Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, способному связываться с вирусами бешенства или с вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к «коктейлю» по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или с вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
Предпосылки создания изобретения
Бешенство представляет собой зоонозное заболевание, вызываемое вирусом бешенства (RABV), то есть, членом рода лиссавирусов, и является ответственным за >55000 смертей в год в развивающихся странах, где передача вируса обычно происходит после укуса инфицированной собаки. В отсутствии лечения, вирус постепенно инфицирует окружающие нейроны и распространяется в центральную нервную систему, что почти неизменно приводит к летальному исходу. Это заболевание может быть предотвращено посредством постконтактной профилактики (PEP), которая заключается во введении инактивированной вакцины против RABV в комбинации с пассивной терапией антителами. При стандартной пассивной терапии антителами, поликлональные иммуноглобулины против вируса бешенства (RIG), полученные от иммунизованного человека (HRIG) или иммунизованных лошадей (ERIG), вводят в пораженный участок (The Journal of Infectious Diseases 2014; 210: 200-8).
Учитывая тот факт, что вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства, не могут быть нейтрализованы после их проникновения в периферические нервы в месте укуса, все профилактические процедуры после укуса, которые действуют за счет нейтрализации вируса, должны быть проведены только на участке укуса. RIG были использованы для нейтрализации вируса в месте укуса еще до проникновения вируса в нервную систему. Очевидно, что наличие большего количества лекарственного средства в месте укуса будет повышать шанс защиты пациента.
Как описано выше, стандартная схема профилактики после укуса бешенного животного включает введение RIG и вакцины. RIG обеспечивают развитие раннего иммунитета против вируса по пассивному механизму, в то время как вакцина обеспечивает более поздний иммунитет против вируса по активному механизму. Любая успешная схема должна поддерживать необходимый баланс (i) RIG, которые будут обеспечивать высокую степень защиты от вируса бешенства на ранней стадии, то есть, сразу (через 72 часа) после укуса животного, но (ii) не будут нейтрализовать вакцину против бешенства (которая также вводится сразу после укуса животного) и, таким образом, будет обеспечиваться защита против вируса бешенства посредством вырабатывания активного иммунитета у пациента на поздней стадии, то есть, вплоть до дня 42 или более.
Данные клинического испытания ERIG, которые представляют собой поликлональную сыворотку против бешенства, полученную от лошадей, то есть, взятую у повторно иммунизованных животных, показали, что эти лекарственные средства могут быть введены человеку в дозе вплоть до 40 МЕ/кг. С другой стороны, HRIG, которые представляют собой поликлональную сыворотку против бешенства, полученную от человека-донора, то есть, взятую у иммунизованных доноров, не могут быть введены в количестве более, чем 20 МЕ/кг, поскольку более высокая доза нейтрализует вакцину, что делает неэффективной саму схему профилактики после укуса (Bull. Wid Hlth Org. 1971, 45, 303-315).
Идеальная схема должна обеспечивать более высокое количество RIG в месте укуса для защиты на ранней стадии, и в то же самое время, вакцина должна обеспечивать защиту на поздней стадии. Различие в дозах между RIG человека и лошадей заключается в том, что введенные человеку лошадиные RIG могут легко распознаваться как чужеродные объекты, что тем самым будет приводить к вырабатыванию иммунного ответа против самого RIG. Таким образом, большое количество лекарственного средства ERIG становится доступным в месте укуса и не остается в организме слишком долго, что позволяет вакцине обеспечивать защиту на поздней стадии. С другой стороны, человеческие RIG не распознаются как чужеродный объект, и, следовательно, иммунная система пациента не взаимодействует с ними, в результате чего HRIG будет циркулировать в кровотоке пациента в течение более длительного периода времени и нейтрализовать вакцину, если ее доза превышает 20 МЕ/кг. Более высокая доза, а именно, 40 МЕ/кг HRIG не будет давать эффекта при такой схеме.
Кроме того, по аналогичной причине наиболее вероятно, что недавно апробированное человеческое моноклональное антитело для проведения схемы профилактики бешенства после укуса было одобрено для его введения в дозе 3,33 МЕ/кг (Продукт под торговым знаком Rabishield®).
Поэтому существует необходимость в получении антител с непродолжительным временем полужизни в кровотоке, таких как не-человеческое или негуманизованное антитело, способное к связыванию и нейтрализации вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства, как части схемы профилактики бешенства после укуса.
Кроме того, эти антитела, полученные из сыворотки, часто имеют различные недостатки, включая ограниченную доступность, вариабельность от партии к партии, высокую стоимость, загрязнение нежелательными агентами, присутствующими в крови, и/или риск побочных реакций. По этим причинам, специалисты Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) приняли решение о необходимости разработки и оценки альтернативных биологических средств для замены RIG. Одна из таких альтернативных стратегий заключается во введении моноклональных антител (mAb), способных нейтрализовать изоляты RABV широкого ряда. Некоторые исследования показали, что RIG и моноклональные антитела направлены против вирусного G-белка, и что антитела против G-белка обеспечивают защиту против вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства. G-белок состоит из трех отдельных антигенных сайтов. Антигенные сайты I, II и III находятся на гликопротеине вируса бешенства, который был определен исходя из антигенного анализа вариантов гликопротеина вируса CVS-l1 с использованием 12 нейтрализующих моноклональных антител (J. gen. Virol. (1983), 64, 843-851). Гликопротеин вируса бешенства (G) образует поверхностные выступы посредством оболочки вирусного липида и является единственным белком, способным индуцировать вирус-нейтрализующее антитело (VNA) и взаимодействовать с этим антителом. Исследования показали, что выделенный G-белок способен защищать животных от бешенства (J. gen. Virol. (1983), 64, 1649-1656; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 81, 7194-7198, November 1984). Антигенные сайты на гликопротеине были исследованы с использованием мутантов, резистентных к нейтрализации моноклональными антителами. Три основных сайта, то есть, сайты I, II и III описаны в литературе.
RIG, по своей структуре, содержат анти-G антитела, направленные против множества эпитопов на G-белке. Моноклональное антитело может связываться только с одним единственным эпитопом на G-белке. Пассивный иммунитет, обеспечивающий продуцирование продукта, который содержит только одно моноклональное антитело, связан с риском того, что мутантный вирус бешенства будет «ускользать» от действия лекарственного средства, если рассматриваемый эпитоп был потерян вследствие мутации. Следовательно, «коктейль» из двух моноклональных антител, направленных против двух отдельных неперекрывающихся эпитопов на G-белке, будет обеспечивать лучшую защиту против мутантов.
В заявке WO2013048130 описано антитело против бешенства, которое связывается с вирусом бешенства. В указанной патентной заявке раскрываются и описываются химерные, гуманизованные или человеческие моноклональные антитела. Для обеспечения высокой степени защиты против бешенства на ранней стадии, такие антитела не могут быть введены в высокой дозе по обсуждаемым выше причинам, относящимся к человеческим RIG.
В соответствии с этим, крайне необходимо разработать препарат моноклонального антитела для лечения бешенства, который может быть получен и может поставляться в больших количествах посредством синтеза культуры и может иметь однородное качество. Такой продукт может быть получен из хорошо охарактеризованных банков клеток, а поэтому, его использование не связано с риском вирусных инфекций и заражением другими случайными агентами. Поскольку этот продукт был получен на основе моноклонального антитела, то абсолютное количество белка, вводимое пациенту в качестве лекарственного средства, будет намного ниже, чем количество лекарственного средства на основе поликлонального RIG и, следовательно, будет давать меньший риск анафилактических реакций.
Таким образом, настоящее изобретение, как описано в настоящей заявке, относится к получению моноклональных антител, способных связываться с двумя отдельными сайтами и нейтрализовать вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства, а также к получению «коктейля» такого препарата, содержащего указанные два моноклональных антитела, смешанные в эквипотентных количествах, для нейтрализации вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу, способному связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Настоящее изобретение также относится к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В соответствии с настоящим изобретением, указанный коктейль может нейтрализовать вирусы бешенства и вирусы, родственные вирусам бешенства, которые происходят от животных таких видов, как летучие мышы, собаки, коровы, мангусты, скунсы и волки, и, таким образом, может быть эффективным при лечении пациента, который может быть инфицирован вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и происходящими от животных различных видов. Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинации мышиного моноклонального антитела или коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител и вакцины против бешенства для использования в целях постконтактной профилактики (PEP) от заражения вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
Краткое описание чертежа
На фигуре 1 показан линейный график зависимости средней концентрации RVNA от времени после введения коктейля mAb А и mAb B+вакцины и Imogam® + вакцины пациентам с укусом животного, предположительно, инфицированного вирусом бешенства. Смесь была введена в дозе 40 МЕ/кг, а Imogam® (HRIG) был введен в апробированной дозе 20 МЕ/кг. Через 14 дней, коктейль согласно изобретению сохранял более высокие средние титры RVNA по сравнению с HRIG.
Перечень сокращений, используемых в настоящем описании:
Аббревиатуры аминокислот, используемые в настоящей заявке, представлены в нижеследующей таблице:
(3-буквенная)
(1-буквенная)
Другие аббревиатуры, используемые в настоящей заявке:
ABV: Вирус австралийской летучей мыши
ВНК: Фибробласты почек детеныша хомячка
CDRH1: Комплементарность-определяющая область 1 тяжелой цепи
CDRH2: Комплементарность-определяющая область 2 тяжелой цепи
CDRH3: Комплементарность-определяющая область область 3 тяжелой цепи
CDRL1: Комплементарность-определяющая область 1 легкой цепи CDRL2: Комплементарность-определяющая область 2 легкой цепи CDRL3: Комплементарность-определяющая область 3 легкой цепи
СНО: Яичник китайского хомячка
CSO: Яичник Cynoglossus Semilaevis
CVS: Штамм вируса для контрольного заражения
DP: Лекарственный продукт
DS: Лекарственное вещество
EBLV: Лиссавирус европейской летучей мыши
ERIG: Иммуноглобулины против лошадиного бешенства
FAVN: Нейтрализация вируса флуоресцентным антителом
FFU: Единица, образующая Флуоресцентный сигнал
FITC: Флуоресцеин-изотиоцианат
НС: Тяжелая цепь
HCMV: Вариабельная область тяжелой цепи
HEK: Почки эмбриона человека
HeLa: Клетки Генриэтта-Лакса
HRIG: Иммуноглобулины против вируса бешенства человека
LC: Легкая цепь
LCVR: Вариабельная область легкой цепи
mAb A: Моноклональное антитело A
mAb В: Моноклональное антитело В
MCB: Банк клеток Master
Клетки NA: Клетки нейробластомы
PBS: Забуференный фосфатом физиологический раствор
PEP: Постконтактная профилактика
RABV: Вирус бешенства
RFFIT: Быстрый анализ на ингибирование очага поражения с использованием флуоресцентного антитела
RIG: Иммуноглобулины против вируса бешенства
RVNA: Антитело, нейтрализующее вирус бешенства
SRIG: Стандартный иммуноглобулин против вируса бешенства
SV: Вирус Стрит
WCB: Рабочий банк клеток
Список последовательностей, используемых в настоящем описании:
SEQ ID NO. 1: SSWMH (CDRH1 mAb A)
SEQ ID NO. 2: QTHPNSGYTNYNEKFKG (CDRH2 mAb A)
SEQ ID NO. 3: ESGDGPHWYFDV (CDRH3 mAb A)
SEQ ID NO. 4: KASQDVSTAVA (CDRL1 mAb A)
SEQ ID NO. 5: SASYRYT (CDRL2 mAb A)
SEQ ID NO. 6: QQHYSSPHT (CDRL3 mAb A)
SEQ ID NO. 7:
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKTSGYAFTSSWMHWAKQRPGQGLEWIGQTHPNSGYTNYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARESGDGPHWYFDVWGAGTAVTVSS (HCVR mAb A)
SEQ ID NO. 8:
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSSPHTFGGGTKLETK (LCVR mAb A)
SEQ ID NO. 9:
QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKTSGYAFTSSWMHWAKQRPGQGLEWIGQTHPNSGYTNYNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLTSEDSAVYYCARESGDGPHWYFDVWGAGTAVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (HC mAb A)
SEQ ID NO. 10:
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSSPHTFGGGTKLETKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (LC mAb A)
SEQ ID NO. 11:
QVQLKESGPGLLAPSQSLSITCTVSGFSLTGHGVNWVRQPPGKGLEWLGIIWADGTTNYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTASYYCAREGDISGYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK (HC mAb B)
SEQ ID NO. 12:
DVQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRPSQDINNYLSWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (LC mAb B).
Определения
Используемый здесь термин «коктейль» означает смесь по меньшей мере двух моноклональных антител как двух независимых активных лекарственных веществ. Коктейль согласно изобретению предпочтительно содержит смесь mAh a и mAh B. Предпочтительно указанный коктейль получают в буфере для приготовления композиций. Коктейль получают путем смешивания терапевтических количеств, предпочтительно, эквипотентных количеств двух активных лекарственных средств, а именно, моноклональных антител в буфере для приготовления композиций. И наконец, его приготавливают вместе с другим(и) подходящим(и) фармацевтическим(и) наполнителем(ями) для получения стабильной фармацевтической композиции моноклональных антител против бешенства, которые могут быть использованы для терапии или лечения.
Используемый здесь термин «PEP» или «постконтактная профилактика» включает следующие стадии, где:
1. Все раны от укусов, царапины и места инфицирования RABV должны обработаны как можно быстрее после контакта с животным; при этом необходима тщательная промывка и обработка раны в течение приблизительно 15 минут мылом или детергентом и большим количеством воды. Если это возможно, то на рану должен быть нанесен йод-содержащий препарат или аналогичный вирицидный препарат для местного применения.
2. Ряд инъекций вакцины против бешенства следует вводить сразу после инфицирования как часть активного компонента иммунизации PEP.
3. RIG следует вводить для лечения заболеваний тяжелой категории III как часть компонента пассивной иммунизации PEP.
Вакцина против бешенства согласно изобретению может представлять собой любую вакцину против бешенства, известную специалистам в данной области. RIG согласно изобретению может включать мышиное моноклональное антитело или коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител.
Используемый здесь термин «mAb А» означает моноклональное антитело, которое может связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Моноклональное антитело mAb А согласно изобретению включает область CDRH1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 1; область CDRH2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 2; область CDRH3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3, область CDRL1, содержащиую полипептид SEQ ID NO: 4; область CDRL2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 5; и Область CDRL3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 6. Область HCVR и LCVR mAb А согласно изобретению представляют собой полипептид SEQ ID NO: 7, и полипептид SEQ ID NO: 8, соответственно. Кроме того, тяжелая цепь и легкая цепь mAb А согласно изобретению представляют собой полипептид SEQ ID NO: 9, и полипептид SEQ ID NO: 10, соответственно. Предпочтительно, mAb А согласно изобретению представляет собой мышиное моноклональное антитело. В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к mAb А, содержащему константную область IgG1, а предпочтительно, мышиного IgG1. Это антитело связывается с сайтом II на G-белке оболочки вируса бешенства.
Используемый здесь термин «mAb В» означает моноклональное антитело, которое может связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Моноклональное антитело mAb В согласно изобретению, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь mAb В согласно изобретению, представляет собой полипептид SEQ ID NO: 11, и полипептид SEQ ID NO: 12, соответственно. Предпочтительно, mAb В согласно изобретению представляет собой мышиное моноклональное антитело. В одном из своих аспектов, настоящее изобретение относится к mAb B, содержащему константную область IgG2b, а предпочтительно мышиного IgG2b. Это антитело связывается с сайтом III на G-белке оболочки вируса бешенства.
Используемый здесь термин «антитело» включает полноразмерные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (то есть, антигенсвязывающую часть), или их отдельные цепи. Термин «антитело» означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой здесь как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь остоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой здесь как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH И VL могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые комплементарность-определяющими областями (CDR), перемежающимися с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. В предпочтительных аспектах изобретения, антитело согласно изобретению представляет собой мышиное антитело.
Используемые здесь термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» означают препарат молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела обладает одной специфичностью связывания и аффинностью с конкретным эпитопом.
Термин «фармацевтическая композиция» означает препараты, полученные в форме, обеспечивающей абсолютно эффективную биологическую активность активных ингредиентов. Термины «фармацевтический препарат» или «фармацевтическая композиция» или «композиция» могут быть использованы здесь как синонимы. Фармацевтически приемлемым носителем или наполнителями являются носители или наполнители, которые могут быть надежно введены млекопитающему для обеспечения эффективной дозы применяемого активного ингредиента.
Термин «наполнитель» означает агент, который может быть добавлен к композиции для стабилизации активного лекарственного вещества в готовой форме для регуляции и поддержания осмомоляльности и рН фармацевтических препаратов. Примеры обычно используемых наполнителей включают, но не ограничиваются ими, сахара, полиолы, аминокислоты, поверхностно-активные вещества и полимеры. Фармацевтически приемлемыми наполнителями являются наполнители, которые могут быть надежно введены млекопитающему для обеспечения эффективной дозы применяемого активного ингредиента.
В контексте настоящего изобретения, термин «терапевтическое количество» или «эффективное количество» антитела, если он относится к фармакологии, означает количество, эффективное для профилактики или лечения заболевания, для лечения которого антитело является эффективным.
Термин «эквипотентное количество» в соответствии с настоящим изобретением означает количество каждого антитела, которое имеет такую же активность, как и другое антитело или другие антитела, присутствующие в препарате-коктейле. Активность антитела согласно изобретению может быть выражена в Международных единицах. Активность антител, нейтрализующих вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства, определяют методом RFFIT по сравнению с Международным стандартом активности иммуноглобулина против бешенства у человека в соответствии с критериями ВОЗ (RAI) или по сравнению с апробированным внутренним эталонным стандартом по отношению к указанному Международному стандарту.
Термины «пациент» и «индивидуум» используются здесь как синонимы в своем общепринятом смысле и относятся к живому организму, страдающему состоянием или предрасположенному к развитию состояния, которое может излечено или предотвращено путем введения композиции согласно изобретению, и включают животных. Термин «животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних животных, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних птиц, диких птиц и дичь, таких как куры, индейки и другие птицы семейства куриных, утки и гуси; и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, обезьяны, шимпанзе и другие человекообразные обезьяны и обезьяны других видов. Этот термин не относится к конкретному возрасту. Таким образом, интерес представляют взрослые, ювенильные и новорожденные особи.
Используемый здесь термин «вирус бешенства» включает вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства. В соответствии с настоящим изобретением, мышиные антитела, которые могут связываться с сайтом II или с сайтом III G-белка любого вируса, могут быть использованы для лечения заболевания, при котором активность указанного вируса является опасной.
Используемый здесь термин «контакт» включает укусы, царапины и облизывание животным, зараженным бешенством.
Используемый здесь термин «Imogam®» представляет собой апробированный HRIG, имеющийся на фармацевтическом рынке. Это средство известно специалистам в данной области.
Варианты осуществления изобретения
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к мышиному моноклональному антителу для PEP-профилактики после инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител для PEP-профилактики после инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или к коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител, которые могут быть использованы в более высокой дозе, чем апробированная доза HRIG или человеческих моноклональных антител или гуманизованных моноклональных антител. В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или к коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител, которые могут быть использованы в дозе более, чем 20 МЕ/кг. В своем более предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или к коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител, которые могут быть использованы в дозе от 20 МЕ/кг до 100 МЕ/кг.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или к коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител для PEP-профилактики инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, где такое антитело или коктейль обеспечивают активную иммунизацию для вырабатывания и поддержания эффективного иммунного ответа.
В одном из своеих вариантов, настоящее изобретение относится к комбинации мышиного моноклонального антитела и вакцины против бешенства для PEP-профилактики инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к комбинации коктейля по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител и вакцины против бешенства для PEP-профилактики инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к применению мышиного моноклонального антитела для PEP-профилактики инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к применению коктейля по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител для PEP-профилактики инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, способному связываться с вирусами бешенства или с вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему последовательность моноклонального антитела.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему область CDRH1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 1, область CDRH2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 2, и область CDRH3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему область CDRL1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 4, область CDRL2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 5, и область CDRL3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 6.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему:
(а) CDRH1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 1;
(b) CDRH2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 2;
(c) CDRH3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3;
(d) CDRL1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 4;
(e) CDRL2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 5; и
(f) CDRL3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 6.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему HCVR, содержащую полипептид SEQ ID NO: 7.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему LCVR, содержащую полипептид SEQ ID NO: 8.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему: (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую полипептид SEQ ID NO: 7, и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую полипептид SEQ ID NO: 8.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 9.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 10.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему: (а) тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 9, и (b) легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 10.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 11.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к к моноклональному антителу, включающему легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 12.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, включающему: (а) тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 11, и (b) легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 12.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В своем более предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к коктейлю из двух моноклональных антител mAb А и mAb B.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий последовательность моноклонального антитела.
В одном своем варианте, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной полинуклеотидом, кодирующим последовательность моноклонального антитела.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу получения моноклонального антитела согласно изобретению путем культивирования клеточной линии.
В своем дополнительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В своем более предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, где одно из моноклональных антител включает область CDRH1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 1, область CDRH2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 2, и область CDRH3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3 и/или область CDRL1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 4, область CDRL2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 5, и область CDRL3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 6.
В своем дополнительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, где одно из моноклональных антител включает HCVR, содержащую полипептид SEQ ID NO: 7, и/или включает LCVR, содержащую полипептид SEQ ID NO: 8.
В своем дополнительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, где одно из моноклональных антител включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 9, и/или легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 10.
В одном из своих предпочтительных вариантов, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, где одно из моноклональных антител включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 11, и/или легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 12.
В своем предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, где одно антитело включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 9, а второе антитело включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 11, и/или одно антитело включает легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 10, а второе антитело включает легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 12.
В другом варианте осуществления изобретения, композиция согласно изобретению содержит коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител и фармацевтических наполнителей. Коктейль согласно изобретению является таким, как он описан в вышеприведенных вариантах изобретения.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу получения антитела, заявленного по любому из предшествующих пунктов, с применением способа культивирования клеток, включающего:
i) культивирование клеток-хозяев, экспрессирующих моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы; и
ii) выделение и получение моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, экспрессируемые в указанной клетке-хозяине.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу очистки антитела, заявленного по любому из предшествующих пунктов, с применением подходящего метода хроматографии или очистки.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к набору, содержащему моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В одном из своих предпочтительных вариантов, настоящее изобретение относится к набору, содержащему коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу диагностики бешенства с использованием моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а предпочтительно, с использованием коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения и профилактики бешенства с использованием моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а предпочтительно, с использованием коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу детектирования вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства, с использованием моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а предпочтительно, с использованием коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы.
Подробное описание изобретения
Как описано выше, бешенство является одним из наиболее опасных заболеваний для человека, которое приводит к летальному исходу, если его не лечить вовремя. Схема постконтактной профилактики (PEP) предпочтительно включает два компонента, одним из которых является вырабатывание активного иммунитета, а другим, вырабатывание пассивного иммунитета. Активный иммунитет вырабатывается вакциной, которая действует посредством активации иммунной системы пациента/индивидуума и генерирует иммунитет против рассматриваемого вируса с задержкой, то есть, только на седьмой день или через семь дней после вакцинации. Пассивный иммунитет обеспечивается уже имеющимися антителами, такими как поликлональные антитела (HRIG, ERIG и т.п.), моноклональные антитела или их смесь, которые обеспечивают противовирусную защиту непосредственно после инъекции пациенту/индивидууму. Поскольку пассивная иммунизация несет значительный риск нейтрализации активной иммунизации, затрудняет PEP, и представляет угрозу для жизни пациента, то правильно сбалансированная доза для пассивной иммунизации и тип пассивной иммунизации в отношении времени полужизни в кровотоке пациента является важным фактором для обеспечения достаточного количества и типа нейтрализующих антител для пассивной иммунизации, которая обеспечивает защиту/иммунитет на ранней стадии, и в то же время позволяет вакцине (для активной иммунизация) постоянно осуществлять свои функции вместе с образованием непрерывного окна иммунной защиты у пациента. До сих пор, пассивная иммунизация в значительной степени обеспечивалась обычными продуктами, а именно, HRIG и ERIG, которые используются в дозе 20 МЕ/кг И 40 МЕ/кг, соответственно. HRIG и ERIG, как описано выше, являются небезопасными из-за потенциального риска переноса патогенов. Попытки разработки более безопасных продуктов в качестве замены в виде моноклональных гуманизованных/человеческих антител привели к получению продуктов, способных обеспечить только очень низкую активность антител на ранней стадии пассивной иммунизации, поскольку при более высоких дозах, они приводили к нейтрализации активной иммунизации. Таким образом, существует потребность в получении продукта для пассивной иммунизации, который был бы более безопасным, чем обычные продукты, а также обеспечивал бы сравнимую активность.
Настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител в качестве пассивной иммунизации PEP после инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, вместе с вакциной в качестве компонента для активной иммунизации. Мышиное моноклональное антитело или коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител согласно изобретению могут быть введены в более высокой дозе, чем апробированная доза HRIG или человеческих моноклональных антител или гуманизованных моноклональных антител без значительной нейтрализации активной иммунизации, обеспечиваемой вакциной против вируса бешенства, вводимой как часть схемы PEP. Мышиное моноклональное антитело или коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител согласно изобретению могут быть введены в дозе более, чем 20 МЕ/кг, а предпочтительно в дозе от 20 МЕ/кг до 100 МЕ/кг. Антитела или коктейль согласно изобретению не позволяют значительно нейтрализовать активную иммунизацию, обеспечиваемую вакциной против бешенства, вводимой как часть схемы PEP в дозе более, чем 20 МЕ/кг, а предпочтительно в дозе от 20 МЕ/кг до 100 МЕ/кг. Таким образом, мышиное моноклональное антитело или коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител согласно изобретению для PEP позволяет обеспечивать активную иммунизацию и поддерживать эффективный иммунный ответ против вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства. Вакцина согласно изобретению представляет собой вакцину против бешенства, известную специалистам в данной области. Настоящее изобретение относится к мышиному моноклональному антителу или коктейлю по меньшей мере из двух мышиных моноклональных антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы для PEP-профилактики заражения вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
Моноклональные антитела mAb A и mAb B:
Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, содержит HCVR, включающую область CDRH1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 1; область CDRH2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 2; и область CDRH3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 3. Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению содержит LCVR, включающую CDRL1, содержащую полипептид SEQ ID NO: 4, область CDRL2, содержащую полипептид SEQ ID NO: 5, и область CDRL3, содержащую полипептид SEQ ID NO: 6. Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, содержит HCVR, содержащую полипептид SEQ ID NO: 7.
Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, содержит LCVR, включающую полипептид SEQ ID NO: 8.
Моноклональное антитело, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 9. Моноклональное антитело, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, включает легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 10.
Моноклональное антитело, содержащее полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 9 и 10 тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, обозначено здесь как mAb A. mAb A содержит аминокислотные последовательности HCVR И LCVR, представленные в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Кроме того, mAb A содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3, представленные в SEQ ID NO.1, 2 и 3, соответственно. Кроме того, mAb A содержит аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.
Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, включает тяжелую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 11.
Моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, включает легкую цепь, содержащую полипептид SEQ ID NO: 12.
Моноклональное антитело, содержащее полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 11 и 12 тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, обозначено здесь как mAb В.
Предпочтительно, mAb А и mAb B представляют собой мышиные антитела согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к коктейлю из двух или более моноклональных антител. Предпочтительно, настоящее изобретение относится к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител, то есть, mAb А и mAb B, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Предпочтительно, коктейль содержит эквипотентные количества антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы. Одно из двух антител согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело, содержащее аминокислотные последовательности HCVR И LCVR, представленные в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Второе моноклональное антитело согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело, содержащее аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, представленные в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно.
Предпочтительно, коктейль согласно изобретению содержит одно моноклональное антитело, имеющее тяжелую цепь и легкую цепь, содержащие полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, и второе моноклональное антитело, имеющее тяжелую цепь и легкую цепь, содержащие полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно.
Моноклональные антитела для получения коктейля выбирают исходя из таких критериев, как специфичность связывания, спектр нейтрализации лиссавирусов, биологическая активность, нейтрализующая активность и т.п. и промышленная применимость. Различные штаммы лиссавируса выделяют у животных конкретных видов в различных географических регионах. Так, например, были включены RABV (генотипа 1) собак из Азии (Индии, Филиппин, Таиланда и т.п.), Африки (Северной Африки, стран Африки к югу от Сахары и т.п.) и стран Нового Света, а также мангустов из Южной Африки.
В первую очередь были включены RABV (генотипа 1) собак из Азии (Индии, Филиппин, Таиланда и т.п.), Африки (Северной Африки, стран Африки к югу от Сахары и т.п.) и стран Нового Света, а также мангустов из Южной Африки. Кроме того, нейтрализующая способность антител была также протестирована против вирусов, родственных вирусам бешенства, а именно, EBLV-1, -2, (генотипа 5, 6), ABLV (генотипа 7), вируса Дювенхейга (генотипа 4), иркутского вируса, вируса Кхуань и вируса Араван.
Нейтрализацию вируса проводили с использованием вирусов бешенства и вирусов, родственных вирусам бешенства, таких как CVS 11, SAD B19, PV, Kelev, EBLV1, EBLV2, ABV, вируса Дювенхейга, иркутского вируса, вируса Араван и вируса Кхуань. Нейтрализацию вируса проводили с использованием изолятов вирусов бешенства и вирусов, родственных вирусам бешенства, выделенных у европейской лисицы; собаки, обитающей в Турции; собаки, обитающей в Эфиопии; собаки, обитающей в Индии; собаки, обитающей в Мексике; волка, обитающего в районе города Сараево; рыси, обитающей в США; восточноевропейской лисицы; полярной лисицы; собаки, обитающей в Азербайджане; собаки, обитающей в Непале; енота, обитающего на юго-востоке США; серой лисицы, обитающей в Техасе, полярной лисицы из Аляски; скунса, в штате Южная Каролина, США; и скунса, обитающего в странах Центральной Америки.
Для исследования нейтрализации широкого спектра штаммов лиссавирусов, как было упомянуто в примерах, приведенных ниже, были проведены анализы путем проведения быстрого теста на ингибирование в очаге заражения с использованием флуоресцентного антитела (RFFIT) или теста на нейтрализацию вируса с использованием флуоресцентного антитела (FAVN).
Антитела продуцировали в экспрессионной системе, которая может содержать экспрессионный вектор и клеточную линию хозяина. В настоящем изобретении может быть использован любой экспрессионный вектор, известный специалистам, и выбор экспрессионных векторов зависит от природы выбранной клетки-хозяина. Введение вектора в клетки-хозяева может быть осуществлено, без какого-либо ограничения, путем трансфекции фосфатом кальция, инфицирования вирусом, трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекции липофектамином или электропорации, и специалист в данной области может выбрать способ введения, подходящий для используемого экспрессионного вектора и используемой клетки-хозяина. Вектор содержит все необходимые элементы, требуемые для экспрессии антитела (антител). Предпочтительно, вектор содержит один или более селективных маркеров, без ограничеий, и может быть также использован вектор, не содержащий селективного маркера.
Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит экспрессионный вектор, трансформированный в клетку-хозяина для получения моноклонального антитела согласно изобретению. В настоящем изобретении, клетка-хозяин может содержать клетки млекопитающих, растений, насекомых, грибов или бактерий, но не ограничивается ими. Клетка млекопитающего может быть выбрана из клеток, которыми являются, но не ограничиваются ими, клетки СНО, клетки F2N, клетки CSO, клетки ВНК, клетки меланомы Бауэса, клетки HeLa, клетки 911, клетки AT1080, клетки А549, клетки НЕК 293 и клетки HEK293T. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для получения антител и их коктейля согласно изобретению. Предпочтительной клеткой-хозяином, используемой для получения антител согласно изобретению, является клетка-хозяин, происходящая от SP2/0.
Специалист в данной области может также использовать другую экспрессионную систему, которая содержит гибридные клетки, где одну клетку-хозяина, содержащую нуклеотидные последовательности, экспрессирующие аминокислотные последовательности моноклональных антител согласно изобретению, подвергают слиянию с другой клеткой-хозяином для получения экспрессионной системы. Способ получения антител, способных связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы согласно изобретению, включает, главным образом, i) культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы; и ii) выделение и получение моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, и экспрессируемого в указанной клетке-хозяине.
Культивирование клетки-хозяина, экспрессирующей моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, включает предпочтительно продуцирование моноклонального антитела способом культивирования клеток Sp2/0 в подходящих средах, известных специалистам. Экспрессия моноклонального антитела происходит по конститутивному механизму и секретируется клетками в растворимой форме.
Выделение и получение моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, экспрессируемые в указанной клетке-хозяине, включают, главным образом, осветление клеток, аффинную хроматографию в комбинации с другими подходящими методами хроматографии и/или методами фильтрации с получением очищенного основного лекарственного продукта, а именно, представляющего интерес моноклонального антитела. Очищенное моноклональное антитело или его препарат в виде коктейля тестируют на нейтрализацию различных штаммов лиссавируса.
Настоящее изобретение также относится к стабильной фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело, способное связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а предпочтительно к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител и фармацевтически приемлемого носителя или наполнителя. Предпочтительными наполнителями являются буфер, соль и поверхностно-активное вещество. Подходящие наполнители для приготовления и получения конечного основного лекарственного продукта могут быть выбраны специалистом в данной области. Фармацевтическая композиция согласно изобретению обладает терапевтической эффективностью моноклонального антитела или коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител. Указанная терапевтическая эффективность составляет в пределах от 1 МЕ/мл до 5000 МЕ/мл, а предпочтительно от 100 МЕ/мл до 3000 МЕ/мл. Терапевтическая эффективность согласно изобретению составляет каждое целое число и дробное число в указанных интервалах, то есть, от 1 МЕ/мл до 5000 МЕ/мл. Так, например, указанный интервал включает 10 МЕ/мл, 25 МЕ/мл, 50 МЕ/мл, 100 МЕ/мл, 150 МЕ/мл, 200 МЕ/мл, 300 МЕ/мл, 400 МЕ/мл, 500 МЕ/мл, 600 МЕ/мл, 700 МЕ/мл, 800 МЕ/мл, 900 МЕ/мл, 1000 МЕ/мл, 1200 МЕ/мл, 2000 МЕ/мл, 3000 МЕ/мл, 4000 МЕ/мл и 5000 МЕ/мл. Коктейли антител согласно изобретению могут обладать терапевтической эффективностью каждого моноклонального антитела в описанном терапевтическом интервале. Предпочтительно, коктейль антител включает терапевтическое количество, предпочтительно эквипотентное количество каждого моноклонального антитела в описанном терапевтическом интервале. Предпочтительная терапевтическая эффективность антитела согласно изобретению составляет от 100 МЕ/мл до 3000 МЕ/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения, предпочтительная терапевтическая эффективность коктейля согласно изобретению составляет 400 МЕ/мл -1500 МЕ/мл. Более предпочтительно, терапевтическая эффективность антитела согласно изобретению составляет 150 МЕ/мл или 300 МЕ/мл или 600 МЕ/мл. Более предпочтительно, терапевтическая эффективность коктейля согласно изобретению составляет 300 МЕ/мл или 600 МЕ/мл или 1200 МЕ/мл. Профилактическая и терапевтическая композиция согласно изобретению является стерильной и стабильной в условиях ее получения и хранения. Она может быть получена в виде раствора, и подходящий фармацевтически приемлемый наполнитель может быть добавлен и/или смешан до или во время доставки для получения унифицированной лекарственной формы для инъекций. Альтернативно, композиция согласно изобретению может быть получена в лиофилизованной форме, которая может быть разведена в подходящем фармацевтически приемлемом наполнителе до или во время доставки. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительным способом приготовления является лиофилизация. «Лиофилизованная композиция» или «композиция, полученная путем сушки вымораживанием» представляет собой лекарственную форму, которую получают путем лиофилизации или сушки вымораживанием. Лиофилизацию проводят с применением обычной методики лиофилизации, описанной в литературе, включая такие стадии, как замораживание, отжиг, первичная сушка и вторичная сушка.
Композиция моноклонального антитела, способного связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а предпочтительно коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител согласно изобретению могут быть использованы для лечения и профилактики бешенства, а предпочтительно для профилактики после укусов. Моноклональные антитела или их коктейль согласно изобретению исследуют для оценки активности нейтрализации вируса бешенства. Активность антител, нейтрализующих вирусы бешенства, или вирусы, родственными вирусам бешенства, определяют с помощью RFFIT по сравнению с Международным стандартом активности иммуноглобулина против бешенства у человека в соответствии с критериями ВОЗ (RAI) или по сравнению с апробированным внутренним эталонным стандартом по отношению к указанному Международному стандарту. Анализ RFFIT является подходящим для определения антител против вирусов бешенства или вирусов, родственных вирусам бешенства как на ранней стадии (пассивная иммунизация), так и на поздней стадии (активная иммунизация).
Способы введения профилактической и терапевтической композиции настоящего изобретения могут быть подразделены на пероральное и парентеральное введение. Предпочтительным способом введения является инфильтрация в пораженный участок и вокруг него. Остальной объем, но необязательно, инъецируют внутримышечно в участок (участки), удаленный(е) от места поражения, но этот способ не имеет конкретных ограничений.
Было обнаружено, что моноклональное антитело и коктейль по меньшей мере из двух моноклональных антител обладают способностью нейтрализовать различные вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства и, таким образом, являются подходящими для лечения и профилактики бешенства у пациентов и животных, инфицированных вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства. Предпочтительно, моноклональное антитело и коктейль из двух моноклональных антител могут быть введены непосредственно в область, окружающую участок поражения после укуса бешенного животного. Остальной объем, но необязательно, вводят внутримышечно в другие части тела. Предпочтительно, коктейль антител содержит mAb A и mAb B согласно изобретению.
Дозу профилактических и терапевтических антител согласно изобретению выбирают из 1 МЕ/кг - 100 МЕ/кг. Предпочтительный интервал доз профилактических и терапевтических антител согласно изобретению составляет от 10 МЕ/кг до 80 МЕ/кг. Более предпочтительно, доза профилактического и терапевтического антитела согласно изобретению составляет 40 МЕ/кг. В одном из вариантов осуществления изобретения, дозу профилактического и терапевтического коктейля согласно изобретению выбирают из 1 МЕ/кг - 100 МЕ/кг. Предпочтительно, дозу профилактического и терапевтического коктейля согласно изобретению выбирают из 10 МЕ/кг - 80 МЕ/кг. Более предпочтительно, доза профилактического и терапевтического коктейля согласно изобретению составляет 40 МЕ/кг.
Схема профилактических и терапевтических антител согласно изобретению включает введение антитела согласно изобретению в комбинации с вакциной против бешенства. Вакцина против бешенства согласно изобретению может представлять собой коммерчески доступные вакцины против бешенства или вакцины, находящиеся на стадии клинической разработки. Так, например, вакцина против бешенства согласно изобретению может быть выбрана из Imovax, Rabvert, Rabipur, Rabivax, Vaxirab N, Abhayrab, Indirab, Verorab, SPEEDA и т.п. Эти вакцины представляют собой вакцины против бешенства, доступные на фармацевтическом рынке под указанными торговыми знаками. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело настоящего изобретения вводят без задержки в качестве экстренной процедуры. Эта вакцина может быть также введена вплоть до 7 дней после введения первой дозы вакцины. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело или коктейль согласно изобретению могут быть использованы для PEP-профилактики от вирусов бешенства и вирусов, родственных вирусам бешенства. Более предпочтительно, антитело или коктейль согласно изобретению используют в комбинации с вакциной против бешенства для PEP-профилактики от инфицирования вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства.
Аналитические методы, применяемые в настоящем изобретении:
Быстрый тест на ингибирование очага заражения с использованием флуоресцентного антитела (RFFIT) для определения активности и титра RVNA
Анализ RFFIT проводили в 96-луночных планшетах для культивирования тканей. Фиксированную дозу CVS-1l инкубировали с каждым из серийных разведений тестируемых и контрольных веществ 1:2. После 90-минутного инкубирования, тестируемые и контрольные вещества вместе с вирусом CVS-11 добавляли поверх клеток ВНК-21 и инкубировали в течение еще 22±2 часов в инкубаторе с 5% СО2 при 37°C. По окончании периода инкубирования, клеточный монослой промывали и фиксировали 80% ацетоном. Присутствие ненейтрализованного вируса при каждом серийном разведении детектировали путем идентификации клеток, инфицированных остаточным вирусом, с использованием ФИТЦ-конъюгированного антитела против нуклеопротеина вируса бешенства и подсчета флуоресцирующих инфицированных клеток под флуоресцентным микроскопом. Титр RVNA был вычислен как показано ниже:
Вычисление титра RVNA
Разность логарифмов = □□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
Инфекционность выше 50% - инфекционность ниже 50%
Log (величина, обратная конечной точке разведения 50%) =
Log (величина, обратная исходной точке разведения) + разность логарифмов
Титр конечной точки=Антилогарифм Log (величина, обратная конечной точке разведения 50%)
Конечный титр образца
Титр RVNA (МЕ/мл) = □□□□□□□□□□□□□□□□□□□ × 2 МЕ/мл (эталонный стандарт)
Конечный титр эталонного. стандарта
Настоящее изобретение проиллюстрировано на нижеследующих неограничивающих примерах, которые никоим образом не должны интерпретироваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1: Получение моноклонального антитела mAb А в качестве активного лекарственного вещества
Способ получения моноклонального антитела mAb A в качестве лекарственного вещества включает:
- Процедуру культивирования клеток Sp2/0, а затем
- Процедуру очистки.
Предварительный способ культивирования для получения моноклонального антитела mAb A
Моноклональное антитело mAb A получали с использованием экспрессионной системы клеток-хозяев способом культивирования клеток Sp2/0 в присутствии сред, не содержащих компонентов живтного происхождения, и питательных компонентов. Среды, содержащие компоненты сыворотки, могут быть также использованы для получения указанного антитела. Сначала, получение каждой партии инициировали путем создания основного банка клеток (МСВ) или рабочего банка клеток (WCB) в сосуде, содержащем клетки Sp2/0, включающие полинуклеотидную последовательность mAb А. После приготовления сосуда с банком клеток проводили серию стадий развития зародышей для получения конечного инокулята с адекватным количеством клеток, и инокулировали в биореактор для продуцирования. Процесс культивирования клеток в биореакторе проводили хорошо регулируемым образом с использованием различных контрольных параметров онлайн и офлайн для экспрессии моноклонального антитела mAb А по конститутивному механизму. Белок секретировался клетками в растворимой форме.
Было получено множество партий композиции, содержащей моноклональное антитело. Инокулят mAb А культивировали в 200-литровых биореакторах, содержащих жидкую клеточную культуральную среду. Зрелое антитело, кодируемое этими нуклеиновыми кислотами, представляет собой mAb А и содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 9, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 10. Культивирование клеток проводили в регулируемой среде путем поддержания pH 7,0±0,3 с использованием газообразного CO2 и/или бикарбоната натрия, если это необходимо. Концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне насыщения 15±5% путем барботирования воздухом и/или газообразного кислорода и путем регуляции скорости перемешивания в биореакторе. Биореакторы работали при температуре приблизительно от 36,0°С до приблизительно 37,0°C.
Среда для культивирования содержит следующие компоненты:
Клетки культивировали в указанных выше условиях в течение двух дней, начиная со дня 2, а затем инициировали подпитку, и эту потпитку продолжали до получения конечной партии. Следующие компоненты среды подавали в среду для культивирования клеток в качестве общей подпитки:
Продолжительность культивирования составляла от 7 до 9 дней. Возраст клеток in vitro (на дни культивирования от начального размораживания основного банка клеток до сбора) составлял 26 дней или менее. После этого, осветленный супернатант клеточной культуры собирали путем центрифугирования и глубинной фильтрации среды для культивирования клеток. Затем, этот осветленный супернатант снова разводили так, чтобы он, по существу, соответствовал последующим условиям уравновешивания на колонке для очистки. Затем супернатант подвергали хроматографии на белке и с этой хроматографической колонки удаляли примеси путем оттока.
Последующий способ очистки для получения моноклонального антитела mAb A в качестве лекарственного вещества
Способ очистки моноклонального антитела mAb А проводили посредством нескольких отдельных процедур, включающих осветление клеток, повторное разведение, хроматографию, инактивацию вируса, удаление вируса и мембранную ультрафильтрацию-диафильтрацию. Очистка с помощью хроматографии включала различные методы обменной хроматографии, такие как аффинная хроматография и другие подходящие методы хроматографии и фильтрации. Инактивацию вирусов проводили при низком рН в течение определенного периода времени, а клиренс вируса проводили путем нанофильтрации. Повторное разведение и/или буферный обмен осуществляли с помощью стандартной мембранной ультрафильтрации-диафильтрации.
По окончании процедуры очистки, очищенное моноклональное антитело mAb А фильтровали через 0,2 мкм-фильтр, хранили в асептических условиях и в замороженном состоянии в подходящей системе для хранения закрытых контейнеров. Затем проводили мониторинг всей процедуры очистки и регулировали соответствующие физические и физико-химические параметры моноклонального антитела mAb А и параметры его очистки. При оценке с помощью аналитической высокоэффективной эксклюзионной хроматографии было обнаружено, что лекарственное вещество mAb А имеет чистоту более, чем 99%.
Пример 2: Получение моноклонального антитела mAb В в качестве активного лекарственного вещества
Способ получения моноклонального антитела mAb В в качестве лекарственного вещества включает:
- Процедуру культивирования клеток Sp2/0, а затем
- Процедуру очистки.
Предварительный способ культивирования для получения моноклонального антитела mAb В
Моноклональное антитело mAb В получали с использованием экспрессионной системы клеток-хозяев способом культивирования клеток Sp2/0 в присутствии сред, не содержащих компонентов живтного происхождения, и питательных компонентов. Среды, содержащие компоненты сыворотки, могут быть также использованы для получения указанного антитела. Сначала, получение каждой партии инициировали путем создания основного банка клеток (МСВ) или рабочего банка клеток (WCB) в сосуде, содержащем клетки Sp2/0, включающие полинуклеотидную последовательность mAb В. После приготовления сосуда с банком клеток проводили серию стадий развития зародышей для получения конечного инокулята с адекватным количеством клеток, и инокулировали в биореактор для продуцирования. Процесс культивирования клеток в биореакторе проводили хорошо регулируемым образом с использованием различных контрольных параметров онлайн и офлайн для экспрессии моноклонального антитела mAb В по конститутивному механизму. Белок секретировался клетками в растворимой форме.
Было получено множество партий композиции, содержащей моноклональное антитело. Инокулят mAb В культивировали в 200-литровых биореакторах, содержащих жидкую клеточную культуральную среду. Зрелое антитело, кодируемое этими нуклеиновыми кислотами, представляет собой mAb В и содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 11, и аминокислотную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 12. Культивирование клеток проводили в регулируемой среде путем поддержания pH 7,0±0,3 с использованием газообразного CO2 и/или бикарбоната натрия, если это необходимо. Концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне насыщения 30±10% путем барботирования воздуха и/или газообразного кислорода и путем регуляции скорости перемешивания в биореакторе. Биореакторы работали при температуре приблизительно от 36,0°С до приблизительно 37,0°C.
Среда для культивирования содержит следующие компоненты:
Клетки культивировали в указанных выше условиях в течение двух дней. Начиная со дня 2 инициировали подпитку, и эту потпитку продолжали до получения конечной партии. Следующие компоненты среды подавали в среду для культивирования клеток в качестве общей подпитки:
Среда для культивирования содержит следующие компоненты:
для подпитки 7а
для подпитки 7b
Продолжительность культивирования составляла от 5 до 7 дней. Возраст клеток in vitro (на дни культивирования от начального размораживания основного банка клеток до сбора) составлял 33 дня или менее. После этого, осветленный супернатант клеточной культуры собирали путем центрифугирования и глубинной фильтрации среды для культивирования клеток. Затем, этот осветленный супернатант снова разводили так, чтобы он, по существу, соответствовал последующим условиям уравновешивания на колонке для очистки. Затем супернатант подвергали хроматографии на белке А и с этой хроматографической колонки удалали примеси путем оттока.
Последующий способ очистки для получения моноклонального антитела mAb В в качестве лекарственного вещества
Способ очистки моноклонального антитела mAb В проводили посредством нескольких отдельных процедур, включающих осветление клеток, повторное разведение, хроматографию, инактивацию вируса, удаление вируса и мембранную ультрафильтрацию-диафильтрацию. Очистка с помощью хроматографии включала различные методы обменной хроматографии, такие как аффинная хроматография и другие подходящие методы хроматографии и фильтрации. Инактивацию вирусов проводили при низком рН в течение определенного периода времени, а клиренс вируса проводили путем нанофильтрации. Повторное разведение и/или буферный обмен осуществляли с помощью стандартной мембранной ультрафильтрации-диафильтрации.
По окончании процедуры очистки, очищенное моноклональное антитело mAb В фильтровали через 0,2 мкм-фильтр, хранили в асептических условиях и в замороженном состоянии в подходящей системе для хранения в закрытых контейнерах. Затем проводили мониторинг всей процедуры очистки и регулировали соответствующие физические и физико-химические параметры моноклонального антитела mAb В и параметры его очистки. При оценке с помощью аналитической высокоэффективной эксклюзионной хроматографии было обнаружено, что лекарственное вещество mAb В имеет чистоту более, чем 99%.
Пример 3: Получение коктейля антител, содержащего эквипотентные антитела
Для получения коктейля антител, содержащего эквипотентное количество двух антител, величина активности в МЕ/мг была присвоена очищенному лекарственному веществу mAb А и mAb B после проведения теста RFFIT. Отдельные лекарственные вещества mAb А и mAb B разводили в зависимости от концентрации (мг/мл) для достижения аналогичной величины активности, выраженной в МЕ/мл, цитратным буфером, рН 6,0, содержащим хлорид натрия и полисорбат. Для получения коктейля антител, содержащего эквипотентные антитела, разведенные лекарственные вещества mAb A и mAb B соответствующим образом смешивали.
Пример 4. Получение коктейля моноклональных антител
Коктейль антител получали путем смешивания эквипотентных количеств моноклональных антител mAb А и mAb B в качестве лекарственных веществ в присутствии цитратного буфера, рН 6,0, содержащего хлорид натрия и полисорбат. Компаундирование осуществляли постадийно в подходящем сосуде. рН раствора на различных стадиях компаундирования регулировали и раствор тщательно перемешивали. После завершения компаундирования, брали аликвоту полученного объема и анализировали на рН и осмомоляльность. Для снижения биологической нагрузки и стерильной фильтрации препарата в конечном объеме использовали 0,2 мкм стрилизующих фильтров, а затем препарат загружали в стеклянные сосуды или шприцы. Целостность фильтра определяли до и после фильтрации всей массы. Заполнение осуществляли с использованием насоса, и объем заполнения оценивали по массе в течение всего процесса заполнения. Затем первые заполненные контейнеры закрывали в режиме онлайн в стерильных условиях. После закрытия была проведена герметизация путем нажатия до щелчка. Полученный таким образом конечный продукт представляет собой стабильную фармацевтическую композицию, которая, как было установлено, остается стабильной в течение по меньшей мере 36 месяцев в условиях хранения при нужной температуре в реальном времени в указанной системе в закрытых контейнерах.
Пример 5: Исследования mAb A и mAb B in vitro
Перекрестную реактивность выбранных mAb-кандидатов in vitro оценивали путем отбора вирусов RABV и вирусов, родственных вирусам бешенства, выделенных у хозяев конкретных видов в различных географических регионах путем проведения различных серий экспериментов. Сначала использовали RABV (генотипа 1) собак из Азии (Индии, Филиппин, Таиланда и т.п.), Африки (Северной Африки, стран Африки к югу от Сахары и т.п.) и стран Нового Света. Кроме того, использовали RABV (генотипа 1) мангуста(ов) из Южной Африки. Кроме того, была протестирована нейтрализующая способность mAb (mAb A и mAb B) против вирусов, родственных вирусам бешенства, таких как EBLV-1, EBLV-2, (генотипа 5, 6), ABLV (генотипа 7), вируса Дювенхейга (генотипа 4), выделенных у конкретных видов, включая Иркутский вирус, вирус Кхуань и вирус Араван.
Монослои клеток NA инфицировали выбранными штаммами RABV и вируса, родственного вирусам бешенства, при множественности заражения 0,1 в течение 1 часа при 37°C в 5% CO2. Затем вирусный инокулят удаляли, к клеткам добавляли свежую среду, после чего клетки инкубировали в течение 72 часов при 37°C в 0,5% CO2. Затем супернатанты культуры собирали и титровали на клетках ВНК 21. Было проведено до трех пассажей с получением достаточных титров вируса. Вирусы хранили при -80°С для дальнейшего использования.
Быстрый тест на ингибирование очага заражения с использованием флуоресцентного антитела (RFFIT) или тест на нейтрализацию вируса флуоресцентным антителом (FAVN) проводили на клетках ВНК 21 с использованием постоянного вируса, но с применением методов с использованием различных mAb. Каждое mAb (очищенное или в супернатанте) последовательно разводили (10,0-0,03 МЕ/мл) и инкубировали с 104 БОЕ/мл RABV и вирусов, родственных вирусам бешенства, которые были протестированы. Для определения нейтрализующей активности каждого mAb, 100%-ное снижение уровня тестируемого вируса с использованием mAb А и mAb B сравнивали со 100%-ным снижением уровня того же самого тестируемого вируса, но с использованием иммуноглобулина против бешенства в качестве Международного стандарта (SRIG, 2-го препарата человеческого иммуноглобулина против бешенства, National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, UK). Используемый здесь термин SRIG означает человеческий иммуноглобулин против бешенства, который может быть также упомянут как HRIG. Данные тестирования считывали после инкубирования в течение 24 часов.
5. 1. In vitro исследование нейтрализации вирусов выбранными mAb
Таблица 1. Паттерн нейтрализации антителами mAb A и SRIG, оцененный с использованием 17 вирусов RABV и вирусов, родственных вирусам бешенства. Заштрихованные (серым) прямоугольники означают наличие жизнеспособного вируса.
# Заштрихованные прямоугольники означают наличие жизнеспособного вируса.
Таблица 2. Паттерн нейтрализации антителами mAb В и SRIG, оцененный с использованием 17 вирусов RABV и вирусов, родственных вирусам бешенства. Заштрихованные (серым) прямоугольники означают наличие жизнеспособного вируса.
# Заштрихованные прямоугольники означают наличие жизнеспособного вируса.
Оба mAb тестировали в качестве ресуспендированного очищенного антитела, начиная с активности 10 МЕ/мл до разведения 0,03 МЕ/мл. Кроме того, было обнаружено, что эти антитела являются комплементарными по их способности к нейтрализации. Этот тест показал, что выбранные антитела были сравнимы с SRIG в отношении нейтрализации вируса широкого ряда.
5. 2 In vitro исследование нейтрализации вирусов выбранными mAb
В тестах in vitro использовали семь различных RABV (2 лабораторных штамма и 5 полевых штаммов RABV) для определения нейтрализующей активности каждого mAb. Кроме того, в панель вирусов были включены 4 различных вируса, родственных вирусам бешенства и относящихся к генотипам 4, 5 и 6, а также 4 изолята лиссавирусов летучих мышей из Центральной Азии и Восточной Сибири [вируса Австралийских летучих мышей (ABV), вируса Араван (ARAV), вируса Кхуань (KHUV) и Иркутского вируса (IRKV)].
Таблица 3. Паттерн нейтрализации антителами SRIG, mAb A и В, оцененный с использованием RABV и вирусов, родственных вирусам бешенства.
Штамм
вируса
# Заштрихованные прямоугольники означают наличие жизнеспособного вируса.
Существует широкий in vitro спектр перекрестных реактивностей кандидатов mAb против вирусов бешенства и некоторых других лиссавирусов. Все вирусы бешенства или вирусы, родственные вирусам бешенства, были нейтрализованы любым из моноклональных антител. Кроме того, было обнаружено, что эти антитела являются комплементарными по их способности к нейтрализации. Этот тест показал, что выбранные антитела были сравнимы с SRIG в отношении нейтрализации вируса широкого ряда. Полученные данные продемонстрировали сходство между антителами и SRIG в их способности нейтрализовать различные вирусы бешенства и RABV, такие как лиссавирусы.
5. 3 In vitro исследование нейтрализации вируса с использованием коктейля из mAb A и mAb B, HRIG и ERIG
Эксперимент проводили для изолятов вируса бешенства Стрит и штамма CVS
Таблица 4. Схема нейтрализации с использованием коктейля из mAb, HRIG и ERIG
(mAb A и mAb B)
Было обнаружено, что коктейль из mAb A и B нейтрализует все изоляты по аналогии с нейтрализацией антителами HRIG (препаратом человеческого иммуноглобулина против бешенства) и ERIG (препаратом лошадиного иммуноглобулина против бешенства).
Пример 6: Исследования активности коктейля mAb in vivo
6. 1. Исследование активности коктейля mAb, ERIG и HRIG in vivo
В данном исследовании, в качестве животных-моделей использовали мышей. Зараженные вирусом животные были подразделены на 5 экспериментальных групп: 1) контрольную группу, которой вводили нормальный физиологический раствор; 2) группу, которой вводили коктейль mAb в дозе 0,2 МЕ/мышь; 3) группу, которой вводили коктейль mAb в дозе 0,4 МЕ/мышь; 4) группу, которой вводили HRIG в дозе 0,2 МЕ/мышь; 5) группу, которой вводили ERIG в дозе 0,4 МЕ/мышь.
В этом исследовании, вирус CVS и 10 штаммов вируса Стрит использовали для заражения животных. Коктейль mAb вводили в двух дозах 0,2 МЕ/мышь и 0,4 МЕ/мышь для сравнения с аналогичной дозой HRIG и ERIG. Разведение тестируемого mAb вычисляли исходя из рекомендуемых доз HRIG (20 МЕ/кг) и ERIG (40 МЕ/кг). Каждой мыши вводили HRIG в дозе 0,2 МЕ/мышь в группе 4 и ERIG в дозе 0,4 МЕ/мышь в группе 5. Тестируемый коктейль mAb вводили в дозах 0,2 МЕ/мышь и 0,4 МЕ/мышь животным в группах 2 и 3, соответственно.
Каждую группу, содержащую 8 мышей, заражали 100 LD50 каждого указанного вируса. Через 1 час после заражения вирусом, контрольная группа получала 100 мкл нормального физиологического раствора, введенного в тот же участок, в который была проведена инокуляция вируса. Остальные четыре группы получали одно из разведенных mAb, введенных в тот же самый участок, в который был инокулирован вирус. Мышей наблюдали в течение 1 месяца.
Таблица 5. Исследование действия коктейля mAb, ERIG и HRIG у животных, то есть, у мышей, зараженных вирусом
No.
(mAb A+mAb B)
0,2 МЕ/ мышь
0,4 МЕ/ мышь
Результаты, представленные в таблице 7, показали, что 100% выживаемость наблюдалась в экспериментальной группе, обработанной моноклональным антителом против вируса бешенства (HRIG, ERIG и коктейлем mAb). При этом, в контрольной группе, зараженной CVS, наблюдалась 100% смертность.
Это также подтверждает, что коктейль mAb согласно изобретению является таким же эффективным, как и апробированные в настоящее время антитела (HRIG и ERIG).
6. 2. Исследование активности коктейля mAb и HRIG in vivo
Для того чтобы установить ФK/ФД-корреляцию для соответствующего протокола клинического исследования у человека, было проведено исследование на эффективность in vivo у хомячков, зараженных вирусом бешенства (CVS-11).
Определение эффективности проводили исходя из количества хомячков, выживших после введения им летальной дозы вируса бешенства, после обработки равной дозой тест-образца коктейля mAb и стандартного HRIG (Kamrab, Kamada Ltd, Beit-Kama, Israel).
Исследуемые животные были произвольно распределены по группам исходя из их массы тела и подразделены на различные группы обработки. Зараженные вирусом животные были подразделены (по 10 животных в каждой группе) на следующие три группы: 1) группу, которой вводили только вирус CVS-11; 2) группу, которой вводили вирус CVS-11 и коктейль mAb против вируса бешенства по отдельности; 3) группу, которой вводили вирус CVS-11 и стандартный HRIG (Kamrab, Kamada Ltd, Beit-Kama, Israel).
Препарат вируса бешенства с известным титром LD50 был соответствующим образом разведен, и 200 мкл вводили в правую икроножную мышцу каждого хомячка. Приготовленный раствор коктейля mAb против вируса бешенства и стандартный Kamrab вводили через 6 часов определенным группам животных в один и тот же участок инъекции вируса в условиях подпитки. Выбранный уровень доз составлял 15 МЕ/хомячка для минимизации объема дозы в месте инъекции (~100 мкл). Хомячков наблюдали ежедневно на любые клинические признаки бешенства, такие как паралич или гибель. После наблюдения каких-либо признаков заражения вирусом бешенства, животных умерщвляли путем асфиксии диоксидом углерода. % Выживаемости определяли через 30 дней после заражения вирусом. Результаты исследования представлены в Таблице 8.
Таблица 6. Исследование животных на эффективность коктейля mAb и HRIG, вводимых в определенных дозах без вакцины через 6 часов после заражения вирусом CVS-11
Исследование in vivo на эффективность коктейля mAb по сравнению с HRIG (Kamrab, Kamada Ltd, Beit-Kama, Israel) было проведено для того, чтобы продемонстрировать вирус- нейтрализующую активность коктейля mAb у хомячков, зараженных вирусом бешенства. В данном исследовании, в том случае, когда животных обрабаотывали коктейлем mAb согласно изобретению через 6 часов после заражения вирусом, выживаемость составляла 90%. Очевидно, что такая выживаемость лучше, чем 50% выживаемость при введении HRIG (Kamrab, Kamada Ltd. Beit-Kama).
Пример 7. Фаза III клинического испытания коктейля mAb
Эффективность коктейля, содержащего mAb А и mAb B, была исследована в рандомизированном, многоцентровом клиническом исследовании с участием человека, проводимом с открытой меткой и с регулируемым сравнением в фазе III, для оценки и сравнения эффективности и безопасности коктейля и HRIG в отношении параметров PEP, где оба препарата были введены вместе с вакциной против бешенства.
В исследование участвовали 308 пациентов с укусом(ами) предположительно бешенными животными категории III по ВОЗ, где указанные пациенты были разделены на две равные группы. В одной группе, индивидуумы получали коктейль mAb (40 МЕ/кг) в комбинации с вакциной против бешенства (VaxiRab N; Cadila Healthcare Ltd. Ahmedabad, India), а в другой группе, индивидуумы получали HRIG (Imogam® (20 МЕ/кг, Sanofi Pasteur SA France) вместе с вакциной против бешенства.
В обоех группах, лекарственные средства вводили непосредственно в окружающую область ран от укуса бешенного животного (в один участок/во множество участков), а остальной объем вводили внутримышечно в другие части тела. Оба лекарственных средства вводили в день 0 в комбинации с вакциной против бешенства в соответствии со схемой подпитки для вакцинации против бешенства (пять внутримышечных доз на дни 0, 3, 7, 14 и 28). Исследование проводили в течение 84 дней для каждого индивидуума.
Результаты:
Было установлено, что лекарственные средства, коктейль Mab и HRIG были по меньшей мере сравнимы в отношении титров RVNA, как было определено в ранних временных точках (дни 3 и 7) и в поздних временных точках (дни 14, 28, 42 и, 84). Исследование показало, что коктейль mAb, подобно HRIG, обеспечивал непрерывное окно защиты, то есть, без значительной нейтрализации вакцины против бешенства в течение всего исследования. Кроме того, титры в более поздние моменты времени, наблюдаемые на дни 28, 42 и 84, были выше в группе, который вводили коктейль mAb, по сравнению с HRIG, что указывает на то, что коктейль мышиного mAb нейтрализировал вакцину (активная иммунизация) на меньшем уровне, чем человеческое поликлональное антитело (HRIG), и этот результат продемонстрировал преимущество мышиных моноклональных антител по сравнению с человеческими антителами в соответствии с параметрами PEP.
Включение в настоящее описание посредством ссылки
Полное описание каждого из патентных документов и научных статей, упоминаемых в настоящей заявке, включено во всех целях посредством ссылки.
Эквиваленты
Изобретение может быть осуществлено в других конкретных формах, не выходя за рамки существа изобретения или его основных характеристик. Поэтому, приведенные выше варианты изобретения следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, и не ограничивающие описанное здесь изобретение. Таким образом, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые находятся в пределах значений и интервалов эквивалентности формулы изобретения, вводятся в описание настоящего изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> КАДИЛА ХЕЛЗКЭР ЛИМИТЕД
<120> Моноклональные антитела против вируса бешенства и их смесь
<130> CHL-PCT0794
<150> 201821041598
<151> 2018-11-02
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRH1 mAb A)
<400> 1
Ser Ser Trp Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRH2 mAb A)
<400> 2
Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRH3 mAb A)
<400> 3
Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRL1 mAb A)
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRL2 mAb A)
<400> 5
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (CDRL3 mAb A)
<400> 6
Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His Thr
1 5
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (HCVR mAb A)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (HCVR mAb A) (LCVR mAb A)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys
100 105
<210> 9
<211> 445
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (HC mAb A)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Thr His Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Asp Gly Pro His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210 215 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290 295 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305 310 315 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340 345 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355 360 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405 410 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (LC mAb A)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 11
<211> 455
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (HC mAb B)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly His
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Asp Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Asp Ile Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr
210 215 220
Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys
245 250 255
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
275 280 285
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
325 330 335
Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg
340 345 350
Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg
355 360 365
Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp
370 375 380
Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser
420 425 430
Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr
435 440 445
Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Мышиное моноклональное антитело (LC mAb B)
<400> 12
Asp Val Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2764740C1 |
| АНТИТЕЛА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ПАССИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГРИППА, И ИХ КОМПОЗИЦИИ, КОМБИНАЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2720282C1 |
| ВАРИАНТНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD3 ДОМЕНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2019 |
|
RU2810222C2 |
| Терапевтические антитела к CD47 | 2016 |
|
RU2748401C2 |
| Терапевтический биопрепарат для лечения гепатоцеллюлярной карциномы | 2014 |
|
RU2739218C2 |
| АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ ИНТЕРЛЕЙКИНУ-2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2018 |
|
RU2745451C1 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ БЕШЕНСТВА | 2014 |
|
RU2712743C2 |
| ХИМЕРНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСОВ РОДОВ FLAVIVIRUS И LYSSAVIRUS | 2019 |
|
RU2816136C2 |
| АНТИТЕЛА К PD-1 СОБАК | 2014 |
|
RU2732604C2 |
| ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, НАЦЕЛЕННЫЕ НА FLT3 | 2018 |
|
RU2820859C2 |
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к мышиному моноклональному антителу, способному связываться с вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства, и нейтрализовать эти вирусы, а также к коктейлю по меньшей мере из двух моноклональных антител, обладающих указанными свойствами. Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинации мышиного моноклонального антитела или коктейля по меньшей мере из двух моноклональных антител и вакцины против бешенства для использования в целях постконтактной профилактики (PEP) заражения вирусами бешенства или вирусами, родственными вирусам бешенства. Коктейль может нейтрализовать вирус, происходящий от таких видов, как летучие мыши, собаки, коровы, мангусты, скунсы и волки, и, таким образом, он может быть использован для лечения потенциально инфицированного пациента. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 7 пр.
1. Композиция коктейля из двух моноклональных антител для нейтрализации вируса бешенства, содержащая
одно моноклональное антитело с тяжелой цепью и легкой цепью, содержащее полипептиды SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно, и
второе моноклональное антитело с тяжелой цепью и легкой цепью, содержащее полипептиды SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, соответственно, и
наполнители, выбранные из буфера, сахара, полиола, аминокислоты, поверхностно-активного вещества и полимера.
2. Композиция по п. 1, содержащая наполнители, выбранные из цитратного буфера, полисорбата 80, хлорида натрия.
3. Композиция по п. 1 или 2, которая представляет собой лиофилизованный препарат.
4. Композиция по п. 1, где одно из антител в коктейле присутствуют в концентрации от 1 до 5000 МЕ/мл, или от 100 до 3000 МЕ/мл, или 150 МЕ/мл, или 300 МЕ/мл, или 600 МЕ/мл.
5. Композиция по п. 1, где коктейль присутствует в концентрации от 100 до 150 МЕ/мл, или 400 до 1500 МЕ/мл, или 300 МЕ/мл, или 600 МЕ/мл, или 1200 МЕ/мл.
6. Композиция по п. 1, которую вводят путем инфильтрации в участок заражения и в окружающую его область и/или внутримышечно в участок, удаленный от раневого участка, или в участки, удаленные от раневого участка.
7. Композиция по п. 1 или 6, которую вводят в дозе от 1 до 100 МЕ/кг, или 10 до 80 МЕ/кг, или 40 МЕ/кг.
8. Композиция по любому из пп. 1, 6, 7, которую вводят вплоть до 7 дней после контакта, начиная непосредственно с момента контакта.
9. Комбинация вакцины против бешенства и композиции по п. 1 для PEP-профилактики заражения вирусами бешенства и вирусами, связанными с бешенством, такими как вирусы рода Lyssavirus, который включает RABV (генотип 1), EBLV-l, -2 (генотип 5, 6), ABLV (генотип 7), вирус Дювенхейджа (генотип 4), вирус Иркут, вирус Худжанд и вирус Араван.
10. Применение композиции по п. 1 для PEP-профилактики заражения вирусами бешенства и вирусами, родственными вирусам бешенства, такими как вирусы рода Lyssavirus, который включает RABV (генотип 1), EBLV-l, -2 (генотип 5, 6), ABLV (генотип 7), вирус Дювенхейджа (генотип 4), вирус Иркут, вирус Худжанд и вирус Араван.
| CN 104761640 A, 08.07.2015 | |||
| BAHLOUL C | |||
| et al., Field trials of a very potent rabies DNA vaccine which induced long lasting virus neutralizing antibodies and protection in dogs in experimental conditions, Vaccine, 2006, vol | |||
| Пишущая машина для тюркско-арабского шрифта | 1922 |
|
SU24A1 |
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ ПЕРЕНОСНЫЙ ФОНАРЬ | 1924 |
|
SU1063A1 |
| МУКАПТАЕВ К.Н | |||
| испытание экспресс-метода на основе моноклональных антител для обнаружения вируса | |||
