Способ моделирования лучевого пульмонита в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61N5/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным и доклиническим исследованиям, и может быть использовано для моделирования изолированных лучевых реакций и поздних осложнений у экспериментальных животных и изучении на этой модели механизмов ее развития и лечения.

На сегодняшний день существуют разные способы моделирования лучевого пульмонита у крыс. Эти способы преимущественно заключаются в облучении на обычных линейных ускорителях в стандартном фракционировании.

Известен способ моделирования пульмонитов введением подопытным крысам блеомицина [Ghebremariam YT, Cooke JP, Gerhart W, Griego C, Brower JB, Doyle-Eisele M, Moeller BC, Zhou Q, Ho L, de Andrade J, Raghu G, Peterson L, Rivera A, Rosen GD. Pleiotropic effect of the proton pump inhibitor esomeprazole leading to suppression of lung inflammation and fibrosis. J Transl Med. 2015 Aug 1; 13:249]. Недостатком данного способа является использование химических агентов для формирования повреждения легочной ткани, с экстраполяцией полученных результатов на лучевой пульмонит. Такой способ позволяет относительно надёжно получить модель повреждений легочной ткани, которое развивается в данном случае по другому механизму, соответственно, прямая экстраполяция результатов исследований была бы некорректна.

Известен способ моделирования пульмонитов в виде культивирования в трехмерной (3D) системе первичных эпителиальных клеток легких [Ghebremariam YT, Cooke JP, Gerhart W, Griego C, Brower JB, Doyle-Eisele M, Moeller BC, Zhou Q, Ho L, de Andrade J, Raghu G, Peterson L, Rivera A, Rosen GD. Pleiotropic effect of the proton pump inhibitor esomeprazole leading to suppression of lung inflammation and fibrosis. J Transl Med. 2015 Aug 1;13:249]. Стандартные колбы T75 покрывали внеклеточным матриксом MaxGel (Sigma) (ECM; экстракт базальной мембраны человека, который обеспечивает тканеподобную микросреду благодаря своему составу из коллагена, фибронектина, ламинина, эластина и других протеогликанов) на 4 ч при 37°С/5%СО₂. Раствор отсасывали перед тем, как дать колбам высохнуть на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем первичные бронхиальные эпителиальные клетки человека (Lonza) суспендировали в среде для роста эпителиальных клеток (BEGM) и высевали в предварительно покрытые трехмерные колбы. Когда клетки достигли 60% слияния, их обрабатывали эзомепразолом или носителем в течение 24 часов перед облучением. Клетки подвергали рентгеновскому облучению путем воздействия непрерывного ионизирующего излучения 6 Грэй (6 Гр) (биологическая система RS-2000; Rad Source Technologies) со скоростью 2 Гр/мин. Затем облученные и контрольные клетки инкубировали при 37°C/5%CO₂ в течение дополнительных 6 ч перед сбором и экстракцией РНК, как описано выше. Этот метод позволяет оценить непосредственное влияние лучевого воздействия на клетки легкого, однако не предоставляет информации о действии системы «легкое» в живом организме при лучевом воздействии.

Целесообразно отметить, что недостатками известных из литературы методов является длительность создания модели, высокая стоимость, недостаточная степень изолированности повреждений органа - мишени. Существенным же недостатком является то, что существующие модели лучевого пульмонита не позволяют добиться максимального приближения развития патологии к клиническому течению заболевания.

Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования лучевого пульмонита [Effects of NF-κB inhibitor on nuclear factor-κB and intercellular adhesion moceule-1 in lung injury associated with radiation of rats]. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 2017], который взят нами в качестве прототипа.

Способ-прототип заключается в облучении крыс на линейном ускорителе с энергией 6 МэВ РОД 8 Гр, до СОД 40 Гр за 5 последовательных дней. Облучению подвергается область грудной клетки не селективно относительно окружающих органов и тканей, что обусловлено размерами первичной мишени и взаиморасположением органов внутри грудной клетки. При этом, прицеливание в первый день осуществляется только по верхним и нижним контурам легочных полей рентгеновского снимка, после чего производится облучение одним полем "сквозным" методом. Повторные облучения проводились с прицеливанием по костным ориентирам. В дальнейшем, осуществлялось динамическое наблюдение за экспериментальными животными, с последующим отбором крыс с развившимися признаками лучевого пульмонита с 20 по 55 день после облучения. В то же время, исследователи отметили значительное количество сопутствующих повреждений спинного мозга и сердца. Таким образом, способ-прототип не позволяет добиться максимального приближения развития патологического процесса к клиническому течению заболевания.

Этот способ позволяет создать модель с высоким выходом лучевых пульмонитов. Однако, нами проведены ряд экспериментов с использованием линейных ускорителей и планирующих систем, показавших, что применение стандартного 3D конформного, IMRT, VMAT оборудования на объектах столь малого размера как крысы, не позволяет исключить лучевого повреждения окружающих органов и тканей, что приводит к искажению результатов за счёт развития коморбидных состояний, что делает данный метод не обеспечивающим изолированность повреждений легких (Фиг.1 и Фиг. 2). Кроме того, способ предполагает многократное применение повторных наркозов для животных, что так же может вносить изменения в состояние экспериментальных животных, подвергает их ненужным страданиям и повторяющемуся стрессу. Также, для его реализации требуется надежная, и, что более важно, повторяемая в течение 5 дней укладка животного.

Итак, несмотря на наличие достаточного количества используемых способов моделирования ЛП, существует настоятельная необходимость поиска новых, менее травматичных и рискованных методов, позволяющих добиться положительных результатов.

Технический результат настоящего изобретения заключается в создании эффективного и безопасного способа моделирования лучевого пульмонита, обеспечивающего максимальное приближение к клиническому течению заболевания, за счет подведения дозы лучевой терапии локально, с минимальным количеством поврежденных окружающих тканей.

Этот результат достигается тем, что в известном способе моделирования лучевого пульмонита у экспериментальных животных, включающем наркотизацию животного, визуализацию плевральных полостей, сердца и спинного мозга с последующим облучением плевральной полости с легкими, согласно изобретению, выполняют фиксацию животного в стереотаксической рамке или на деке стола, а облучение проводят при помощи ионизирующего излучения на установке для стереотаксической лучевой терапии одной фракцией с суммарной очаговой дозе 20 - 25 Гр.

Сущность способа заключается в следующем.

Моделирование лучевого пульмонита in vivo выполняют на мелких экспериментальных животных (крысы). Проводят анестезию животного, после чего при помощи компьютерного томографа или магнитно-резонансного томографа выполняют визуализацию плевральных полостей, легкие, сердца и спинного мозга с получением 3D изображения, затем с использованием планирующих станций формируют области облучения - плевральные полости с легкими и зоны критических структур - сердце, спинной мозг, лучевое повреждение которых необходимо предельно сократить. Фиксируют животное в стереотаксической рамке или на деке стола установки по указаниям планирующе-командной станции с последующим облучением плевральной полости на стереотаксических установках. При этом облучение осуществляют γ-излучением, протонным пучком или фотонами с граничной энергией квантов до 18 МэВ. Кроме того, при создании модели на крысе облучение проводилось одной фракцией в дозе 20-25 Гр, учитывая, что толерантность легочной ткани к ионизирующему излучению ограничена СОД 30Гр стандартного фракционирования. Наблюдение за животными, в зависимости от требуемых результатов, осуществляли: для острых лучевых реакций- до 90 суток, а для поздних осложнений - до 9 месяцев.

Для лучшего понимания приводим описание чертежей.

Фиг. 1 и Фиг. 2 - Попытка планировать область облучения на стандартном линейном ускорителе - избыточное повреждение спинного мозга (SC) и сердца (Heart). Выполнение ограничения по критическим структурам невозможно.

Фиг 3 - Выполнение плана на планирующей станции GammaPlan для установки Leksell Gammaknife.

Таким образом, предлагаемая последовательность действий позволяет сократить время создания модели более чем на 4 суток, что в свою очередь обеспечивает точность облучения и уменьшает токсичность лучевой терапии и наркоза.

Сущность способа поясняется примерами

Для уточнения наиболее подходящих доз облучения нами была проведена серия экспериментов. В качестве животных для создания модели использовали крыс линии «Вистар», 200-250 гр, 15 самцов, 15 самок. Необходимо отметить, что всем животным визуализация плевральных полостей с легкими, сердцем и спинным мозгом была проведена при помощи компьютерно-томографического исследования или магнитно-резонансной томографии.

1. Десять крыс «Вистар» 5 самцов, 5 самок были последовательно наркотизированы и фиксированы. Проведена визуализация плевральных полостей с легкими, сердцем и спинным мозгом на аппарате МРТ. При помощи программного обеспечения «Gamma Plan 11.3» проведено предлучевое планирование. Крыса фиксирована в удерживающем устройстве аппарата Lexell Gamma-Knife (Фиг. 3) после чего подведена доза 20 Гр за 1 сеанс. Крысы обследованы через 25 дней, у 5 самцов и 4 самок выявлены признаки острого лучевого пульмонита, у 1 животного изменений не выявлено. Таким образом, данная доза была признана достаточной для гарантированного создания модели ЛП.

2. Десять крыс «Вистар» 5 самцов, 5 самок были последовательно наркотизированы и фиксированы. Проведена визуализация плевральных полостей с легкими, сердцем и спинным мозгом на аппарате МРТ. При помощи программного обеспечения «Gamma Plan 11.3» проведено предлучевое планирование. Крыса фиксирована в удерживающем устройстве аппарата Lexell Gamma-Knife после чего подведена доза 15 Гр за 1 сеанс. Крысы обследованы через 25 дней, у 3 самцов и 2 самок выявлены признаки острого лучевого пульмонита, у 5 животных изменений не выявлено. Таким образом, доза в 20 Гр была признана недостаточной для гарантированного создания модели лучевого пульмонита.

3. Десять крыс «Вистар» 5 самцов, 5 самок были последовательно наркотизированы и фиксированы. Проведена визуализация плевральных полостей с легкими, сердцем и спинным мозгом на аппарате КТ. При помощи программного обеспечения «Gamma Plan 11.3» проведено предлучевое планирование. Крыса фиксирована в удерживающем устройстве аппарата Lexell Gamma-Knife после чего подведена доза 25 Гр за 1 сеанс. Крысы обследованы через 5 месяцев, у 4 самцов и 4 самок выявлены признаки хронического лучевого пульмонита, у 2 животных изменений не выявлено. Таким образом, данная доза была признана достаточной для гарантированного создания модели ЛП.

4. Десять крыс «Вистар» 5 самцов, 5 самок были последовательно наркотизированы и фиксированы. Проведена визуализация плевральных полостей с легкими, сердцем и спинным мозгом на аппарате КТ. При помощи программного оборудования «Gamma Plan 11.3» проведено предлучевое планирование. Крыса фиксирована в удерживающем устройстве аппарата Lexell Gamma-Knife после чего подведена доза 20 Гр за 1 сеанс. Крысы обследованы через 5 месяцев, у 2 самцов и 2 самок выявлены признаки хронического лучевого пульмонита, у 6 животных изменений не выявлено. Доза в 20 Гр была признана недостаточной для гарантированного создания модели ЛП.

Таким образом, при помощи проведенных экспериментов мы определили, что облучение одной фракцией с суммарной очаговой дозой 20-25 Гр обеспечивает надежное создание модели лучевого пульмонита за один сеанс облучения, снижая при этом воздействие на изучаемый объект лекарственных средств для последовательных наркозов и, не вызывая при этом избыточных негативных последствий для экспериментальных животных, обеспечивает максимальное приближение к клиническому исходу заболевания.

Все это обеспечивает создание высокоэффективной модели острого лучевого пульмонита на крысах со сроками развития с 25 го дня до 90 суток и модели хронического лучевого пульмонита со сроками развития свыше 90 суток для дальнейшего использования при тестировании фармакологических препаратов.

Применение ионизирующего излучения, подведенного при помощи установок для стереотаксической лучевой терапии, использующих фотонное, гамма- или протонное излучение подобных установок для моделирования лучевого повреждения оправдано, и обеспечивает подведение однократного запланированного максимума необходимой дозы с высоким краевым градиентом в орган-мишень.

Наряду с этим к преимуществам использования таких установок для моделирования лучевого пульмонита можно отнести, высокую конформность и развитие патологического процесса по физиологическому пути. Предлагаемый способ технически легко воспроизводим специалистами в данной области.

Способ разработан в отделе лучевых и комбинированных методов лечения «РНЦРХТ им. Ак. А.М. Гранова» МЗ РФ и может быть рекомендован для моделирования лучевого пульмонита.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным и доклиническим исследованиям, и может быть использовано для моделирования лучевого пульмонита у крыс, моделирования изолированных лучевых реакций и поздних осложнений у экспериментальных животных и изучения на этой модели механизмов его развития и лечения. Проводят наркотизацию животного, визуализацию плевральных полостей, сердца и спинного мозга с последующим облучением плевральной полости с легкими, но с минимизацией лучевого повреждения сердца и спинного мозга. При этом выполняют фиксацию животного в стереотаксической рамке или на деке стола, а облучение проводят при помощи ионизирующего излучения на установке Lexell Gamma-Knife одной фракцией с суммарной очаговой дозой 20-25 Гр. Способ обеспечивает создание эффективного и безопасного способа моделирования лучевого пульмонита, обеспечивающего максимальное приближение к клиническому течению заболевания, за счет подведения дозы лучевой терапии локально с минимальным количеством поврежденных окружающих тканей. 3 ил.

Способ моделирования лучевого пульмонита у крыс, включающий наркотизацию животного, визуализацию плевральных полостей, сердца и спинного мозга с последующим облучением плевральной полости с легкими, но с минимизацией лучевого повреждения сердца и спинного мозга, отличающийся тем, что выполняют фиксацию в стереотаксической рамке или на деке стола, а облучение проводят при помощи ионизирующего излучения на установке Lexell Gamma-Knife одной фракцией с суммарной очаговой дозой 20-25 Гр.