АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ IL4R, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 A61P37/00 

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ И ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №62/982,521, поданной 27 февраля 2020 года.

[0002] Вышеупомянутая заявка и все документы, цитируемые в ней или в ходе ее рассмотрения («прилагаемые цитируемые документы»), и все документы, цитируемые или упоминаемые в настоящем документе (включая, без ограничения, все литературные документы, патенты, опубликованные патентные заявки, цитируемые в настоящем документе) («цитируемые в настоящем описании документы»), и все документы, цитируемые или упоминаемые в цитируемых в настоящем описании документах, вместе с любыми инструкциями производителя, описаниями, спецификациями продукта и описаниями продукта для любых продуктов, упомянутых в настоящем документе или в любом документе, включенном в настоящий документ посредством ссылки, включены в настоящий документ посредством ссылки и могут быть использованы в практическом применении изобретения. Более конкретно, все ссылочные документы включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый отдельный документ был конкретно и индивидуально указан для включения посредством ссылки. Любые последовательности из базы генетических данных Genbank, упомянутые в настоящем описании, включены посредством ссылки с последовательностью из базы генетических данных Genbank, соответствующей самой ранней действительной дате подачи настоящего изобретения.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение в целом относится к выделенному моноклональному антителу, в частности, мышиному, химерному или гуманизированному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, которое связывается с IL4R человека или более конкретно, с IL4Rα человека с высокой аффинностью и функциональностью. Также предложены молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающую часть, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части. В настоящем изобретении дополнительно предложены биспецифическая молекула, иммуноконъюгат, химерный антигенный рецептор, онколитический вирус и фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигеневязывающую часть, а также способ лечения с применением антитела к IL4Rα или его антигенсвязывающей части согласно настоящему изобретению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Аллергические расстройства, связанные с воспалением 2 типа, такие как атопический дерматит, анафилактическая реакция, аллергический ринит и аллергическая астма, поражают более 3 миллиардов человек по всему миру, и заболеваемость продолжает расти. Согласно гигиенической гипотезе, высокая заболеваемость отчасти обусловлена уменьшением воздействия инфекций по мере повышения уровня жизни, что заставляет иммунную систему больше бороться с некоторыми, в других случаях безвредными, аллергенами (Stephen J. Galli et al., (2008) Nature 454(7203):445-454). Двумя факторами, имеющими центральное значение для иммунитета 2 типа, являются интерлейкин-4 (IL-4) и IL-13. Они необходимы для управления большинством ключевых признаков, ассоциированных с воспалением 2 типа, таких как продукция иммуноглобулина Е и рекрутинг врожденных клеток в места воспаления (Griming G et al., (1998) Science 282: 2261-2263; Rankin JA et al., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 7821-7825; Wills-Karp M et al., (1998) Science 282:2258-2261).

[0005] IL-4 и IL-13 примыкают друг к другу на хромосоме 5 у человека и могут иметь общие регуляторные элементы. В клетках Т-хелперах 2 (T_H2) наблюдается как координатная, так и некоординатная экспрессия этих двух цитокинов (Katherine Bao et al., (2015) Cytokine 75(1):25-37). Два цитокина связывают рецепторы клеточной поверхности для регулирования клеточных функций и активации транскрипционного механизма. В частности, IL-4 сначала связывается с цепью IL-4Rα с пикомолярной аффинностью и рекрутирует цепь IL-2Rγ γс с образованием рецепторного комплекса типа I или, в качестве альтернативы, IL-13Rα1 с образованием рецепторного комплекса типа II. Уровень или доступность IL-2Rγ γс и IL-13Rα1 определяет, какой из них должен быть рекрутирован при образовании рецепторного комплекса. Было обнаружено, что негемопоэтические клетки не экспрессируют или экспрессируют низкие уровни IL-2Rγ γс и экспрессируют более высокие количества IL-13Rα1, в то время как противоположное было обнаружено в лимфоцитах. Миелоидные клетки находятся между этими двумя категориями клеток. Образование IL-4 рецепторного комплекса типа II также может быть инициировано связыванием IL-13 с цепью IL-13Rα1 с наномолярной аффинностью, что приводит к дальнейшему рекрутингу цепи IL-4Rα. В дополнение к рецептору IL-4 типа II, IL-13 также связывает IL-13Rα2 с пикомолярной аффинностью, который функционирует как рецептор-ловушка (Irina G. Luzina et al., (2012) J Leukoc Biol 92(4):753-764). После сборки IL-4 рецепторных комплексов активируются внутриклеточные сигнальные молекулы, причем передача сигнала STAT6 (сигнальный белок и активатор транскрипции 6) и IRS (субстрат инсулинового рецептора) реагирует на активацию рецептора IL-4 типа I, в то время как рецептор IL-4 типа II не способен значительно активировать IRS (Heller NM et al., (2008) Sci Signal I(51):ra17-ra17). Передача сигнала STAT6 важна для дифференцировки клеток Тн2 и продукции IL-4, и молекулы IRS активируют сигнальные пути, включая PI3K и mTOR (Gadani SP et al., (2012) J Immunol 189:4213-4219).

[0006] Исследования предположили, что избыточная передача сигналов IL-4/IL-13 может вызывать аллергические заболевания, и поэтому было разработано несколько терапевтических антител для модификации передачи сигналов, опосредованных IL-4 и IL-13. Например, леприкизумаб, анрукинзумаб и тралокинумаб связывают IL-13, и пасколизумаб нацелен на IL-4. Дупилумаб и питракинра являются антагонистами IL-4Rα, причем питракинра при связывании с IL-4Rα блокирует рецепторы IL-4 как типа I, так и типа II (Antoniu SA (2010) Curr Opin Investig Drugs 11:1286-1294). Кроме того, было обнаружено, что ингибитор STAT6 ингибирует рост клеток рака предстательной железы, что позволяет предположить, что нацеливание на IL-4/IL-13 может принести пользу при лечении рака (Nappo G et al., (2017) Oncogenesis 2017, 6(5):e342). Следовательно, необходимо больше антител, нацеленных на IL-4, IL-13 и их рецепторы, особенно IL-4Rα, с более желательными терапевтическими свойствами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, например, мышиному, человеческому, химерному или гуманизированному моноклональному антителу, или его антигенсвязывающей части, которое связывается с IL4Rα (например, IL4Rα человека) и имеет сопоставимую или более высокую аффинность/способность связывания с IL4Rα человека и/или обезьяны и сопоставимую или более высокую блокирующую активность в отношении взаимодействия IL4Rα-IL4/IL13-IL13Rα1 и соответствующей внутриклеточной трансдукции сигнала по сравнению с антителами к IL4Rα, известными из предшествующего уровня техники, такими как дупилумаб.

[0008] Антитело или антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению может быть использовано для различных применений, включая обнаружение белка IL4Rα, а также лечение и предотвращение заболеваний, ассоциированных с IL4, IL13 или IL4R, таких как аллергические заболевания и раковые заболевания.

[0009] Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу (например, мышиному, химерному или гуманизированному антителу) или его антигенсвязывающей части, связывающему IL4Rα, имеющему вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит область CDR1 (CDR -область, определяющая комплементарность), область CDR2 и область CDR3, где указанные область CDR1, область CDR2 и область CDR3 содержат аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с (1) SEQ ID NO: 1, 5 и 10, соответственно; (2) SEQ ID NO: 1, 6 и 11, соответственно; (3) SEQ ID NO: 2, 7 и 12, соответственно; (4) SEQ ID NO: 3, 8 и 13, соответственно; (5) SEQ ID NO: 4, 8 и 13, соответственно; или (6) SEQ ID NO: 3, 9 и 14, соответственно.

[0010] В одном аспекте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID NO: 32, 33 (X1=W, X2=S; X1=L, X2=A; X1=W, X2=A), 34, 38, 40, 41 (X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H), 42 (X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N), 43, 44, 47, 49, 51 или 53, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с IL4Rα. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 32 может кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 59 или 60. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 40 может кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 65 или 66. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 33 (X1=W, Х2=А) и 41 (X1=V, Х2=К, Х3=М, Х4=Н) могут кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 61 и 67, соответственно.

[0011] В одном аспекте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению, которое связывает IL4Rα, содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит область CDR1, область CDR2 и область CDR3, где указанные область CDR1, область CDR2 и область CDR3 содержат аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с (1) SEQ ID NO: 15, 22 и 26, соответственно; (2) SEQ ID NO: 16, 22 и 27, соответственно; (3) SEQ ID NO: 17, 23 и 28, соответственно; (4) SEQ ID NO: 18, 24 и 29, соответственно; (5) SEQ ID NO: 19, 24 и 30, соответственно; (6) SEQ ID NO: 20, 25 и 31, соответственно; или (7) SEQ ID NO: 21, 25 и 31, соответственно.

[0012] В одном аспекте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по настоящему изобретению содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID NO: 35, 36 (X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), 37, 39, 45, 46, 48, 50, 52 или 54, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с IL4Rα. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 35 может кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 62 или 63. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 45 может кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 68 или 69. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 36 (X1=F, X2=V) и 46 могут кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 64 и 70, соответственно.

[0013] В одном аспекте выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, каждая из которых содержит область CDR1, область CDR2 и область CDR3, где CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с (1) SEQ ID NO: 1, 5, 10, 15, 22 и 26, соответственно; (2) SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 22 и 27, соответственно; (3) SEQ ID NO: 2, 7, 12, 17, 23 и 28, соответственно; (4) SEQ ID NO: 3, 8, 13, 18, 24 и 29, соответственно; (5) SEQ ID NO: 4, 8, 13, 19, 24 и 30, соответственно; (6) SEQ ID NO: 3, 9, 14, 20, 25 и 31, соответственно; или (7) SEQ ID NO: 3, 9, 14, 21, 25 и 31, соответственно, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с IL4Rα.

[0014] В одном варианте осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с (1) SEQ ID NO: 32 и 35, соответственно; (2) SEQ ID NO: 33 (X1=W, X2=S) и 36 (X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), соответственно; (3) SEQ ID NO: 33 (X1=W, X2=S) и 37, соответственно; (4) SEQ ID NO: 34 и 36 (X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), соответственно; (5) SEQ ID NO: 34 и 37, соответственно; (6) SEQ ID NO: 33 (X1=L, X2=A) и 36 (X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), соответственно; (7) SEQ ID NO: 33 (X1=L, X2=A) и 37, соответственно; (8) SEQ ID NO: 33 (X1=W, X2=A) и 36 (X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; X1=F, X2=I), соответственно; (9) SEQ ID NO: 33 (X1=W, X2=A) и 37, соответственно; (10) SEQ ID NO: 38 и 39, соответственно; (11) SEQ ID NO: 40 и 45, соответственно; (12) SEQ ID NO: 41 (X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; X1=V, X2=K, X3=M, X4=H) и 46, соответственно; (13) SEQ ID NO: 42 (X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; X1=R, X2=V, X3=T, X4=N) и 46, соответственно; (14) SEQ ID NO: 43 и 46, соответственно; (15) SEQ ID NO: 44 и 46, соответственно; (16) SEQ ID NO: 47 и 48, соответственно; (17) SEQ ID NO: 49 и 50, соответственно; (18) SEQ ID NO: 51 и 52, соответственно; или (19) SEQ ID NO: 53 и 54, соответственно, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с IL4Rα.

[0015] В одном варианте осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению содержит тяжелую цепь и легкую цепь, соединенные дисульфитными связями, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи, где С-конец вариабельной области тяжелой цепи соединен с N-концом константной области тяжелой цепи, а С-конец вариабельной области легкой цепи соединен с N-концом константной области легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, описанные выше, и антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с IL4Rα. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG4 человека, имеющую аминокислотную последовательность, представленную, например, в SEQ ID NO: 55, и константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа человека, имеющую аминокислотные последовательности, представленные, например, в SEQ ID NO: 56. Аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 55 и 56, могут кодироваться нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 71 и 72, соответственно.

[0016] Антитело согласно настоящему изобретению в некоторых вариантах осуществления содержит или состоит из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, где каждая тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи, вариабельную область тяжелой цепи или последовательности CDR, упомянутые выше, и каждая легкая цепь содержит константную область легкой цепи, вариабельную область легкой цепи или последовательности CDR, упомянутые выше, где антитело связывается с IL4Rα. Антитело согласно настоящему изобретению может представлять собой полноразмерное антитело, например, изотипа IgG1, IgG2 или IgG4, предпочтительно изотипа IgG4 со слабой активностью ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа. Антитело согласно настоящему изобретению в других вариантах осуществления изобретения может представлять собой антитело с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) или фрагменты антитела, такие как фрагменты Fab или F(ab')₂.

[0017] Антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению имеет сопоставимую, если не более высокую, аффинность/способность связывания с IL4Rα человека и/или IL4Rα обезьяны и сопоставимую, если не более высокую, блокирующую активность в отношении взаимодействия IL4Rα-IL4/IL13-IL13α1 и соответствующей внутриклеточной трансдукции сигнала по сравнению с антителами к IL4Rα, известными из предшествующего уровня техники, такими как дупилумаб.

[0018] В настоящем изобретении также предложена биспецифическая молекула, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть согласно настоящему изобретению, соединенное со вторым функциональным фрагментом (например, вторым антителом), имеющим другую специфичность связывания, чем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть. В настоящем изобретении также предложен иммуноконъюгат, такой как конъюгат антитела и лекарственного средства, содержащий антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть, соединенное с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин. В другом аспекте антитело или его антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению могут быть превращены в часть химерного антигенного рецептора (CAR). Также предложена иммунная клетка, содержащая химерный антигенный рецептор, такая как Т-клетка. Антитело или его антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению также могут кодироваться или использоваться в сочетании с онколитическим вирусом.

[0019] Также предложены композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающую часть или иммуноконъюгат, биспецифическую молекулу, онколитический вирус, CAR или CAR-T-клетку согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно содержать противоаллергическое средство или противоопухолевое средство.

[0020] Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие части согласно настоящему изобретению, также охватываются настоящим изобретением, также как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии. Также предложен способ получения антитела к IL4Rα или его антигенсвязывающей части с использованием клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, включающий стадии (i) экспрессии антитела в клетке-хозяине и (ii) выделения антитела из клетки-хозяина или ее клеточной культуры.

[0021] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения передачи сигналов IL4/IL13. IL4 передает сигналы через рецептор, содержащий IL-4Rα и γС, тогда как передача сигналов IL13 включает рецептор, содержащий IL-4Rα и IL13Rα1. Неограничивающие примеры передачи сигналов IL4/IL13 включают активацию и/или пролиферацию В-клеток, эозинофилов, макрофагов (например, альтернативно активированных макрофагов), пролиферацию фибробластов и пролиферацию гладких мышц, такую как пролиферация клеток гладких мышц дыхательных путей.

[0022] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, ассоциированного с избыточной передачей сигнала IL4/IL13, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части согласно настоящему изобретению.

[0023] Заболевание может представлять собой аллергическое заболевание. Аллергическое заболевание может представлять собой атопический дерматит, анафилактическую реакцию, аллергический ринит или аллергическую астму. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения аллергического заболевания может включать введение композиции, биспецифической молекулы или онколитического вируса, кодирующего антитело или несущего антитело, согласно настоящему изобретению, или, в качестве альтернативы, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, способного экспрессировать ее у субъекта. Способ также может включать введение противоаллергического средства. Противоаллергическое средство может представлять собой противогистаминное средство, кортикостероид, агонист бета-адренергических рецепторов, средство, нацеленное на cyc-LT, или средство, нацеленное на IgE.

[0024] Заболевание может представлять собой опухолевое заболевание. Опухоль может представлять собой солидную опухоль или несолидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления изобретения опухоль представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает введение композиции, биспецифической молекулы, иммуноконъюгата, такого как конъюгат антитела и лекарственного средства, CAR-T-клетки или онколитического вируса, кодирующего антитело или несущего антитело, согласно изобретению, или, в качестве альтернативы, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, способного экспрессировать ее у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно дополнительное противораковое антитело можно вводить вместе с антителом или его антигенсвязывающей частью согласно настоящему изобретению, такое как антитело к VISTA, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к LAG-3, антитело к CTLA-4, антитело к TIM 3, антитело к STAT3 и/или антитело к ROR1. В еще одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающую часть согласно изобретению вводят с цитокином (например, IL-2, IL-21 и/или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)) или ко стимулирующим антителом (например, антителом к CD137 и/или антителом к GITR). Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой, например, мышиные, человеческие, химерные или гуманизированные антитела.

[0025] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу снижения иммунитета 2 типа, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающей части согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает введение композиции, биспецифической молекулы или онколитического вируса, кодирующего антитело или несущего антитело, согласно настоящему изобретению, или, в качестве альтернативы, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, способного экспрессировать ее у субъекта.

[0026] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способам диагностики, композициям и наборам. В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению используют для определения наличия и экспрессии IL4Rα в клетке или ткани и для установления прогноза и соответствующего лечения и последующего наблюдения.

[0027] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылок, данных из Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых по всей настоящей заявке, напрямую включено в настоящий документ посредством ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0028] На фиг. 1А-1С показана способность связывания мышиных антител B1D2F7D3B5 (A), B8G11F2B7G5E8 и B9D1D11F8D8 (В), С2С1А1А1 и C2B2F7B7 (С) с IL4Rα человека.

[0029] На фиг. 2A-2D показана способность связывания мышиных антител B1D2F7D3B5 (A), B8G11F2B7G5E8 (В), B9D1D11F8D8 (С), С2С1А1А1 и C2B2F7B7 (D) с IL4Rα человека на поверхности клетки.

[0030] На фиг. 3 показана способность связывания мышиных антител B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, С2С1А1А1 и C2B2F7B7 с IL4Rα яванского макака.

[0031] На фиг. 4А-4 В показана блокирующая способность мышиных антител B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8 и B9D1D11F8D8 (А), С2С1А1А1 и C2B2F7B7 (В) в отношении взаимодействия IL4Rα-IL4 человека.

[0032] На фиг. 5А-5 В показана способность мышиных антител B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8 и B9D1D11F8D8 (А), С2С1А1А1 и C2B2F7B7 (В) блокировать связывание IL4Rα человека с эталоном.

[0033] На фиг. 6А-6С показана блокирующая способность мышиных антител B1D2F7D3B5 и B8G11F2B7G5E8 (A), B9D1D11F8D8 (В), С2С1А1А1 и C2B2F7B7 (С) в отношении взаимодействия IL4 человека с IL4Rα человека на поверхности клетки.

[0034] На фиг. 7 показана активность мышиных антител B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, С2С1А1А1 и C2B2F7B7 в отношении ингибирования индуцированного IL4 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0035] На фиг. 8 показана активность мышиных антител B1D2F7D3B5, B8G11F2B7G5E8, B9D1D11F8D8, С2С1А1А1 и C2B2F7B7 в отношении ингибирования индуцированного IL13 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0036] На фиг. 9 показана способность связывания химерных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 с IL4Rα человека.

[0037] На фиг. 10 показана способность связывания химерных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 с IL4Rα человека на поверхности клетки.

[0038] На фиг. 11 показана блокирующая способность химерных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 в отношении взаимодействия IL4Rα-IL4 человека.

[0039] На фиг. 12 показана активность химерных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 в отношении ингибирования индуцированного IL4 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0040] На фиг. 13 показана активность химерных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 в отношении ингибирования индуцированного IL13 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0041] На фиг. 14А-14 В показана способность связывания гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) с IL4Rα человека.

[0042] На фиг. 15А-15 В показана способность связывания гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) с IL4Rα яванского макака.

[0043] На фиг. 16А-16 В показана способность связывания гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) с cal-IL4Rα.

[0044] На фиг. 17А-17 В показана способность связывания гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) с IL4Rα человека на поверхности клетки.

[0045] На фиг. 18А-18 В показана блокирующая способность гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) в отношении взаимодействия IL4 человека с клетками 293F, экспрессирующими IL4Rα человека.

[0046] На фиг. 19А-19 В показана блокирующая способность гуманизированных антител huB8G1 1F2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4 и huB8GHF2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) в отношении взаимодействия IL4Rα-IL4 человека.

[0047] На фиг. 20А-20 В показана способность гуманизированных антител huB8G11F2B7G5E8-V2, huBSG1 1F2B7G5E8-V4 и huB8G11F2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) блокировать связывание с IL4Rα человека с эталоном.

[0048] На фиг. 21 показана активность гуманизированных антител huB8GHF2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 и huB8G11F2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) в отношении ингибирования индуцированного IL4 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0049] На фиг. 22 показана активность гуманизированных антител huB8GHF2B7G5E8-V2, huB8G11F2B7G5E8-V4 и huB8G11F2B7G5E8-V14 (А), huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 (В) в отношении ингибирования индуцированного IL13 фосфорилирования STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2.

[0050] Следующее подробное описание, приведенное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения изобретения только конкретными описанными вариантами осуществления изобретения, будет проще для понимания в сочетании с прилагаемыми графическими материалами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0051] Для обеспечения лучшего понимания настоящего изобретения, сначала определены некоторые термины. Дополнительные определения изложены в процессе подробного описания.

[0052] Термин «IL4Rα» относится к альфа-субъединице рецептора интерлейкина 4. Термин «IL4Rα» включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитело, специфичное к белку IL4Rα человека, может в некоторых случаях вступать в перекрестную реакцию с белком IL4Rα из вида, отличного от человека, такого как обезьяна. В других вариантах осуществления антитело, специфичное к белку IL4Rα человека, может быть полностью специфичным к белку IL4Rα человека и не проявлять перекрестной реактивности в отношении других видов или других типов, или может вступать в перекрестную реакцию с IL4Rα некоторых других видов, но не всех других видов.

[0053] Термин «IL4Rα человека» относится к белку IL4Rα, имеющему аминокислотную последовательность от человека, такую как аминокислотная последовательность IL4Rα человека, имеющая учетный номер в Genbank NP_00124433 5.1. Термины «IL4Rα яванского макака» и «IL4Rα мартышки» относятся к последовательностям IL4Rα, имеющим, например, аминокислотные последовательности с учетными номерами в Genbank ЕНН60265.1 и NP_001244161.1, соответственно.

[0054] Термин «антитело», как упоминается в настоящем документе, включает целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или их одиночные цепи. Целые антитела представляют собой гликопротеины, содержащие две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначается в данном документе как V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначается в данном документе как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена C_L. Указанные V_H и V_L области можно дополнительно разделить на области гипервариабельности, называемые как области, определяющие комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

[0055] Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») в данном контексте относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, белком IL4Rα). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть выполнена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и C_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR); и (viii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая один вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет им быть получеными в виде одиночной белковой цепи, в которой области V_L и V_H спариваются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; и Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для включения в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники, и указанные фрагменты подвергают скринингу в отношении пригодности таким же образом, как и интактные антитела.

[0056] «Выделенное антитело», как используется в настоящем документе, предназначено для обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывает белок IL4Rα, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от белков IL4Rα). Выделенное антитело, которое специфически связывает белок IL4Rα человека, может, однако, иметь перекрестную реактивность в отношении других антигенов, таких как белки IL4Rα других видов. Кроме того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

[0057] Термины «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител», как используется в настоящем документе, относятся к препарату на основе молекул антител одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител проявляет одну специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу.

[0058] Термин «мышиное антитело», как используется в настоящем документе, предназначен для включения антител, имеющих вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии мыши. Кроме того, если указанное антитело содержит константную область, указанная константная область также происходит из последовательностей иммуноглобуллина зародышевой линии мыши. Мышиные антитела согласно настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, некодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии мыши (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин «мышиное антитело», как используется в настоящем документе, не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, были привиты на каркасные последовательности мыши.

[0059] Термин «химерное антитело» относится к антителу, полученному путем объединения генетического материала от нечеловеческого источника с генетическим материалом от человека. Или, в более общем смысле, химерное антитело представляет собой антитело, имеющее генетический материал от определенного вида вместе с генетическим материалом от другого вида.

[0060] Термин «гуманизированное антитело», как используется в настоящем документе, относится к антителу из видов, не являющихся человеком, белковые последовательности которых были модифицированы для повышения сходства с вариантами антител, продуцируемых в природе у человека.

[0061] Термин «изотип» относится к классу антител (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи.

[0062] Выражения «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфичное к антигену» используются в данном документе взаимозаменяемо с термином «антитело, которое специфически связывается с антигеном».

[0063] Как используется в настоящем документе, антитело, которое «специфически связывается с IL4Rα человека», предназначено для обозначения антитела, которое связывается с белком IL4Rα человека (и, возможно, белком IL4Rα одного или более видов, не являющихся человеком), но по существу не связывается с белками, не являющимися IL4Rα. Предпочтительно антитело связывается с белком IL4Rα человека с «высокой аффинностью», а именно с K_D 5,0×10^-8 М или менее, более предпочтительно 1,0×10^-8 М или менее и более предпочтительно 7,0×10^-9 М или менее.

[0064] Термин «по существу не связывается» с белком или клетками, как используется в настоящем документе, означает, что он не связывается или не связывается с высокой аффинностью с белком или клетками, то есть связывается с белком или клетками c K_D 1,0×10^-6 М или более, более предпочтительно 1,0×10^-5 М или более, более пред почтительно 1,0×10^-4 М или более, более предпочтительно l,0×l0^-3 М или более, еще более предпочтительно 1,0×10^-3 М или более.

[0065] Термин «высокая аффинность» для антитела IgG относится к антителу, имеющему K_B 1,0×10^-6 М или менее, более предпочтительно 5,0×10^-8 М или менее, еще более предпочтительно 1,0×10^-8 М или менее, еще более предпочтительно 7,0×10^-9 М или менее и еще более предпочтительно 1,0×10^-9 М или менее в отношении антигена-мишени. Однако «высокоаффинное» связывание может варьироваться для других изотипов антител. Например, «высокоаффинное» связывание для изотипа IgM относится к антителу, имеющему K_D 10^-6 М или менее, более предпочтительно 10^-7 М или менее, еще более предпочтительно 10^-8 М или менее.

[0066] Термин «К_ассоц» или «К_а», как используется в настоящем документе, предназначен для обозначения скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин «К_дис» или «K_d», как используется в настоящем документе, предназначен для обозначения скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «K_D», как используется в настоящем документе, предназначен для обозначения константы диссоциации, которую получают из отношения K_d к К_а (то есть K_d/K_a) и выражают в виде молярной концентрации (М). Значения K_D для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Предпочтительным способом определения K_D антитела является использование поверхностного плазмонного резонанса, предпочтительно с использованием биосенсорной системы, такой как система Biacore™.

[0067] Термин «ЕС₅₀», также известный как полумаксимальная эффективная концентрация, относится к концентрации антитела, которая индуцирует ответ наполовину между исходным уровнем и максимумом после определенного времени воздействия.

[0068] Термин «IC₅₀», также известный как полумаксимальная ингибирующая концентрация, относится к концентрации антитела, которое ингибирует специфическую биологическую или биохимическую функцию на 50% по сравнению с отсутствием антитела.

[0069] Термин «субъект» включает любого человека или животное, не являющееся человеком. Термин «животное, не являющееся человеком» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, не являющиеся человеком, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, земноводные и рептилии, хотя предпочтительными являются млекопитающие, такие как приматы, не являющиеся человеком, овцы, собаки, кошки, коровы и лошади.

[0070] Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество антитела согласно настоящему изобретению, достаточное для предотвращения или облегчения симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием (таким как рак), и/или уменьшения тяжести заболевания или состояния. Терапевтически эффективное количество следует рассматривать в контексте состояния, подлежащего лечению, где фактическое эффективное количество легко распознается специалистами в данной области техники.

[0071] Термин «идентичность», используемый в настоящем изобретении, относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями могут быть выполнены с помощью настроек по умолчанию алгоритма BLASTN/BLASTP, доступных на веб-сайте Национального центра биотехнологического института.

[0072] Различные аспекты настоящего изобретения более подробно описаны в следующих подразделах.

[0073] Антитела к IL4Rα, обладающие повышенной аффинностью связывания с IL4Rα человека и лучшей блокирующей активностью в отношении передачи сигналов IL4/IL13

[0074] Антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению специфически связывается с IL4Rα человека с сопоставимой, если не лучшей, аффинностью/способностью связывания по сравнению с ранее описанными антителами к IL4Rα, такими как дупилумаб.

[0075] Антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению блокирует связывание IL4Rα с IL4 или IL13-IL13Rα1 и, следовательно, блокирует соответствующую внутриклеточную трансдукцию сигнала с сопоставимой или более высокой активностью по сравнению с ранее описанными антителами к IL4Rα, такими как дупилумаб.

[0076] Предпочтительными антителами согласно изобретению являются гуманизированные моноклональные антитела. Дополнительно или в качестве альтернативы, антитела могут представлять собой, например, химерные моноклональные антитела.

[0077] Моноклональные антитела к IL4Rα

[0078] Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, структурно и химически охарактеризованное так, как описано ниже и в следующих примерах. Идентификационные номера аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой/легкой цепи антител суммированы в таблице 1 ниже, причем некоторые антитела имеют одинаковые V_H или V_L. Константная область тяжелой цепи для антител может представлять собой константную область тяжелой цепи IgG4 человека, имеющую аминокислотную последовательность, представленную, например, в SEQ ID NO: 55, и константная область легкой цепи для антител может представлять собой константную область каппа человека, имеющую аминокислотную последовательность, представленную, например, в SEQ ID NO: 56.

[0079] CDR вариабельной области тяжелой цепи и CDR вариабельной области легкой цепи в Таблице 1 были определены согласно системе нумерации по Кабату (Kabat). Однако, как хорошо известно в данной области техники, области CDR также могут быть определены с помощью других систем, таких как система/способ нумерации по Чотиа (Chothia) и IMGT, АbМ или Contact, на основе последовательностей вариабельной области тяжелой цепи/легкой цепи.

[0080] Последовательности V_H и V_L (или последовательности CDR) других антител к IL4Rα, которые связываются с IL4Rα человека, могут «сочетаться и комбинироваться» с последовательностями V_H и V_L (или последовательностями CDR) антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, когда цепи V_H и V_L (или CDR в таких цепях) сочетаются и комбинируются, последовательность V_H из конкретного спаривания V_H/V_L заменяют структурно подобной последовательностью V_H. Аналогично, предпочтительно последовательность V_L из конкретного спаривания V_H/V_L заменяют структурно подобной последовательностью V_L.

[0081] Соответственно, в одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающая часть содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную выше в Таблице 1; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную выше в Таблице 1, или V_L другого антитела к IL4Rα, где антитело специфически связывает IL4Rα человека.

[0082] В другом варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающая часть содержит:

(a) области CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, указанные выше в Таблице 1; и

(b) области CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи, указанные выше в Таблице 1, или CDR другого антитела к IL4Rα, где антитело специфически связывает IL4Rα человека.

[0083] В еще одном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть включает CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела к IL4Rα в сочетании с CDR других антител, которые связывают IL4Rα человека, например, CDR1 и/или CDR3 из вариабельной области тяжелой цепи, и/или CDR1, CDR2 и/или CDR3 из вариабельной области легкой цепи другого антитела к IL4Rα.

[0084] Кроме того, в данной области техники хорошо известно, что домен CDR3, независимо от домена(ов) CDR1 и/или CDR2, сам по себе может определять специфичность связывания антитела с распознанным антигеном и что можно предсказуемо получить несколько антител, обладающих одинаковой специфичностью связывания на основе общей последовательности CDR3. См., например, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.92:2529-2533 (1995); Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996); Berezov et al., BIAjournal 8: Scientific Review 8 (2001); Igarashi et al., J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998); Levi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993); Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) и Xu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000). См. также патент США №6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 и 5,760,185. Каждая из этих ссылок включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

[0085] Соответственно, в другом варианте осуществления изобретения антитела согласно настоящему изобретению содержат CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела к IL4Rα и по меньшей мере CDR3 вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи антитела к IL4Rα или CDR3 вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи другого антитела к IL4Rα, где антитело способно специфически связываться с IL4Rα человека. Эти антитела предпочтительно (а) конкурируют за связывание с IL4Rα; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом и/или (d) имеют схожую аффинность связывания, что и антитело к IL4Rα согласно настоящему изобретению. В еще одном варианте осуществления антитела дополнительно могут содержать CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела к IL4Rα или CDR2 вариабельной области легкой цепи другого антитела к IL4Rα, где антитело способно специфически связываться с IL4Rα человека. В другом варианте осуществления изобретения антитела согласно настоящему изобретению дополнительно могут включать CDR1 вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи антитела к IL4Rα или CDR1 вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи другого антитела к IL4Rα, где антитело способно специфически связываться с IL4Rα человека.

[0086] Консервативные модификации

[0087] В другом варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению содержит последовательности вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, которые отличаются от последовательностей антител к IL4Rα согласно настоящему изобретению одной или более консервативными модификациями. В данной области техники известно, что могут быть сделаны определенные консервативные модификации последовательности, которые не удаляют связывание антигена. См., например, Brummell et al., (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al., (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., (1998) Int. Immunol. 10:341-6 и Beers et al., (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43.

[0088] Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где:

(a) последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, указанную выше в Таблице 1, и/или ее консервативные модификации; и/или

(b) последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, указанную выше в Таблице 1, и/или ее консервативные модификации; и/или

(c) последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, указанную выше в Таблице 1, и/или ее консервативные модификации; и/или

(d) последовательности CDR1, и/или CDR2, и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи содержат последовательность(и), указанную(ые) выше в Таблице 1; и/или их консервативные модификации; и

(e) антитело специфически связывает IL4Rα человека.

[0089] Антитело согласно настоящему изобретению обладает одним или более из следующих функциональных свойств, описанных выше, таких как высокая аффинность связывание с IL4Rα человека и блокирующая активность в отношении связывания IL4Rα-IL4 или IL4Rα-IL13-IL13Rα1.

[0090] В различных вариантах осуществления антитело может представлять собой, например, мышиное, человеческое, гуманизированное или химерное антитело.

[0091] В настоящем документе термин «консервативные модификации последовательностей» предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления и делеции. Модификации могут быть введены в антитело согласно настоящему изобретению с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, таких как сайт-специфический мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семьи включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков в областях CDR антитела согласно настоящему изобретению могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть протестировано в отношении сохранения функции (т.е. функций, изложенных выше) с использованием функциональных анализов, описанных в настоящем документе.

[0092] Сконструированные и модифицированные антитела

[0093] Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием антитела, имеющего одну или более последовательностей V_H/V_L антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или более остатков в пределах одной или обеих вариабельных областей (то есть V_H и/или V_L), например, в пределах одной или более областей CDR и/или в пределах одной или более каркасных областей. Дополнительно или в качестве альтернативы, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в пределах константной(ых) области(ей), например, для изменения эффекторной функции(й) антитела.

[0094] В некоторых вариантах осуществления изобретения прививка CDR может быть использована для конструирования вариабельных областей антител. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести областях, определяющих комплементарность, (CDR) тяжелых и легких цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах CDR являются более отличающимися между отдельными антителами, чем последовательности за пределами CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических встречающихся в природе антител, могут быть экспрессированы путем конструирования векторов экспрессии, которые включают последовательности CDR из специфического встречающегося в природе антитела, привитых на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. См. также США 86:10029-10033; патент США№5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 и 6,180,370).

[0095] Соответственно, другой вариант осуществления изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие последовательности согласно настоящему изобретению, как описано выше, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие последовательности согласно настоящему изобретению, как описано выше. Хотя эти антитела содержат последовательности CDR V_H и V_L моноклонального антитела согласно настоящему изобретению, они могут содержать различные каркасные последовательности.

[0096] Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека "VBase" (доступна в Интернете по адресу www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat et al., (1991), цитируется выше; Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; и Cox et al., (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждого из которых напрямую включено в настоящий документ посредством ссылки. В качестве другого примера, последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека можно найти в базе данных Genbank. Например, следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, обнаруженные у мыши НСо7 HuMAb, доступны в сопроводительных учетных номерах Genbank: 1-69 (NG--0010109, NT--024637 и ВС070333), 3-33 (NG-0010109 и NT-024637) и 3-7 (NG-0010109 и NT-024637). В качестве другого примера, следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, обнаруженные у мыши НСо12 HuMAb, доступны в сопроводительных учетных номерах Genbank: 1-69 (NG-0010109, NT-024637 и ВС070333), 5-51 (NG-0010109 и NT-024637), 4-34 (NG-0010109 и NT-024637), 3-30,3 (CAJ556644) и 3-23 (AJ406678).

[0097] Последовательности белка антитела сравнивают с составленной базой данных последовательностей белка с использованием одного из способов поиска сходства последовательностей, называемого Gapped BLAST (Altschul et al., (1997), supra), который хорошо известен специалистам в данной области техники.

[0098] Предпочтительными каркасными последовательностями для применения в антителах согласно настоящему изобретению являются те, которые структурно схожи с каркасными последовательностями, используемыми антителами согласно настоящему изобретению. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 V_H могут быть привиты на каркасные области, которые имеют идентичную последовательность, подобную последовательности гена иммуноглобулина зародышевой линии, из которой получают каркасную последовательность, или последовательности CDR могут быть привиты на каркасные области, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях целесообразно осуществлять мутацию остатков в пределах каркасных областей для поддержания или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, патент США№5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 и 6,180,370).

[0099] Другой тип модификации вариабельной области представляет собой мутацию аминокислотных остатков в пределах областей CDR1, CDR2 и/или CDR3 V_H и/или V_L для улучшения тем самым одного или более связывающих свойств (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-специфический мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез могут быть выполнены для введения мутации(ий), и влияние на связывание антитела или другое представляющее интерес функциональное свойство может быть оценено в анализах in vitro или in vivo, известных из уровня техники. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как известно в данной области техники). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции, но предпочтительно представляют собой замены. Кроме того, обычно изменяется не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков в области CDR.

[00100] Соответственно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам к IL4Rα или их антигенсвязывающим частям, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) область CDR1 V_H, содержащую последовательность согласно настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений; (b) область CDR2 V_H, содержащую последовательность согласно настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений; (с) область CDR3 V_H, содержащую последовательность согласно настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений; (d) область CDR1 V_L, содержащую последовательность согласно настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений; (е) область CDR2 V_L, содержащую последовательность по настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений; и (f) область CDR3 V_L, содержащую последовательность согласно настоящему изобретению или аминокислотную последовательность, содержащую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений.

[00101] Сконструированные антитела по изобретению включают такие антитела, в которых были сделаны модификации в каркасных остатках в пределах V_H и/или V_L, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие каркасные модификации делают для снижения иммуногенности антитела. Например, одним из подходов является «обратное мутирование» одного или более каркасных остатков в соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых получено антитело.

[00102] Другой тип каркасной модификации включает мутацию одного или более остатков в пределах каркасной области или даже в пределах одной или более областей CDR для удаления эпитопов Т-клеток для уменьшения таким образом потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход также называют «деиммунизация», и он более подробно описан в публикации патента США №20030153043.

[00103] Дополнительно или в качестве альтернативы модификациям, произведенным в пределах каркасных или CDR-областей, антитела согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, что они включают модификации в пределах Fc-области, обычно для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полувыведения в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу могут быть присоединены один или более химических фрагментов) или может быть модифицировано для изменения его гликозилирования, также для изменения одного или более функциональных свойств антитела.

[00104] В одном варианте осуществления шарнирная область C_H1 модифицирована таким образом, что количество цистеиновых остатков в шарнирной области изменено, например, увеличено или уменьшено. Этот подход дополнительно описан в патенте США №5,677,425. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области C_H1 изменяют, например, для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или увеличения или уменьшения стабильности антитела.

[00105] В другом варианте осуществления шарнирную область Fc антитела подвергают мутации для уменьшения биологического периода полувыведения антитела. Более конкретно, одну или более аминокислотных мутаций вводят в область контакта доменов C_H2-C_H3 шарнирного фрагмента Fc, таким образом, что антитело имеет нарушенное связывание стафилококкового белка A (SpA) по сравнению со связыванием нативного шарнирного домена Fc с SpA. Этот подход дополнительно описан в патенте США №6,165,745.

[00106] В еще одном варианте осуществления модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено гликозилированное антитело (т.е., у антитела отсутствует гликозилирование). Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, могут быть выполнены одна или более аминокислотных замен, которые приводят к удалению одного или более сайтов гликозилирования каркаса вариабельной области, чтобы таким образом удалить гликозилирование на этом сайте. Такое агликозилирование может увеличить аффинность антитела к антигену. См., например, патенты США№5,714,350 и 6,350,861.

[00107] Дополнительно или в качестве альтернативы может быть получено антитело, которое имеет измененный тип гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее уменьшенные количества остатков фукозила, или антитело, имеющее увеличенные разветвляющиеся структуры GlcNac. Было продемонстрировано, что такие измененные паттерны гликозилирования увеличивают или снижают ADCC-способность антител. Такие углеводные модификации могут быть осуществлены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным аппартом гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования были описаны в уровне техники и могут быть использованы в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела согласно изобретению, в результате чего получают антитело с измененным гликозилированием. Например, в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 (а(1,6)-фукозилтрансфераза), так что антитела, экспрессируемые в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, не содержат фукозы на своих углеводах. FUT8-/- клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 были созданы путем целевого разрушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с использованием двух векторов замещения (см. публикацию патента США №20040110704 и Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера, ЕР 1,176,195 описывает клеточную линию с функционально разрушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, проявляют гипофукозилирование путем снижения или удаления фермента, связанного с α-1,6-связью. В ЕР 1,176,195 также описаны клеточные линии, которые обладают низкой ферментативной активностью из-за добавления фукозы к N-ацетилглюкозамину, который связывается с Fc-областью антитела или не обладает ферментативной активностью, например, клеточная линия миеломы крыс YB2/0 (АТСС CRL 1662). В публикации РСТ WO 03/035835 описан вариант клеточной линии СНО (клетка яичника китайского хомячка), клетки Lec13, с уменьшенной способностью присоединять фукозу к Аsn(297)-соединенным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также, Shields et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). Антитела с модифицированным профилем гликозилирования также могут быть получены в куриных яйцах, как описано в публикации РСТ WO 06/089231. В качестве альтернативы антитела с модифицированным профилем гликозилирования могут быть получены в растительных клетках, таких как Lemna (Ряска). Способы получения антител в растительной системе описаны в патентной заявке США, соответствующей №040989/314911 в патентном реестре Alston & Bird LLP, поданной 11 августа 2006 года. Остатки фукозы антитела могут быть отщеплены с использованием фермента фукозидазы; например, фукозидаза α-L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Tarentino et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).

[00108] Еще одной модификацией антител согласно изобретению, которая рассматривается в настоящем описании, является пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения биологического (например, сывороточного) периода полувыведения антитела. Для пегилирования антитела антитело или его фрагмент обычно подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное PEG, в условиях, когда одна или более групп PEG присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно легирование может быть осуществлено путем реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичным реакционноспособный водорастворимым полимером). Используемый здесь термин «полиэтиленгликоль» предназначен для охвата любой из форм PEG, которые были использованы для дериватизации других белков, таких как моно (C₁-С₁₀) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В некоторых вариантах осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области и могут быть применены к антителам по изобретению. См., например, ЕР 0154316 и ЕР 0401384.

[00109] Физические свойства антител

[00110] Антитела согласно настоящему изобретению могут быть охарактеризованы с помощью их различных физических свойств для обнаружения и/или дифференцировки их различных классов.

[00111] Например, антитела могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Такие сайты гликозилирования могут приводить к повышению иммуногенности антитела или изменению рК антитела из-за измененного связывания антигена (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172: 5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) G1ycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело к IL4Rα, которое не содержит гликозилирования вариабельной области. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител, которые не содержат мотив гликозилирования в вариабельной области, либо путем мутации остатков в области гликозилирования.

[00112] В предпочтительном варианте осуществления антитела не содержат сайтов изомеризма аспарагина. Дезаминирование аспарагина может происходить на последовательностях N-G или D-G и приводить к созданию остатка изоаспарагиновой кислоты, который вводит связь в полипептидную цепь и снижает ее стабильность (эффект изоаспарагиновой кислоты).

[00113] Каждое антитело будет иметь уникальную изоэлектрическую точку (pI), которая обычно находится в диапазоне рН от 6 до 9,5. Эта pI для антитела IgG1 обычно находится в диапазоне рН от 7 до 9,5, a pI для антитела IgG4 обычно находится в диапазоне рН от 6 до 8. Существует предположение, что антитела с pI за пределами нормального диапазона могут иметь некоторое разворачивание и нестабильность в условиях in vivo. Таким образом, предпочтительно иметь антитело к IL4Rα, которое имеет значение pI, которое находится в нормальном диапазоне. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител с pI в нормальном диапазоне, либо путем мутации заряженных поверхностных остатков.

[00114] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по изобретению

[00115] В другом аспекте настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи или CDR антител согласно настоящему изобретению. Указанные нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целой клетке, в клеточном лизате, или в частично очищенной или в по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является «выделенной» или «по существу чистой» при очистке от других клеточных компонентов или других загрязнений, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик. Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота является молекулой кДНК.

[00116] Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены с использованием стандартных молекулярно биологических методик. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами, полученными из трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобуллина человека, как описано далее), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, производимого гибридомой, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации или технологий клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с использованием методики фагового дисплея), нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело может быть восстановлена из библиотеки генов.

[00117] Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию включают молекулы, кодирующие последовательности V_H и V_L моноклонального антитела к IL4Rα или CDR. После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты V_H и V_L, с этими фрагментами ДНК можно проводить дополнительные манипуляции, используя стандартные методы на основе рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены цепей полноразмерного антитела, гены Fab-фрагментов или ген scFv. При этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий V_L или V_H, фунционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Термин «функционально связанный», используемый в данном контексте, предназначен для обозначения того, что два фрагмента ДНК объединены так, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.

[00118] Выделенная ДНК, кодирующая область V_H, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей V_H, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области (C_H1, C_H2 и C_H3) тяжелой цепи. Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области техники, и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента, ДНК, кодирующая V_H, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область C_H1 тяжелой цепи.

[00119] Выделенная ДНК, кодирующая область V_L, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания ДНК, кодирующей V_L, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, C_L. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области техники, и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены с помощью стандартной ПЦР-амплификации. В предпочтительных вариантах осуществления константная область легкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда.

[00120] Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие V_H и V_L, функционально связаны с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так что последовательности V_H и V_L могут быть экспрессированы в виде непрерывного одноцепочечного белка, причем области V_L и V_H соединены гибким линкером (см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

[00121] Получение моноклональных антител согласно изобретению

[00122] Моноклональные антитела (mAb) согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием хорошо известной методики гибридизации соматических клеток (гибридомы) из Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Другие варианты осуществления изобретения для получения моноклональных антител включают вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов и методики фагового дисплея. Химерные или гуманизированные антитела также хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США №4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 и 6,180,370, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00123] Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела согласно изобретению

[00124] Антитела согласно настоящему изобретению также могут быть получены в трансфектоме клетки-хозяина с использованием, например, комбинации методов рекомбинантной ДНК и способов трансфекции генов, как хорошо известно в данной области техники (например, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). В одном варианте осуществления изобретения ДНК, кодирующая частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные стандартными методами молекулярной биологии, встраивается в один или более векторов экспрессии таким образом, что гены функционально связаны с транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями. В этом контексте под термином «функционально связанный» следует понимать, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности внутри вектора выполняют предназначенную для них функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела.

[00125] Термин «регуляторная последовательность» следует понимать, кака включающий промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии клеток-хозяев млекопитающих включают вирусные элементы, которые контролируют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяны 40 (SV40), аденовируса, например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP), и полиомы. В качестве альтернативы можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор β-глобина. Кроме того, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из различных источников, такие как система промотора SRα, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинного терминального повтора вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (Takebe et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином.

[00126] Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в один и тот же или отдельные векторы экспрессии. В предпочтительных вариантах осуществления вариабельные области используют для создания полноразмерных генов антител любого изотипа антитела путем их вставки в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи желаемого изотипа, так что сегмент V_H функционально связан с сегментом(ами) C_H в пределах вектора, а сегмент V_L функционально связан с сегментом C_L в пределах вектора. Дополнительно или в качестве альтернативы, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, что облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен в рамке считывания с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетеро логичным сигнальным пептидом (то есть сигнальным пептидом белка, не являющегося иммуноглобулином).

[00127] Для экспрессии легкой и тяжелой цепей, вектор(ы) экспрессии, кодирующий(ие) тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяин стандартными методами. Различные формы термина «трансфекция» предназначены, чтобы охватывать широкий спектр методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию DEAE-декстраном и тому подобное. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела согласно настоящему изобретению в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки, и в частности клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, собирают и секретируют правильно свернутое и иммунологически активное антитело.

[00128] Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR (дигидрофолатредуктаза), например, как описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159: 601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для применения клеток миеломы NSO, еще одной предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии гена GS, раскрытая в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338,841. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культур ал ьной среды стандартными методами очистки белка.

[00129] Биспецифические молекулы

[00130] В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, содержащим одно или более антител согласно настоящему изобретению, соединенных по меньшей мере с одной другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом для рецептора), для получения биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Таким образом, в данном контексте «биспецифическая молекула» включает молекулы, которые имеют три или более специфичности.

[00131] В одном варианте осуществления изобретения биспецифическая молекула имеет, в дополнение к специфичности связывания с Fc и специфичности связывания с IL4Rα, третью специфичность.

[00132] Биспецифические молекулы могут присутствовать во многих различных форматах и размерах. На одном конце размерного спектра биспецифическая молекула сохраняет традиционный формат антитела, за исключением того, что вместо двух связывающих плеч одинаковой специфичности, она имеет два связывающих плеча, каждое из которых имеет разную специфичность. На другом конце находятся биспецифические молекулы, состоящие из двух одноцепочечных фрагментов антител (scFv), соединенных пептидной цепью, так называемой конструкцией Bs(scFv)2. Биспецифические молекулы промежуточного размера включают два различных фрагмента F(ab), соединенных пептидильным линкером. Биспецифические молекулы этих и других форматов могут быть получены с помощью генной инженерии, соматической гибридизации или химических методов. См., например, Kufer et al., цитируемые выше; Сао and Suresh, Bioconjugate Chemistry, 9 (6), 635-644 (1998); и van Spriel et al., Immunology Today, 21 (8), 391-397 (2000), и ссылки, цитируемые в них.

[00133] Иммуноконъюгаты

[00134] Антитела согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с терапевтическим агентом с образованием иммуноконъюгата, такого как конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC). Подходящие терапевтические агенты включают цитотоксины, алкилирующие агенты, ДНК, связывающаяся с малой бороздой, ДНК-интеркаляторы, ДНК-сшивающие агенты, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы ядерного экспорта, ингибиторы протеасом, ингибиторы топоизомеразы I или II, ингибиторы белка теплового шока, ингибиторы тирозинкиназы, антибиотики и антимитотические агенты. В ADC антитело и терапевтический агент предпочтительно конъюгированы через расщепляемый линкер, такой как пептидильный, дисульфидный или гидразоновый линкер. Более предпочтительно линкер представляет собой пептидильный линкер, такой как Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-G1y-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser или G1u. ADC могут быть получены, как описано в патенте США №7,087,600; 6,989,452 и 7,129,261; публикациях РСТ WO 02/096910; WO 07/038,658; WO 07/051,081; WO 07/059,404; WO 08/083,312; и WO 08/103,693; публикациях патентов США 20060024317; 20060004081 и 20060247295; описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00135] Онколитический вирус, кодирующий антитело или несущий антитело

[00136] Онколитический вирус предпочтительно инфицирует и убивает раковые клетки. Антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в сочетании с онколитическими вирусами. В качестве альтернативы, онколитические вирусы, кодирующие антитела по настоящему изобретению, могут быть введены в организм человека.

[00137] Химерный антигенный рецептор

[00138] В настоящем документе также предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий scFv к IL4Rα, где scFv к IL4Rα содержит CDR и вариабельные области тяжелой/легкой цепи, описанные в настоящем документе.

[00139] CAR к IL4Rα может содержать (а) внеклеточный антигенсвязывающий домен, содержащий scFv к IL4Rα; (b) трансмембранный домен и (с) внутриклеточный сигнальный домен.

[00140] CAR может содержать сигнальный пептид на N-конце внеклеточного антигенсвязывающего домена, который направляет зарождающийся рецептор в эндоплазматический ретикулум, и шарнирный пептид на N-конце внеклеточного антигенсвязывающего домена, который делает рецептор более доступным для связывания. CAR предпочтительно содержит во внутриклеточном сигнальном домене первичный внутриклеточный сигнальный домен и один или более костимулирующих сигнальных доменов. В основном используемым и наиболее эффективным первичным внутриклеточным сигнальным доменом является цитоплазматический домен CD3-дзета, который содержит ITAM (иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив), фосфорилирование которого приводит к активации Т-клеток. Ко стимулирующий сигнальный домен может быть получен из костимулирующих белков, таких как CD28, CD 137 и ОХ40.

[00141] CAR могут дополнительно добавлять факторы, которые усиливают размножение Т-клеток, устойчивость и противоопухолевую активность, такие как цитокины, и костимулирующие лиганды.

[00142] Также предложены сконструированные иммунные эффекторные

клетки, содержащие CAR, предложенный в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунная эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, NK-клетку (естественная киллерная клетка), мононуклеарную клетку периферической крови (МКПК), гемопоэтическую стволовую клетку, плюрипотентную стволовую клетку или эмбриональную стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунная эффекторная клетка представляет собой Т-клетку.

[00143] Фармацевтические композиции

[00144] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей одно или более антител (или их антигенсвязывающую часть, или биспецифические агенты, CAR-T-клетки, онколитические вирусы, иммуноконъюгаты) согласно настоящему изобретению, составленных вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Антитела (или их антигенсвязывающую часть, или биспецифические агенты, CAR-T-клетки, онколитические вирусы, иммуноконъюгаты) можно вводить отдельно, когда композиция содержит более одного антитела (или его антигенсвязывающей части, или биспецифических агентов, CAR-Т-клеток, онколитических вирусов, иммуноконъюгатов). Композиция может необязательно содержать один или более дополнительных фармацевтически активных ингредиентов, таких как другое антитело или лекарственное средство, такое как противоопухолевое лекарственное средство или противоаллергическое средство.

[00145] Фармацевтическая композиция может содержать любое количество эксципиентов. Эксципиенты, которые могут быть использованы, включают носители, поверхностно-активные агенты, загустители или эмульгаторы, твердые связующие вещества, дисперсионные или суспензионные добавки, солюбилизаторы, красители, ароматизаторы, покрытия, дезинтегрирующие агенты, смазывающие вещества, подсластители, консерванты, изотонические агенты и их комбинации. Выбор и использование подходящих эксципиентов описаны в Gennaro, ed, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003), описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00146] Предпочтительно, фармцевтические композиции являются пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, инъекцией или инфузией). В зависимости от способа введения, активный ингредиент может быть покрыт материалом, чтобы защитить его от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать его. Выражение «парентеральное введение», как используется в данном описании, обозначает способы введения, отличные от энтерального введения и местного применения, обычно путем инъекции, и включают, но не ограничиваются, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. В качестве альтерантивы антитело согласно настоящему изобретению можно вводить не парентеральным способом, таким как местный, эпидермальный или мукозальный способ введения, например, интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.

[00147] Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильных водных растворов или дисперсий. Они также могут быть составлены в виде микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства.

[00148] Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с материалом-носителем для получения единичной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа введения и, в целом, будет представлять собой количество композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект. В целом, из ста процентов это количество будет находиться в диапазоне от около 0,01% до около девяносто девяти процентов активного ингредиента, предпочтительно от около 0,1% до около 70%, наиболее предпочтительно от около 1% до около 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[00149] Режимы дозирования можно регулировать для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введен один болюс, может быть введено несколько раздельных доз на протяжении периода времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с требованиями, обусловленными терапевтической ситуацией. Особенно предпочтительно составлять парентеральные композиции в виде единичной дозированной формы для простоты введения и однородности дозирования. Единичная дозированная форма в данном контексте относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве однократных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного ингредиента, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. В качестве альтернативы, антитело можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, в этом случае требуется менее частое введение.

[00150] Для введения композиции дозировка может находиться в диапазоне от около 0,0001 до 100 мг/кг и чаще от 0,01 до 5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в диапазоне от 1 до 10 мг/кг. Пример режима лечения включает введение один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые три месяца или один раз каждые три-шесть месяцев. Предпочтительные режимы дозирования для антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению включают 1 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела путем внутривенного введения, причем антитело вводят с использованием одной из следующих схем дозирования: (i) каждые четыре недели для шести доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела один раз с последующим введением 1 мг/кг массы тела каждые три недели. В некоторых способах дозировку регулируют для достижения концентрации антитела в плазме около 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах около 25-300 мкг/мл.

[00151] "Терапевтически эффективная доза" антитела к IL4Rα или его антигенсвязывающей части, или биспецифических агентов, CAR-T-клеток, онколитических вирусов, иммуноконъюгатов согласно настоящему изобретению предпочтительно приводит к уменьшению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов отсутствия симптомов заболевания или предотвращению ухудшения или недееспособности вследствие поражения заболеванием. Например, для лечения субъектов, имеющих опухоль, «терапевтически эффективная доза» предпочтительно ингибирует рост опухоли по меньшей мере на около 20%, более предпочтительно по меньшей мере на около 40%, еще более предпочтительно по меньшей мере на около 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере на около 80% по сравнению с субъектами, не получавшими лечение. Терапевтически эффективное количество терапевтического антитела может уменьшить размер опухоли или иным образом облегчать симптомы у субъекта, который, как правило, является человеком или может быть другим млекопитающим.

[00152] Фармацевтическая композиция может представлять собой состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, био совместимые полимеры, такие как этиле нвинил ацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00153] Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, таких как (1) безыгольные устройства для подкожных инъекций (например, патент США №5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 и 4,596,556); (2) микроинфузионные насосы (патент США №4,487,603); (3) трансдермальные устройства (патент США №4,486,194); (4) инфузионные устройства (патенты США №4,447,233 и 4,447,224) и (5) осмотические устройства (патент США №4,439,196 и 4,475,196); описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00154] В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональные антитела согласно настоящему изобретению могут быть составлены для обеспечения надлежащего распределения in vivo. Например, для обеспечения того, чтобы терапевтическое антитело согласно изобретению пересекало гематоэнцефалический барьер, они могут быть составлены в форме липосом, которые могут дополнительно содержать нацеливающие фрагменты для усиления селективного переноса к конкретным клеткам или органам. См., например, патенты США №4,522,811; 5,374,548; 5,416,016 и 5,399,331; V. V. Ranade (1989) J. Clin.Pharmacol.29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al., (1995) FEBS Lett.357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; и Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

[00155] Применения и способы согласно изобретению

[00156] Композиция, содержащая антитела или их антигенсвязывающую часть, или биспецифические агенты, CAR-T-клетки, онколитические вирусы, иммуноконъюгаты по настоящему изобретению, обладает многочисленными практическими применениями in vitro и in vivo, включая, например, лечение аллергических заболеваний с избыточной передачей сигнала IL4 и/или IL13.

[00157] Учитывая способность антител к IL4Rα согласно настоящему изобретению блокировать связывание IL4Rα с IL4 или IL13-IL13Rα1 для снижения иммунитета 2 типа, в настоящем изобретении предложены способы лечения аллергических заболеваний, связанных с иммунитетом 2 типа, включающие введение субъекту композиции согласно настоящему изобретению. Аллергическое заболевание может представлять собой атопический дерматит, анафилактическую реакцию, аллергический ринит или аллергическую астму.

[00158] В другом аспекте, поскольку передача сигнала IL4 или IL13 активирует молекулы STAT6, и было обнаружено, что ингибитор STAT6 ингибирует рост раковых клеток, в настоящем изобретении предложен способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, включающий введение субъекту композиции согласно настоящему изобретению таким образом, что рост опухоли у субъекта ингибируется. Неограничивающие примеры опухолей, которые можно лечить с помощью антител согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, меланому, рак легких, рак почки, рак предстательной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак яичника и уротелиальный рак.

[00159] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу уменьшения или ингибирования активации клеток, чувствительных к IL-4 или IL-13. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибирование активации включает ингибирование продукции или секреции цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибирование активации включает ингибирование пролиферации. Клетки, чувствительные к IL-4 за счет стимуляции гибридных рецепторов IL-4Rα/γC, включают, но не ограничиваются, В-клетки, эозинофилы и макрофаги. Клетки, чувствительные к IL-13 за счет стимуляции гибридных рецепторов IL-4Rα/IL-3Rα1, включают, но не ограничиваются, фибробласты и клетки гладких мышц. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации клеток гладких мышц. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования пролиферации фибробластов.

[00160] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к диагностическим способам, композициям и наборам. В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению используют для определения наличия и экспрессии IL4Rα в клетке или ткани. В одном варианте осуществления изобретения диагностика указывает прогноз и/или регулирует лечение и/или последующее наблюдение за ходом лечения. Например, наблюдается, что сверхэкспрессия IL4Rα при раке мочевого пузыря человека коррелирует с патологической степенью и стадией заболевания. В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению применяют для диагностики степени и стадии рака мочевого пузыря. Наблюдается, что высокая экспрессия IL-4Rα коррелирует с повышенной вероятностью рецидива рака полости рта. В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению используют в наборе или способе для диагностики рака полости рта для определения прогноза и соответствующего лечения и последующего наблюдения. Экспрессия IL-4Rα в опухоли обратно коррелирует с выживаемостью у пациентов, перенесших хирургическую резекцию эпителиальной злокачественной плевральной мезотелиомы (МРМ). В одном варианте осуществления антитело согласно настоящему изобретению используют в диагностическом наборе или способе для определения прогноза и соответствующего лечения и/или последующего наблюдения за МРМ.

[00161] Комбинированная терапия

[00162] В одном аспекте настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, в которой антитела к IL4Rα или их антигенсвязывающую часть, или биспецифические агенты, онколитические вирусы согласно настоящему изобретению вводят совместно с одним или более дополнительными агентами, которые эффективны для облегчения симптомов аллергии, связанных с иммунитетом 2 типа. Такие агенты могут представлять собой противогистаминные средства, нацеленные на гистаминовый рецептор H₁, клинически используемые для лечения аллергического ринита, или кортикостероиды, агонисты бета-адренергических рецепторов и лекарственные средства, нацеленные на Cyc-LT, которые клинически предназначены для лечения астмы. Омализумаб, антитело к IgE, также можно применять с антителами или их антигенсвязывающей частью или биспецифическими агентами, онколитическими вирусами по настоящему изобретению для лечения аллергических заболеваний. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является человек.

[00163] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам комбинированной терапии, в которых антитела к IL4Rα или их антигенсвязывающую часть, или биспецифические агенты, CAR-T-клетки, онколитические вирусы, иммуноконъюгаты по настоящему изобретению вводят совместно с одним или более дополнительными антителами, которые эффективны для ингибирования роста опухоли у субъекта. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухоли у субъекта, включающему введение субъекту антитела к IL4Rα (или его антигенсвязывающей части, или биспецифических молекул, онколитического вируса, CAR-T-клеток, иммуноконъюгатов) и одного или более дополнительных антител, таких как антитело к ОХ40, антитело к TIM-3, антитело к CD 137, антитело к GITR, антитело к LAG-3, антитело к PD-L1 и антитело к PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является человек. Блокада пути IL4Rα также может быть дополнительно скомбинирована со стандартными способами лечения рака. Например, блокада пути IL4Rα может быть скомбинирована с блокадой LAG-3 и/или PD-1, а также химиотерапевтическими режимами. Например, химиотерапевтический агент можно вводить с антителами к IL4Rα, которые могут представлять собой цитотоксический агент. Например, эпитубицин, оксалиплатин и 5-FU вводят пациентам, получающим анти-IL4Rα терапию. Необязательно, комбинация антитела к IL4Rα и одного или более дополнительных антител (например, антител к LAG-3 и/или к PD-1) может быть дополнительно скомбинирована с иммуногенным агентом, таким как раковые клетки, очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и углеводные молекулы) и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины (Не et al., (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Неограничивающие примеры опухолевых вакцин, которые могут быть использованы, включают пептиды антигенов меланомы, такие как пептиды gp100, антигены MAGE, Trp-2, MART1 и/или тирозиназа, или опухолевые клетки, трансфицированные для экспрессии цитокина GM-CSF. Другие виды терапии, которые могут быть скомбинированы с антителом к IL4Rα, включают, но не ограничиваются, введение интерлейкина-2 (IL-2), лучевую терапию, хирургическое вмешательство или выключение эндокринной функции.

[00164] Комбинацию терапевтических агентов, обсуждаемых в настоящем документе, можно вводить одновременно в виде одной композиции в фармацевтически приемлемом носителе или одновременно в виде отдельных композиций с каждым агентом в фармацевтически приемлемом носителе. В другом варианте осуществления изобретения комбинацию терапевтических агентов можно вводить последовательно.

[00165] Кроме того, если последовательно вводят более одной дозы комбинированной терапии, порядок последовательного введения может быть изменен или сохранен в том же порядке в каждый момент времени введения, последовательные введения могут быть скомбинированы с одновременными введениями или любая их комбинация.

[00166] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрированоследующими примерами, которые не следует рассматривать как дополнительно ограничивающие. Содержание всех графических материалов и всех ссылок, последовательностей из Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых по всей настоящей заявке, напрямую включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00167] Примеры

[00168] Пример 1 Получение мышиных моноклональных антител к IL4Rα с использованием гибридомной технологии

[00169] Иммунизация

[00170] Мышей иммунизировали в соответствии со способом, описанным в Е Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998. В качестве иммуногена использовали рекомбинантный белок IL4Rα-his человека (Sino biological inc., кат. №10402-Н08Н), и для определения титра антисыворотки и для скрининга гибридом, секретирующих антиген-специфические антитела, использовали изготовленный в лаборатории белок IL4Rα-his человека (аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 57). Иммунизирующие дозы содержали 20 мкг белка IL4Rα-his человека/мышь/инъекция как для первичной, так и для бустерной иммунизации. Для усиления иммунного ответа использовали полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда (Sigma, St. Louis, Mo., США), соответственно, для первичной и бустерной иммунизации. Вкратце, смесь адъюванта и антигена получали, сначала осторожно перемешивая адъювант во флаконе с использованием вихревой мешалки. Требуемое количество адъюванта переносили в автоклавированную микроцентрифужную пробирку емкостью 1,5 мл. Антиген получали в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) или физиологическом растворе с концентрацией в диапазоне от 0,2 до 0,3 мг/мл. Затем вычисленное количество антигена добавляли в микроцентрифужную пробирку с адъювантом и полученную смесь осторожно перемешивали с вихревой мешалкой в течение 2 минут для получения эмульсий вода-в-масле. Затем эмульсию адъюванта и антигена забирали в соответствующий шприц для инъекции животным. В общей сложности 20 мкг антигена инъецировали в объеме от 150 до 200 мкл. Каждое животное иммунизировали, а затем бустировали 2-3 раза в зависимости от титра антисыворотки. Животным с хорошими титрами вводили финальный буст путем внутрибрюшинной инъекции перед слиянием.

[00171] Слияние гибридом и скрининг

[00172] Клетки линии клеток миеломы мыши (SP2/0-Ag14, ATCC#CRL-1581) культивировали для достижения стадии логарифмической фазы непосредственно перед слиянием. Клетки селезенки иммунизированных мышей получали стерильно и сливали с клетками миеломы в соответствии со способом, описанным в Kohler G, and Milstein С, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity," Nature, 256: 495-497 (1975). Затем слитые «гибридные клетки» распределяли в 96-луночные планшеты в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла)/20% FCS (фетальная телячья сыворотка)/НАТ (гипоксантин-аминоптеринтимидиновая среда). Выжившие колонии гибридом наблюдали под микроскопом через семь-десять дней после слияния. Через две недели супернатант из каждой лунки подвергали скринингу на основе ИФА (иммуноферментный анализ) с использованием рекомбинантного белка IL4Rα-his человека. Вкратце, планшеты для ИФА покрывали 60 мкл IL4Rα-his человека (2,0 мкг/мл в PBS) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали 4 раза PBST (фосфатно-солевой буфер с твином) и блокировали 200 мкл блокирующего буфера (5 мас./об.% нежирного молока в PBST). В каждую лунку добавляли разбавленный супернатант гибридом (60 мкл) и инкубировали при 37°С в течение 40 минут. Затем планшеты промывали 4 раза, для обнаружения использовали HRP (пероксидаза хрена)-козье анти-мышиное IgG антитело (Jackson Immuno research, кат. №115-036-071) и наблюдали OD (оптическая плотность) связывания при 450 нм. Затем отбирали и переносили в 24-луночные планшеты положительную гибридому, секретирующую антитело, которая связывается с белком IL4Rα-his человека. Клоны гибридом, продуцирующие антитела, которые показали высокие специфичность связывания IL4Rα человека и активности блокирования IL4Rα-IL4 или IL4Rα-13Rα1-IL13, субклонировали путем лимитирующего разбавления для обеспечения клональности клеточной линии, а затем очищали моноклональные антитела. Вкратце, колонку с белком А сефароза (от bestchrom (Shanghai) Biosciences, кат. №АА0273) промывали с использованием буфера PBS 5-10 объемами колонки. Супернатанты клеток пропускали через колонки, а затем колонки промывали с использованием буфера PBS до тех пор, пока оптическая плотность белка не достигала исходного уровня. Колонки элюировали элюирующим буфером (0,1 М глицин-HCl, рН 2,7) и сразу же собирали в пробирки емкостью 1,5 мл с нейтрализующим буфером (1 М Трис-HCl, рН 9,0). Фракции, содержащие иммуноглобулины, объединяли и диализировали в PBS в течение ночи при 4°С. Затем функциональные активности in vitro очищенных моноклональных антител охарактеризовывали следующим образом.

[00173] Пример 2 Определение аффинности связывания мышиных моноклональных антител к IL4Rα с использованием поверхностного плазмонного резонанса BIACORE

[00174] Очищенные мышиные моноклональные антитела (mAb) к IL4Rα, полученные в примере 1, охарактеризовывали по аффинности связывания и кинетике связывания с помощью системы Biacore Т200 (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США).

[00175] Вкратце, козье анти-мышиное IgG антитело (GE healthcare, кат. № BR100838, Mouse Antibody Capture Kit (набор для захвата мышиного антитела)) ковалентно связывали с чипом СМ5 (чип с покрытием из карбоксиметилдекстрана) с помощью первичных аминов, используя стандартный набор для связывания аминов, предоставленный Biacore (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США). Непрореагировавшие фрагменты на поверхности биосенсора блокировали этаноламином. Затем очищенные антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению в концентрации 66,67 нМ и эталон антитела к IL4Rα (Dupilumab (дупилумаб), также называемый ВМ) в концентрации 10 мкг/мл пропускали на чип со скоростью потока 10 мкл/мин. Затем последовательно разбавленный рекомбинантный IL4Rα-his человека (изготовленный в лаборатории, аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 57), белок IL4Rα-his яванского макака (Sino biological inc., кат. №90897-С08Н) или белок IL4Rα-his мартышки (изготовленный на заказ компанией Sino biological inc., также называемый cal-IL4Rα-his, аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 58) в буфере HBS ЕР (забуференный 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин этансульфоновой кислотой физиологический раствор с ЭДТА и поверхностно-активным веществом) (предоставленный Biacore) пропускали на чип со скоростью потока 30 мкл/мин. Кинетику ассоциации антигена и антитела наблюдали в течение 2 минут, и кинетику диссоциации наблюдали в течение 10 минут. Кривые ассоциации и диссоциации соответствовали модели связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения для оценки BIA. Значения K_D, К_а и K_d определяли и суммировали в таблице 2 ниже.

[00176] Все мышиные антитела согласно изобретению специфически связывались с IL4Rα человека, и большинство из них демонстрировали сопоставимую или более высокую аффинность связывания по сравнению с эталоном.

[00177] Пример 3 IL4Rα-связывающая активность мышиных антител к IL4Rα

[00178] Связывающую активность мышиных антител к IL4Rα согласно настоящему изобретению с IL4Rα определяли с помощью ИФА с захватом, проточной цитометрии (FACS) и непрямого ИФА.

[00179] 3.1 ИФА с захватом

[00180] Вкратце, 96-луночные планшеты покрывали 2 мкг/мл козьего анти-мышиного IgG, специфического к фрагменту Fcγ (Jackson Immuno Research, кат. №115-005-008), в PBS, 100 мкл/лунка, в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали один раз промывочным буфером (PBS+0,05 мас./об.% Твин-20, PBST), а затем блокировали 200 мкл/лунку блокирующим буфером (5 мас./об.% нежирное молоко в PBST) в течение 2 часов при 37°С. Планшеты снова промывали и инкубировали с 100 мкл/лунку последовательно разбавленных антител к IL4Rα согласно изобретению, эталона или отрицательного контроля hIgG (иммуноглобулина человека (рН4) для внутривенной инъекции, Hualan Biological Engineering Inc.) (5-кратное разбавление в 2,5 мас./об.% нежирного молока в PBST, начиная с 66,7 нМ) в течение 40 минут при 37°С, а затем снова промывали 4 раза. Планшеты, содержащие захваченные антитела к IL4Rα, инкубировали с меченым биотином белком IL4Rα-his человека (изготовленный в лаборатории с SEQ ID NO: 57, 0,14 нМ в 2,5 мас./об.% нежирного молока в PBST, 100 мкл/лунку) в течение 40 минут при 37°С, промывали 4 раза и инкубировали с конъюгированной со стрептавидином HRP (разбавление 1:10000 в PBST, Jackson Immuno Research, кат. №016-030-084, 100 мкл/лунку) в течение 40 минут при 37°С. После финальной промывки планшеты инкубировали с 100 мкл/лунку ИФА-субстрата ТМВ (тетраметилбензидиновый субстрат) (Innoreagents, кат. №TMB-S-002). Реакцию останавливали через 10 минут при 25°С с помощью 50 мкл/лунку 1М H₂SO₄, и считывали оптическую плотность при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения ЕС₅₀.

[00181] 3.2 FACS связывания на основе клеток

[00182] Связывающую активность мышиных антител к IL4Rα в отношении IL4Rα, экспрессируемого на поверхности клеток 293F-IL4Rα, исследовали с помощью проточной цитометрии (FACS). Вкратце, клетки 293F (Thermofisher Inc., кат. №11625019) трансфицировали плазмидной конструкцией pCMV-T-P с нуклеотидом, кодирующим IL4Rα человека (аминокислотные остатки 1-825 с uniprot №Р24394-1) между EcoRI и XbaI, и для последующих анализов FACS связывания на основе клеток и блокирования лигандов на основе клеток выбирали стабильный пул клеток под названием 293F-IL4Rα. Клетки 293F-IL4Rα собирали из колб для культивирования клеток, дважды промывали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 2 об.% фетальной бычьей сыворотки (буфер FACS). Затем 2×10⁵ клеток на лунку в 96-луночных планшетах инкубировали в 100 мкл антител к IL4Rα или контролей с различными концентрациями (начиная с 80 нМ с 4-кратным последовательным разбавлением) в буфере FACS в течение 40 минут на льду. Клетки дважды промывали буфером FACS и добавляли 100 мкл/лунку R-фикоэритрина аффинно очищенного F(ab')₂ фрагмента козьего анти-мышиного IgG (H+L) (разбавление 1:1000 в буфере FACS, Jackson Immunoresearch, кат. №115-116-146). После инкубации в течение 40 минут при 4°С в темноте клетки промывали три раза и ресуспендировали в буфере FACS. Флуоресценцию измеряли с использованием оборудования Becton Dickinson FACS Canto II-HTS. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения ЕС₅₀.

[00183] 3.3 Непрямой ИФА

[00184] Измеряли перекрестную реакцию антител к IL4Rα с белками IL4Rα яванского макака или белками cal-IL4Rα-his. Вкратце, 96-луночные микропланшеты покрывали 2 мкг/мл белка IL4Rα-his яванского макака (Sino Biological Inc., кат. №90897-С08Н) или 0,2 мкг/мл белка cal-IL4Rα-his (изготовленный по заказу компанией Sino Biological Inc., кат №ВАХ2) в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6), 100 мкл/лунку, в течение 2 часов при 37°С. Планшеты для ИФА промывали один раз промывочным буфером (PBS+0,05 мас./об.% Твин-20, PBST), а затем блокировали 200 мкл/лунку блокирующего буфера (5 мас./об.% нежирное молоко в PBST) в течение 2 часов при 37°С. Планшеты снова промывали и инкубировали с 100 мкл/лунку последовательно разбавленных антител к IL4Rα согласно изобретению или контролей (0,004-66,7 нМ, 5-кратное последовательное разбавление в 2,5 мас./об.% нежирного молока в PBST, начиная с 66,7 нМ) в течение 40 минут при 37°С. Планшеты для ИФА промывали 4 раза и инкубировали с пероксидазой аффинно очищенного козьего анти-мышиного IgG, специфического к фрагменту Fcγ (разбавление 1:5000 в буфере PBST, Jackson Immunoresearch, кат. №115-035-071, 100 мкл/лунку) в течение 40 минут при 37°С. После финальной промывки планшеты инкубировали со 100 мкл/лунку ТМВ (Innoreagents). Реакцию останавливали через 3-10 минут при 25°С с помощью 50 мкл/лунку 1М H₂SO₄, и считывали оптическую плотность при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения ЕС₅₀.

[00185] Результаты трех анализов показаны в таблице 3 и на фиг. 1А-1С, 2А-2D и 3.

[00186] Можно заметить, что мышиные антитела к IL4Rα согласно изобретению специфически связывали IL4Rα человека с высокой способностью связывания, и некоторые из них связывались с белками IL4Rα обезьяны с более высокой связывающей активностью, чем эталон.

[00187] Пример 4 Блокирующая активность мышиных антител к IL4Rα в отношении взаимодействия IL4Rα-эталон или IL4Rα-IL4

[00188] 4.1 ИФА блокирования лиганда

[00189] Активность антител к IL4Rα согласно настоящему изобретению в отношении блокирования взаимодействия IL4-IL4Rα измеряли в конкурентном анализе ИФА. Вкратце, 100 мкл белков IL4Rα-his человека (изготовленные в лаборатории с SEQ ID NO: 57) покрывали 96-луночные микропланшеты при 2 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C. На следующий день планшеты промывали промывочным буфером (PBS+0,05 мас./об.% Твин-20, PBST) и блокировали 5 мас./об.% нежирным молоком в PBST в течение 2 часов при 37°С. Затем планшеты снова промывали промывочным буфером.

[00190] Последовательно разбавленные антитела к IL4Rα или контроли (начиная с 80 нМ с 4-кратным последовательным разбавлением) в 2,5 мас./об.% нежирного молока в PBST, 100 мкл на лунку, добавляли к планшетам для связывания IL4Rα и инкубировали с белками IL4Rα-his человека при 37°С в течение 40 минут. Планшеты промывали 4 раза с использованием промывочного буфера, а затем добавляли и инкубировали в течение 40 минут при 37°С со 100 мкл/лунку 0,56 нМ меченного биотином белка IL4 человека (Sino Biological Inc., кат. №11846-HNAE). Затем планшеты снова промывали промывочным буфером. После этого в планшеты добавляли 100 мкл/лунку конъюгированной со стрептавидином HRP (разбавление 1:10000 в буфере PBST, Jackson Immunoresearch, кат. №016-030-084) и инкубировали в течение 40 минут при 37°С. Затем планшеты снова промывали промывочным буфером. Наконец, добавляли ТМВ и останавливали реакцию, используя 1М H₂SO₄, и считывали оптическую плотность при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения IC₅₀.

[00191] 4.2 ИФА блокирования эталона

[00192] Способность антител к IL4Rα согласно настоящему изобретению блокировать связывание эталона с IL4Rα человека измеряли в конкурентном анализе ИФА. Вкратце, эталоном покрывали 96-луночные микропланшеты в концентрации 2 мкг/мл в PBS, 100 мкл на лунку, и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующий день планшеты промывали промывочным буфером (PBS+0,05 мас./об.% Твин-20, PBST) и блокировали 5 мас./об.% нежирным молоком в PBST в течение 2 часов при 37°С. Во время блокирования в планшете антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению или контроли разбавляли меченными биотином белками IL4Rα-his человека (изготовленные в лаборатории с SEQ ID NO: 57, 0,55 нМ в 2,5 мас./об.% нежирного молока в PBST), начиная со 100 нМ с 4-кратным последовательным разбавлением, и инкубировали при 25°С в течение 40 минут. После промывки планшета смеси антитело/IL4Rα-his добавляли к планшетам, покрытым эталоном, 100 мкл на лунку. После инкубации при 37°С в течение 40 минут планшеты промывали промывочным буфером. Затем в планшеты добавляли 100 мкл/лунку конъюгированной со стрептавидином HRP и инкубировали с ней в течение 40 минут при 37°С для обнаружения меченного биотином IL4Rα-his человека, связанного с планшетами. Затем планшеты снова промывали промывочным буфером. Наконец, добавляли ТМВ и останавливали реакцию, используя 1М H₂SO₄, и считывали оптическую плотность при 450 нм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения IC₅₀.

[00193] 4.3 FACS блокирования лиганда на основе клеток

[00194] Активность антител к IL4Rα в отношении блокирования связывания белка IL4 с IL4Rα на поверхности клетки оценивали с помощью проточной цитометрии (FACS) с использованием клеток 293F-IL4Rα, полученных выше.

[00195] Вкратце, клетки 293F-IL4Rα собирали из колб для культивирования клеток, дважды промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 2 об.% фетальной бычьей сыворотки (буфер FACS). Затем 1×10⁵ клеток на лунку в 96-луночных планшетах инкубировали в 100 мкл антител к IL4Rα или контролей с различными концентрациями (начиная с 80 нМ с 4-кратным последовательным разбавлением) в буфере FACS в течение 40 минут на льду. Планшеты дважды промывали буфером FACS, добавляли и инкубировали в течение 40 минут при 4°С в темноте со 100 мкл/лунку 1,67 нМ меченного биотином белка IL4 человека (Sino biological inc., кат. №11846-HNAE). Планшеты дважды промывали буфером FACS, а затем добавляли и инкубировали в течение 40 минут при 4°С в темноте с 100 мкл/лунку R-фикоэритрина стрептавидина (разбавление 1:500 в буфере FACS, Jackson Immunoresearch, кат. №016-110-084). Клетки дважды промывали и ресуспендировали в буфере FACS. Флуоресценцию измеряли с использованием оборудования Becton Dickinson FACS Canto II-HTS. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения IC₅₀.

[00196] Результаты трех анализов показаны в таблице 4 ниже и на фиг. 4А-4В, 5А-5 В и 6А-6С.

[00197] Из таблицы 4 и фиг. 4А-4 В видно, что все антитела к IL4Rα согласно изобретению способны блокировать взаимодействие IL4 человека с IL4Rα человека с сопоставимой блокирующей активностью по сравнению с эталоном.

[00198] На фиг. 5А и 5 В показано, что некоторые из антител согласно настоящему изобретению способны блокировать связывание IL4Rα человека с эталоном, из чего можно предположить, что они могут связываться с тем же или подобным эпитопом, что и эталон.

[00199] Кроме того, как показано в таблице 4 и на фиг. 6А-6С, все антитела к IL4Rα способны блокировать связывание IL4 с IL4Rα на поверхности клетки с очень близкой блокирующей способностью по сравнению с эталоном, несмотря на немного более высокое значение IC₅₀.

[00200] Пример 5 Функциональный анализ на основе клеток мышиных антител к IL4Rα

[00201] IL4 и IL13 способны связываться с IL4Rα и индуцировать фосфорилирование STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2. Этап фосфорилирования имеет решающее значение для сигнального пути IL4/IL13.

[00202] Клетки HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 изготавливали в лаборатории. Вкратце, клетки НЕК293Т (АТСС CRL-11268), естественно экспрессирующие IL13Rα1, стабильно трансфицировали плазмидной конструкцией pcDNA3.1-Puro (YouBio biological inc., кат. №VT9222) с нуклеотидом, кодирующим IL4Rα человека между BamHI и XhoI, плазмидой STAT6 (Sino biological inc., кат. №HG13190-NH) с нуклеотидом, кодирующим STAT6 человека между KpnI и XbaI, и плазмидой репортера STAT6 люциферазы STAT6-Luc (Yeasen biological inc., кат. №11588ES03), а затем для всех последующих функциональных анализов выбирали одноклеточный клон LB2.

[00203] Антитела к IL4Rα согласно настоящему изобретению тестировали на ингибирующее действие в отношении индуцированного IL4 и IL13 фосфорилирования STAT6.

[00204] Вкратце, клетки HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 на стадии логарифмической фазы высевали в 96-луночные планшеты в 100 мкл среды (RPMI1640+10% FBS), 5×10⁵ клеток/лунку. Затем в планшеты добавляли 50 мкл последовательно разбавленных антител к IL4Rα или контролей (включая изготовленное в лаборатории антитело к CD22) (начиная со 100 нМ, 5-кратное последовательное разбавление) и инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Затем в планшеты добавляли 50 мкл белка IL4 (600 пг/мл, Sino Biological Inc., кат. №11846-HNAE) или белка IL13 (50 нг/мл, Sino Biological Inc., кат. №10369-HNAC) и инкубировали при 37°C в течение 20 минут. Планшеты центрифугировали и дважды промывали с использованием окрашивающего буфера (изготовленного в лаборатории DPBS (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко)+0,5 мас./об.% BSA (бычий сывороточный альбумин)+2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)), а затем добавляли 50 мкл/лунку фиксирующего буфер (BD Biosciences Inc., кат. №5545655) и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Клетки дважды промывали и инкубировали с пермеабилизирующим буфером (200 мкл/лунку, BD biosciences inc., кат. №558050) в течение 30 минут на льду. Планшеты промывали три раза с использованием окрашивающего буфера. Затем в планшеты добавляли антитело к pSTAT6 (20-кратное разбавление исходного раствора pSTAT6, BD biosciences inc., кат. №562079) и оставляли на льду в течение 60 минут. Планшеты окончательно дважды промывали и ресуспендировали в окрашивающем буфере. Флуоресценцию измеряли с использованием оборудования Becton Dickinson FACS Canto II-HTS. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Graphpad Prism и сообщали значения IC₅₀.

[00205] Результаты показаны в таблице 5 ниже и на фиг. 7 и 8.

[00206] Можно заметить, что все антитела к IL4Rα способны блокировать индуцированное IL4 или IL13 фосфорилирование STAT6 в клетках HEK293T-IL4Rα-STAT6-STAT6LUC-LB2 с сопоставимой или более высокой блокирующей активностью по сравнению с эталоном.

[00207] Пример 6 Получение и характеристика химерных антител

[00208] Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи мышиных mAb к IL4Rα были секвенированы, и идентификационные номера последовательностей суммированы в таблице 1.

[00209] Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи мышиных mAb к IL4Rα С2С1А1А1 и B8G11F2B7G5E8 клонировали в рамке с тяжелой цепью IgG4 человека (SEQ ID NO: 55) и константными областями легкой цепи каппа человека (SEQ ID NO: 56), соответственно, при этом С-конец вариабельной области соединен с N-концом соответствующей константной области.

[00210] Векторы, каждый из которых содержит нуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, соединенную с константной областью тяжелой цепи IgG4 человека, и векторы, каждый из которых содержит нуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, соединенную с константной областью легкой цепи каппа человека, временно трансфицировали в 50 мл суспензионных культур клеток 293F в соотношении 60% к 40% конструкции легкой цепи к конструкции тяжелой цепи с 1 мг/мл PEI.

[00211] Супернатанты клеток собирали через шесть дней во встряхиваемых колбах, центрифугировали до гранулированных клеток и фильтровали через фильтры 0,22 мкм для отделения иммуноглобулинов. Химерные антитела очищали с помощью аффинной хроматографии на белке А. Вкратце, колонку с белком А сефароза (от bestchrom (Shanghai) Biosciences, кат. №АА0273) промывали 5-10 объемами колонки с использованием буфера PBS. Супернатанты клеток пропускали через колонки, а затем колонки промывали с использованием буфера PBS до тех пор, пока оптическая плотность белка не достигала исходного уровня. Колонки элюировали элюирующим буфером (0,1 М глицин-HCl, рН 2,7) и сразу же собирали в пробирки емкостью 1,5 мл с нейтрализующим буфером (1 М Трис-HCl, рН 9,0). Фракции, содержащие иммуноглобулины, объединяли и диализировали в PBS в течение ночи при 4°С.

[00212] Очищенные антитела тестировали с помощью ИФА с захватом, конкурентного ИФА, аффинного теста BIAcore, FACS связывания на основе клеток и функционального анализа на основе клеток в соответствии с протоколами, используемыми в предыдущих примерах, с незначительными модификациями, описанными ниже.

[00213] Для ИФА с захватом 96-луночные микропланшеты покрывали 2 мкг/мл козьего анти-человеческого IgG (аффинно очищенное козье анти-человеческое IgG, специфическое к фрагменту Fcγ, Jackson Immunoresearch, кат. №109-005-098) вместо фрагмента Fcγ козьего анти-мышиного IgG, 100 мкл/лунку.

[00214] Для непрямого ИФА использовали пероксидазу аффинно очищенного F(ab')₂ фрагмента козьего анти-человеческого IgG, специфического к фрагменту Fcγ (Jackson Immunoresearch, кат. №109-036-098), вместо пероксидазы аффинно очищенного козьего анти-мышиного IgG, специфического к фрагменту Fcγ, 100 мкл/лунку.

[00215] Для BIAcore козий анти-человеческий IgG (GE Healthcare, кат. № BR100839, Human Antibody Capture Kit (набор для захвата человеческого антитела)) был ковалентно связан с чипом СМ5 вместо козьего анти-мышиного IgG.

[00216] Для FACS связывания на основе клеток использовали R-фикоэритрин аффинно очищенного козьего анти-человеческого IgG, специфического к фрагменту Fcγ (Jackson Immunoresearch, кат. №109-115-098), вместо R-фикоэритрина аффинно очищенного F(ab')₂ фрагмента козьего анти-мышиного IgG (H+L), разбавление 1:1000 в буфере FACS, 100 мкл/лунку.

[00217] Результаты показаны в таблице 6 и на фиг. 9-13. Данные показали, что химерные антитела имеют схожую аффинность/способность связывания и блокирующую активность по сравнению с их исходными мышиными антителами.

[00218] Пример 7 Гуманизация моноклональных антител к IL4Rα B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1

[00219] Мышиные антитела к IL4Rα B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 уманизировали и дополнительно охарактеризовывали. Гуманизацию мышиных антител [роводили с использованием хорошо известного способа трансплантации CDR, как юдробно описано ниже.

[00220] Для выбора акцепторных каркасов для гуманизации мышиных антител B8G11F2B7G5E8 и С2С1А1А1 последовательности вариабельной области легкой [тяжелой цепи каждого мышиного антитела подвергали сравнению с использованием JLAST (программа для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания) относительно базы данных генов иммуноглобулина человека. J качестве акцепторных каркасов для гуманизации были выбраны зародышевые линии человека с наивысшей гомологией. Области CDR вариабельной области тяжелой/легкой цепи мышиного антитела вставляли в выбранные каркасы, и остаток(остатки) в каркасах дополнительно обратно мутировали для получения большего количества вариантов вариабельных областей тяжелой/легкой цепи. Всего получали 13 иллюстративных гуманизированных антител B8G11F2B7G5E8, а именно huB8G11F2B7G5E8-V1 - huB8G11F2B7G5E8-V11, huB8G11F2B7G5E8-V13 и huB8GHF2B7G5E8-V14, и 16 иллюстративных гуманизированных антител С2С1А1А1, а именно huC2C1A1A1-V1 -huC2C1A1A1-V16, индентификационные номера последовательностей вариабельных областей тяжелой/легкой цепи которых приведены в таблице 1.

[00221] Векторы, каждый из которых содержит нуклеотид, кодирующий гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи, соединенную с константной областью тяжелой цепи IgG4 человека (SEQ ID NO: 55), и векторы, каждый из которых одержит нуклеотид, кодирующий гуманизированную вариабельную область легкой цепи, соединенную с константной областью легкой цепи каппа человека (SEQ ID NO: 56), временно трансфицировали в 50 мл суспензионных культур клеток 293F в соотношении 60% к 40% конструкции легкой цепи к конструкции тяжелой цепи с 1 мг/мл PEI.

[00222] Супернатанты клеток собирали через шесть дней во встряхиваемых колбах, центрифугировали до гранулированных клеток и фильтровали через фильтры 0,22 мкм для отделения иммуноглобулинов. Антитела очищали с помощью аффинной хроматографии на белке А. Вкратце, колонку с белком А сефароза (от bestchrom Shanghai) Biosciences, кат. №АА0273) промывали 5-10 объемами колонки с использованием буфера PBS. Супернатанты клеток пропускали через колонки, а затем колонки промывали с использованием буфера PBS до тех пор, пока оптическая плотность белка не достигала исходного уровня. Колонки элюировали элюирующим буфером (0,1 М глицин-HCl, рН 2,7) и сразу же собирали в пробирки емкостью 1,5 мл с нейтрализующим буфером (1 М Трис-HCl, рН 9,0). Фракции, содержащие иммуноглобулины, объединяли и диализировали в PBS в течение ночи при 4°С.

[00223] Пример 8 Характеристика гуманизированных антител

[00224] Аффинность связывания гуманизированных антител с IL4Rα человека оценивали с помощью технологии BIAcore в соответствии с протоколами, используемыми в предыдущих примерах. Значения К_а, K_d и K_D определяли и суммировали в таблицах 7 и 8.

[00225] Данные показали, что гуманизированные антитела имели схожую аффинность связывания IL4Rα человека по сравнению с химерным антителом, и все гуманизированные антитела huC2C1A1A1 продемонстрировали более высокую аффинность связывания IL4Rα человека, чем эталон.

[00226] Гуманизированные антитела huB8GHF2B7G5E8-V2, huB8GHF2B7G5E8-V4, huB8GHF2B7G5E8-V14, huC2C1A1A1-V14 и huC2C1A1A1-V15 дополнительно тестировали с помощью Biacore, ИФА с захватом, непрямого ИФА, FACS связывания на основе клеток, конкурентного ИФА и функционального анализа на основе клеток, следуя протоколам, используемым в предыдущих примерах, с незначительными модификациями, описанными ниже.

[00227] Для ИФА с захватом 96-луночные микропланшеты покрывали 2 мкг/мл козьего анти-человеческого IgG (афинно очищенный козий анти-человеческий IgG, специфический к фрагменту Fcγ, Jackson Immunoresearch, кат. №109-005-098) вместо фрагмента Fcγ козьего анти-мышиного IgG, 100 мкл/лунку.

[00228] Для непрямого ИФА использовали пероксидазу аффинно очищенного F(ab')₂ фрагмента козьего анти-человеческого IgG, специфического к фрагменту Fcγ (Jackson Immunoresearch, кат. №109-036-098), вместо пероксидазы аффинно очищенного козьего анти-мышиного IgG, специфического к фрагменту Fcγ, 100 мкл/лунку.

[00229] Для BIAcore козье анти-человеческий IgG (GE healthcare, кат. № BR100839, Human Antibody Capture Kit) был ковалентно связан с чипом СМ5 вместо козьего анти-мышиного IgG.

[00230] Для FACS связывания на основе клеток использовали R-фикоэритрин аффинно очищенного козьего анти-человеческого IgG, специфического с фрагменту Fcγ (Jackson Immunoresearch, кат.№109-115-098), вместо R-фикоэритрина аффинно очищенного F(ab')₂ фрагмента козьего анти-мышиного IgG (H+L), разбавление 1:1000 в буфере FACS, 100 мкл/лунку.

[00231] Гуманизированные антитела huB8GHF2B7G5E8-V14 и huC2C1A1A1-V15 также тестировали на термическую стабильность. Вкратце, анализ теплового сдвига белка использовали для определения Tm (температуры плавления) с использованием набора для оценки стабильности белка с помощью теплового сдвига GloMelt™ Thermal Shift Protein Stability Kit (Biotium, кат. №33022-T, лот. №: 181214). Вкратце, краситель G1oMelt™ оставляли размораживаться и достигать комнатной температуры. Флакон, содержащий краситель, перемешивали на мешалке и центрифугировали. Затем 10х краситель получали путем добавления 5 мкл 200х красителя к 95 мкл PBS. Добавляли 2 мкл 10х красителя и 10 мкг гуманизированных антител и добавляли PBS к общему объему реакции 20 мкл. Пробирки, содержащие краситель и антитела, подвергали кратковременному центрифугированию и помещали в термоциклер для ПЦР в реальном времени (Roche, LightCycler 480 II), настроенный с помощью программы кривой плавления, имеющей параметры, указанные в таблице 9.

[00232] Результаты показаны в Таблицах 10-1-10-3 и на Фиг. 14А-14 В-22.

PCT/CN2021/077784 63 WO 2021/170020

[00233] Согласно данным, гуманизированные антитела С2С1А1А1 продемонстрировали сопоставимую, если не лучшую, аффинность/активность связывания с IL4Rα человека и блокирующую способность в отношении IL4Rα-IL4/IL13 по сравнению с эталоном. В тоже время гуманизированные антитела B8G11F2B7G5E8, очевидно, имели лучшую блокирующую способность в отношении взаимодействия IL4/IL13-IL13Rα1-IL4Rα.

[00234] Хотя изобретение было описано выше в связи с одним или более вариантами осуществления изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничивается этими вариантами осуществления изобретения, и описание предназначено для охвата всех альтернатив, модификаций и эквивалентов, которые могут быть включены в сущность и объем прилагаемой формулы изобретения. Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, дополнительно включены посредством ссылки в полном объеме.

[00235] Последовательности в настоящей заявке суммированы ниже.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CHIA TAI TIANQING PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.

<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ IL4R, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<150> US62982521

<151> 2020-02-27

<160> 72

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 1

Thr Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 2

Asp Thr Tyr Met His

1 5

<210> 3

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 3

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 4

Asn Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 5

Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 6

Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 7

Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 8

Gly Ile Arg Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 9

Ser Ile Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 10

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 10

Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 11

Phe Phe Arg Ile Arg Asn Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 12

Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 13

Gly Asp Lys Leu Arg Pro Tyr His Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 14

Ser Gly Gly Ser Ala Pro Tyr

1 5

<210> 15

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 15

Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 16

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 17

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 18

Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 19

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Val

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 20

Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 21

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 22

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 23

Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 24

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 25

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 26

Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr Trp Thr

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 27

Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr Trp Thr

1 5 10

<210> 28

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 28

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 29

Gln Gln His Tyr Ser Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 30

Gln Gln His Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 31

Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 32

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (47)

<223> X= W или L

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (49)

<223> X= S или A

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Xaa Val

35 40 45

Xaa Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Phe Arg Phe Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Asn Ile Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (46)

<223> X= L или F

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (48)

<223> X= I или V

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Pro Pro Arg Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Pro Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Phe Arg Ile Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro Thr

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 40

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 41

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (24)

<223> X= A или V

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (38)

<223> X= K или Q

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (48)

<223> X= V или M

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (95)

<223> X= H или Y

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Xaa Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Xaa Cys

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (67)

<223> X= R или K

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (68)

<223> X= A или V

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (76)

<223> X= S или T

<220>

<221> НЕОПРЕДЕЛЕННАЯ

<222> (77)

<223> X= N или D

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Xaa Xaa Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 43

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 44

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Val Ser Arg Arg Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 45

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 46

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 47

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Arg Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Lys Leu Arg Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 48

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Lys Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Asp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Arg Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Lys Leu Arg Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ile Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 51

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Glu

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Ser Ala Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 52

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 52

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Met Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 53

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 53

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Met Asn Ile Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Glu

85 90 95

Arg Ser Gly Gly Ser Ala Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 54

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Mus sp.

<400> 54

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Met Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 55

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 55

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 56

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 56

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 57

<211> 242

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 57

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn

115 120 125

Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn

165 170 175

Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr

195 200 205

Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser

210 215 220

Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His His His His His His His His His

225 230 235 240

His His

<210> 58

<211> 242

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 58

Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Tyr Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Gln Val Ala Gly Ser Gly Ser Met Lys Val Leu Gln Glu Pro

20 25 30

Thr Cys Val Ser Asp Tyr Ile Ser Leu Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met

35 40 45

Gly Gly Pro Thr Asn Cys Ser Ala Glu Leu Arg Leu Val Tyr Gln Leu

50 55 60

Val Phe Leu Ile Ser Glu Thr Asn Met Cys Val Pro Glu Asn Asn Gly

65 70 75 80

Ala Ala Gly Cys Val Cys His Leu Phe Met Glu Asp Met Val Gly Ala

85 90 95

Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys

100 105 110

Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Lys Ala Pro Glu Asn

115 120 125

Leu Thr Val Tyr Thr Asn Val Ser Glu Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser

130 135 140

Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Glu Lys Leu Thr Tyr Ala

145 150 155 160

Val Asn Ile Trp Asn Glu Asn Asp Pro Thr Asp Ser Arg Ile Tyr Asp

165 170 175

Val Thr Tyr Gln Glu Pro Thr Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys

180 185 190

Ser Gly Val Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Ser Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp Tyr Asn Ala

210 215 220

Tyr Lys Glu Pro Phe Glu Lys His His His His His His His His His

225 230 235 240

His His

<210> 59

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 59

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acttatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaacc attaatagta atggtggtag taccagttat 180

ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt tttactgtgc aagatttttc 300

cgctttagga atgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357

<210> 60

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 60

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggatc cctgaagctg 60

tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc acatacggca tgtcctgggt gagacagacc 120

cctgataaga gactggagct ggtggccacc atcaacagca acggcggcag caccagctac 180

cccgacagcg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca acgccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatgt ccagcctgaa gagcgaggat acagccatgt tctactgtgc caggttcttt 300

aggttcagaa atgccatgga ctactggggc cagggcacct ccgtgacagt gagcagc 357

<210> 61

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 61

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ccggcggctc tctgagactg 60

agctgcgctg cctccggctt cacctttagc acctacggca tgagctgggt gagacaagcc 120

cccggcaaag gactggtgtg ggtggctacc atcaacagca acggcggctc cacaagctac 180

cccgacagcg tgaagggaag attcaccatc tctagagaca acgccaagaa cacactgtat 240

ctgcagatga actctctgag agccgaagac accgctgtgt actactgcgc tagattcttt 300

agatttagaa acgccatgga ctactggggc caaggcacac tggtgacagt gtcctcc 357

<210> 62

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 62

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gaacaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagttcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga atatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat tattatggtc ctcccacgtg gacgttcggt 300

ggaggcacca agctggaaat caaa 324

<210> 63

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 63

gacatccaga tgacacagag ccccgccagc ctgtccgcct ccgttggaga gaccgtgacc 60

atcacctgta ggacctccga gaatatctac agctacctgg cctggtatca acagaagcag 120

ggcaagtccc ctcagtttct ggtgtacaac gccaagaccc tggccgaggg cgtgccctct 180

aggttctccg gctccggcag cggcacccag ttcagcctga atatcaacag cctgcagagc 240

gaggactttg gcagctacta ctgtcagcac tactacggcc ctcccacctg gacatttggc 300

ggcggcacaa agctggagat caag 324

<210> 64

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 64

gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgctt ccgtgggaga tagagtgacc 60

atcacatgca gaacctccga gaacatctac agctatctgg cttggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagttcct ggtgtacaac gccaagacac tggctgaggg cgtgcctagc 180

agattcagcg gctccggcag cggcacagac tttacactga caatcagctc tctgcaaccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcac tactatggcc cccctacatg gacctttggc 300

caaggcacca aggtggagat caag 324

<210> 65

<211> 348

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 65

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagat cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg ggttggaagg attgatccta cgaatggtta tactatatat 180

gcctcaaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcatccaa cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctggggac actgccgtct atcattgtgt tagtcggagg 300

ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 66

<211> 348

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 66

gaggtgcagc tgcagcagtc cggcgccgac ctggtgaggc caggagcttc cgtgaagctg 60

agctgcacag ccagcggctt caacatcaag gacacataca tgcactgggt gaagcagagg 120

cccgagcagg gcctggagtg ggtgggaaga atcgacccca ccaacggcta caccatctac 180

gcctccaagt tccagggcaa ggccaccatc acagccgata cctcctccaa cacagcctac 240

atgcagctgt ccagcctgac aagcggcgat accgccgtgt accactgcgt gtccagaagg 300

ccttggttcg cctactgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtccgcc 348

<210> 67

<211> 348

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 67

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgccac cgtgaagatc 60

agctgcaagg tgagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gaagcaagcc 120

cccggcaaag gactggagtg gatgggaaga atcgacccca ccaacggcta caccatctac 180

gccagcaagt tccaaggcaa ggccaccatc accgccgaca cctccagcaa taccgcctac 240

atggagctga gctctctgag aagcgaggac accgccgtgt accactgtgt gagcagaaga 300

ccttggttcg cctactgggg ccaaggcaca ctggtgaccg tgagcagc 348

<210> 68

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 68

gatattttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggagc tcaagcctcc 60

atctcttgca gatcaagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagttac caatcgattt 180

tctggggtcc cagataggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336

<210> 69

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 69

gacatcctga tgacacagac acccctgtcc ctgcctgtgt ccctgggcgc tcaggcctcc 60

atctcctgta ggagcagcca gtccatcgtg cacagcaatg gcaacaccta cctggagtgg 120

tacttgcaga agcctggcca gagccccaag ctgctgatct acaaggtgac caacagattc 180

agcggcgtgc ccgataggtt cagcggctcc ggcagcggca ccgatttcac actgaagatc 240

tccagggtgg aggccgagga cctgggcatc tactactgct tccagggctc ccacgtgcct 300

tacacctttg gcggcggcac aaagctggag atcaag 336

<210> 70

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 70

gacatcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgtccgtga cacccggcca gcctgccagc 60

atcagctgta ggagctccca gtccatcgtg cactccaatg gcaatacata cctggagtgg 120

tacttgcaga agcccggcca gtcccctcag ctgctgatct acaaggtgac caatagattc 180

tccggcgtgc ccgataggtt ctccggcagc ggctccggca cagacttcac actgaagatc 240

agcagagtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacgtgccc 300

tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336

<210> 71

<211> 984

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 71

gccagcacaa agggcccttc cgtgtttccc ctggccccct gcagcaggag cacctctgag 60

tccaccgccg ccctgggctg tctggtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgagc 120

tggaattccg gcgccctgac atccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcctcc 180

ggcctgtaca gcctgagctc cgtggtgaca gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240

tacacatgta atgtggatca caagcccagc aacacaaagg tggataagag agtggagtcc 300

aagtacggcc ctccttgccc tccctgtcct gccccagagt tcctgggcgg cccctctgtg 360

ttcctgttcc cccctaagcc caaggacaca ctgatgatct ccaggacccc tgaggtgacc 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaggac cctgaggtgc agttcaattg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag cccagagagg agcagtttaa ttccacatac 540

agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgtaaggtga gcaacaaggg cctgccttcc tccatcgaga agacaatcag caaggccaag 660

ggccagccta gggagcccca ggtgtacaca ctgcctccca gccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag 780

tgggagtcca acggccagcc cgagaataac tacaagacaa caccccccgt gctggattcc 840

gatggcagct tctttctgta ctccaggctg accgtggata agagcaggtg gcaggagggc 900

aatgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca atcactacac ccagaagagc 960

ctgtccctga gcctgggcaa gtga 984

<210> 72

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 72

cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttga 324

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, связывающемуся с альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-4 (IL4Rα), а также к биспецифической молекуле и композиции, его содержащим. Также раскрыта молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанное выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть. Изобретение эффективно для лечения аллергического заболевания, ассоциированного с избыточной передачей сигнала IL4 и/или IL13, а также для лечения опухоли, ассоциированной с повышенной активацией STAT6. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 22 ил., 10 табл., 7 пр.

1. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, связывающееся с альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-4 (IL4Rα), содержащее вариабельную область тяжёлой цепи и вариабельную область легкой цепи, каждая из которых содержит область CDR1, область CDR2 и область CDR3, где области CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и области CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, представленные в (1) SEQ ID NO: 1, 5, 10, 15, 22 и 26 соответственно; (2) SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 22 и 27 соответственно; (3) SEQ ID NO: 2, 7, 12, 17, 23 и 28 соответственно; (4) SEQ ID NO: 3, 9, 14, 20, 25 и 31 соответственно; или (5) SEQ ID NO: 3, 9, 14, 21, 25 и 31 соответственно.

2. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, где вариабельная область тяжёлой цепи содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность c SEQ ID NO: 32, 33, где X1=W, X2=S; X1=L, X2=A; или X1=W, X2=A, 34, 38, 40, 41, где X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; или X1=V, X2=K, X3=M, X4=H, 42, где X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; или X1=R, X2=V, X3=T, X4=N, 43, 44, 51 или 53.

3. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с SEQ ID NO: 35, 36, где X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; или X1=F, X2=I, 37, 39, 45, 46, 52 или 54.

4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, где вариабельная область тяжёлой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность с (1) SEQ ID NO: 32 и 35, соответственно; (2) SEQ ID NO: 33, где X1=W, X2=S, и 36, где X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; или X1=F, X2=I, соответственно; (3) SEQ ID NO: 33, где X1=W, X2=S, и 37, соответственно; (4) SEQ ID NO: 34 и 36, где X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; или X1=F, X2=I, соответственно; (5) SEQ ID NO: 34 и 37, соответственно; (6) SEQ ID NO: 33, где X1=L, X2=A, и 36, где X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; или X1=F, X2=I, соответственно; (7) SEQ ID NO: 33, где X1=L, X2=A, и 37, соответственно; (8) SEQ ID NO: 33, где X1=W, X2=A, и 36, где X1=L, X2=I; X1=F, X2=V; или X1=F, X2=I, соответственно; (9) SEQ ID NO: 33, где X1=W, X2=A, и 37, соответственно; (10) SEQ ID NO: 38 и 39, соответственно; (11) SEQ ID NO: 40 и 45, соответственно; (12) SEQ ID NO: 41, где X1=A, X2=K, X3=V, X4=H; X1=V, X2=K, X3=V, X4=H; X1=A, X2=Q, X3=V, X4=H; X1=A, X2=K, X3=M, X4=H; X1=A, X2=K, X3=V, X4=Y; или X1=V, X2=K, X3=M, X4=H, и 46, соответственно; (13) SEQ ID NO: 42, где X1=R, X2=A, X3=S, X4=N; X1=K, X2=V, X3=S, X4=N; X1=K, X2=A, X3=T, X4=N; X1=K, X2=A, X3=S, X4=D; или X1=R, X2=V, X3=T, X4=N, и 46, соответственно; (14) SEQ ID NO: 43 и 46, соответственно; (15) SEQ ID NO: 44 и 46, соответственно; (16) SEQ ID NO: 51 и 52, соответственно; или (17) SEQ ID NO: 53 и 54, соответственно.

5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, где вариабельная область тяжёлой цепи и вариабельная область легкой цепи содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 33, где X1=W, X2=A, и 36, где X1=F, X2=V, соответственно.

6. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1 или 4, содержащее константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, соединенную с вариабельной областью тяжёлой цепи, и константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, соединенную с вариабельной областью легкой цепи.

7. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 5, содержащее константную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, соединенную с вариабельной областью тяжёлой цепи, и константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, соединенную с вариабельной областью легкой цепи.

8. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, которое (a) связывает IL4Rα человека; (b) связывает IL4Rα обезьяны; (c) блокирует взаимодействие IL4Rα-IL4; и (d) блокирует взаимодействие IL4Rα-IL13-IL13Rα1.

9. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, которое представляет собой мышиное, человеческое, химерное или гуманизированное антитело.

10. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, которое представляет собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.

11. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-10.

12. Биспецифическая молекула, связывающаяся с IL4Rα, содержащая выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-10.

13. Фармацевтическая композиция для лечения аллергического заболевания, ассоциированного с избыточной передачей сигнала IL4 и/или IL13, содержащая выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-10 или молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11 и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п. 13, дополнительно содержащая противоаллергическое средство.

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где противоаллергическое средство представляет собой противогистаминное средство, кортикостероид, агонист бета-адренергических рецепторов, средство, нацеленное на cyc-LT, или средство, нацеленное на IgE.

16. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, ассоциированной с повышенной активацией STAT6 (сигнальный белок и активатор транскрипции 6), содержащая выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1-10 или молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16, дополнительно содержащая противоопухолевое средство.

18. Применение фармацевтической композиции по п. 13 для лечения аллергического заболевания, ассоциированного с избыточной передачей сигнала IL4 и/или IL13.

19. Применение по п. 18, где аллергическое заболевание представляет собой атопический дерматит, анафилактическую реакцию, аллергический ринит или аллергическую астму.

20. Применение по п. 18 или 19, которое дополнительно включает введение субъекту противоаллергического средства.

21. Применение по п. 20, где противоаллергическое средство представляет собой противогистаминное средство, кортикостероид, агонист бета-адренергических рецепторов, средство, нацеленное на сyc-LT, или средство, нацеленное на IgE.

22. Применение фармацевтической композиции по п. 16 для лечения опухоли, ассоциированной с повышенной активацией STAT6.

23. Применение по п. 22, где опухоль представляет собой солидную опухоль.