Штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV, предназначенный для получения туберкулопротеинов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K39/04 C12R1/325 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, и биотехнологии может быть использовано в научно-исследовательских целях и при производстве паратуберкулезного аллергена на предприятиях биологической промышленности.

Штамм Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных Федерального научного центра - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук под номером В-1402.

Паратуберкулез, паратуберкулезный энтерит, болезнь Йоне (Johnes disease - англ.; Paratuberculose der Rinder, Johnesche Krankheit - нем.; Paratuberculeuse - франц.) - хроническая инфекционная болезнь, в основном, жвачных животных, чаще всего протекающая латентно, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов и как следствие - сопровождающаяся расстройством желудочно-кишечного тракта (диареей) с прогрессирующим истощением - до летального исхода.

Паратуберкулез крупного рогатого скота впервые был описан A. Johne, L. Frothingham в 1895 году, как особая форма туберкулеза кишечника, вызываемая ослабленным возбудителем туберкулеза бычьего или птичьего видов [Найманов А.Х., Гулюкин М.И. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулез и паратуберкулез) // Москва: Зооветкнига, 2014 -235 с.]

В 1902 году Мс. Fadylan назвал эту болезнь в честь первого автора - болезнью Йоне. [Найманов А.Х., Вангели Е.П., Мясоедов Ю.М. и др. Хронические инфекции животных. Паратуберкулез // монография - Москва: Спутник+, 2022, -с. 3].

В дальнейшем - возбудитель заболевания был квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а болезнь названа паратуберкулезом. После исследований с применением молекулярно-генетических методов было доказано, что гены М. avium и М. paratuberculosis на 99% гомологичны. Впоследствии, по предложению M.F. Thorel et al., возбудитель паратуберкулеза стали считать подвидом микобактерий птичьего вида -Micobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) [Thorel M.F, Krichevsky M., Levy-Frebault V. Numerical taxonomy of mycobactin-dependent mycobacteria, emended description of Mycobacterium avium subsp.avium subsp.nov., Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis subsp.nov., and Mycobacterium avium subsp.silvaticum subsp.nov. // Int. J. Syst. Bacterid., 1990, 40, 254-260].

При паратуберкулезе нет высокоэффективных методов диагностики, лечения и вакцинопрофилактики. По мнению многих исследователей ни один из существующих методов диагностики паратуберкулеза не обладает 100% эффективностью, поэтому рекомендуется применять комплексный подход к диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота [Larson, J. Johne's Disease - Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: A Debilitating Enteric Disease of Ruminants // U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Service. National Agricultural Library Animal Welfare Information Center. - 2002].

В соответствии с «Кодексом здоровья наземных животных МЭБ» в редакции 2019 года при паратуберкулезе нет рекомендуемых тестов, а в качестве альтернативных тестов предлагается внутрикожная туберкулиновая проба и иммуноферментный анализ.

В «скрытости» инфекции, низкой чувствительности и специфичности методов диагностики, сложности выделения, культивирования и идентификации возбудителя в отсутствии возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных - заключаются основные сложности в установлении диагноза на паратуберкулез. До настоящего времени нет единого мнения о диагностической ценности туберкулина для птиц и ионина (паратуберкулина), применяемых в ветеринарной практике. Своевременная диагностика является непременным условием эффективности комплекса профилактических и оздоровительных мероприятий. Основной проблемой аллергической диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота является выявление реагирующих на ионин и туберкулин для птиц животных, сенсибилизированных различными видами микобактерий.

Уровень техники

В соответствии «Наставления по диагностике паратуберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.04.2001 г., исследования на паратуберкулез в благополучных хозяйствах проводят при обнаружении животных, вызывающих подозрение на заболевание, а в неблагополучных хозяйствах - для выявления больных животных. Диагноз на паратуберкулез устанавливают на основании результатов клинического осмотра животных, аллергического, серологического, бактериоскопического, патологоанатомического и гистологического методов исследования с учетом эпизоотологических данных.

В нашей стране аллергические исследования животных на паратуберкулез проводят внутрикожной пробой с ППД-туберкулином для птиц. Учет и оценку реакции проводят через 72 часа после введения аллергена. Реагирующими считают животных с увеличением толщины кожной складки на 6 мм и более.

Известен ряд штаммов Micobacterium avium subspecies paratuberculosis (шт. А, шт. P-06, шт. 179, шт Б) который использовались в качестве продуцентов туберкулопротеинов-йонинов предназначенных для выявления животных больных паратуберкулезом аллергическим методом [Найманов А.Х., Вангели Е.П., Мясоедов Ю.М. и др. Хронические инфекции животных. Паратуберкулез // Москва: Спутник+, 2022, - с. 24-28]

Наиболее близким аналогом для заявляемого Штамма является типовой штамм М. avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС, используемый в качестве продуцента туберкулопротеинов при изготовлении комплексного аллергена для диагностики паратуберкулеза. (Прототип) [Патент Комплексный аллерген для диагностики паратуберкулеза №2771778 от 2021].

Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является необходимость расширения арсенала штаммов паратуберкулеза - продуцентов туберкулопротеинов предназначенных для производства паратуберкулезных аллерго-диагностикумов.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат изобретения получение охарактеризованного штамма, продуцента туберкулопротеинов обладающего стабильными культурально-морфологическим и антигенным свойствами, расширяющего арсенал штаммов паратуберкулеза - продуцентов туберкулопротеинов предназначенных для производства паратуберкулезных аллерго-диагностикумов.

Для получения паратуберкулезного аллерго-диагностикума предлагается новый хорошо изученный и охарактеризованный штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1402. Использование предложенного штамма при производстве аллергодиагностикума позволит достоверности повысить уровень выявляемость животных, инфицированных паратуберкулезом на территории страны.

Осуществление изобретения

Пример 1. Авторский штамм микроорганизма Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV.

1. Вид микроорганизма: Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, рода Mycobacterium paratuberculosis Mycobacterium, семейства Mycobacteriaceae, порядка Actynomycetales.

2. Штамм депонирован в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных», Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) 11.05.2023 г., под номером В-1402

3. Основание для депонирования: штамм микобактерий для производства диагностических и профилактических средств специфической профилактик паратуберкулеза у сельскохозяйственных животных. Штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV является продуцентом туберкулопротеинов.

4. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов по группам патогенности санитарных правил и норм САНПИН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» бактериальные агенты рода Mycobacterium spp. относятся к IV группе патогенности

5. Дата, источник и место выделения: штамм выделен в 2020 году в лаборатории хронических инфекций ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН от положительно реагирующей в РСК коровы из длительно неблагополучного по паратуберкулезу СПК «Нива» Юкаменского района, Удмуртской республики, авторами штамма.

6. Где идентифицирована культура: в лаборатории хронических инфекций авторами штамма ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН

7. Методы идентификации: штамм идентифицирован на основании изученных морфологических и физиологических свойств и молекулярно-генетических исследований в соответствии с микробиологическими определителями и генетической базой данных.

7.1. Проведено полногеномное секвенирование штамма Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV на платформе Illumina NovaSeq с использованием технологии парных прочтений. Биоинформатический анализ включал фильтрацию и тримминг прочтений с использованием программ fastqc (0.11.9) и trimmomatic (0.39). Сборка генома осуществлялась с помощью программы Unicycler (0.4.8). Полученные контиги проверялись на таксономическую принадлежность с помощью программ kraken2 (2.1.2) и blastn (2.5.0). Биоинформатический анализ подтвердил принадлежность вышеупомянутого штамма к виду Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.

8. Морфологические признаки: Макроморфологические признаки: на твердых питательных средах культура растет в виде мельчайших гладких, шаровидных, непигментированных колоний Микроморфологические признаки: Возбудитель паратуберкулеза - самая мелкая из микобактерий, тонкая полиморфная неподвижная палочка с закругленными концами, длиной 0,5 - 1,5 мкм, шириной 0,2 -0,5 мкм, спор и капсул не образует, грамположительна, кислото-спиртоустойчивая, хорошо окрашивается по Цилю-Нильсену.

8.1. Культуральные особенности: типичными для вида Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Культура штамма Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis плохо растет на искусственных питательных средах. Растет в аэробных условиях очень медленно, первичный рост появляется в промежуток времени от 8 -12 недель до 4 - 6 мес. на яичных и других специальных питательных средах (Левенштейна-Йенсена, модифицированная казеиновая среда Дюбо-Смита, среды Данкина, Гона, Ренжара и др.) с добавлением фактора роста - экстракта из М. phlei.

9. Дополнительные признаки: наличие хламидоспор, артроспор, склероциев и т.д. не выявлены.

10. Биохимические свойства: низкая катал азная активность, не восстанавливает нитраты, не обладает арилсульфатазной активностью, не вызывает гидролиз Твин 80, восстанавливает теллурит калия. Обладает никотинамидазной активностью.

11. Серологические свойства: положительная реакция в РСК с паратуберкулезным антигеном

12. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: в процессе роста в жидких питательных средах накапливается эндотоксическое вещество (паратуберкулин или йонин), вызывающее у зараженного животного аллергическую реакцию.

13. Вирулентность для лабораторных животных: отсутствует

14. Молекулярно-генетические характеристики штамма: Полногеномный проект штамма Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV депонирован в GenBank NCBI под номером JARWSH000000000; BioProject ID: PRJNA956706; BioSample: SAMN34228878; SUBID: SUB 12864032

15. Условия культивирования: Растет в аэробных условиях при температуре 37°С на яичных и других специальных питательных средах (Левенштейна-Йенсена, модифицированная казеиновая среда Дюбо-Смита, среды Данкина, Гона, Ренжара и др.) с добавлением фактора роста - экстракта из М. phlei.

16. Условия хранения: культуры штамма хранятся в лиофилизированном состоянии под вакуумом в ампулах или в пробирках на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением микобактина под ватно-марлевыми пробками, при температуре от 4 до 6°С. Периодичность пересевов из пробирок один раз в 6 месяцев, из ампул - один раз в 5 лет.

Пример 2. Получение туберкулопротеинов для диагностики паратуберкулеза.

Для получения туберкулопротеинов использовали: штаммы Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и штамм M. avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС, которые параллельно и раздельно культивировали на глицериново-картофельной среде, при температуре 39°С, в течение 30 суток. После окончания периода культивирования указанных микобактерий на глицериново-картофельной среде (вся поверхность картофельного клина покрыта сплошным слоем микобактерий) осуществляли два последовательных пересева колоний на мясо-пептонный глицериново-картофельный бульон (культивирование при температуре 39°С в течение 30 суток).

Второй пересев на мясо-пептонный глицериново-картофельный бульон характеризовался сплошной пленкой, который и использовали для посева на синтетическую среду. Культуры микобактерий штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и штамм M. avium subspecies, paratuberculosis №19698 АТСС характеризовались сплошным ростом на поверхности синтетической питательной среде (Культивирование при температуре 39°С в течение 55 суток в бутылях). После окончания периода культивирования штаммов микобактерий на синтетической среде, проводили стерилизацию посевов при температуре 120°С в течение 30 минут и последующим охлаждением до температуры 18-20°С, в течение 4 часов. Жидкость из бутылей фильтровали через фильтр-полотно получая культуральный фильтрат. Раздельно проводили обработку культурального фильтрата микобактерий Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и культурального фильтрата микобактерий М. avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС, согласно последовательности, представленной ниже. Обработка вариантов культурального фильтрата проводилась 50% раствором трихлоруксусной кислоты при перемешивании на мешалке в течение 5-10 минут, после чего проводили отстаивание в течение 16-18 часов при 4-6°С. В течение указанного периода происходило взаимодействие трихлоруксусной кислоты и протеинов культуральных фильтратов. После этого сливали надосадочную жидкость, а осадок (туберкулопротеин) центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 20-25 минут, с последующим удалением надосадочной жидкости. Полученный осадок вариантов туберкулопротеина растворяли дистиллированной водой из расчета 1:5 и подщелачивали 10% раствором нашатырного спирта до рН 7,2-7,4. Растворы туберкулопротеинов подкисляли 10% раствором уксусной кислоты до рН 4,0-5,0 и смешивали с равным количеством насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешивали три раза с интервалом 10-15 минут и отстаивали в течение 18 часов при 6°С. После этого проводили центрифугирование при 3000 об/мин. в течение 20-30 минут, надосадок сливали, а осадок растворяли в дистиллированной воде в соотношении 1:5. После этого подщелачивали 10% раствором нашатырного спирта до рН 7,4-7,6 и проводили диализ в проточной водопроводной воде в течение 4 суток, после этого подщелачивают до рН 7,2-7,4 10% раствором аммиака, центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 30 минут и фильтровали через стерилизующий фильтр. Таким образом, были получены растворы туберкулопротеинов микобактерий из Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и Micobacterium avium subspecies paratuberculosis штамм №19698 АТСС.

В полученных растворах определили концентрацию туберкулопротеинов. Биологическую активность туберкулопротеинов определяли по Международному стандарту ППД для птиц на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями птичьего типа.

Биологическая активность туберкулопротеина полученного из культурального фильтрата микобактерий Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV соответствовала 9000 МЕ/мл.

Биологическая активность туберкулопротеина полученного из культурального фильтрата микобактерий Micobacterium avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС соответствовала 8000 МЕ/мл.

Результаты, полученные при определении выхода туберкулопротеина с единицы среды и его специфическая активность представлена в таблице 1

На основании проведенных исследований сделано заключение, что выход туберкулопротеинов - ионинов с единицы среды, изготовленных из Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV выше, чем у штамма Micobacterium avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС.

Полученные растворы туберкулопротеинов разводили растворителем для микобактериальных аллергенов до стандартной рабочей концентрации (2500МЕ) помещали во флаконы, закрывали резиновыми пробками и закатывали алюминиевыми колпачками, и стерилизовали при температуре 120°С в течение 30 минут. После охлаждения до температуры 20°С растворы туберкулопротеинов использовали для оценки и сравнения их специфической активности на морских свинках.

Пример 3. Сравнение биологической активности туберкулопротеинов полученных из штаммов Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и Micobacterium avium subspecies paratuberculosis №19698 ATCC.

Активность микобактериальных аллергенов осуществлялось на морских свинках. Морских свинок весом 350-400 грамм сенсибилизировали культурой М. paratuberculosis в ланолин-вазелиновом адъюванте. Культуру вводили подкожно в область холки и крестца из расчета 0,5 см³ адъюванта, содержащего 5 мг микобактерий.

Определение специфической активности осуществлялось через 35 дней после сенсибилизации. У сенсибилизированных и контрольных свинок боковые поверхности справа и слева депилировали и внутрикожно в объеме 0,1 см³ инъецировали туберкулопротеины, справа полученные из штамма Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV, а слева из штамма Micobacterium avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС. Результаты учитывали через 24 часа после введения аллергенов.

Как видно из таблицы 1, что накопление туберкулопротеинов полученных при культивировании Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV и их биологическая активность выше, чем при использовании штамма Micobacterium avium subspecies paratuberculosis №19698 АТСС.

Полученные данные характеризуют штамм Micobacterium avium subspecies, paratuberculosis VIEV, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных Федерального научного центра - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук под номером В-1402 как продуцента туберкулопротеинов пригодных для получения аллергодиагностикума.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV, обладающий повышенной способностью накопления туберкулопротеинов с повышенной биологической активностью, депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1402. Изобретение обеспечивает расширение арсенала штаммов - продуцентов туберкулопротеинов, предназначенных для производства паратуберкулезных аллергодиагностикумов. 1 табл., 3 пр.

Штамм Micobacterium avium subspecies paratuberculosis VIEV, предназначенный для получения туберкулопротеинов, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1402.