ГУМАНИЗИРОВАННОЕ ОДНОДОМЕННОЕ АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C07K16/24 A61K39/395 A61P11/00 A61P13/12 A61P17/00 A61P17/02 A61P19/02 A61P31/06 A61P31/22 A61P37/02 A61P37/08 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к области техники, связанной с антителами, и в частности относится к гуманизированному однодоменному антителу к IL-4Rα и его применению.

Уровень техники

[0002] Воспалительные реакции 2 типа в организме человека вызываются Т-хелперами 2 типа (TH2). Такие реакции характеризуются сопоставимыми признаками и обозначаются как аллергические заболевания, такие как астма и ряд других воспалительных заболеваний. При традиционном лечении, направленном на подавление воспаления, как правило, для лечения заболеваний применяют иммунодепрессивные средства широкого спектра действия для подавления боли, вызываемой заболеваниями, или лекарственные средства, которые специфично нацеливаются на последующие продукты активности TH2-клетки, например, лекарственные препараты, нацеливающиеся на IgE. По сравнению с традиционным лечением, нацеливание на цитокины 2 типа, секретируемые TH2, т. е. IL-4, IL-5 и IL-13, продемонстрировало более высокий потенциал при лечении различных иммунологических заболеваний и обеспечило достижение лучших исходов лечения для пациентов. После того, как было получено несколько разочаровывающих клинических результатов при использовании средств терапии, нацеливающихся на IL-4, IL-5 и IL-13, у субъектов, страдающих астмой, исследователями стала применяться персонализированная терапия для подтипов астмы, демонстрирующих «аллергический» фенотип, и ее использование приводит к благоприятным терапевтическим эффектам. В последнее время благоприятные терапевтические эффекты также были достигнуты для более широкого спектра субъектов, страдающих астмой. Это указывает на то, что воспаление 2 типа тесным образом ассоциировано с тяжелой формой астмы, если ключевые движущие факторы, расположенные выше по сигнальному пути, подвергнуты блокированию надлежащим образом. Более того, одновременное подавление активности IL-4 и IL-13 продемонстрировало терапевтические эффекты в случае наиболее частых сопутствующих заболеваний при астме, например, атопическом дерматите и хроническом синусите, как например при полипах носовой полости, что поддерживает следующую гипотезу: нацеливание на ключевые «движущие факторы сигнальных путей» может обеспечивать получение терапевтических эффектов для многих аллергических заболеваний.

[0003] Аллергические заболевания все чаще начинают носить характер глобальной эпидемии. Результаты эпидемиологических исследований продемонстрировали увеличение распространенности видов пищевой аллергии, риноконъюнктивита, атопического дерматита и астмы. Аллергия представляет собой системную воспалительную реакцию 2 типа на безвредные антигены (аллергены), вызываемую сложным взаимодействием между генетическими и относящимися к окружающей среде факторами. Такая реакция в результате приводит к продуцированию иммуноглобулина E (IgE) и увеличению выраженности различных ассоциированных воспалительных иммунных реакций. У пациентов могут проявляться разные степени тяжести заболеваний, связанных с поражением отдельных органов или нескольких систем органов и тканей - от легких до угрожающих жизни. Аллергические заболевания могут приобретать совершенно разные формы ввиду их уникальной манифестации в органах и тканях, и их лечение обычно осуществляется клиницистами разных медицинских специализаций. Тем не менее, наблюдаемые тенденции возникновения нескольких аллергических заболеваний параллельным или последовательным образом (т. е. «атопический марш») свидетельствуют о том, что к этим заболеваниям, возможно, приводят общие основные движущие факторы. В связи с этим, уже давно признано, что в патогенезе астмы и атопического дерматита (двух широко распространенных хронических заболеваний, характеризующихся различающимися тканеспецифичными проявлениями в легком и коже) ключевую роль играют воспалительные реакции 2 типа, опосредуемые TH2.

[0004] Несмотря на то, что в ходе первоначальных клинических исследований с использованием регуляторов сигнального пути, вовлеченного в воспаление 2 типа, были получены в некоторой степени неудовлетворительные результаты, клинические данные (идентифицированные с использованием биомаркеров), полученные для пациентов с аллергической астмой, подтверждают важную роль трех цитокинов 2 типа, т. е. интерлейкина-5 (IL-5) и родственных характеризующихся наличием корецептора цитокинов IL-4 и IL-13 (фиг. 1). Эффективность для некоторых пациентов, страдающих от астмы и хронического синусита с полипами носовой полости (CSwNP), продемонстрировало гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к IL-5 (mAb), представляющее собой меполизумаб (разработано GlaxoSmithKline). Кроме того, было подтверждено, что одновременное блокирование передачи сигналов, опосредуемой IL-4 и IL-13, с использованием полностью гуманизированного блокирующего антитела к α-субъединице рецептора IL-4 (IL-4Rα) (дупилумаб; разработанный Regeneron/Sanofi) обеспечивает возможность лечения трех аллергических заболеваний, т. е. атопического дерматита, CSwNP и астмы. Последние клинические данные указывают на привлекающую внимание возможность, предполагающую то, что нацеливание на ключевые центральные «движущие факторы» может обеспечивать достижение существенных терапевтических эффектов в отношении аллергических заболеваний, характеризующихся наличием нескольких клинических органоспецифичных проявлений. Теперь будут представлены определения и классификация аллергических заболеваний, чтобы обеспечить оптимизацию способов лечения в соответствии с основными сигнальными путями иммунной системы.

[0005] Преобладание воспаления 2 типа является ключевым движущим фактором, обуславливающим аллергические заболевания. Тип антигена в комбинации с факторами окружающей среды и подлежащими генетическими факторами может влиять на высвобождение целого ряда цитокинов, которые вызывают инициирование или распространение воспаления 2 типа, опосредуемое клетками, относящимися к врожденной иммунной системе, а также лимфоидными клетками. В барьерной зоне, подвергающейся воздействию стимулов окружающей среды, эпителиальные цитокины, такие как IL-25, IL-33 и тимический стромальный лимфопоэтин (TSLP), могут инициировать развитие иммунных реакций 2 типа или усиливать уже существующее воспаление 2 типа Такие первичные медиаторы стимулируют клетки врожденной иммунной системы к продуцированию цитокинов 2 типа, а также способствуют поляризации наивных Т-клеток в сторону CD4+TH2-клеток. Классификация субпопуляций TH-лимфоцитов осуществляется в соответствии с иммунными ответами, ассоциированными со специфическими цитокинами и медиаторами воспаления, специфичными для каждой субпопуляции. Например, TH1-клетки продуцируют интерферон-γ (IFNγ); TH2-клетки продуцируют IL-4, IL-5 и IL-13; TH9-клетки продуцируют IL-9; TH17-клетки продуцируют IL-17A; IL-17F, IL-21 и IL22; TH22-клетки продуцируют IL-22; а регуляторные Т-клетки (TREG) могут продуцировать IL-10. Помимо других видов активности, TH2-клетки индуцируют пролиферацию B-клеток и, пройдя впоследствии стадию переключения типов антител, обуславливают в результате высокие уровни IgE в кровотоке. Таким образом, IgE является ключевым нижележащим по сигнальному пути биомаркером активации TH2-клетки. IgE связывается с высокоаффинными рецепторами IgE (FcεRI), обнаруживаемыми на базофилах и тучных клетках, и образование перекрестных сшивок с участием IgE на этих клетках приводит к клеточной активации и дегрануляции различных медиаторов воспаления. Такие медиаторы воспаления включают гистамин, простагландин и другие провоспалительные цитокины (такие как IL-4, IL-5 и IL-13), которые усиливают воспалительные реакции 2 типа. В нижних отделах дыхательных путей такое окружение, обуславливаемое воспалением 2 типа, приводит в результате к эозинофилии, продуцированию слизи и сокращению гладкой мускулатуры. Эти процессы, несмотря на то, что они направлены на укрепление важных функций иммунной защиты от паразитических инфекций, оказывают патологический эффект применительно к безвредным антигенам или аллергенам, приводя к развитию аллергий.

[0006] Помимо аллергических заболеваний, имеющих классическое определение (включая астму, атопический дерматит, виды пищевой аллергии, аллергический ринит и конъюнктивит), различные заболевания неизвестной этиологии также характеризуются клиническими признаками воспаления 2 типа (наиболее ярко выраженными признаками являются эозинофилия и/или высокие уровни IgE в сыворотке крови). Такие заболевания включают хроническую идиопатическую крапивницу, CSwNP и эозинофильный эзофагит.

[0007] Хотя при лечении некоторых видов аллергических заболеваний (как например аллергического ринита) хорошие результаты обеспечивает применение антигистаминных средств со средством специфической иммунотерапии, а основной способ лечения аллергических заболеваний с более высокой степенью тяжести (как например атопического дерматита и астмы) представлен неспецифической иммунодепрессивной терапией, аномальные воспалительные реакции, протекающие при заболеваниях, относящихся к обоим из случаев, могут обостряться и способствовать распространению симптомов заболевания. Симптомы тяжелой формы заболевания могут быть эффективно ослаблены за счет снижения воспаления посредством системного введения иммунодепрессивных средств широкого спектра действия (например, пероральное введение или внутривенная инъекция кортикостероидов, циклоспорина A, метотрексата, азатиоприна или микофенолата мофетила). Иммунодепрессивная активность таких средств обеспечивается за счет нацеливания на нижележащие по сигнальному пути медиаторы, такие как факторы транскрипции. Например, кортикостероиды связываются с глюкокортикоидным рецептором и подавляют экспрессию ключевых факторов транскрипции, например ядерного фактора κB (NF-κB), которые обуславливают воспаление. Циклоспорин A представляет собой ингибитор кальциневрина, который способен предупреждать продуцирование IL-2 (посредством фактора транскрипции, представляющего собой ядерный фактор активированных T-клеток (NFAT)), что необходимо для активации и пролиферации Т-клеток. Однако, ввиду широкого спектра действия циклоспорина A и кортикостероидов системная иммунодепрессивная терапия может приводить к плейотропным эффектам, приводя к формам токсичности, таким как застойная водянка, непереносимость глюкозы, гипертензия, мышечная слабость, желудочно-кишечная интолерантность, потенциальная потеря костной ткани, подавление гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и повышенная восприимчивость к инфекции. Местное применение (т. е. лекарственные средства для небулизации, капли для местного применения, назальные спреи или кремы) может уменьшать побочные эффекты этих иммунодепрессивных средств. Однако, местной иммунодепрессии недостаточно для лечения более тяжелых форм данных заболеваний. Поэтому по-прежнему крайне актуальны более специфичные средства лечения.

[0008] Жесткое подавление воспаления не обеспечивает понимания того, какие сигнальные пути иммунной системы обуславливают и способствуют распространению заболевания. Например, лекарственное средство широкого спектра действия циклоспорин A является эффективным при лечении псориаза и атопического дерматита. Напротив, специфичное нацеливание на фактор некроза опухоли (TNF) при псориазе и атопическом дерматите приводит к разной клинической эффективности, что свидетельствует о том, что эти два кожных заболевания характеризуются разными сигнальными путями, обуславливающими их развитие. Блокаторы TNF были одобрены в качестве средства для лечения псориаза, однако до сих пор они не продемонстрировали устойчивую эффективность при атопическом дерматите (заболевании, обуславливаемом воспалением 2 типа).

[0009] Однодоменное антитело омализумаб (Ксолар; Novartis/Genentech) индуцирует более специфичную иммунодепрессию при аллергических заболеваниях посредством нацеливания на главнейший медиатор воспаления 2 типа и IgE, высокоэффективный инициатор дегрануляции тучной клетки и базофила. Применение этого IgE-специфичного гуманизированного моноклонального антитела является первым утвержденным способом терапии астмы на основе моноклональных антител, однако оно не обеспечивает эффективность при лечении атопического дерматита. Омализумаб способствует снижению уровня свободного IgE в сыворотке крови и проявляет эффект уменьшения обострений за счет этого нового противовоспалительного механизма. Однако, с точки зрения объема форсированного выдоха за 1 секунду (FEV1), то есть количественного показателя легочной функции, омализумаб демонстрирует небольшое улучшение в отношении объема форсированного выдоха. Омализумаб также способствует улучшению в отношении симптомов сопутствующего CSwNP. Омализумаб также утвержден в качестве средства лечения хронической идиопатической крапивницы, не поддающейся лечению антигистаминными средствами. В ходе опорного испытания омализумаб показал значительное улучшение при прурите и по конечным точкам, связанным с активностью заболевания. С другой стороны, при атопическом дерматите снижения уровней свободного IgE в сыворотке крови недостаточно для обеспечения хорошего клинического ответа. При лечении пациентов с атопическим дерматитом умеренной степени тяжести омализумабом в течение 16 недель по конечным точкам, связанным с заболеванием (индексу площади поражения и степени тяжести экземы (EASI) и общей оценке исследователя) улучшение не имело место. Кроме того, показатели для оценки прурита подверглись небольшому ухудшению у пациентов, получавших средство лечения, по сравнению с группой, получавшей плацебо. Эти результаты указывают на то, что IgE, представляющий собой конечный продукт сигнального пути с участием TH2-клеток, не является универсальным модулятором заболеваний даже в случае тех заболеваний, которые обуславливаются воспалением 2 типа.

[0010] Нацеливание на вышележащие по сигнальному пути движущие факторы, а не на нижележащие по сигнальному пути медиаторы сигнальных путей, обуславливающих воспаление 2 типа, может обеспечивать достижение оптимальных терапевтических эффектов при ряде различных аллергических заболеваний. В данной связи три ключевых цитокина 2 типа, представляющие собой IL-4, IL-5, и IL-13 являются перспективными кандидатами для систематического лечения воспалительных аллергических заболеваний.

[0011] IL-4 является ключевым фактором дифференцировки, обуславливающим реакцию TH2-типа. IL-4 инициирует дифференцировку T-клеток в субпопуляцию TH2 и индуцирует продуцирование цитокинов и хемокинов, связанных с воспалением 2 типа, таких как IL-5, IL-9, IL-13, TARC и эотаксин. В случае B-клеток IL-4 индуцирует переключение изотипа на IgE. IL-4 способствует дифференцировке наивных T-клеток TH в Т-хелперы 2 типа in vitro. Дефицит IL-4 in vivo может приводить к подавлению продуцирования цитокинов 2 типа, происходящему в ответ на паразитарную инфекцию. В свою очередь, IL-4 осуществляет отрицательную регуляцию ответов TH1-типа, ассоциированных с продуцированием IFNγ и активацией макрофагов, и, таким образом, обеспечивается иммунная поляризация по отношению к ответам 2 типа.

[0012] IL-4 и IL-13 являются эффективными медиаторами иммунного ответа 2 типа с перекрывающимися и различающимися функциональными характеристиками, связанными с паттернами экспрессии их рецепторов. Несмотря на то, что IL-4 и IL-13 обладают лишь 25% гомологией аминокислотной последовательности, данные цитокины объединяет наличие у них общего рецепторного фрагмента, IL-4Rα. Данный рецептор, связываясь с уникальной дополнительной цепью, индуцирует передачу сигнала. IL-4Rα экспрессируется как на гематопоэтических, так и на негематопоэтических клетках. Однако, по дифференциальной экспрессии дополнительных цепей в различных клетках были выявлены функциональные различия в отношении IL-4Rα (фиг. 1). Рецептор 1 типа состоит из IL-4Rα и общей γ-цепи, и при этом последняя обнаруживается только в гематопоэтических клетках. Рецепторный комплекс 2 типа состоит из IL-4Rα и IL-13Rα1, и при этом последнее обнаруживается во многих негематопоэтических клетках, как например относящихся к кератиноцитам, фолликулам волоса, сальной и потовой железам кожи, эпителиоцитам носовой полости и бронхов, гладкомышечным клеткам и фибробластам. IL-4 обеспечивает передачу сигнала посредством рецепторных комплексов как 1 типа, так и 2 типа, тогда как IL-13 обеспечивает передачу сигнала только посредством рецепторного комплекса 2 типа. Это объясняется связыванием IL-13 со своей главной связывающей цепью (IL-13Rα1), в то время как IL-4 связывается главным образом с IL-4Rα.

[0013] Кроме того, данные два цитокина характеризуются разными уровнями эффективности и кинетическими параметрами передачи сигнала. Сильное связывание IL-4 с IL-4Rα не зависит от аффинности связывания (KD) γ-цепи или IL-13Rα1, тогда как присутствие IL-4Rα способствует повышению аффинности связывания IL-13 с IL-13Rα1 (значение KD изменяется с 10 мM на 30 пM). Более того, рецептор 2 типа для IL-4 вовлечен во внутриклеточную передачи сигналов с более быстрой временной динамикой, чем в случае IL-13. В мышиных моделях паразитарной инфекции и аллергии физиологические различия между IL-4 и IL-13 анализируют путем нокаута продуцирования цитокинов и по фенотипам, характеризующимся сверхэкспрессией. Тщательная проверка данных фенотипов, осуществляемая нижеприведенным образом, может поддерживать следующую гипотезу: IL-4 является центральным медиатором дифференцировки TH2-клеток, роста B-клеток, инициирования переключения классов изотипов (особенно IgE) и рекрутинга эозинофилов. Хотя в таких провоспалительных процессах IL-13 характеризуется определенной избыточностью, он выполняет другие функции, относящиеся к опосредованию пролиферации бокаловидных клеток и сокращению гладкой мускулатуры, что, возможно, связано с уникальным паттерном экспрессии рецепторного комплекса 2 типа и местным продуцированием цитокинов.

[0014] Как IL-4, так и IL-13 опосредуют продуцирование IgE за счет активности B-клеток. Нокаут IL-4 или IL-13 у мышей приводит к серьезным дефектам в отношении IgE, индуцируемого аллергенами. Несмотря на то, что IL-4 может инициировать и стимулировать переключение изотипов и рост B-клеток, данные свидетельствуют о возможности связывания IL-13 с активированными B-клетками человека. Это указывает на то, что IL-13 способствует непрерывному продуцированию IgE, а также обеспечивает интерпретацию фенотипов, наблюдаемых у мышей, подвергнутых нокауту генов.

[0015] IL-4, IL-5 и IL-13 могут способствовать развитию эозинофилии в ткани и крови при воспалении 2 типа, IL-5 является активным эозинофильным фактором и отвечает за рост, дифференцировку, выживание и мобилизацию клеток костного мозга, а также за их миграцию из костного мозга в кровь. IL-5 связывается с цитокин-специфической субъединицей рецептора IL-5Rα, образующей комплекс вместе с общей β-цепью субъединицы для передачи сигнала. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-SCF) и IL-3 также нуждаются в β-цепи для передачи сигналов. Высокий уровень экспрессии IL-5Rα наблюдается в эозинофилах и клетках-предшественницах эозинофилов, а также имеет место в базофилах. В случае отсутствия IL-5 (либо при нокаутировании генов, либо после лечения IL-5-специфичными антителами) индуцируемые аллергенами эозинофильные ответы, развивающиеся в крови и ткани, устраняются.

[0016] Продуцирование вышележащих по сигнальному пути цитокинов 2 типа может способствовать экспрессии посредством эпителиальных цитокинов IL-25, IL-33 и TSLP, а их высвобождение может происходить в барьерной зоне после повреждения ткани или воздействия аллергенов. Активность таких эпителиальных цитокинов в отношении ряда различных типов клеток врожденного иммунитета (например, лимфоидных клеток врожденного иммунитета 2 типа и тучных клеток) может индуцировать продуцирование IL-4, IL-5 и IL-13, а также может стимулировать опосредуемый TH2 ответ. В частности, IL-33 действует в качестве «алармина» (сигнала о повреждении клеток или тканей), и может приводить к поляризации наивных T-клеток в сторону TH2-клеток, а также усиливать уже имеющийся ответ 2 типа. Совместно с IL-25 IL-33 также индуцирует лимфоидные клетки врожденного иммунитета к продуцированию цитокинов 2 типа на высоких уровнях, в частности, IL-5 и IL-13. TSLP стимулирует продуцирование цитокинов в базофилах, моноцитах и натуральных киллерных Т-клетках, а также активирует дендритные клетки с инициацией и активацией TH2-клеток.

[0017] В заключение следует отметить, что IL-4, IL-5 и IL-13 обладают плейотропным действием, координируют иммунный ответ 2 типа, а также выполняют различные функции, т. е. относящиеся к продуцированию IgE и эозинофилии, к обуславливанию экспрессии маркеров активации для сигнальных путей, связанных с воспалением 2 типа и TH2. Доклинические данные предоставляют убедительные доказательства, указывающие на то, что как астма, так и атопический дерматит обуславливаются этими медиаторами воспаления 2 типа. У трансгенных мышей со сверхэкспрессией всех трех типов цитокинов 2 типа, представляющих собой IL-4, IL-5 и IL-13, спонтанно развиваются заболевание легких, подобное астме, и кожное заболевание, подобное атопическому дерматиту, характеризующиеся патологически усиленными реакциями 2 типа, т. е. повышенными уровнями сывороточного IgE, обширной клеточной инфильтрацией (в том числе эозинофилами и лимфоцитами) кожи и легких, утолщением кожных покровов, гипертрофией эпителия дыхательных путей. Дальнейшие исследования показали, что как IL-4, так и IL-13, взятых отдельно, достаточно для того, чтобы вызвать аналогичную патологию. Доклинические данные указывают на то, что IL-4 и IL-13 являются ключевыми непосредственными движущими факторами, обуславливающими заболевание.

[0018] Кроме того, гуманизированные антитела главным образом относятся к антителам, полученным в результате конструирования и повторной экспрессии моноклональных антител, отличных от человеческих, осуществляемой посредством технологии клонирования генов и ДНК-рекомбинации. Большая часть аминокислотных последовательностей гуманизированных антител заменена на человеческие последовательности, что в целом обеспечивает сохранение специфичности и аффинности родительских моноклональных антител, обеспечивает снижение гетерогенности, и это создает благоприятные условия для их применения у людей. В настоящее время имеется потребность в гуманизированном антителе на основе верблюжьего однодоменного антитела, нацеливающемся на IL-4Rα.

Сущность изобретения

[0019] Основной целью настоящего изобретения является обеспечение гуманизированного однодоменного антитела к IL-4Rα и его применения. Однодоменное антитело к IL-4Rα согласно настоящему изобретению, которое было модифицировано путем его гуманизации, сохраняет аффинность и способность к подавлению пролиферации опухолевых клеток и обеспечивает эффективное уменьшение выраженности побочной реакции со стороны иммунной системы.

[0020] Осуществление настоящего изобретения предусматривает следующее.

[0021] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гуманизированное однодоменное антитело к IL-4Rα, имеющее определяющие комплементарность области, предусматривающие CDR1, CDR2 и CDR3, и каркасные области, предусматривающие FR1, FR2, FR3 и FR4.

[0022] Аминокислотная последовательность CDR1 представлена под SEQ ID NO: 3, аминокислотная последовательность CDR2 представлена под SEQ ID NO: 12, и аминокислотная последовательность CDR3 представлена под SEQ ID NO: 18.

[0023] Аминокислотная последовательность FR1 представлена под SEQ ID NO: 2, аминокислотная последовательность FR2 выбрана из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 4-11, аминокислотная последовательность FR3 выбрана из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 13-17, и аминокислотная последовательность FR4 представлена под SEQ ID NO: 20 или 21.

[0024] Посредством научно обоснованной и целесообразной модификации путем гуманизации верблюжьего однодоменного антитела к IL-4Rα, характеризующегося последовательностью под SEQ ID NO: 22, осуществленной в подходящем местоположении, авторами настоящего изобретения было получено гуманизированное однодоменное антитело к IL-4Rα, которое сохраняет аффинность и способность к подавлению пролиферации опухолевых клеток, а также обеспечивает эффективное уменьшение выраженности побочной реакции со стороны иммунной системы.

[0025] Определяющие комплементарность области и каркасные области соединены в следующем порядке с образованием структуры первичной последовательности однодоменного антитела по настоящему изобретению: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0026] В необязательном варианте осуществления аминокислотная последовательность FR2 представлена под SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность FR3 представлена под SEQ ID NO: 15, и аминокислотная последовательность FR4 представлена под SEQ ID NO: 21.

[0027] По сравнению с другими гуманизированными однодоменными антителами однодоменное антитело согласно данному варианту осуществления проявляет превосходные технические эффекты, а также характеризуется более высокой аффинностью и обуславливает менее выраженную побочную реакцию со стороны иммунной системы.

[0028] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает слитый белок, который содержит однодоменное антитело к IL-4Rα, как описано выше.

[0029] Однодоменное антитело согласно настоящему изобретению может быть слито с любыми другими белками или веществами с достижением различных целей. Например, при объединении с флуоресцентными белками, ферментами или радиоактивными элементами однодоменное антитело лучше поддается анализированию, или при слиянии с молекулами лекарственных средств для лечения родственных заболеваний, опосредованных IL-4Rα, оно способствует достижению более сильного терапевтического эффекта. Тип белка, с которым слито однодоменного антитела, может рационально выбираться специалистами в данной области техники исходя из фактических потребностей и целей, и при этом получаемый в результате слитый белок полностью подпадает под объем правовой охраны настоящего изобретения вне зависимости от типа вещества, с которым слито однодоменное антитело.

[0030] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело, которое предусматривает однодоменное антитело к IL-4Rα, как описано выше.

[0031] Исходя из последовательности и структуры однодоменного антитела, представленного в настоящем изобретении, специалисты в данной области техники легко смогут определить варианты слияния однодоменного антитела с другими специфическими антителами с получением биспецифических или мультиспецифических антител, которые способны специфично связываться с двумя или более антигенами. Этого легко достигают специалисты в данной области техники. Таким образом, все биспецифические антитела, независимо от типа антитела, слитого с однодоменным антителом, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.

[0032] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение однодоменного антитела к IL-4Rα, как описано выше, слитого белка, как описано выше, или биспецифического антитела, как описано выше, в получении лекарственного средства, нацеленного на IL-4Rα, для лечения заболевания.

[0033] Однодоменное антитело, слитый белок и биспецифическое антитело согласно настоящему изобретению можно применять в случае любого из заболеваний, при которых терапевтической мишенью является IL-4Rα, предусматривающих без ограничения астму, аллергический дерматит, экзему, артрит, герпес, хроническую первичную крапивницу, склеродермию, гипертрофический рубец, хроническую обструктивную болезнь легких, атопический дерматит, идиопатический фиброз легких, болезни Кавасаки, серповидно-клеточное заболевание, болезнь Грейвса, синдрома Шегрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Баррета, аутоиммунный увеит, туберкулез и нефропатию.

[0034] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает лекарственное средство для лечения заболевания, предусматривающее однодоменное антитело к IL-4Rα, как описано выше, слитый белок, как описано выше, или биспецифическое антитело, как описано выше, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0035] Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество относится к фармацевтическим вспомогательным веществам, используемым в области фармацевтики, таким как разбавители, наполнители, связующие, смачивающие средства, усилители поглощения, поверхностно-активные вещества, разрыхлители, адсорбирующие носители, смазывающие средства и т. п. Дополнительно, может предусматриваться добавление других вспомогательных веществ, таких как ароматизирующие средства, подсластители и т. п. Таким образом, вспомогательными веществами являются одно или два или более из разбавителей, наполнителей, связующих, смачивающих средств, усилителей поглощения, поверхностно-активных веществ, разрыхлителей, адсорбирующих носителей, смазывающих средств, ароматизирующих средств и подсластителей. При необходимости специалисты в данной области техники могут выбрать рациональные варианты.

[0036] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую однодоменное антитело к IL-4Rα, как описано выше.

[0037] Следует отметить, что основываясь на настоящем изобретении, специалисты в данной области техники могут легко получить полинуклеотидную молекулу, кодирующую упомянутые выше однодоменное антитело и слитые белки, посредством традиционно используемых в данной области техники методик, а в силу вырожденности кодонов полинуклеотидная молекула характеризуется вариабельностью с обеспечением ряда различных специфических последовательностей оснований. Исходя из этого, вне зависимости от варьирования последовательности, полинуклеотидная молекула подпадает под объем правовой охраны настоящего изобретения при условии, что она способна кодировать однодоменное антитело или слитый белок по настоящему изобретению.

[0038] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает вектор или рекомбинантную клетку, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше.

[0039] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения однодоменного антитела к IL-4Rα, как описано выше, включающий культивирование рекомбинантной клетки и выделение и очистку однодоменного антитела к IL-4Rα из продукта культивирования; при этом рекомбинантная клетка содержит рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий вышеуказанную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0040] Следует отметить, что для получения однодоменного антитела, слитого белка и антитела по настоящему изобретению могут быть использованы химический синтез, или методики генной инженерии, или другие способы. Все из однодоменного антитела, слитого белка или антитела по настоящему изобретению подпадает под объем правовой охраны настоящего изобретения, каким бы способом они ни были получены.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0041] Для более четкого описания технических решений, предусматриваемых в вариантах осуществления настоящего изобретения, далее кратко описываются сопроводительные графические материалы, представленные для описания вариантов осуществления. Следует понимать, что на следующих сопроводительных графических материалах показаны только некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, которые не следует рассматривать как ограничивающие его объем. Специалист в данной области техники при этом может получить другие сопроводительные графические материалы из таких предоставленных сопроводительных графических материалов без творческих усилий

[0042] На фиг. 1 представлено схематическое изображение путей передачи сигнала с участием IL4/IL-13 и IL-5;

[0043] на фиг. 2 представлен результат выравнивания последовательностей некоторых клонов после гуманизации моноклонального антитела к IL-4Rα 4E9;

[0044] на фиг. 3 представлены результаты анализа применительно к нейтрализующему действию, оказываемому различными клонами гуманизированного антитела 4E9 на пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-4;

[0045] на фиг. 4 представлены результаты анализа применительно к нейтрализующему действию, оказываемому предпочтительными клонами гуманизированного антитела 4E9 на пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-13;

[0046] на фиг. 5 представлены результаты анализа (ELISA) для определения способности биспецифического антитела к IL-4Rα/IL-5 4E9V10-2B3V2 блокировать связывание IL-4Rα с IL-4;

[0047] на фиг. 6 представлены результаты анализа (ELISA) для определения способности биспецифического антитела к IL-4Rα/IL-5 4E9V10-2B3V2 блокировать связывание IL-5R с IL-5;

[0048] на фиг. 7 представлены результаты анализа применительно к нейтрализующему действию, оказываемому биспецифическим антителом к IL-4Rα/IL-5 4E9V10-2B3V2 на пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-4;

[0049] на фиг. 8 представлены результаты анализа применительно к нейтрализующему действию, оказываемому биспецифическим антителом 4E9V10-2B3V2 к IL-4Rα/IL-5 на пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-13; и

[0050] на фиг. 9 представлены результаты анализа применительно к нейтрализующему действию, оказываемому биспецифическим антителом 4E9V10-2B3V2 к IL-4Rα/IL-5 на пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0051] Для того чтобы сделать более понятными цель, технические решения и преимущества вариантов осуществления настоящего изобретения, ниже будет представлено четкое и полное описание технических решений, предусматриваемых в вариантах осуществления настоящего изобретения. Если конкретные условия не указаны в вариантах осуществления, то их осуществляют в соответствии с обычными условиями или условиями, предложенными производителями. Реагенты или инструменты, используемые без указания изготовителя, представляют собой стандартные продукты, которые могут быть приобретены на рынке.

[0052] Ниже будет представлено дополнительное подробное описание признаков и характеристик настоящего изобретения в сочетании с примерами.

[0053] Пример 1

[0054] Модификация путем гуманизации

[0055] Модификацию путем гуманизации проводили на основе однодоменного антитела к IL-4Rα 4E9 (обозначенного как 4E9-V0) под SEQ ID NO: 22.

[0056] Последовательности модифицированных гуманизированных однодоменных антител (обозначенных как 4E9 V1-V14 соответственно) показаны в таблице 1, а результаты выравнивания частичных последовательностей гуманизированных антител показаны на фиг. 2.

[0057] Пример 2

[0058] Анализ для определения нейтрализующего действия, оказываемого гуманизированными однодоменными антителами на пролиферацию клеток TF1, индуцированную IL-4 или индуцированную IL-13

[0059] (1) В 96-луночный планшет в количестве 10000 клеток/лунка высевали клетки TF-1, пассированные 3-4 раза после их восстановления.

[0060] (2) Различные Tab и гуманизированные однодоменные антитела из таблицы 1 составляли в растворах при концентрации 10 мкг/мл и подвергали 5-кратному градиентному разбавлению.

[0061] (3) Антитела Tab (полученные с использованием способа, раскрытого в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство») и гуманизированные однодоменные антитела, все из которых подвергали градиентному разбавлению, смешивали с IL-4 или IL13 в концентрации, соответствующей EC80 (полученной с использованием способа, раскрытого в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство»), в соотношении 1:1 с получением смешанного раствора. Определение EC80 является следующим: EC80, а именно концентрация, необходимая для достижения 80% от максимального эффекта (EC80), относится к концентрации, которая способна обеспечивать достижение эффекта, величина которого составляет 80% от величины максимального эффекта.

[0062] (4) Смешанный раствор из предыдущей стадии добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему раствора для культивирования клеток.

[0063] (5) После инкубирования в течение 72 ч жизнеспособность клеток выявляли с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток посредством люминесцентного метода.

[0064] (6) Концентрации, соответствующие EC50, различных гуманизированных однодоменных антител, необходимые для нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-4 или индуцированной IL13, рассчитывали в соответствии с результатами анализа. EC50, а именно концентрация, необходимая для достижения 50% от максимального эффекта (EC50), относится к концентрации, которая способна обеспечивать достижение эффекта, величина которого составляет 50% от величины максимального эффекта. Результаты показаны в таблице 2, таблице 3, на фиг. 3 и на фиг. 4.

[0065] Из результатов видно, что из всех гуманизированных антител наибольшим нейтрализующим действием по отношению к пролиферации клеток обладает антитело 4E9-V10, а его EC50 составляет 0,27 нM, при этом наименьшим эффектом обладает антитело 4E9-V1, а 4E9-V6, 4E9-V8, 4E9-V12 и 4E9-V13 обладают определенными нейтрализующими эффектами.

[0066] Пример 3

[0067] Анализ для определения термостабильности гуманизированных однодоменных антител методом дифференциальной сканирующей калориметрии

[0068] Способ проведения анализа:

[0069] (1) В 8-пробирочный стрип или 96-луночный ПЦР-планшет добавляли 45 мкл раствора упомянутых выше гуманизированных однодоменных антител в концентрации 0,1 мг/мл, после чего добавляли 5 мкл 100× оранжевого красителя Sypro. Конечная концентрация красителя являлась 5-кратной. Для каждого образца предусматривали 3 повторности, при этом в качестве холостой пробы использовали 1x PBS.

[0070] (2) Анализ с определением кривой плавления выполняли с параметрами, предусматривающими репортерную группу ROX и отсутствие гасителя, в соответствии с программой нагрева, предусматривающей 25°C в течение 5 мин, диапазоном сканирования, составляющим 25-95°C, при скорости нагревания, составляющей 1% (приблизительно 1°C/мин).

[0071] (3) Температуру, соответствующую максимальному значению первой производной кривой плавления, принимали за температуру денатурации белка (значение Tm).

[0072] Результаты анализа приведены в таблице 4.

[0073] Из результатов видно, что из всех последовательностей гуманизированных однодоменных антител наибольшей термостабильностью обладает 4E9-V13, 4E9-V3 характеризуется наименьшей не поддающейся обнаружению термостабильностью, и 4E9-V10 занимает третье место в отношении самой высокой термостабильности среди всех антител.

[0074] Пример 4

[0075] Определение аффинности гуманизированных однодоменных антител

[0076] Получение SD-буфера: соответствующее количество бычьего сывороточного альбумина и Tween 20 растворяли в 1x PBS (pH 7,4) с таким расчетом, чтобы массовые (или объемные) доли бычьего сывороточного альбумина и Tween 20 составляли 0,1% и 0,02% соответственно. IL-4Rα-связывающие молекулы (частично гуманизированные однодоменные антитела, упомянутые выше) составляли с SD-буфером с доведением концентрации до 10 мкг/мл.

[0077] Получение рабочего раствора антигена: сначала антиген составляли с SD-буфером до достижения концентрации 200 нM, а затем подвергали 2-кратному градиентному разбавлению. В общей сложности получали 5 концентрационных градиентов в дополнение к SD-буферу в качестве холостой контрольной пробы.

[0078] Получение регенерационного раствора: соответствующее количество исходного 0,1 M раствора глицина разбавляли 10 раз в деионизированной воде и тщательно перемешивали с получением регенерационного раствора.

[0079] Стадии анализа: Запускали Octet 96 и программное обеспечение для получения данных на вспомогательном компьютере. С использованием ткани для протирки оптических стекол с подходящим количеством 75% этилового спирта очищали донную и боковые поверхности зонда для отбора проб, и прибор предварительно разогревали в течение 15 мин или дольше. Предварительное увлажнение сенсора: перед началом анализа сенсор выдерживали погруженным в SD-буфер в течение

10 мин или дольше для последующего использования. Затем процедуру, осуществляемую аппаратом, настраивали следующим образом: исходный уровень → антитело → исходный уровень → связывание антигена → диссоциация антигена → регенерация сенсора для проведения анализа. Результаты анализа показаны в таблице 5.

[0080] KD: константа аффинности, выраженная в молях (M).

[0081] Ka: константа скорости ассоциации, выраженная в виде величины, обратной молям в единицу времени (1/Мс).

[0082] Kd: константа скорости диссоциации, выраженная в виде величины, обратной времени.

[0083] R2: степень соответствия, то есть степень соответствия между кривой, полученной по результатам измерения, и аппроксимированной кривой. Чем ближе R2 к 1, тем ближе подобранное значение к измеренному значению, и в данной системе значение R2 должно превышать по меньшей мере 0,95.

[0084] X2: статистический параметр для оценки рабочих характеристик измеряемых системой значений, который должен составлять менее чем 3, и при этом чем меньше его величина, тем более достоверным является измеренное значение.

[0085] Все остальные значения ошибки являются значениями ошибки для соответствующих им параметров, величины которых должны быть величинами, предусматривающими на один порядок (10-кратно) более низкие значения, чем таковые для параметров, которым они соответствуют, или меньше.

[0086] Из результатов видно, что наименьшие значения KD имеют 4E9-V6 и 4E9-V10, и при этом они характеризуются самой высокой аффинностью к антигену.

[0087] Исходя из вышеприведенных результатов, а также из результатов клеточного анализа функциональных характеристик антител и результатов физико-химического анализа следует, что 4E9-V10 является гуманизированным однодоменным антителом с наилучшим комплексным эффектом среди всех гуманизированных последовательностей, что стало неожиданным для авторов настоящего изобретения, и 4E9-V10 использовали для анализов в последующих примерах.

[0088] Пример 5

[0089] Конструирование эукариотического вектора экспрессии Fc-слитого антитела на основе биспецифического однодоменного антитела к белку IL-4Rα/IL-5

[0090] (1) Генетическую последовательность (положения 1-345 в SEQ ID NO: 23) кодон-оптимизированного гуманизированного однодоменного антитела к IL-4Rα (4E9V10) или генетическую последовательность (положения 1069-1434 в SEQ ID NO: 23) гуманизированного однодоменного антитела к IL-5 (обозначенного как 2B3V2) синтезировали и встраивали в вектор RJK-V4-3 (полученный с использованием способа, раскрытого в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство») соответственно посредством способов синтеза последовательности.

[0091] (2) Сконструированным рекомбинантным эукариотическим вектором экспрессии трансформировали Escherichia coli DH5α, и их культивировали для осуществления с помощью реагентов «максипреп» выделения плазмиды, а также удаления эндотоксинов.

[0092] (3) Выделенные плазмиды секвенировали и идентифицировали.

[0093] (4) Идентифицированную последовательность антитела к IL-4Rα субклонировали в эукариотический вектор экспрессии, содержащий последовательность антитела к IL-5, а именно: с использованием эндонуклеаз рестрикции Xba I и BamH I последовательность антитела к IL-4Rα вырезали из эукариотического вектора экспрессии, в составе которого она находилась, и лигировали с эукариотическим вектором экспрессии, содержащим последовательность антитела к IL-5, по тем же липким концам, образуемым эндонуклеазой. Лигированный вектор подвергали трансформации, секвенированию и идентификации; клоны, подтвержденные секвенированием, подвергали выделению плазмид с помощью реагентов «максипреп» для удаления эндотоксинов; выделенные плазмиды затем подвергали секвенированию и идентификации; и подтвержденные рекомбинантные векторы подготавливали для последующей трансфекции и экспрессии в эукариотической клетке. Получали эукариотический вектор экспрессии биспецифического однодоменного антитела к белку IL-4Rα/IL-5. Биспецифическое однодоменное антитело к белку IL-4Rα/IL-5 (характеризующееся аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 24, а также генетическая последовательность, показанная под SEQ ID NO: 23) обозначено как 4E9V10-2B3V2 и состоит из трех фрагментов: 4E9V10-Fc-фрагмент-2B3V2; где 4E9V10 находится на амино-конце (положения 1-115 в последовательности под SEQ ID NO: 24), Fc-фрагмент охватывает положения 116-356 в последовательности под SEQ ID NO: 24, а 2B3V2 находится на карбоксильном конце (положения 357-478 в последовательности под SEQ ID NO: 24).

[0094] Пример 6

[0095] Экспрессию биспецифических однодоменных антител к белку IL-4Rα/IL-5 осуществляли в клетках ExpiCHO-S в суспензионной культуре с использованием способа проведения анализа, представленного в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство».

[0096] Пример 7

[0097] Экспрессию биспецифических однодоменных антител к белку IL-4Rα/IL-5 осуществляли в клетках 293F в суспензионной культуре с использованием способа проведения анализа, представленного в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство».

[0098] Пример 8

[0099] Очистку биспецифических однодоменных антител к белку IL-4Rα/IL-5 осуществляли с использованием способа проведения анализа, представленного в заявке на патент Китая № CN202010576200.7 на изобретение под названием «Однодоменное антитело к IL-4Rα, а также применение и лекарственное средство».

[0100] Пример 9

[0101] Анализ блокирования связывания рецептора с лигандом с использованием биспецифического однодоменного антитела

[0102] (1) Рецепторный белок (IL-4Rα или IL-5R) разбавляли в растворе для разбавления белка до концентрации 1

мкг/мл и в закрытом виде оставляется на ночь при 4°C.

[0103] (2) Планшет промывали и осуществляли блокирование с помощью добавления 5% обезжиренного молока при 37°C.

[0104] (3) Биотин-конъюгированный лигандный белок (IL-4 или L-5) разбавляли до концентрации, равной 2-кратному значению EC80, и антитело разбавляли до концентрации, равной 2-кратному значению исходной концентрации, и осуществляли 5-кратное градиентное разбавление. Лигандный белок и разбавленное антитело (дупилумаб, 4E9V10-2B3V2, 4E9-V0 или 2B3 (SEQ ID NO: 25)), а также hIgG соответственно переносили в соотношении 1:1 в новый планшет для дозированного внесения и тщательно перемешивали.

[0105] (4) Планшет промывали, а разбавленную смесь лигандный белок/антитело переносили в двух повторностях в планшет для ELISA и инкубировали при 37°C.

[0106] (5) Планшет промывали, и добавляли разбавленный стрептавидин[HRP], и инкубировали 37°C.

[0107] (6) Планшет промывали, добавляли однокомпонентную TMB для проявления цвета при комнатной температуре в темноте.

[0108] (7) Добавляли стоп-раствор и сразу же проводили считывание показаний для образцов в разных лунках при длине волны, составляющей 450 нм, с помощью микропланшетного ридера, и их значения регистрировали как OD450. EC50 рассчитывали путем построения графиков. 4E9-V0, негуманизированное однодоменное антитело к IL-5 2B3, дупилумаб, реслизумаб и hIgG использовали в качестве контролей, а результаты показаны в таблицах 6 и 7 и на фиг. 5 и 6 соответственно.

[0109] Из результатов видно, что гуманизированное биспецифическое антитело являлось неаттенуированным и характеризовалось незначительно более превосходной эффективностью в отношении блокирования связывания рецептора с лигандом, представляющих собой IL-4/IL-4Rα или IL-5/IL-5R, по сравнению с негуманизированным антителом. По сравнению с соответствующими коммерческими лекарственными средствами гуманизированное биспецифическое антитело характеризовалось почти идентичной и незначительно более превосходной блокирующей способностью.

[0110] Пример 10

[0111] Анализ для определения нейтрализации биспецифическими однодоменными антителами пролиферации клеток TF1, индуцированной IL-4 или индуцированной IL-13

[0112] Способ анализа приведен в примере 2.

[0113] Результаты анализа показаны в таблицах 8 и 9 и на фиг. 7 и 8.

[0114] Из результатов видно, что гуманизированное биспецифическое антитело являлось неаттенуированным и характеризовалось незначительно более превосходной эффективностью в отношении нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-4, по сравнению с негуманизированным антителом. По сравнению с соответствующими коммерческими лекарственными средствами гуманизированное биспецифическое антитело характеризовалось почти идентичной блокирующей способностью.

[0115] Пример 11

[0116] Анализ в отношении пролиферации клеток TF1, индуцированной человеческим рекомбинантным белком IL-5, и нейтрализации пролиферации посредством инструментального антитела (Tab)

[0117] A. Анализ в отношении пролиферации клеток TF1, индуцированной человеческим рекомбинантным белком IL-5:

[0118] (1) В 96-луночный планшет в количестве 10000 клеток/лунка высевали клетки TF-1, пассированные 3-4 раза после их восстановления.

[0119] (2) Человеческий белок IL-5 составляли в растворе при максимальной концентрации, составляющей 500 нг/мл, и подвергали 5-кратному градиентному разбавлению.

[0120] (3) Раствор белка IL-5, подвергнутый градиентному разбавлению, добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему раствора для культивирования клеток.

[0121] (4) После инкубирования в течение 72 ч жизнеспособность клеток выявляли с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток посредством люминесцентного метода.

[0122] (5) Концентрации, соответствующие EC80, необходимые для обеспечения пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-5, рассчитывали в соответствии с результатами анализа, и рассчитанный результат составил 2,96 нг/мл.

[0123] B. Анализ в отношении нейтрализующего эффекта Tab в отношении пролиферации клеток TF1, индуцированной IL-5

[0124] (1) В 96-луночный планшет в количестве 10000 клеток/лунка высевали клетки TF-1, пассированные 3-4 раза после их восстановления.

[0125] (2) Tab составляли в растворе при концентрации, составляющей 10 мкг/мл, и подвергали 5-кратному градиентному разбавлению.

[0126] (3) Tab, подвергнутое градиентному разбавлению, смешивали в соотношении 1:1 с IL-5 при концентрации, соответствующей EC80, значение которой получали в ходе анализа в отношении пролиферации, с получением смешанного раствора.

[0127] (4) Смешанный раствор добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему раствора для культивирования клеток.

[0128] (5) После инкубирования в течение 72 ч жизнеспособность клеток выявляли с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток посредством люминесцентного метода.

[0129] (6) Концентрацию Tab, соответствующую EC50, необходимую для нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-5, рассчитывали в соответствии с результатами анализа.

[0130] Пример 12

[0131] Анализ применительно к нейтрализующему действию, оказываемому гуманизированными биспецифическими однодоменными антителами на пролиферацию клеток TF1, индуцированную IL-5.

[0132] (1) В 96-луночный планшет в количестве 10000 клеток/лунка высевали клетки TF-1, пассированные 3-4 раза после их восстановления.

[0133] (2) Tab и упомянутое выше гуманизированное биспецифическое однодоменное антитело составляли в растворе при концентрации, составляющей 10 мкг/мл, и подвергали 5-кратному градиентному разбавлению.

[0134] (3) Tab и гуманизированное антитело, подвергнутые градиентному разбавлению, в соотношении 1:1 смешивали соответственно с белком IL-5 при концентрации, соответствующей EC80, значение которой было получено в примере 13-A, с получением смешанного раствора.

[0135] (4) Смешанный раствор добавляли в лунки для культивирования клеток в объеме, равном объему раствора для культивирования клеток.

[0136] (5) После инкубирования в течение 72 ч жизнеспособность клеток выявляли с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток посредством люминесцентного метода.

[0137] (6) Концентрации, соответствующие EC50, различных однодоменных антител, необходимые для нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-5, рассчитывали в соответствии с результатами анализа, а результаты анализа показаны в таблице 10 и на фиг. 9.

[0138] Из результатов видно, что гуманизированное биспецифическое антитело являлось неаттенуированным и характеризовалось незначительно более превосходной эффективностью в отношении нейтрализации пролиферации клеток TF-1, индуцированной IL-5, по сравнению с негуманизированным антителом. По сравнению с соответствующими коммерческими лекарственными средствами гуманизированное биспецифическое антитело характеризовалось почти идентичной блокирующей способностью.

[0139] Пример 12

[0140] Анализ для определения кинетических характеристик аффинности для гуманизированного биспецифического антитела выполняли посредством метода анализа, приведенного в примере 4, а результаты анализа показаны в таблице 11.

[0141] Из результатов видно, что были определены значения аффинности биспецифического антитела, нацеливающегося на IL4Rα и IL-5, по отношению к двум соответствующим антигенам, и оба соответствующих значения аффинности были ниже 1 нM.

[0142] Вышеизложенное отображает и описывает основные принципы, главные признаки и преимущества настоящего изобретения. Специалисты в данной области техники смогут понять, что настоящее изобретение не ограничивается вышеизложенными вариантами осуществления. Описания, приведенные в вариантах осуществления и в тексте настоящего описания, иллюстрируют только принципы настоящего изобретения. Различные модификации и улучшения осуществляются в рамках настоящего изобретения без отступления от сущности или объема настоящего изобретения, и эти модификации и улучшения должны подпадать под объем правовой охраны настоящего изобретения. Объем правовой охраны настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> РЕДЖЕНЕКОР БИОТЕК КО., ЛТД

<120> ГУМАНИЗИРОВАННОЕ ОДНОДОМЕННОЕ АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО

ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PCTCN2021077649

<150> 2020114456354

<151> 2020-12-09

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR1 гуманизированного однодоменного антитела

4E9-V0

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

20

<210> 2

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR1 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

20

<210> 3

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> определяющая комплементарность область CDR1 гуманизированного

однодоменного антитела к IL-4Rα

<400> 3

Ser Gly Asp Phe Tyr Cys

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 4

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 5

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 5

Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 6

Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 7

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 7

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 8

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 8

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

<210> 9

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 9

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala

1 5 10 15

Lys

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 10

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala

1 5 10 15

Thr

<210> 11

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR2 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 11

Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 12

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> определяющая комплементарность область CDR2 гуманизированного

однодоменного антитела к IL-4Rα

<400> 12

Ile Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr

1 5

<210> 13

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR3 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 13

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 14

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR3 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 14

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 15

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR3 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 15

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 16

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR3 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 16

Tyr Leu Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 17

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR3 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 17

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 18

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> определяющая комплементарность область CDR3 гуманизированного

однодоменного антитела к IL-4Rα

<400> 18

Ala Val Gly Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp

1 5 10

<210> 19

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> определяющая комплементарность область CDR3 гуманизированного

однодоменного антитела к IL-4Rα

<400> 19

Ala Val Gly Val Asp Ala Asn Cys Arg Asn Tyr Trp

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR4 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 20

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каркасная область FR4 гуманизированного однодоменного антитела

к IL-4Rα

<400> 21

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> однодоменное антитело к IL-4Rα 4E9 (обозначаемое как 4E9-V0)

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Cys Met Ala

20 25 30

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Val Gly

85 90 95

Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 1434

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность гена гуманизированного однодоменного

антитела к IL-5

<400> 23

caagtgcaac ttgtggaatc aggaggagga tcagtgcaag caggaggatc acttagactt

60

tcatgcgcag catcaggaga tttctattgt atggcatggt ttagacaagc acctggaaag

120

gagagggaag gagtggcaac aatcagatca ggaggaagat caacatacta cgcagattca

180

gtgaaaggaa gatttacaat ctcaaaggac aatgcaaagg acacccttta ccttcaaatg

240

aactcactta aacctgaaga tacagcaatg tactactgcg cagtgggagt ggatggaaac

300

tgcagaaact actggggcca ggggacacaa gtgacagtgt catcagagag caagtacggc

360

cctccttgcc ccagctgccc cgcccccgag tttctgggag gccccagcgt gtttctgttt

420

cctcccaagc ccaaagacac actgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac atgcgtggtg

480

gtcgacgtga gccaagaaga tcccgaggtg cagttcaact ggtatgtgga cggcgtggag

540

gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagggag gagcaattca acagcaccta cagagtggtg

600

agcgtgctga ccgtgctgca ccaagactgg ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtg

660

agcaacaagg gcctccccag cagcatcgag aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct

720

agggagcctc aagtgtacac actgcccccc agccaagagg agatgaccaa aaaccaagtg

780

tctctgacat gcctcgtgaa gggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc

840

aatggccagc ccgagaataa ctacaagacc accccccccg tgctcgactc cgatggcagc

900

ttctttctgt actctaggct gaccgtggac aagtctaggt ggcaagaggg aaacgtgttc

960

agctgttccg tgatgcacga ggctctgcac aaccactaca cccagaagag cctctctctg

1020

tctctgggaa aggagagcaa gtacggccct ccttgcccca gctgccccca agtgcagctg

1080

gtggagagtg ggggcggtag cgtacaagcg ggcggcagcc tgagactgag ctgcgccgcc

1140

agcggcaaca ccttcagctt cagcacctac tgcatgggct ggttcagaca gagccccggc

1200

aaggagagag agggcagcct ggccaccatc tacgacgcca gcaccgccta cgccggcagc

1260

gtgaagggca gattcaccat cagcagagac aacagcaaga acatcctgta cctgcagatg

1320

aacaacctga gagccgagga caccgccgtg tactactgcg ccgccgccag atactgcatg

1380

ttctggagcc accccagcta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc

1434

<210> 24

<211> 478

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность биспецифического

однодоменного антитела к белку IL-4Rα/IL-5

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Cys Met Ala

20 25 30

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile

35 40 45

Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly

85 90 95

Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

130 135 140

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

145 150 155 160

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

165 170 175

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

180 185 190

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

195 200 205

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

210 215 220

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

225 230 235 240

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

245 250 255

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

260 265 270

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

275 280 285

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

290 295 300

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

305 310 315 320

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

325 330 335

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

340 345 350

Pro Ser Cys Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val

355 360 365

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr

370 375 380

Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly

385 390 395 400

Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala

405 410 415

Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

420 425 430

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr

435 440 445

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His

450 455 460

Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

465 470 475

<210> 25

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность дупилумаба

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser

20 25 30

Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Ala Ala Lys Tyr Cys Met Phe Trp Ser Asp Pro Ser Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к гуманизированному однодоменному антителу к IL-4Rα, способу его получения, а также к слитому белку и лекарственному средству, его содержащим. Также раскрыто биспецифическое антитело для ингибирования пролиферации клеток, индуцированной белком IL-5 или индуцированной IL-4Rα. Изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеуказанное антитело к IL-4Rα, а также к вектору и клетке, ее содержащим. Изобретение эффективно для лечения заболевания, индуцированного IL-4Rα. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 11 табл., 12 пр.

1. Гуманизированное однодоменное антитело к IL-4Rα, содержащее определяющие комплементарность области, предусматривающие CDR1, CDR2 и CDR3, и каркасные области, предусматривающие FR1, FR2, FR3 и FR4;

где CDR1 характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 3, CDR2 характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 12, и CDR3 характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 18; и

FR1 характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 2, FR2 характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 4-11, FR3 характеризуется аминокислотной последовательностью, выбранной из любой из последовательностей под SEQ ID NO: 13-17, и FR4 характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 20 или 21.

2. Гуманизированное однодоменное антитело к IL-4Rα по п. 1, где аминокислотная последовательность FR2 представлена под SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность FR3 представлена под SEQ ID NO: 15 и аминокислотная последовательность FR4 представлена под SEQ ID NO: 21.

3. Слитый белок для анализа IL-4Rα, содержащий однодоменное антитело к IL-4Rα по п. 1 или 2, слитое с флуоресцентным белком, ферментом или радиоактивным элементом.

4. Биспецифическое антитело для ингибирования пролиферации клеток, индуцированной белком IL-5 или индуцированной IL-4Rα, характеризующееся аминокислотной последовательностью, представленной под SEQ ID NO: 24.

5. Применение однодоменного антитела к IL-4Rα по п. 1 или 2, слитого белка по п. 3 или биспецифического антитела по п. 4 в получении лекарственного средства, нацеленного на IL-4Rα, для лечения заболевания, индуцированного IL-4Rα.

6. Применение по п. 5, где заболевание выбрано из астмы, аллергического дерматита, экземы, артрита, герпеса, хронической первичной крапивницы, склеродермии, гипертрофического рубца, хронической обструктивной болезни легких, атопического дерматита, идиопатического фиброза легких, болезни Кавасаки, серповидно-клеточного заболевания, болезни Грейвса, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Баррета, аутоиммунного увеита, туберкулеза и нефропатии.

7. Лекарственное средство для лечения заболевания, индуцированного IL-4Rα, предусматривающее однодоменное антитело к IL-4Rα по п. 1 или 2, слитый белок по п. 3 или биспецифическое антитело по п. 4 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты для кодирования однодоменного антитела к IL-4Rα по п. 1 или 2.

9. Рекомбинантная клетка для экспрессии гуманизированного однодоменного антитела к IL-4Rα по п. 1 или 2, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.

10. Вектор для экспрессии гуманизированного однодоменного антитела к IL-4Rα по п. 1 или 2, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.

11. Способ получения однодоменного антитела к IL-4Rα по п. 1 или 2, включающий культивирование рекомбинантной клетки и выделение и очистку однодоменного антитела к IL-4Rα из продукта культивирования; при этом рекомбинантная клетка содержит рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.