ПРИМЕНЕНИЕ N-(2-ОКСО-6-(3,4,5-ТРИМЕТОКСИФЕНИЛ)-2H-ПИРАН-3-ИЛ)БЕНЗАМИДА В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОМИКРОБНОГО СРЕДСТВА Российский патент 2023 года по МПК C07D309/38 A61K31/35 A61P31/04 

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса пиран-2-онов, а именно к N-(2-оксо-6-(3,4,5-триметоксифенил)-2Н-пиран-3-ил)бензамиду (1):

Данное соединение обладает противомикробной активностью в отношении золотистого стафилокока (S.aureus) и кишечной палочки (E.coli) что позволяет предположить его использование в медицине в качестве противомикробного средства.

Известен структурный аналог заявляемым соединениям - (S,E)-6-(4-гидрокси-3-оксопент-1-ен-1-ил)-2H-пиран-2-он (2) выделенный из Полыни арги (Artemisia argyi) обладающий умеренным противомикробным действием(Gu Н, Zhang S., Liu L., Yang Z., Zhao F., Tian Y. Antimicrobial Potential of Endophytic Fungi From Artemisia argyi and Bioactive Metabolites From Diaporthe sp.AC1. // Frontiers in Microbiology - 2022. - 13, 908836.).(Таблица 1).

Эталоном сравнения был выбран фенилсалицилат формулы 3:

который широко применяется в лечебной практике, и являются аналогами по действию [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Новая волна», 2010 - с. 472].

Задачей изобретения является поиск веществ с выраженным противомикробным и действием, и низкой токсичностью.

Пример 1. Заявляемое соединение 1 синтезируется в 2 стадии, включающих в себя взаимодействие 3,4,5-триметоксиацетофенона 4 с диметилформамид-диметилацеталем с получением соответствующего (Е)-3-(диметиламино)-1-(3,4,5-триметоксифенил)проп-2-ен-1-она 5, взаимодействие соединения 5 с гиппуровой кислотой в присутствии уксусного ангидрида с образованием соответствующего N-(2-оксо-6-(3,4,5-триметоксифенил)-2H-пиран-3-ил)бензамида 1.

Получение соединения 1. Стадия 1. 3,4,5-Триметоксиацетофенон 4 (1,0 экв.) и диметилацеталь N,N-диметилформамида (DMF-DMA) (2,0 экв.) кипятили с обратным холодильником до тех пор, пока исходные материалы не были израсходованы. За протеканием реакции следили с помощью метода тонкослойной хроматографии. По завершении реакции, реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Все летучие компоненты удаляли при пониженном давлении и полученный (Е)-3-(диметиламино)-1-(3,4,5-триметоксифенил)проп-2-ен-1-она 5 в дальнейшем синтезе использовали без дополнительной очистки. Выход 95%. Стадия 2. Эквимолярное количество гиппуровой кислоты и (Е)-3-(диметиламино)-1-(3,4,5-триметоксифенил)проп-2-ен-1-она 5 нагревали при 90°С необходимое количество времени. По истечении заданного времени уксусный ангидрид отгоняли при пониженном давлении. Остаток растворяли в CHCl₃ и остатки уксусного ангидрида нейтрализовали насыщенным водным раствором NaHCO₃, промывали водой и насыщенным водным раствором NaCl. Органический слой отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄. Растворитель упаривали при пониженном давлении и полученный неочищенный остаток очищали с помощью перекристаллизации из этанола. Выход 87%. C₁₆H₂₂O₂. Спектр ЯМР ¹H, (400 МГц, CDCl₃), δ, м.д.: ¹Н NMR (400 MHz, CDCl₃), δ, м.д.: 8.73 (с, 1Н), 8.56 (д, J=7.7 Hz, 1Н), 7.93 (д, 2Н), 7.60 (т, 1Н), 7.53 (т, 2Н), 7.03 (с, J=6.9 Hz, 2Н), 6.73 (д, J=6.8 Hz, 3Н), 3.96 (с, 6Н), 3.92 (с, 3Н). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, CDCl₃), δ, м.д.:166.0, 159.66, 153.75, 140.42, 133.72, 132.44, 128.92, 127.14, 126.56, 124.38, 123.88, 102.71, 101.84, 60.96, 56.44, 14.3. Полученное соединение 1 представляет собой желтое кристаллическое вещество, растворимое в хлороформе, ацетоне, этилацетате.

Пример 2. Определение антимикробной активности проводили методом двукратных серийных разведений [Першин Г.Н. «Методы экспериментальной химиотерапии, 1971, с. 109] на музейных тест - культурах: Staphylococcus aurous, штамм 906; Escherichia coli, штамм 1257 (ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», г. Москва). В опытах использовали 18 часовые агаровые тест - культуры (5*10⁵ микробных тел в 1 мл среды). Для исследования брали растворы соединения 1 в диметилформамиде (ДМФА).

Максимальная из испытанных концентраций была 1000 мкг/мл. Пробирки инкубировали при 37°C с последующим высевом через 20 часов и 7 суток в пробирки со скошенным мясопептонным агаром. Учет результатов проводили по наличию и характерному росту культур микроорганизмов на питательной среде. (Таблица 1.)

Пример 3 Цитотоксичность определяли по отношению HEK-293 (эмбриональные клетки почки человека). Линии клеток HEK-293 (эмбриональные клетки почки человека) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в качестве антибиотика при 37°С и 5% CO₂ во влажной атмосфере. Цитотоксичность синтезированного соединения определяли с помощью МТТ-теста [1]. Суспензии клеток в концентрации 1×104 клеток/200 мкл высевали в 96-луночный планшет (SPL Life Sciences, Корея) и культивировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂ в инкубаторе 460-СЕ (Thermo Fisher Scientific, США). Через 24 часа инкубации к культурам клеток добавляли исследуемые соединения, растворенные в ДМСО, в диапазоне концентраций от 3,125 до 100 мкмоль⋅л^-1. После добавления соединения клетки культивировали в указанных выше условиях. В качестве контроля использовали лунки с добавлением ДМСО, конечная концентрация которого не превышала 1% и не была токсична для клеток. Выживаемость клеток оценивали через 72 часа инкубации с исследуемым соединением путем добавления 20 мкл раствора МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дидифенил тетразолия бромид, 5 мг/мл) в каждую лунку. После инкубирования клеток с раствором МТТ в течение 4 часов, среду из планшетов удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного спектрофотометра FLUOstar Optima (BMG Labtech, Германия) определяли оптическую плотность при 544 нм. Данные сравнивали с отрицательным контролем (1% раствор ДМСО), в качестве положительного контроля служил доксорубицин (Tocris Bioscience, США). Значение 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) определяли на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0.

Как видно из таблицы, заявляемое соединение 1 превышает по противомикробной активности препарат сравнения (Фенилсалицилат) и наиболее близкий структурный аналог. И не воздействует на здоровые клетки человека. Таким образом, N-(2-оксо-6-(3,4,5-триметоксифенил)-2Н-пиран-3-ил)бензамид проявляет более высокую активность, что делает возможным использовать его для создания новых лекарственных средств, целенаправленного действия.

Настоящее изобретение относится к применению N-(2-оксо-6-(3,4,5-триметоксифенил)-2H-пиран-3-ил)бензамида в качестве противомикробного средства:

. Технический результат - средство, обладающее противомикробной активностью в отношении золотистого стафилококка. 1 табл., 3 пр.

Применение N-(2-оксо-6-(3,4,5-триметоксифенил)-2H-пиран-3-ил)бензамида в качестве противомикробного средства: