1,0 см, объем кюветы 4 мл. Для обнаружения остаточных гидроксибензойных кислот и их возможных метаболитов культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток центрифугированием (9660 g в течение 10 мин на центрифуге 3К30 «Sigma Sartorius», Германия) и анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-20AD Prominance («Shimadzu», Япония) с колонкой С-18 (150х4,6 мм, «Sigma-Aldrich», США) и УФ-детектором SPD-20A («Shimadzu», Япония) при длине волны 205 нм. В качестве элюента используют систему ацетонитрил–0,1%-ная Н3РО4 (60:40). Качественное определение гидроксибензойных кислот и их возможных метаболитов проводят по сравнению времени удержания на колонке исследуемых соединений и стандартных соединений (4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот, катехол в виде водных растворов в концентрации 100 мг/л). Количественное определение гидроксибензойных кислот проводят по сравнению площади пиков на хроматограмме исследуемых и стандартных соединений (4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот в виде водных растворов в концентрации 100 мг/л).

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Биодеградацию 4-гидроксибензойной кислоты проводят с использованием клеток R. ruber P25 (ИЭГМ 896) в 100 мл минеральной среды, содержащей источники азота, фосфора и минеральные соли при постоянном перемешивании (140 об/мин) и при 28°С. 4-гидроксибензойную кислоту(1000 мг/л) вносят одновременно с инокулятом в виде водного раствора с рН 7.0. Количество остаточной 4-гидроксибензойной кислоты контролируют методом ВЭЖХ. Полная биодеградация 4-гидроксибензойной кислоты в концентрации 1000 мг/л регистрируется через 5 сут, после внесения кислоты.

Пример 2.

Способ осуществляется по примеру 1, но вносят 3,4-дигидроксибензойную кислоту в концентрации 1000 мг/л. Полная биодеградация 3,4-дигидроксибензойной кислоты регистрируется на 5 сут после внесения кислоты.

Пример 3.

Способ осуществляется по примеру 1, но вносят 2,5-дигидроксибензойную кислоту в концентрации 1000 мг/л. Полная биодеградация 2,5-дигидроксибензойной кислоты регистрируется на 6 сут после внесения кислоты.

Пример 4.

Способ осуществляется по примеру 1, но вносят смесь 4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот в концентрации 1000 мг/л. Полная биодеградация смеси кислот наступает через 6 сут после внесения данной смеси.

Пример 5.

Способ осуществляется по примеру 4, но культивирование проводят при 32°С. Полная биодеградация смеси гидроксибензойных кислот регистрируется через 7 сут после внесения данной смеси кислот.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к разрушению гидроксилированных бензойных кислот с помощью микроорганизмов. Способ биодеградации гидроксибензойных кислот предусматривает взаимодействие 4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот в концентрации 1000 мг/л с клетками штамма Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) в жидкой минеральной среде без дополнительных источников углерода. Предлагаемый способ обеспечивает биодеградацию моно- и дигидроксилированных бензойных кислот высокой концентрации, образующихся как продукт разложения внутриклеточных соединений и стойких органических загрязнителей до безопасных соединений. 5 пр.

Способ биодеградации гидроксибензойных кислот, предусматривающий взаимодействие 4-гидроксибензойной, 3,4-дигидроксибензойной, 2,5-дигидроксибензойной кислот в концентрации 1000 мг/л с клетками штамма Rhodococcus ruber P25 (ИЭГМ 896) в жидкой минеральной среде без дополнительных источников углерода.