Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, в частности, к способу получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных.
Паратуберкулез - хроническое инфекционное заболевание жвачных животных, распространенное во всем мире, в т.ч. в странах с высокоразвитым животноводством.
Клиническое проявление болезни (диарея, истощение) имеет место в 2 - 5% случаев заболевания. Чаще наблюдается бессимптомная форма течения болезни, которая может длиться годами.
Для правильной постановки диагноза необходимо проведение комплексного исследования с использованием аллергического, паталогоанатомического, бактериологического и серологического методов.
Известны антигены для выявления гуморальных антител в сыворотке крови больных паратуберкулезом животных в реакции связывания комплемента (РСК), а также в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД).
Известен способ получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных, включающий получение бактериальной массы из штамма микобактерий паратуберкулеза N 18 (Вейбриджская коллекция штаммов микроорганизмов), механическое ее разрушение, удаление клеточного детрита центрифугированием и высушивание супернатанта (1).
Недостатком данного антигена является невысокая его чувствительность ввиду того, что для получения препарата используется грубое механическое разрушение бактериальной массы (посредством механического пресса), что ведет к значительной потере серологически активных компонентов. Кроме того, для получения антигена используется не свежевыделенный изолят, а штамм, длительно поддерживаемый в лабораторных условиях, что привело к изменению некоторых его биологических свойств.
Известен также способ получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных, включающий получение бактериальной массы из штаммов микобактерий паратурберкулеза II-V N106 и Teps N 105 (Вейбриджская коллекция штаммов микроорганизмов), путем выращивания их на среде Рейда в течение 45 - 60 суток, ее фильтрацию, отмывку от остатков среды дистиллированной водой, концентрацию путем центрифугирования при 2000 - 3000 об/мин в течение 15 мин, обработку ацетоном, диализ, добавление мертиолята 1:5000, последующую дезинтеграцию ультразвуком в течение 30 мин, осаждение клеточного детрита путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 30 мин, отделение супернатанта с содержанием 3,5 - 7 мг/см3 протеина и лиофильное высушивание целевого продукта (2).
Недостатком данного способа является невысокая чувствительность получаемого антигена из-за его использования в РСК, а также его низкая специфичность ввиду того, что до 50% реакций у животных являются ложноположительными (неспецифическими).
Данный способ является, кроме того, трудоемким по получению целевого продукта.
Целью изобретения является повышение эффективности антигена для диагностики паратуберкулеза в реакции иммунодиффузии, а также снижение затрат по его получению.
Указанная цель достигается тем, что получение бактериальной массы осуществляют из штамма Mycobacterium paratuberculosis ВГНКИ "КА" ДЕП, который выращивают на среде Ватсона-Рейда в течение 28 - 35 суток, после отмывки дистиллированной водой бактериальную массу суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 70 - 90 мг/см3, дезинтегрируют при 22 кГц в течение 15 - 16 мин, осаждают клеточный детрит центрифугированием при 16 - 20 тыс. об/мин в течение 30 - 50 мин, после отделения супернатант консервируют тиомерсалом из расчета 1:10000.
Новый штамм Mycobacterium paratuberculosis получен из изолята, выделенного из организма больной паратурберкулезом козы. Штамм путем перемежающихся посевов и последовательных пассажей адаптирован к росту на жидкой синтетической среде Ватсона-Рейда.
Штамм M. paratuberculosis депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный номер "КА" - ДЕП.
Штамм M. paratuberculosis ВГНКИ "КА"-ДЕП характеризуется следующими признаками и свойствами.
По своим таксономическим признакам штамм ВГНКИ "КА"-ДЕП является типичным представителем вида M. paratuberculosis (Берги, 1988).
Морфологические признаки. При окраске по методу Циля-Нильсена в мазках - мелкие прямые или слегка изогнутые рубиново-красные палочки с 1-2 гранулами, собранные в кучки или лежащие изолированно, длиной 1-2 мкм и шириной 0,3 - 0,5 мкм.
Культуральные свойства. На элективных яичных средах (Левенштейна-Иенсена, Геррольда, Финна-2) с микобактином на 14 - 16 сутки инкубации при 37 - 38oC образует полусферические колонии серо-белого цвета. На этой же среде без обогащения микобактином рост отсутствует.
Добавление дополнительно в среду Левенштейна-Иенсена с микрбактином натрия салицилата в количестве 1 мг/см3, тубазида из расчета 5 мкг/см3, стрептомицина и этамбутола в количестве 1 мкг/см3 и 50 мкг/см3 соответственно не ингибирует роста штамма ВГНКИ "КА". Характер роста и морфология колоний на среде Левенштейна-Иенсена с указанными лекарственными средствами идентичны росту на среде Левенштейна-Иенсена с микобактином.
Ферментативные свойства. Штамм ВГНКИ "КА" не редуцирует нитраты в нитриты. Под действием специальных реактивов окраска раствора не меняется. Вызывает гидролиз Твина-80. Под действием энзимов изменяется окраска субстрата из янтарной в розово-красную. Каталазная активность 16 - 20 мм.
Серологические свойства. Штамм ВГНКИ "КА" в РИД с гипериммунными кроличьими сыворотками к штамму "КА" образует 4 полосы преципитации, а с антисыворотками к штаммам микобактерий паратуберкулеза, выделенных от крупного рогатого скота, - три полосы преципитации.
Вирулентные свойства. У хомяков и белых мышей вызывает массивную бактериальную диссеминацию паренхиматозных органов и кишечника.
Пример 1
Штамм M. paratuberculosis ВГНКИ "КА" культивируют в жидкой синтетической среде Ватсона-Рейда при 37 - 38oC в течение 28 - 35 суток. Бактериальную массу отмывают на бумажном фильтре от остатков среды 2-3 раза дистиллированной водой. После отмывки бактериальную массу суспендируют в стерильном физиологическом растворе до концентрации 70 мг/см3 и подвергают дезинтеграции ультразвуком при 22 кГц в течение 15 мин. После дезинтеграции ультразвуком проводят осаждение клеточного детрита центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30 мин и отделяют супернатант, содержащий антиген с концентрацией белка 1,5 мг/см3. Перед расфасовкой и укупоркой в готовый препарат вносят консервант тиомерсал из расчета 1:10000.
Пример 2
Антиген готовят аналогично примеру 1. Отмытую дистиллированной водой бактериальную массу из штамма M. paratuberculosis ВГНКИ "КА" суспендируют в стерильном физиологическом растворе до концентрации 80 мг/см3 и подвергают дезинтеграции ультразвуком в течение 16 мин. Осаждение клеточного детрита проводят центрифугированием при 18000 об/мин в течение 40 мин и отделяют супернатант, содержащий антиген с концентрацией белка 1,6 мг/см3.
Пример 3
Антиген готовят аналогично примеру 1. Отмытую дистиллированной водой бактериальную массу из штамма M. paratuberculosis ВГНКИ "КА" суспендируют в стерильном физиологическом растворе до концентрации 90 мг/см3 и подвергают дезинтеграции ультразвуком в течение 16 мин. Осаждение клеточного детрита проводят центрифугированием при 20000 об/мин в течение 50 мин и отделяют супернатант, содержащий антиген с концентрацией белка 1,8 мг/см3.
Готовый антиген представляет собой жидкость желтоватого цвета с легкой опалесценцией.
Антиген сохраняет свои серологические свойства в течение 24 мес. хранения в сухом темном месте при температуре 2 - 8oC.
Пример 4
Изучают активность 3-х вариантов полученного антигена в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) с сыворотками крови больных паратуберкулезом животных. Реакцию ставят в чашках Петри (d = 100 мм). Чашки расставляют на строго горизонтальной поверхности и в каждую вносят по 16 см3 расплавленного агара. Оставляют при комнатной температуре до полного застывания его. Штампом пробивают в агаре лунки с одной центральной и шестью, рапсоложенными по периферии. Кусочки геля из лунок удаляют с помощью водоструйного насоса или препаровальной иглой. На одной чашке размещают 6 фигур для исследования 36 проб сывороток.
В центральную лунку вносят антиген по примеру 1, 2 или 3, в периферические-испытуемые сыворотки. Исследуют 18 сывороток крови крупного рогатого скота, 39 сывороток крови овец и 59 сывороток крови коз из хозяйств, неблагополучных по паратуберкулезному энтериту. В одной чашке ставят контроль с положительной паратуберкулезной гипериммунной кроличьей сывороткой (референс-сыворотка). Чашки Петри закрывают крышками и оставляют при температуре не ниже 20oC.
Учет реакции проводят визуально при дневном свете или с помощью осветителя ОИ-19. Образование одной или нескольких полос преципитации между центральной лункой с антигеном и периферическими лунками с испытуемыми сыворотками через 18 - 48 часов после постановки реакции свидетельствует о положительной реакции. При отсутствии в контроле с референс-сывороткой линии преципитации результаты РИД с испытуемыми сыворотками не подлежат оценке.
При получении положительных результатов в РИД животное признают инфицированным возбудителем паратуберкулеза.
Устанавливают в РИД активность всех трех полученных антигенов с исследуемыми сыворотками животных и равнозначное количество положительно реагирующих сывороток крови животных с каждым из антигенов.
Регистрируют с положительными реакциями в РИД: 10 из 18 сывороток крови крупного рогатого скота, 21- из 39 сывороток овец и 33 из 59 сывороток крови коз. Таким образом, признают 55,6% коров, 53,8% овец и 55,9% коз от исследованного поголовья, инфицированными возбудителем паратуберкулеза в хозяйствах, неблагополучных по этому заболеванию.
Пример 5
Изучают специфичность антигена в РИД по примеру 1 в отношении близкородственных возбудителей - микобактерий туберкулеза бычьего вида.
Аналогично, как в примере 4 исследуют в РИД 50 сывороток крови крупного рогатого скота из туберкулезного изолятора и 20 сывороток крови от животных, имеющих туберкулезные поражения в органах на вскрытии.
Исследуемый антиген со всеми сыворотками не образует линий преципитации, что говорит об отрицательной РИД и специфичности антигена.
Пример 6
Изучают специфичность полученного антигена в РИД по примеру 3 с гипериммунными сыворотками против бруцеллеза (13 проб), псевдотуберкулеза, кампилобактериоза, лептоспироза (по 4 пробы каждой сыворотки), иерсиниоза (2 пробы). Со всеми сыворотками исследуемый антиген в РИД не образует линий преципитации, что подтверждает его специфичность.
Пример 7
Изучают диагностическую эффективность полученного антигена по примеру 2 и коммерческого антигена СибНИВИ.
Аналогично, как в примере 4, исследуют в РИД 18 сывороток крови крупного рогатого скота, 38 сывороток крови овец и 91 сыворотку коз, полученных из хозяйств, неблагополучных по паратуберкулезному энтериту. Одновременно, все полученные сыворотки исследуют в РСК с коммерческим антигеном СибНИВИ. Результаты сравнительных исследований сывороток крови на паратуберкулез представлены в таблице.
Из таблицы видно, что предлагаемый антиген значительно превосходит по своей активности известный препарат и выявляет в 1,4 - 9,8 раз больше больных животных, чем производственный антиген СибНИВИ.
Таким образом, заявляемый антиген является активным и специфичным препаратом.
Использование РИД с предлагаемым антигеном доступно любой ветеринарной лаборатории, т. к. не требует специального оборудования и высококвалифицированного персонала.
Способ является простым, наглядным, быстрым и дешевым.
РИД с разработанным антигеном может быть применена непосредственно в полевых условиях (на ферме, в отарах).
Использование для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных более совершенного метода позволит своевременно и эффективно проводить комплекс мероприятий по борьбе с паратуберкулезом, что значительно сократит экономический ущерб от этого заболевания.
Источники информации:
1. D.M. Sherman, K.J.F.Markham, F.Bates "Agar del immunodifusion testfor diagnosis et clinical paratuberculosis in cattle" J.Amer Veter Med. Association (AVMA), 1984, 185, N 2 p. 179 - 182
2. Патент Румынии N 81670, кл. A 61 K 39/02, 19833
Способ предназначен для получения антигена из штамма Mycobacterium paratuberculosis ВГНКИ"КА"-ДЕП. Штамм культивируют в среде Ватсона-Рейда в течение 28 - 35 суток. Выращенную бактериальную массу отмывают дистиллированной водой, суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 70 - 90 мг/см3 и дезинтегрируют ультразвуком при 22 кГц в течение 15 - 16 мин. Отделяют клеточный детрит центрифугированием при 16 - 20 тыс. об/мин в течение 50 минут. Супернатант концентрируют тиомерсалом из расчета 1:10000. Способ позволяет получить более активный и специфичный антиген, использовать для диагностики паратуберкулеза жвачных животных в РИД. Применение РИД с полученным антигеном позволит выявлять в 1,4-9,8 раз больше больных животных, чем РСК. Проведение диагностики заболевания является простым, наглядным, быстрым и дешевым. 1 табл.
Способ получения антигена для серологической диагностики паратуберкулеза у жвачных животных, включающий культивирование штамма бактерий Mycobacterium paratuberculosis в питательной среде, отмывку бактериальной массы дистиллированной водой с последующей ее дезинтеграцией ультразвуком, осаждением клеточного детрита центрифугированием и отделением супернатанта, отличающийся тем, что используют штамм Mycobacterium paratuberculosis ВГНКИ "КА"-ДЕП, который культивируют в среде Ватсона-Рейда в течение 28 - 35 суток, после отмывки дистиллированной водой полученную бактериальную массу суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 70 - 90 мг/см3, дезинтеграцию ультразвуком проводят при 222 кГц в течение 15 - 16 мин, осаждение клеточного детрита центрифугированием осуществляют при 16000 - 20000 об/мин в течение 30 - 50 мин, после отделения супернатант консервируют тиомерсалом из расчета 1 : 10000.
| D.M | |||
| Sherman, K.J.F | |||
| Markman, F.Bates Agas del immunodifusion test for diagnosis et clunical paratuberculosis in cattle AVMA, 1984, 185, N 2, р.179 - 182. |
