Способ ранней диагностики алкогольного стеатоза печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и внутренним болезням, и может быть использовано для ранней диагностики алкогольного стеатоза печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя.

Известен лабораторный способ диагностики алкогольного стеатоза печени, основанный на прижизненном морфологическом исследовании биоптатов печени (Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Жаркова М.С., Жигалова С.Б., Киценко Е.А., Манукьян Г.В., Трухманов А.С, Маев И.В., Тихонов И.Н., Деева Т.А. Клинические рекомендации Российского общества по изучению печени Российской гастроэнтерологической ассоциации по диагностике и лечению фиброза и цирроза печени и их осложнений. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2021;31 (6):56-102.) Недостатки способа: трудоемкость, травматичность, способ требует специальных условий проведения, имеется техническая сложность получения материала и высокий риск развития тяжелых осложнений во время и после проведения манипуляции, охватывает только 0,2% печеночной паренхимы, низкая информативность о распределении инфильтратов, оценка гистологического строения органов достаточно продолжительна по времени, процедура субъективно неприятна.

Технический результат: снижение травматичности, отсутствие риска осложнений, доступность, простота исполнения при высокой чувствительности, специфичности и эффективности.

Указанный результат достигается путем определения активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови у обследуемого пациента с синдромом зависимости от алкоголя при выполнении ранней диагностики алкогольного стеатоза печени.

Способ осуществляется следующим образом: у больного натощак осуществляют забор венозной крови из локтевой вены в количестве 5 мл в вакуумную пробирку с активатором свертывания. Далее центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин для получения сыворотки. Активность фермента антиоксидантной системы глутатионпероксидазы в сыворотке крови определяли методом Prohaska М.А. фотометрически на КФК-3 (фотометр фотоэлектрический, Россия) по скорости окисления НАДФН в инкубационной пробе при длине волны 340 нм (Вавилова, Т.П. Практикум по биохимии: учебное пособие для студентов медицинских вузов/ Т.П. Вавилова, О.Л. Евстафьева, И.Г. Островская. - М.: ВЕДИ, 2010.- 128 с).

Принцип метода основан на том, что глутатионпероксидаза (селенсодержащий фермент), восстанавливая гидропероксиды, окисляет восстановленный глутатион при уменьшении которого в среде инкубации определяется активность фермента глутатионпероксидазы. Необходимые реактивы:

1. 0,1 моль/л фосфатный буфер, рН - 7,4. Для этого 6,8 г KH₂PO₄ растворяют в 500 мл дистиллированной воды, 11,4 г K₂HPO₃×3H₂O в 500 мл H₂O₂ и смешивают полученные растворы под контролем до необходимого рН;

2. 31,88 ммоль/л раствор восстановленного глутатиона, то есть 24,29 мг/мл восстановленного глутатиона;

3. 14,52 мг натрия азида и 27,68 мг ЭДТА-Na растворяют в 35 мл фосфатного буфера, рН - 7,4. Раствор готовят непосредственно перед исследованием;

4. 13,8 ммоль/л пероксида водорода;

5. 1,49 мг/мл НАДФН.

Ход определения: 0,05 мл исследуемой сыворотки в соответствии 1:10 внести в кювету с длиной оптического пути 10 мм, которая содержит 1,8 мл калий-фосфатного буфера с рН - 7,4, 0,1 мл восстановленного глутатиона, а после инициации добавить 0,1 мл раствора Н₂О₂ и 0,05 мл НАДФН. Измерить оптическую плотность в кювете 10 мм при длине волны 340 нм в течение 3 минут. За единицу активности глутатионпероксидазы принимали количество фермента, необходимого для восстановления 1 мкмоля глутатионпероксидазы в 1 минуту. При расчетах использовали коэффициент молярной экстинции для НАДФН равный 6,22.

Оптическую плотность каждой пробы измеряли против воды на фотометре (фотометр фотоэлектрический, Россия) при длине волны 340 нм. После проводили расчет активности глутатионпероксидазы в крови по формуле:

Е - активность глутатионпероксидазы, мкмоль / (мкмоль/л/мин);

А - разность экстинции контрольной и опытной проб;

V р.с. - объем реакционной смеси равный 2,05 мл;

V пр. - объем пробы, мл;

l - длина оптического пути - 1 см;

Е - молярный коэффициент светопоглощения НАДФН при длине волны 340 нм, равный 6,22 * 10³ м^-1 * см^-1;

t - время наблюдения 3 минуты. При значении активности глутатионпероксидазы менее или равном 16,1 мкмоль/мкмоль/л/мин диагностируют алкогольный стеатоз печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя, при значении активности глутатионпероксидазы более 16,1 мкмоль/(мкмоль/л/мин) - отсутствие алкогольного стеатоза печени. Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Пациентка А., 40 лет обратилась ГБУЗ ПК «Пермский краевой клинический наркологический диспансер» с целью лечения синдрома зависимости от алкоголя с жалобами на приверженность к употреблению алкоголя, диспепсию, умеренно выраженную слабость. В анамнезе имелись данные о систематическом приеме алкоголя в среднем 1 литр водки в неделю. При сборе анамнеза было установлено, что пациентка страдает хроническим алкоголизмом в течение 8 лет.

При объективном осмотре выявлено: умеренно выраженная потливость рук, легкий тремор рук. Кожные покровы и видимые слизистые физиологической окраски. Телосложение астеническое. Печень выступает из-под края реберной дуги на 0,5 см, умеренной плотности, гладкая, безболезненная. Биохимическое исследование: АЛТ 31 Ед/л, ACT 25 Ед/л, общий билирубин 9 мкмоль/л, ХС 4,9 ммоль/л, ТГ 0,8 ммоль/л, ХС-ЛПВП 3,61 ммоль/л, ХС-ЛПНП 3,8 ммоль/л. Производим расчет активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови:

Активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови составляет 10,986 мкмоль / (мкмоль/л/мин).

Таким образом, предлагаемым способом подтвержден диагноз «алкогольный стеатоз печени».

Пример 2. Пациентка 46 лет, стоит на учете в ГБУЗ ПК «Пермский краевой клинический наркологический диспансер» с диагнозом «Синдром зависимости от алкоголя» в течение 17 лет. Пациент пришел на плановый прием к наркологу. Жалобы на дискомфорт, тупую боль в правом подреберье, эпигастрии, снижение аппетита. Объективный статус: кожные покровы, видимые слизистые физиологической окраски. Телосложение нормостеническое. Печень выступает из-под края реберной дуги на 1,5 см, умеренной плотности, гладкая, с закругленным краем. Биохимическое исследование: АЛТ 24 Ед/л, ACT 28 Ед/л, общий билирубин 14 мкмоль/л, ХС 3,9 ммоль/л, ТГ 0,8 ммоль/л, ХС-ЛПВП 3,2 ммоль/л, ХС-ЛПНП 3,6 ммоль/л.

Производим расчет активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови:

Активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови составляет 13,183 мкмоль /(мкмоль/л/мин).

Таким образом, предлагаемым способом подтвержден диагноз «алкогольный стеатоз печени».

Пример 3. Пациент, 40 лет, впервые обратилась на прием в ГБУЗ ПК «Пермский краевой клинический наркологический диспансер» к наркологу. При сборе алкогольного анамнеза выявлено, что пациентка регулярно, в течение 14 лет принимает около 70 г этанола в сутки. Жалобы на ощущение умеренно выраженного дискомфорта в правом подреберье после приема пищи, незначительно выраженную слабость. Объективный статус: кожные покровы, видимые слизистые физиологической окраски. Телосложение нормостеническое. Печень на 1 см ниже края реберной дуги, гладкая, плотная. Биохимическое исследование: АЛТ 30 Ед/л, ACT 20 Ед/л, общий билирубин 15 мкмоль/л, ХС 4,9 ммоль/л, ТГ 0,9 ммоль/л, ХС-ЛПВП 3,6 ммоль/л, ХС-ЛПНП 3,8 ммоль/л.

Производим расчет активности каталазы в сыворотке крови:

Активность глутатионпероксидазы в сыворотке крови составляет 15,380 мкмоль/(мкмоль/л/мин).

Таким образом, предлагаемым способом подтвержден диагноз «алкогольный стеатоз печени».

Пример 4. Пациент, 41 год. Со слов пациента алкоголь употребляет около 1 раза в 2 месяца (примерно 30 г 11% сухого вина). Жалоб не предъявляет. АЛТ 14 Ед/л, ACT 16 Ед/л, общий билирубин 8 мкмоль/л, ХС 4,0 ммоль/л, ТГ 0,9 ммоль/л, ХС-ЛПВП 3,56 ммоль/л, ХС-ЛПНП 3,1 ммоль/л.

Производим расчет активности каталазы в сыворотке крови:

Активность глутатионпероксидазы 19,7749 мкмоль /(мкмоль/л/мин). Алкогольный стеатоз печени у женщины исключен. Данный пример иллюстрирует результат предлагаемого способа диагностики.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет обеспечить своевременное выявление алкогольного стеатоза печени на ранней стадии, значительное снижение экономических затрат на лечение и оплачивание больничных листов.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и гепатологии, и может быть использовано для ранней диагностики алкогольного стеатоза печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя. У пациента в сыворотке крови фотометрически определяют активность глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин), с последующим перерасчетом активности глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин), по формуле: , где Е - активность глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин); А - разность экстинции контрольной и опытной проб; V р.с. - объем реакционной смеси равный 2,05 мл; V пр. - объем пробы, мл; l - длина оптического пути - 1 см; Е - молярный коэффициент светопоглощения НАДФН при длине волны 340 нм, равный 6,22 ⋅ 10³ м^-1 ⋅ см^-1; t - время наблюдения 3 мин. При значении активности глутатионпероксидазы менее или равном 16,1 мкмоль/(мкмоль/л/мин) диагностируют алкогольный стеатоз печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя. При значении активности глутатионпероксидазы более 16,1 мкмоль/(мкмоль/л/мин) - отсутствие алкогольного стеатоза печени. Способ обеспечивает возможность снижения травматичности, отсутствия риска осложнений, доступности, простоты исполнения при высокой чувствительности, специфичности и эффективности, за счет определения активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови у обследуемого пациента с синдромом зависимости от алкоголя. 4 пр.

Способ ранней диагностики алкогольного стеатоза печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя, заключающийся в том, что у пациента в сыворотке крови фотометрически определяют активность глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин), с последующим перерасчетом активности глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин), по формуле:

Е - активность глутатионпероксидазы, мкмоль/(мкмоль/л/мин);

А - разность экстинции контрольной и опытной проб;

V р.с. - объем реакционной смеси равный 2,05 мл;

V пр. - объем пробы, мл;

l - длина оптического пути - 1 см;

Е - молярный коэффициент светопоглощения НАДФН при длине волны 340 нм, равный 6,22 ⋅ 10³ м^-1 ⋅ см^-1;

t - время наблюдения 3 мин; и при значении активности глутатионпероксидазы менее или равном 16,1 мкмоль/(мкмоль/л/мин) диагностируют алкогольный стеатоз печени у пациентов с синдромом зависимости от алкоголя, при значении активности глутатионпероксидазы более 16,1 мкмоль/(мкмоль/л/мин) - отсутствие алкогольного стеатоза печени.