ПРИМЕНЕНИЕ 4-O-α-АРАБИНОФУРАНОЗИЛЭЛЛАГОВОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/7048 A61P7/02 C07H17/04 C07D493/04 

Изобретение относится к области фитохимии, к применению биологически активных соединений природного происхождения - класса гидролизуемых таннинов а именно 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговая кислота формулы (1):

обладающему антиагрегационной активностью, что позволяет предложить его использование в фармакологии и медицине в качестве антиагрегационного средства.

Существуют один основной способ получения гидролизуемых таннинов, известный из уровня техники - выделение из природных источников.

Известны структурные аналоги к заявляемому соединению, проявляющие антиагрегационное действие.

Антиагрегационная активность заявляемого соединения 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговая кислота ранее не была исследована.

Задачей изобретения является изыскание новых соединений, обладающих антиагрегационной активностью, и расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

Поставленная задача решается тем, что соединение 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговая кислота (1) проявляет высокую антиагрегационную активность при низкой токсичности.

Получают заявляемое соединение путем выделения из листьев морошки обыкновенной - Rubus chamaemorus L.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение заявляемого соединения (1)

Объектом исследования послужили собранные в период цветения растения и высушенные листья Rubus chamaemorus. Высушенные листья измельчались и просеивались через сито с диаметром 1 мм. 700 грамм высушенных и измельченных листьев подвергались многократной экстракции 96% этанолом (3000 мл) при комнатной температуре в течении трех дней. Полученный суммарный экстракт сгущался до объема 1.0 л после чего к нему добавляли 100 мл воды. Суммарный экстракт затем подвергался многократной жидкость-жидкостной экстракции н-гексаном. Спиртоводный остаток после добавления к нему еще 300 мл воды многократно экстрагировался дихлорметаном. Полученный после всех этапов экстракции спиртоводный остаток затем сгущали до 100 мл на ротационно-вакуумном испарителе Heidolph при 60°С и наносили на колонку с Dianion HP-20. Колонку элюировали сперва 100% водой, а затем 100% ацетоном. Объединенная фракция, собранная при элюировании колонки HP-20 100% ацетоном выпарили досуха и перерастворяли в минимальном объеме 96% этанола. Этанольный раствор затем загружали на колонку с Sephadex LH-20 и элюировали изократически 96% этанолом. Полученные подфракции анализировались методом ВЭЖХ с диодноматричным детектором и ТСХ в система БУВ (4:1:2). Фракция, содержащая 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговую кислоту в дальнейшем была подвержена препаративной ВЭЖХ, для выделения соединения в индивидуальном виде.

Характеристика метода аналитического ВЭЖХ:

Хроматографическая колонка «SUPELCOSIL» LC-18, 25см x 4.6 мм, 5 мкм. Температура анализа - 40°C. Элюент: вода (компонент А), ацетонитрил (компонент В) с содержанием ТФУ 0,1%.

Время (мин) Скорость потока (мл/мин) Концентрация компонента А (%) Концентрация компонента В (%) 0,01 1,00 95 5 5,00 1,00 95 5 45,75 1,00 0 100 50,00 1,00 0 100 60,00 1,00 95 5 65,00 1,00 95 5

Время удерживания: 19,011 мин.

Характеристика метода препаративного ВЭЖХ:

Хроматографическая колонка «Kromasil» 100-5C18, 250 x 30 мм. Скорость потока 40 мл/мин. Элюент: вода (компонент А), ацетонитрил (компонент В) с содержанием ТФУ 0,1%.

Время (мин) Скорость потока (мл/мин) Концентрация компонентаА (%) Концентрация компонента В (%) 0,00 40,000 95 5 5,00 40,000 95 5 40,00 40,000 50 50 42,00 40,000 95 5

Длина волны: 254 нм.

Ацетонитрил компании «J.T.Baker» класса ВЭЖХ.

Полученная фракция упаривалась и леофилизировалась.

Заявляемое соединение (1) представляет собой желтое кристаллическое вещество, с максимумами поглощения в УФ-спектре (λ_max) при 252 и 361 нм. Спектр HR-ESI-MS содержал пик молекулярного иона [M+H]⁺ при m/z 435.0563 (расч. 435.0564), что соответствует формуле C₁₉H₁₄O₁₂.

Данные ¹Н ЯМР-спектров соединения 1.

Положение Химический сдвиг ¹H 5-СН 7.72 (1H, s) 5'-СН 7.58 (1H, s) 1''-CH 5.62 (1H, d 1.0 Hz) 2''-CH 4.35 (1H, dd, 4.1, 1.0 Hz) 3''-CH 3.86 (1H, dd, 6.5, 4.1 Hz) 4''-CH 4.35 (1H, m) 5a''-CH 3.60 (1H, dd, 11.7, 2.7 Hz) 5b''-CH 3.48 (1H, dd, 11.7, 5.5 Hz). ¹³С 1-C 107.9 2-С 136.5 3-С 142.3 4-С 147.0 6-С 115.1 7-С 159.8 1'-C 114.1 2'-C 130.62 3'-C 140.5 4'-C 149.4 6’-C 112.2 7'-C 159.6 2''-C 86.6 3''-C 81.8 4''-C 77.1 5''-C 61.5

При установлении структуры соединения 1 применяли спектральные методы анализа. УФ-спектроскопию (СФ-2000, ОКБ Спектр, Россия), ЯМР-спектроскопию (Bruker Avance III 400 NMR Spectrometer, США) и масс-спектрометрию высокого разрешения (Bruker Micromass Q-TOF spectrometer, США).

Пример 2. Исследование влияние заявляемого соединения (I) на процессы активации и агрегации тромбоцитов

Оценка влияния соединения I на функциональную активность тромбоцитов проводилась в условиях in vitro следующим образом. Эксперименты выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 12 человек. Забор крови проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1.

Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).

Исследование влияния на процесс агрегации тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.G.V.Nature (London).-1962 .-V.194.) на агрегометре "АТ-02” (НПФ "Медтех", Россия). Определение антиагрегационной активности исследуемых веществ и препаратов сравнения проводили в конечной концентрации 1×10^-3 моль/л. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту («Ацетилсалициловая кислота», Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия, г. Барнаул).

В качестве маркера активации тромбоцитов измеряли экспрессию Р- селектина на поверхности тромбоцитов. Цитофлуориметрический анализ проводили на приборе BD FACSCanto II (США), используя оригинальное программное обеспечение. Измеряли связывание с тромбоцитами крови здоровых доноров флюорисцентно-меченых антител против СD62. Для этого образцы богатой тромбоцитами плазмы разводили в 100 раз 0,15 М фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,0-7,5), вносили исследуемые препараты и инкубировали в течение 5 минут. Для активации тромбоцитов в пробы вносили АДФ до конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию проводили в течение 15 минут, после чего клетки фиксировали добавлением 1% раствора формалина. После инкубации образцы богатой тромбоцитами плазмы окрашивали 20 минут при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами CD62, меченными APC (алофикоцианином) (Becton Dickinson, США) согласно рекомендациям производителя. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Для каждой пробы собирали не менее 10000 событий. «Тромбоцитарное окно» выделяли по параметрам прямого (FCS) и малоугольного (SSC) светорассеяний в логарифмической шкале координат. Оценивали количество позитивных клеток (%) по СD62.

Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Выявлено, что вид распределения полученных данных отличается от нормального, поэтому при дальнейшей работе использовались непараметрические методы. Данные представлены в виде медианы, 25 и 75 процентилей. Дисперсионный анализ проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.

По результатам исследования установлено, что ацетилсалициловая кислота в скрининговой концентрации 1×10^-3 моль/л проявила выраженную антиагрегационную активность, подавляя агрегацию тромбоцитов на 13,7% относительно контроля. При этом следует отметить, что ацетилсалициловая кислота не оказывает влияние на процессы реакции высвобождения тромбоцитов (латентный период) (таблица 1) и процессы активации тромбоцитов (таблица 2).

Таблица 1. Влияние соединения I и ацетилсалициловой кислоты на показатели агрегации тромбоцитов, Ме (0,25-0,75)

№ Шифр Латентный период, % к контролю Максимальная амплитуда, % к контролю Скорость агрегации, % к контролю Время достижения МА, % к контролю Соединение I +14,9 (14,1-17,8)*, ## -19,1 (16,8-20,7)**, # -13,9 (12,8-17,1)*, # -23,0 (21,6-27,9)**, ## Ацетилсалициловая кислота -2,1 (1,1-2,6) -13,7 (10,8-16,4)* -10,5 (7,6-12,3)* +10,5 (8,7-13,4)*

Примечание: *р≤0.05, **р≤0.001 - в сравнении с контролем; #р≤0.05, ##р≤0.001 - в сравнении с ацетилсалициловой кислотой; n=6.

Таблица 2. Экспрессия CD62 тромбоцитов в присутствии соединения I и ацетилсалициловой кислоты, Ме (0,25-0,75)

№ Шифр CD62АДФ- CD62АДФ+ Контроль 1,3 (1,1-1,4) 17,9 (16,5-19,3)‡‡ Соединение I 1,1 (0,8-1,3)* 1,1 (0,9-1,2)**, ‡ Ацетилсалициловая кислота 1,3 (1,1-1,4)* 16,4 (14,5-17,3)*, ‡‡

Примечание: Уровень статистической значимости различий признаков в сравнении с контролем: * - p>0,05, ** - p≤0,05; уровень статистической значимости различий признаков групп после активации АДФ: ‡ - p>0,05, ‡‡ - p≤0,05. CD62АДФ- - экспрессия CD62 до воздействия АДФ, CD62АДФ+ - экспрессия CD62 после воздействия АДФ.

Соединение I в эквимолярной концентрации подавляло АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в среднем на 19,7%, что превышает показатели активности ацетилсалициловой кислоты. Однако соединение I эффективнее ацетилсалициловой кислоты удлиняет реакцию высвобождения тромбоцитов на 14,9% и полностью ингибирует активацию тромбоцитов (экспрессия Р-селектина).

Таким образом, соединение I оказывает выраженную антиагрегационную активность, превосходящую по уровню и спектру аналоговый препарат - ацетилсалициловую кислоту.

Изобретение относится к применению биологически активных соединений природного происхождения - класса гидролизуемых таннинов, а именно к применению 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговой кислоты формулы (1) в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью. Технический результат – эффективная антиагрегационная активность 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговой кислоты, которая может найти свое применение в фармакологии и медицине в качестве антиагрегационного лекарственного средства. 2 табл., 2 пр.

Применение 4-О-α-L-арабинофуранозилэллаговой кислоты (1)

в качестве средства, обладающего антиагрегационной активностью.