СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ ВОСПАЛЕНИЯ НА ФОНЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и онкологии, и может быть использовано для осуществления диагностики на раннем этапе развития ассоциированного воспаления, сопровождающего множество патологий на примере модели метаболического синдрома в эксперименте на крысах.

Изучение механизмов развития хронического ассоциированного воспаления, которое сопровождает множество иммунных, обменных, сердечно-сосудистых, неврологических, ревматологических и других заболеваний лежит в основе ключевых механизмов запуска онкогенеза, и является одной из актуальных проблем современной медицины. Согласно эпидемиологическим исследованиям, воспаление служит потенциальным фактором риска развития опухолевого процесса - до 25% злокачественных опухолей человека связаны с хроническим воспалением и инфекцией (Hussain and Harris, 2007, Department of Clinical and Molecular Sciences, Polytechnic University of Marche, School of Medicine, Ancona, Italy, 2016).

Известно, что одним из ключевых звеньев запуска реакции воспаления может быть толл-подобный рецептор 4 типа - Toll-like receptors (TLR 4), который отвечает наряду с TLR 2 типа за распознавание чужеродных молекул экзогенного и эндогенного происхождения, и которые первыми активируют врожденный и приобретенный иммунитет (Griffin С., L. Eter, N. Lanzetta et al. TLR 4, TRIF, and MyD88 are essential for myelopoiesis and CD11c+ adipose tissue macrophage production in obese mice. Journal of Biological Chemistry. 2018; 293: 8775-8786).

TLR 4-проводимые пути внутриклеточной сигнализации тесно связаны с регуляцией ряда транскрипционных факторов (ядерный фактор каппа В - NF-kB, пероксисом-пролифератор активируемые рецепторы - PPARs), чрезмерная активация которых приводит к развитию системной воспалительной реакции организма с выбросом провоспалительных цитокинов - интерлейкинов 1,6, фактора некроза опухоли альфа (TNFa) и повышением уровня С-реактивного белка (СРБ) (Петренко В.И., Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. Молекулярно-генетические аспекты в патогенезе метаболического синдрома. Клиническая патофизиология. 2017; 22(1): 19-32). В настоящее время обсуждается роль иммунных молекулярных маркеров TLR 4 в развитии метаболического синдрома (МС), но исследований, показывающих единый механизм и взаимосвязь между ними в аспекте метаболического синдрома ранее не выполнялось.

Для диагностики метаболического синдрома и воспалительных нарушений на его фоне проводят изучение метаболических изменений на уровне углеводно-липидного обмена и гормонального статуса. Однако, универсальные маркеры для оценки наличия воспаления и степени его выраженности при метаболическом синдроме на сегодняшний день отсутствуют.

Известен способ диагностики метаболического синдрома и заболеваний, включающих в себя данный синдром (Заявка №97121292. Опубл. 10.11.1999), в котором используется диагностическая система на основе агониста кортизола для диагностики связанных с метаболическим синдромом состояний, таких как абдоминальное ожирение, резистентность к инсулину, включая риск развития диабета второго типа, повышенное содержание жиров в крови и повышенное артериальное давление, для чего измеряют содержание кортизола в сыворотке крови для измерения ингибирующего действия на аутопродукцию кортизола, при котором диагностическая система включает в себя средства измерения базального содержания кортизола.

Однако, способ не дает возможности проведения ранней диагностики воспалительных нарушений, возникающих на фоне метаболического синдрома.

В качестве прототипа выбран способ диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома (Патент РФ №2561039. Опубл. 27.07.2015), включающий определение в сыворотке венозной крови концентрации маркера воспаления неоптерина - маркера активации клеточной иммунной системы, с применением иммуноферментного анализа (ELISA), и при концентрации неоптерина более либо равной 10 нмоль/л диагностирование воспаления жировой ткани.

Недостатками данного способа являются следующие: невысокая точность диагностики, нет возможности проводить оценку воспалительного процесса на ранних этапах нарушения липидного обмена, не учитываются взаимосвязи с концентрацией молекулярных и биохимических маркеров.

Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома в эксперименте с существенными признаками заявляемого способа.

Исходя из вышеприведенного уровня техники, при диагностике развития ассоциированного воспаления на фоне метаболического синдрома у лабораторных животных проблемой является невысокая точность оценки наличия воспаления и степени его выраженности, а также возможность проведения ранней диагностики данных нарушений.

Технический результат заключается в повышении эффективности ранней диагностики развития воспалительного процесса на фоне экспериментального метаболического синдрома.

Разработка способа диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома путем создания модели метаболического синдрома, наиболее полно воспроизводящей клиническую картину данной патологии, и измерения уровней концентрации в плазме крови двух наиболее значимых прогностических маркеров активации клеточной иммунной системы, даст возможность наиболее точно проводить диагностику в зависимости от степени и сроков развития воспалительной реакции, и является основой для дальнейшего изучения развития хронического ассоциированного воспаления при различных иммунных, обменных, сердечно-сосудистых, неврологических, ревматологических заболеваниях, что позволяет решить вышеуказанную проблему.

Предлагается, как и в прототипе, определять в плазме крови показатели углеводно-липидного обмена, уровни концентрации маркеров воспаления и проведение по их количественным значениям оценки активности воспалительного процесса в жировой ткани.

В заявляемом способе авторами впервые предлагается использовать дополнительно два маркера реакции ассоциированного воспаления на фоне развития экспериментального метаболического синдрома, а именно, мембранный белок TLR 4 и СРВ, определенным образом взаимосвязанных между собой.

Диагностика воспалительного процесса осуществляется на основании увеличения количественного содержания в плазме крови мембранного белка TLR 4 более чем в 6 раз по отношению к норме с одновременным увеличением уровня СРВ более чем в 2,5 раза по отношению к норме, что наиболее полно раскрывает клиническую картину воспалительных нарушений, свойственных метаболическому синдрому.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: измерение в плазме крови уровня содержания С-реактивного белка и уровня концентрации маркера активации клеточного иммунного ответа мембранного белка TLR 4 с учетом характеристики липидного обмена, и последующая оценка полученных количественных значений данных маркеров позволяет судить о степени развития воспаления на фоне экспериментального метаболического синдрома на начальных этапах его развития.

Анализ содержания в плазме крови концентрации маркера TLR 4, имеющего существенную роль в патогенезе воспалительного процесса на фоне метаболического синдрома во взаимосвязи с уровнем содержания СРВ, являющегося одним из прогностических факторов воспаления, позволяет повысить точность ранней диагностики развития реакции ассоциированного воспалительного процесса, и, соответственно, своевременно выбрать адекватную коррекционную тактику данной патологии.

Повышение концентрации в крови данных маркеров более чем в 2 раза по сравнению с контролем позволяет судить о высокой степени развития воспаления, а при значениях менее 2х-кратного повышения - судят о низкой вероятности развития воспаления.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома в эксперименте, включающем исследование плазмы крови и определение показателей углеводно-липидного обмена, уровня концентрации маркера воспаления, согласно изобретению, в качестве маркеров активации клеточной иммунной системы используют мембранный белок TLR 4 и С-реактивный белок (СРВ), измеряют уровни концентрации TLR 4 и СРВ в плазме крови методом иммуноферментного анализа, и при повышении уровня концентрации TLR 4 более 4,06 нг/мл и увеличении уровня содержания С-реактивного белка более 1,74 мкг/мл по отношению к контролю судят о развитии воспалительного процесса на раннем этапе.

Способ осуществляют следующим образом.

Для индукции метаболического синдрома используют фруктозную модель.

Для диагностики реакции ассоциированного воспаления определяют уровни концентраций TLR 4 и СРВ в плазме крови лабораторных животных с экспериментальным МС с применением иммуноферментного анализа (ELISA). Концентрацию данных маркеров оценивают с помощью статистического и корреляционного анализа для оценки активности воспаления на фоне МС.

Экспериментальное исследование выполнено на 48 белых крысах-самцах линии Wistar категории SPF (питомник ФИБХ РАН «Пущино»), массой тела 290-310 грамм, возрастом 3-3,5 мес.

Протокол эксперимента одобрен комитетом по биоэтике и соответствует указаниям Директивы Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 г. (86/609 /ЕСС). Животных содержали в клетках, каждая из которых содержала шесть животных, в помещении с контролируемой температурой (20±2 С°), относительной влажностью (60±5%) и световым циклом (12 ч свет/темнота) со свободным доступом к пище и воде.

На протяжении 14 дней до начала эксперимента был выдержан соответствующий период акклиматизация животных.

В качестве модели МС использовали фруктозную модель кормления кормом с 60%-м содержанием фруктозы (ФМК) на протяжении 24 недель (Park J., Kho М., Kim Н. et al. Blackcurrant Suppresses Metabolic Syndrome Induced by High-Fructose Diet in Rats // Evid Based Complement Alternat Med. - 2014).

Развитие МС оценивали с помощью критериев Международной Диабетической Федерации (МДФ, 2005): абдоминальное ожирение и наличие любых двух факторов из следующих четырех - увеличение уровня Триглицериды (ТГ) более 1,7 ммоль/л (140 мг/дл) или проведение снижающей ТГ терапии; низкий уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) - менее 1,03 ммоль/л для мужчин и менее 1,29 ммоль/л для женщин, или проведение специфической терапии; гипергликемия натощак при значении более 5,6 ммоль/л (100 мг/дл) или ранее установленный диагноз СД 2 типа; артериальная гипертензия (АГ) - САД >130 мм рт.ст. или ДАД >85 мм рт.ст., или гипотензивная терапия.

В соответствии с целью исследования было сформировано 2 группы животных (n=12 в каждой группе).

1 группа - контрольная группа интактных животных с «контрольной» диетой (Lab Rodent 5001, 0,30% фруктозы).

2 группа - МС - крысы на фруктозной диете в течение 24 недель без коррекции.

В ходе эксперимента использовались следующие методы исследования: соматометрические - исследование массы висцеральной жировой клетчатки крыс, например, при помощи весов лабораторных электронных ВЛТЭ-500, биохимические - определение уровня глюкозы, липидов - общий холестеин (ОХС), ТГ, ЛПВП, а также мочевой кислоты в плазме крови, например, при помощи автоматичесого биохимического анализатора ERBA XL-180 («Erba Lachema», Чехия).

Определение уровня концентрации TLR 4 и содержание СРБ в плазме крови выполнялось, например, с помощью тест-систем производства «CUSABIO BIOTECH Co., Ltd» (США), в соответствии с инструкциями производителя. Концетрация TLR4 выражалась в нг/мл, содержание СРБ - в мкг/мл, диапазон детекции - 0,625-40 нг/мл, чувствительность - 0,146 нг/мл, время анализа 1-5 ч., объем образца 50-100 мкл, длина волны детекции была равна 450 нм.

Концентрацию TLR 4 и содержание СРБ в плазме крови оценивали на 14-й неделе и в конце эксперимента - на 24-й неделе перед забоем во всех группах животных.

Для иммуноферментного анализа (ИФА) использовались, например, микропланшетный анализатор Multiskan FC, микропланшетный промыватель W600, термошейкер для микропланшетов PST - 60HL, вспомогательное оборудование, необходимое для проведения твердофазного иммуноферментного анализа.

Взятие крови из хвостовой вены для оценки уровня глюкозы плазмы крови (ммоль/л) производилось на 0, 4, 8, 11, 14, 16, 18-й неделе ФМК, а также во время декапитации - 24-я неделя.

Для оценки уровня липидов и мочевой кислоты использовалась кровь, полученная до начала (0) и в конце эксперимента (24-я неделя, после декапитации). Для получения сыворотки нестабилизированную кровь предварительно охлаждали, а затем центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин (604 g).

Анализ биохимических маркеров выполнялся по стандартной методике. Плазма крови замораживалась в жидком азоте и хранилась при -80°С для дальнейшего анализа. Уровни глюкозы, общего холестерола (ОХС), триглицеридов (ТГ), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и мочевой кислоты (ммоль/л) определяли в плазме крови с помощью автоматического биохимического анализатора ERBA XL-180 («Erba Lachema», Чехия).

Эвтаназию крыс осуществляли на 24-й неделе эксперимента после 12-часового периода голодания путем декапитации под эфирным наркозом. После производился забор органов и висцеральной жировой клетчатки, которую извлекали из брыжейки тонкой кишки, сальника и забрюшинного пространства (весы лабораторные электронные ВЛТЭ-500).

Статистический анализ выполнялся с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США) с использованием параметрических критериев (Т-критерий Стьюдента) и непараметрических критериев (W-критерий Вилкоксона). Достоверными считали различия при р<0,05. Количественные параметры величин представляли в виде среднего значения с указанием стандартной ошибки в виде М±m. Перед выполнением статистической обработки каждая выборка проверялась на однородность с анализом распределения данных. Для определения нормального распределения использовался коэффициент нормальности Колмогорова-Смирнова и Лиллиефорса.

На основании проведенного эксперимента было установлено, что моделирование фруктоз-индуцированного МС приводит к развитию классических признаков МС, включая центральный признак - абдоминальное ожирение, и вспомогательные признаки - гипергликемию, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, снижение уровня ЛПВП и повышение уровня мочевой кислоты в плазме крови.

При анализе результатов веса абдоминальной клетчатки крыс с МС было выявлено, что вес жировой клетчатки в брюшной полости в группе крыс с МС без коррекции в 2,5 раза больше - 11,31±0,28 г, чем в контрольной группе - 4,53±0,38 г (р<0,001).

Оценивая уровень глюкозы у животных с экспериментальным МС было зарегистрировано отсутствие гипергликемии в течение длительного времени. К 24-й неделе эксперимента среднее значение уровня глюкозы крови крыс с индуцированным МС достигло своего максимального значения (6,8 ммоль/л), что превышало на 12,5% (р<0,01).

Также развитие МС сопровождалось характерными нарушениями липидного обмена - повышением уровня ТГ, ОХС и снижением ЛПВП.

В таблице 1 приведены изменения концентрации TLR4 (нг/мл) и СРБ (мкг/мл) в плазме крови экспериментальных животных при МС (М±m).

Развитие МС сопровождалось развитием ассоциированной воспалительной реакции. Это связано с усилением экспрессии TLR 4, о чем свидетельствовало повышение уровня концентрации TLR 4 в 5,8 раз по сравнению с контролем (р<0,001), при этом уровень концентрации С-реактивного белка возрос более чем в 2,5 раза по сравнению с контрольными значениями (р<0,001) (Таблица 1).

При повышении уровня концентрации TLR 4 более 4,06 нг/мл и увеличении уровня содеражния С-реактивного белка более 1,74 мкг/мл по отношению к контролю судят о развитии воспалительного процесса.

В таблице 2 приведен корреляционный анализ молекулярных маркеров TLR 4 и СРБ при МС, представлен ранговый коэффициент Спирмена с указанием р.

Выявлена четкая корреляционная взаимосвязь между уровнем концентрации TLR 4 и уровнем концентрации СРБ - на 14-й неделе фруктозной диеты она была обратно-пропорциональной со слабой степенью выраженности (коэффициент Спирмена составил - 0,343), но к концу эксперимента эта связь стала достоверно высокой и прямой положительной (при коэффициенте Спирмена 0,704; р<0,05).

Проведенный статистический анализ продемонстрировал достоверность полученных данных.

Полученные результаты исследований подтверждают связь между изменением фосфолипидного спектра периферической крови у животных с метаболическим синдромом и развитием воспалительных изменений в жировой ткани за счет определения в плазме крови маркеров воспаления СРБ и TLR 4, по значительному повышению уровня концентрации которых судят об активности воспалительного процесса на раннем этапе его развития.

Предлагаемый способ может быть эффективно использован для ранней диагностики воспалительного процесса на фоне метаболического синдрома.

Заявляемый способ позволяет в динамике оценивать наличие развития воспаления на фоне МС в данный конкретный промежуток времени, и позволяет с высокой точностью и чувствительностью охарактеризовать степень развития воспалительного процесса.

Ранняя идентификация патологического процесса дает возможность своевременного проведения профилактических мер. Заявляемый способ может быть использован в качестве скринингового, а также для проведения мониторинга лечения, выбора наиболее рационального его вида, коррекции терапии на различных этапах патологического процесса, что обеспечивает повышение точности персонифицированного прогнозирования эффективности лечения.

Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к способу диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома. Способ диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома в эксперименте на крысах включает исследование плазмы крови и определение уровня концентрации маркера воспаления, где в качестве маркеров активации клеточной иммунной системы используют мембранный белок TLR 4 и С-реактивный белок (СРБ), измеряют уровни концентрации TLR 4 и СРБ в плазме крови методом иммуноферментного анализа и при повышении уровня концентрации TLR 4 более 4,06 нг/мл и увеличении уровня содержания С-реактивного белка более 1,74 мг/мл по отношению к контролю судят о развитии воспалительного процесса на раннем этапе. Вышеописанный способ обладает повышенной эффективностью при ранней диагностике развития воспалительного процесса на фоне экспериментального метаболического синдрома. 2 табл.

Способ диагностики развития воспаления на фоне метаболического синдрома в эксперименте на крысах, включающий исследование плазмы крови и определение уровня концентрации маркера воспаления, где в качестве маркеров активации клеточной иммунной системы используют мембранный белок TLR 4 и С-реактивный белок (СРБ), измеряют уровни концентрации TLR 4 и СРБ в плазме крови методом иммуноферментного анализа и при повышении уровня концентрации TLR 4 более 4,06 нг/мл и увеличении уровня содержания С-реактивного белка более 1,74 мг/мл по отношению к контролю судят о развитии воспалительного процесса на раннем этапе.