СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИНКА В ЭКССУДАТЕ "КОЖНОГО ОКНА" Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно аллергологии и иммунологии, дерматовенерологии, терапии и лабораторной диагностики и может быть использовано для количественного определения уровня цинка на уровне шокового органа - в коже.

Кожа - сложный и не полностью изученный орган человеческого тела, функционально связанный с внутренними органами и отражающий их состояние, как в норме, так и при патологии. Никакая другая ткань так часто не подвергается травме и влиянию большого количества внешних факторов среды, как кожа.

Кожа является самым большим органом человеческого тела. Ее площадь может достигать 2 м², а вес составляет от 4 до 6% от всей массы тела, в среднем 4,5 кг у взрослого человека. Общее количество всех минеральных составных частей кожи у человека составляет от 0,69 до 1% веса человека (Кожные и венерические болезни / Под ред. Иванова О.Л. / Москва: Шико, - 2006, 217 с.).

Кожные покровы человека являются третьей по содержанию цинка тканью в организме (60% скелетные мышцы, 30% кости, 5-6% кожа). Общее количество цинка в организме взрослого человека составляет 1,5-3 г (Physiology of zinc: General aspects / Jackson M.J. // Zinc In Human Biology; Mills C.F. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany - 1989, p.1-14). Эпидермис содержит больше цинка, чем дерма. В эпидермисе цинк более обильно распределен по всему остистому (шиповатому) слою, чем в других слоях. В дерме концентрация цинка выше в верхнем слое, чем в нижнем (Zinc in epidermis and dermis in healthy subjects / Michaellson G., Ljunghall K., Danielson B.G. // Acta. Derm. Venerol. - 1980, 60, p.295-299).

Цинк - уникальный эссенциальный микроэлемент в организме человека, т.к. присутствует во всех органах и тканях, является вторым по распространенности после железа, к нему привязано около 10% белков. Это единственный элемент, который представлен в составе ферментов всех 6 классов. Он принимает участие во всех видах обмена, т.к. является кофактором более чем в 1000 ферментативных реакций и необходим для более 2000 факторов транскрипции. Ему принадлежит важная роль в синтезе белка и нуклеиновых кислот, он необходим для стабилизации структуры ДНК, РНК и рибосом, играет важную роль в процессе трансляции, роста и деления клеток, участвует в стабилизации и проницаемости клеточных и внутриклеточных мембран, процессах мембранного транспорта, формировании антиоксидантного статуса в качестве протектора свободнорадикальных реакций, оказывает значительное влияние на иммунную систему и процессы апоптоза, остеогенез, гемопоэз, клеточное дыхание, рост, формирование мозга и его нейротрансмиттерную функцию, выступая в качестве нейромодулятора и нейромедиатора, репродукцию и развитие плода. Катионы цинка выполняют в клетках каталитическую, структурную и регуляторную функции. Цинк повышает активность остеобластов и ингибирует активность остеокластов. В остеобластах цинк может усиливать пролиферацию клеток, активность щелочной фосфатазы и остеогенный эффект. Катионы цинка регулируют биосинтез и хранение инсулина, а также являются сигнальной молекулой для α-клеток поджелудочной железы, высвобождаясь во внеклеточное пространство после секреции инсулина (Биологическая роль цинка и его значимость в патогенезе расстройств аутистического спектра / Преснякова М.В., Костина О.В., Альбицкая Ж.В. / Социальная и клиническая психиатрия - 2019, т.29, №3, с. 63-70).

Проявлениями дефицита цинка, в первую очередь, выступают следующие признаки: задержка роста, замедленное половое созревание, гипогонадизм, гипоспермия, алопеция, медленное заживление ран, поражение кожных покровов, снижения иммунитета, снижение аппетита, нарушение поведения, фотофобия и ночная слепота, нарушения вкуса (Цинк в нейропедиатрии и нейродиетологии / Студеникин В.М., Турсунхужаева С.Ш., Шелковский В.И. / Лечащий врач - 2012, №1)

Для цинка характерно аутокринное, паракринное, трансклеточное и трансмембранное действие на клетки-мишени. Подобно кальцию и цАМФ цинк действует как внутриклеточный вторичный мессенджер, способный непосредственно трансдуцировать внеклеточный стимул во внутриклеточные сигнальные события (Zinc is novel intracellular second messenger / Yamasaki S., Nishida K., Kabu K., Hirano T. / The journal of cell biology - 2007, vol. 177, №4, p.637-645).

Все исследования по изучению содержания цинка в организме человека проводятся в разных физиологических жидкостях и выделениях (сыворотка и плазма крови, цельная кровь, эритроциты и мембрана эритроцитов, моноциты, лимфоциты, нейтрофилы, тромбоциты крови, грудное молоко, моча, дуоденальное содержимое, пот, слюна, смешанная слюна, слюнные отложения, семенная жидкость, фекалии); биопсийном материале (придатки яичек, образцы кожи, поджелудочной железы, печени, мозга, мышечной ткани, слизистая оболочка и стенки пищевода, слизистая ротовой полости и т.д.), костях, зубах, волосах, ногтях и других тканях и органах; с использованием клеточных линий, таких как эпидермальные кератиноциты человека (НаСаТ), меланоциты кожи человека, эндотелиальные клетки человека (НАЕС), клетки гладкой мускулатуры аорты человека (AoSMC), фибробласты кожи человека (hDF), клетки рака толстой кишки человека (НТ-29), злокачественные эпителиальные клетки человека LIM 1215 (толстый кишечник), А 549 (альвеолярный тип 2) и NCl-H292 (бронхиальный тип), иммортализованные в культуре клеток кератиноциты человека (HDK 1) и нормальные кератиноциты человека (NHEKs) и другие, а также модели животных (цинк-дефицитные мыши, knock out модели мышей, культуры тучных клеток, полученных из костного мозга (ВММС) мышей линии C57/BL6, культивируемые кератиноциты мыши, ткань полости рта крыс линии Wistar, и многие другие). Изучение метаболизма цинка возможно с использованием обогащенных стабильных изотопов цинка (Zn⁷⁰) и применением цинк-хелатирующих реагентов. Помимо непосредственного исследования содержания цинка в организме человека цинковый гомеостаз изучают определением импортеров (ZIP 1-14) и экспортеров (ZnT 1-10) цинка, а также металлотионеинов (МТ).

Для детекции цинка применяются такие методы как атомно-абсорбционная спектрофотометрия, масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, спектрофлуориметрия, ионная хроматография, иммуногистохимия, иммуноцитохимия, высокоэнергетическая рентгеновская флуоресценция синхротронного излучателя (SR-XRF), вестерн-блот анализ с хемифлуоресцентной визуализацией, методы изотопного анализа, использование цветной реакции с дитизоном (дифенилтиокарбазон).

Исследование экспрессии генов, которые регулируются статусом цинка, а именно, импортеров и экспортеров цинка, металлотионеинов, генов участвующих в реакции на токсичность цинка SCL30A1, SCL39A6, SCL30A5, SCL30A10 или экспрессии белков, принимающих участие в цинк-зависимой стимуляции меланоцитов таких как АКТ 3, ERK , c-MYC, CYDC проводится с помощью молекулярно-генетических методов (ПНР, иммуноблоттинг). Определение металлотионеинов возможно с помощью иммуногистохимии, иммуноблоттинга.

Перечисленные методы исследования являются трудоемкими, для их проведения требуется дорогостоящее и специфическое оборудование и наличие высококвалифицированных специалистов, а также длительность проведения исследования. Полезность разных показателей цинкового статуса постоянно пересматривается и открыта для дискуссий. Проблема заключается в том, что цинк - это металл, который распространен по всему организму и не существует единого окончательного теста, который может быть использован для оценки статуса цинка. Определение цинка на системном уровне не отражает полной картины цинкового статуса в коже. В исследованиях, измеряющих изменение внутриклеточных ионов необходимо использовать индикаторы с высокой селективностью к цинку, не подверженных влиянию низких значений рН или окислителей, а также важно исключить сайты связывания для таких «интерферирующих» ионов, как Са и Mg с помощью хелатирующих агентов. Геномные и протеомные исследования импортеров и экспортеров цинка, а также металлотионеинов, которые в свою очередь регулируются статусом цинка, могут быть полезны для выявления потенциальных маркеров кандидатов маржинального дефицита цинка.

Анатомические особенности кожи способствуют внедрению более доступных и простых методов определения цинка непосредственно в коже. Любой воспалительный процесс в коже приводит к высвобождению цинка из внутриклеточных депо и увеличению внеклеточной фракции цинка. Новые подходы, которые локально определяют уровень цинка, дополнят необходимые данные о гомеостазе цинка в шоковом органе. Перечисленные трудности исследований определяют актуальность исследования цинка на локальном уровне - в коже. Методов количественного определения уровня цинка непосредственно в коже, на настоящий момент нет.

Для количественного определения цинка на локальном уровне необходимо исследовать его концентрацию в коже методом «кожного окна».

Ранее, с помощью метода «кожного окна» появилась возможность определения количественного уровня биологически активных веществ (иммуноглобулины, цитокины) на уровне кожи.

Известен способ оценки активности атопического воспаления, который заключается в количественном определении иммуноглобулинов sIgA, IgA, IgM и IgG в экссудатах «кожного окна» у больных с атопическим дерматитом в период обострения (Цораева З.А. Нарушения местного и системного иммунитета при атопическом дерматите у детей и совершенствование тактики его лечения. / Цораева З.А. // Автореферат диссертации кандидата медицинских наук. - Москва. - 2007. - 27 с.). С целью изучения местного иммунитета кожи использовался метод «кожного окна» по Rebuck J и Crowley J в модификации Климова В.В (Патент №1534395 от 07.01.1990 на изобретение: «Способ диагностики аллергического диатеза»/ В.В. Климов, Т.В. Кошовкина, В.К. Раткин, А.А. Денисов), которая предполагает использование камер над зоной повреждения. Переднюю сторону предплечья дезинфицируют спиртом. Затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхний слой эпидермиса на участке кожи площадью 1×1 см, получают поверхность с характерным блеском. На скарифицированный участок помещают камеру объемом 1 мл, предварительно заполненную стерильным физизиологическим раствором. Камеру фиксируют на 18 часов с помощью лейкопластыря. После снятия камеры в экссудате определяли количественный состав sIgA, IgA, IgM и IgG методом «радиальной иммунодиффузии» по Mancini et al., a IgE - иммуноферментным методом по стандартной методике. Показатели иммуноглобулинов характеризуют только гуморальное звено иммунитета и не отражают картины цинкового статуса в коже. К недостаткам метода также относятся: длительность проведения процедуры, устаревший метод «радиальной иммунодиффузии».

Также известен способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии, который заключается в изучении цитокиновых профилей в экссудатах «кожного окна» при отсутствии каких-либо клинических проявлений у пациентов с атопическим дерматитом (Медицинская технология «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии» ФС №2010/217 от 10.06.2010 Климов ВВ, Денисов АА, Фирсова ЕК, Саликова ТИ, Загрешенко ДС.). Забор экссудата по методике «кожного окна» по Rebuck J и Crowley J в модификации Климова В.В. проводился через 6 часов. В бесклеточной фракции экссудата «кожного окна» с помощью метода иммуноферментного анализа проводилось определение уровней IL-4, IFN-γ и IL-10. В соответствии с профилем цитокинов определяется наличие или отсутствие минимальной воспалительной активности кожи. Данный способ также не отражает картины цинкового статуса в коже.

Назначение настоящего изобретения - количественное определение уровня цинка in vivo в экссудатах «кожного окна».

Назначение изобретения достигается способом определения концентрации цинка в экссудате «кожного окна». Проводят постановку метода «кожного окна», а именно в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхние слои эпидермиса до блестящего слоя, удалив роговой слой, на участке кожи площадью 1 на 1 см, получают поверхность с характерным блеском, на скарифицированный участок помещают пластиковую камеру объемом 1 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильным раствором натрия хлорид 0,9%, камеру фиксируют на скарифицированном участке кожи с помощью лейкопластыря. Через 6 часов камеру снимают, ее содержимое пипеточным дозатором собирают и переносят в пробирку типа эппендорф, центрифугируют экссудат «кожного окна», а полученную бесклеточную фракцию экссудата - супернатант сразу используют для определения концентрации цинка с применением набора реагентов Цинк-Ново фирмы «Вектор-Бест», основным компонентом которого является специфический комплексон 2-(5-бром-2-пиридилазо)-5-(N-пропил-N-сульфопропиламино)-фенол (5-Br-PAPS). Проводят измерение уровня цинка на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab PRIME 60i фирмы «Thermo Fisher Scientific», анализатор автоматически обрабатывает образец и с помощью встроенного фотометра с интерференционными сменными фильтрами проводит фотометрическое измерение оптической плотности образующегося стабильного комплекса образца при длине волны 575 нм.

Если для проведения исследования необходимо набрать определенное количество материала, а определение уровня цинка планируется через некоторое время, тогда супернатант немедленно замораживают при температуре -20°С для хранения, а перед процедурой определения уровня цинка образцы размораживают при комнатной температуре в течение 20 минут, далее центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2-х минут, при этом допустимо только однократное замораживание и размораживание образцов.

Новизна способа:

1. Количественное определение уровня цинка in vivo в экссудатах «кожного окна».

2. С применением данного способа появилась возможность быстрого определения уровня цинка непосредственно в коже.

3. Малая инвазивность, простота способа определения уровня цинка.

Технический результат, достигаемый предлагаемым способом позволяет определить in vivo уровень цинка в экссудатах «кожного окна» доступным и быстрым методом, малоинвазивным, в сочетании с высокочувствительным фотоколориметрическим методом без депротеинизации.

Способ проводят следующим образом.

Методика проведения «кожного окна» для получения кожного экссудата.

Перед началом процедуры исследователь надевает медицинские перчатки. Переднюю поверхность предплечья пациента дезинфицируют 70% этиловым спиртом. Затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхние слои эпидермиса до блестящего слоя. Удалив роговой слой, на участке кожи площадью 1 на 1 см, получают поверхность с характерным блеском.

На скарифицированный участок помещают пластиковую камеру объемом 1 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильным раствором натрия хлорид 0,9%. Камеру фиксируют на скарифицированном участке кожи с помощью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья лейкопластырем обеспечивает наиболее надежную фиксацию камеры.

Через 6 часов камера снимают, ее содержимое пипеточным дозатором собирают и переносят в пробирку типа эппендорф. Далее, центрифугируют экссудат «кожного окна», а полученную бесклеточную фракцию экссудата (супернатант) сразу используют для определения концентрации цинка.

Если для проведения исследования необходимо набрать определенное количество материала, а определение уровня цинка планируется через некоторое время (например через 1-2 месяца), тогда супернатант требуется немедленно заморозить при температуре -20°С для хранения. Перед процедурой определения уровня цинка образцы размораживают при комнатной температуре в течение 20 минут, далее центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2-х минут. Допустимо только однократное замораживание и размораживание образцов. Необходимо убедиться, что образцы доведены до комнатной температуры.

Метод количественного определения уровня цинка в экссудатах «кожного окна»

Для проведения анализа используют набор реагентов для определения концентрации цинка, основным компонентом которого является специфический комплексон 2-(5-бром-2-пиридилазо)-5-(N-пропил-N-сульфопропиламино)-фенол (5-Br-PAPS) (Цинк-Ново, производитель Вектор-Бест, Россия). В соответствии с инструкцией производителя к набору реактива проводят подготовку к хранению реагентов, подготовку реагентов к анализу и проведение колориметрического метода с измерением оптической плотности образца, прямо пропорциональной концентрации цинка в пробе, при длине волны 575 нм.

Для проведения анализа используют автоматический биохимический анализатор Konelab PRIME 60i (производитель "Thermo Fisher Scientific", Финляндия).

Полученную после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 2-х минут бесклеточную фракцию экссудата (супернатант) с помощью пипеточного дозатора переносят из эппендорфа в пробирки для проб, которые устанавливают в сегменты для образцов и помещают на борт биохимического анализатора Konelab PRIME 60i. Анализатор автоматически обрабатывает образец и с помощью встроенного фотометра с интерференционными сменными фильтрами проводит фотометрическое измерение оптической плотности образующегося стабильного комплекса образца при длине волны 575 нм.

Изобретение иллюстрируется фотографиями, представленными на Фиг. 1-5.

Фиг. 1. Подготовка пациента к процедуре. Пациент усаживается перед исследователем. Необходим свободный доступ к передней поверхности предплечья пациента, которую обрабатывают 70% этиловым спиртом. Далее необходимо убедиться в полном испарении спирта с поверхности кожи, она должна быть сухой.

Фиг. 2. В средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхние слои эпидермиса на участке кожи площадью 1 на 1 см, путем последовательного и многократного соскабливания кожи. В итоге, должна появиться блестящая поверхность, которую можно увидеть под определенным углом зрения. Остатки слущенного эпидермиса удаляют с передней поверхности предплечья с помощью ватки или салфетки.

Фиг. 3. На скарифицированный участок кожи устанавливают пластиковую камеру объемом 1 мл, которую заполняют стерильным раствором натрия хлорида 0,9%.

Фиг.4. Камеру фиксируют на скарифицированном участке кожи с помощью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья лейкопластырем должна обеспечивать надежную фиксацию камеры, но не нарушать приток и отток крови в конечности и не сдавливать ткани.

Фиг. 5. Через 6 часов камеру снимают. Содержимое камеры собирают пипеточным дозатором и переносят в пробирку типа эппендорф, или создают серию аликвот в эппендорфах одного и того же образца.

При выполнении поставленной задачи было проведено 2 исследования.

Исследование №1 (Фиг. 1-5.). Обследовано 25 образцов замороженных экссудатов «кожного окна», полученных из устанавливаемых на скарифицированный участок кожи камеры объемом 1 мл, предварительно заполненной стерильным 0,9% раствором натрия хлорида практически здоровым донорам-добровольцам. До проведения количественного определения уровня цинка в экссудатах, образцы хранились в течение 2-х месяцев при температуре - 20°С. Далее образцы выдерживались при комнатной температуре в течение 20 минут и центрифугировались при 1500 об/мин в течение 2-х минут. Полученный супернатант использовался для определения концентрации цинка на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab PRIME 60i. Требуемое количество образца для проведения анализа составляет 8 мкл. Анализатор автоматически обрабатывает образец и проводит вычисление концентрации цинка в образце, количественный результат выдается в течение 10 минут в мкмоль/л. Таким образом, метод «кожного окна» с применением камеры, заполненной стерильным физиологическим раствором свидетельствует о его пригодности, в качестве способа количественного определения уровня внеклеточной фракции цинка на уровне кожи.

Исследование №2 (Фиг. 1-5.). Экссудаты «кожного окна», полученные от пяти здоровых доноров добровольцев, после снятия камеры с участка скарификации через 6 часов, без предварительной заморозки, собирают в эппендорф и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2-х минут.

Супернатант, полученный после центрифугирования экссудата, незамедлительно используется для определения концентрации цинка на биохимическом анализаторе Konelab PRIME 60i. Время проведения анализа составляет 10 минут, после чего получают концентрацию цинка в экссудате в мкмоль/л. Полученные результаты незамороженных образцов не отличаются от результатов, подвергшихся заморозке и хранению образцов экссудатов «кожного окна».

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

Абсолютные противопоказания:

1. Наличие рубцовых изменений и инфекционных воспалительных процессов на коже передней поверхности обеих рук.

2. Декомпенсированные системные заболевания.

3. Интеркуррентные заболевания в остром периоде.

Относительные противопоказания:

1. Заболевания, связанные с нарушением системы свертываемости крови.

2. Беременность и период лактации.

3. Возраст до 18 лет.

4. Склонность к гипертрофическим и келоидным рубцам.

5. Низкий порог болевой чувствительности.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения концентрации цинка в экссудате «кожного окна». Для этого проводят постановку метода «кожного окна», а именно в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхние слои эпидермиса до блестящего слоя, удалив роговой слой. На скарифицированный участок помещают пластиковую камеру объемом 1 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильным раствором натрия хлорид 0,9%. Камеру фиксируют на скарифицированном участке кожи с помощью лейкопластыря. Через 6 часов камеру снимают, ее содержимое пипеточным дозатором собирают и переносят в пробирку типа эппендорф. Центрифугируют экссудат «кожного окна», а полученную бесклеточную фракцию экссудата - супернатант сразу используют для определения концентрации цинка с применением набора реагентов Цинк-Ново фирмы «Вектор-Бест», основным компонентом которого является специфический комплексон 2-(5-бром-2-пиридилазо)-5-(N-пропил-N-сульфопропиламино)-фенол (5-Br-PAPS). Проводят измерение уровня цинка на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab PRIME 60i фирмы «Thermo Fisher Scientific», анализатор автоматически обрабатывает образец и с помощью встроенного фотометра с интерференционными сменными фильтрами проводит фотометрическое измерение оптической плотности образующегося стабильного комплекса образца при длине волны 575 нм. Изобретение позволяет определить in vivo уровень цинка в экссудатах «кожного окна» доступным и быстрым методом, малоинвазивным, в сочетании с высокочувствительным фотоколориметрическим методом без депротеинизации. 1 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ определения концентрации цинка в экссудате «кожного окна», характеризующийся тем, что проводят постановку метода «кожного окна», а именно в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляют верхние слои эпидермиса до блестящего слоя, удалив роговой слой, на участке кожи площадью 1 на 1 см, получают поверхность с характерным блеском, на скарифицированный участок помещают пластиковую камеру объемом 1 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильным раствором натрия хлорид 0,9%, камеру фиксируют на скарифицированном участке кожи с помощью лейкопластыря; через 6 часов камеру снимают, ее содержимое пипеточным дозатором собирают и переносят в пробирку типа эппендорф, центрифугируют экссудат «кожного окна» при 1500 об/мин в течение 2-х минут, а полученную бесклеточную фракцию экссудата - супернатант сразу используют для определения концентрации цинка с применением набора реагентов Цинк-Ново фирмы «Вектор-Бест», основным компонентом которого является специфический комплексон 2-(5-бром-2-пиридилазо)-5-(N-пропил-N-сульфопропиламино)-фенол (5-Br-PAPS), проводят измерение уровня цинка на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab PRIME 60i фирмы «Thermo Fisher Scientific», анализатор автоматически обрабатывает образец и с помощью встроенного фотометра с интерференционными сменными фильтрами проводит фотометрическое измерение оптической плотности образующегося стабильного комплекса образца при длине волны 575 нм.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что супернатант немедленно замораживают при температуре -20°С для хранения, а перед процедурой определения уровня цинка образцы размораживают при комнатной температуре в течение 20 минут, далее центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2-х минут, при этом допустимо только однократное замораживание и размораживание образцов.