Способ получения базальных клеток легкого человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека Российский патент 2024 года по МПК C12N5/00 A61K35/42 A61P11/00 

Область техники

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к базальным клеткам легкого человека и способу их получения.

Предшествующий уровень техники

Базальные клетки легкого человека (чБКЛ) являются тканеспецифичными прогениторными эпителиальными клетками, способными к самообновлению и дифференцировке в специализированные клетки легкого [1]. чБКЛ получают для моделирования заболеваний дыхательных путей, разработки способов in vitro редактирования наследственных заболеваний, а также для возможной в будущем клеточной терапии при восстановлении эпителия дыхательных путей. чБКЛ характеризуются экспрессией маркеров: опухолевого белка 63 (ТР63), кератина 5 (KRT5) и рецептора фактора роста нервов (NGFR (CD271)). чБКЛ могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чИПСК) в несколько этапов дифференцировки: 1) дифференцировка чИПСК в клетки дефинитивной эндодермы (ДЭ); 2) дифференцировка ДЭ в клетки эндодермы передней кишки (ЭПК); 3) дифференцировка ЭПК в NKX2.1+ легочные прогениторы; 4) культивирование NKX2.1+ легочных прогениторов на среде для базальных клеток; 5) выделение популяции чБКЛ. Известные способы получения чБКЛ из чИПСК предполагают дифференцировку в NKX2.1+ легочные прогениторы, образование бронхиальных органоидов, клеточную сортировку по поверхностному маркеру базальных клеток (CD271) и культивирование полученных клеток в форме сфероидов [2-3]. В другом варианте способа получения чБКЛ, NKX2.1+ легочные прогениторы культивируют в среде, содержащей факторы, индуцирующие образование базальных клеток на фидерном слое [4] или без него [5].

За ближайший аналог принят заявка на изобретение «Generation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells» [6], в которой получение чБКЛ осуществляют путем образования из NKX2.1+ легочных прогениторов бронхиальных органоидов с помощью ингибирования сигнального пути WNT и культивирования в 3D матриксе, с последующей клеточной сортировкой по поверхностному маркеру CD271 и культивированием клеток в среде с ингибиторами сигнальных путей TGF-b, BMP и SMAD. NKX2.1+ легочные прогениторы в свою очередь получают последовательной дифференцировкой из чИПСК: 1) дифференцировка чИПСК в клетки ДЭ с применением коммерческого набора STEMdifF™ Definitive Endoderm Kit; 2) получение клеток эндодермы передней кишки (ЭПК) с помощью ингибирования путей BMP и TGFb; 3) получение NKX2.1 +легочных прогениторов с помощью активации путей WNT и BMP.

Недостатком данного способа является стадия образования бронхиальных органоидов, в то время как можно получать чБКЛ напрямую из NKX2.1+ легочных прогениторов согласно ранее опубликованным работам [4-5]. В работе [4], NKX2.1+ легочные прогениторы культивировали в среде для базальных эпителиальных клеток на фидерном слое, состоящем из митотически инактивированных клеток мыши 3T3-J2. Применение фидерного слоя сопряжено с риском контаминации, поскольку фидерный слой может открепляться от культурального пластика во время снятия целевых клеток [7], что недопустимо при дальнейшем клиническом применении [8], а отсутствие этапа обогащения популяции базальных клеток с применением клеточной сортировки на поверхностные маркеры базальных клеток, что описано в работах [4-5] может приводить к неоднородной культуре и появлению дифференцированных клеток.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание способа получения базальных клеток легкого из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в быстром получении чБКЛ из чИПСК, снижении риска контаминации другими культурами клеток и как следствие получении однородной культуры чБКЛ.

Технический результат, достигается за счет того, что способ получения чБКЛ из чИПСК, осуществляется в три основных последовательных этапа, при этом:

на первом этапе осуществляют получение и культивирование популяции клеток NKX2.1+ легочных прогениторов из чИПСК в три стадии:

на первой стадии первого этапа выполняют получение клеток ДЭ из чИПСК, предварительно культивируемых на среде mTESR1, конфлюэнтность которых в день начала дифференцировки должна составлять 60%, и культивацию которых осуществляют в контакте с внеклеточным матриксом в течение 24 часов в присутствии культуральной Среды 1, к которой добавлены рекомбинантный человеческий Активин А и CHIR99021.

Затем осуществляют культивирование с внеклеточным матриксом в течение 48 ч в присутствии культуральной Среды 1, к которой добавляют рекомбинантный человеческий Активин А,

На второй стадии первого этапа выполняют получение клеток ЭПК из ДЭ, путем пассирования клеток ДЭ в соотношении количества клеток для пассирования к количеству клеток ДЭ 1:2 и культивирование ДЭ в контакте с внеклеточным матриксом в течение 72 ч в присутствии культуральной Среды 2, к которой добавлены SB431542 и дорсоморфин, а через 24 ч проводят смену культуральной среды на аналогичную среду без добавления Y-27632.

На третьей стадии первого этапа выполняют получение NKX2.1+ легочных прогениторов из клеток ЭПК путем проведения культивирования клеток ЭПК в контакте с внеклеточным матриксом в течение 7 суток в присутствии культуральной Среды 2, к которой добавлены CHIR99021, ВМР4 и ретиноевая кислота, смену культуральной среды проводят через день в течение последующих 7 суток, ретиноевую кислоту вносят в культуральную среду непосредственно перед сменой культуральной среды.

На втором этапе осуществляют культивирование NKX2.1+ легочных прогениторов в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии культуральной среды для базальных клеток (Среды 3). Продолжительность культивирования NKX2.1+ легочных прогениторов на Среде 3 составляет 7 суток.

На третьем этапе осуществляют выделение и культивирование популяции чБКЛ из клеток, полученных на втором этапе, методом клеточной сортировки по поверхностному маркеру базальных клеток CD271 (NGFR) и затем культивирование выделенных клеток в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии культуральной Среды 3, с добавлением Y-27632, после этого через 24 ч проводят смену среды на Среду 3 без Y-27632.

Оценку однородности полученных культур базальных клеток легкого человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека проводят путем экспрессии основных маркеров базальных клеток опухолевого белка 63 (ТР63) и клеток белка цитоскелета кератина 5 (KRT5).

В частном исполнении способа получения чБКЛ из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека внеклеточный матрикс содержит белковую смесь, секретируемую клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (MATRIGEL™).

В частном исполнении способа получения чБКЛ из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека внеклеточный матрикс содержит витронектин.

Изобретение поясняется следующими фигурами, где:

на фигуре 1 приведены результаты оценки экспрессии маркера базальных клеток CD271 (NGFR) методом проточной цитофлуориметрии, где: А - точечная диаграмма клеток и выделение популяции по размеру и гранулярности клеток; Б - точечная диаграмма окрашивания клеток на маркер CD271 (NGFR);

на фигуре 2, приведены результаты фазово-контрастной микроскопии чБКЛ 1 (А), 4 (Б) и 16 (В) пассажей, полученных из чИПСК пациента с муковисцидозом с мутацией p.F508del/p.F508del в гене CFTR;

на фигуре 3, приведены результаты оценки экспрессии маркеров базальных клеток ТР63 и KRT5 методом иммунофлуоресцентного окрашивания у чБКЛ 5 пассажа, полученных из чИПСК пациента с муковисцидозом с мутацией p.F508del/p.F508del в гене CFTR.

Осуществление изобретения

Получение базальных клеток легкого из чИПСК осуществляется в три последовательных этапа. Для этого на первом этапе в три стадии осуществляют получение NKX2.1 +легочных прогениторов, на втором этапе выполняют культивирование NKX2.1 +легочных прогениторов на среде для базальных клеток, а на третьем этапе проводят получение чБКЛ.

На первом этапе получение NKX2.1+ легочных прогениторов осуществляют в три стадии, включающие в себя получение: клеток ДЭ из чИПСК, клеток ЭПК из ДЭ и прогениторов NKX2.1+ легочных прогениторов из ЭПК, следующим образом:

на первой стадии первого этапа для получения клеток ДЭ из чИПСК, чИПСК предварительно культивируют в 6-луночном планшете (кат. номер 3506, Costar), покрытом рекомбинантным витронектином человека (VTN-N) (кат. номер А14700, Thermo Fisher Scientific), в среде mTESR1 (кат. номер 85850, STEMCELL Technologies) до достижения конфлюэнтности чИПСК 60%, так как при больших значениях конфлюэнтности к концу первой стадии будет формироваться переросший монослой клеток, а при меньших значениях конфлюэнтности дифференцировка чИПСК в ДЭ может проходить менее эффективно. После этого производят смену среды mTESR1 в планшете с чИПСК на Среду 1 (96% RPMI-1640 (кат. номер С330п, ПанЭко), 50× В-27 (кат. номер 17504044, Thermo Fisher Scientific), 100× GlutaMAX (кат. номер 35050061, Thermo Fisher Scientific) и 100× пенициллин-стрептомицин (кат. номер А063, ПанЭко)) с добавлением 5 мкМ CHIR99021 (кат. номер 4423, Tocris Bioscience) и 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А (кат. номер 338-АС-010, R&D Systems) и культивируют чИПСК в течение 24 ч. Затем выполняют культивирование с внеклеточным матриксом в течение 48 ч в присутствии культуральной Среды 1, к которой добавлены 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А. При меньшем времени дифференцировки эффективность образования ДЭ из чИПСК будет снижена, при большем времени дифференцировки будет формироваться переросший монослой клеток. В частном исполнении первой стадии первого этапа как эквивалент VTN-N применяют MATRIGEL™ (кат. номер 354230, Corning).

На второй стадии первого этапа для получения ЭПК из ДЭ производят пассирование клеток ДЭ. Для пассирования лунку(и) с клетками ДЭ трижды промывают раствором DPBS без Ca²⁺ и Mg²⁺, вносят 1 мл раствора Версена (кат. номер Р080п, ПанЭко) и инкубируют 3 мин при комнатной температуре (25°С). Затем удаляют раствор Версена, вносят 1 мл Среды 2 (72% IMDM (кат. номер 21980032, Thermo Fisher Scientific), 24% F12(Ham) (кат. номер 11765054, Thermo Fisher Scientific), 100x B-27 (кат. номер 17504044, Thermo Fisher Scientific), 200× N2 (кат. номер 17502048, Thermo Fisher Scientific), 0,05% бычий сывороточный альбумин (BSA) (кат. номер A8412-100ML, Sigma Aldrich), 0,45 мМ тиоглицерол (кат. номер M6145-25ML, Sigma Aldrich), 100Х GlutaMAX (кат. номер 35050061, Thermo Fisher Scientific), 0,05 мг/мл L-аскорбиновую кислоту (кат. номер A4544-25G, Sigma Aldrich) и 100 мкг/мл примоцин (кат. номер ant-pm-2, InvivoGen) с добавлением 10 мкМ SB431542 (кат. номер 1614, Tocris), 2 мкМ дорсоморфина (кат. номер 3093, Tocris) и 10 мкМ Y-27632 (кат. номер 72302, STEMCELL Technologies) и ресуспендируют клетки до состояния одноклеточной суспензии. После этого переносят суспензию клеток в 6-луночный планшет (кат. номер 3506, Costar), предварительно покрытый раствором VTN-N в DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ (финальная концентрация 5 мкг/мл), в соотношении количество клеток для пассирования к количеству клеток ДЭ 1:2. Через 24 ч проводят смену культуральной среды на аналогичную среду без добавления Y-27632. Культивирование клеток ДЭ в контакте с внеклеточным матриксом осуществляют в течение 72 ч, при меньшем времени дифференцировки эффективность образования ЭПК из ДЭ будет снижена, при большем времени дифференцировки в конце третьей стадии дифференцировки будет формироваться переросший монослой клеток. Смену среды производят каждый день. В частном исполнении второй стадии первого этапа как эквивалент VTN-N применяют MATRIGEL™.

На третьей стадии первого этапа для получения NKX2.1+ легочных прогениторов из клеток ЭПК, проводят культивирование клеток в контакте с внеклеточным матриксом VTN-N в течение 7 суток в присутствии культуральной Среды 2 с добавлением 3 мкМ CHIR99021 (кат. номер 4423, Tocris Bioscience), 10 нг/мл ВМР4 (кат. номер 314-ВР-050, R&D Systems) и 100 нМ ретиноевой кислоты (кат. номер R2625-50MG, Sigma Aldrich). Смену культуральной среды проводят через день в течение последующих 7 суток, ретиноевую кислоту вносят в культуральную среду непосредственно перед сменой культуральной среды. В частном исполнении третьей стадии первого этапа как эквивалент VTN-N применяют MATRIGEL™.

На втором этапе способа осуществляют культивирование NKX2.1 +легочных прогениторов на культуральной посуде, покрытой внеклеточным матриксом VTN-N в присутствии культуральной Среды 3, содержащей: 98,97% PneumaCult™-Ex Plus Medium (кат. номер 05040, STEMCELL Technologies), 1000× гидрокортизон (кат. номер 07925, STEMCELL Technologies), 1 мкМ А83-01 (кат. номер 72022, STEMCELL Technologies), 1 мкМ DMH1 (кат. номер D8946, Sigma Aldrich), 100х пенициллин-стрептомицин и 10 мкМ Y-27632 (кат. номер 72304, STEMCELL Technologies). Продолжительность культивирования NKX2.1 +легочных прогениторов на Среде 3, для наиболее эффективного выделения чБКЛ клеток, подбирают экспериментально для каждой клеточной линии. В частном случае оптимальное время культивирования, подобранное на основании получения чБКЛ из трех линий чИПСК [10-12], составило 7 суток, однако для одной линии [9] чИПСК процент CD271+клеток снижался со временем культивирования на Среде 3 и эффективнее было проводить клеточную сортировку по маркеру CD271 из NKX2.1 +легочных прогениторов. В частном исполнении второго этапа как эквивалент VTN-N применяют MATRIGEL™.

На третьем этапе для выделения популяции чБКЛ и культивирования, NKX2.1 +легочных прогениторов после культивирования на Среде 3 трижды промывают раствором DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺, вносят 1 мл раствора Версена и инкубировали 3-5 мин при 37°С, затем удаляют раствор Версена, вносят 1 мл раствора DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ и ресуспендируют клетки. Затем клеточную суспензию центрифугируют при 150g в течение 5 мин. Осадок ресуспендируют в 3 мл FACS-буфера (DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ с добавлением 1% бычьей фетальной сыворотки (кат. номер 16141079, Thermo Fisher Scientific) и проводят подсчет клеток на автоматическом счетчике клеток Countess II (Thermo Fisher Scientific). Переносят по 0,5×10⁶ клеток в пробирки №№1-2 объемом 1,5 мл. Центрифугируют при 150g в течение 5 мин. Осадки ресуспендируют в 100 мкл FACS-буфера и вносят антитела в соответствии со следующими группами: пробирка №1 - ничего, пробирка №2-5 мкл антитела против CD271 (кат. номер 345106, Bio Legend). Клетки инкубируют 30 мин при комнатной температуре (25°С) в темноте, после чего вносят по 1 мл FACS-буфера в каждую пробирку и центрифугируют при 150 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендируют в 500 мкл FACS-буфера с добавлением 2 мкМ Y-27632. Проводят сортировку клеток на приборе S3e Cell Sorter (Bio-Rad). Перед проведением клеточной сортировки клетки пропускают через фильтр с размером пор 50 мкм. Настраивают прибор на неокрашенных и контрольных клетках: проводят гейтирование по размеру клеток (FSC-A против SSC-A), затем отделяют синглеты (FSC-A против FSC-H) и гейтируют их по уровню флуоресценции (FL против Count) (фиг. 1). Проводят сортировку популяции, экспрессирующей высокий уровень CD271 в режиме «Enrich». В пробирку для отсортированных клеток вносят 4 мл среды с добавлением 1 мкМ Y-27632. Окрашенные клетки до момента сортировки хранят при +4°С в темноте. Суспензии отсортированных клеток центрифугируют при 150g в течение 5 мин. Осадок ресуспендируют в Среде 3 с добавлением Y-27632 и переносят на покрытый VTN-N культуральный планшет. Через 24 4 проводят смену Среды 3 на среду без Y-27632. Микрофотографии чБКЛ представлены на фигуре 2. Смену культуральной среды проводят каждый день. В частном исполнении второго этапа как эквивалент VTN-N применяют MATRIGEL™ .

Для оценки однородности полученные клетки окрашивали на маркеры базальных клеток белка 63 (ТР63) и и клеток белка цитоскелета кератина 5 (KRT5) (фиг. 3). Для иммуноцитохимического окрашивание базальных клеток, клетки фиксировали в холодном 4% растворе формалина (Carl Roth, Германия) в DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ в течение 15 мин при комнатной температуре (25°С). Проводили дважды отмывку DPBS без Са²⁺и Mg²⁺. Затем клетки пермеабилизировали в 0,1% растворе Tween 20 (Merck, Германия) в течение 10 мин при комнатной температуре (25°С), отмывали трижды DPBS без Са²⁺и Mg²⁺ и проводили блокировку в 1% BSA (Sigma Aldrich, США) и 0.1% Tween 20 в DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ в течение 30 мин при комнатной температуре (25°С). После этого вносили растворы первичных антител ТР63 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 703809) и Cytokeratin 5 (Abeam, cat. no. ab52635). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре (25°С). Проводили трижды отмывку DPBS без Са2+и Mg2+. Вносили раствор вторичных антител Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488) (Abeam, cat. no. ab 150077). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре (25°С). Проводили трижды отмывку DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺. Добавляли DAPI (Abeam, США) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре (25°С). Визуализацию окрашенных клеток проводили на автоматизированном имиджере Lionheart FX (BioTek, США). Для количественного определения клеток, которые экспрессируют исследуемые маркеры, полученные изображения анализировали в программном обеспечении CellProfiler 3.0.0 (Broad Institute of MIT and Harvard, США) (12). Для статистической оценки производили фотографирование 15 полей зрения в двух каналах DAPI и GFP. Затем проводили морфометрический анализ, ядра определяли с помощью библиотеки StarDist версии 0.3.0 (13). Измерения средней интенсивности маркеров производили в CellProfiler на основе полученной маски клетки и площади радиусом 15 пикселей вокруг ядра, что принимали за цитоплазму.

По результатам способа в течение 21 суток получили однородную культуру чБКЛ, в которой 100% клеток окрашивается на маркер ТР63 и 90% клеток на маркер KRT5, что быстрее и проще в сранении с ближайщим аналогом, где время получения составляет от 30 суток и более, а способ получения имеет стадию образования бронхиальных органоидов, что сложнее в работе.

Примеры осуществления изобретения

ПРИМЕР 1. Получение базальных клеток легкого из чИПСК:

Первый этап: Получение NKX2.1+ легочных прогениторов.

чИПСК предварительно культивировали в 6-луночном планшете (кат. номер 3506, Costar), покрытом рекомбинантным витронектином человека (VTN-N) (кат. номер А14700, Thermo Fisher Scientific), в среде mTESR1 (кат. номер 85850, STEMCELL Technologies). В день начала дифференцировки конфлюэнтность чИПСК составила 70%. Для дифференцировки в клетки ДЭ производили смену культуральной среды в планшете с чИПСК на Среду 1 (96% RPMI-1640 (кат. номер С330п, ПанЭко), 50× В-27 (кат. номер 17504044, Thermo Fisher Scientific), 100×х GlutaMAX (кат. номер 35050061, Thermo Fisher Scientific) и 100× пенициллин-стрептомицин (кат. номер A063, ПанЭко)) к которой добавлены 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А (кат. номер 338-АС-010, R&D Systems) и 5 мкМ CHIR99021 (кат. номер 4423, Tocris Bioscience) и культивировали в течение 24 ч, с последующим культивированием чИПСК, в течение 48 ч в присутствии культуральной Среды 1, к которой добавлено 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А. Для получения ЭПК из ДЭ производили пассирование клеток ДЭ через 72 ч от начала дифференцировки. А именно, лунку(и) с клетками ДЭ трижды промывали раствором DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ (кат. номер Р060Е, ПанЭко), вносили 1 мл раствора Версена (кат. номер Р080п, ПанЭко) и инкубировали 3 мин при комнатной температуре (25°С). Затем удаляли раствор Версена, вносили 1 мл Среды 2 (75% IMDM (кат. номер 21980032, Thermo Fisher Scientific), 25% F12(Ham) (кат. номер 11765054, Thermo Fisher Scientific), 100× В-27 (кат. номер 17504044, Thermo Fisher Scientific), 200× N2 (кат. номер 17502048, Thermo Fisher Scientific), 0,05% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (кат. номер A8412-100ML, Sigma Aldrich), 0,45 мМ тиоглицерола (кат. номер M6145-25ML, Sigma Aldrich), 100× GlutaMAX (кат. номер 35050061, Thermo Fisher Scientific), 0,05 мг/мл L-аскорбиновой кислоты (кат. номер A4544-25G, Sigma Aldrich) и 100 мкг/мл примоцина (кат. номер ant-pm-2, InvivoGen) с добавлением 10 мкМ SB431542 (кат. номер 1614, Tocris), 2 мкМ дорсоморфина (кат. номер 3093, Tocris) и 10 мкМ Y-27632 (кат. номер 72302, STEMCELL Technologies) и ресуспендировали клетки до состояния одноклеточной суспензии. После этого переносили суспензию клеток в 6-луночный планшет (кат. номер 3506, Costar), предварительно покрытый раствором VTN-N в DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ (финальная концентрация = 5 мкг/мл), в соотношении количество клеток для пассирования к количеству клеток ДЭ 1:2. Через 24 ч проводили смену культуральной среды на аналогичную среду без добавления Y-27632. Дифференцировку в клетки ЭПК проводили в течение 72 ч. Для получения NKX2.1+ легочных прогениторов из ЭПК, проводили культивирование клеток на Среде 2 с добавлением 3 мкМ CHIR99021 (кат. номер 4423, Tocris Bioscience), 10 нг/мл ВМР4 (кат. номер 314-ВР-050, R&D Systems) и 100 нМ ретиноевой кислоты (кат. номер R2625-50MG, Sigma Aldrich). Смену среды проводили через день в течение последующих 7 суток, ретиноевую кислоту вносили в среду непосредственно перед сменой среды.

Второй этап: Культивирования NKX2.1+ легочные прогениторы на среде для базальных клеток.

Для этого NKX2.1+ легочные прогениторы культивировали не менее 7 суток на культуральной посуде, покрытой внеклеточным матриксом, и в присутствии культуральной Среды 3, содержащей: 98,97% PneumaCult™-Ex Plus Medium (кат. номер 05040, STEMCELL Technologies), 1000Х гидрокортизон (кат. номер 07925, STEMCELL Technologies), 1 мкМ А83-01 (кат. номер 72022, STEMCELL Technologies), 1 мкМ DMH1 (кат. номер D8946, Sigma Aldrich), 100Х пенициллин-стрептомицин и 10 мкМ Y-27632 (кат. номер 72304, STEMCELL Technologies). Продолжительность культивирования NKX2.1 +легочных прогениторов на Среде 3, для наиболее эффективного выделения чБКЛ клеток, подбирали экспериментально на основании получения чБКЛ из четырех линий чИПСК [8-11], которое в среднем составило 7 суток.

Третий этап. Выделение популяции чБКЛ и культивирование. Для этого клетки, NKX2.1+легочные прогениторы, после культивирования на Среде 3, трижды промывали раствором DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺, вносили 1 мл раствора Версена и инкубировали 3-5 мин при 37°С, затем удаляли раствор Версена, вносили 1 мл раствора DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ и ресуспендировали клетки. Затем клеточную суспензию центрифугировали при 150g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 3 мл FACS-буфера (DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ с добавлением 1% бычьей фетальной сыворотки (кат. номер 16141079, Thermo Fisher Scientific) и проводили подсчет клеток на автоматическом счетчике клеток Countess II (Thermo Fisher Scientific). Переносили по 0,5×10⁶ клеток в пробирки №№1-2 объемом 1,5 мл. Центрифугировали при 150 g в течение 5 мин. Осадки ресуспендировали в 100 мкл FACS-буфера и вносили антитела в соответствии со следующими группами: пробирка №1 - ничего, пробирка №2-5 мкл антитела против CD271 (кат. номер 345106, Bio Legend). Клетки инкубировали 30 мин при комнатной температуре (25°С) в темноте, после чего вносили по 1 мл FACS-буфера в каждую пробирку и центрифугировали при 150g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 500 мкл FACS-буфера с добавлением 2 мкМ Y-27632. Проводили сортировку клеток на приборе S3e Cell Sorter (Bio-Rad). Перед проведением клеточной сортировки клетки пропускали через фильтр с размером пор 50 мкм. Настраивали прибор на неокрашенных и контрольных клетках: проводили гейтирование по размеру клеток (FSC-A против SSC-A), затем отделяли синглеты (FSC-A против FSC-H) и гейтировали по уровню флуоресценции (FL против Count) (фиг.1). Проводили сортировку популяции, экспрессирующей высокий уровень CD271 в режиме «Enrich». В пробирку для отсортированных клеток вносили 4 мл среды с добавлением 1 мкМ Y-27632. Окрашенные клетки до момента сортировки хранили при +4°С в темноте. Средний процент отсортированных клеток составлял 24,8±12,8% (n=18). Суспензии отсортированных клеток центрифугировали при 150 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в Среде 2 и переносили на покрытый VTN-N культуральный планшет. Через 24 ч проводили смену среды на среду без Y-27632. Микрофотографии чБКЛ представлены на фигуре 2. Смену среды проводили каждый день.

Полученные клетки окрашивали на маркеры базальных клеток (ТР63 и KRT5). Для иммуноцитохимического окрашивание базальных клеток, клетки фиксировали в холодном 4% растворе формалина (Carl Roth, Германия) в DPBS без Са²⁺и Mg²⁺в течение 15 мин при комнатной температуре (25°С). Проводили дважды отмывку DPBS без Са²⁺и Mg²⁺. Затем клетки пермеабилизировали в 0,1% растворе Tween 20 (Merck, Германия) в течение 10 мин при комнатной температуре (25°С), отмывали трижды DPBS без Са²⁺и Mg²⁺ и проводили блокировку в 1% BSA (Sigma Aldrich, США) и 0.1% Tween 20 в DPBS без Са²⁺ и Mg²⁺ в течение 30 мин при комнатной температуре (25°С). После этого вносили растворы первичных антител ТР63 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 703809) и Cytokeratin 5 (Abeam, cat. no. ab52635). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре (25°С). Проводили трижды отмывку DPBS без Са²⁺и Mg²⁺. Вносили раствор вторичных антител Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488) (Abeam, cat. no. ab 150077). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре (25°С). Проводили трижды отмывку DPBS без Са²⁺и Mg²⁺. Добавляли DAPI (Abeam, США) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре (25°С). Визуализацию окрашенных клеток проводили на автоматизированном имиджере Lionheart FX (BioTek, США). Для количественного определения клеток, которые экспрессируют исследуемые маркеры, полученные изображения анализировали в программном обеспечении CellProfiler 3.0.0 (Broad Institute of MIT and Harvard, США) [12]. Для статистической оценки производили фотографирование 15 полей зрения в двух каналах DAPI и GFP. Затем проводили морфометрический анализ, ядра определяли с помощью библиотеки StarDist версии 0.3.0 [13]. Измерения средней интенсивности маркеров производили в CellProfiler на основе полученной маски клетки и площади радиусом 15 пикселей вокруг ядра, что принимали за цитоплазму. Полученные изображение представлены на фиг. 3.

Список литературы

1. Rock J. R. et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - №. 31. C. 12771-12775.

2. Rock J. R. et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - №. 31. - C. 12771-12775.

3. de Carvalho A. L. R. T. et al. Glycogen synthase kinase 3 induces multilineage maturation of human pluripotent stem cell-derived lung progenitors in 3D culture // Development. -019. -. 146. -. 2. - C. dev171652.

4. Djidrovski I. et al. S ARS-CoV-2 infects an upper airway model derived from induced pluripotent stem cells // Stem cells. - 2021. - T. 39. - №. 10. - C. 1310-1321.

5. Wong A. P. et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein // Nature biotechnology. - 2012. - T. 30. - №. 9. - C. 876-882.

6. Заявка на изобретение WO 2021168199 A1 от 26.08.2021 «GENERATION OF AIRWAY BASAL STEM CELLS FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS».

7. Llames S. et al. Feeder layer cell actions and applications // Tissue Engineering Part B: Reviews. - 2015. - T. 21. - №. 4. - C. 345-353.

8. Zhang R. et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells // Nature communications. 2013. T. 4. №. 1. C. 1335.

9. Kondrateva E. et al. Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation // Stem Cell Research. - 2020. - T. 48. - C. 101933.

10. Kondrateva E. et al. Derivation of iPSC line (RCMGi002-A) from dermal fibroblasts of a cystic fibrosis female patient with homozygous F508del mutation // Stem Cell Research. - 2021. - T. 53. - C. 102251.

11. Kondrateva E. et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (RCMGi004-A and-B) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with compound heterozygous F508del/W1282X mutations in CFTR gene // Stem Cell Research. - 2021. - T. 52. - C. 102232.

12. Салихова Д.И. и др. Сравнительный анализ влияния кондиционированных сред, полученных при культивировании нейрональных и глиальных предшественников, на мозжечковые нейроны при глутаматной эксайтотоксичности // Гены и клетки. - 2019. - Т. 14. - №. 4. - С. 46-53.

13. Carpenter АЕ, Jones TR, Lamprecht MR, Clarke С, Kang IH, Friman О, et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 2006; 7.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения базальных клеток легкого человека (чБКЛ) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чИПСК). Изобретение эффективно для быстрого получения чБКЛ из чИПСК без использования фидерного слоя, что позволяет снизить риск контаминации другими клетками и, как следствие, получить однородную культуру чБКЛ. 3 ил., 1 пр.

Способ получения базальных клеток легкого человека (чБКЛ) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (чИПСК), характеризующийся тем, что способ реализуется в три последовательных этапа, при которых:

на первом этапе осуществляют получение NKX2.1+ легочных прогениторов в три последовательные стадии, при этом

на первой стадии первого этапа выполняют получение клеток дефинитивной эндодермы (ДЭ) из чИПСК, которые предварительно были культивированы на среде mTESR1 и конфлюэнтность которых в день начала дифференцировки составляет 60%, путем культивирования чИПСК в контакте с внеклеточным матриксом в течение 24 ч в присутствии культуральной Среды 1, содержащей: 96% RPMI-1640, 50× B-27, 100× GlutaMAX и 100× пенициллин-стрептомицин, к которой добавлены 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А и 5 мкМ CHIR99021, после этого выполняют культивирование с внеклеточным матриксом в течение 48 ч в присутствии культуральной Среды 1, к которой добавлены 100 нг/мл рекомбинантного человеческого Активина А,

на второй стадии первого этапа осуществляют получение клеток эндодермы передней кишки (ЭПК) из ДЭ, при которой выполняют пассирование клеток ДЭ в соотношении количество клеток для пассирования к количеству клеток ДЭ 1:2, а культивирование клеток ДЭ в контакте с внеклеточным матриксом осуществляют в течение 72 ч в присутствии культуральной Среды 2, содержащей: 72% IMDM, 24% F12(Ham), 100× B-27, 200× N2, 0,05% бычий сывороточный альбумин, 0,45 мМ тиоглицерол, 100× GlutaMAX, 0,05 мг/мл L-аскорбиновую кислоту и 100 мкг/мл примоцин, к которой также добавляют 10 мкМ SB431542, 2 мкМ дорсоморфина и 10 мкМ Y-27632, через 24 ч проводят смену культуральной среды на аналогичную среду без добавления Y-27632, при этом дифференцировку в клетки ЭПК проводят в течение 72 ч, а смену среды производят каждый день,

на третьей стадии первого этапа осуществляют получение NKX2.1+ легочных прогениторов из клеток ЭПК, которая включает в себя культивирование клеток ЭПК в контакте с внеклеточным матриксом в течение 7 суток в присутствии культуральной Среды 2, к которой добавляют 3 мкМ CHIR99021, 10 нг/мл BMP4 и 100 нМ ретиноевой кислоты, смену культуральной среды проводят через день в течение последующих 7 суток, ретиноевую кислоту вносят в культуральную среду непосредственно перед сменой культуральной среды,

на втором этапе осуществляют культивирование NKX2.1+ легочных прогениторов на культуральной посуде, покрытой внеклеточным матриксом в присутствии культуральной Среды 3, содержащей: 98,97% PneumaCult™-Ex Plus Medium, 1000× гидрокортизон, 1 мкM A83-01, 1 мкM DMH1, 100× пенициллин-стрептомицин и 10 мкМ Y-27632, при этом продолжительность культивирования NKX2.1+ легочных прогениторов на Среде 3 составляет 7 суток,

на третьем этапе осуществляют выделение и культивирование популяции чБКЛ, для этого проводят клеточную сортировку клеток, полученных на втором этапе, по поверхностному маркеру базальных клеток CD271 (NGFR) и затем культивируют полученные клетки в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии культуральной Среды 3 с добавлением Y-27632, после этого через 24 ч проводят смену среды на Cреду 3 без Y-27632, оценку однородности полученных культур базальных клеток легкого человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека проводят путем экспрессии основных маркеров базальных клеток опухолевого белка 63 (TP63) и клеток белка цитоскелета кератина 5 (KRT5).