Способ регенерации клеток головного мозга с восстановлением его функций Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61K35/26 G01N33/48 G09B23/28 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к невропатологии, и может быть использовано для восстановления ткани и функций головного мозга при черепно-мозговой травме у позвоночных.

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) составляет от 40 до 55% от всех травматических повреждений. Доказано, что важным звеном патогенеза ЧМТ являются вегетативные, эндокринные, в частности, гипофизарно-надпочечниковые и иммунные, нарушения обусловленные морфологическими и функциональными изменениями неспецифических систем головного мозга (Дизрегуляция вегетативной, гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем у пациентов с тяжелой ЧМТ. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2013. - Т. 113. - №. 2. - С.4-8). Эти нарушения могут быть как компенсированными, так и некомпенсированными, обратимыми и необратимыми, чем в большой мере и определяется прогноз заболевания, в частности, его смертельный исход.

Нейровоспаление является одним из основных компонентов патофизиологии ЧМТ и вносит вклад как в формирование вторичных повреждений, так и в механизмы восстановления. Воспалительный ответ, возникающий на первичное повреждение мозга, сопровождается высвобождением большого числа регуляторных пептидов: цитокинов (провоспалительного и противовоспалительного характера), оксида азота, протеаз, эйкозаноидов, лизоцима и др. В разные фазы воспалительного процесса меняются типы клеточных взаимодействий и приоритетная роль переходит от одних субпопуляций клеток к другим. При этом каждый из этапов подготавливает и запускает следующий, определяя интенсивность его реализации. Цитокины синтезируются нейронами, активированной макро- и микроглией, клетками поврежденного эндотелия сосудов, а также клетками иммунной системы, мобилизованными из общей циркуляции к очагу повреждения и в соседние с ним области вследствие изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера. Причем, выделяемые на ранней стадии иммунного ответа цитокины, могут служить критерием, по которому можно определить тип последующего иммунного ответа (Мамытова Э. М. Особенности иммунного статуса в остром периоде черепно-мозговой травмы //Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2013. - №. 4. - С.57-61).

Известен способ снижения системного уровня регуляторных Т-клеток или их активности для лечения заболеваний и травм центральной нервной системы, при котором вводят активный агент, который вызывает снижение уровня системной иммуносупрессии путем снятия ограничения, налагаемого на иммунную систему одной или несколькими иммунными контрольными точками. Активный агент вводится с помощью режима дозирования, включающего, по меньшей мере два сеанса лечения, а упомянутая иммунная контрольная точка (несколько точек) выбирается из группы, состоящей из ICOS-B7RP1, lg-супрессора активации Т- клеток V-домена (VISTA), В7-CD28-подобной молекулы, CD40L-CD40, CD28-CD80, CD28-CD86, В7Н3, В7Н4, В7Н7, BTLA-HVEM, CD137-CD137L, OX40L, CD27-CD70, стимулятора генов интерферона (STING), ингибиторного мотива домена (иммуноглобулина и иммунорецептора Т-клеток на основе тирозина (TIGIT), а также A2aR-аденозина и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO)-L-триптофана (RU 2018104962, A61K 39/395, 2019).

Недостатком данного способа является системное многократное введение в организм мощных иммуностимуляторов, имеющих серьезные побочные эффекты на все органы и ткани организма пациента.

Известен способ оказания нейропротекторного действия на популяцию клеток у субъекта после травматического повреждения центральной нервной системы. В частности, способы по изобретению предусматривают введение прогестина или метаболита прогестина после черепно-мозговой травмы. Прогестин или метаболит прогестина вводят в терапевтически эффективных концентрациях, которые оказывают нейропротекторное действие (US 2002072509, A61K 31/57, 2002).

Недостатком данного способа является системное введение в организм прогестина, являющегося женским гормоном и оказывающим серьезное побочное действия на все органы и ткани организма пациентов как женского так и мужского пола.

Установлено, что D-серин эффективен для ингибирования потери нейронов из-за иммунного ответа глиальных клеток на повреждение головного мозга. Способ включает искусственное введение композиции, содержащей D-серин, в клетки головного мозга после их повреждения, при этом композиция включает количество D-серина, эффективное для ингибирования гибели нейронов (US 2020289449, A61K 31/198, 2020).

Недостатком данного способа является необходимость введения в организм D-серина, D-аминокислоты, нефизиологичной для тканей за пределами гематоэнцефалического барьера.

Известно изобретение, направленное на лечение черепно-мозговой травмы путем введения клеток, которые обладают одним или несколькими из следующих эффектов у травмированного субъекта: взаимодействуют со спленоцитами, сохраняют массу селезенки, увеличивают пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, повышают уровень IL-4 и IL-10 и увеличивают соотношение макрофагов М2:М1 в месте повреждения. Изобретение также направлено на способы открытия лекарств для скрининга агентов, которые модулируют способность клеток оказывать эти эффекты. Изобретение также относится к банкам клеток, которые можно использовать для получения клеток для введения субъекту, при этом банки содержат клетки, обладающие желаемой эффективностью для достижения этих эффектов (US 2016256502, A61K 35/28, 2016).

Недостатком данного способа является использование различных субпопуляций иммунных клеток сложно поддающихся стандартизации и контролю, а также необходимость длительной криоконсервации данных клеток, которая может влиять на их жизнеспособность и следовательно эффективность самой процедуры.

Известно применение композиций, содержащих кофеин, для стимулирования восстановительных процессов в различных тканях.

Например, известно применение питательной композиции для перорального введения, содержащей кофеин и углевод для увеличения скорости ресинтеза мышечного гликогена. Предложен также способ активации ресинтеза мышечного гликогена после интенсивной физической нагрузки, истощающей запасы гликогена, включающий прием композиции, содержащей кофеин и гликоген. Изобретение позволяет быстро восстановить запасы мышечного гликогена за счет повышения скорости его ресинтеза в первые часы после окончания физической нагрузки (RU 2438355, A23L 1/30, 2012).

Известна композиция, повышающая переносимость пациентом визуализации миокарда и содержащей кофеин, регаденозон и, по меньшей мере, один фармацевтический наполнитель, и к применению указанной фармацевтической композиции, где кофеин вводят пациенту одновременно с регаденозоном, до введения регаденозона или в виде одной фармацевтической композиции. Изобретение также относится к применению кофеина, радионуклида и регаденозона для повышения переносимости пациентом индуцируемой вазодилататором стрессовой визуализации миокардиальной перфузии у человека, где исследование миокарда проводят путем определения площадей недостаточного кровотока после введения радионуклида и регаденозона. Изобретение также относится к применению однократного в/в болюсного вливания кофеина и регаденозона для повышения переносимости пациентом индуцируемой вазодилататором стрессовой визуализации миокардиальной перфузии у человека (RU 2459626, А61К 31/7076, 2012).

Наиболее близким к заявляемому, является способ стимуляции нейрогенеза в гиппокампе при депрессивноподобных состояниях у млекопитающих. Способ включает забор зрелых периферических иммунных клеток у млекопитающего в депрессивноподобном состоянии, клетки подвергают in vitro экспозиции с кофеином либо фармакологически активными солями кофеина в действующих концентрациях 100-500 мкг на 15×10⁶ клеток в течение 10-25 минут. Затем отмывают клетки от препарата кофеина и вводят в кровоток млекопитающего в депрессивноподобном состоянии. Использование изобретения позволяет стимулировать нейрогенез в гиппокампе без непосредственного введения кофеина в организм. В качестве солей кофеина используют гидрохлорид кофеина, сульфат кофеина, кофеина натрия бензоат и другие водорастворимые соли (RU 2675111, А61К 35/28, 2018).

Особенностью способа является таргетная стимуляция нейрогенеза в гиппокампе, тогда как при ЧМТ локализация повреждений может оказаться значительно шире.

Задачей данного изобретения является ускорение регенерации клеток головного мозга с восстановлением его функций при ЧМТ у позвоночных.

Указанная задача решается тем, что в способе регенерации клеток головного мозга с восстановлением его функций при закрытой черепно-мозговой травме с применением кофеина, забор зрелых периферических иммунных клеток производят у зебраданио с закрытой черепно-мозговой травмой, затем клетки подвергают in vitro экспозиции с кофеином в действующих концентрациях 150-450 мкг/мл 20-25 минут, затем отмывают от кофеина и вводят отмытые клетки в кровоток зебраданио с закрытой черепно-мозговой травмой в дозе 80×10³ клеток на особь.

Предложенное изобретение, на наш взгляд, является новым. Существенным отличием от прототипа является то, что в прототипе используются иммунокомпетентные клетки от млекопитающего в состоянии стресс-индуцированной депрессии, сопровождающейся, как известно, нейровоспалением и нейродегенерацией, преимущественно наблюдаемой в гиппокампе, а также системным хроническим низкоградиентным воспалением. В предложенном способе используются иммунокомпетентные клетки от особи (зебраданио) после острой ЧМТ. В способе-прототипе клетки обладают спектром функциональной активности, характерной для хронического воспаления. Существенные признаки изобретения направлены на решение вышеуказанной задачи, т.к.внутривенное введение зебраданио при ЧМТ прекультивированных определенным способом с кофеином зрелых периферических иммунных клеток способствует у реципиентов образованию новых нейронов в месте повреждения, снижению уровня тканевой гипоксии, увеличению продукции медиаторов тканевой репарации и нормализации поведенческих показателей, свидетельствующих о позитивном патогенетическом эффекте модулированных кофеином иммунных клеток, направленном на ускорение регенерации клеток головного мозга с восстановлением его функций после ЧМП.

Изобретение позволяет провести направленное воздействие на функциональную активность периферических зрелых иммунных клеток in vitro кофеином в супрафизиологических концентрациях, не подвергая негативному избыточному стрессу остальные системы организма, а затем воздействовать модулированными кофеином сингенными иммунными клетками после их внутривенного введения на процессы восстановления головного мозга при закрытой ЧМТ.

Ранее нами была продемонстрирована способность иммунных клеток (спленоцитов), прекультивированных с кофеином позитивно влиять на процессы нейродегенерации и нейровоспаления в организме позвоночных (Маркова Е.В. Иммунокомпетентные клетки и регуляция поведенческих реакций в норме и патологии. Монография/ Красноярск: Научно-инновационный центр, 2021. - 184 с; E.V. Markova, М.А. Knyazheva, М.А. Tikhonova, T.G. Amstislavskaya. Structural and functional characteristics of the hippocampus in depressive-like recipients afte r transplantation of in vitro caffeine-modulated immune cells. Neuroscience Letters, 2022, 786, 136790. doi.org/10.1016/j.neulet.2022.136790). При разработке данного способа в результате многочисленных экспериментов был установлен действующий диапазон концентраций кофеина (150-450 мкг/мл),необходимых для модуляции функциональной активности иммуноцитов, и дозу вводимых отмытых от кофеина клеток (80×10³ клеток на особь) в кровоток зебраданио с закрытой ЧМТ.

В приведенных ниже примерах использовали гипопигментированных зебраданио после закрытой ЧМТ, вызванной направленным лазерным излучением, по оригинальной методике. Рыбок зебраданио анестезировали и помещали в лазерную установку. Для облучения рыбок использовали лазерный диод с длиной волны 405 нм. Лазер включали на малую мощность и лазерное излучение фиксировалось на мишени-конечном мозге рыбок зеброданио. Прозрачная кожа и череп рыбьей головы позволили сфокусировать лазерное излучение на глубоких слоях тканей - головном мозге- без повреждения поверхности черепа. Данная методика позволяет локализовать повреждение и варьировать повреждение нервной ткани, изменяя мощность лазера и продолжительность лазерного излучения (Tikhonova MA, Maslov N.A., Bashirzade, A. A., NehoroshevE.V., Babchenko V.Y., Chizhova N.D., Tsibulskaya E.O., Akopyan A.A., Markova E.V.,Yang Y-L., Lu K-T., Kalueff A.V., Aftanas LI., Amstislavskaya T.G. A Novel Laser-Based Zebrafish Model for Studying Traumatic Brain Injury and Its Molecular Targets. Pharmaceutics. - 2022. - Vol.14. - Iss. 8. - 1751; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14081751).

Восстановление функций головного мозга оценивали по показателям поведения у животных после трансплантации иммуноцитов в тесте нового аквариума и уровню нейровоспаления в мозге методом иммуногистохимического анализа с применением специфичных антител против микроглиального маркера Iba1. Регенерацию клеток головного мозга, а именно восстановление и регенерацию нейронов; снижение гипоксии головного мозга оценивали в приведенных ниже тестах. Уровень восстановления нейронов оценивали по экспрессии в клетках специфического маркера вновь образованных нейронов - NeuN. Регенерацию нейронов оценивали по уровню экспрессии Bdnf в головном мозге, белок Bdnf - нейротрофический фактор роста, участвует в развитии, дифференцировке, синаптогенезе и выживании нейронов головного мозга, а также в процессах их адаптации к внешним воздействиям. Уровень гипоксии клеток головного мозга оценивали по экспрессии Hif1a, индуцируемого гипоксией, основного транскрипционного фактора ответа клетки на гипоксию с применением специфичных антител.

Восстановление указанных параметров у зебраданио после ЧМТ без каких-либо воздействий регистрируется не ранее 7-х суток после ЧМТ (Tikhonova М.А., Maslov N.A., Bashirzade, A. A., NehoroshevE.V, BabchenkoVY., ChizhovaN.D., TsibulskayaE.O., AkopyanAA, MarkovaE.V.,YangY-L, LuK-T., KalueffA.V, AftanasL.I., Amstislavskaya, T. G.A Novel Laser-Based Zebrafish Model for Studying Traumatic Brain Injury and Its Molecular Targets. Pharmaceutics. - 2022. - Vol.14. - Iss. 8. - 1751; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14081751).

Приведенные примеры 1.1 - 2.3 иллюстрируют более быстрое восстановление функций мозга; примеры 3.1 - 5.3 -более быструю регенерацию клеток головного мозга после ЧМТ.

Пример 1.1.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на поведение реципиентов у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ, обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 150 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанной концентрации спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток по поведению в тесте нового аквариума; редукцию размерности полученных поведенческих показателей проводили при помощи нелинейного метода понижения размерности, классификатора «случайный лес» (Breiman, L. RandomForests. Machine Learning 2001, v. 45, p.5-32.); сравнение полученного интегрального показателя поведения, включающего 15 параметров, проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 1.1.

Пример 1.2.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на поведение реципиентов у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 300 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток по поведению в тесте нового аквариума; редукцию размерности полученных поведенческих показателей проводили при помощи нелинейного метода понижения размерности, классификатора «случайный лес» (Breiman, L. Random Forests. Machine Learning 2001, v. 45, p.5-32.); сравнение полученного интегрального показателя поведения, включающего 15 параметров, проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 1.2.

Пример 1.3.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на поведение реципиентов у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 450 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток по поведению в тесте нового аквариума; редукцию размерности полученных поведенческих показателей проводили при помощи нелинейного метода понижения размерности, классификатора «случайный лес» (Breiman, L. Random Forests. Machine Learning 2001, v. 45, p.5-32.); сравнение полученного интегрального показателя поведения, включающего 15 параметров, проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 1.3.

Данные примеры показывают ускорение восстановления поведенческих реакций за счет стимуляции поведенческой активности у рыб зебраданио начиная с первых суток после травмы в результате введения спленоцитов, прекультивированных с дозами кофеина в диапазоне концентраций 150 мкг/мл - 450 мкг/мл.

Пример 2.1.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень нейровоспаления в головного мозге у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 150 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С. Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера Iba1 В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 2.1.

Пример 2.2.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень нейровоспаления в головного мозге у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 300 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (вретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40)в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера Iba1. B качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 2.2.

Пример 2.3.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень нейровоспаления в головного мозге у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 450 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера Iba1. B качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 2.3.

Данные примеры показывают ускореннное снижения нейровоспаления у рыб зебраданио, начиная с первых суток после травмы в результате введения спленоцитов, прекультивированных с дозами кофеина в диапазоне концентраций 150 мкг/мл - 450 мкг/мл.

Пример 3.1.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию Bdnf у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся, скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 150 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Bdnf. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 3.1.

Пример 3.2.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию Bdnf у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 300 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ(экспериментальная группа:n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.С.Т. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С. Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Bdnf. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 3.2.

Пример 3.3.

Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию Bdnf у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 450 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (SakuraFinetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et at., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Bdnf. B качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 3.3.

Данные примеры показывают полное восстановление уровня экспрессии нейротрофического фактора роста Bdnf в головном мозге рыб зебраданио на 3 сутки после травмы в результате введения спленоцитов, прекультивированных с дозами кофеина в диапазоне концентраций 150 мкг/мл - 450 мкг/мл.

Пример 4.1.

Образование новых нейронов после ЧМТ оценивали с помощью окрашивания срезов головного мозга антителами к специфическому нейрональному маркеру NeuN. Вновь образованные нейроны были идентифицированы как NeuN-положительные клетки. Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию NeuN у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 150 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера NeuN. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 4.1.

Пример 4.2

Образование новых нейронов после ЧМТ оценивали с помощью окрашивания срезов головного мозга антителами к специфическому нейрональному маркеру NeuN. Вновь образованные нейроны были идентифицированы как NeuN-положительные клетки. Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию NeuN у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 300 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера NeuN. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 4.2.

Пример 4.3.

Образование новых нейронов после ЧМТ оценивали с помощью окрашивания срезов головного мозга антителами к специфическому нейрональному маркеру NeuN.

Вновь образованные нейроны были идентифицированы как NeuN-положительные клетки. Для оценки влияния трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на экспрессию NeuN у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 450 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против микроглиального маркера NeuN. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 4.3.

Данные примеры показывают увеличение количества вновь образованных нейронов в головном мозге рыб зебраданио на 3 сутки после травмы после введения спленоцитов, прекультивированных с дозами кофеина в диапазоне концентраций 150 мкг/мл - 450 мкг/мл.

Пример 5.1.

Влияние трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень гипоксии клеток головного мозга оценивали по экспрессии Hif1a. Для этого у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 150 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С. Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Hif1a. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 5.1.

Пример 5.2.

Влияние трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень гипоксии клеток головного мозга оценивали по экспрессии Hifla. Для этого у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 300 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Hif1a. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 5.2.

Пример 5.3.

Влияние трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на уровень гипоксии клеток головного мозга оценивали по экспрессии Hif1a. Для этого у зебраданио с ЧМТ в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки и помещали во флакон с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 минут при 150д. Находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI-1640.

Клетки селезенки, выделенные у рыб с ЧМТ обрабатывали in vitro кофеином в концентрации 450 мкг/мл в течение 25 минут, после чего спленоциты 3-кратно отмывали от кофеина и ресуспензировали в среде RPMI-1640. Прекультивированные с кофеином в указанных концентрациях спленоциты вводили внутривенно (в ретроорбитальный синус) зебраданио с ЧМТ (экспериментальная группа: n=40) в количестве 80×10³ клеток на одну особь. В качестве групп сравнения использовали группу интактных животных и группу животных с ЧМТ (n=40 в каждой группе). Рыб в каждой группе умерщвляли после холодовой анестезии с последующей декапитацией спустя 1 и 3 сутки после нанесения травмы. Головы фиксировали в течение 24 ч при 4°С в свежем забуференном 10% формалине. Далее вынимали мозг и дофиксировали его в течение последующих 24 ч. После фиксации и промывки в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) образцы головного мозга замораживали в среде для заливки Tissue-Tek О.СТ. (Sakura Finetek, США) и хранили при температуре -70°С Криосрезы толщиной 30 мкм получали с использованием криотома HistoSafeMicroCut - SADV (Китай). Срезы помещали на покрытые желатином стекла. Иммуногистохимический анализ проводили согласно описанной методике (Tikhonova et al., 2020, doi: 10.3390/nu12123877) при помощи моноклональных антител против маркера Hif1a. В качестве групп сравнения использовали интактных животных и животных с ЧМТ. Эффект клеточной терапии оценивали на 1 и 3 сутки после введения клеток; сравнение полученного показателя проводили при помощи U-критерия Манн-Уитни. Результаты представлены в таблице 5.3.

Данные примеры показывают снижение уровня гипоксии в головном мозге рыб зебраданио уже на 1 сутки после травмы в результате введения спленоцитов, прекультивированных с дозами кофеина в диапазоне концентраций 150 мкг/мл -450 м кг/мл.

Результаты показывают позитивное влияние трансплантации прекультивированных с кофеином спленоцитов на функции головного мозга (ускорение восстановления поведенческих реакций, снижения нейровоспаления), ускоренную регенерацию клеток головного мозга с более быстрым снижением гипоксии головного мозга при ЧМТ. Предложенное изобретение позволяет исключить непосредственное введение в организм животного химических веществ, в частности кофеина, которые воздействуют на все органы и ткани организма. Обработка периферических зрелых иммунных клеток кофеином in vitro, а затем внутривенное введение модулированных кофеином сингенных иммунных клеток ускоряет восстановительные процессы после ЧМТ. Таким образом, изобретение позволяет получить стимулирующий эффект кофеина на регенерацию клеток и ткани головного мозга без непосредственного введения кофеина в организм.

Изобретение относится к медицине, а именно к невропатологии. Забор зрелых периферических иммунных клеток производят у зебраданио с закрытой черепно-мозговой травмой (ЧМТ). Затем клетки подвергают in vitro экспозиции с кофеином в действующих концентрациях 150-450 мкг/мл в течение 20-25 минут. Отмывают от кофеина и вводят отмытые клетки в кровоток зебраданио с закрытой черепно-мозговой травмой в дозе 80×10³ клеток на особь. Способ позволяет исключить непосредственное введение в организм животного кофеина, который воздействует на все органы и ткани организма, ускорить восстановительные процессы после ЧМТ за счет обработки периферических зрелых иммунных клеток кофеином in vitro и внутривенного введения модулированных кофеином сингенных иммунных клеток. 15 табл., 15 пр.

Способ регенерации клеток головного мозга с восстановлением его функций при закрытой черепно-мозговой травме (ЧМТ) с применением кофеина, включающий забор зрелых периферических иммунных клеток, отличающийся тем, что забор зрелых периферических иммунных клеток производят у зебраданио с закрытой ЧМТ, затем клетки подвергают in vitro экспозиции с кофеином в действующих концентрациях 150-450 мкг/мл в течение 20-25 минут, затем отмывают от кофеина и вводят отмытые клетки в кровоток зебраданио с закрытой черепно-мозговой травмой в дозе 80×10³ клеток на особь.