Полимерные носители био- и фотоактивных наноструктурированных компонентов, способ их получения и применение в комбинированной локальной АФК-опосредованной и фототермической терапии злокачественных новообразований Российский патент 2024 года по МПК A61K9/51 A61K9/50 A61K33/04 A61K33/242 A61P35/00 B82B1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к системам доставки наноразмерных объектов, обладающими фото- и биоактивными свойствами для лечения онкологических заболеваний при АФК-зависимом механизме апоптоза опухолевых клеток с фототермическим эффектом инкорпорированных наночастиц.

Из уровня техники известны различные носители для внутриклеточной доставки наноструктурированных компонентов, включая вирусы, мицеллы, липосомы, синтетические везикулы и полимерсомы. Однако, полимерные носители имеют ряд преимуществ: простота синтеза, защита терапевтических агентов от связывания с белками плазмы крови, оптимальные характеристики распределения и удержания тканями, а также возможность контроля дозировки доставляемых агентов за счет контролируемого высвобождения; и преодоление барьера липидного бислоя клеточной мембраны различными путями эндоцитоза [Polymer nanocontainers for intracellular delivery / S.P. Chali, B. J. Ravoo // Angewandte Chemie International Edition. – 2020. – № 59 (8). – P. 2962-2972. – URL: https://doi.org/10.1002/anie.201907484].

Перечисленные свойства полимерных носителей открывают широкие возможности для использования их в диагностике и лечении онкологических заболеваний, в том числе и для фототермической терапии.

Фототермическая терапия (Далее – ФТТ) – это неинвазивный терапевтический метод лечения рака, который использует тепловую энергию, индуцируемую материалами для преобразования света в тепло, для подавления активности опухолевых клеток [Solutions to the drawbacks of photothermal and photodynamic cancer therapy / X. Deng, Z. Shao, Y. Zhao // Advanced science. – 2021. – № 8 (3). – P. 16. – URL: https://doi.org/10.1002/advs.202002504].

Основное преимущество ФТТ заключается в том, что светочувствительные материалы локализуются в области опухоли, создавая высокие локальные температуры с минимальным влиянием на здоровые клетки и ткани [NIR-II fluorescence imaging guided tumor-specific NIR-II photothermal therapy enhanced by starvation mediated thermal sensitization strategy / Y. Dai, Z. Sun, H. Zhao, D. Qi, X. Li, D. Gao, M. Li, Q. Fan, Q. Shen, W. Huang // Biomaterials. – 2021. – № 275. – P. 120935. – URL: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.120935], [Highly inoxidizable heptamethine cyanine–glucose oxidase conjugate nanoagent for combination of enhanced photothermal therapy and tumor starvation / Y. Zou, W. Liu, W. Sun, J. Du, J. Fan, X. Peng // Advanced Functional Materials. – 2022. – № 32 (17). – P. 2111853. – URL: https://doi.org/10.1002/adfm.202111853]. ФТТ, тем не менее, имеет ряд недостатков, которые значительно затрудняют широкое применение этого метода в клинической практике:

1. Низкая способность лазерного излучения проникать в глубину опухолевых тканей;

2. Низкая тропность фотоактивных материалов к опухолевым клеткам;

3. Дефекты светочувствительных материалов;

4. Недостаточный фототермический эффект;

5. Возможное термическое повреждение злокачественно не измененных тканей.

[Gold nanoparticle based photothermal therapy: development and application for effective cancer treatment / W. Yang, H. Liang, S. Ma, D. Wang, J. Huang // Sustainable materials and technologies. – 2019. – № 22. – URL: https://doi.org/10.1016/j.susmat.2019.e00109].

Для устранения этих недостатков и было предложено использовать наночастицы (Далее – НЧ) в качестве системы доставки фотоактивных материалов в область опухоли. Наночастицы размером менее 100 нм могут успешно проникать в опухолевые ткани и задерживаться там в течение определенного периода времени [Enhanced primary tumor penetration facilitates nanoparticle draining into lymph nodes after systemic injection for tumor metastasis inhibition / J. Liu, H.-J. Li, Y.-L. Luo, C.-F. Xu, X.-J. Du, J.-Z. Du, J. Wang // ACS Nano. – 2019. – № 13 (8). – P. 8648-8658. – URL: https://doi.org/10.1021/acsnano.9b03472].

Существует два основных способа введения НЧ с загруженным в них лекарственным препаратом: внутривенное и внутриопухолевое. Однако при внутривенной инъекции конечное количество светочувствительных материалов обычно не превышает 5-10 % в месте опухоли, чего не может быть достаточно для эффективной реализации метода ФТТ. Для повышения концентрации фотоактивных материалов внутри опухоли, часто применяют внутриопухолевое введение.

Для минимизации распределения терапевтических агентов за пределами места инъекции (зоны опухоли) используются микроформуляции лекарственных средств. Этот способ введения безопасен для пациентов и позволяет получить высокую концентрацию терапевтических агентов в опухоли [Fluorescent hollow mesoporous carbon spheres for drug loading and tumor treatment through 980-nm laser and microwave co-irradiation / X. Gui, Y. Chen, Z. Zhang, L. Lei, F. Zhu, W. Yang, Y. Guo, M. Chu // Biomaterials. – 2020. – № 248. – P. 120009. – URL: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120009]. В связи с этим микро- и наноконтейнеры нашли применение как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях для местного лечения злокачественных новообразований (Далее – ЗНО).

В исследованиях также было показано, что золотые наночастицы (Далее – НЧ Au) различной морфологии являются одними из наиболее эффективных фототермических наноматериалов для ФТТ благодаря их поверхностному плазмонному резонансу (Далее – ППР) и высокой эффективности преобразования света в тепло [Stephan Link & Mostafa A. El-Sayed (2000): Shape and size dependence of radiative, non-radiative and photothermal properties of gold nanocrystals, International Reviews in Physical Chemistry, 19:3, 409-453. - URL: 10.1080/01442350050034180], [Photothermal-augmented reactive oxygen species oxidative synergistic therapy based on nanoceria doped mesoporous polydopamine nanoplatform / S. Jiang, F. Zhu, Y. Lin, L. Ran, F. Lin, H. Tian, T. Hu, P. Wang, C. Lu // Materials & Design. – 2023. – № 225. – P. 111590. – URL: https://doi.org/10.1016/j.matdes.2023.111590].

Существуют разные способы, направленные на локализацию подачи тепла и на локализованную визуализацию биологических материалов, например, использование лазерного излучения заданной длиной волны совместно с микро- и наноносителями, введенными локально либо внутривенно. Патент [US20020103517, опубл. 08.02.2001] описывает локализованную индукцию гипертермии в раковой клетке или ткани путем доставки НЧ золота и др. металлов в указанную клетку или ткань и воздействия на НЧ источника возбуждения в условиях, при которых данные НЧ выделяют тепло. Данное изобретение имеет схожее строение оболочка-сердцевина, а также может использоваться в инфракрасном диапазоне излучения, однако противоопухолевый эффект достигается только за счет локальной гипертермии, без участия биоактивных компонентов.

В патенте [CN106075443, опубл. 15.07.2015] описываются наночастицы селенида меди, покрытые золотом, которые обладают высокой термической стабильностью, эффективностью фототермического преобразования и агрегативной устойчивостью. Такие НЧ потенциально подходят для лечения ЗНО, однако, до сих пор не применяются в клинической практике. Настоящее изобретение отличается комбинированным воздействием на злокачественно измененные клетки, благодаря наличию дополнительного биоактивного компонента, способного индуцировать выработку активных форм кислорода (далее – АФК).

Патент [CN110680927, опубл. 30.10.2019] описывает способ получения наносфер, содержащих наночастицы золота и оксида железа, которые можно использовать для фототермической терапии с магнитным нацеливанием. Настоящее изобретение также включает в себя наночастицы золота для фототермической терапии, но отличается тем, что используются наночастицы селена для комбинированного эффекта.

Патент [CN105833810, опубл. 06.04.2016] описывает способ получения полимерных полиэлектролитных микрокапсул на основе полистиролсульфоната натрия (далее – ПСС) и поли(аллиламин) гидрохлорида (далее – ПАГ). Предложенное нами изобретение также включает в себя полимерные носители, состоящие из полимерных электролитных слоев, однако, в данном патенте отсутствует применение с включением фотоактивных материалов, за счет которых возможно усиление противоопухолевого эффекта.

Патент [JP2011063867, опубл. 18.09.2009] описывает стержнеобразные золотые наночастицы, покрытые многослойной пленкой из полимеров(поли-(4-стиролсульфонат натрия) и поли-(аллиламин) гидрохлорид), с дополнительным слоем полиэтиленгликоля (далее – ПЭГ) и способ их получения. В формуле патента указано, что получаемые наночастицы используются в качестве биомаркера. При этом, в рамках данного изобретения не проверялось возможность использования данных частиц в терапии и нет никаких данных о способах введения, уровне цитотоксичности и эффективности их использования в ФТТ, что отличается их от заявляемого изобретения. В данном патенте не указывается возможность комбинации с другими видами терапии опухолей, что отличает их от заявляемого изобретения.

В сравнении с использованием фотоактивных нанокомпонентов одного типа, комбинация двух или более элементов в одном носителе повышает фототермическую эффективность, за счет чего может быть достигнут синергетический эффект [Multifunctional microcapsules: A theranostic agent for US/MR/PAT multi-modality imaging and synergistic chemo-photothermal osteosarcoma therapy / H. Wang, S. Xu, D. Fan, X. Geng, G. Zhi, D. Wu, H. Shen, F. Yang, X. Zhou, X. Wang. – Bioactive Materials. – 2022. – № 7. – P. 453-465. – URL: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.05.004].

Из научной литературы также известно, что в комбинации с другими видами терапии опухолей, включая хирургию, химиотерапию, иммунотерапию и фототермические элементы могут повышать эффективность лечения [Recent strategies for nano-based PTT combined with immunotherapy: from a biomaterial point of view / X. Huang, Y. Lu, M. Guo, S. Du, N. Han // Theranostics. – 2021. – № 11 (15). – P. 7546-7569. URL:https://doi.org/10.7150/thno.56482]. Многие из этих методов возможно комбинировать одновременно с помощью полимерных носителей.

В патенте [CN113244195, опубл. 20.05.2021] описывается система для доставки лекарств с наночастицами золота (Au@PDA-PEG-MTX NPs). Данная система также содержит в себе наночастицы золота для фототермической терапии, однако, для получения синергетического эффекта используется химиотерапия с препаратом Метотрексат, который обладает выраженной гематологической токсичностью. Однако, описываемое в заявке изобретение характеризуется отсутствием токсического воздействия на здоровые ткани и организм в целом.

Комбинация фоточувствительных наночастиц с агентами, вызывающими АФК-зависимый апоптоз опухолевых клеток, позволяет сократить длительность воздействия высоких температур, необходимых для ФТТ, а также уменьшить воздействие на окружающие опухолево неизмененные клетки [Recent advances in selective photothermal therapy of tumor / L. Zhao, X. Zhang, X. Wang, X. Guan, W. Zhang, J. Ma // Journal of Nanobiotechnology. – 2021. – № 19 (1). – P. 335. – URL:https://doi.org/10.1186/s12951-021-01080-3], [Nanomedicines for reactive oxygen species mediated approach: An emerging paradigm for cancer treatment / S. Kwon, H. Ko, D.G. You, K. Kataoka, J. H. Park // Accounts of Chemical Research. – 2019. – № 52 (7). – P. 1771-1782. URL: https://doi.org/10.1021/acs.accounts.9b00136].

Изобретателями из Китая была подана заявка на патент [US20110262564A1, опубл. 18.06.2010], который так и не был выдан, в формуле которого заявляется возможность применения наночастиц элементарного селена в способе контроля пролиферации клеток андрогензависимого рака предстательной железы, с предположением об использовании наночастиц селена в качестве фармакологической композиции.

Применение ФТТ в комбинации с АФК-чувствительными наноматериалами позволяет добиться низкой выживаемости (<20%) опухолевых клеток в комбинированной терапии в сравнении с воздействием в моно-режиме.

Ближайшим аналогом для заявляемого изобретения является работа ученых Мичиганского университета и исследователей из Хуачжунского университета науки и технологий, в которой были описаны способы получения наночастиц типа “ядро-оболочка” на основе Au НЧ и Наночастицы селена (Далее – НЧ Se) для комбинированной ФТТ в сочетании с иммунотерапией [Chemo-photothermal therapy combination elicits anti-tumor immunity against advanced metastatic cancer / J. Nam, S. Son, L.J. Ochyl, R. Kuai, A.Schwendeman, J.J. Moon // Nature Communications. – 2018. – № 9 (1). – P. 1074. – URL: https://doi.org/10.1038/s41467-018-03473-9], [Hierarchically constructed selenium-doped bone-mimetic nanoparticles promote ROS-mediated autophagy and apoptosis for bone tumor inhibition / X. Li, Y. Wang, Y. Chen, P. Zhou, K. Wei, H. Wang, J. Wang, H. Fang, S. Zhang // Biomaterials. – 2020. – № 257. – P. 120253. – URL: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120253].

Наночастицы селена оказывают как противоопухолевое действие на различных стадиях канцерогенеза. Однако, такие НЧ Se характеризуются высокой системной токсичностью, что ограничивает их клиническое применение. Описанная выше методика получения НЧ типа «ядро-оболочка» на основе НЧ Au и НЧ Se является наиболее близкой к настоящему изобретению по совокупности существенных признаков (исходные компоненты для синтеза), при этом отличающаяся тем, что:

1. Данная методика синтеза занимает более суток и требует многостадийного процесса (4-5 стадий синтеза);

2. Полученный материал характеризуется низким коэффициентом эффективности фототермического преобразования;

3. Полученный материал показывает противоопухолевую активность по отношению к раку шейки матки (HeLa), однако эффективность комплексов в отношении других опухолевых клеточных линий не была доказана.

Таким образом, до сих пор существует потребность в решении задачи по созданию полимерных носителей для внутриопухолевого введения с возможностью включения фотоактивных и биоактивных наноструктурных компонентов, в том числе с возможностью комбинации фоточувствительных наночастиц с агентами, вызывающими АФК-зависимый апоптоз опухолевых клеток для сокращения длительности воздействия высоких температур, используемых при ФТТ. Причем, такие носители должны отличаться высоким коэффициентом эффективности фототермического преобразования (ŋ > 30-60%), возможностью нивелировать токсичность загружаемых компонентов, что позволит обеспечить локальное комбинированное воздействие на опухолевую ткань, и при этом снизить воздействие на окружение опухолевых клеток.

Разработанный способ получения микро- и субмикронных полимерных носителей с включенными фотоактивными наноструктурированными компонентами обладает рядом преимуществ по сравнению с ближайшим аналогом:

1. Методика синтеза состоит из 2-x стадий и занимает малое количество времени (от 5 до 12 часов в общей сложности);

2. Полученные носители обладают оптимальными фармакокинетическими параметрами и физико-химическими характеристиками, что позволяет обеспечить локальное воздействие на опухолевую ткань;

3. Полученные носители характеризуются высоким коэффициентом эффективности фототермического преобразования (ŋ > 30-60%);

4. Полученные носители обладают высокой агрегативной устойчивостью в биологических средах (стабильны в течение 6 мес.);

5. Полученные носители показывает высокую противоопухолевую активность по отношению к раку шейки матки, меланомы, рака молочной железы и колоректального рака.

Настоящее изобретение решает задачу создания многокомпонентных носителей, обладающих свойствами индукции АФК-зависимого механизма апоптоза и фототермическим эффектом, пригодных для доставки в очаг интереса (опухолевую ткань) для комбинированной локальной терапии ЗНО и оптимизации известной из уровня техники методики синтеза таких носителей.

Сущность заявляемого изобретения заключается в разработке способа получения полимерных носителей с включенными фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами, их применения в медицине, а именно в доставке биологически активных соединений для терапии ЗНО.

Технический результат: получение полимерных носителей с включенными фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами, их применения в медицине, а именно в доставке биологически активных соединений для терапии ЗНО.

Технический результат достигается путем создания способа получения полимерных носителей, включающих: приготовление водных растворов НЧ Au и НЧ Se, синтез полимерных носителей в ядре которых находятся НЧ Au и НЧ Se. При этом фотоактивным компонентом являются НЧ Au, а биоактивным компонентом, вызывающим АФК-зависимый механизм апоптоза опухолевых клеток – НЧ Se.

Полученные в рамках заявляемого продукта полимерные носители могут быть использованы для реализации комплексного подхода для лечения широкого спектра ЗНО. Благодаря своим уникальным фармакологически значимым параметрам, таким как биосовместимость, нетоксичность, биодоступность, разработанные полимерные носители способны обеспечивать доставку в очаг интереса сочетание фото- и биоактивных компонентов.

Использование заявленного изобретения, содержащего в себе фото-и биоактивные элементы, позволяет локально воздействовать непосредственно на клетки опухоли и её микроокружения, что приводит к максимальному терапевтическому эффекту при минимальном воздействии на окружающие здоровые ткани.

В ходе экспериментов была доказана эффективность захвата полимерных носителей (фигура 3) различными опухолево измененными клеточными линиями, что подтверждает их эффективность и говорит об использовании для применения в терапии ЗНО, а именно:

1) Меланома. ЗНО кожи являются одними из агрессивных видов опухолей, поскольку обладают высокой скоростью метастазирования и частотой рецидивирования. Использование предложенного изобретения позволит локально воздействовать на пораженный участок кожи и, в дальнейшем, как следствие избежать метастазирования других органов и систем;

2) Рак молочной железы. На сегодняшний день является самым распространенным онкологическим заболеванием у женщин во всем мире. Лечение пациентов с раком молочной железы 1-й и 2-й стадии заключается в химиотерапии и хирургическом вмешательстве: мастэктомия или лампэктомия. Использование предложенного изобретения позволит избежать хирургического лечения на ранних стадиях, поскольку полимерные носители, содержащие фото- и биоактивные компоненты способны подавлять рост ЗНО и не оказывают негативного воздействия на организм в целом;

3) Интракраниальные опухоли головного мозга. Являются прогрессирующим заболеванием в XXI в. Они отличаются быстрым ростом и агрессивным воздействием на здоровые ткани, прорастая в них или сдавливая. Одним из подходов лечения ЗНО головного мозга является лучевая терапия, однако такой вид терапии подходит не всем пациентам и характеризуется высоким риском воздействия на злокачественно неизмененные клетки головного мозга. Фототермическая терапия является многообещающим терапевтическим подходом, использующим лазерное излучение, чтобы вызвать локальное термическое повреждение в интересующей области. Использование текущего изобретения в лечении ЗНО головного мозга представляет собой вариант комбинированного локального воздействия на пораженный участок головного мозга без воздействия на окружающие ткани.

На Фигуре 4 представлены результаты экспериментов, отражающие влияние синергического противоопухолевого эффекта in vitro от НЧ Se и НЧ Au, включенных в ядро полимерных носителей.

Для этого варьировали количество фото- и биоактивных компонентов НЧ Se (5 и 100 мкг) и НЧ Au NRs (5 и 60 мкг) внутри полимерных носителей. Чтобы оценить цитотоксичность и фототермический эффект всех исследуемых образцов, был использован метод проточной цитометрии с детекцией 7-AАD. Результаты показывают, что НЧ Se, иммобилизованные в полимерные носители, индуцируют гибель клеток в зависимости от концентрации и вне зависимости от лазерного излучения, НЧ Au без лазерного излучения не проявляют токсического воздействия на клетки, что согласуется с литературными данными, а комбинация НЧ Se:Au при воздействии лазерного облучения вызывает гибель 90% клеток.

На Фигуре 5 представлена схема терапии, благодаря которой была доказана противоопухолевая эффективность разработанных полимерных носителей, содержащих НЧ Se и НЧ Au использовали мышей-носителей опухоли B16-F10 (размер опухоли составлял около 100 мм3 или 0,1 см3). Мышей случайным образом разделили на восемь групп: ФСБ (контрольная группа), ФСБ+ лазер, НЧ Se, НЧ Se + лазер, НЧ Au, НЧ Au + лазер, НЧ Se:Au и НЧ Se:Au + лазер. После внутриопухолевой инъекции тестируемых материалов опухоли облучали лазером в течение 5 мин на животное. Изменения средних объемов опухоли оценивали каждые 3-4 дня. На Фигуре 5 показаны профили роста опухолей восьми групп мышей в течение 14 дней. По сравнению с контрольной группой ФСБ, все группы, получавшие лечение, демонстрировали сниженную скорость роста опухоли. Наибольшая эффективность ингибирования опухоли наблюдалась в группе НЧ Se:Au + лазер.

Таким образом, объектом настоящего изобретения являются полимерные носители био- и фотоактивных наноструктурированных компонентов, способ их получения и применение в комбинированной локальной АФК-опосредованной и фототермической терапии злокачественных новообразований.

Использование изобретения позволяет достичь синергетического эффекта между АФК-опосредованной терапией с помощью наночастиц Se и ФТТ за счет НЧ Au. Высокая внутриклеточная концентрация АФК, возникающая в присутствии НЧ Se, индуцирует апоптоз опухолевых клеток, а НЧ Au под действием электромагнитного излучения в инфракрасном диапазоне приводят к гибели опухолевых клеток вследствие возникающих фототермических эффектов.

На Фигурах иллюстрирующих техническое решение дано:

На Фигуре 1 Схема синтеза полимерных носителей с включенными фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами для целей комбинированной ФТТ ЗНО: 1 – CaCl₂, 2 – Na₂CO₃, 3 – НЧ биоактивного компонента, 4 – НЧ фотоактивного компонента, 5 – ядро из CaCO₃ с НЧ фото- и биоактивных компонентов, 6 – полимер с положительным зарядом, 7 – полимер с отрицательным зарядом, 8 – ядро из CaCO₃ с НЧ фото- и биоактивных компонентов, покрытое полимерными слоями, 9 – растворение ядра с помощью ЭДТА, 10 – полимерный носитель с НЧ фото- и биоактивных компонентов.

На Фигуре 2 представлена характеризация полимерных носителей и фото- и биоактивных компонентов при помощи просвечивающей электронной микроскопии (далее – ПЭМ). 11 и 12 представляют собой изображения ПЭМ, подтверждающие неагрегированное состояние как НЧ Au, так и НЧ Se. 13 - изображение ПЭМ, подтверждающее монодисперсное распределение НЧ Se и Нч Au в полости полимерного носителя.

На Фигуре 3 Результаты проточной цитометрии по эффективности захвата полимерных носителей клетками меланомы (B16-F10) при различном соотношении клетка:полимерный носитель: 14 – 1:1, 15 – 1:3, 16 – 1:5, 17 – 1:10. *APC-Cy7 – аллофикоцианин+цианиновый краситель Cy7.

На Фигуре 4 представлены результаты эксперимента in vitro, полученные с помощью проточной цитофлуометрии, отражающие выживаемость клеток меланомы (B16-F10), инкубированных с различными концентрациями полимерных носителей, со включенными в них фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами:18 - контроль, 19 - НЧ Se 5 мкг; 20 - НЧ Se 100 мкг; 21 - НЧ Au 5 мкг ; 22 - НЧ Au 60 мкг ; 23 - НЧ Se/Au 100/60 мкг). *7-ААД – 7-аминоактиномицин.

Фигура 5 - противоопухолевый эффект in vivo в зависимости от полимерных носителей содержащих фото- и биоактивные наноструктурированные компоненты для АФК-опосредованной комбинированной PTT против опухоли меланомы B16-F10: 24 – натрий-фосфатный буфер, 25 - натрий-фосфатный буфер+лазер, 26 – НЧ Au, 27 – Se:Au, 28 – НЧ Se, 29 – НЧ Se+лазер, 30 – НЧ Au+лазер, 31 – Se:Au+лазер.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

Этап 1. Синтез полимерных носителей с включенными фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами.

1.1 Получение наноструктурированных фото- и биоактивных материалов;

1.2 Инкапсуляцию фото- и биоактивных материалов в структуру полимерных носителей.

Этап 2. Внутриопухолевое введение носителей, содержащих наночастицы селена и золота.

Этап 3. Воздействие электромагнитным излучением в инфракрасном диапазоне на инкапсулированные наночастицы золота и селена.

Далее осуществление изобретения показано на конкретных примерах, что не должно восприниматься как ограничение в отношении созданного изобретения.

Пример 1.

Этап 1. Синтез наночастиц селена

Наночастицы Se получают путем приготовления водного раствора H₂SeO₃ в концентрации 1-1000 мг/мл и его смешивания с водным раствором полистирол сульфата в концентрации 1-10 мг/мл. После смешивания в реакционную смесь добавляют 1-1000 мМ аскорбиновой кислоты до окрашивания раствора в желтый цвет (рН 3,4-3,6). Затем в раствор добавляют деионизованную воду для получения и оставляют реакцию на 2-7 часов при комнатной температуре. Не прореагировавшую аскорбиновую кислоту и H₂SeO₃ удаляют методом диализа в воде в течение 12 ч (рН 6,0-6,5).

Этап 2. Синтез наночастиц золота (НЧ Au)

Исходный раствор получают путем смешивания 0,1-1 М раствора CTAB с 0,1-1 мМ HAuCl₄ при постоянном перемешивании. Затем свежеприготовленные 0,01-0,1 М NaBH₄ разбавляют деионизованной водой до 1 мл и добавляют к раствору Au(III)-поверхностно-активного вещества. Затем, 1-10 M NaOH и 9 г 1-10 M смешивают с 100-500 мл воды и нагревают до полного растворения реагентов. Затем раствор охлаждают и добавляют 1-10 мM AgNO₃. После этого добавляют 100-500 мл 1-10 мM раствора HAuCl₄ и оставляют при непрерывном перемешивании (700 об/мин) на 90 мин. Для регулирования рН вводят 1-10 мл HCl. К раствору добавляют 0,01-1 М аскорбиновой кислоты и добавляют ранее приготовленный раствор частиц. Полученный раствор оставляют на 12 ч при 30°C для образования НЧ Au. На следующий день НЧ Au центрифугируют при 7000 об/мин в течение 30 мин для удаления надосадочной жидкости и ресуспендируют в том же количестве деионизированной воды. Далее, НЧ Au покрывают CTAB. Для этого 15 мл ранее приготовленной суспензии НЧ Au центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 10 мин. Затем отбирают надосадочную жидкость и НЧ Au повторно ресуспендируют в 0,5 мл водного раствора H₂N-PEG-SH (1-10 мг/мл) с использованием ультразвука. Затем НЧ Au снова центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость и добавляют к НЧ Au еще 0,5 мл водного раствора H₂N-PEG-SH, по истечению времени повторяют процедуру обработки ультразвуком.

Этап 3. Инкапсулирование НЧ Se и НЧ Au в структуру полимерных носителей

Для получения полимерных носителей водный раствор хлорида кальция (CaCl₂) с концентрацией 1-10М и смешивают с НЧ Se и НЧ Au. Затем в смесь по каплям добавляют карбонат натрия (Na₂CO₃, 1-10М), при непрерывном перемешивании 1000 об/мин в течение 30 с при комнатной температуре.

Полученные ядра промывают водой. Далее к промытым ядрам CaCO₃ (Se-Au) добавляют раствор полимера (например, ПАГ) и перемешивают при комнатной температуре. Затем ядра CaCO₃ (Se-Au) 2 раза промывают водой и добавляют раствор другого полимера (например, ПСС). Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком и перемешивают при комнатной температуре. Эту процедуру повторяют 6 раз для образования частиц “ядро-оболочка”. Затем ядра CaCO₃ удаляют путем растворения в растворе ЭДТА. Для этого к полученной суспензии частиц добавляют ЭДТА (0,1-1М) и ресуспендируют. Затем полученные полимерные носители дважды промывают деионизованной водой и диспергируют в изотоническом растворе.

Для синтеза полимерных носителей используется:

Дигидрат хлорида кальция (CaCl₂, MW = 147,01), безводный карбонат натрия (Na₂CO₃, MW = 105,99), поли-(4-стиролсульфонат натрия) (ПСС, MW = 70 000) и поли-(аллиламин) гидрохлорид (ПАГ, MW = 17 000), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, MW=292,2438), очищенная вода с удельным сопротивлением выше 18,2 MΩ cm^-1 из трехступенчатой системы очистки Milli-Q Plus 185.

Для синтеза биоактивных компонентов используется:

Тригидрат хлорида золота (III) (HAuCl₄·3H₂O, ≥ 99,9%), аскорбиновая кислота (AК, ≥99,0%), борогидрид натрия (NaBH₄, 98%), бромид цетилтриметиламмония (CTAB, ≥99%), гидроксид натрия (NaOH, > 97,0%) и амин-поли(этиленгликоль)-тиол (NH₂-PEG-SH, MW 1.000), сложный эфир сульфоцианина 5 NHS (Cy5, MW = 777,95), бычий сывороточный альбумин (БСА, 66 кДа), селенистая кислота (H₂SeO₃, MW = 128,97, ≥ 99,9%), очищенная вода с удельным сопротивлением более 18,2 MΩ cm^-1 из трехступенчатой системы очистки Milli-Q Plus, поли-(4-стиролсульфонат натрия) (ПСС, MW = 70 000).

Группа изобретений относится к многокомпонентному носителю типа «ядро-оболочка» для доставки наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза и обладающих фототермическим эффектом, в опухолевую клетку или клетку, образующую её микроокружение, включающему в ядре наночастицы золота в качестве наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза, и наночастицы селена в качестве наноструктурированных компонентов, обладающих фототермическим эффектом, а в оболочке включающему полимерные слои, выполненные из поли(аллиламин) гидрохлорида, поли(4-стиролсульфоната натрия), также относится к способу получения многокомпонентного носителя, состоящему в том, что водный раствор хлорида кальция смешивают с наночастицами селена и наночастицами золота, затем в полученную смесь по каплям добавляют карбонат натрия при непрерывном перемешивании 1000 об/мин в течение 30 с при комнатной температуре для получения ядер карбоната кальция, затем ядра карбоната кальция, содержащие наночастицы селена и наночастицы золота, покрывают полимерными слоями следующим образом: ядра карбоната кальция с наночастицами промывают водой и добавляют к ним раствор поли(аллиламин) гидрохлорида, затем ядра карбоната кальция с наночастицами промывают водой 2 раза и добавляют раствор поли(4-стиролсульфоната натрия), полученную суспензию обрабатывают ультразвуком и перемешивают при комнатной температуре, и повторяют покрытие полимерными слоями 6 раз для образования частиц «ядро-оболочка», затем ядра карбоната кальция удаляют путем растворения в растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты, также относится к применению многокомпонентного носителя для доставки наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза и обладающих фототермическим эффектом, в опухолевую клетку или клетку, образующую её микроокружение, посредством внутриопухолевого введения субъекту для терапии злокачественных новообразований. Группа изобретений обеспечивает получение полимерных носителей с включенными фото- и биоактивными наноструктурированными компонентами, их применение в медицине, а именно в доставке биологически активных соединений для терапии злокачественных новообразований (ЗНО). 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 пр.

1. Многокомпонентный носитель типа «ядро-оболочка» для доставки наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза и обладающих фототермическим эффектом, в опухолевую клетку или клетку, образующую её микроокружение, включающий в ядре наночастицы золота в качестве наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза, и наночастицы селена в качестве наноструктурированных компонентов, обладающих фототермическим эффектом, а в оболочке включающий полимерные слои, выполненные из поли(аллиламин) гидрохлорида, поли(4-стиролсульфоната натрия).

2. Способ получения многокомпонентного носителя по п.1, состоящий в том, что водный раствор хлорида кальция смешивают с наночастицами селена и наночастицами золота, затем в полученную смесь по каплям добавляют карбонат натрия при непрерывном перемешивании 1000 об/мин в течение 30 с при комнатной температуре для получения ядер карбоната кальция, затем ядра карбоната кальция, содержащие наночастицы селена и наночастицы золота, покрывают полимерными слоями следующим образом: ядра карбоната кальция с наночастицами промывают водой и добавляют к ним раствор поли(аллиламин) гидрохлорида, затем ядра карбоната кальция с наночастицами промывают водой 2 раза и добавляют раствор поли(4-стиролсульфоната натрия), полученную суспензию обрабатывают ультразвуком и перемешивают при комнатной температуре, и повторяют покрытие полимерными слоями 6 раз для образования частиц «ядро-оболочка», затем ядра карбоната кальция удаляют путем растворения в растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты.

3. Применение многокомпонентного носителя по п.1 для доставки наноструктурированных компонентов, обладающих АФК-зависимым механизмом апоптоза и обладающих фототермическим эффектом, в опухолевую клетку или клетку, образующую её микроокружение, посредством внутриопухолевого введения субъекту для терапии злокачественных новообразований.

4. Применение многокомпонентного носителя по п.3, где фототермический эффект достигается посредством действия лазерного излучения.