Рекомбинантные плазмидные ДНК lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, обеспечивающие активацию экспрессии гена MYC в клетках человека, способ получения клеток человека со стабильно повышенной экспрессией гена MYC и моноклональная линия клеток рака молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной экспрессией гена MYC Российский патент 2024 года по МПК C12N15/67 C12N15/79 

Изобретение относится к биотехнологии, генетической и белковой инженерии, а именно к получению генетической конструкции, обеспечивающей активацию экспрессии гена MYC в клетках человека, предназначенных для исследования механизмов дедифференцировки (стволовой пластичности) клеток человека.

Получение генетических конструкций с целью создания модельных клеточных линий для исследования процессов дедифференцировки клеток крайне востребовано в современной биомедицине, в частности в онкологии и регенеративной медицине.

Ген MYC (также известный как с-MYC и MYCC) расположен в локусе 8q24.21 на хромосоме 8 и имеет длину около 6 т.п.н. Он содержит 3 экзона и 4 промотора P₀, P₁, P₂, P₃, участвующих в регуляции транскрипции гена, два альтернативных старт-кодона (CTG и ATG), из-за чего мРНК MYC существует в двух изоформах, и, соответственно, транслируется в две изформы белка [1]. Ген MYC входит в семейство онкогенов, состоящее из трех паралогов (С-MYC, N- MYC и L- MYC). Отличие между паралогами заключается в том, что они экспрессируются в разных тканях организма и на разных стадиях развития.

Экспрессия MYC контролируется сигнальными путями, контролирующими пролиферацию клеток, факторами транскрипции (E2F, SP1, β-катенин/TCF-4, Smad3, NF-κB, STAT3, ER, и AR). Ремоделирование хроматина также участвует в регуляции транскрипции гена MYC, что зависит от присутствия или отсутствия нуклеосом на определенных участках, в том числе за счет ацетилирования гистонов, метилирования ДНК. Гену MYC свойственна аутосупрессия - способность самостоятельно регулировать уровень собственной экспрессии. Этот процесс осуществляется прямым (когда белок Myc садится на промотор P₂) и косвенным (когда Myc действует как активатор и репрессор своих собственных активаторов и репрессоров) путями [1].

MYC является онкогеном, ассоциированным с появлением и развитием различных злокачественных опухолей. Более 10 лет назад была обнаружена так называемая стволовая пластичность дифференцированных раковых клеток. Под этим термином понимают способность зрелых раковых клеток превращаться в стволовые раковые клетки. Это является ключевым открытием для понимания механизмов метастазирования - любая дифференцированная раковая клетка может дать начало вторичному опухолевому узлу. Способность клеток к стволовой пластичности коррелирует с повышенным уровнем экспрессии генов стволовости, одним из ключевых таких генов является ген MYC.

Развитие метастатической болезни является основной причиной смерти онкологических больных. Особенно остро данная проблема стоит для пациентов с раком молочной железы. Процент больных, у которых в различные сроки после удаления первичной опухоли молочной железы развиваются метастазы, колеблется от 15 до 75%. Именно поэтому изучение механизмов метастазирования, которые до конца не выяснены на сегодняшний день, является одним из важнейших направлений исследований в современной онкологии.

Для проведения исследований направленных на разработку подходов к регуляции экспрессии данного гена требует создания модельных клеточных линий, различающихся уровнем экспрессии гена MYC. Подобные клеточные линии высоко востребованы как для проведения исследований in vitro так и для исследований in vivo на моделях ксенографтов опухолей человека. Так в литературе описана модель клеток лимфомы Беркитта, содержащих ген Myc под контролем tet-репрессора, что позволяет выключать экспрессию гена Myc при внесении тетрациклина и постепенно наращивать после его удаления [2]. Известна панель, предназначенная для проведения фундаментальных исследований и разработки противораковых препаратов, состоящая из 9 типов культур клеток которые содержат различные мутации MYC или разное число копий гена MYC - MYC Genetic Alteration Cell Panel (ATCC). Данная панелья включает линии клеток В-лимфом CRL-1647 ST486, CRL-1648 CA46 и ATCC HTB-62 P3HR-1, рака желудка CRL-5974 SNU-16, рака легких HTB-175 NCI-H82, CRL-2081 MSTO-211H и ATCC HTB-171 NCI-H446, лейкемии CCL-240 HL-60 и плазмацитомы CRL-9068 NCI-H929.

Векторы, обеспечивающие временную экспрессию Myc в клетках млекопитающих, используют для репрограммирования неопухолевых клеток человека. Так, известны эписомальные векторы, для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), например, такие как pCEP4-M2L [3] или pMaster1 [4]. Описаны плазмидные векторы, экспрессирующие химерный c-MYC в составе белка слияния с активирующим доменом вируса простого герпеса VP16, обеспечивающие разный уровень экспрессии c-MYC в клетках - pSN26, pSN27 и pSN28 - сильный, умеренный и слабый, соответственно, и предназначенные для репрограммирования фибробластов [5].

В литературе описаны плазмидные векторы, обеспечивающие временную экспрессию c-Myc в клетках млекопитающих. Так, например, известна плазмида pMXs-KMS, кодирующая ген c-Myc в составе полицистронной молекулы с KLF4 и SOX2 [6] или плазмида pEBG-hMYC-FLAG для экспрессии химерного белка GST-MYC-FLAG под контролем промотора вируса SV40 [7]. Известны плазмиды pcDNA5-FRT-hMYC и pcDNA5-FRT-GFP-MYC для экспрессии с-Myc человека, в том числе совместно с зеленым флуоресцентным белком (GFP), под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV) [8, 9]. Эти плазмиды также могут быть использованы для встраивания последовательности кодирующей c-Myc в геном клетки. Описан плазмидный вектор для транзиентной экспрессии, позволяющий индуцировать экспрессию c-Myc с использованием доксициклина pCW57.1 CMYC (Plasmid #164145) [10].

Известны плазмидные векторы, которые позволяют получить клеточную линию, стабильно экспрессирующую Myc, за счет внесения в клетку дополнительной копии данного гена в форме трансгена. Так описаны ретровирусные плазмидные векторы для гиперэкспрессии генов BCL2 и MYC человека MSCV-MYC-t2A-BCL2 [11], pBabe-c-myc-zeo [12] или pWZL Blast myc [13]. Известны лентивирусные векторы, кодирующие c-Myc человека, например, ZsGreen1-cMYC/pLVX-Puromycin [14] и MYC-PGK-blast [15], позволяющие провести встраивание трансгена в геном клетки млекопитающих и обеспечить стабильную экспрессию данного транскрипционного фактора.

Описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, предназначенные для повышения содержания с-Myc в клетке за счет эпигенетической активации экспрессии эндогенного гена. Так, известны два вектора, представляющие собой эписомальный (GG-EBNA-OMKSL-PP EBNA) или генетический вектор на основе транспозонов (PB-GG-OMKSL-PGK-Puro), любой из которых кодирует 10 направляющих РНК под U6 промотором для повышения экспрессии генов OCT4, MYC, KLF4, SOX2 и LIN28A с целью получения iPSC [16]. Данные векторы экспрессируют направляющую РНК, комплементарную последовательности ccctttataatgcgagggtc гена MYC. Данные векторы предназначены для временной экспрессии генов. В оригинальной работе для активации экспрессии пяти генов, в том числе MYC, использовали клетки, экспрессирующие мутантную форму нуклеазы SpdCas9VP192, слитой с активирующим доменом P65-HSF1.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является вектор sgRNA(MS2)_zeo insert c-MYC

(Plasmid #164636) представляющий собой плазмиду sgRNA(MS2)_zeo backbone в которую клонирована последовательность, комплементарная последовательности гена MYC человека: 5-GTTCCCCCACGCCCTCTGCTT-3´. Для повышения экспрессии c-Myc с использованием данной плазмиды клетки необходимо предварительно модифицировать таким образом, чтобы они экспрессировали мутантную форму нуклеазы dCAS9-VP64. Данная плазмида была сконструирована в лаборатории Гюнтера Шнайдера (Günter Schneider Lab, Каролинский институт, Швеция), однако какая-либо информация об использовании данной плазмиды для получения линии клеток отсутствует.

Технической задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантных плазмид, обеспечивающих активацию экспрессии гена MYC в клетках человека и наиболее приемлемого и экономически выгодного способа получения линии клеток человека со стабильно повышенной экспрессией гена MYC для научных исследований и разработок.

Новый технический результат достигают получением рекомбинантных плазмидных ДНК lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, обеспечивающих активацию экспрессии гена MYC в клетках человека, обладающих способностью экспрессировать РНК, содержащую участок длиной 21 нуклеотид комплементарный ДНК промоторной области гена MYC человека, способную формировать комплекс с белками активирующими транскрипцию гена, и представляющих собой плазмидные векторы lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone гидролизованные по сайту BsmBI, содержащие сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор U6 РНК полимеразы III человека, фрагмент размером 21 п.о. комплементарный промоторной области гена MYC человека, экспрессирующийся в составе модифицированной молекулы направляющей РНК из Streptococcus pyogenes системы CRISPR/Cas9, и формирующей MS2 вторичные структуры, обеспечивающие взаимодействие РНК с белками способными активировать экспрессию гена, генетические маркеры: bla ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli, и Sh ble ген из Streptoalloteichus hindustanus, определяющий устойчивость к зеоцину при трансфекции клеток человека, последовательности необходимые для сборки лентивирусных частиц: 5' усеченные длинные концевые повторы (LTR) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), сигнал упаковки ВИЧ-1, Rev чувствительный элемент (RRE) ВИЧ-1, центральный полиуридиновый тракт (cPPT) ВИЧ-1.

Также, новый технический результат достигают способом получения моноклональной клеточной линии, предусматривающим трансформацию клеток E.coli Stable3, сконструированной плазмидой lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc; выращивание трансформированных клеток в среде с ампициллином, выделением рекомбинантной плазмидной ДНК; трансфекцию клеток человека плазмидной ДНК для продукции лентивирусных частиц, трансдукцию клеток человека лентивирусными частицами, селекцию клеток на среде с зеоцином, получение клона единичной клетки со стабильно повышенной экспрессией гена MYC.

Сущность изобретения заключается в том, что конструируют плазмиду lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, путем встраивания в плазмидный вектор lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone фрагмента ДНК, комплементарного промоторной области гена MYC, трансформируют полученной плазмидой клетки Escherichia coli Stable3, обеспечивающие амплификацию рекомбинантной плазмиды, выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК; трансфицируют клетки человека плазмидной ДНК для продукции лентивирусных частиц, трансдуцируют клетки человека (предварительно трансформированных таким образом чтобы они экспрессировали белки-активаторы транскрипции, способные формировать комплекс c молекулой РНК, кодируемой плазмидой lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc) лентивирусными частицами, получают клон единичной клетки со стабильно повышенной экспрессией гена MYC.

Способ осуществляют следующим образом:

Генно-инженерными методами получают плазмиды lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, содержащие фрагмент ДНК, комплементарный участку промотора гена MYC и полученный методом отжига двух синтетических олигонуклеотидных последовательностей.

Клетки E.coli Stable3 трансформируют тремя сконструированными плазмидами lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc и выращивают в течение ночи в среде с добавлением ампициллина. Далее клетки используют для выделения плазмидной ДНК. Плазмидными ДНК совместно с плазмидными ДНК pRSV-Rev, pMD2.G, pMDLg/pRRE трансфицируют клетки линии 293T, получают лентивирусные частицы, которые используют для трансдукции клеток моноклональной линии рака молочной железы человека BT549, экспрессирующих dCAS-VP64, MS2-P65-HSF1 за счет предварительной трансдукции лентивирусными частицами. После трансдукции клетки выращивают на среде с добавлением зеоцина, снимают с поверхности пластика разводят до концентрации 10 клеток в 1 мл и переносят по 100 мкл в лунки культурального планшета. На следующий день методом микроскопии отмечают те лунки планшета, в которых находится 1 клетка и культивируют планшеты до достижения 80% конфлуентности. Далее клетки моноклона последовательно переносят в культуральные емкости большего объема.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантных плазмид lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc являются:

а) плазмидный вектор lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone, обеспечивающий встраивание фрагмента ДНК, комплементарного участку промотора гена MYC и его экспрессию в составе молекулы РНК, формирующей вторичные структуры, которые обеспечивают сборку комплекса активирующего транскрипцию на промоторе гена;

б) три фрагмента ДНК, комплементарных участку промотора гена MYC человека, которые получают в результате отжига синтетических олигонуклеотидов.

Полученные в результате плазмиды серии lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc (фиг. 1) характеризуются следующими признаками:

- имеют молекулярную массу 6,2 МДа и размер 9998 п.н.;

- кодируют молекулу РНК, содержащую фрагмент комплементарный п участку промотора гена MYC и обеспечивающую сборку комплекса, активирующего транскрипцию, на промоторе гена MYC человека;

- состоят из следующих элементов:

а) фрагмента ДНК, размером 21 п.о., комплементарного участку промотора гена MYC, расположенного в геноме на хромосоме 8;

б) плазмиды lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone, экспрессирующей РНК, которая обеспечивает сборку комплекса активирующего транскрипцию на промоторе гена MYC человека;

- содержат:

а) сайт инициации репликации плазмиды pBR322;

б) промотор U6 полимеразы III человека;

в) генетические маркеры: bla ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli, Sh ble ген из Streptoalloteichus hindustanus, определяющий устойчивость к зеоцину при трансфекции клеток человека.

г) ген, кодирующий модифицированную методами генной инженерии молекулу направляющей РНК из Streptococcus pyogenes системы CRISPR/Cas9, способной формировать MS2 вторичные структуры, которые обеспечивают взаимодействие РНК с белками, способными активировать экспрессию гена.

д) последовательности необходимые для сборки лентивирусных частиц: 5' длинный концевой повтор (LTR) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), сигнал упаковки ВИЧ-1, Rev чувствительный элемент (RRE) ВИЧ-1, центральный полиуридиновый тракт (cPPT) ВИЧ-1.

Таким образом, получены три плазмидные ДНК, направляющие продукцию в клетках человека РНК, обеспечивающую сборку комплекса, активирующего транскрипцию на промоторе гена MYC человека, и моноклональная линия клеток рака молочной железы человека BT549_Myc с повышенной экспрессией гена MYC.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1. Общая схема структурной организации плазмиды lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, содержащей фрагмент ДНК размером 21 п.о., комплементарный промоторной области гена MYC, экспрессирующийся в составе РНК, формирующей вторичные структуры, которые обеспечивают сборку комплекса, активирующего транскрипцию на промоторе гена, сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор U6 полимеразы III человека, генетические маркеры: bla ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli, Sh ble ген из Streptoalloteichus hindustanus, определяющий устойчивость к зеоцину при трансфекции клеток человека, последовательности, необходимые для сборки лентивирусных частиц: 5' длинный концевой повтор (LTR) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), сигнал упаковки ВИЧ-1, Rev чувствительный элемент (RRE) ВИЧ-1, центральный полиуридиновый тракт (cPPT) ВИЧ-1.

Фиг. 2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид с использованием эндонуклеазы Bsu I. Control - плазмида lenti sgRNA(MS2)_zeobackbone, M12 - маркер молекулярного веса M12 (СибЭнзим, Россия) (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 п.о.) BsuI - плазмиды, обработанные эндонуклеазой, (-) - плазмиды не обработанные эндонуклеазой; шифр плазмид, выделенных из отобранных для скрининга клонов, указан сверху.

Фиг. 3. Фрагменты хроматограмм, полученных после секвенирования по Сенгеру плазмидной ДНК, выделенной из рекомбинантных клонов (А) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma2, (Б) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma3, (В) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma4.

Фиг. 4. Кривые амплификации кДНК, полученной на матрице мРНК, выделенной из образцов клеток линий BT549 (на графике - 1) и генетически трансформированной моноклональной линии BT549, экспрессирующей нуклеазу dCas в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 и химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующий транскрипцию (на графике - 2), с праймерами к (А) гену актина В человека ACTB, (Б) гену dCas9 и (В) гену р65.

Фиг. 5. Анализ уровня экспрессии транскрипционного фактора c-Myc в (A) клетках исходной линии BT549 и (Б) клетках моноклональной линии BT549_Myc. Клетки окрашены Anti-c-Myc антителами (зеленый сигнал), ядра окрашены DAPI (синий сигнал).

Фиг. 6. Кривые роста клеточной линии BT549 и моноклональной линии BT549_Myc.

Пример 1. Получение рекомбинатной плазмиды lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc.

Для получения фрагмента, комплементарного участку промотора гена MYC человека, используют 3 пары олигонуклеотидов длинной 24 н.о.

Ma2 5'-CACCGATCGCGCTGAGTATAAAAGC-3'

5'-AAACGCTTTTATACTCAGCGCGATC-3'

Ma3 5'-CACCGTGCCCTTCTCGAGGCAGGAG-3'

5'-AAACCTCCTGCCTCGAGAAGGGCAC-3'

Ma4 5'-CACCGAGCTAGAGTGCTCGGCTGCC-3'

5'-AAACGGCAGCCGAGCACTCTAGCTC-3'

Готовят реакционную смесь, содержащую по 10 мкМ каждого праймера из пары, Т4 лигазный буфер (Евроген, Россия), 10 е.а. Т4 полинуклеотидкиназы (NEB, Великобритания). Реакцию проводят в термоциклере (Applied Biosystems, США) при 37°С в течение 30 минут, при 95°С в течение 5 минут и далее охлаждают смесь со скоростью 5°С/мин до 25°С. Реакционную смесь разводят в десять раз водой, отбирают 1 мкл и смешивают в Quick ligation буфер (Евроген) с добавлением 0,25 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma), 10 е.а. эндонуклеазы рестрикции BsmBI (Thermo Scientific), 375 е.а. Т7 лигазы (NEB), 25 нг плазмидной ДНК lenti sgRNA(MS2)_zeobackbone (Addgene). Смесь инкубируют в термоциклере (Applied Biosystems, США) в течение 15 циклов, включающих 2 шага: 37°С 5 мин, 20°С 5 мин. Полученную реакционную смесь используют для трансформации компетентных клеток Escherichia coli Stbl3. Трансформированные клетки культивируют на чашках Петри с агаризованной LB-средой с добавлением ампициллина до конечной концентрации 50 мкг/мл в течение ночи при 30°С. Для выделения рекомбинантных плазмид отбирают по 3 колонии, выросшие на селективной среде, переносят в 5 мл LB-среды (с добавлением ампициллина 50 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при 30°С при постоянном перемешивании при 180 rpm. Выделение плазмидной ДНК проводят набором Plasmid Miniprep (Евроген, Россия) согласно инструкции производителя.

Выполняют рестрикционный анализ выделенных плазмид с использованием эндонуклеазы рестрикции BsuI (СибЭнзим, Россия), реакцию проводят в течение 1 часа при 37°С. Фрагменты ДНК, полученные после расщепления эндонуклеазой, разделяют методом электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением интеркалирующего красителя бромистого этидия. Фрагменты ДНК визуализируют с использованием гель-документирующей системы G-box (Syngen, Великобритания). Исходная плазмида lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone расщепляется эндонуклазой Bsu I на 5 линейных фрагментов - 2940, 2100, 1901, 1529 и 1527 п.н.; рекомбинантная плазмида расщепляется Bsu I с образованием 4 фрагментов - 4842, 2098, 1529, 1527 п.н. (фиг. 2).

Соответствие последовательности фрагмента, клонированного в плазмидный вектор lenti sgRNA(MS2)_zeobackbone, ожидаемой подтверждают методом секвенирования по Сэнгеру с использованием праймера к CRISPR-Seq_F 5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATAT-3’ (фиг. 3).

Пример 2. Получение лентивирусных частиц для трансдукции клеток человека

Клетки почки эмбриона человека 293T (АТСС^®) культивируют в полной питательной среде DMEM/F12 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% FBS (Gibco, Великобритания) и 1/100 GlutaMAX 100× (Gibco, Великобритания) в СО₂-инкубаторе MCO-5M (Sanyo, Япония) при 5% СО₂, 37°С. До начала исследования in vitro клетки культивируют не менее чем до 3 пассажа. Для снятия клеток с пластика при пересеве используют TrypLE (Gibco, Дания). Количество живых клеток определяют методом окрашивания с Trypan Blue stain 0,4% (Invitrogen, США) на автоматическом счетчике Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, Сингапур).

Клетки рассаживают в лунки 6-луночного планшета, дно которых предварительно покрывают полилизином (poly-L-lysine, Sigma-Aldrich, США) по 0,6×10⁶ клеток 293T на лунку. На следующий день среду удаляют и приливают 2 мл полной питательной среды DMEM/F12. Готовят смесь для трансфекции: для этого 5 мкл Metafectene (Biontex, Германия) переносят в 45 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Вносят 50 мкл ФСБ содержащего 2,5 мкг плазмид (Addgene) - pRSV-Rev: pMD2.G: pMDLg/pRRE: и одну из плазмид lenti dCAS-VP64_Blast / lenti MS2-P65-HSF1_Hygro / lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc в массовом соотношении 2: 3: 4: 5. Смесь мягко перемешивают пипетированием, инкубируют 15 мин при комнатной температуре и по каплям вносят в соответствующие лунки планшета с клетками 293T.

Утром на следующий день после трансфекции среду заменяют на свежую, через 12 часов среду, содержащую лентивирусные частицы, собирают в отдельную пробирку, а в лунку вносят свежую ППС DMEM/F12. Процедуру сбора лентивирусных частиц повторяют еще 2 раза с интервалом 12 часов. Пробирку с собранными лентивирусными частицами центрифугируют при 170×g в течение 7 минут.Надосадок собирают и фильтруют через 0,45 мкм фильтр (GVS Filter Technology, США). Получают фильтрат с лентивирусными частицами, содержащими один из трансгенов, кодирующих:

а) нуклеазу dCAS в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 и устойчивость к бластицидину, или

б) химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующий транскрипцию, и устойчивость к гигромицину, или

в) направляющую РНК sgRNA(MS2) и устойчивость к зеоцину.

Лентивирусные частицы позволяют проводить трансдукцию клеток человека.

Пример 3. Трансдукция клеток человека лентивирусными частицами для получения линии, экспрессирующей dCAS-VP64, MS2-P65-HSF1 и sgRNA(MS2) к промотору гена MYC.

Клетки протоковой карциномы молочной железы человека BT-549 культивируют в полной питательной среде (ППС) DMEM/F12 (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% FBS (Gibco, Великобритания) и 1/100 GlutaMAX 100× (Gibco, Великобритания) в СО₂-инкубаторе MCO-5M (Sanyo, Япония) при 5% СО₂, 37°С. До начала исследования in vitro клетки культивируют не менее чем до 3 пассажа. Для снятия клеток с поверхности пластика при пересеве используют TrypLE (Thermo Fisher Scientific, Дания). Количество живых клеток определяют методом окрашивания с Trypan Blue stain 0,4% (Invitrogen, США) на автоматическом счетчике Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, Сингапур).

Клетки линии BT-549 рассаживают в лунки 6-луночного планшета по 0,3×10⁶ клеток/лунку. На следующий день среду удаляют, вносят 1,5 мл полной питательной среды DMEM/F12 и 1,5 мл среды, содержащей лентивирусные частицы двух типов: (1) кодирующие нуклеазу dCAS в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 в сочетании с устойчивостью к бластицидину и (2) кодирующие химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующий транскрипцию в сочетании с устойчивостью к гигромицину. Во все лунки вносят водный раствор гексадиметрин бромида (Polybrene, Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации 8 мкг/мл. Плашку центрифугируют на центрифуге с охлаждением Sigma 3K30 (Sigma, Германия) при 931×g, 32°C в течение 2 часов для осаждения лентивирусных частиц на клетки. Помещают плашку в СО₂-инкубатор при 37°C. Через 24 часа выполняют замену среды. Еще через 24 часа заменяют на среду, содержащую 4 мкг/мл бластицидина и 50 мкг/мл гигромицина. Селекцию в среде с антибиотиками проводят в течение 2 недель, с заменой среды каждые три дня. Количество клеток в лунке оценивают методом микроскопии.

Полученные после селекции клетки, экспрессирующие нуклеазу dCAS в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 и химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующим транскрипцию (фиг. 4), трансдуцируют смесью трех типов лентивирусных частиц lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, кодирующих РНК, содержащую фрагмент комплементарный участку промотора гена MYC. Трансдукцию проводят аналогично вышеописанной процедуре. Селекцию трансдуцированных клеток проводят на среде с добавлением зеоцина (InvivoGen) в конечной концентрации 100 мкг/мл в течение 2 недель, с заменой среды каждые три дня. Количество клеток в лунке оценивают методом микроскопии. Полученная поликлональная линия клеток BT-549_Myc экспрессирует sgRNA(MS2) к промотору гена MYC, а также белки dCAS-VP64 и MS2-P65-HSF1.

Пример 4. Получение моноклональной линии клеток человека с повышенной экспрессией гена MYC.

Готовят суспензию клеток поликлональной линии клеток BT-549_Myc, полученную в результате селекции в среде с зеоцином (см. пример 3), в полной питательной среде DMEM/F12 методом последовательных разведений до концентрации 10 клеток/мл и разносят по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета. Планшеты инкубируют в СО₂ инкубаторе при 37°С. Через 24 часа отмечают лунки, в которых обнаруживается только 1 клетка при анализе с использованием инвертированного микроскопа Leica DMi8 (Leica Microsystems GmbH, Германия). Клетки культивируют в стандартных условиях, замену среды проводят по мере необходимости, но не реже двух раз в неделю. После достижения 70-80% конфлюентности клетки моноклональной линии BT-549_Myc в отмеченных лунках последовательно пересаживают в 24-, 6-луночные планшеты, и далее в культуральный флакон Т25.

Экспрессию гена MYC в клетках моноклональных линий BT-549_Myc оценивают методом ПЦР в режиме реального времени и методом иммунофлуоресцентного анализа, для окрашивания используют антитела Anti-c-Myc (1:100, Recombinant Anti-c-Myc rabbit monoclonal [Y69] antibody ab32072, Abcam, Великобритания) (фиг.5). Кратность изменения экспрессии гена MYC в клетках линии BT-549_Myc относительно исходной линии клеток BT-549 составляет 3,56±0,60.

Для сравнительной характеристики скорости пролиферации клеток моноклональной линии, клетки исходной линии BT-549 и генетически модифицированной линии BT-549_Myc рассаживают в лунки 96-луночного планшета и определяют относительное содержание белка в лунках (на 1, 3, 5, 7, 9 сутки после рассадки) с сульфородамином Б. Время удвоения популяции (Doubling time, сутки) рассчитывают по формуле:

Время удвоения популяции на стадии экспоненциального роста составило 2,3 суток для исходной линии и 2,0 суток для линии BT549_Myc9 (фиг.6).

Таким образом, впервые получены плазмидные ДНК lenti sgRNA(MS2) zeo-Myc, имеющие последовательность SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 и обеспечивающие активацию транскрипции гена MYC в клетках человека, предложен способ получения моноклональной линии клеток человека и получена моноклональная линия клеток рака молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной экспрессией гена MYC.

Список источников

1. L.A. Carabet, P.S. Rennie, A. Cherkasov, Therapeutic Inhibition of Myc in Cancer. Structural Bases and Computer-Aided Drug Discovery Approaches, Int J Mol Sci. 20 (2018) 120.

2. C.Y. Lin, J. Lovén, P.B. Rahl, R.M. Paranal, C.B. Burge, J.E. Bradner, T.I. Lee, R.A. Young, Transcriptional amplification in tumor cells with elevated c-Myc, Cell 15 (2012) 56-67.

3. J. Yu, K. Hu, K. Smuga-Otto, S. Tian, R. Stewart, I.I. Slukvin, J.A. Thomson, Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences, Science 324(5928) (2009) 797-801.

4. S. Wu, Y. Wu, X. Zhang, M.R. Capecchi, Reprogram somatic cells to iPS cells Efficient germ-line transmission obtained with transgene-free induced pluripotent stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A 111 (2014) 10678-10683.

5. S. Narayan, G. Bryant, S. Shah, G. Berrozpe, M. Ptashne, OCT4 and SOX2 Work as Transcriptional Activators in Reprogramming Human Fibroblasts, Cell Rep.20 (2017) 1585-1596.

6. L. Wang, D. Huang, C. Huang, Y. Yin, K. Vali, M. Zhang, Y. Tang, Enhanced human somatic cell reprogramming efficiency by fusion of the MYC.

7. p.-h.-F.w.a.g.f.A.N.A.p.h.n.t.n.a. RRID:Addgene_185374).

8. p.-F.-h.w.a.g.f.A.N.A.p.h.n.t.n.a. RRID:Addgene_185373).

9. p.-F.-G.-M.w.a.g.f.A.N.A.p.h.n.t.n.a. RRID:Addgene_185375).

10. p.C.w.a.g.f.R.P.A.p.h.n.t.n.a. RRID:Addgene_164145.

11. R. Caeser, M. Di Re, J.A. Krupka, J. Gao, M. Lara-Chica, J.M.L. Dias, S.L. Cooke, R. Fenner, Z. Usheva, H.F.P. Runge, P.A. Beer, H. Eldaly, H.K. Pak, C.S. Park, G.S. Vassiliou, B.J.P. Huntly, A. Mupo, R.J.M. Bashford-Rogers, D.J. Hodson, Genetic modification of primary human B cells to model high-grade lymphoma, Nat Commun. 10 (2019).

12. C. Dai, L. Whitesell, A.B. Rogers, S. Lindquist, Heat shock factor 1 is a powerful multifaceted modifier of carcinogenesis, Cell 130 (2007) 1005-1018.

13. J.S. Boehm, M.T. Hession, S.E. Bulmer, W.C. Hahn, Transformation of human and murine fibroblasts without viral oncoproteins, Mol Cell Biol. 25 (2005) 6464-6474.

14. S.E. Moree, L. Maneix, P. Iakova, F. Stossi, E. Sahin, A. Catic, Imaging-Based Screening of Deubiquitinating Proteases Identifies Otubain-1 as a Stabilizer of c-MYC, Cancers (Basel) 14 (2022) 806.

15. M.-P.-b.w.a.g.f.J.S.A.p.h.n.t.n.a. RRID:Addgene_190618.

16. D. Balboa, S. Katayama, M. Bespalov, K. Krjutskov, E. Jouhilahti, R. Trokovic, J. Kere, T. Otonkoski, Nat Commun. 9 (2018) 2643.

Рекомбинантные плазмидные ДНК lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, обеспечивающие активацию экспрессии гена MYC в клетках человека, способ получения клеток человека со стабильно повышенной экспрессией гена MYC и моноклональная линия клеток рака молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной экспрессией гена MYC

Фигура 1. Общая схема структурной организации плазмиды lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, содержащей фрагмент ДНК размером 21 п.о., комплементарный промоторной области гена MYC, экспрессирующийся в составе РНК, формирующей вторичные структуры, которые обеспечивают сборку комплекса, активирующего транскрипцию на промоторе гена, сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор U6 полимеразы III человека, генетические маркеры: bla ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации Escherichia coli, Sh ble ген из Streptoalloteichus hindustanus, определяющий устойчивость к зеоцину при трансфекции клеток человека, последовательности, необходимые для сборки лентивирусных частиц: 5' длинный концевой повтор (LTR) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), сигнал упаковки ВИЧ-1, Rev чувствительный элемент (RRE) ВИЧ-1, центральный полиуридиновый тракт (cPPT) ВИЧ-1.

Фигура 2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид с использованием эндонуклеазы Bsu I. Control - плазмида lenti sgRNA(MS2)_zeobackbone, M12 - маркер молекулярного веса M12 (СибЭнзим, Россия) (10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 п.о.) BsuI - плазмиды, обработанные эндонуклеазой, (-) - плазмиды не обработанные эндонуклеазой; шифр плазмид, выделенных из отобранных для скрининга клонов, указан сверху.

Фигура 3. Фрагменты хроматограмм, полученных после секвенирования по Сенгеру плазмидной ДНК, выделенной из рекомбинантных клонов (А) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma2, (Б) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma3, (В) lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc_Ma4.

Фигура 4. Кривые амплификации кДНК, полученной на матрице мРНК, выделенной из образцов клеток линий BT549 (на графике - 1) и генетически трансформированной моноклональной линии BT549, экспрессирующей нуклеазу dCas в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 и химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующий транскрипцию (на графике - 2), с праймерами к (А) гену актина В человека ACTB, (Б) гену dCas9 и (В) гену р65.

Фигура 5. Анализ уровня экспрессии транскрипционного фактора c-Myc в (A) клетках исходной линии BT549 и (Б) клетках моноклональной линии BT549_Myc. Клетки окрашены Anti-c-Myc антителами (зеленый сигнал), ядра окрашены DAPI (синий сигнал).

Фигура 6. Кривые роста клеточной линии BT549 и моноклональной линии BT549_Myc.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2022-31 2.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"

productionDate="2022-12-14">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022/2-32</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-13</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2022-1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения

Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia Sibirskii

gosudarstvennyi meditsinskii universitet Ministerstva

zdravookhraneniia Rossiiskoi Federatsii</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантные плазмидные ДНК

lenti sgRNA(MS2)_zeo_Myc, обеспечивающие активацию экспрессии гена

MYC в клетках человека, способ получения клеток человека со стабильно

повышенной экспрессией гена MYC и моноклональная линия клеток рака

молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной

экспрессией гена MYC.</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9998</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9998</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccagg

ctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtcccca

ggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaa

ctccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttt

tatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga

ggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttga

caattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaag

ttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggc

tcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcat

cagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgag

ctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgaga

tcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggc

cgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttc

ggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgccc

accccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataa

agcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtata

ccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgc

tcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagcta

actcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaa

tgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgact

cgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccac

agaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaag

gccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtc

agaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctc

tcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct

catagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac

cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacga

cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagag

ttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagc

cagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggttt

ttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg

gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct

tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtc

tgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagtt

gcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatga

taccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcg

cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagt

agttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgt

ttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaa

aaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatg

gttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt

actcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacggga

taataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactc

tcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcat

cttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataag

ggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttat

tgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttc

cccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtaca

atctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagt

gcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggt

taggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttat

taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacgg

taaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat

agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca

gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc

attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat

taccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttcca

agtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtc

gtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgc

gttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaa

cccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac

tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacag

ggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacg

gcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagag

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggcc

agggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt

aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcaga

caggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggataga

gataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacag

caagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaa

tataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagag

aaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgc

agcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttg

ctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaa

gaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaact

catttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcac

acgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaat

cgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattg

gtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggttta

agaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcaga

cccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacag

agacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtatt

catccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataata

gcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattaca

gggacagcagagatccagtttggttaattagctagcgagggcctatttcccatgattccttcatatttgc

atatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtaca

aaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggac

tatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaa

acaccgatcgcgctgagtataaaagcgttttagagctaggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

cctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

ccaagtggcaccgagtcggtgctttttttggatcctgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaat

ctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcag

agcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag

gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaa

ccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa

gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttc

cacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggcct

tgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgc

gaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatg

acctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatt

tcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc

tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcct

cgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaa

agatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgaaggacgcggcgctcgggagagcgggcgg

gtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagta

ccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggag

gggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga

tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggt

tcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgatgtacaatggccaagttgaccagtgccgttccggtg

ctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcg

tggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggt

ggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggag

gtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggc

gggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgagaatt

cgatatcaagcttatcggtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaac

tatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgta

tggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgt

caggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacc

tgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgcc

ttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatc

gtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccct

tcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttc

gccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgaga

cctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaa

gcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaagg

cagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaag

acaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacacca

gggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaagg

tagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgaccc

ggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcat

ccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacc

cactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactc

tggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaaacccg

ctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttg

accctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagta

ggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcag

gcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtat

ccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac

ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttcc

ccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaa

aaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgt

tggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtcta

ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaa

tttaacgcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9998</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9998</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccagg

ctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtcccca

ggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaa

ctccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttt

tatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga

ggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttga

caattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaag

ttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggc

tcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcat

cagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgag

ctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgaga

tcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggc

cgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttc

ggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgccc

accccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataa

agcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtata

ccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgc

tcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagcta

actcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaa

tgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgact

cgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccac

agaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaag

gccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtc

agaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctc

tcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct

catagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac

cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacga

cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagag

ttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagc

cagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggttt

ttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg

gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct

tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtc

tgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagtt

gcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatga

taccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcg

cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagt

agttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgt

ttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaa

aaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatg

gttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt

actcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacggga

taataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactc

tcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcat

cttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataag

ggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttat

tgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttc

cccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtaca

atctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagt

gcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggt

taggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttat

taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacgg

taaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat

agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca

gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc

attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat

taccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttcca

agtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtc

gtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgc

gttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaa

cccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac

tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacag

ggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacg

gcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagag

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggcc

agggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt

aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcaga

caggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggataga

gataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacag

caagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaa

tataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagag

aaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgc

agcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttg

ctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaa

gaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaact

catttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcac

acgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaat

cgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattg

gtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggttta

agaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcaga

cccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacag

agacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtatt

catccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataata

gcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattaca

gggacagcagagatccagtttggttaattagctagcgagggcctatttcccatgattccttcatatttgc

atatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtaca

aaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggac

tatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaa

acaccgtgcccttctcgaggcaggaggttttagagctaggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

cctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

ccaagtggcaccgagtcggtgctttttttggatcctgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaat

ctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcag

agcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag

gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaa

ccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa

gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttc

cacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggcct

tgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgc

gaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatg

acctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatt

tcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc

tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcct

cgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaa

agatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgaaggacgcggcgctcgggagagcgggcgg

gtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagta

ccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggag

gggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga

tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggt

tcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgatgtacaatggccaagttgaccagtgccgttccggtg

ctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcg

tggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggt

ggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggag

gtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggc

gggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgagaatt

cgatatcaagcttatcggtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaac

tatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgta

tggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgt

caggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacc

tgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgcc

ttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatc

gtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccct

tcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttc

gccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgaga

cctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaa

gcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaagg

cagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaag

acaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacacca

gggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaagg

tagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgaccc

ggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcat

ccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacc

cactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactc

tggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaaacccg

ctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttg

accctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagta

ggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcag

gcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtat

ccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac

ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttcc

ccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaa

aaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgt

tggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtcta

ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaa

tttaacgcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9998</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9998</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccagg

ctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtcccca

ggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaa

ctccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttt

tatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga

ggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttga

caattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaag

ttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggc

tcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcat

cagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgag

ctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgaga

tcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggc

cgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttc

ggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgccc

accccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataa

agcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtata

ccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgc

tcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagcta

actcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaa

tgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgact

cgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccac

agaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaag

gccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtc

agaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctc

tcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttct

catagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac

cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacga

cttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagag

ttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagc

cagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggttt

ttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacg

gggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct

tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtc

tgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagtt

gcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatga

taccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcg

cagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagt

agttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgt

ttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaa

aaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatg

gttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagt

actcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacggga

taataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactc

tcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcat

cttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataag

ggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttat

tgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttc

cccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtaca

atctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagt

gcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggt

taggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttat

taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacgg

taaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat

agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggca

gtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggc

attatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat

taccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttcca

agtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtc

gtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgc

gttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaa

cccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgac

tctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacag

ggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacg

gcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagag

atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggcc

agggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt

aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcaga

caggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggataga

gataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacag

caagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaa

tataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagag

aaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgc

agcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttg

ctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaa

gaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaact

catttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcac

acgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaat

cgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattg

gtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggttta

agaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcaga

cccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacag

agacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtatt

catccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataata

gcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattaca

gggacagcagagatccagtttggttaattagctagcgagggcctatttcccatgattccttcatatttgc

atatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtaca

aaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggac

tatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaa

acaccgagctagagtgctcggctgccgttttagagctaggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

cctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccaacatgaggatcacccatgtctgcaggg

ccaagtggcaccgagtcggtgctttttttggatcctgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaat

ctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcag

agcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaag

gtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaa

ccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa

gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttc

cacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggcct

tgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgc

gaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatg

acctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatt

tcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc

tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcct

cgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaa

agatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatgaaggacgcggcgctcgggagagcgggcgg

gtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagta

ccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggag

gggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga

tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggt

tcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgatgtacaatggccaagttgaccagtgccgttccggtg

ctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcg

tggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggt

ggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggag

gtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggc

gggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgagaatt

cgatatcaagcttatcggtaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaac

tatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgta

tggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgt

caggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacc

tgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgcc

ttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatc

gtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccct

tcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttc

gccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgaga

cctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaa

gcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaagg

cagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaag

acaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacacca

gggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaagg

tagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgaccc

ggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcat

ccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacc

cactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactc

tggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagggcccgtttaaacccg

ctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttg

accctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagta

ggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcag

gcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtat

ccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac

ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttcc

ccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaa

aaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgt

tggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtcta

ttcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaa

tttaacgcg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, а именно к рекомбинантным плазмидным ДНК серии sgRNA(MS2)_zeo_Myc. Указанные плазмидные ДНК кодируют последовательность направляющей РНК, содержащую участок длинной 21 нуклеотидов, комплементарный промоторной области гена MYC человека, которая обеспечивает активацию гена MYC в клетках человека. Изобретение также относится к способу получения моноклональной клеточной линии рака молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной экспрессией гена MYC. Настоящее изобретение позволяет получать линии клеток человека с гиперэкспрессией гена MYC и предназначено для проведения научных исследований и разработок. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК lenti sgRNA(MS2)_zeo-Myc, обеспечивающая активацию транскрипции гена MYC в линиях клеток рака молочной железы BT549_Myc, имеющая молекулярную массу 6,2 МДа и представляющая собой плазмидный вектор lenti sgRNA(MS2)_zeo backbone, гидролизованный по сайту BsmBI, содержащий сайт инициации репликации плазмиды pBR322, промотор U6 РНК полимеразы III человека, фрагмент размером 21 п.о. комплементарный ДНК гена MYC человека, имеющий одну из последовательностей SEQ ID NO 1-3, который экспрессируется под контролем U6 промотора в составе генетически модифицированной направляющей РНК из Streptococcus pyogenes системы CRISPR/Cas9, способной формировать вторичные структуры, обеспечивающие взаимодействие РНК с белками-активаторами транскрипции, генетические маркеры: bla ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину, и Sh ble ген, определяющий устойчивость к зеоцину, последовательности, необходимые для сборки лентивирусных частиц: 5' усеченные длинные концевые повторы (LTR) вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), сигнал упаковки ВИЧ-1, Rev чувствительный элемент (RRE) ВИЧ-1, центральный полиуридиновый тракт (cPPT) ВИЧ-1.

2. Способ получения линии клеток рака молочной железы человека BT-549 со стабильно повышенной экспрессией гена MYC, заключающийся в том, что проводят трансдукцию клеток лентивирусными частицами двух типов: кодирующими нуклеазу dCAS в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64 и кодирующими химерный белок MS2-P65-HSF1, активирующий транскрипцию, получают моноклональную линию клеток, стабильно экспрессирующих оба этих белка, проводят трансфекцию клеток линии 293Т плазмидой lenti sgRNA(MS2)_zeo-Myc по п.1 для продукции трех типов лентивирусных частиц, кодирующих направляющие РНК, содержащие последовательности SEQ ID NO 1-3, и проводят трансдукцию клеток, экспрессирующих dCAS-VP64 и MS2-P65, комбинацией этих трех видов лентивирусных частиц, селекцию трансдуцированных клеток на среде с антибиотиком зеоцином и выделение клона единичной клетки со стабильно повышенной экспрессией гена MYC методом предельных разведений.

3. Линия клеток рака молочной железы человека BT549_Myc со стабильно повышенной экспрессией гена MYC для проведения исследований в области онкологии, полученная способом по п.2, отличающаяся тем, что содержит в геноме фрагменты ДНК, кодирующие нуклеазу dCAS в составе белка слияния с трансактивирующим доменом VP64, химерный белок MS2-P65-HSF1 и направляющие РНК, содержащие в своей структуре хотя бы одну последовательность SEQ ID NO 1-3.