ВЫБОР И ПРИМЕНЕНИЕ ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ МЕЛАТОНИН БАКТЕРИЙ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ МЛАДЕНЧЕСКИХ КОЛИК Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 A61P1/00 A61P1/06 A61P25/00 C12R1/225 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение обеспечивает определенные штаммы молочнокислых бактерий, отобранные по их способности повышать уровень мелатонина для профилактики и/или лечения колик (или других заболеваний, связанных с пониженным уровнем мелатонина), включая способность продуцировать предшественников и другие важные компоненты для высвобождения мелатонина, способ отбора таких штаммов и продуктов, содержащих такие штаммы. Кроме того, это изобретение относится к препаратам, включающим компоненты субстрата, специально выбранные для повышения эффективности таких штаммов.

Уровень техники

Несмотря на их значимость с точки зрения распространенности и причиняемые ими страдания, природа и причины детской колики остаются плохо изученными. Существуют также разные термины, применяемые для описания этого состояния. Эти термины включают такие термины как «младенческие колики», «вечерние колики», поскольку появление боли в основном ограничивается вечерним временем, и «трехмесячные колики» под тем предлогом, что они исчезают примерно через три месяца после рождения. Разные авторы применяют разные определения. В литературе, в основном, принято определение Весселя (Wessel), согласно которому колики - это пароксизмы плача в течение трех или более часов в день в течение трех или более дней в неделю в течение, по меньшей мере, трех недель. В 2006 году были опубликованы критерии Rome III, в соответствии с которыми этот критерий был изменен с целью рассмотрения диагноза «младенческая колика», применимого к младенцам с приступами раздражительности, беспокойства или плача, которые начинаются и прекращаются без очевидной причины, продолжительностью 3 или более часов в день и возникающими по меньшей мере 3 дня в неделю, но не менее 1 недели (иногда их называют модифицированными критериями Весселя). Критерии Rome IV представляют собой дальнейшее более тонкое уточнение критериев (Benninga et al; Gastroenterology 2016; 150: 1443-1455). Любое из этих определений (Rome III или Rome IV) относится к настоящему изобретению.

На сегодняшний день основные обсуждаемые возможные причинные факторы детской колики подразделяют на: психосоциальные, желудочно-кишечные, включая микробный дисбактериоз, и нарушения развития нервной системы.

Психосоциальные факторы включают: варианты нормального плача, поведенческие эффекты атипичного выполнения родительских обязанностей и проявление проблем во взаимодействии родителей и младенцев.

К коликам могут быть причастны желудочно-кишечные расстройства из-за положения ног младенца и гримасы во время приступа плача. Ниже приводится краткий обзор желудочно-кишечных факторов:

Неправильные способы кормления, такие как кормление из бутылочки, кормление в горизонтальном положении и отсутствие отрыжки после кормления, рассматриваются как причинные факторы. Было установлено, что грудное вскармливание в первые шесть месяцев представляет собой защитный фактор. Риск младенческой колики был в 1,86 раза выше среди младенцев, не вскармливаемых грудью (Saavedra MA, Dacosta JS, Garcias G, Horta BL, Tomasi E, Mendoca R. Infantile colic incidence and associated risk factors: a cohort study. Pediatr (Rio J) 2003; 79(2): 115-122).

В настоящее время не существует полного излечения от колик. Текущая парадигма лечения колик состоит из фармакологических и/или нефармакологических способов, обеспечивающих в лучшем случае уменьшение симптомов. Типичные терапевтические вмешательства при коликах, предлагаемые родителям, делятся на четыре категории, включая диетические, физические, поведенческие и фармакологические. Диетические манипуляции включают профессиональные советы по различным способам кормления или применению гипоаллергенного молока, смесей без содержания сои или лактозы, пищевых добавок, таких как различные пробиотики и пребиотики, а также раннее введение твердой пищи.

Безрецептурный лекарственный препарат для лечения колик в основном включает введение симетикона или диметилполисилоксана, неабсорбируемого, отпускаемого без рецепта препарата, который уменьшает размер пузырьков кишечного газа. Симетикон имеет безопасный профиль, и его часто рекомендуют, несмотря на результаты нескольких исследований, продемонстрировавших, что эффективность симетикона при младенческой колике не лучше, чем у плацебо.

Появлялись сообщения об изменении структуры микробиоты у младенцев с коликами, что побудило нескольких исследователей провести и опубликовать различные рандомизированные клинические контролируемые испытания (RCT), в которых оценивали способность, например, Lactobacillus reuteri DSM 17938 сокращать время плача у таких младенцев. Например, Savino et al (Pediatrics 2010; 126: e526-33) провели в 2010 г. RCT, чтобы проверить эффективность этого штамма при младенческой колике. Пятьдесят младенцев с коликами, находившихся исключительно на грудном вскармливании и диагностированных в соответствии с модифицированными критериями Весселя, были случайным образом распределены для получения в течение 21-го дня либо L. reuteri DSM 17938 (10⁸ колониеобразующих единиц), либо плацебо ежедневно. По опросникам родителей отслеживали ежедневное время плача и побочные эффекты. 46 младенцев (группа L. reuteri: 25; группа плацебо: 21) завершили испытание. Ежедневное время плача в минутах/день (медиана) составляло 370 против 300 в день 0 и 35,0 против 90,0 (p = 0,022) на день 21.

В 2013 году Szajewska и др. (J Pediatr 2013; 162: 257-62) опубликовали RCT с аналогичным дизайном с участием 80 младенцев в возрасте <5 месяцев, указав, что процент ответивших на лечение был значительно выше в группе пробиотиков по сравнению с плацебо. Минуты в день (медиана) составили 180 против 180 на 7 день, 75 против 128 на 14 день и 52 против 120 (p<0,05) на 21 день. Также было проведено несколько других исследований, показавших эффект L. reuteri DSM 17938 у младенцев с коликами, который заключался в значительном сокращении времени плача у младенцев, находившихся на грудном вскармливании. Однако существует потребность в еще более эффективных вмешательствах для снижения более высокой частоты крика у детей с коликами, в том числе у детей, находящихся на искусственном вскармливании.

Следовательно, в настоящее время существует потребность в новых (и предпочтительно улучшенных) безопасных и эффективных соединениях, композициях и способах, которые окажутся полезными для лечения колик у младенцев. Композиции и способы по настоящему изобретению отвечают этой потребности, обеспечивая продукты, которые могут безопасно и эффективно предотвращать и лечить колики (или симптомы, связанные с коликами) у младенцев.

Другие цели и преимущества станут более очевидными из следующего раскрытия.

Раскрытие изобретения

Незрелость гормонов новорожденных считается основным фактором ранних проблем развития моторики кишечника и, таким образом, вызывает боль и плач у младенца, например, при младенческой колике. Мелатонин - это гормон, который обладает способностью поддерживать биологические ритмы и оказывает важное влияние на многие функции человека и животных. Серотонин, тоже нейромедиатор, который может быть получен из аминокислоты триптофана, представляет собой предшественника мелатонина.

Мелатонин - нейротрансмиттер, который ранее считался секретируемым преимущественно шишковидной железой. Однако существуют внепинеальные участки продукции мелатонина, такие как сетчатка и желудочно-кишечный тракт.

Синхронизация продукции с различными циркадными ритмами и последующее высвобождение серотонина и мелатонина у младенцев потенциально важна для предотвращения нарушений моторики кишечника и боли, такой как младенческая колика (IC).

Серотонин увеличивает сокращение гладких мышц кишечника, а мелатонин расслабляет гладкие мышцы кишечника. Пики концентрации серотонина могут вызвать спазмы кишечника, если не уравновешиваются другими агентами, из которых мелатонин представляет собой важный агент. И серотонин, и мелатонин имеют циркадные ритмы. В то время как серотонин вырабатывается и циркадные ритмы серотонина развиваются при рождении ребенка, выработка эндогенного мелатонина и циркадный ритм мелатонина у многих младенцев не готовы начаться до 3-го месяца жизни. Это время совпадает со временем нормального исчезновения младенческой колики.

Можно сказать, что младенческая колика - это состояние мелатониновой недостаточности. Поэтому было предложено давать экзогенный мелатонин младенцам с IC, но многие врачи и родители неохотно дают гормоны младенцам.

По оценкам, среди всех новорожденных детей распространенность ИЦ составляет от 5% до 25%, что во многих отношениях обременительно и дорого обходится обществу, родителям и самому младенцу.

Таким образом, хотя некоторые дети, по-видимому, способны вырабатывать и высвобождать необходимый мелатонин из пищи и/или кишечных бактерий и, следовательно, у них с меньшей вероятностью разовьется младенческая колика, есть много других, которые к этому не способны, и поэтому нуждаются в дополнительной поддержке для предотвращения или лечения IC.

Таким образом, существует потребность в поиске и разработке продуктов и способов для поддержки продукции и высвобождения мелатонина у детей, с риском развития IC или имеющих IC.

Настоящее изобретение основано на открытии того, что можно отобрать бактерии, например, молочнокислые бактерии, которые способны продуцировать аденозин. Молочнокислые бактерии, продуцирующие аденозин, не описаны в данной области техники, и такие бактерии, например, можно применять для увеличения продукции арилалкиламино-N-ацетилтрансферазы (AANAT), скорость-лимитирующего фермента в синтезе мелатонина. Хотя фермент AANAT находится в шишковидной железе, он также вырабатывается во внепинеальных участках продукции мелатонина, например, в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, увеличение продукции AANAT (например, за счет увеличения продукции аденозина) обеспечивает средства для увеличения продукции мелатонина или повышения уровня мелатонина в желудочно-кишечном тракте. Такие бактерии, таким образом, могут быть применены для лечения или предупреждения младенческой колики или других заболеваний, связанных или характеризующихся сниженным, низким или недостаточными продукцией или синтезом мелатонина.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию аденозина, для применения в продукции аденозина (например, для увеличения уровней аденозина или увеличения или стимулирования продукции аденозина) у субъекта, или для применения в продукции мелатонина (например, для повышения уровня мелатонина или увеличения или стимулирования продукции мелатонина) у субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования аденозина или мелатонина (например, увеличения уровней аденозина или мелатонина или увеличения или стимулирования продукции аденозина или мелатонина) у субъекта, указанный способ включающий этап введения указанному субъекту эффективного количества бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию аденозина.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продуцирование аденозина, при производстве лекарственного средства или композиции для применения в продукции аденозина или мелатонина (например, для повышения уровня аденозина или мелатонина, или увеличения или стимулирования продукции аденозина или мелатонина) в субъекте.

В более общем плане настоящее изобретение также обеспечивает бактерии, например, молочнокислые бактерии, которые способны продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина. Таким образом, такие бактерии можно применять для продукции мелатонина, например, для увеличения продукции или уровней мелатонина у субъекта.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает штамм молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина, для применения в продукции мелатонина (например, для повышения уровней мелатонина или увеличения или стимулирования продукции мелатонина) у субъекта.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения мелатонина (например, повышение уровней мелатонина или увеличение или стимулирование продукции мелатонина) у субъекта, причем указанный способ включает стадию введения эффективного количества штамма молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина, указанному субъекту.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение штамма молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина, при производстве лекарственного средства или композиции для применения при продукции мелатонина (например, для повышения уровня мелатонина или увеличения или стимулирования продукции мелатонина) у субъекта.

Как обсуждалось выше, такие штаммы можно применять при лечении или предупреждении младенческой колики или других заболеваний, связанных или характеризующихся сниженной, низкой или недостаточной выработкой или синтезом или уровнями мелатонина.

Таким образом, изобретение также относится к штамму молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина, для применения в лечении или предупреждении младенческой колики или других заболеваний, связанных или характеризующихся сниженным, низким или недостаточным продуцированием или синтезом или уровнями мелатонина у субъекта.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или предупреждения младенческой колики, или другого заболевания, связанного или характеризующегося сниженным, низким или недостаточным продуцированием или синтезом или уровнями мелатонина, у субъекта, указанный способ, включающий стадию введения эффективного количества штамма молочнокислых бактерий, который способен производить или индуцировать продукцию мелатонина указанному субъекту.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает применение штамма молочнокислых бактерий, который способен производить или индуцировать продукцию мелатонина, при производстве лекарственного средства или композиции для применения в лечении или предупреждении младенческой колики, или другого заболевания, связанного или характеризующегося сниженной, низкой или недостаточной продукцией или синтезом или уровнями мелатонина, у субъекта.

Такие штаммы могут быть способны продуцировать или индуцировать продукцию аденозина и тем самым продуцировать или индуцировать продукцию (например, продукцию на последующих стадиях метаболического пути) мелатонина, как описано в другом месте в настоящем документе.

Другие объекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными для читателя, и предполагается, что эти объекты и преимущества находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему, показывающую путь продуцирования мелатонина.

Фиг. 2 представляет собой схему, показывающую как бактерии, способные продуцировать аденозин по изобретению, влияют на путь продуцирования мелатонина.

Фиг. 3 показывает измерение активности 5'-нуклеотидазы в супернатанте бактериальных клеток L reuteri.

Фиг. 4 показывает продукцию мелатонина на модели кишечного энтероида путем добавления супернатанта бактериальных клеток L reuteri.

Фиг. 5A показывает измерение активности 5'-нуклеотидазы в супернатанте бактериальных клеток L.reuteri DSM 33198 по сравнению с бактериальными клетками DSM 17938. Фиг. 5B показывает измерение активности 5'-нуклеотидазы в супернатанте бактериальных клеток различных бактериальных клеток L.reuteri по сравнению с бактериальными клетками DSM 17938.

Осуществление изобретения и его предпочтительные воплощения

Таким образом, как указано выше, настоящее изобретение обеспечивает штаммы бактерий, например, штаммы молочнокислых бактерий, которые способны продуцировать, стимулировать, индуцировать или поддерживать продукцию мелатонина, например, для повышения уровня мелатонина, особенно в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Такие штаммы могут сами производить мелатонин, например, секретировать мелатонин и, таким образом, напрямую обеспечивать или производить мелатонин.

Однако также предлагаются штаммы, которые косвенно приводят к выработке мелатонина, например, путем продуцирования, стимуляции или индукции продукции компонента, находящегося на предыдущих стадиях пути синтеза мелатонина (или предшественника мелатонина) и тем самым поддерживают или повышают продукцию мелатонина. В качестве предпочтительного примера можно привести продукцию или индукцию арилалкиламино-N-ацетилтрансферазы (AANAT), которая представляет собой фермент, ограничивающий скорость превращения серотонина в N-ацетилсеротонин, который, в свою очередь, превращается в мелатонин.

Как указано выше, еще один особенно предпочтительный штамм молочнокислых бактерий - это штамм, который может продуцировать или индуцировать продукцию аденозина у субъекта, особенно в желудочно-кишечном (GI) тракте. Такой аденозин может воздействовать на соответствующие аденозинозиновые рецепторы клеточной поверхности (например, рецепторы A2A, рецепторы A2B, A3 или рецепторы A4, предпочтительно, рецепторы A2A) и приводить к продукции повышенных уровней внутриклеточного цАМФ. Известно, что A2A и другие рецепторы аденозина присутствуют в клетках желудочно-кишечного тракта. Внутриклеточный цАМФ, в свою очередь, участвует в продукции AANAT (смотри фиг. 2). Таким образом, повышенные уровни внутриклеточного цАМФ могут приводить к увеличению уровней AANAT и, следовательно, к увеличению уровней мелатонина. Аденозин, таким образом, предпочтительно должен поступать внеклеточно, чтобы иметь возможность связываться с аденозиновыми рецепторами на поверхности клетки. С этой целью аденозин может продуцироваться в бактериальных клетках и выводиться из клетки (или секретироваться). В качестве варианта, аденозин может продуцироваться внеклеточно, например, на поверхности бактериальных клеток или в супернатанте. Такую внеклеточную продукцию может быть, например, удобно осуществлять за счет присутствия заякоренного в клеточной стенке (или на поверхности клетки) фермента 5'-нуклеотидазы (или фермента экто-5'-нуклеотидазы), который может превращать соответствующий субстрат в аденозин. Такая внеклеточная продукция в равной степени может происходить в результате присутствия фермента 5'-нуклеотидазы (или фермента экто-5'-нуклеотидазы) как в клеточном супернатанте, так и во внеклеточном пространстве. Как показано в данном документе, бактериальные штаммы могут обеспечивать, продуцировать или высвобождать такой фермент 5'-нуклеотидазу (или фермент экто-5'-нуклеотидазу) в клеточный супернатант или во внеклеточное пространство, где он затем может преобразовывать соответствующий субстрат в аденозин. Подходящие субстраты включают АМФ.

Таким образом, когда бактериальные штаммы упоминаются в настоящем документе как способные продуцировать аденозин, то это означает, в том числе, прямую продукцию аденозина самими бактериальными клетками, а также продукцию аденозина бактериальными клетками посредством клеток, имеющих активный фермент 5'-нуклеотидазу (который, например, присутствует на поверхности бактериальной клетки или высвобождается в супернатант клетки или внеклеточное пространство) и, таким образом, превращает или способен превращать соответствующий субстрат, например, АМФ, в аденозин. Такой субстрат может присутствовать обычным образом, например, эндогенно в окружающей среде, или может быть обеспечен в бактериях, например, посредством экзогенных средств.

Таким образом, такие штаммы могут приводить к повышению уровня мелатонина, например, по сравнению с уровнями, при которых такие штаммы отсутствуют.

Известно, что мелатонин вырабатывается в желудочно-кишечном тракте, и поэтому продукция или увеличение продукции в этой области должно быть физиологически эффективным. Предпочтительно, чтобы количество продуцируемого мелатонина было клинически или терапевтически значимым. Таким образом, штаммы по изобретению можно применять для лечения любого заболевания или состояния, связанного (или характеризующегося) сниженным или пониженным уровнем мелатонина, или связанного с (или характеризующегося) дефицитом мелатонина, или их можно применять для лечения любого заболевания или состояния, при котором повышенный уровень мелатонина может принести пользу. Специалистами в данной области техники легко распознают такие заболевания или состояния (и безусловно субъектов, страдающих такими заболеваниями или состояниями), которые будут, например, включать заболевания, состояния или субъектов с низким, сниженным, например, значительно сниженным (или ненормальным) уровнем мелатонина или дефицитом мелатонина, например, по сравнению с уровнями у нормального или здорового субъекта, например, с уровнями у нормального или здорового субъекта того же, эквивалентного или сопоставимого возраста. Предпочтительный пример такого заболевания представляет собой младенческую колику. Предпочтительные штаммы для таких терапевтических целей представляют собой штаммы, которые продуцируют мелатонин или аденозин.

Таким образом, в дополнительных аспектах изобретения обеспечивают штамм молочнокислых бактерий, который способен производить или индуцировать продукцию мелатонина, например, в силу того что указанный штамм способен продуцировать или индуцировать продукцию аденозина, или штамм молочнокислых бактерий, который способен продуцировать или индуцировать продукцию аденозина. Также обеспечивают терапевтическое применение таких штаммов. Предпочтительно, указанные штаммы содержат ген, кодирующий 5'-нуклеотидазу, или такие штаммы имеют активный фермент 5'-нуклеотидазы, например, для преобразования АМФ (или другого подходящего субстрата) в аденозин. Типичные уровни продукции аденозина или уровни активности 5'-нуклеотидазы или продукции мелатонина описаны в другом месте в настоящем документе.

Предпочтительные штаммы по настоящему изобретению представляют собой штаммы L. reuteri, более предпочтительно штаммы L. reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM 33198 (подробные сведения о депозитариях этих штаммов представлены в другом месте настоящего документ) и такие штаммы, например, изолированные штаммы или биологически чистые культуры, или препараты таких штаммов, составляют дополнительные аспекты изобретения, как и композиции (например, фармацевтические или пищевые, например, пищевые добавки, или пробиотические композиции, например, с фармацевтически или пищевыми приемлемыми разбавителями и/или вспомогательными веществами), включающие указанные штаммы, или терапевтическое применение таких штаммов, например, как описано в другом месте в данном документе, в особенности, для лечения или профилактики младенческой колики (или других заболеваний, как описано в другом месте в данном документе). В некоторых воплощениях штамм DSM 17938 не применяют. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM 33198 для применения в терапии, например, для лечения или предупреждения заболеваний, как описано в другом месте в настоящем документе. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает, например, штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM33198 для применения в лечении или предупреждении младенческой колики.

Таким образом, еще один дополнительный аспект изобретения обеспечивает способ лечения или предупреждения младенческой колики, или других заболеваний, как описано в данном документе, у субъекта, причем указанный способ включает стадию введения эффективного количества штамма Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM 33198 указанному субъекту.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает применение штаммов Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM 33198 при производстве лекарственного средства или композиции для применения в лечении или профилактике младенческой колики, или другого заболевания как описано в другом месте в настоящем документе, у субъекта.

Альтернативные и предпочтительные воплощения и признаки изобретения, как описаны в другом месте в настоящем документе, в равной степени применимы к способам лечения и применениям изобретения, описанным в настоящем документе и в других местах настоящего документа.

Штаммы L. reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и/или DSM 33198 были отобраны за их способность продуцировать аденозин, например, поскольку имели ген, кодирующий 5'-нуклеотидазу, и активный фермент 5'-нуклеотидазы, который может преобразовывать субстрат АМФ в аденозин, и подходит не только для повышения уровня аденозина (например, по сравнению с уровнями, в которых эта черта отсутствует), но также для повышения уровня мелатонина, например, путем увеличения уровня AANAT как описано в другом месте в настоящем документе. Штаммы содержат активный фермент 5'-нуклеотидазу, закрепленный в клеточной стенке, а также демонстрируют активность фермента 5'-нуклеотидазы в своих соответствующих супернатантах (см. фиг. 3 и фиг. 5 A/B).

Эти штаммы L. reuteri были разработаны (другими словами, модифицированы, адаптированы или генетически изменены) на основе природных штаммов, а также были отобраны по одному или нескольким другим улучшенным свойствам, таким как повышенная устойчивость к желчи или повышенная адгезия к поверхностям слизистой оболочки, например, к поверхности желудочно-кишечного тракта. Таким образом, DSM 32846 и DSM 32847 модифицировали так, чтобы они были более толерантными к желчным кислотам и, таким образом, например, они выживают в большем количестве в желудочно-кишечном тракте. DSM 32848 и DSM 32849 были модифицированы для лучшего адгезии к слизистой с целью улучшения колонизации в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, улучшения функционирования, например, согласно настоящему изобретению. Штамм L. reuteri DSM 33198 также был модифицирован в ходе многоступенчатого процесса отбора, включая повторную процедуру сублимационной сушки, чтобы сделать его более толерантным и обеспечить более высокую выживаемость в процессе производства, чем его нативный изолят (родительский штамм). Таким образом, такие штаммы не соответствуют штаммам, встречающимся в природе, их принудительно генетически изменили, и они представляют собой ненативные штаммы. Отобрали все штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848, DSM 32849 и DSM 33198. Предпочтительные штаммы представляют собой DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 или DSM 33198. Более предпочтительные штаммы представляют собой DSM 32846, DSM 32847 или DSM 33198.

В одном из воплощений штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и/или DSM 32849 отбирают или применяют. Предпочтительные штаммы представляют собой DSM 32846, DSM 32847 или DSM 32849. Более предпочтительные штаммы представляют собой DSM 32846 или DSM 32847, например, DSM 32846 представляет собой предпочтительный штамм в некоторых воплощениях. В некоторых воплощениях, отбирают или применяют штамм DSM 33198.

Настоящее изобретение обеспечивает применение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, который способен продуцировать аденозин или индуцировать продукцию аденозина (например, повышая уровни аденозина, или увеличивая или стимулируя продукцию аденозина), при производстве лекарственного средства или композиции для применения в продукции аденозина у субъекта.

Такие способы и применения могут быть применены для лечения или профилактики младенческой колики или других заболеваний, как описано в другом месте в настоящем документе, например, синдрома раздраженного кишечника (IBS), нарушения сна или нейродегенеративных заболеваний или расстройств, например, болезни Альцгеймера или других видов деменции, например, других видов старческой деменции. Такие болезни также представляют собой примеры заболеваний, связанных с (или характеризующихся) дефицитом или снижением мелатонина, или которые могут получить пользу от повышенных или увеличенных уровней мелатонина.

Под моторикой желудочно-кишечного тракта понимают растяжение и сокращение мышц желудочно-кишечного тракта для передачи перевариваемой пищи. Синхронизированное сокращение этих мышц называется перистальтикой.

В желудочно-кишечном тракте действует множество выделяемых локально факторов, включая гормоны, которые регулируют моторику и секрецию. Моторику определяют движения пищеварительной системы и перемещение содержимого в ней. Когда нервы и/или мышцы в любой части пищеварительного тракта, двигательной функции желудочно-кишечного тракта, не функционируют с нормальной силой и координацией, то у человека развиваются симптомы, связанные с нарушением моторики.

Было описано, что нарушения двигательной функции вызывают множество симптомов в различных областях кишечника, например, как у субъектов с младенческой коликой.

Младенческая колика - это термин, применяемый для описания младенцев, которые чрезмерно плачут без видимой причины в течение первых трех месяцев жизни. Колики представляют собой одну из самых мучительных проблем младенчества. Это неприятно для младенца, родителей и медицинского работника. Причина колик до конца не выяснена.

Незрелость гормонов новорожденных считается основным фактором ранних проблем развития моторики кишечника и из-за нее возникает также боль и плач у младенца, например, при младенческой колике.

Мелатонин представляет собой гормон, который обладает способностью поддерживать биологические ритмы и оказывает важное влияние на многие функции у людей и животных. Гормон влияет на моторику желудочно-кишечного тракта с помощью селективных рецепторов (рецепторов мелатонина), экспрессируемых в гладких мышцах и клетках миентерального сплетения желудочно-кишечного тракта. Циклическая генерация электрического тока представляет собой основной механизм сокращения гладких мышц желудочно-кишечного тракта. Миоэлектрическая активность желудочно-кишечного тракта состоит из двух видов электрических потенциалов: медленной волны и спайковой активности, организованной в миоэлектрическом мигрирующем комплексе.

Серотонин - это предшественник мелатонина, который сам представляет собой нейромедиатор и который может быть получен из аминокислоты триптофана.

Было показано, что мелатонин частично блокирует вызванное серотонином уменьшение перемещения пищи. Эта система, уравновешивающая мелатонин и серотонин, регулирует деятельность кишечника.

Кроме того, функциональная и сбалансированная система мелатонин-серотонин влияет на аппетит и пищеварительные процессы посредством эндокринных, а также паракринных эффектов, как в мозге, так и в желудочно-кишечном тракте.

Действие двух гормонов, по-видимому, имеет противоположный эффект на моторику, и конечные эффекты зависят от дозы. Также известно, что мелатонин и серотонин участвуют в процессах гиперчувствительности и проведении боли.

Мелатонин, также известный как N-ацетил-5-метокситриптамин, представляет собой гормон и нейромедиатор, который, как ранее считалось, секретируется преимущественно шишковидной железой. Но есть важные внепинеальные участки продукции мелатонина, такие как сетчатка и желудочно-кишечный тракт. В настоящее время появились сообщения, показывающие, что в желудочно-кишечном тракте по меньшей мере в 400 раз больше мелатонина, чем в шишковидной железе. Циркадные колебания желудочно-кишечного мелатонина, по-видимому, контролируются не освещенностью (как шишковидная железа), а приемом пищи и составом пищи.

Синхронизация между продукцией и различными циркадными ритмами и последующим высвобождением серотонина и мелатонина у маленьких детей важна для предотвращения нарушений моторики кишечника и боли, такой как младенческая колика (IC).

Серотонин увеличивает сокращение гладких мышц кишечника, а мелатонин расслабляет гладкие мышцы кишечника. Пики концентрации серотонина могут вызвать спазмы кишечника, если не уравновешиваются другими агентами, среди которых очень важен мелатонин. И серотонин, и мелатонин имеют циркадные ритмы. Хотя серотонин вырабатывается и циркадные ритмы серотонина развиваются при рождении младенца, выработка эндогенного мелатонина и циркадный ритм мелатонина у многих младенцев не готовы начаться до 3-го месяца жизни. Это время совпадает со временем исчезновения младенческой колики в норме. Было показано, что у младенцев, страдающих коликами, уровень мелатонина по утрам низкий, тогда как у младенцев, не страдающих коликами, он высокий (Cengiz et al, 2015, Turkish journal of family medicine and primary care; 9 (1)/10-15). Такие младенцы (например, младенцы с формами младенческой колики, ассоциированными с дефицитом мелатонина или баланса мелатонина, например, дефицитом уровня мелатонина по утрам, например, в или до 6 утра, 8 утра, 10 утра или 12 дня) представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с применением настоящего изобретения.

Таким образом, хотя некоторые дети, по-видимому, способны вырабатывать и высвобождать необходимый мелатонин эндогенно, из пищи и/или кишечных бактерий и, следовательно, у них с меньшей вероятностью разовьется младенческая колика, существуют много других детей, у которых этого не происходит, и поэтому они нуждаются в дополнительной поддержке для предотвращения или лечения IC. Такие младенцы (например, младенцы с дефицитом мелатонина, вызванного, например, не полностью развитым кишечным микробиомом, или младенцы, страдающие от проблем с питанием или проблем с кормлением) также представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с помощью настоящего изобретения.

Можно сказать, что младенческая колика - это состояние мелатониновой недостаточности. Это особенно важно для детей, находящихся в стрессовых ситуациях, или для детей, которые менее способны справляться со стрессом, например, для детей, рожденных до полного срока гестации или с не полностью функциональным пищевым метаболизмом и т.д. Такие младенцы (например, младенцы с дефицитом мелатонина, рожденные до полного срока беременности, путем кесарева сечения или без полностью функционального пищевого метаболизма) также представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с применением настоящего изобретения.

Другой пример состояния, связанного с балансом функции мелатонина, - это синдром раздраженного кишечника (СРК), который представляет собой распространенное заболевание, характеризующееся повторяющейся болью в животе или дискомфортом в сочетании с нарушением ритма опорожнения кишечника при отсутствии идентифицируемых причин. Предполагается, что мелатонин оказывает положительное влияние на восприятие боли и ритма опорожнения кишечника (Siah KTH et al, 2014, World J Gastroenterol; 20 (10): 2492-2498). Таким образом, субъекты, страдающие СРК, в особенности, формами СРК, связанными с дефицитом мелатонина или нарушением баланса мелатонина, также представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с применением настоящего изобретения.

Дефицит мелатонина в основном исследовали в шишковидной железе, кровотоке, слюне, спинномозговой жидкости и, путем измерения содержания метаболита 6-сульфатоксимелатонина, в моче.

В кишечнике более 20 типов энтероэндокринных клеток, что делает его самым большим эндокринным органом в организме человека. Энтерохромафинные клетки (ЭК) представляют собой тип энтероэндокринных и нейроэндокринных клеток. Они располагаются рядом с эпителием, выстилающим просвет пищеварительного тракта, и играют решающую роль в регуляции желудочно-кишечного тракта, особенно, перистальтики кишечника и секреции. Клетки ЭК модулируют передачу сигналов нейронов в кишечной нервной системе (ENS) посредством секреции нейромедиатора серотонина и других пептидов, они дополнительно экспрессируют аденозиновые рецепторы и обладают активным синтезом мелатонина.

Нарушение сна - это один из распространенных признаков недостаточной передачи сигналов мелатонина, а мелатонин представляет собой одну из самых популярных натуральных добавок для здоровья в наше время. Мелатонин часто называют «гормоном темноты», потому что его синтез и секреция в некоторых частях тела усиливаются темнотой и подавляются светом. Нарушения сна широко распространены у детей и без соответствующего лечения могут стать хроническими и продолжаться в течение многих лет (Esposito et al.2019, J Transl Med, 17:77). Сообщается, что даже у пожилых людей нарушается сон. Ночной пик мелатонина регулярно уменьшается с возрастом. Таким образом, субъекты, субъекты, имеющие или страдающие нарушениями сна или расстройствами сна, в особенности, формами нарушений сна или расстройства сна, связанными с дефицитом мелатонина или нарушением баланса мелатонина, также представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с применением настоящего изобретения.

Снижение уровня мелатонина также неоднократно описывали при нейродегенеративных расстройствах, особенно, при болезни Альцгеймера и других видах старческой деменции (Blumenbach Johann Friedrich, 2012, The Scientific World Journal Volume 2012, Article ID 640389). Таким образом, субъекты, имеющие такие нейродегенеративные расстройства, в особенности, такие формы нейродегенеративных расстройств, которые ассоциированы с дефицитом мелатонина или нарушением баланса мелатонина, также представляют собой примеры субъектов, которых можно лечить с применением настоящего изобретения.

Скорость образования мелатонина зависит от активности фермента арилалкиламино-N-ацетилтрансферазы (AANAT) (фиг. 1 и фиг. 2) в шишковидной железе, но также и на экстрапинеальных участках продукции мелатонина, например, в желудочно-кишечном тракте.

Аденозин увеличивает уровни внутриклеточного цАМФ через аденозиновый рецептор, что увеличивает продукцию AANAT, скорость-лимитирующего фермента в синтезе мелатонина.

Цель настоящего изобретения заключается в применении продуцирующих аденозин штаммов молочнокислых бактерий для предупреждения и/или лечения младенческой колики.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в применении продуцирующих аденозин штаммов молочнокислых бактерий для предупреждения и/или лечения IBS.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в применении продуцирующих аденозин штаммов молочнокислых бактерий для предупреждения и/или лечения нарушения сна.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в применении продуцирующих аденозин штаммов молочнокислых бактерий для предупреждения и/или лечения нейродегенеративных расстройств, например, болезни Альцгеймера и других видов деменции, например, других видов старческой деменции.

Это изобретение также относится к способу отбора конкретных бактериальных штаммов, включая штаммы молочнокислых бактерий, способные продуцировать аденозин, и применению таких штаммов для оказания благоприятных эффектов для младенца, страдающего коликами или подверженного риску колик. Новые бактериальные штаммы, которые способны продуцировать аденозин, представляют собой дополнительный объект изобретения.

Метаболизм пуринов, при котором пурины метаболизируют и расщепляются определенными ферментами, представляет собой один из важных метаболических процессов в организме человека. Экто-5'-нуклеотидаза (CD73), которая считается ключевым ферментом в продукции аденозина, представляет собой один из примеров таких ферментов.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые специфические штаммы пробиотических бактерий способны продуцировать аденозин.

Настоящее изобретение, таким образом, включает новый способ отбора конкретных бактериальных штаммов, включая штаммы молочнокислых бактерий, которые эффективны в продукции аденозина. Цель отбора конкретных штаммов бактерий заключается в их применении для лечения определенных заболеваний, таких как младенческая колика (или других заболеваний, как описано в другом месте в настоящем документе).

Настоящее изобретение обеспечивает способ отбора штаммов бактерий, в особенности, штаммов молочнокислых бактерий, которые полезны в качестве пробиотиков и в терапии, например, в качестве фармацевтических препаратов или пищевых добавок.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает способ отбора бактериального штамма, предпочтительно штамма молочнокислых бактерий, способного продуцировать аденозин, при этом указанный способ включает:

а) скрининг бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, на наличие гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, например, 5'-нуклеотидазу, заякоренную в клеточной стенке; и /или

б) скрининг бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, или его супернатанта на наличие активного фермента 5'-нуклеотидазы, например, фермента 5'-нуклеотидазы, закрепленного в клеточной стенке.

Такие ферменты 5'-нуклеотидазы (5'NT) можно также называть ферментами экто-5'-нуклеотидазы или CD73 (кластер дифференцировки 73). Затем можно отобрать штаммы, которые способны продуцировать аденозин.

В качестве альтернативы настоящее изобретение обеспечивает способ отбора бактериального штамма, предпочтительно, штамма молочнокислых бактерий, путем скрининга бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, на его способность продуцировать аденозин, и отбора штамма, обладающего такой способностью.

После того, как соответствующий штамм отбирают с применением способа по настоящему изобретению, его можно затем применять для продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта.

Бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, выбранный, продуцируемый, полученный или который можно получить с помощью способов по настоящему изобретению, в котором указанный штамм способен продуцировать аденозин, например, продуцировать аденозин локально, представляет собой еще один дополнительный аспект изобретения.

Кроме того, обеспечивают терапевтическое применение при младенческой колике (или других заболеваниях, как описаны в другом месте в настоящем документе) штаммов, отобранных с помощью настоящего изобретения.

Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения обеспечивает бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, выбранный, продуцируемый, полученный или который можно получить с помощью способов по настоящему изобретению, в котором указанный штамм имеет ген 5'-нуклеотидазы или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин, для применения в продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта.

Альтернативные воплощения изобретения обеспечивают бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, в котором указанный штамм имеет ген 5'-нуклеотидазы или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин, для применения в продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта. Предпочтительные признаки этого штамма и его применения описаны в других местах в настоящем документе.

Как будет указано в других местах в настоящем документе, конкретное воплощение изобретения представляет собой профилактику и/или лечение младенческой колики (или других заболеваний, как описаны в другом месте в настоящем документе).

Кроме того, обеспечивают способы лечения или способы продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта, указанные способы включают введение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, отобранного, продуцированного, полученного или которого можно получить с помощью способа отбора изобретения, или введение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, в котором указанный штамм имеет ген 5'-нуклеотидазы или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин, указанному субъекту в количестве, эффективном для продукции, например, локальной продукции, аденозина у указанного субъекта. Предпочтительные признаки этого штамма и его применения, например, при младенческой колике (или других заболеваниях, как описаны в другом месте в настоящем документе), описаны в других местах в настоящем документе.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, отобранного, продуцированного, полученного или который можно получить с помощью способа отбора изобретения, в котором указанный штамм имеет ген 5'-нуклеотидазы или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин, в производстве композиции или лекарственного средства для применения в продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта. Альтернативные воплощения обеспечивают применение бактериального штамма, например, штамма молочнокислых бактерий, в котором указанный штамм имеет ген 5'-нуклеотидазы или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин, в производстве композиции или лекарственного средства для применения в продукции, например, локальной продукции, аденозина у субъекта. Предпочтительные признаки этого штамма и его применения, например, при младенческой колике (или других заболеваниях, как описаны в другом месте в настоящем документе), описаны в других местах в настоящем документе.

Изделия или композиции, например, фармацевтические композиции, пробиотические композиции или диетические/нутрицевтические композиции, включающие бактериальные штаммы (например, включающие один или несколько бактериальных штаммов), как описано в настоящем документе (например, бактериальные штаммы, способные продуцировать или индуцировать продукцию аденозина, мелатонина и т.д.), и применение указанных изделий или композиций в способах и применениях, как описано в настоящем документе, еще образуют дополнительные аспекты изобретения.

Организация по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств Организации Объединённых Наций определяет пробиотики как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина». В настоящее время в качестве пробиотиков применяют ряд различных бактерий, например, бактерии, продуцирующие молочную кислоту, такие как штаммы Lactobacillus и Bifidobacterium.

Альтернативные и предпочтительные воплощения и признаки изобретения, как описаны в другом месте в настоящем документе, в равной степени применимы к способам лечения, применениям и изделиям изобретения.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к отбору и применению штаммов бактерий, которые способны продуцировать аденозин.

Указанные штаммы, которые эффективны в продуцировании аденозина, могут быть применены для локальной продукции аденозина у субъекта, например, млекопитающего, предпочтительно, человека.

Таким образом, как указано выше, настоящее изобретение обеспечивает различные способы отбора или скрининга штаммов бактерий, способных продуцировать аденозин.

Некоторые из способов включают стадию (например, стадию а)) скрининга на присутствие гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, например, 5'-нуклеотидазу, закрепленную в клеточной стенке. Такой скрининг можно проводить с применением любого подходящего способа, и отбирают штаммы, положительные по гену 5'-нуклеотидазы. Такие способы удобно осуществлять in vitro, например, это могут быть генетические способы или способы на основе нуклеиновых кислот для обнаружения присутствия гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, например, закреплённую в клеточной стенке 5'-нуклеотидазу (или ее идентификационный фрагмент), последовательности которой известны в данной области техники. Например, для этого может быть легко разработан протокол ПЦР (или другой метод, основанный на нуклеиновых кислотах), на основе известных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих ферменты, или, в качестве альтернативы, последовательности генома штаммов-кандидатов могут быть тщательно изучены с целью идентификации указанного гена, кодирующий 5'-нуклеотидазу, например, закрепленную в клеточной стенке 5'-нуклеотидазу, например, на основе гомологии с известными последовательностями 5'-нуклеотидазы, включая, например, присутствие LPXTG-мотива (SEQ ID NO: 1), как обсуждается ниже.

Примерный ген, который подлежит детектированию в способах по изобретению, представляет собой ген (экто)-5'-нуклеотидазы из L. reuteri, закрепляемую в клеточной стенке (например, номер доступа в GenBank: AEI56270.1, белок клеточной стенки с якорным доменом, содержащим мотив LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112]), или соответствующий гомолог/5'-нуклеотидаза из других видов бактерий, например, других молочнокислых бактерий. Примерная методика описана в экспериментальном разделе «Примеры».

Некоторые способы включают стадию (например, стадию b)) скрининга на присутствие активного (функционального) фермента 5'-нуклеотидазы, например, фермента 5'-нуклеотидазы, закрепленного в клеточной стенке. Такой этап можно выполнить с помощью любого подходящего способа, например, с помощью ферментативного анализа. Фермент 5'-нуклеотидаза катализирует следующую реакцию: АМФ + H₂O аденозин + фосфат (АМФ представляет собой аденозинмонофосфат), и анализ для измерения этой реакции может быть легко применен для определения наличия активного фермента 5'-нуклеотидазы (или 5'-нуклеотидазной активности). Другими словами, при отсылке в настоящем документе к активному или функциональному ферменту 5'-нуклеотидазе надо понимать, что это фермент, который способен катализировать эту реакцию в подходящих условиях, например, при поставке с подходящим субстратом, таким как АМФ. При желании активность фермента 5'-нуклеотидазы может быть определена количественно, например, в таком ферментативном анализе, например, путем измерения количества или концентрации фосфата или аденозина или другого соответствующего последующего продукта в пути распада аденозина, который образуется в реакции и может быть измерен или определен количественно. Активность можно удобно измерять в образце бактериальных клеток или супернатанте бактериальных клеток.

Способы проведения такого анализа должны быть хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, коммерчески доступны соответствующие наборы, такие как набор для анализа 5'-нуклеотидазы Crystal Chem (Crystal Chem, № по каталогу 80229, Downers Grove, IL, США), в котором активность фермента 5'-нуклеотидазы измеряют путем продукции красителя (хинонового красителя), который образуется как последующий продукт в метаболическом пути распада АМФ до аденозина (т.е. в результате продукции аденозина). АМР обеспечивают в качестве субстрата. Иллюстративный способ описан в разделе «Примеры». Соответствующую методику можно также легко получить от других поставщиков реагентов, например, от «Sigma», в сочетании с их реагентом на основе фермента 5'-нуклеотидазы.

Штаммы с высоким или значительным уровнем продукции фермента 5'-нуклеотидазы (или активности 5'-нуклеотидазы) предпочтительны, например штаммы, которые имеют активность 5'-нуклеотидазы по меньшей мере или более 2 единиц/л (единиц на литр) и/или способны продуцировать аденозин на уровне по меньшей мере или более 2 мкмоль л^-1⋅мин^-1 (мкмоль на литр в минуту). Таким образом, в предпочтительных воплощениях выбирают штамм, обладающий 5'-нуклеотидазной активностью на уровне по меньшей мере или более чем 3, 4, 5, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 единиц/л, и/или способный продуцировать аденозин на уровне по меньшей мере или более 3, 4, 5, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мкмоль л^-1⋅мин^-1. В некоторых воплощениях такие значения могут представлять собой верхние пределы. Такие значения обычно относятся к значениям активности 5'-нуклеотидазы, измеренным на образце бактериальных клеток, например, на поверхности бактериальных клеток или в супернатанте бактериальных клеток в культуре, предпочтительно, в супернатанте. Такие значения обычно относятся к уровням аденозина (предпочтительно, к внеклеточным уровням аденозина), измеренным в образце бактериальных клеток, например, в супернатанте бактериальных клеток в культуре. Такие значения обычно относятся к значениям активности 5'-нуклеотидазы (или уровням аденозина) при измерении при концентрации 10⁹ бактерий/мл или в супернатанте от такой культуры. Одну единицу определяют как количество фермента, необходимое для продукции 1 мкмоль продукта/мин (например, 1 мкмоль продукта/литр/мин). Тогда концентрация в единицах на литр будет соответствовать концентрации фермента, необходимой для увеличения концентрации на 1 мкМ/мин (например, 1 мкМ/литр/мин). Соответствующий и примерный анализ для измерения этой активности показан в примерах с применением набора 5'-нуклеотидазы (№ 80229) от «Crystal Chem Inc». Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления указанные выше единицы и значения относятся к единицам и значениям при измерении с применением этого набора и/или условий, изложенных в примерах, в особенности, при концентрации 10⁹ бактерий/мл, или в супернатанте от такой культуры, или эквивалентного анализа. Таким образом, такие способы будет удобно выполнять in vitro.

Способы, включающие, по меньшей мере, стадию b), будут предпочтительными, поскольку наличие гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, не всегда указывает на присутствие активного фермента 5'-нуклеотидазы. В способах, применениях и молочнокислых бактериях изобретения продукция аденозина или активность аденозина должна происходить внеклеточно, то есть снаружи или на поверхности молочнокислых бактерий, так что она может, например, присутствовать в супернатанте или другой внеклеточной жидкости, продуцируемой молочнокислыми бактериями. Таким образом, присутствие активного фермента 5'-нуклеотидазы на клеточной поверхности, например, в виде закрепленной в клеточной стенке 5'-нуклеотидазы, или внеклеточно по отношению к бактериальной клетке, например, в супернатанте, может быть полезным признаком, так как реакция, продуцирующая аденозин, происходит вне клетки, например, на поверхности бактериальной клетки.

Таким образом, продукция аденозина на хороших уровнях (например, внеклеточный аденозин, продуцируемый ферментом 5'-нуклеотидазой) также может служить индикатором присутствия гена 5'-нуклеотидазы или присутствия активного фермента 5'-нуклеотидазы. Таким образом, способы селекции изобретения также могут включать стадии отбора штамма, продуцирующего аденозин. Штаммы с высоким или значительным уровнем продукции аденозина, например, внеклеточного аденозина, предпочтительны, например штаммы, которые продуцируют аденозин на уровне, который представляет собой терапевтически эффективный уровень для субъекта, или на уровне, при котором наблюдают повышенные (и, в особенности, терапевтически эффективные) уровни мелатонина. Такие значения обычно относят к значениям аденозина, измеренным в супернатанте штаммов в культуре или на клеточной поверхности штаммов в культуре (in vitro), и некоторые иллюстративные конкретные значения приведены выше.

Однако в некоторых воплощениях уместно отсылать к значениям, уровням или количествам аденозина, продуцируемым у субъекта, например, локально, например, в месте введения, например, в желудочно-кишечном тракте. Например, предпочтительные штаммы могут способствовать увеличению продукции аденозина, например, увеличению продукции in vivo, например, локальной продукции (например, в желудочно-кишечном тракте), аденозина, например, по сравнению с соответствующим контролем как описано в другом месте в настоящем документе, таким как уровни аденозина, когда никакие штаммы не вводят, или базовый или естественный уровень аденозина у конкретного субъекта.

Во всех аспектах изобретения, описанных в настоящем документе, локальная продукция может относиться к продукции или уровням аденозина в месте введения, например, к продукции или уровням аденозина в желудочно-кишечном тракте (например, при пероральном введении). В одном из аспектов локальная продукция аденозина может иметь дальнейшие системные эффекты и может повышать уровни аденозина или мелатонина в системе кровообращения, например, в крови или плазме или других местах вне желудочно-кишечного тракта.

Таким образом, штаммы, которые могут вызывать повышенный локальный уровень аденозина (или активности мелатонина или 5'-нуклеотидазы), например, в желудочно-кишечном тракте субъекта, предпочтительны, в особенности, когда такой эффект наблюдают при пероральном введении штаммов. Предпочтительно, указанные увеличения представляют собой измеримые или значительные увеличения, например, статистически или клинически значимые увеличения. Например, предпочтительны штаммы, которые могут вызвать увеличение по меньшей мере или вплоть до в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6 7, 8 раз в уровнях аденозина (или мелатонина или активности 5'-нуклеотидазы), например, локальных уровнях аденозина (или мелатонина или активности 5'-нуклеотидазы). Можно применять любое подходящее сравнение, например, увеличение по сравнению с уровнями, наблюдаемыми, когда штамм не вводили, или уровнями, когда вводили контрольную композицию, например, контрольную композицию, не содержащую соответствующего штамма.

Соответствующие способы измерения уровней продукции аденозина (или мелатонина или активности 5'-нуклеотидазы) хорошо известны специалисту в данной области техники. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения, способ селекции будет включать стадию обнаружения или определения количества или уровня (например, концентрации) аденозина, продуцируемого штаммом-кандидатом.

Необязательно, уровни продукции аденозина или 5'-нуклеотидазной активности (или, действительно, любого другого подходящего свойства штаммов, описанных в настоящем документе) можно удобно сравнить со штаммами положительного или отрицательного контроля. Подходящим штаммом положительного контроля может служить DSM 17938, который, как показано в Примерах, продуцирует значительные уровни активности аденозина/5'-нуклеотидазы, например, в супернатанте бактериальных клеток. Некоторые штаммы будут производить более высокие, иногда значительно более высокие, уровни активности аденозина/5'-нуклеотидазы, чем DSM 17938, например, в супернатанте бактериальных клеток. Таким образом, штаммы, способные продуцировать более высокие (повышенные) уровни или значительно более высокие (повышенные) уровни активности 5'-нуклеотидазы, чем DSM 17938, например, в супернатанте бактериальных клеток, при оценке in vitro, образуют еще один дополнительный аспект изобретения. DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 и DSM 33198 представляют собой иллюстративные штаммы (см. фиг. 3 и фиг. 5 A/B). С другой стороны, штаммы, способные продуцировать или индуцировать продукцию более высоких (повышенных) уровней или значительно более высоких (повышенных) уровней, аденозина, чем DSM 17938, например в супернатанте бактериальных клеток, при оценке in vitro, образуют еще один дополнительный аспект изобретения. Например, штаммы, способные продуцировать или индуцировать продукцию более высоких (повышенных) уровней или значительно более высоких (повышенных) уровней аденозина у субъекта, например, более высоких и т.д., локальных уровней аденозина у субъекта, чем DSM 17938, при оценке in vivo, например, образуют еще один аспект дополнительных изобретений, в особенности, где такой эффект наблюдается при пероральном введении штаммов.

В общем, для некоторых воплощений предпочтительны штаммы, которые имеют одно или несколько улучшенных (например, значительно улучшенных) свойств по сравнению с DSM17938.

Предпочтительно, указанные увеличения (продукции аденозина или активности 5'-нуклеотидазы) представляют собой измеримые или значимые увеличения, например, статистически или клинически значимые увеличения. Например, штаммы, которые могут вызывать увеличение по меньшей мере или вплоть до 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550% или более высоких уровней аденозина, например, локальных или in vitro уровней аденозина, или уровней активности 5'-нуклеотидазы (например, при оценке in vitro) по сравнению с уровнями с DSM 17938, представляют собой предпочтительные штаммы. С другой стороны, предпочтительны штаммы, которые могут вызвать по меньшей мере или вплоть до, 1,5-, 2-, 2,5-, 3-, 3,5-, 4-, 4,5-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-кратное увеличение уровней аденозина, например, локальных или in vitro уровней аденозина или уровней 5'-нуклеотидазной активности по сравнению с уровнями с DSM 17938. Уровни in vitro можно удобно измерить, как описано в другом месте в настоящем документе, например, на бактериальных культурах. Предпочтительно, такое повышение представляет собой увеличение внеклеточного уровня аденозина или активности 5'-нуклеотидазы, например, при измерении in vitro, например, в супернатанте бактериальных культур.

Подходящим штаммом отрицательного контроля может быть штамм, который не содержит гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, или не содержит активного фермента 5'-нуклеотидазы (или не обладает 5'-нуклеотидазной активностью, как описано в другом месте в настоящем документе).

Из-за применения на последующих этапах штаммов, которые отбирают способами изобретения, после отбора или выделения штаммов, продуцирующих аденозин, другие воплощения будет включать в себя дополнительные стадии культивирования или размножения или получения таких штаммов, и необязательно составление указанных культивируемых или размноженных или продуцируемых штаммов в композицию, включающую указанный штамм, например, в фармацевтическую или пищевую композицию, например, как описано в другом месте в настоящем документе, или возможно хранение таких штаммов для будущего применения, например, посредством лиофилизации или сублимационной сушки. В одном из воплощений штаммы бактерий обеспечивают в лиофилизированной форме.

Стадии отбора способов изобретения (и, конечно, терапевтические способы, как описаны в настоящем документе) необходимо проводить в подходящей культуральной среде (или в in vivo окружении), которая поддерживает продукцию аденозина. Предпочтительные культуральные среды (или in vivo окружение) будут содержать соответствующий источник углерода, который будет поддерживать продукцию аденозина указанным штаммом, предпочтительно вместе с подходящим субстратом для продукции аденозина ферментом 5'-нуклеотидазой, например, АМФ.

Хотя такие анализы удобно проводить in vitro, другой возможностью может быть оценка штаммов в соответствующем анализе ex vivo, например, с применением соответствующей модели кишечных энтероидов (см., например, модель энтероидов и анализы, описанные в примере 5, в котором можно оценить, например, уровни мелатонина).

Таким образом, хотя любые подходящие модели in vitro или ex vivo для оценки штаммов, например, для оценки индукции продуцирования аденозина или мелатонина штаммами, предпочтительные модели in vitro или ex vivo для оценки штаммов представляют собой модели кишечных энтероидов, предпочтительно модели кишечных энтероидов человека, которые, например, можно применять для оценки уровня мелатонина. Такие модели предпочтительно включают энтероэндокринные клетки, например, как описано в примере 5.

Предпочтительные штаммы изобретения способны продуцировать или индуцировать продукцию по меньшей мере или вплоть до 10, 20, 30, 40, 50, 60 или 70 пг/мл мелатонина. В некоторых воплощениях такие значения могут представлять собой верхние пределы. Такие значения обычно относят к уровням продукции мелатонина, индуцированной указанными штаммами, при измерении в соответствующем анализе in vitro или ex vivo, например, относят к уровням мелатонина, которые продуцируют энтероэндокринные клетки (предпочтительно, клетки человека), или продуцируют в модели кишечного энтероида, включающей энтероэндокринные клетки (например, с % энтероэндокринных клеток, как описаны в другом месте в настоящем документе), предпочтительно, в модели, включающей клетки человека, когда указанные клетки вступают в контакт со штаммами изобретения или с супернатантом, полученным из указанных штаммов. Соответствующий и иллюстративный анализ для измерения этой активности приведен в примерах с применением модели кишечного энтероида человека, включающей энтероэндокринные клетки, например, по меньшей мере 20% или 30%, например, 20-40%, 30-40% или вплоть до 40% энтероэндокринных клеток. Таким образом, в предпочтительных воплощениях вышеуказанные значения относятся к значениям, измеренным с применением этого анализа (или эквивалентного анализа, например, с указанным выше % энтероэндокринных клеток) и/или условий, описанных в разделе «Примеры».

Некоторые штаммы будут способны продуцировать или индуцировать более высокие, иногда значительно более высокие уровни мелатонина, чем DSM 17938, например, из энтероэндокринных клеток или в моделях кишечных энтероидов, как описано выше. Таким образом, штаммы, способные продуцировать или индуцировать более высокие (повышенные) уровни или значительно более высокие (повышенные) уровни мелатонина, чем DSM 17938, например, при оценке, как описано выше, например, с применением энтероэндокринных клеток или модели кишечных энтероидов, образуют еще один дополнительный аспект изобретения. Приведенные в качестве примера штаммы могут привести к увеличению в по меньшей мере или вплоть до в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3мраза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 5,5 раз, 6 раз, 6,5 раз, 7 раз, 7,5 раз, 8 раз, 8,5 раз, 9 раз, 9,5 раз или 10 раз в уровнях продукции мелатонина по сравнению с уровнями с DSM 17938 и представляют собой предпочтительные штаммы.

Способы скрининга изобретения могут, таким образом, необязательно включать дополнительную стадию отбора штамма, который способен производить или индуцировать продукцию мелатонина, например, применяя методологию, как описана выше, или любую другую подходящую методологию. Отобранные штаммы могут предпочтительно вызывать продукцию мелатонина на уровнях, как описаны выше.

В воплощениях, в которых скринингу с применением способов изобретения подвергают более одного бактериального штамма, количество генерируемой активности аденозина или 5'-нуклеотидазы (или мелатонина) необязательно может быть определено количественно, и может быть отобран бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, с наивысшей активностью или уровнем фермента 5'-нуклеотидазы, или достаточно высокой активностью или уровнем фермента 5'-нуклеотидазы, например, с активностями или уровнями, как описаны в другом месте в настоящем документе, например с активностями или уровнями выше (предпочтительно, значительно выше), чем у DSM17938, или штамм, производящий наибольшее количество или уровень аденозина или мелатонина, или достаточно высокое количество или уровень аденозина или мелатонина, например, с количествами или уровнями, как описаны в другом месте в настоящем документе, например, с количествами или уровнями выше (предпочтительно, значительно выше), чем DSM17938.

Таким образом, еще один аспект изобретения заключается в обеспечении способа отбора бактериальных штаммов, предпочтительно, штаммов молочнокислых бактерий, эффективных в продукции аденозина (или мелатонина), включающего:

a) скрининг штаммов молочнокислых бактерий на наличие гена, кодирующего 5'-нуклеотидазу, например, закрепленную на клеточной поверхности 5'-нуклеотидазу, и;

b) количественную оценку активности фермента 5'-нуклеотидазы и необязательно

c) отбор штамма молочнокислых бактерий, который имеет наивысшую или достаточно высокую активность фермента 5'-нуклеотидазы.

Способы, включающие определенные стадии, как описаны в настоящем документе, также включают, где необходимо, способы, состоящие из этих стадий.

Как указано выше, бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, отобранный, продуцированный, полученный или который можно получить с помощью способов изобретения, в котором указанный штамм способен продуцировать аденозин, и, предпочтительно, в свою очередь продуцировать, или способствовать продукции, например, увеличению продукции, мелатонина, представляет собой еще один дополнительный аспект изобретения.

Любой подходящий бактериальный штамм, например, пробиотический бактериальный штамм, например, любые пробиотические бактерии, могут быть подвергнуты способу селекции изобретения и любой подходящий бактериальный штамм, например, пробиотический бактериальный штамм, который способен продуцировать аденозин может быть применен в способах или применениях настоящего изобретения, например, в терапевтических способах или применениях, описанных в настоящем документе.

Предпочтительные бактериальные штаммы представляют собой молочнокислые бактерии, например Lactobacillus или Bifidobacterium. Особенно предпочтительные бактериальные штаммы представляют собой Lactobacillus reuteri, в особенности, штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и DSM 32849, которые были депонированы по Будапештскому договору в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (MascheroderWeg 1b, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig)) 4 июля 2018, и Lactobacillus reuteri DSM 33198 который был депонирован по Будапештскому договору в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (MascheroderWeg 1b, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig)) 9 июля 2019. Эти штаммы бактерий или изолированные штаммы бактерий (и другие штаммы, например, штаммы L.reuteri, в особенности, родственные штаммы L.reuteri, с одной или несколькими характеристиками, например, способностью производить аденозин и/или 5'-нуклеотидазную активность, и/или мелатонин или оказывать действие на их продукцию, в одном или нескольких депонированных штаммов) образуют предпочтительные аспекты изобретения и могут, например, быть применены для лечения заболеваний или состояний, как описаны в другом месте в настоящем документе, или для любых других применений, как описаны в настоящем документе. В некоторых воплощениях, штамм L.reuteri DSM 17938 не применяют.

Таким образом, в еще одном дополнительном аспекте изобретение обеспечивает применение таких штаммов для лечения или профилактики одного или нескольких заболеваний, как описаны в настоящем документе.

В другом аспекте изобретения обеспечивают способ улучшения применения и эффекта от лечения конкретных заболеваний, как описаны в настоящем документе, включающий максимизацию, увеличение или улучшение активности 5'-нуклеотидазы отобранных штаммов, например, штаммов молочнокислых бактерий, которые предпочтительно приведут к увеличению или улучшению продукции аденозина. Это может быть достигнуто путем культивирования бактерий в определенных условиях роста, чтобы обеспечить высокий выход аденозина (или более высокий, например, значительно более высокий выход аденозина, например, по сравнению с выходом, наблюдаемым в отсутствии определенных условий роста). В одном из воплощений изобретения, конкретные условия роста могут представлять собой, например, культивирование молочнокислых бактерий в нормальной питательной среде с добавлением соответствующего субстрата для продукции аденозина под действием фермента 5'-нуклеотидазы, например, АМФ, или соответствующих компонентов, из которых может быть получен АМФ, такие как АДР и/или ATP.

В дополнительном сходном воплощении изобретения, чтобы максимизировать активность 5'-нуклеотидазы, можно вводить более высокую концентрацию бактерий, например, молочнокислых бактерий. Например, концентрация может быть в 2-10 раз выше, чем обычная доза.

В дополнительном сходном воплощении изобретения, ген 5'-нуклеотидазы может быть сверхэкспрессирован или индуцирован в бактериальных штаммах с помощью соответствующих способов, например, вставкой в плазмидный вектор гена 5'-нуклеотидазы под контролем соответствующего промотора, например, индуцибельного промотора. Альтернативно, ген 5'-нуклеотидазы может быть сверхэкспрессирован путем вставки одной или нескольких дополнительных копий гена в бактериальную клетку, например, путем вставки в хромосому бактериальной клетки под контроль соответствующего промотора, например, индуцибельного или нативного промотора.

Как описано выше, штаммы изобретения, или штаммы, отобранные, продуцированные, полученные или которые можно получить способами изобретения, имеют применение в терапии. Таким образом, дополнительный аспект изобретения обеспечивает штаммы, продуцирующие аденозин, изобретения, или штаммы, отобранные, полученные или которые можно получить способами селекции изобретения, для применения в продукции, например, локальной продукции, аденозина, и, таким образом, предпочтительно мелатонина у субъекта. В предпочтительных воплощениях изобретения, указанную продукцию аденозина и т.д. и, предпочтительно, мелатонина применяют для лечения младенческой колики (и других заболеваний, как описаны в настоящем документе), в отношении которых будет полезна продукция или увеличение продукции, например, локальной продукции, аденозина и, таким образом, мелатонина.

Введение бактериальных штаммов субъектам (животным/млекопитающим), нуждающимся в лечении, в способах лечения и применения по изобретению осуществляют в фармацевтически, терапевтически или физиологически эффективных количествах. Таким образом, указанные способы и применения могут включать дополнительную стадию выявления субъекта, нуждающегося в лечении.

Лечение заболевания или состояний в соответствии с настоящим изобретением (например, лечение уже существующего заболевания) включает излечение указанного заболевания или состояний или любое уменьшение или облегчение заболевания (например, уменьшение тяжести заболевания) или симптомов заболевания.

Способы и применения настоящего изобретения подходят для профилактики заболеваний или состояний, а также для лечения заболеваний или состояний. Таким образом, профилактическое лечение также входит в объем изобретения. Именно по этой причине в способах и применениях настоящего изобретения, лечение или терапия также включает профилактику или предупреждение, где это необходимо. Такие предупредительные (или защитные) аспекты можно удобно осуществлять на здоровых или нормальных субъектах, как описаны в настоящем документе, и они могут включать как полное предупреждение, так и существенное предупреждение. Точно так же, существенное предупреждение может включать сценарий, при котором тяжесть заболевания или симптомы заболевания снижаются (например, измеримо или значительно снижаются) по сравнению с тяжестью или симптомами, которых можно было бы ожидать, если лечение не проводили.

В еще одном дополнительном аспекте изобретение обеспечивает штамм или изделие для терапевтических применений, как определены в других местах в настоящем документе, в котором указанное применение дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного средства, например, дополнительного терапевтического или питательного средства. Например, средства могут быть компонентами субстрата, которые увеличивают или улучшают производство аденозина (например, компонент, который может увеличить или усилить продукцию аденозина), или источниками таких компонентов.

Таким образом, в еще одном дополнительном воплощении изобретения, в котором речь идет о бактериях, продуцирующих аденозин, введение указанных штаммов или изделий дополнительно включает введение компонента субстрата, например, АМФ и/или материала или средства, которые производят этот компонент. Предпочтительным субстратом будет АМФ, или источник АМФ.

В таких воплощениях компонент субстрата или другой дополнительный компонент может быть добавлен к бактериальному препарату непосредственно перед введением субъекту. Альтернативно, его можно добавить к бактериальному препарату в конце процесса производства, например, в конце ферментации, после чего бактерии могут быть сохранены для будущего применения, например, путем лиофилизации или сублимационной сушки. Его можно ввести отдельно, как описано ниже.

В таких воплощениях, дополнительное терапевтическое средство может представлять собой любое дополнительное средство, которое будет полезно при лечении рассматриваемого заболевания.

Указанные дополнительные средства можно вводить вместе со штаммами или изделиями по изобретению (например, в виде комбинированного препарата) или можно вводить отдельно. Кроме того, указанные дополнительные средства можно вводить одновременно со штаммами или изделиями по изобретению или в разные моменты времени, например, последовательно. Подходящие режимы и время введения могут быть легко определены специалистом в зависимости от рассматриваемого дополнительного средства.

Настоящее изобретение также обеспечивает композицию (или комбинированное изделие или набор), включающий:

(i) бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, отобранный, продуцированный, полученный или который можно получить с помощью способа отбора изобретения (или бактериальный штамм, способный продуцировать или индуцировать продукцию аденозина как иначе определено в настоящем документе), в котором указанный бактериальный штамм имеет ген, кодирующий закрепленную на клеточной поверхности 5'-нуклеотидазу, или активный фермент 5'-нуклеотидазы и способен продуцировать аденозин; и

(ii) один или несколько компонентов субстрата или средств, которые увеличивают или улучшают продукцию аденозина, или источник таких компонентов или средств.

Иллюстративные компоненты или средства были описаны выше. АМФ или источник АМФ представляет собой предпочтительный компонент.

Изобретение также обеспечивает композицию (или комбинированное изделие или набор), подходящую для увеличения продукции мелатонина или аденозина у субъекта, включающую:

(i) первый бактериальный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, способный продуцировать или индуцировать продукцию мелатонина или аденозина, как описано в настоящем документе; и

(ii) дополнительный источник мелатонина и/или аденозина, или один или несколько компонентов субстрата или средств для увеличения или усиления продукции или индукции продукции мелатонина и/или аденозина, или источник таких компонентов или средств, при необходимости, штаммом молочнокислых бактерий.

Предпочтительный компонент представляет собой АМФ или источник АМФ.

В наборах или комбинированных продуктах изобретения, компоненты (i) и (ii) обычно обеспечивают в отдельных компартментах или флаконах или как отдельные составляющие комплекта или продукта. Наборы могут включать дополнительные компоненты, которые также могут находиться в отдельных компартменте или флаконах. Предпочтительно наборы (или комбинированные изделия) предназначены для применения в способах или применениях настоящего изобретения, как описаны в настоящем документе, например, предназначены для применения в лечении или предупреждении других заболеваний, описанных в настоящем документе, в особенности, младенческой колики. Необязательно инструкции по применению наборов или изделий в способах и применении по изобретению могут быть обеспечены.

Термин «субъект» как используется в настоящем документе включает млекопитающих, в особенности, людей, в особенности, младенцев (например, когда заболевание, которое необходимо предотвратить или лечить, представляет собой колики). В предпочтительных воплощениях изобретения, отобранный штамм, например, штамм молочнокислых бактерий, вводят человеку. Для заболеваний, отличных от колик, подходит любой субъект, например, субъект-человек, например, субъект-взрослый или субъект-ребенок или субъект-младенец, страдающий указанным заболеванием или предположительно страдающий указанным заболеванием или находящийся в группе риска указанного заболевания.

Предпочтительный субъект в соответствии с настоящим изобретением представляет собой младенца в возрасте младше или вплоть до 12 месяцев, предпочтительно младше или вплоть до 5 или 6 месяцев, предпочтительно, младше или вплоть до 3 или 4 месяцев. Такие субъекты особенно подходят, когда болезнь, которую нужно лечить или предотвращать, представляет собой младенческую колику. Субъектов, таким образом, можно лечить с рождения или в течение первых нескольких недель (например, в течение первых 1, 2, 3 или 4 недель) или в течение первых нескольких месяцев (например, в течение первых 1, 2, 3 или 4 месяцев) жизни.

Как описано в другом месте в настоящем документе, предпочтительные субъекты, - это те, которые страдают от младенческой колики (или от одного из других заболеваний, как описаны в настоящем документе), или полагают или предполагают, что они страдают от младенческой колики (или от одного из других заболеваний, как описаны в настоящем документе). Поскольку терапевтические применения изобретения также могут быть применены для предотвращения заболевания, подходящие субъекты включают тех, кто рискует пострадать от младенческой колики (или от одного из других заболеваний, как описаны в настоящем документе).

В качестве примера, субъекты будут включать младенцев, которые находились исключительно (только) на грудном вскармливании, и младенцев, которые находились исключительно (только) на искусственном вскармливании (младенцев, не находившихся на грудном вскармливании), или младенцев, которые находились на грудном вскармливании и на искусственном вскармливании.

Другие субъекты, которые можно привести в качестве примера, включают младенцев, в особенности, младенцев с коликами, с подозрением на колики или с риском развития колик, которые еще не продуцируют или не высвобождают мелатонин или иным образом не способны продуцировать или высвобождать мелатонин, например, младенцев, у которых циркадный цикл мелатонина еще не сложился или не начался, или младенцев, которые не способны продуцировать или высвобождать необходимый мелатонин из своей пищи и/или своих кишечных бактерий, или включают младенцев, которые имеют низкие, сниженные, например, значительно сниженные (или аномальные) уровни мелатонина или недостаток мелатонина, например, по сравнению с уровнями у нормального или здорового субъекта, например, с уровнями у нормального или здорового субъекта того же, эквивалентного или сопоставимого возраста.

При других заболеваниях, отличных от колик, субъекты, которые можно привести в качестве примера, включают субъектов, которые имеют низкие, сниженные, например, значительно сниженные (или аномальные) уровни мелатонина или недостаток мелатонина, например, по сравнению с уровнями у нормального или здорового субъекта, например с уровнями у нормального или здорового субъекта того же, эквивалентного или сопоставимого возраста.

Другие субъекты, которых можно привести в качестве примера, включают младенцев, у которых есть какие-то сложности или проблемы с питанием или диетой, что, например, приводит к низким или недостаточным уровням мелатонина. Такие субъекты могут включать младенцев, рожденных до истечения полного срока беременности, например, недоношенных младенцев или младенцев, родившихся до 36 недель беременности, или младенцев у которых отсутствует полноценный пищевой метаболизм, или младенцев, у которых проблемы с кормлением или проблемы с питанием.

Другие субъекты, которых можно привести в качестве примера, включают субъектов, предпочтительно, младенцев с гормональной незрелостью (другими словами, с субоптимальной, субнормальной, неразвитой, недостаточной, низкой или незрелой выработкой гормонов), например, по сравнению с нормальным младенцем или субъектом того же возраста, например, мелатониновой незрелостью, в особенности, тех субъектов, которые имеют недостаточность моторики кишечника в результате незрелости указанного гормона. Такая гормональная незрелость, например, мелатониновая незрелость или снижение или дефицит мелатонина, могут, например, быть связаны с некоторыми младенцами, страдающими младенческой коликой. Другие предпочтительные заболевания (и, следовательно, субъекты), подлежащие лечению, представляют собой заболевания или состояния, связанные с дефицитом мелатонина (или субъектов, страдающих указанными заболеваниями).

У всех таких субъектов, если это уместно или необходимо, уровни мелатонина для каждого из указанных субъектов могут быть легко измерены с применением способов, легко доступных и известных в данной области техники. Например, уровни мелатонина можно легко измерить в образцах сыворотки/крови или слюны. Также доступны коммерческие наборы для таких измерений.

Можно применять любой подходящий режим введения. Удобно осуществлять указанное введение перорально, ректально или через зонд. Таким образом, бактерии можно вводить в желудочно-кишечный тракт или в полость рта, если желательно или целесообразно. Бактерии могут быть включены в детскую смесь или пищевую добавку или масляные капли, а также в фармацевтическую композицию.

Соответствующие дозы штаммов, изделий и композиций изобретения, как определено в настоящем документе, можно легко выбрать в зависимости от заболевания (или состояния), подлежащего лечению, способа введения и рассматриваемой композиции.

Например, дозу и режим введения выбирают так, чтобы бактерии, вводимые субъекту в соответствии с настоящим изобретением, могли привести к увеличению продукции, например, локального продукции, аденозина (или мелатонин) и вызвать желаемый терапевтический эффект или пользу для здоровья при младенческой колике (или при другом подлежащем лечению заболевании). Таким образом, предпочтительно указанная дозировка представляет собой терапевтически эффективную дозировку, которая подходит для типа млекопитающего и состояния, которое лечат, и ее вводят, например, нуждающемуся в этом субъекту. Например, могут быть применены суточные дозы, например, однократная суточная доза, равная от 10⁴ до 10¹², например, от 10⁵ до 10⁹, или от 10⁶ до 10⁸, или от 10⁸ до 10¹⁰, или от 10¹⁰ до 10¹² общего КОЕ бактерий.

В одном из воплощений суточную дозу (например, 10⁵ до 10⁹ или 10⁶ до 10⁸or 10⁸ до 10¹⁰ или 10¹⁰ до 10¹² КОЕ) разделяют на несколько введений, например, 2-8 введений (например, 3-5 введений) или в связи с каждым кормлением (грудным и/или искусственным) субъекта. В одном из воплощений, более высокую дозу, например, в от 2 до 10 или в от 10 до 100 раз более высокую дозу после начального периода, и/или более часто назначаемую дозу вводят в качестве начальной в течение 3-14 дней (например, 5-10 дней, например, 7 дней) для достижения более быстрого облегчения у субъекта.

Термин «увеличивать» или «усиливать» или «повышенный» (или эквивалентные термины), как описаны в настоящем документе, включает любое измеримое увеличение или повышение по сравнению с соответствующим контролем. Соответствующие контроли могут быть легко определены специалистом в данной области техники и могут включать уровни, когда штаммы не присутствуют, или уровни у не получавших лечение или получавших плацебо субъектов, или уровни у здоровых или нормальных субъектов, например, подобранных по возрасту субъектов, или у того же субъекта до лечения. Предпочтительно, увеличение будет значимым, например, клинически или статистически значимым, например, со значением вероятности ≤0,05.

Предпочтительно, такие увеличения (и, конечно, другие увеличения, улучшения или положительные эффекты, как указано в других местах в настоящем документе) представляют собой измеримые увеличения и т.д. (в зависимости от обстоятельств), более предпочтительно, они представляют собой значимые, клинически значимые или статистически значимые увеличения, например, со значением вероятности ≤0,05 по сравнению с соответствующим контрольным уровнем или значением (например, по сравнению с необработанным или получавшим плацебо субъектом или по сравнению со здоровым или нормальным субъектом или тем же субъектом до лечения).

Термин «снижать» или «уменьшать» (или эквивалентные термины), как описано в настоящем документе, включает любое измеримое уменьшение или уменьшение по сравнению с соответствующим контролем. Соответствующие контроли могут быть легко определены специалистом в данной области техники и могут включать уровни, когда штаммы не присутствуют, или уровни у не получавших лечение или получавших плацебо субъектов, или уровни у здоровых или нормальных субъектов, например, подобранных по возрасту субъектов, или у того же субъекта до лечения. Предпочтительно снижение или уменьшение будет значимым, например, клинически или статистически значимым, например, со значением вероятности ≤0,05.

Таким образом, предпочтительно такое снижение (и, конечно, другие снижения, сокращения или отрицательные эффекты, как упоминались в других местах в настоящем документе) представляют собой измеримые снижения и т.д., (при необходимости), более предпочтительно, они представляют собой значимые снижения, предпочтительно, клинически значимые или статистически значимые снижения, например, со значением вероятности ≤0,05, по сравнению с соответствующим контрольным уровнем или значением (например, по сравнению с не получавшим лечение или получавшим плацебо субъектом или по сравнению со здоровым или нормальным субъектом или тем же субъектом до лечения).

Как применено во всей заявке, термин, относящийся к отдельному компоненту или стадии, применяют в том смысле, что он относится к «по меньшей мере одному», «по меньшей мере первому», «одному или нескольким» или «множеству» таких компонентов или стадий, за исключением случаев, когда после этого конкретно указывают верхний предел.

Кроме того, если в настоящем документе применяют термины «содержат», «содержит», «имеет» или «имеющий» или другие эквивалентные термины, то в некоторых более конкретных воплощениях эти термины включают термин «состоит из» или «состоит в основном из» или другие эквивалентные термины. Перечни, «состоящие из» различных компонентов и функций, обсуждаемые в настоящем документе, также могут относиться к перечням, «включающим» различные компоненты и признаки.

Другие цели и преимущества будут более очевидны из следующих неограничивающих примеров и прилагаемой формулы изобретения.

Примеры

Пример 1

Способ идентификации штаммов, содержащих ген, кодирующий расположенную на поверхности клетки 5'-нуклеотидазу

Культивировали бактерии на чашках MRS в течение 16-ти часов при 37°C в анаэробной атмосфере. Собирали 10 бактериальных колоний стерильной пластиковой петлей и суспендировали в 100 микролитрах стерильной воды (качество ПЦР). (Альтернативный вариант: получали ДНК из бактериальной культуры подходящим способом).

Наличие гена 5'-нуклеотидазы можно исследовать с помощью ПЦР, например, применяя гранулы PuReTaq Ready To Go для ПЦР («GE HealthCare») и любую из пар праймеров, описанных ниже (по 0,4 мМ каждого). Бактериальную суспензию или препарат ДНК (0,5 мкл) следует добавить к смеси для ПЦР и провести реакцию ПЦР, запустив программу 95°C, 5 мин; 30x (95°C, 30 сек; 55°C, 30 сек; 72°C, 30 сек); 72°С, 10 мин. Продукты ПЦР можно было разделить и визуализировать с помощью стандартного электрофореза в агарозном геле, а последовательности определить можно с помощью стандартного секвенирования по Сэнгеру (с помощью прямого праймера, применямого для ПЦР).

Ген может быть обнаружен с помощью любого из следующих праймеров:

Пара праймеров 1 (размер продукта 233 п.н.)

LrNuc1f: GGAACTTTGGGAAACCATGA(SEQ ID NO:2)

LrNuc1r: CGGGCAACTTTACCATCACT(SEQ ID NO:3)

Пара праймеров 2 (размер продукта 212 п.н.)

LrNuc2f: TACTCGTGAAAATGCCGTTG(SEQ ID NO:4)

LrNuc2r: GTGCCCCTGTCATTTCAACT(SEQ ID NO:5)

Пара праймеров 3 (размер продукта 232 п.н.)

LrNuc3f: AGCTTTACCAAATTGACCCTGA(SEQ ID NO:6)

LrNuc3r: TTGATATTAGGCGCATCCTTTT(SEQ ID NO:7)

Последовательности

Ген, кодирующий закрепленную на клеточной поверхности 5'-нуклеотидазу, номер доступа в GenBank: AEI56270.1, белок клеточной стенки с якорным доменом, несущим мотив LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112] (SEQ ID NO:8)

ATGAAGAATAATAGTTCAAAATATTGTTTATTGTTAGGGACAGCGCTGTTAGGACTATATTTCCAAGCTAATAGTGTTCATGCGGATGCGACTGGTATCACAGCTAATGGAGAAACTACCCATAGCAATGTTACTCCAATGGTTCAGACTAATAAGGATGAGGCAAGTACACCGCAAACAACTACTGATTGGTCTGACCCGGCCAAATATCAAAGTGACATTCCAGTTCAGATTTTAGGAATCAATGACTTGCATGGTGGGTTAGAAACGACTGGATCAGCTACGATTGGAGATAAGACTTATTCGAATGCCGGAACAGTTGCACGCCTAGCTGGTAACCTTGATGCGGCGGAGGAAAGTTTTAAGAACGCTAATCCGACGGGAAGCTCAATTCGGGTAGAAGCCGGAGATATGGTTGGGGCTTCTCCAGCAAATTCTGCTCTTCTCCAAGACGAATCAACCATGCATGCTTTAGACGCAATGCATTTTGAAATAGGAACTTTGGGAAACCATGAGTTCGATGAAGGTTTAGCTGAGTATATGCGGATTGTTAATGGTGGTGAACCTACTAAACAATATAATGAAGCTGAGATGGCCTATCCTCATGTGAAAACAGGGATTAATATCATTACTGCCAATGTTGTAAATAAATCTGATGGTCAAATCCCATTTGGAATGCAACCATACTTGATTAAAGAAATTCATACTAGTGATGGTAAAGTTGCCCGGATCGGATTTATTGGGATTGAAACTACTTCCCTACCAATTTTAACCTTATACGATAATTACAAAGATTATGATGTTTTAGACGAGGCTGAAACAATTGCAAAATATGATCAAATTTTACGCAAAAAAGGTGTTAACGCAATTGTAGTTCTTGCCCATACAGGGGTTTCAACTGATAAAGATGGCAGCACTAAAGGTAATGCTGTTGATATCATTAAGAAGCTTTACCAAATTGACCCTGATAATTCTGTCGACCTTTATATTGCTGGTCACTCCCACCAATATGCTAATGCTACTGTTGGAAGTGTAAAATTAGTGCAAGCCATTTACACGGGTAAAGCTTACGATGATATTATCGGTTACATCGATCCAACAACTAATGATTTTGCGCCCAATAGTCTCGTTTCACATGTCTTTCCGGTACTATCTGAAAAGGATGCGCCTAATATCAAAACGGATGCAAATGTTACAGCAATTGTTGAAGATGCGAACAACCGAGTAGCACCGATTATTAACAAGAAAATAGGGGAAGCTGCTACAACAGGCGATATTCTTGGACGACTTCATAATACTCCTACTCGTGAAAATGCCGTTGGTGAATTAGTTGTCGATGGTCAATTATATGCCGCTCATAAAGTAGGCTTACCAGCTGATTTTGCGATGACTAATACAGGGGGCGTTCGTGCAGATCTGCATGTTAATCCTGATCGTTCCATTACATGGGGGAGTGCCCAAGCAGTTCAACCATTTGGTAATATTTTGCGGGTAGTTGAAATGACAGGGGCACAAATCGTTGAAGCCTTGAATCAACAATACGACGAAGATCAAGCTTACTACTTACAGATTTCCGGGCTACATTATACTTATACTGACCAAAACGATCCTAACCAACCATATAAGGTCGTTCAAGTTTATGACCAACATAATCAACCGCTTGATATGAATAAGACTTACAATGTTGTTATTAATGACTTTTTAGCAGGTGGCGGAGATGGCTTTTCTGCATTTAAGGGTACTAAAGTTGTCGGGATTGTTGGTCAAGATACAGACGCGTTTATTGACTATATTACTGATATGACTAATGATGGTAAACCAATTACTGCGCCAACAATGAACCGTAAGATTTACTTGACTGCTGAACAAGTAGCGAAGGCTGACTCAGATTCACAGTTACAAACAGGAACTAATCAGAACACTCAAAACGATGCTAATTCCCAGACTGAAGGAAATCAGCTTCAAGAAGTTCCGAGCCAACCGGTATCTCCAACAGTAACCTTGCCAACAACAGCTGGTCAACCCGCCGAAACTGTTACACTACATGCTCAATCTAAGCAACAAACCGTAGCTGCTAATAATCAATTAATTAATTTGACGCCTACATCAATTAATGGCCAAAAACAAAAAGCAGCTGACCAGCAAGCAGCTTTACCACAAACTAGTAACGATGAAGATCTTGCATTACTTCTTCTCGGAAGTTCATTAATGGCAGCAACCGGATTGACAATTATTGATCGCAAGCGTAAACATGCTTAA

Белок 5'-нуклеотидазы, закрепленный на клеточной поверхности, номер доступа в GenBank : AEI56270.1, белок клеточной стенки с якорным доменом, несущим мотив LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112] (SEQ ID NO:9)

MKNNSSKYCLLLGTALLGLYFQANSVHADATGITANGETTHSNVTPMVQTNKDEASTPQTTTDWSDPAKYQSDIPVQILGINDLHGGLETTGSATIGDKTYSNAGTVARLAGNLDAAEESFKNANPTGSSIRVEAGDMVGASPANSALLQDESTMHALDAMHFEIGTLGNHEFDEGLAEYMRIVNGGEPTKQYNEAEMAYPHVKTGINIITANVVNKSDGQIPFGMQPYLIKEIHTSDGKVARIGFIGIETTSLPILTLYDNYKDYDVLDEAETIAKYDQILRKKGVNAIVVLAHTGVSTDKDGSTKGNAVDIIKKLYQIDPDNSVDLYIAGHSHQYANATVGSVKLVQAIYTGKAYDDIIGYIDPTTNDFAPNSLVSHVFPVLSEKDAPNIKTDANVTAIVEDANNRVAPIINKKIGEAATTGDILGRLHNTPTRENAVGELVVDGQLYAAHKVGLPADFAMTNTGGVRADLHVNPDRSITWGSAQAVQPFGNILRVVEMTGAQIVEALNQQYDEDQAYYLQISGLHYTYTDQNDPNQPYKVVQVYDQHNQPLDMNKTYNVVINDFLAGGGDGFSAFKGTKVVGIVGQDTDAFIDYITDMTNDGKPITAPTMNRKIYLTAEQVAKADSDSQLQTGTNQNTQNDANSQTEGNQLQEVPSQPVSPTVTLPTTAGQPAETVTLHAQSKQQTVAANNQLINLTPTSINGQKQKAADQQAALPQTSNDEDLALLLLGSSLMAATGLTIIDRKRKHA

Пример 2

Процедура анализа активности 5'-нуклеотидазы

Для определения 5'-нуклеотидазной активности бактериальных клеток и супернатантов ферментации применяли набор для анализа 5'-нуклеотидазы Crystal Chem («Crystal Chem», Elk Grove Village, IL, США). Вкратце процедура была следующей.

В две стадии к образцам, содержащим бактерии или супернатанты, добавляли реагенты CC1 и CC2. Реагент 1 содержит АМФ, который был преобразован в аденозин ферментом 5'-нуклеотидазой из бактерий. Аденозин далее гидролизовался до инозина и гипоксантина компонентами реагента 1. На втором этапе гипоксантин превращался в мочевую кислоту и перекись водорода, которую применяли для получения хинонового красителя, который измеряли кинетически при 550 нм на спектрофотометре. Активность определяли путем расчета изменения оптической плотности между 3 и 5 минутами и сравнения со значением из образца калибратора.

Пример 3

5'-нуклеотидазная активность в штамме Lactobacillus reuteri

Экспериментальные данные, показывающие активность 5'-нуклеотидазы в Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и DSM 32849, а также в Lactobacillus reuteri DSM 17938 (депонированы по Будапештскому договору в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) 30 января 2006) были получены с помощью способа, описанного выше в примере 2. Результаты представлены на фиг. 3.

Пример 4

Отбор штаммов

Все новые штаммы в приведенном выше примере 3, т.е. Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и DSM 32849, продемонстрировали 5'-нуклеотидазную активность в бактериальном супернатанте. Анализ проводили на супернатанте бактериальных культур с концентрацией 10⁹ бактерий на мл.

Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и DSM 32849 были разработаны/усовершенствованы для улучшения свойств. DSM 32846 и DSM 32847 модифицировали так, чтобы они стали более толерантными к желчным кислотам и, таким образом, выживали в большем количестве в желудочно-кишечном тракте. DSM 32848 и DSM 32849 модифицировали так, чтобы они лучше прилипали к слизистой, с целью лучше колонизировать желудочно-кишечный тракт и, таким образом, лучше функционировали в соответствии с настоящим изобретением.

Были отобраны все штаммы Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 и DSM 32849. Предпочтительные штаммы представляют собой DSM 32846, DSM 32847 и DSM 32849.

Пример 5

Влияние пробиотических бактериальных штаммов на продукцию мелатонина в модели кишечного энтероида человека

История вопроса

Кишечные энтероиды человека (HIE), происходящие из стволовых клеток кишечных крипт, биологически значимы в модели кишечного эпителия in vitro. HIE содержат все типы эпителиальных клеток кишечника; однако, как и кишечник человека, HIE в норме продуцируют энтероэндокринные клетки (EEC) в небольших количествах (~ 1%), что ограничивает их исследования. Для увеличения количества EEC в HIE, применяли трансдукцию лентивируса для стабильного конструирования HIE тощей кишки с индуцируемой доксициклином экспрессией нейрогенина-3 (NGN3), фактора транскрипции, который управляет дифференцировкой EEC (tetNGN3-HIE). В этой генно-инженерной клеточной линии количество энтероэндокринных клеток, присутствующих в культуре, увеличивается с ≤1% до ~ 40%.

Материалы и способы

Кишечные энтероиды человека

Культуры HIE были получены из крипт, выделенных из тканей тощей кишки взрослых пациентов, перенесших бариатрическую операцию. Данные стабилизированные культуры были получены в Бэйлорском медицинском колледже в рамках плана клинического исследования и клинического исследования Техасского медицинского центра болезней органов пищеварения. Трехмерные культуры HIE получали из образцов ткани и поддерживали в культуре. Чтобы увеличить количество EEC в HIE, применяли трансдукцию лентивируса для стабильного конструирования HIE тощей кишки с индуцируемой доксициклином экспрессией нейрогенина-3 (NGN3), фактора транскрипции, который управляет дифференцировкой EEC (tetNGN3-HIE). В этой генно-инженерной клеточной линии количество энтероэндокринных клеток, присутствующих в культуре, увеличивается с ≤1% до ~ 40%. Все энтероиды размножали и дифференцировали в 96-луночный монослой в соответствии со стандартными протоколами. Дополнительная информация об этой линии энтероидов, способах ее культивирования и общая методология анализа описаны в работе Chang-Graham et al. (Chang-Graham et al., Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, 2019, S2352-345X (19) 30049- 9, в печати, доступна онлайн-публикация).

Бактериальные штаммы и препараты

В этом эксперименте два разных штамма Lactobacillus reuteri (DSM 17938 и DSM 32846) изучали в отношении их способности увеличивать продукцию мелатонина в кишечнике.

В этом исследовании применяли кондиционированную среду (супернатант) от Lactobacillus reuteri DSM 17938 и Lactobacillus reuteri DSM 32846, выращенных в среде определённого состава для лактобактерий (Lactobacillus Defined Media 4 (LDM4)) до достижения ими стационарной фазы, подробнее смотри ниже.

Отдельную колонию бактериального штамма отбирали с чашки с агаром MRS и применяли для инокуляции в 10 мл бульона MRS и инкубировали в плотно закрытой конической пробирке на водяной бане при 37°C. Через восемь часов проводили разведение культуры 1:10, оптическую плотность при 600 нм регистрировали с помощью спектрофотометра, затем 25 мл предварительно нагретого LDM4 инокулировали при исходной OD, равной 0,1 (расчет ниже), и помещали в водяную баню для инкубации в течение 16 часов.

○ OD = 0,307. Разведение 1:10 = OD равно 3,07

25 мл * (0,1 OD) = 3,07x x = 0,814 мл

○ 814 мкл объединяли с 24,19 мл LDM4

Через 16 часов культуру извлекли. Конечная OD была равна 2,6. Клетки осаждали центрифугированием при 4700 об/мин и супернатант переносили в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Супернатанты хранили при -20°C в течение ночи.

Примененные химикаты

АМФ = Аденозин 5'-монофосфат, 99% («Acros Organics») Код: 102790259, Лот: A0395274.

10 мл исходного раствора (основной раствор 2 мМ = 6,9 мг/мл (FW = 347,224)) готовили в воде MiliQ и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкМ.

Экспериментальные условия

Контрольные обработки на индуцированных энтероидах:

• LDM4 (культуральная среда),

• LDM4 + 20 мкМ АМФ,

• LDM4 + 200 мкМ АМФ

Экспериментальная обработка супернатанта DSM 32846 и DSM 17938 на индуцированных энтероидах:

• DSM 32846 только супернатант

• DSM 32846 супернатант + 20 мкМ АМФ

• DSM 32846 супернатант + 200 мкМ АМФ

• DSM 17938 только супернатант

• DSM 17938 супернатант + 20 мкМ АМФ

• DSM 17938 супернатант + 200 мкМ АМФ

Прежде чем супернатант или другие добавки были готовы к нанесению на энтероиды, pH нейтрализовали и супернатант стерилизовали фильтрованием. рH доводили до 7,0, с помощью 10-30 мкл 10 М раствора гидроксида натрия, и pH измеряли, нанося 2 мкл супернатанта на бумагу для определения pH («Fisher Brand» - № по каталогу 13-640-510, диапазон 6,0-8,0). Супернатант стерилизовали фильтрованием, применяя фильтр 0,22 мкм (фильтры Thermo Scientific Nalgene Rapid Flow 0,22 мкМ, код: 00158).

100 мкл (общий объем) материала для обработки помещали на энтероиды. Инкубация на энтероидах длилась 1 час при 37°C в инкубаторе для культур тканей с 5%-ным CO₂. После инкубации супернатант извлекали и хранили при -20°C до последующего анализа.

Мелатонин детектировали с помощью ELISA (Eagle Biosciences Inc, Amherst, NH, США). Единственный шаг, который выполняли перед тем, как следовать стандартному протоколу, заключался в том, что супернатанты размораживали и позволяли им достичь комнатной температуры (примерно 20-21 градус Цельсия).

Результаты

Кишечные энтероиды человека (HIE) биологически значимы в качестве модели кишечного эпителия in vitro. Как показано на фиг. 4, сам по себе DSM 32846 не оказывает значительного эффекта, но при добавлении АМФ он показывает выраженный эффект на продукцию мелатонина в HIE. Более высокая концентрация АМФ давала еще более высокую продукцию мелатонина. DSM 17938 имеет повышенную продукцию мелатонина по сравнению с контролем, но меньше, чем DSM 32846. DSM 32846, следовательно, представляет собой хороший штамм-кандидат для применения при продукции мелатонина в кишечнике.

Пример 6

5'-нуклеотидазная активность в штаммах Lactobacillus reuteri

Экспериментальные данные, показывающие активность 5'-нуклеотидазы в Lactobacillus reuteri DSM 33198, были получены с помощью способа, описанного выше в примере 2. Результаты представлены на фиг. 5A, где они нормализованы по отношению к активности 5'-нуклеотидазы DSM17938 (активность DSM17938 = 1) из того же эксперимента. Такой же тип нормализации в отношении 5'-нуклеотидазной активности DSM17938 (активность DSM17938 = 1) также был проведен для результатов фиг. 3, и это представлено на фиг. 5B, что позволяет легко сравнить кратность изменения в активности 5'-нуклеотидазы по отношению к DSM17938 для различных бактериальных штаммов.

Пример 7

Отбор штаммов

Новый штамм в вышеприведенном примере 6, т.е. Lactobacillus reuteri DSM 33198, проявляет высокую активность 5'-нуклеотидазы в бактериальном супернатанте. Анализ проводили на супернатанте бактериальной культуры с концентрацией 10⁹ бактерий на мл.

Lactobacillus reuteri DSM 33198 разрабатывали для улучшения свойств. Штамм L. reuteri DSM 33198 модифицировали в результате многоступенчатого процесса отбора, включая повторную процедуру сублимационной сушки, для того чтобы сделать его более толерантным и обеспечить более высокую выживаемость в процессе производства, по сравнению с его нативным изолятом.

Отобрали Lactobacillus reuteri DSM 33198.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> BIOGAIA AB

<120> SELECTION AND USE OF MELATONIN SUPPORTING BACTERIA TO REDUCE

INFANTILE COLIC

<130> 69.139115/02

<150> GB 1905470.9

<151> 2019-04-17

<150> GB 1812079.0

<151> 2018-07-24

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Motif

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> any amino acid

<400> 1

Leu Pro Xaa Thr Gly

1 5

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc1f

<400> 2

ggaactttgg gaaaccatga

20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc1r

<400> 3

cgggcaactt taccatcact

20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc2f

<400> 4

tactcgtgaa aatgccgttg

20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc2r

<400> 5

gtgcccctgt catttcaact

20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc3f

<400> 6

agctttacca aattgaccct ga

22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer LrNuc3r

<400> 7

ttgatattag gcgcatcctt tt

22

<210> 8

<211> 2259

<212> DNA

<213> Lactobacillus reuteri SD112

<400> 8

atgaagaata atagttcaaa atattgttta ttgttaggga cagcgctgtt aggactatat

60

ttccaagcta atagtgttca tgcggatgcg actggtatca cagctaatgg agaaactacc

120

catagcaatg ttactccaat ggttcagact aataaggatg aggcaagtac accgcaaaca

180

actactgatt ggtctgaccc ggccaaatat caaagtgaca ttccagttca gattttagga

240

atcaatgact tgcatggtgg gttagaaacg actggatcag ctacgattgg agataagact

300

tattcgaatg ccggaacagt tgcacgccta gctggtaacc ttgatgcggc ggaggaaagt

360

tttaagaacg ctaatccgac gggaagctca attcgggtag aagccggaga tatggttggg

420

gcttctccag caaattctgc tcttctccaa gacgaatcaa ccatgcatgc tttagacgca

480

atgcattttg aaataggaac tttgggaaac catgagttcg atgaaggttt agctgagtat

540

atgcggattg ttaatggtgg tgaacctact aaacaatata atgaagctga gatggcctat

600

cctcatgtga aaacagggat taatatcatt actgccaatg ttgtaaataa atctgatggt

660

caaatcccat ttggaatgca accatacttg attaaagaaa ttcatactag tgatggtaaa

720

gttgcccgga tcggatttat tgggattgaa actacttccc taccaatttt aaccttatac

780

gataattaca aagattatga tgttttagac gaggctgaaa caattgcaaa atatgatcaa

840

attttacgca aaaaaggtgt taacgcaatt gtagttcttg cccatacagg ggtttcaact

900

gataaagatg gcagcactaa aggtaatgct gttgatatca ttaagaagct ttaccaaatt

960

gaccctgata attctgtcga cctttatatt gctggtcact cccaccaata tgctaatgct

1020

actgttggaa gtgtaaaatt agtgcaagcc atttacacgg gtaaagctta cgatgatatt

1080

atcggttaca tcgatccaac aactaatgat tttgcgccca atagtctcgt ttcacatgtc

1140

tttccggtac tatctgaaaa ggatgcgcct aatatcaaaa cggatgcaaa tgttacagca

1200

attgttgaag atgcgaacaa ccgagtagca ccgattatta acaagaaaat aggggaagct

1260

gctacaacag gcgatattct tggacgactt cataatactc ctactcgtga aaatgccgtt

1320

ggtgaattag ttgtcgatgg tcaattatat gccgctcata aagtaggctt accagctgat

1380

tttgcgatga ctaatacagg gggcgttcgt gcagatctgc atgttaatcc tgatcgttcc

1440

attacatggg ggagtgccca agcagttcaa ccatttggta atattttgcg ggtagttgaa

1500

atgacagggg cacaaatcgt tgaagccttg aatcaacaat acgacgaaga tcaagcttac

1560

tacttacaga tttccgggct acattatact tatactgacc aaaacgatcc taaccaacca

1620

tataaggtcg ttcaagttta tgaccaacat aatcaaccgc ttgatatgaa taagacttac

1680

aatgttgtta ttaatgactt tttagcaggt ggcggagatg gcttttctgc atttaagggt

1740

actaaagttg tcgggattgt tggtcaagat acagacgcgt ttattgacta tattactgat

1800

atgactaatg atggtaaacc aattactgcg ccaacaatga accgtaagat ttacttgact

1860

gctgaacaag tagcgaaggc tgactcagat tcacagttac aaacaggaac taatcagaac

1920

actcaaaacg atgctaattc ccagactgaa ggaaatcagc ttcaagaagt tccgagccaa

1980

ccggtatctc caacagtaac cttgccaaca acagctggtc aacccgccga aactgttaca

2040

ctacatgctc aatctaagca acaaaccgta gctgctaata atcaattaat taatttgacg

2100

cctacatcaa ttaatggcca aaaacaaaaa gcagctgacc agcaagcagc tttaccacaa

2160

actagtaacg atgaagatct tgcattactt cttctcggaa gttcattaat ggcagcaacc

2220

ggattgacaa ttattgatcg caagcgtaaa catgcttaa

2259

<210> 9

<211> 752

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri SD112

<400> 9

Met Lys Asn Asn Ser Ser Lys Tyr Cys Leu Leu Leu Gly Thr Ala Leu

1 5 10 15

Leu Gly Leu Tyr Phe Gln Ala Asn Ser Val His Ala Asp Ala Thr Gly

20 25 30

Ile Thr Ala Asn Gly Glu Thr Thr His Ser Asn Val Thr Pro Met Val

35 40 45

Gln Thr Asn Lys Asp Glu Ala Ser Thr Pro Gln Thr Thr Thr Asp Trp

50 55 60

Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Gln Ser Asp Ile Pro Val Gln Ile Leu Gly

65 70 75 80

Ile Asn Asp Leu His Gly Gly Leu Glu Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile

85 90 95

Gly Asp Lys Thr Tyr Ser Asn Ala Gly Thr Val Ala Arg Leu Ala Gly

100 105 110

Asn Leu Asp Ala Ala Glu Glu Ser Phe Lys Asn Ala Asn Pro Thr Gly

115 120 125

Ser Ser Ile Arg Val Glu Ala Gly Asp Met Val Gly Ala Ser Pro Ala

130 135 140

Asn Ser Ala Leu Leu Gln Asp Glu Ser Thr Met His Ala Leu Asp Ala

145 150 155 160

Met His Phe Glu Ile Gly Thr Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Glu Gly

165 170 175

Leu Ala Glu Tyr Met Arg Ile Val Asn Gly Gly Glu Pro Thr Lys Gln

180 185 190

Tyr Asn Glu Ala Glu Met Ala Tyr Pro His Val Lys Thr Gly Ile Asn

195 200 205

Ile Ile Thr Ala Asn Val Val Asn Lys Ser Asp Gly Gln Ile Pro Phe

210 215 220

Gly Met Gln Pro Tyr Leu Ile Lys Glu Ile His Thr Ser Asp Gly Lys

225 230 235 240

Val Ala Arg Ile Gly Phe Ile Gly Ile Glu Thr Thr Ser Leu Pro Ile

245 250 255

Leu Thr Leu Tyr Asp Asn Tyr Lys Asp Tyr Asp Val Leu Asp Glu Ala

260 265 270

Glu Thr Ile Ala Lys Tyr Asp Gln Ile Leu Arg Lys Lys Gly Val Asn

275 280 285

Ala Ile Val Val Leu Ala His Thr Gly Val Ser Thr Asp Lys Asp Gly

290 295 300

Ser Thr Lys Gly Asn Ala Val Asp Ile Ile Lys Lys Leu Tyr Gln Ile

305 310 315 320

Asp Pro Asp Asn Ser Val Asp Leu Tyr Ile Ala Gly His Ser His Gln

325 330 335

Tyr Ala Asn Ala Thr Val Gly Ser Val Lys Leu Val Gln Ala Ile Tyr

340 345 350

Thr Gly Lys Ala Tyr Asp Asp Ile Ile Gly Tyr Ile Asp Pro Thr Thr

355 360 365

Asn Asp Phe Ala Pro Asn Ser Leu Val Ser His Val Phe Pro Val Leu

370 375 380

Ser Glu Lys Asp Ala Pro Asn Ile Lys Thr Asp Ala Asn Val Thr Ala

385 390 395 400

Ile Val Glu Asp Ala Asn Asn Arg Val Ala Pro Ile Ile Asn Lys Lys

405 410 415

Ile Gly Glu Ala Ala Thr Thr Gly Asp Ile Leu Gly Arg Leu His Asn

420 425 430

Thr Pro Thr Arg Glu Asn Ala Val Gly Glu Leu Val Val Asp Gly Gln

435 440 445

Leu Tyr Ala Ala His Lys Val Gly Leu Pro Ala Asp Phe Ala Met Thr

450 455 460

Asn Thr Gly Gly Val Arg Ala Asp Leu His Val Asn Pro Asp Arg Ser

465 470 475 480

Ile Thr Trp Gly Ser Ala Gln Ala Val Gln Pro Phe Gly Asn Ile Leu

485 490 495

Arg Val Val Glu Met Thr Gly Ala Gln Ile Val Glu Ala Leu Asn Gln

500 505 510

Gln Tyr Asp Glu Asp Gln Ala Tyr Tyr Leu Gln Ile Ser Gly Leu His

515 520 525

Tyr Thr Tyr Thr Asp Gln Asn Asp Pro Asn Gln Pro Tyr Lys Val Val

530 535 540

Gln Val Tyr Asp Gln His Asn Gln Pro Leu Asp Met Asn Lys Thr Tyr

545 550 555 560

Asn Val Val Ile Asn Asp Phe Leu Ala Gly Gly Gly Asp Gly Phe Ser

565 570 575

Ala Phe Lys Gly Thr Lys Val Val Gly Ile Val Gly Gln Asp Thr Asp

580 585 590

Ala Phe Ile Asp Tyr Ile Thr Asp Met Thr Asn Asp Gly Lys Pro Ile

595 600 605

Thr Ala Pro Thr Met Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Thr Ala Glu Gln Val

610 615 620

Ala Lys Ala Asp Ser Asp Ser Gln Leu Gln Thr Gly Thr Asn Gln Asn

625 630 635 640

Thr Gln Asn Asp Ala Asn Ser Gln Thr Glu Gly Asn Gln Leu Gln Glu

645 650 655

Val Pro Ser Gln Pro Val Ser Pro Thr Val Thr Leu Pro Thr Thr Ala

660 665 670

Gly Gln Pro Ala Glu Thr Val Thr Leu His Ala Gln Ser Lys Gln Gln

675 680 685

Thr Val Ala Ala Asn Asn Gln Leu Ile Asn Leu Thr Pro Thr Ser Ile

690 695 700

Asn Gly Gln Lys Gln Lys Ala Ala Asp Gln Gln Ala Ala Leu Pro Gln

705 710 715 720

Thr Ser Asn Asp Glu Asp Leu Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu

725 730 735

Met Ala Ala Thr Gly Leu Thr Ile Ile Asp Arg Lys Arg Lys His Ala

740 745 750

<---

Изобретение относится к штаммам Lactobacillus reuteri DSM 32846, Lactobacillus reuteri DSM 32847, Lactobacillus reuteri DSM 32849, Lactobacillus reuteri DSM 33198, продуцирующим аденозин. Указанные штаммы используют для лечения или профилактики младенческой колики, синдрома раздраженного кишечника (IBS) или нарушений сна у субъекта. Также предложен комбинированный продукт, подходящий для индуцирования продукции аденозина у субъекта, включающий один из указанных штаммов и компонент субстрата, представляющего собой АМФ. Изобретение может быть эффективно использовано для лечения или профилактики младенческой колики, IBS или нарушений сна у субъекта. 8 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 пр.

1. Бактериальный штамм, продуцирующий аденозин, где указанный штамм представляет собой Lactobacillus reuteri DSM 32846.

2. Бактериальный штамм, продуцирующий аденозин, где указанный штамм представляет собой Lactobacillus reuteri DSM 32847.

3. Бактериальный штамм, продуцирующий аденозин, где указанный штамм представляет собой Lactobacillus reuteri DSM 32849.

4. Бактериальный штамм, продуцирующий аденозин, где указанный штамм представляет собой Lactobacillus reuteri DSM 33198.

5. Применение штамма по любому из пп. 1-4 для лечения или профилактики младенческой колики у субъекта.

6. Применение штамма по любому из пп. 1-4 для лечения или профилактики синдрома раздраженного кишечника (IBS) у субъекта.

7. Применение штамма по любому из пп. 1-4 для лечения или профилактики нарушений сна у субъекта.

8. Применение по любому из пп. 5-7, в котором субъект представляет собой младенца в возрасте до 12 месяцев, предпочтительно до 6 или 5 месяцев или предпочтительно до 3 или 4 месяцев и/или в котором субъект находится на грудном вскармливании или кормлении молочной смесью или их комбинацией.

9. Комбинированный продукт, подходящий для индуцирования продукции аденозина у субъекта, включающий:

(i) бактериальный штамм по любому из пп. 1-4 и

(ii) компонент субстрата, представляющий собой АМФ.