Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола Российский патент 2024 года по МПК A61K35/12 A61K35/66 A61K35/76 A61K39/12 A61K39/395 A61K39/42 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, в частности, к разработке способа получения специфического средства экстренной профилактики против лихорадки Эбола.

Геморрагическая лихорадка, вызываемая вирусом Эбола, является особо опасным вирусным инфекционным заболеванием, характеризующимся летальным исходом в 50-90% случаев. Данная нозологическая форма впервые была выявлена в 1976 г., а пристальное внимание к заболеванию значительно усилилось после крупнейшей эпидемии лихорадки Эбола за всю историю наблюдений в странах Западной Африки во втором десятилетии 21 века. Общее количество заболевших (подтвержденные случаи) с декабря 2013 г. по июнь 2016 г. составило 28652, из них погибло 11325. В ходе данной эпидемии зарегистрированы случаи завоза заболевания из Западной Африки на все обитаемые континенты. Всего было зарегистрировано 36 завозных случаев заболевания в не эндемичных регионах [Baize, S.EmergenceofZaireEbolaVirusDiseaseinGuinea-PreliminaryReport/S. Baize, D. Pannetier, L. Oestereich, [et al.]//NewEng. J. Med. - 2014. -NEJM.org. - P. 1-8].

Важнейшим компонентом рассматриваемого Всемирной организацией здравоохранения спектра медицинских средств экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола на сегодняшний день являются препараты на основе вирусспецифических антител, в том числе и гетерологичные иммуноглобулины с высоким титром вируснейтрализующих антител (далее - ВНА) [http://apps.who.int/gho/data/node.ebola-sitrep].

Показана возможность использования лошадей в качестве продуцентов гипериммунной сыворотки против вируса Эбола [Краснянский В.П., Михайлов В.В., Борисевич И.В., Градобоев В.Н., Евсеев А.А., Пшеничнов В.А. Получение гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса Эбола //Вопр. вирусол. - 1995. - №3. - С. 138-140]. После первичного введения лошадям вируса в диапазоне доз от 2,5⋅10⁷ до 6,0⋅10⁹ БОЕ титры специфических ВНА в сыворотке крови животных определяли в диапазоне от 1:4 до 1:64. Повторные введения вируса Эбола в тех же дозах позволяют значительно повысить уровень иммунного ответа у продуцентов, что позволяет получать от них гипериммунные сыворотки с титром ВНА до 1:4096.

На основе гипериммунной сыворотки из крови лошадей разработан иммуноглобулин против лихорадки Эбола, жидкий [Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола // Вопр. вирусол. - 1995. - №6. С. 270-273], разрешенный для медицинского применения. Препарат зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств и разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска в РФ (регистрационное удостоверение №96/309/123/8) [Государственный Реестр лекарственных средств. М.: Медицина, 1996].

Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включает наработку биомассы штамма Заир вируса Эбола на основе плодиков инфицированных, развивающихся куриных эмбрионов, проведение иммунизации лошадей, взятие гипериммунной крови у лошадей-продуцентов, получение сыворотки, выделение иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду, концентрирование, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку готового препарата. Указанный способ обеспечивает получение нетоксичного стерильного средства экстренной профилактики против лихорадки Эбола со специфической активностью, выражающейся титром вируснейтрализующих антител (ВНА) не ниже 1:4096, содержанием гамма-глобулиновой фракции не ниже 90%, содержанием примесей посторонних белков не более 10%. Препарат иммуноглобулина содержит остаточное количество этилового спирта (не более 4%.). [Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1995; 6: 270-273].

Недостатком разработанного препарата является его высокая анафилактогенность (индекс анафилаксии по Вейглу 2,5±0,5), обусловленная наличием в получаемом конечном продукте большого количества посторонних белков сыворотки крови (до 10% альбуминов, α- и β-глобулинов). Эти компоненты, а также остаточное количество (до 4%) этилового спирта повышают реактогенность препарата [Иммуноглобулин против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкий: ФСП 42-0102-0242-00, ФС 42-0030-00. Введ. 2000-07-26. М.: Департамент Государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ, 2000].

Так же разработан способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, обеспечивающий получение конечного продукта с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта [Пат. 2018 г. Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого //А.Ю. Попова, Ю.В. Демина, В.Ю. Смоленский, Е.В. Гордеев, Е.В. Рождественский, В.П. Краснянский, Д.А. Кутаев, В.Б. Пантюхов, Н.К. Черникова, С.А. Мельников, С.В. Борисевич, И.В. Борисевич, С.А. Нимирская, Я.В. Полянский, С.В. Назаров, Г.Д. Тиманькова, А.Ю. Зверев, В.В. Осин, А.Ф. Андрус, С.И. Сыромятникова, И.В. Шатохина, Т.Е. Сизикова, И.Г. Румянцева, заявитель и патентообладатель ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России]. Данный способ рассматривается нами в качестве прототипа к заявленному изобретению.

Общими с прототипом признаками являются наличие стадий приготовления антигена из вирулентного штамма Заир вируса Эбола для иммунизации лошадей, взятие крови, содержащей специфические антитела к вирусу Эбола, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, стерилизующая фильтрация, фасовка и упаковка.

Заявленный способ отличается от прототипа тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, а не осаждением этиловым спиртом нахолоду, для очистки используют сочетание аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, а не ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Доля мономеров иммуноглобулина в конечном препарате при заявляемом способе составляет 97,5±0,5%, при прототипом способе - 95,0±0,5% (различия достоверны с вероятностью р<0,01). В способе-сравнении предполагается оценка с помощью ВЭЖХ только конечного препарата, в заявленном способе ВЭЖХ проводят как после аффинной, так и после гель-фильтрационной хроматографии.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, обеспечивающего получение конечного продукта со степенью очистки не менее 97%, что позволяет минимизировать анафилактогенность и реактогенность готового препарата.

Технический результат изобретения

Заявленный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиного очищенного с высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 97%) и количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 3%), что снижает анафилактогенность иммуноглобулина (индекс анафилактогенности ≤1,0) и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам [Европейская Фармакопея 7.0.Том 1, 2010: 1273 с.].

Указанный технический результат достигается за счет того, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G и скорости подачи образца 60 см ч^-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см ч^-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 c разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см ч^-1.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола предполагает выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки методом осаждения путем добавления сульфата аммония, двухэтапную очистку иммуноглобулина с применением аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, а также концентрирование раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке с использованием кассеты с пределом эксклюзии мембраны 50 кДа.

Стадия аффинной хроматографии с использованием сорбента Protein G позволяет выделить из осажденной сульфатом аммония смеси глобулинов сыворотки крови лошади фракцию иммуноглобулина G, удалить сульфат аммония, остатки альбумина, а также фракции эуглобулинов.

На следующем этапе очистки с помощью гель-фильтрационной хроматографии от целевого продукта отделяют высокомолекулярные фракции димеров и полимеров антител и низкомолекулярные фрагментарные фракции, которые снижают качество иммуноглобулинов, а также происходит переход на конечный буферный раствор.

Предлагаемый способ является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации неизвестен аналогичный способ получения гетерологичного иммуноглобулина против геморрагической лихорадки Эбола.

Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку из уровня техники явным образом не следует, что использование совокупности используемых методических приемов обеспечивает получение высокоочищенного иммуноглобулина с долей мономерной фракции 97,5±0,5%.

Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.

Изобретение иллюстрируют следующие табличные и графические материалы.

В таблице 1 представлены результаты количественной оценки процесса получения специфического гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола двухстадийным методом аффинной хроматографии и гель-фильтрации.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика показателей качества иммуноглобулинов против лихорадки Эбола, полученных разными методами.

В таблице 3 представлена оценка гиперчувствительности немедленного типа при введении хроматографически очищенного иммуноглобулина против лихорадки Эбола и иммуноглобулина, полученного спиртовым осаждением.

В таблице 4 представлены результаты сравнения протективных свойств препаратов хроматографически очищенного иммуноглобулина и препарата, полученного методом спиртового осаждения.

На фиг. 1 представленахроматограмма ВЭЖХ исходной гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса Эбола.

На фиг. 2 представленахроматограмма аффинной очистки препарата иммуноглобулина на колонке ХК 26/40 с сорбентом Protein G Sepharose6 FF

На фиг. 3 Хроматограмма ВЭЖХ иммуноглобулина G к вирусу Эбола после стадии аффинной препаративной очистки

На фиг 4 Хроматограмма ВЭЖХ IgG после стадии препаративной гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 prepgrade

На фиг. 5 Хроматограмма ВЭЖХ IgG после стадии гель-фильтрации На фиг.6 Хроматограмма иммуноглобулина G, из сыворотки крови лошадей фирмы Rockland(США)

Пример выполнения 1. Выделение иммуноглобулина G методом осаждения сульфатом аммония

Лошадиную сыворотку содержащую антитела к вирусу Эбола разбавляли буфером 20 мМТрис, рН 8,0, в соотношении 1:1. К полученному раствору по каплям добавляли насыщенный (4,32 М) раствор сульфата аммония (в соотношении 1:2) в течение 60 минут, в результате чего достигали 50% насыщения раствора. При этом гамма глобулиновые фракции сыворотки крови лошади выпадают в осадок, а в растворе остаются альбумины. Для получения осадка проводили центрифугирование полупродукта при 3000 об мин^-1 в течение 30 минут. Полученный осадок растворяли в соотношении 1:100 буфером, содержащим 16 мМ Na₂HPO₄ и 4 мМ NaH₂PO₄ (буфер А), рН раствора доводили до значения 7,0 1 М раствором гидроксида натрия. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда на спектрофотометре GeneQuant1300 (GEHealthcare, Швеция). Далее раствор (для отделения от липидов и липопротеинов) фильтровали через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Полученный препарат соответствовал следующим показателям:

Концентрация общего белка - 21,4 мг мл^-1;

Содержание иммуноглобулина G - 88,2%;

Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 89,3%;

Титр ВНА - 1:2048.

Пример выполнения 2. Очистка методом аффинной хроматографии

Очистка методом аффинной хроматографии на сорбенте Protein G включает следующие стадии:

- уравновешивание колонки буфером А;

- нанесение образца на колонку;

- промывание колонки буфером А для удаления не связавшихся с сорбентом белков;

- элюция с колонки фракции целевого белка.

Для хроматографической очистки препарат наносили на колонку со скоростью потока 60 см⋅ч^-1. Белковые компоненты, не связавшиеся с сорбентом, выходят с потоком, объем которого составляет 1,1 от объема нанесенного препарата. Связавшийся с сорбентом специфический иммуноглобулин элюировали с колонки 100 мМ раствором глицина, рН 2,7 (буфер Б) со скоростью потока 100 см⋅ч^-1.

Полученный препарат соответствовал следующим показателям:

Концентрация общего белка - 50 мг-мл^-1;

Содержание иммуноглобулина G - 92,1%;

Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 92,0%;

Титр ВНА - 1:4096.

Пример выполнения 3. Очистка методом гель-фильтрационной хроматографии

Заключительную очистку проводили с помощью препаративной гель-фильтрации на колонке ХК 26/70, наполненной сорбентом Superdex 200 prepgrade (GEHealthcare, Швеция). Разделение белков проводили в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч^-1. Фракции мажорных пиков объединяли и концентрировали в тангенциальном потоке на мембранах с пределом эксклюзии 50 кДА (Millipore, Франция) до конечной концентрации 5%. Данный способ позволяет разделить белковые молекулы в зависимости от их молекулярных масс, благодаря большей скорости прохождения через сорбент тяжелых молекул по сравнению с более легкими фрагментами.

Полученный препарат соответствовал следующим показателям:

Концентрация общего белка - 50 мг⋅мл^-1;

Содержание иммуноглобулина G - 98,6%;

Выход по мономерной фракции иммуноглобулина G - 97,5%;

Титр ВНА - 1:8192.

Пример выполнения 4. Проведение эксклюзионной ВЭЖХ для оценки молекулярных параметров иммуноглобулина против лихорадки Эбола

Использовали хроматографическую колонку Agilent BioSEC-3, размер 300⋅7,8 мм, диаметр частиц 3 мкм (Agilent, США), которая позволяет разделить белки в диапазоне молекулярных масс от 10 до 600 кДа. Исследование проводили на хроматографической системе Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным детектором. Испытуемые образцы доводили до концентрации 5 мг⋅мл^-1 раствором, содержащим 20 мМ натрия дигидрофосфата моногидрата и 0,2% глицина (данный раствор используют так же в качестве плацебо).

Объем пробы - 20 мкл. Содержание белка - около 100 мкг. Скорость потока - 0,5 мг⋅мл^-1. Длина волны детектирования - 280 нм. Последовательность ввода проб: П-С₁-С₂-О₁-О₂-О₃-С₁-С₂, где П - плацебо, C₁ и С₂ - растворы стандартных образцов лошадиного и человеческого иммуноглобулинов соответственно, О₁, O₂, О₃ - испытуемые образцы иммуноглобулинов (серии №2, 3, 4). Инжекции испытуемых образцов повторяли трижды для каждой серии.

Пример выполнения 5. Концентрирование и стерилизующая фильтрация

Для доведения содержания иммуноглобулина в препарате до нормативного - 30 мг/мл (3% раствор) после второго этапа хроматографической очистки полупродукт иммуноглобулина концентрировали на установке с тангенциальным потоком Sartoflow Smart с использованием кассеты Sartocon Slice (Sartorius^®, Германия) (мембрана PESU с размером пор 50 кДа).

Раствор с помощью перистальтического насоса подавали в рециркуляторный бак и далее на мембрану кассеты. Пермиат, содержащий раствор солей, по отводящим трубкам поступал в сборник и утилизировался, а концентрат (частицы размером больше 50 кДа), содержащий целевой белок, возвращался в рециркуляторный бак. Разница давления на входе и выходе при фильтровании автоматически поддерживалась на уровне одного бара. Из одного литра иммуноглобулина получали около 100 мл концентрированного препарата (концентрирование в 10 раз).

Стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина проводили под давлением, не превышающем 0,2 Мпа, при помощи перистальтического насоса, со скоростью потока 0,025 л/мин, через комбинированный стекловолоконый-полиэфирсульфоновый фильтр Sartolab P20Plus (Sartorius^®, Германия) с размером пор 0,2 мкм.

Разработанный образец иммуноглобулина против лихорадки Эбола представляет собой препарат с содержанием мономерной фракции иммуноглобулина 97,5±0,5%, доля димеров иммуноглобулина не более 2,3%, полимеров и агрегатов не более 0,2%.

Стерильный препарат разливали в стеклянные флаконы по 5 мл.

Пример выполнения 6. Сравнительное определение гиперчувствительности немедленного типа для полученного препарата иммуноглобулина

При проведении экспериментов использовали беспородных морских свинок разнополых массой от 250 до 350 г. из питомника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России.

Морским свинкам в область подмышечной впадины внутрикожно вводили 0,1 мл исследуемого иммуноглобулина. Через 30 мин регистрировали отек или покраснение в месте введения и измеряли его диаметр. Проведено сопоставление величин диаметра отека или покраснения в месте введения препарата и содержанием мономеров иммуноглобулина. Данные, полученные при анализе хроматографически очищенного препарата иммуноглобулина, и препарата, полученного спиртовым осаждением по Кону, представлены в таблице 3.

Как следует из представленных данных, между сравниваемыми показателями установлена коррелятивная зависимость. Полученные результаты указывают на необходимость использования параметров, полученных с помощью ВЭЖХ, при разработке гетерологичных иммуноглобулинов против особо опасных инфекционных заболеваний вирусной этиологии.

Пример выполнения 7. Определение протективных свойств полученного препарата иммуноглобулина в отношении геморрагической лихорадки Эбола при использовании по схеме экстренной профилактики.

Проведено сравнительное изучение протективных свойств препарата хроматографически очищенного иммуноглобулина и препарата иммуноглобулина, полученного спиртовым осаждением по Кону.

Испытания защитной эффективности препаратов при введении по экстренно-профилактической схеме проводили на морских свинках. При проведении испытаний использовали серию №3 хроматографически очищенного иммуноглобулина и серию №8 иммуноглобулина, полученного методом спиртового осаждения. В экспериментах использовали морских свинок массой от 250 до 350 г из питомника ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Животных делили на две опытные группы: - введение инфицированным свинкам испытуемых препаратов иммуноглобулина (группы 1 и 2) и четыре контрольные группы: - инфицированные животные без последующего введения иммуноглобулина (группа 3): неинфицированные животные с введением хроматографически очищенного иммуноглобулина (группа 4): - неинфицированные животные с введением иммуноглобулина, полученного методом спиртового осаждения по Кону (группа 5): - чистые животные (группа 6). Животных групп 1-3 внутримышечно инфицировали адаптированным к морским свинкам штаммом вируса Эбола в дозе 50 БОЕ(≈20ЛД_50МСВБ). [Патент РФ №2749345 на изобретение «Адаптированный для морских свинок штамм ЭЗМС 2020 вируса Эбола-Заир, предназначенный для проведения доклинических испытаний МСЗ в отношении геморрагической лихорадки Эбола, авторы Сизикова Т.Е., Сыромятникова СИ., Шатохина И.В., Боярская Н.В., Шагарова Н.В., Левкович Н.Г., Румянцева И.Г., Андрус А.Ф., Чифанов Д.Е., Чухраля О.В., Ковальчук А.В., Пантюхов В.Б., Борисевич С.В.].Через час после инфицирования животным в место инъекции вируссодержащего материала вводили 1,0 мл препарата иммуноглобулина. Животным групп 4 и 5 вводили 1,0 мл препарата иммуноглобулина. Наблюдение за животными проводили в течение 21 суток. Специфичность гибели подтверждали выявлением РНК вируса Эбола в печени погибших животных с помощью ОТ-ПЦР-РВ.

Как следует из полученных данных, для обоих изучаемых видов гетерологичного иммуноглобулина установлена высокая защитная эффективность, что позволяет сделать вывод о том, что примененный процесс очистки не оказывает влияния на его протективные свойства.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола. Способ получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение иммуноглобулина, очистку и концентрирование методом хроматографии, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G при скорости подачи образца 60 см⋅ч^-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см⋅ч^-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 с разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч^-1. Использование изобретения обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиного очищенного с высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 97%) и количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 3%), что снижает анафилактогенность иммуноглобулина (индекс анафилактогенности ≤1,0) и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам. 6 ил., 4 табл., 7 пр.

Способ получения высокоочищенного гетерологичного иммуноглобулина жидкого против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение иммуноглобулина, очистку и концентрирование методом хроматографии, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из лошадиной иммунной сыворотки проводят методом осаждения путем добавления сульфата аммония, очистку иммуноглобулина проводят в два этапа, для первого этапа очистки применяют аффинную хроматографию на сорбенте Protein G при скорости подачи образца 60 см⋅ч^-1 с последующей элюцией на скорости потока 100 см⋅ч^-1 100 мМ раствором глицина, рН 2,7, для второго этапа применяют гель-фильтрационную хроматографию на сорбенте Superdex 200 с разделением белков в изократическом режиме элюирования фосфатно-солевым буфером, рН 7,2, при скорости потока 50 см⋅ч^-1.