Антитела, связывающиеся с протофибриллами α-синуклеина Российский патент 2023 года по МПК C07K16/18 A61K39/395 A61P25/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №63/044881, поданной 26 июня 2020 года, и предварительной заявки на патент США №63/071150, поданной 27 августа 2020 года, содержание каждой из которых во всей своей полноте включено посредством ссылки в настоящий документ.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

В настоящий документ посредством ссылки во всей полноте включен перечень последовательностей, озаглавленный Sequence_Listing_AVR-71925_ST25.txt, включающий от SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO: 20, который содержат нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем описании. Перечень последовательностей был представлен в электронном виде в текстовом формате ASCII посредством EFS. Перечень последовательностей был впервые создан 17 июня 2021 года и имеет размер 18 417 байт.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В международной патентной заявке WO2011/104696 А1 (которая включена в настоящий документ посредством ссылки) раскрыто мышиное моноклональное IgG-антитело mAb47, которое связывается с протофибриллярными формами α-синуклеина. Сохраняется потребность в антителах, селективно связывающихся с протофибриллярными формами α-синуклеина, которые пригодны для применения у людей.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам, обладающим высокой аффинностью к протофибриллам α-синуклеина человека и низкой аффинностью к мономерам α-синуклеина. В некоторых воплощениях описанные здесь антитела селективно нацелены на агрегаты человеческого α-синуклеина, такие как олигомеры/протофибриллы, с намного более сильным связыванием с протофибриллами α-синуклеина по сравнению с мономером. В некоторых воплощениях описанные здесь антитела обладают лучшей селективностью, чем mAb47, при сравнении соотношений связывания протофибрилл α-синуклеина с мономерами α-синуклеина. В некоторых воплощениях описанные здесь антитела представляют собой антитела к α-синуклеину.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к BAN0805, моноклональному антителу, содержащему тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, которое селективно нацелено на агрегаты человеческого α-синуклеина, такие как олигомеры/протофибриллы с высокой аффинностью к протофибриллам человеческого α-синуклеина и с низкой аффинностью к мономерам α-синуклеина. Интересно, что BAN0805 также демонстрирует более низкое связывание мономера α-синуклеина, чем mAb47, что приводит к лучшей селективности в отношении BAN0805, чем в отношении mAb47 при сравнении соотношений связывания протофибрилл и мономера α-синуклеина. Кроме того, связывание с мономером β- и γ-синуклеина или Аβ-протофибриллами не было обнаружено для BAN0805.

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителам для улучшения лечения нейродегенеративных расстройств с патологией α-синуклеина, включающих, без ограничения ими, болезнь Паркинсона (PD).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии этой публикации патента или патентной заявки с цветным рисунком(ами) будут предоставлены Ведомством по запросу и уплате необходимой пошлины.

На Фиг. 1 показаны данные о тепловом стрессе для BAN0805. Образцы очищенных антител-кандидатов в концентрации 1 мг/мл подвергали воздействию температур а) 4°С, б) 25°С, в) 37°С и г) 50°С в течение двух недель. Образцы затем анализировали посредством SEC-MALS (комбинация эксклюзионной хроматографии с многоугольным светорассеянием) для проверки на агрегацию. Данные свидетельствуют об отсутствии проблем с агрегацией у BAN0805 из-за теплового стресса.

На Фиг. 2 показано ингибирование ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) со значениями IC₅₀ для BAN0805 при связывании с мономерами и протофибриллами (PF) α-синуклеина. BAN0805 имеет в 910 раз улучшенную селективность в отношении протофибриллярной формы α-синуклеина по сравнению с mAb47, которое имеет только 340-кратную селективность (не показано). Уровень протофибрилл выражали как эквивалент уровню мономера в концентрации, и размер протофибрилл не учитывали. Кратную селективность рассчитывали путем деления значения IC₅₀ для связывания мономера на значение IC₅₀ для связывания PF.

На Фиг. 3 показано связывание и селективность для BAN0805 по сравнению с mAb47 с использованием Biacore SPR (поверхностный плазмонный резонанс). Значения K_D (константа диссоциации) для протофибрилл α-синуклеина были аналогичными для mAb47 и BAN0805, показывая, что модификация mAb47 не влияет на прочность связывания с протофибриллой α-синуклеина, подтверждая результаты, полученные при ингибировании ELISA. Значения K_D, измеренные с помощью SPR, показали 110000-кратную и 18000-кратную селективность в отношении PF по сравнению с мономером для BAN0805 и mAb47 соответственно. Показаны репрезентативные сенсограммы для mAb47 и BAN0805 при SPR-измерениях на Biacore 8К.

На Фиг. 4 показана перекрестная реактивность BAN0805, здесь упоминаемого как hu47-IgG4, с мономером α-синуклеина, мономером β-синуклеина, мономером γ-синуклеина и Аβ-протофибриллой с использованием ингибирования ELISA. Результат показал отсутствие выявляемого связывания с мономером β- или γ-синуклеина или Аβ-протофибриллой.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к антителам, обладающим высокой аффинностью к протофибриллам человеческого α-синуклеина и низкой аффинностью к мономерам α-синуклеина.

Как показано здесь, настоящее изобретение относится к следующим воплощениям.

Воплощение 1. Антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

Воплощение 2. Антитело из воплощения 1, где антитело относится к изотипу IgG.

Воплощение 3. Антитело из воплощения 1, где антитело относится к изотипу IgG4.

Воплощение 4. Антитело по любому из воплощений 1-3, где антитело имеет значение K_D связывания протофибриллярной формы α-синуклеина, которое по меньшей мере в 110,000 раз меньше, чем значение K_D для связывания формы мономера α-синуклеина.

Воплощение 5. Антитело по любому из воплощений 1-3, где антитело имеет значение K_D для связывания протофибриллярной формы α-синуклеина не более 18 пМ и значение K_D для связывания с мономерной формой α-синуклеина, составляющее по меньшей мере 2200 нМ.

Воплощение 6. Антитело по любому из воплощений 4 или 5, где K_D указанного антитела для связывания с протофибриллярной формой α-синуклеина и K_D указанного антитела для связывания с мономерной формой α-синуклеина измеряют с помощью SPR.

Воплощение 7. Антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Воплощение 8. Антитело по воплощению 7, где антитело содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи.

Воплощение 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4.

Воплощение 10. Нуклеиновая кислота по воплощению 9, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-14 и 17-20.

Воплощение 11. Одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих антитело по любому из воплощений 1-8.

Воплощение 12. Одна или более нуклеиновых кислот по воплощению 11, где

(а) одна или более нуклеиновых кислот содержит последовательности SEQ ID NO: 11 и 12,

(б) одна или более нуклеиновых кислот содержит последовательности SEQ ID NO: 13 и 14,

(в) одна или более нуклеиновых кислот содержит последовательности SEQ ID NO: 17 и 18, или

(г) одна или более нуклеиновых кислот содержит последовательности SEQ ID NO: 19 и 20.

Воплощение 13. Один или более вектор(ов), содержащих нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по любому из воплощений 9, 10, 11 или 12.

Воплощение 14. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую(ые) кислоту(ы) по любому из воплощений 9- 12.

Воплощение 15. Клетка-хозяин, содержащая один или более вектор(ов) по воплощению 13.

Воплощение 16. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело по любому из воплощений 1-8.

Воплощение 17. Композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело по любому из воплощений 1-8, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном аспекте настоящее описание относится к антителу, имеющему высокую аффинность к протофибриллам человеческого α-синуклеина и низкую аффинность к мономерам α-синуклеина и содержащему тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении представленные здесь антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном воплощении представленные здесь антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В некоторых воплощениях представленные здесь антитела содержат две тяжелые цепи и две легкие цепи.

В одном воплощении описанное в настоящем документе антитело относится к изотипу IgG, в частности к изотипу IgG человека. В другом воплощении антитело относится к изотипу IgG4.

В рамках настоящего изобретения высокая аффинность к протофибриллам человеческого α-синуклеина относится к константе диссоциации K_D менее 10^-7М для протофибрилл человеческого α-синуклеина. Соответственно, в одном воплощении описанные в настоящем описании антитела имеют K_D менее 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11 М или 10^-12 М для протофибрилл α-синуклеина человека. В конкретных воплощениях антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и имеют K_D от 11,2 до 25,8 пМ для протофибрилл α-синуклеина человека.

В другом воплощении антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и имеют низкую аффинность к мономеру α-синуклеина человека. Например, K_D описанных в настоящем документе антител для связывания с мономерной формой α-синуклеина составляет по меньшей мере 1500 нМ, по меньшей мере 1600 нМ, по меньшей мере 1700 нМ, по меньшей мере 1800 нМ, по меньшей мере 1900 нМ, по меньшей мере 2000 нМ, по меньшей мере 2100 нМ, по меньшей мере 2200 нМ, по меньшей мере 2300 нМ, по меньшей мере 2400 нМ, по меньшей мере 2500 нМ, по меньшей мере 2600 нМ, по меньшей мере 2700 нМ, по меньшей мере 2800 нМ, по меньшей мере 2900 нМ или по меньшей мере 3000 нМ. В конкретных воплощениях антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и имеют K_D от 1650 нМ до 2730 нМ для мономера α-синуклеина человека.

В одном воплощении антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и имеют более чем 80000-кратную, более чем 90000-кратную, более чем 100000-кратную, более чем 110000-кратную или более чем 120000-кратную селективность к протофибрилле α-синуклеина человека по сравнению с мономерным α-синуклеином. В конкретных воплощениях антитела содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и имеют 64000 - 244000-кратную селективность к протофибрилле α-синуклеина человека, чем к мономерному α-синуклеину.

В одном воплощении эти аффинности связывания измеряют с использованием ингибирования ELISA, например, как описано в примере 3. В другом воплощении эти аффинности связывания измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR), например, как описано в примере 3.

В другом аспекте, в настоящем изобретении предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. Нуклеиновая кислота может содержать последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11-14 и 17-20.

В другом аспекте, в настоящем изобретении предложены одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих антитело по изобретению. В одном воплощении эти одна или более нуклеиновых кислот содержат последовательности SEQ ID NO: 11 и 12. В другом воплощении одна или более нуклеиновых кислот содержат последовательности SEQ ID NO: 13 и 14. В одном воплощении одна или более нуклеиновых кислот содержат последовательности SEQ ID NO: 17 и 18. В одном воплощении одна или более нуклеиновых кислот содержат последовательности SEQ ID NO: 19 и 20.

В другом аспекте, в настоящем изобретении предложены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4. Такие векторы включают, без ограничения ими, клонирующие векторы или экспрессирующие векторы. В одном аспекте предложены один или более векторов, кодирующих антитело по изобретению. В одном воплощении один или более векторов содержат последовательности SEQ ID NO: 11 и 12. В другом воплощении один или более векторов содержат последовательности SEQ ID NO: 13 и 14. В одном воплощении один или более векторов содержат последовательности SEQ ID NO: 17 и 18. В одном воплощении один или более векторов содержат последовательности SEQ ID NO: 19 и 20.

В другом аспекте, в настоящем изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, которые кодируют по меньшей мере один полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4. В одном воплощении клетки-хозяева содержат нуклеиновую(ые) кислоту(ы), кодирующую антитело по изобретению. Клетки-хозяева, описанные здесь, могут быть клетками млекопитающих, такими как В-клетки, гибридомы или клетки СНО (яичник китайского хомячка). В одном воплощении описанные здесь клетки- хозяева представляют собой человеческие клетки.

В другом аспекте, в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Образование кандидатов в антитела

Исходные варианты mAb47 были получены посредством прямой прививки mAb47 CDR в человеческие каркасные последовательности и создания обратных мутаций к остаткам из мышиной последовательности в различных положениях. Ни один из исходных вариантов не показал необходимых свойств связывания с α-синуклеином. Таким образом, была создана и проанализирована новая модель, позволяющая найти больше возможных мутаций для создания новых вариантов.

При второй попытке улучшить mAb47, были проверены менее вероятные остатки, которые взаимодействуют с мишенью, и были проверены остатки, расположенными на расстоянии 4А от установленных CDR. Был получен вариант антитела, имеющий последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 3 и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 4, и назван как BAN0805. Было обнаружено, что обратные мутации V71K и R94K, при одновременном присутствии в BAN0805, являются критическими для связывающей способности этих антител, поскольку их удаление в других вариантах приводит к потере связывания.

Поскольку BAN0805 имеет на одну обратную мутацию меньше, чем сопоставимый вариант, и показал большее связывание и селективность в отношении протофибрилл, чем мономеров, BAN0805 был выбран в качестве основного кандидата.

Пример 2 - Характеристика антител-кандидатов

Для определения термической стабильности антитела подвергали воздействию более высоких температур в течение 10 минут, охлаждали до 4°С и использовали в анализе ELISA с концентрацией EC₈₀ каждого кандидата (обычно 5-50 нг/мл). BAN0805 был стабилен, сохраняя свою способность к связыванию с α-синуклеином вплоть до 75°С, когда она начинает уменьшаться, в то время как связывание химерного мышиного антитела с47 или cmAb47 (химер, объединяющих человеческий IgG4 и вариабельный участок mAb47) ранее резко падало при температуре примерно 5°С.

Для того, чтобы определить температуру плавления антител, cmAb47 тестировали по сравнению с BAN0805 в анализе теплового сдвига. Данные по температуре плавления указывают, что Тm для BAN0805 была рассчитана как 65-65,4°С, что ниже температуры для химерного антитела, составляющей 70°С.

Кроме того, очищенные образцы с концентрацией 1 мг/мл вводили при скорости 0,4 мл/мин на эксклюзионную колонку в системе ВЭЖХ и анализировали посредством многоугольного светорассеяния для определения абсолютных молярных масс и проверки на агрегацию. Данные свидетельствовали об отсутствии проблем с агрегацией у BAN0805. BAN0805 было монодисперсным (Mw/Mn<1,05). Извлечение по массе составляло 100% (рассчитанная масса по сравнению с введенной массой), что свидетельствовало о хорошем извлечении белка.

Хроматография перекрестного взаимодействия с использованием всей массы очищенного поликлонального IgG человека представляет собой метод мониторинга неспецифических белок-белковых взаимодействий и может быть использована для различения растворимых и нерастворимых антител. Повышенный индекс удерживания (k') указывает на склонность к самовзаимодействию и низкую растворимость. BAN0805 продемонстрировал индекс удерживания, равный 0,025, который ниже индекса 0,035 для антитела cmAb47, что указывает на низкую склонность к неспецифическим взаимодействиям и хорошую растворимость.

Для анализа стресса при замораживании/оттаивании образцы очищенных антител-кандидатов в количестве 1 мг/мл подвергали 10 циклам замораживания по 15 минут при -80°С с последующим размораживанием в течение 15 минут при комнатной температуре. Для анализа термоиндуцированного стресса образцы очищенных антител-кандидатов в количестве 1 мг/мл подвергали воздействию температур а) 4°С, б) 25°С, в) 37°С и г) 50°С в течение двух недель. Затем образцы анализировали посредством SEC-MALS для проверки агрегации. Данные свидетельствуют о том, что стресс при циклах замораживания-оттаивания и нагревании не вызывают агрегации BAN0805. Смотрите Фиг. 1.

BAN0805 анализировали и сравнивали с ближайшей зародышевой линией (IGVH4-59*03/IGHJ3*01 для НК и IGVK2-28*01/IGKJ2*02 для КА) в соответствии с определениями IMGT CDR и программой DomainGapAlign. Общая идентичность с зародышевой линией человека составляла 86,5% для легкой цепи, при этом значения выше порогового значения 85% следует считать гуманизированным для этого анализа. Для тяжелой цепи после прививки CDR и введения двух мышиных обратных мутация процент идентичности с зародышевой линией человека снижался до чуть менее 81%. Это можно объяснить тем фактом, что IMGT CDR2 значительно короче, чем используемое здесь определение по Кабат, что приводит к вставке большего количества мышиных остатков в начале рамки 3.

Пример 3 - Селективное связывание BAN0805 с протофибриллами α-синуклеина человека

Селективность связывания BAN0805 с протофибриллами α-синуклеина человека измеряли как посредством ингибирования ELISA, так и при помощи поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Значения IC₅₀ для протофибрилл α-синуклеина были очень похожими для mAb47 и BAN0805 (2,7 нМ и 2,2 нМ соответственно), показывая, что характеристики связывания с протофибриллой не изменяются после гуманизации. В отличие от этого, связывание с мономером α-синуклеина изменяется, приводя к уменьшенной силе связывания BAN0805 с мономером α-синуклеина. Это приводит к лучшей селективности в отношении протофибриллы α-синуклеина по сравнению с мономером для BAN0805 (в 910 раз) в отличие от mAb47 (в 340 раз). Смотрите Фиг. 2.

Однако из-за пределов обнаружения было невозможно еще в большей степени снизить концентрацию антител, чтобы сделать возможным определение еще более низких значений IC₅₀ и, следовательно приблизиться к "истинному" значению IC₅₀. Следовательно, представленные значения IC₅₀ были получены в соответствии с имеющейся на данный момент процедурой ингибирования ELISA, которую применяли для всех партий mAb47 и BAN0805, с учетом того, что значения IC₅₀ для протофибриллы, по-видимому, являются завышенными (то есть сила связывания, по-видимому, занижена). Более точное связывание и, следовательно, селективность получали с использованием SPR, как описано ниже.

Селективность связывания mAb47 и BAN0805 была подтверждена посредством SPR с использованием инструмента Biacore 8К (GE Healthcare). Из-за технических проблем, вызванных сложностью целевого антигена в комбинации с ярко выраженной зависимостью авидности антител, использовали разные настройки в анализе для оценки связывания протофибрилл и мономера α-синуклеина соответственно. Для измерений связывания с мономером чип был покрыт анти-мышиным или античеловеческим антителом к mAb47 и BAN0805 соответственно. Затем 0,25-1,5 мкг/мл mAb47 или BAN0805 были захвачены на поверхности с последующим инъецированием 5-кратного разбавления мономера α-синуклеина с кинетикой одного цикла. Для измерения связывания с протофибриллой (PF), чип покрывали 0,5 мкг/мл PF и 2-кратно разведенные mAb47 или BAN0805 инъецировали с использованием кинетики с одним циклом. Типичные сенсограммы для mAb47 и BAN0805 показаны на Фиг. 3.

Значения K_D для протофибриллы α-синуклеина были похожими для mAb47 и BAN0805, показывая, что модификация mAb47 не влияет на прочное связывание с протофибриллой α-синуклеина (Таблица 1), что подтверждено результаты ингибирования ELISA. Однако значения K_D находились в диапазоне пМ, что подтверждает вышеупомянутые ограничения при ингибировании ELISA. Важно отметить, что SPR подтвердил, что аффинность BAN0805 к мономеру α-синуклеина была снижена по сравнению с mAb47. Значения K_D, измеренные с помощью SPR, приводят к 110000-кратной и 18000-кратной селективности в отношении PF по сравнению с мономером для BAN0805 и mAb47 соответственно. Средние значения K_D для mAb47 и BAN0805 для мономера и протофибрилла α-синуклеина показаны в Таблице 1.

Перекрестная реактивность гомологичных белков, таких как β- или γ-синуклеин, и других белков, склонные к агрегации, таких как Аβ, была протестирована с использованием прямого ELISA (где плотное покрытие имитирует агрегированные формы белка с покрытием), а также ингибирования ELISA. При этом, перекрестную реактивность mAb47 и BAN0805 анализировали параллельно с ингибированием ELISA. Ингибирование ELISA выполняли с мономером β-синуклеина, мономером γ-синуклеина и Аβ-протофибриллой в качестве антигенов. Результат показывает, что не было никакого обнаруживаемого связывания BAN0805 с мономером β- или γ-синуклеина или с Аβ-протофибриллой. Показательный тест перекрестной реактивности BAN0805 с β- или γ-синуклеином при ингибировании ELISA показан на Фиг. 4. Данные представлены в Таблице 2.

Результаты ингибирования ELISA и данные поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore показали, что аффинность BAN0805 к мономеру α-синуклеина была пониженной по сравнению с mAb47, что указывает на лучшую селективность BAN0805 по сравнению с mAb47. Кроме того, для BAN0805 не наблюдается связывания с мономером β- и γ-синуклеина или Аβ-протофибриллами при тестируемых концентрациях (вплоть до мкМ диапазона).

Таким образом, настоящее раскрытие относится к антителу, имеющему высокую аффинность к протофибриллам α-синуклеина и низкую аффинность к мономерам α-синуклеина и имеющему следующие характеристики по сравнению с мышиным mAb47:

(1) BAN0805 имеет более прочное связывание с протофибриллами α-синуклеина по сравнению с мономером;

(2) Данные как по ингибированию ELISA, так и по SPR Biacore показали, что связывание с мономером α-синуклеина было прочнее у mAb47 по сравнению с BAN0805, что приводит к лучшей селективности для BAN0805, чем для mAb47 при сравнении соотношений связывания протофибриллы с мономером α-синуклеина (то есть BAN0805 имеет более низкую тенденцию к связыванию с нежелательной мишенью мономером α-синуклеина по сравнению с mAb47); и

(3) не наблюдается связывание с мономерами β- и γ-синуклеина или с Аβ-протофибриллами при тестируемых концентрациях (вплоть до диапазона мкМ) для BAN0805.

Пример 4 - Получение BAN0805

Для получения BAN0805 оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие BAN0805 VH (SEQ ID NO: 13) и VL (SEQ ID NO: 14), включающие сигнальные пептиды были синтезированы и клонированы в GS векторы рХС-IgG4Pro(deltaK) и рХС-Карра (Lonza) соответственно. Полученные НС и LC SGVs затем использовали для получения вектора с двумя генами (DGV), содержащего и НС, и LC гены. Оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC) BAN0805 представлены в SEQ ID NO: 11 и 12 соответственно. Оптимизированные последовательности ДНК, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) BAN0805 представлены в SEQ ID NO: 13 и 14 соответственно. Все SEQ ID NO: 11-14 включают нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид (смотрите Таблицу 3В). Нуклеотидные последовательности, соответствующие аминокислотным последовательностям для BAN0805 НС, LC, VH и VL, с исключением сигнального пептида, представлены в SEQ ID NO: 17, 18, 19 и 20 соответственно. CDR последовательности BAN0805 представлены в Таблице 3А. Аминокислотные последовательности CDR тяжелой цепи (VH-CDR) 1-3 согласно системе нумерации Чотия представлены в SEQ ID NO: 5, 6 и 7 соответственно. Аминокислотные последовательности CDR тяжелой цепи (VH-CDR) 1-3 согласно системе нумерации Кабат представлены в SEQ ID NO: 15, 16 и 7 соответственно. Аминокислотная последовательность CDR тяжелой цепи (VH-CDR-3) согласно системам нумерации Чотия и Кабат является одинаковой и представлена в SEQ ID NO: 7. Аминокислотные последовательности CDR легкой цепи (VL-CDR) 1-3 согласно системам нумерации Чотия и Кабат являются одинаковыми и представлены в SEQ ID NO: 8, 9 и 10 соответственно.

Полученный DGV, обозначенный как pBAN0805/DGV, затем временно трансфицировали в клетки CHOK1SV GS-KO и культивировали в условиях, которые приводят к секреции собранного антитела. Затем секретируемое антитело очищали посредством аффинной хроматографии с помощью Протеина А.

В Таблице 3А представлены подчеркнутые последовательности, как последовательности CDR согласно системе нумерации Чотия, а выделенные жирным шрифтом последовательности, как последовательности CDR согласно системе нумерации Кабат. CDR1, CDR2 и CDR3 показаны обычном порядке слева (N-конец) направо (С-конец).

В. Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи BAN0805

Подчеркнуты последовательности, кодирующие сигнальный пептид. Инициирующие кодоны выделены жирным шрифтом, а терминирующие кодоны выделены курсивом.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BioArctic AB

<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ПРОТОФИБРИЛЛАМИ альфа-СИНУКЛЕИНА

<130> AVR-71925

<150> 63/071,150

<151> 2020-08-27

<150> 63/044,881

<151> 2020-06-26

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 118

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> BAN0805 VH

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Leu Leu Arg Ser Val Gly Gly Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> BAN0805 VL

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 444

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Тяжелая цепь BAN0805

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Leu Leu Arg Ser Val Gly Gly Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Легкая цепь BAN0805

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Asn

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH-CDR-1 BAN0805 (Чотия)

<400> 5

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH-CDR-2 BAN0805 (Чотия)

<400> 6

Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH-CDR-3 BAN0805 (Кабат/Чотия)

<400> 7

Leu Leu Arg Ser Val Gly Gly Phe Ala Asp

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VL-CDR-1 BAN0805 (Кабат/Чотия)

<400> 8

Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Asn Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VL-CDR-2 BAN0805 (Кабат/Чотия)

<400> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VL-CDR-3 BAN0805 (Кабат/Чотия)

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 11

<211> 1395

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген HC BAN0805 с сигнальной последовательностью

<400> 11

atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactctcag

60

gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagcctt ccgaaacact gtctctgacc

120

tgcaccgtgt ccggcttctc cctgacatct tatggggtgc actggatcag acagcctcca

180

ggcaaaggcc tggaatggat cggagtgatt tggagaggcg gctccaccga ttactccgcc

240

gccttcatgt cccggctgac catctctaag gacacctcca agaaccaggt gtccctgaag

300

ctgtcctctg tgaccgctgc tgataccgcc gtgtactact gtgccaagct gctgagatct

360

gtcggcggct ttgctgattg gggccagggc acaatggtca ccgtgtctag cgcttctaca

420

aagggcccaa gcgtgttccc cctggccccc tgctccagaa gcaccagcga gagcacagcc

480

gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc

540

ggagccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagcag cggcctgtac

600

agcctgagca gcgtggtgac cgtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt

660

aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gggtggagag caagtacggc

720

ccaccctgcc ccccctgccc agcccccgag ttcctgggcg gacccagcgt gttcctgttc

780

ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgtgtggtg

840

gtggacgtgt cccaggagga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag

900

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gagcagttta acagcaccta ccgggtggtg

960

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgtaaggtc

1020

tccaacaagg gcctgccaag cagcatcgaa aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct

1080

agagagcccc aggtctacac cctgccaccc agccaagagg agatgaccaa gaaccaggtg

1140

tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc

1200

aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc acccccccag tgctggacag cgacggcagc

1260

ttcttcctgt acagcaggct gaccgtggac aagtccagat ggcaggaggg caacgtcttt

1320

agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg

1380

tccctgggct gatga

1395

<210> 12

<211> 723

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген LC BAN0805 с сигнальной последовательностью

<400> 12

atgtctgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgccagatgc

60

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc

120

atctcctgca gatcctctca gaccatcgtg cacaacaacg gcaacaccta cctggaatgg

180

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc

240

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc

300

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc

360

ttcacctttg gccagggcac caagctggaa atcaagcgta cggtggccgc tcccagcgtg

420

ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg

480

ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag

540

agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg

600

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag

660

gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgctga

720

tga

723

<210> 13

<211> 413

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген VH BAN0805 с сигнальной последовательностью

<400> 13

atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtccgtga ccaccggcgt gcactctcag

60

gttcagctgc aagagtctgg ccctggcctg gtcaagcctt ccgaaacact gtctctgacc

120

tgcaccgtgt ccggcttctc cctgacatct tatggggtgc actggatcag acagcctcca

180

ggcaaaggcc tggaatggat cggagtgatt tggagaggcg gctccaccga ttactccgcc

240

gccttcatgt cccggctgac catctctaag gacacctcca agaaccaggt gtccctgaag

300

ctgtcctctg tgaccgctgc tgataccgcc gtgtactact gtgccaagct gctgagatct

360

gtcggcggct ttgctgattg gggccagggc acaatggtca ccgtgtctag cgc

413

<210> 14

<211> 396

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген VL BAN0805 с сигнальной последовательностью

<400> 14

atgtctgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgccagatgc

60

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc

120

atctcctgca gatcctctca gaccatcgtg cacaacaacg gcaacaccta cctggaatgg

180

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc

240

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc

300

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc

360

ttcacctttg gccagggcac caagctggaa atcaag

396

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH-CDR-1 BAN0805 (Кабат)

<400> 15

Ser Tyr Gly Val His

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH-CDR-2 BAN0805 (Кабат)

<400> 16

Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Ala Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 17

<211> 1335

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген HC BAN0805

<400> 17

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc cttccgaaac actgtctctg

60

acctgcaccg tgtccggctt ctccctgaca tcttatgggg tgcactggat cagacagcct

120

ccaggcaaag gcctggaatg gatcggagtg atttggagag gcggctccac cgattactcc

180

gccgccttca tgtcccggct gaccatctct aaggacacct ccaagaacca ggtgtccctg

240

aagctgtcct ctgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgtgccaa gctgctgaga

300

tctgtcggcg gctttgctga ttggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcgcttct

360

acaaagggcc caagcgtgtt ccccctggcc ccctgctcca gaagcaccag cgagagcaca

420

gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac

480

agcggagccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg

540

tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccaa gacctacacc

600

tgtaacgtgg accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagggtgga gagcaagtac

660

ggcccaccct gccccccctg cccagccccc gagttcctgg gcggacccag cgtgttcctg

720

ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg

780

gtggtggacg tgtcccagga ggaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg

840

gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt ttaacagcac ctaccgggtg

900

gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaagagta caagtgtaag

960

gtctccaaca agggcctgcc aagcagcatc gaaaagacca tcagcaaggc caagggccag

1020

cctagagagc cccaggtcta caccctgcca cccagccaag aggagatgac caagaaccag

1080

gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag

1140

agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc cagtgctgga cagcgacggc

1200

agcttcttcc tgtacagcag gctgaccgtg gacaagtcca gatggcagga gggcaacgtc

1260

tttagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc

1320

ctgtccctgg gctga

1335

<210> 18

<211> 660

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген LC BAN0805

<400> 18

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc

60

atctcctgca gatcctctca gaccatcgtg cacaacaacg gcaacaccta cctggaatgg

120

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc

180

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc

240

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc

300

ttcacctttg gccagggcac caagctggaa atcaagcgta cggtggccgc tcccagcgtg

360

ttcatcttcc ccccaagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg

420

ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag

480

agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg

540

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag

600

gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgctga

660

<210> 19

<211> 356

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген VH BAN0805

<400> 19

caggttcagc tgcaagagtc tggccctggc ctggtcaagc cttccgaaac actgtctctg

60

acctgcaccg tgtccggctt ctccctgaca tcttatgggg tgcactggat cagacagcct

120

ccaggcaaag gcctggaatg gatcggagtg atttggagag gcggctccac cgattactcc

180

gccgccttca tgtcccggct gaccatctct aaggacacct ccaagaacca ggtgtccctg

240

aagctgtcct ctgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgtgccaa gctgctgaga

300

tctgtcggcg gctttgctga ttggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcgc

356

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> ген VL BAN0805

<400> 20

gacatcgtga tgacccagtc tccactgagc ctgcctgtga cacctggcga gcctgcttcc

60

atctcctgca gatcctctca gaccatcgtg cacaacaacg gcaacaccta cctggaatgg

120

tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc

180

tctggcgtgc ccgacagatt ttccggctct ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc

240

tccagagtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccaaggctc tcacgtgccc

300

ttcacctttg gccagggcac caagctggaa atcaag

336

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу, связывающемуся с протофибриллами α-синуклеина, а также к композиции, его содержащей. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую и/или легкую цепь вышеуказанного антитела, а также вектор и клетка, ее содеращие. Изобретение эффективно для селективного связывания с протофибриллярными формами α-синуклеина. 11 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Антитело, связывающееся с протофибриллами α-синуклеина, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

2. Антитело по п. 1, где антитело имеет изотип IgG.

3. Антитело по п. 1, где антитело имеет изотип IgG4.

4. Антитело по любому из пп. 1-3, где антитело имеет значение K_D связывания с протофибриллярной формой α-синуклеина, которое по меньшей мере в 110000 раз меньше, чем значение K_D связывания с мономерной формой α-синуклеина.

5. Антитело по любому из пп. 1-3, где антитело имеет значение K_D связывания с протофибриллярной формой α-синуклеина, составляющее не более 18 пМ, и значение K_D связывания с мономерной формой α-синуклеина, составляющее по меньшей мере 2200 нМ.

6. Антитело по любому из пп. 4 или 5, где K_D связывания указанного антитела с протофибриллярной формой α-синуклеина и K_D связывания указанного антитела с мономерной формой α-синуклеина измерено с помощью SPR (поверхностный плазмонный резонанс).

7. Антитело, связывающееся с протофибриллами α-синуклеина, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

8. Антитело по п. 7, которое содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи.

9. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 3.

10. Нуклеиновая кислота по п. 9, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 13, 17 и 19.

11. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 4.

12. Нуклеиновая кислота по п. 11, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 14, 18 и 20.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-6, которая

(а) содержит последовательности SEQ ID NO: 13 и 14, или

(б) содержит последовательности SEQ ID NO: 19 и 20.

14. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 7, 8, которая

(а) содержит последовательности SEQ ID NO: 11 и 12, или

(б) содержит последовательности SEQ ID NO: 17 и 18.

15. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту п. 13.

16. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 14.

17. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело по любому из пп. 1-6, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 13 или экспрессирующий вектор по п. 15.

18. Клетка-хозяин, экспрессирующая антитело по любому из пп. 7, 8, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 14 или экспрессирующий вектор по п. 16.

19. Композиция для связывания с протофибриллами α-синуклеина, содержащая антитело по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.