КОНТРОЛИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-ВЕКТОРОВ С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК) Российский патент 2024 года по МПК A61K48/00 C12N15/86 A61P43/00 A61P35/00 A61P37/00 A61P17/00 A61P25/28 A61P3/00 A61P3/14 A61P11/06 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно §119(e) Раздела 35 Свода законов США на основании предварительных заявок США №62/633882, поданной 22 февраля 2018 г.; №62/633757, поданной 22 февраля 2018 г.; №62/633795, поданной 22 февраля 2018 г.; и №62/746762, поданной 17 октября 2018 г., содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[0002] Данная заявка включает перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная ASCII-копия, созданная 21 февраля 2019 г., имеет название 080170-091100-WOPT_SL.txt и размер 116872 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Данное изобретение относится к области генной терапии, включая бескапсидные векторы для контролируемой экспрессии трансгена или выделенных полинуклеотидов у субъекта или в клетке. Описанная в данном документе технология относится к способам контролируемой экспрессии трансгена in vivo из бескапсидных ДНК-векторов с замкнутыми концами (зкДНК), причем уровень экспрессии может поддерживаться на желаемом уровне в течение заданного времени или возрастать с одним или несколькими последующими введениями (например, бустерное введение или повторная доза).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Целью генной терапии является улучшение клинических исходов для пациентов, страдающих генетическими мутациями или приобретенными заболеваниями, вызываемыми аберрациями в профиле генной экспрессии. Генная терапия включает лечение или предотвращение медицинских состояний, вызываемых дефектными генами или аномальной регуляцией или экспрессией, например, недостаточной экспрессией или избыточной экспрессией, которые могут приводить к расстройству, заболеванию, злокачественному новообразованию и т.п. Например, лечение, предотвращение или облегчение заболевания или расстройства, вызываемого дефектным геном, может осуществляться путем доставки пациенту корректирующего генетического материала, изменения или сайленсинга дефектного гена, или доставки терапевтического антитела, например, приводящих к терапевтической экспрессии указанного генетического материала у указанного пациента.

[0005] Основой генной терапии является введение транскрипционной кассеты с активным генным продуктом (иногда называемым трансгеном), который, например, может приводить к положительному эффекту усиления функции, отрицательному эффекту потери функции, или другому исходу. Генная терапия может также применяться для лечения заболевания или злокачественного новообразования, вызываемого другими факторами. Лечение моногенных нарушений у человека может осуществляться путем доставки и экспрессии нормального гена в клетках-мишенях. Доставка и экспрессия корректирующего гена в целевые клетки (клетки-мишени) пациента может быть осуществлена с применением многочисленных способов, в том числе с применением полученных методами генной инженерии вирусов и вирусных векторов для доставки генов. Среди многочисленных доступных векторов вирусного происхождения (например, из рекомбинантного ретровируса, рекомбинантного лентивируса, рекомбинантного аденовируса и т.п.), набирает популярность в качестве многоцелевого вектора для генной терапии рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рААВ).

[0006] Аденоассоциированные вирусы (ААВ) принадлежат к семейству Parvoviridae; более конкретно, они составляют род Dependoparvovirus. Векторы, происходящие из ААВ (т.е. рекомбинантные ААВ (рААВ) или ААВ-векторы), являются перспективным способом доставки генетического материала, поскольку (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр типов неделящихся и делящихся клеток, в том числе миоциты и нейроны; (ii) они лишены вирусных структурных генов, что обеспечивает уменьшение ответов клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например, интерферон-опосредованных ответов; (iii) вирусы дикого типа считаются непатогенными для человека; (iv) в отличие от ААВ дикого типа, который способен к интеграции в геном клетки-хозяина, у дефектных по репликации ААВ-векторов отсутствует ген rep, и они обычно персистируют в виде эписом, что ограничивает риск инсерционного мутагенеза или генотоксичности; и (v) по сравнению с другими векторными системами, ААВ-векторы в целом считаются относительно слабыми иммуногенами и, соответственно, не вызывают значимого иммунного ответа (см. ii), обеспечивая таким образом персистенцию векторной ДНК и, потенциально, долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов.

[0007] Однако, применение частиц ААВ в качестве вектора для доставки генов имеет ряд серьезных недостатков. Одним из основных недостатков, связанных с рААВ, является ограниченная емкость вирусной упаковки, составляющая примерно 4,5 т.п.о. гетерологичной ДНК (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010), вследствие чего использование ААВ-векторов ограничено их способностью кодировать белки размером менее 150000 Да. Вторым недостатком является то, что в результате распространенности инфекции ААВ дикого типа среди населения, кандидаты на генную терапию с использованием рААВ должны проходить скрининг на наличие нейтрализующих антител, элиминирующих вектор из организма пациента. Третий недостаток связан с иммуногенностью капсида, которая предотвращает повторное введение пациентам, не исключенным из первичного лечения. Иммунная система пациента может отвечать на вектор, который фактически выступает в роли «бустерного» агента, стимулируя иммунную систему, генерирующую высокие титры антител против ААВ, что исключает лечение в будущем. В некоторых недавних сообщениях высказывается обеспокоенность иммуногенностью в ситуациях с использованием высоких доз. Другой заметный недостаток заключается в относительно медленном начале ААВ-опосредованной генной экспрессии, учитывая, что одноцепочечная ДНК ААВ должна быть преобразована в двухцепочечную ДНК до экспрессии гетерологичного гена.

[0008] Кроме того, обычные вирионы ААВ с капсидами получают путем введения плазмиды или плазмид, содержащих геном ААВ, гены rep и гены cap (Grimm et al., 1998). Однако было обнаружено, что такие заключенные в капсиды вирусные ААВ-векторы неэффективно трансдуцируют определенные типы клеток и тканей, и указанные капсиды также индуцируют иммунный ответ.

[0009] Кроме того, традиционные генно-терапевтические векторы для доставки трансгенов (например, аденоассоциированный вирус (ААВ), аденовирус, лентивирусные векторы и т.д.) обычно ограничиваются однократным введением вектора пациентам, что частично вызвано иммунным ответом пациента на вирусные белки. Кроме того, для устойчивой длительной экспрессии трансгена обычно требуется первоначальное введение высокого титра, что может приводить к вредным побочным эффектам. Традиционные вирусные векторы для генной терапии являются по существу непригодными из-за отсутствия устойчивой длительной экспрессии трансгена. Кроме того, диапазон трансгенного генетического материала, подходящего для доставки в таких вирусных векторах, ограничен емкостью упаковки вирусных капсидных белков (например, около 4,5 т.п.о. для ААВ), что исключает доставку более крупных трансгенов для терапии. Соответственно, применение обычных векторов на основе аденоассоциированного вируса (ААВ-векторов) для генной терапии ограничено из-за однократного введения пациентам (вследствие иммунного ответа пациента), ограниченного диапазона трансгенного генетического материала, подходящего для доставки в ААВ-векторах, ввиду минимальной емкости вирусной упаковки (около 4,5 т.п.о.), и медленной ААВ-опосредованной генной экспрессии.

[0010] Кроме того, в ряде сообщений высказывалась обеспокоенность по поводу использования слишком высокой дозы вирусного вектора. Большинство вирусных векторов также вызывают обеспокоенность вследствие иммуногенности, связанной с ААВ.

[0011] Соответственно, в данной области техники существует потребность в технологии, обеспечивающей возможность использования многократных доз вектора для генной терапии. Кроме того, в данной области техники существует потребность в способах контроля экспрессии генов из генно-терапевтического вектора с минимальными эффектами вне целевой области, и сохраняется важная неудовлетворенная потребность в контролируемых рекомбинантных ДНК-векторах с улучшенными характеристиками продуцирования и/или экспрессии. Кроме того, как будет понятно квалифицированному врачу, способность титровать экспрессию/дозу трансгена является желательной для индивидуальной адаптации генной терапии на основании конкретного набора симптомов и/или серьезности заболевания субъекта и, кроме того, для минимизации побочных эффектов или токсичности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Описанное в данном документе изобретение относится к бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (называемому в данном документе «ДНК-вектором с замкнутыми концами», или «зкДНК-вектором») для контролируемой экспрессии трансгена в клетке, например, для лечения заболевания. В частности, технология, описанная в данном документе, относится к бескапсидным ДНК-векторам с замкнутыми концами (зкДНК) для контролируемой экспрессии трансгена, включая, без ограничений, любую из устойчивой экспрессии трансгена, долгосрочной контролируемой экспрессии трансгена, дозозависимой и/или титруемой экспрессии трансгена, и повторное введение дозы трансгена с использованием векторов, описанных в данном документе. Соответственно, способы, раскрытые в данном документе, позволяют персонализировать генную терапию на протяжении всей жизни индивидуума для экспрессии трансгена на уровне, который соответствует потребностям индивидуума, путем поддержания уровня экспрессии трансгена на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени или, альтернативно, повышения экспрессии трансгена зависимым от дозы образом посредством одного или нескольких введений после исходного первичного введения, контролируя тем самым уровень экспрессии трансгена в соответствии с желаемым уровнем экспрессии или желаемым диапазоном уровней экспрессии на основе концентрации зкДНК-вектора при введении повторной дозы, что позволяет обеспечить контролируемое и специфическое повышение экспрессии трансгена в клетке или у субъекта.

[0013] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно вводить повторно (что также называется в данном документе «повторной дозой» или «бустерным» введением) для обеспечения сохранения уровня экспрессии трансгена на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или для повышения уровня экспрессии трансгена выше предшествующего уровня экспрессии, который был достигнут после первого или предшествующего введении зкДНК-вектора, причем второе введение или бустерное введение не вызывают иммунную реакцию, которая препятствует экспрессии трансгена, не вызывая иммунный ответ на сам вектор, влияющий на экспрессию трансгена, или же иммунная реакция является меньшей по сравнению с повторным введением вирусного вектора, содержащего вирусные белки, включая, без ограничений, вирусный вектор, содержащий капсид, такой как парвовирус или лентивирус.

[0014] Не ограничиваясь теорией, укажем, что, как показывают исследования, продолжительная экспрессия трансгена при использовании обычных вирусных векторов ААВ со временем снижается. Одним из способов обеспечения длительной экспрессии трансгена с использованием обычных ААВ-векторов традиционно было увеличение титра и дозы ААВ-вектора, доставленного при первоначальном введении. Однако известно, что слишком высокий титр или доза ААВ-вектора может приводить к различным побочным эффектам. Кроме того, как было описано выше, повторное введение вирусного вектора ААВ традиционно невозможно из-за иммунных ответов. Способы, позволяющие избежать иммунного ответа на повторное введение векторов ААВ, обычно требуют повторного введения вектора ААВ с другой конфигурацией капсида по сравнению с вектором ААВ, введенным при любом из предшествующих введений. Однако, такие стратегии могут все же представлять значительный риск для субъекта, вызывая иммунный ответ на вектор ААВ и потенциально вредные эффекты.

[0015] Описанное в данном документе изобретение относится к способу контролируемой экспрессии трансгена, включая длительную экспрессию, с использованием ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК). В данном документе продемонстрировано, что зкДНК-вектор можно титровать для увеличения уровней экспрессии трансгена, например, путем повторения или повторного введения зкДНК-вектора. Кроме того, уровень экспрессии трансгена может поддерживаться в течение длительного времени и, если наблюдается какое-либо падение уровней экспрессии, можно использовать введение повторной дозы зкДНК-вектора для поддержания желаемого уровня или даже для повышения уровня экспрессии трансгена, если это желательно для субъекта и/или заболевания или расстройства, подлежащего лечению.

[0016] Соответственно, в данном документе предлагаются способы введения зкДНК-векторов для поддержания и/или повышения уровня экспрессии трансгена из зкДНК-вектора в клетке или у субъекта, причем уровень экспрессии может поддерживаться или увеличиваться с помощью одного или нескольких последующих введений (например, повторной дозы или бустерного введения). В случае, когда экспрессия трансгена, доставленного с помощью зкДНК, снижается по какой-либо причине, повторное введение дозы зкДНК-вектора может восстанавливать или поддерживать желаемую экспрессию трансгена на желаемом уровне. В данном документе также представлены способы персонализированной генной терапии, чтобы уровень экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, можно было увеличивать постепенно или поэтапно, с помощью одного или нескольких введений после первоначального примирующего введения (например, в момент времени 0), тем самым оптимизируя (например, титрованием) уровень экспрессии трансгена до желаемого уровня экспрессии или до значения, находящегося в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии, требующегося субъекту.

[0017] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы и способы, раскрытые в данном документе, можно использовать для титрования или осуществления повышения уровня экспрессии трансгена зкДНК-вектором, причем уровень экспрессии трансгена можно титровать дозозависимым образом с помощью одного или нескольких последующих введений (например, дозозависимого введения повторной дозы или бустерного введения). По существу, способы, раскрытые в данном документе, позволяют персонализировать генную терапию на протяжении всей жизни индивидуума, чтобы экспрессировать трансген на уровне, который соответствует потребностям индивидуума, поддерживая уровень экспрессии трансгена на предварительно заданном уровне или, альтернативно, увеличивая экспрессию трансгена дозозависимым образом, путем одного или нескольких введений после первоначального примирующего введения (например, в момент времени 0), тем самым контролируя уровень экспрессии трансгена до желаемого уровня экспрессии или желаемого диапазона уровней экспрессии на основе концентрации зкДНК-вектора при введении повторной дозы, позволяющих контролировать и специфическое увеличивать экспрессию трансгена в клетке или у субъекта.

[0018] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть введен повторно (также называется в данном документе «повторной дозой» или «бустерным» введением) для поддержания уровня экспрессии трансгена на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или для повышения уровня экспрессии трансгена выше предшествующего уровня экспрессии, который был достигнут при первом или предшествующем введении зкДНК-вектора.

[0019] Соответственно, один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к использованию зкДНК-вектора в способах контролируемой экспрессии трансгена, например, в способе модуляции уровней экспрессии трансгена, или для контролируемого повышения уровня экспрессии трансгена, или для дозозависимой экспрессии уровня трансгена в клетке или у субъекта, причем зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность (например, трансген), функционально связанную с промотором и расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), при этом последовательности ИКП могут быть асимметричными, или симметричными, или по существу симметричными, как эти термины определены в данном документе, причем по меньшей мере один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep и, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген, и указанный вектор не заключен в вирусный капсид.

[0020] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, представляет собой бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные из непрерывной цепи комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и не заключенная в капсид структура), которая содержит две последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП), фланкирующие трансген, который функционально связан с промотором или другим регуляторным переключателем, как описано в данном документе. 5'-ИКП и 3'-ИКП могут иметь одинаковую симметричную трехмерную организацию относительно друг друга (т.е. симметричную или по существу симметричную), или, альтернативно, 5'-ИКП и 3'-ИКП могут иметь разную трехмерную организацию относительно друг друга (т.е. асимметричные ИКП), как эти термины определены в данном документе. Кроме того, ИКП могут принадлежать к одному или к разным серотипам. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать последовательности ИКП, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве (т.е. они одинаковы или являются зеркальным отражением друг друга). В некоторых вариантах реализации один ИКП может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой ИКП может принадлежать к другому серотипу ААВ.

[0021] Соответственно, некоторые аспекты технологии, описанной в данном документе, относятся к зкДНК-вектору для редактирования генов, который содержит последовательности ИКП, выбранные из любых из: (i) по меньшей мере одного ИКП дикого типа (ДТ) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (ИКП) ААВ (например, асимметричных модифицированных ИКП); (ii) двух модифицированных ИКП, причем пара мод-ИКП имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричных модифицированных ИКП), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ИКП ДТ-ДТ, причем каждый ИКП-ДТ имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной пары модифицированных ИКП, причем каждый мод-ИКП имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы могут продуцироваться в эукариотических клетках и, соответственно, не содержат прокариотических модификаций ДНК и загрязнений бактериальными эндотоксинами в клетках насекомых.

[0022] В некоторых вариантах реализации способы и зкДНК-векторы, как описано в данном документе, обеспечивают возможность подхода персонализированного генетического лекарственного средства, т.е. титрование повышения уровня экспрессии трансгена путем повторных введений доз зависимым от концентрации образом. Предполагается, что повышение экспрессии трансгена может быть достигнуто дозозависимым образом, поэтапно, с использованием введения повторных доз, повышая таким образом уровень экспрессии трансгена на заданную или определенную величину при каждом введении повторной дозы. Это обеспечивает возможность контролируемого повышения уровня экспрессии трансгена дозозависимым образом и может осуществляться постепенно. Соответственно, может быть введено 1, 2, 3, 4, 5 или 6, или более 6 повторных доз определенного количества зкДНК для повышения каждый раз уровня экспрессии трансгена на определенную величину, чтобы достичь желаемого уровня или желаемого диапазона уровней экспрессии, более высокого, чем уровень экспрессии, достигнутый при предшествующем введении или перед таким повторным введением дозы.

[0023] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предусматривается способ регулирования экспрессии трансгена у хозяина, включающий: (i) введение хозяину достаточного количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе, включающего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, функционально связанный с промотором, расположенный между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), для экспрессии измеримых уровней трансгена, причем трансген кодирует желаемый белок; и (ii) введение по меньшей мере второй дозы зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере один трансген или модифицированный трансген между фланкирующими ИКП, для (i) продолжения экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или (ii) модуляции экспрессии желаемого белка до предварительно определенного уровня, причем второе введение зкДНК-вектора не вызывает иммунную реакцию, препятствующую экспрессии желаемого белка.

[0024] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к использованию зкДНК-вектора в способе поддержания желаемого уровня экспрессии трансгена в клетке, включающем: (а) введение в клетку в первый момент времени первой дозы зкДНК-вектора для достижения экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, и (b) введение в клетку во второй момент времени другой дозы того же или другого зкДНК-вектора для повышения уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня или для компенсации какого-либо снижения уровня экспрессии трансгена после первоначального введения зкДНК-вектора. Следует понимать, что такое постепенное повышение экспрессии трансгена позволяет титровать дозировку у субъекта до желаемого для такого субъекта уровня. В некоторых вариантах реализации использование зкДНК-вектора в способе поддержания уровня экспрессии трансгена в клетке обеспечивает экспрессию трансгена на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 42 суток. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 84 суток. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 132 суток.

[0025] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, используемый в описанных в данном документе способах, например, в способе поддержания экспрессии трансгена в клетке и/или лечения субъекта с заболеванием, вводят в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят во второй момент времени через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев, или 6-12 месяцев, или 1-2 года, или 2-3 года, после первого момента времени.

[0026] В дополнение к повторному введению дозы зкДНК-вектора для простого повышения уровня экспрессии трансгена, если уровни экспрессии снизились с течением времени (например, для продолжения экспрессии трансгена на желаемом предварительно заданном уровне), в некоторых вариантах реализации способы и композиции для повторного введения зкДНК-вектора могут повышать уровень трансгена дозозависимым образом, т.е. повторное введение определенного количества зкДНК-вектора может вызывать определенное повышение уровня экспрессии трансгена. Иными словами, используя произвольные единицы только для иллюстративных целей, единичная доза зкДНК при повторном введении приведет к повышению уровня экспрессии трансгена на 10% по сравнению с предшествующим уровнем, а 2-кратная доза зкДНК-вектора будет приводить к повышению уровня трансгена на 20% по сравнению с предшествующим уровнем, и половинная (0,5) доза зкДНК позволит повысить уровень экспрессии трансгена на 5% по сравнению с предшествующим уровнем.

[0027] Соответственно, в одном варианте реализации зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе для контролируемой экспрессии трансгена, может быть использован для повышения уровня экспрессии трансгена в клетке или у субъекта контролируемым образом. Например, уровень экспрессии трансгена может быть повышен с помощью одного или нескольких последующих введений (например, повторной дозы или бустерного введения) зкДНК-вектора.

[0028] Другой аспект данной технологии относится к способу повышения экспрессии трансгена в клетке, например, для повышения уровня экспрессии трансгена выше предшествующего уровня экспрессии, который был достигнут при предшествующем введении зкДНК, причем способ включает: (a) введение в клетку в первый момент времени примирующей дозы зкДНК-вектора для достижения экспрессии трансгена, и (b) введение в клетку во второй момент времени дозы зкДНК-вектора для повышения уровня экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, достигнутым после введения зкДНК-вектора в первый момент времени, или для повышения уровня экспрессии трансгена для достижения желаемого уровня экспрессии.

[0029] Во всех аспектах, описанных в данном документе, зкДНК-вектор, который вводят в любой момент времени (например, в первый, второй, третий момент времени и т.д.), вводится в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, и необязательно может быть введен с носителем, например, частицами, липосомами или липидными наночастицами (ЛНЧ). Во всех аспектах, описанных в данном документе, зкДНК-вектор, который вводят в любой из: первого, второго или любого последующего момента времени, вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0030] Во всех описанных в данном документе аспектах, зкДНК-вектор, используемый в способах контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, например, в способе поддержания экспрессии трансгена, или контролируемого повышения экспрессии трансгена, или дозозависимой экспрессии трансгена, и/или лечения субъекта с заболеванием, указанный зкДНК-вектор, который вводится в любой из: первого, второго или любого последующего момента времени, вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

[0031] В некоторых вариантах реализации, в которых осуществляется более одного введения зкДНК (например, во второй или любой последующий момент времени), второй момент времени или любой последующий момент времени, через по меньшей мере 10 суток, или 10-30 суток, или по меньшей мере 30 суток, или 30-60 суток, по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев, или 6-12 месяцев, или по меньшей мере год после введения зкДНК-вектора в первый момент времени или в предшествующий момент времени.

[0032] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводится в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой тот же самый зкДНК-вектор, содержащий тот же трансген или модифицированный трансген, и в альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводится в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же трансген или модифицированный трансген, например, другой зкДНК-вектор с другим промотором, функционально связанным с тем же трансгеном, или модифицированным трансгеном. В некоторых вариантах реализации промотор представляет собой индуцибельный или репрессируемый промотор. Трансген также может быть частью регуляторного переключателя, как описано в данном документе.

[0033] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектора, используемого в описанных в данном документе способах контролируемой экспрессии трансгена, зкДНК-вектор, который вводят в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой один и тот же зкДНК-вектор, содержащий тот же трансген, или модифицированный трансген. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же трансген или модифицированный трансген, например, без ограничений, в случаях, когда другой зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном, или с модифицированным трансгеном, или с другим трансгеном. Только для иллюстративных целей, зкДНК-вектор, который вводят в первый момент времени, может содержать трансген и первый промотор или регуляторный переключатель, а зкДНК, которую вводят во второй или последующие моменты времени, может содержать такой же или модифицированный трансген и второй промотор или регуляторный переключатель. причем первый и второй промотор (или регуляторный переключатель) являются разными промоторами или разными регуляторными переключателями. Примеры регуляторных переключателей описаны в данном документе.

[0034] В некоторых вариантах реализации использование зкДНК-вектора в способах контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, например, в способе поддержания экспрессии трансгена, или контролируемого повышения экспрессии трансгена, или дозозависимой экспрессии трансгена и/или лечения субъекта с заболеванием, может необязательно включать стадию введения в клетку, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дополнительной дозы зкДНК-вектора для повышения уровня экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, достигнутым после введения зкДНК-вектора во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии трансгена для поддержания желаемого уровня устойчивой экспрессии, причем композиция, вводимая в один или несколько моментов времени после второго момента времени, содержит зкДНК-вектор, как описано в данном документе.

[0035] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, используемый в раскрытых в данном документе способах контролируемой экспрессии трансгена, обеспечивает возможность экспрессии трансгена в терапевтически эффективном количестве.

[0036] В некоторых вариантах реализации увеличение предварительно определенной дозы зкДНК-вектора, вводимого во второй момент времени или в любой последующий момент времени, повышает уровень экспрессии трансгена в клетке и/или у субъекта. В некоторых вариантах реализации предварительно определенную дозу зкДНК-вектора, вводимую в клетку или субъекту во второй момент времени или в последующий момент времени, определяют по дозовой зависимости для зкДНК-вектора, для достижения желаемого уровня экспрессии трансгена в клетке или у субъекта.

[0037] В некоторых вариантах реализации предварительно определенная доза зкДНК-вектора, вводимая во второй или любой последующий момент времени, представляет собой количество, которое в 2-10 раз превышает дозу зкДНК-вектора, вводимого в первый момент времени. В некоторых вариантах реализации предварительно определенная доза зкДНК-вектора, вводимая во второй или любой последующий момент времени, представляет собой количество, которое повышает экспрессию трансгена по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или в 2-15 раз, или в 2-20 раз, или более чем в 20 раз, по сравнению с экспрессией трансгена, достигнутой после введения зкДНК в первый момент времени или в предшествующий момент времени. В некоторых вариантах реализации желаемый уровень экспрессии трансгена, достигаемый после введения композиции в один или несколько моментов времени после второго момента времени, представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена.

[0038] Аспекты данного изобретения относятся к способам продуцирования зкДНК-вектора, используемого в способах контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, например, в способе поддержания экспрессии трансгена, или контролируемого повышения экспрессии трансгена, или дозозависимой экспрессии трансгена, и/или лечения субъекта с заболеванием. Во всех аспектах, бескапсидный невирусный ДНК-вектор (зкДНК-вектор) для контролируемой экспрессии трансгена получают из плазмиды (называемой в данном документе «зкДНК-плазмида»), содержащей матрицу полинуклеотидного экспрессионного конструкта, содержащую, в указанном порядке: первый 5'-инвертированный концевой повтор (например, ИКП ААВ); гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты; и 3'-ИКП (например, ИКП ААВ), при этом 5'-ИКП и 3'-ИКП могут быть асимметричными друг относительно друга или симметричными (например, представлять собой ИКП-ДТ или модифицированные симметричные ИКП), как определено в данном документе.

[0039] зкДНК-вектор, используемый в способах контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе (например, в способе поддержания уровней экспрессии трансгена и/или контролируемого повышения уровня экспрессии трансгена, или уровня дозозависимой экспрессии трансгена) можно получить рядом способов, которые будут известны специалисту в данной области техники после прочтения данного раскрытия. Например, полинуклеотидная матрица экспрессионного конструкта, используемая для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду (например, см. Фиг.4 В), зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус.В одном варианте реализации зкДНК-плазмида содержит сайт рестрикционного клонирования (например, SEQ ID NO: 123 и/или 124, функционально расположенный между указанными ИКП, в который может быть вставлена экспрессионная кассета, содержащая, например, промотор, функционально связанный с трансгеном, например, репортерным геном и/или терапевтическим геном). В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы получают из полинуклеотидной матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса), содержащей симметричные или асимметричные ИКП (модифицированные ИКП или ИКП дикого типа (ДТ)).

[0040] В пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, полинуклеотидная матрица, имеющая по меньшей мере два ИКП, реплицируется для продуцирования зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора проходит в два этапа: во-первых, вырезания («освобождения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловирусного генома и т.д.) посредством Rep-белков и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора. Белки Rep и Rep-связывающие сайты различных серотипов ААВ хорошо известны рядовым специалистам в данной области техники. Рядовой специалист в данной области техники понимает, что следует выбирать белок Rep из серотипа, который связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты и реплицирует ее, на основе, по меньшей мере, одного функционального ИКП. Например, если компетентный по репликации ИКП относится к серотипу ААВ 2, соответствующий Rep будет принадлежать серотипу ААВ, который работает с указанным серотипом, таким как ИКП ААВ2 с Rep ААВ2 или ААВ4, но не с Rep ААВ5, который неспособен на это. После репликации зкДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами продолжает накапливаться в пермиссивных клетках, и зкДНК-вектор предпочтительно является достаточно стабильным во времени в присутствии белка Rep в стандартных условиях репликации, например, для накопления в количестве, составляющем по меньшей мере 1 пг/клетку. предпочтительно, по меньшей мере 2 пг/клетку, предпочтительно, по меньшей мере 3 пг/клетку, более предпочтительно, по меньшей мере 4 пг/клетку, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5 пг/клетку.

[0041] Соответственно, один аспект изобретения относится к способу получения зкДНК-вектора, используемого в способах контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, включающему стадии: a) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих полинуклеотидную матрицу экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), лишенную последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep, в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, причем клетки-хозяева не содержат последовательностей, кодирующих вирусный капсид; и b) сбора и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ИКП для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако вирусные частицы (например, вирионы ААВ) не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, накладываемые вирионами.

[0042] Присутствие зкДНК-вектора, пригодного для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, выделенного из клеток-хозяев, можно подтвердить путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, с помощью рестриктазы, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа материала расщепленной ДНК на денатурирующем и неденатурирующем гелях для подтверждения наличия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, в отличие от линейной и прерывистой ДНК.

[0043] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, трансген, экспрессируемый контролируемым образом из зкДНК-вектора, представляет собой терапевтический трансген, например, представляющий интерес белок, включая, без ограничений, рецептор, токсин, гормон, фермент или белок клеточной поверхности. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, предусматриваемых в данном документе, представляющий интерес белок является рецептором. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, предусматриваемых в данном документе, представляющий интерес белок является ферментом. Типичные примеры генов, выступающих в роли мишеней, и белков, представляющих интерес, подробно описаны в разделах данного документа, касающихся способов применения и способов лечения.

[0044] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих абзацев:

[0045] Способ регуляции экспрессии трансгена у субъекта, включающий: (а) введение субъекту достаточного количества невирусной бескапсидной ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), содержащей кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, функционально связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), для экспрессии измеримого уровня трансгена, причем трансген кодирует желаемый белок для лечения заболевания; и (b) титрование зкДНК-вектора путем введения субъекту по меньшей мере второй дозы зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере один трансген между фланкирующими ИКП, для обеспечения трансгенной экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или для повышения трансгенной экспрессии желаемого белка до предварительно определенного уровня.

[0046] В некоторых вариантах реализации субъекта обследуют в предварительно определенное время после стадии (а), например, через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или от 60 до 90 суток, или более чем 90 суток после стадии (а), для определения титруемой дозы. Например, в некоторых вариантах реализации субъекта оценивают для определения состояния заболевания у субъекта после стадии (а) и/или уровня желаемого белка, экспрессируемого зкДНК-вектором у субъекта. В некоторых вариантах реализации, оценка болезненного состояния представляет собой оценку по меньшей мере одного симптома заболевания у субъекта. В некоторых вариантах реализации, если болезненное состояние субъекта оставалось стабильным или не улучшилось, или когда болезненное состояние у субъекта ослабело, например, по сравнению с болезненным состоянием на момент первого введения зкДНК-вектора или в любое время перед стадией (а), субъекту вводят вторую дозу зкДНК-вектора в соответствии со стадией (b). Состояние заболевания для любого данного заболевания может быть определено врачом или квалифицированным специалистом в данной области техники, и включает оценку одного или нескольких клинических симптомов и/или биомаркеров заболевания, включая белковые биомаркеры, биомаркеры микроРНК (miRNA) и мРНК и т.п.В некоторых вариантах реализации, если уровень экспрессии трансгена у субъекта снизился от предварительно определенного уровня или снизился от терапевтически эффективного количества, субъекту вводят вторую дозу зкДНК-вектора в соответствии со стадией (b). В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии трансгена определяют путем измерения уровня трансгена (например, измерения уровня белка или уровней мРНК), экспрессируемого из зкДНК-вектора в биологическом образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах реализации биологический образец выбирают из образца крови, плазмы, синовиальной жидкости, спинномозговой жидкости (CSF), слюны или образца биопсии ткани. В некоторых вариантах реализации, в которых зкДНК-вектор экспрессирует трансген, кодирующий желаемый белок или терапевтический ген, и репортерный белок, уровень трансгена можно определить путем измерения желаемого репортерного белка, экспрессированного из зкДНК-вектора in vivo, с использованием методов, общеизвестных рядовым специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации титрование зкДНК-вектора определяет уровень трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, и введение субъекту второй дозы зкДНК-вектора для корректировки или модуляции экспрессии трансгена до предварительно определенного желаемого уровня.

[0047] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу регуляции экспрессии трансгена у субъекта, включающему: (а) введение субъекту достаточного количества невирусного бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, функционально связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), для экспрессии измеримого уровня трансгена, причем трансген кодирует желаемый белок; и (b) введение субъекту по меньшей мере второй дозы зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере один трансген или модифицированный трансген между фланкирующими ИКП для (i) продолжения экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне в течение предварительно определенного периода времени, или (ii) модуляции экспрессии желаемого белка до предварительно определенного уровня.

[0048] Во всех аспектах данного изобретения, второе введение зкДНК-вектора субъекту не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения предварительно определенного уровня экспрессии желаемого белка.

[0049] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят субъекту при первом введении, или при втором введении, или при любом последующем введении, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

[0050] В некоторых вариантах реализации второе введение зкДНК-вектора происходит в то время, когда уровень экспрессии трансгена снижается от желаемого предварительно определенного уровня, например, в некоторых вариантах реализации, второе введение проводят через по меньшей мере примерно 30 суток, или по меньшей мере примерно 60 суток, или по меньшей мере примерно 90 суток, после первого введения. Когда субъекту вводят более двух доз зкДНК-вектора, каждую повторную дозу (например, 3-ю, 4-ю, 5-ю, 6-ю и последующие повторные дозы) вводят в то время, когда уровень экспрессии трансгена снижается или падает от желаемого предварительно определенного уровня, достигнутого при предшествующем введении, например, в некоторых вариантах реализации каждое повторное введение проводят через по меньшей мере примерно 30 суток, или по меньшей мере примерно 60 суток, или по меньшей мере примерно 90 суток, после предшествующего введения зкДНК-вектора.

[0051] В некоторых вариантах реализации способ включает проведение по меньшей мере трех или более введений зкДНК-вектора субъекту, и в случае проведения по меньшей мере трех введений зкДНК-вектора, ни одно из введений не вызывает иммунный ответ на зкДНК-вектор, который предотвращает достижение заданного уровня экспрессии желаемого белка.

[0052] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят субъекту по периодической схеме, например, через каждые 2 месяца, каждые 3 месяца, каждые 6 месяцев, каждые 12 месяцев, каждые 18 месяцев и т.п.

[0053] В некоторых вариантах реализации второе введение предназначено для повышения уровня экспрессии желаемого белка, например, для продления экспрессии желаемого белка на предварительно заданном уровне экспрессии.

[0054] Во всех аспектах данного изобретения, трансген кодирует терапевтический белок, а желаемый уровень экспрессии трансгена представляет собой терапевтически эффективное количество терапевтического белка. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой генетическое лекарственное средство, выбранное из любого из: нуклеиновой кислоты, ингибитора, пептида или полипептида, антитела или фрагмента антитела, слитого белка, антигена, антагониста, агониста, молекулы РНКи (RNAi) и т.д. В некоторых вариантах реализации желаемый белок или терапевтический белок представляет собой белок-ингибитор, например, без ограничений, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или слитый белок. В некоторых вариантах реализации желаемый белок или терапевтический белок заменяет дефектный белок или белок, который не экспрессируется или экспрессируется на низких уровнях. В некоторых вариантах реализации трансген находится под контролем регуляторного переключателя, как определено в данном документе.

[0055] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит промотор, который является индуцибельным или репрессируемым промотором.

[0056] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой зкДНК-вектор одного и того же типа, содержащий тот же трансген или модифицированный трансген. Например, другими словами, один и тот же зкДНК-вектор вводится субъекту многократно, что сравнимо с многократным введением субъекту одного и того же серотипа вирусного вектора.

[0057] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят субъекту при втором введении или любом последующем введении после этого (например, при введении повторной дозы), имеет другой промотор, функционально связанный с тем же трансгеном или модифицированным трансгеном, по сравнению с промотором в зкДНК-векторе, введеном в более ранний момент времени или при более раннем введения.

[0058] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят при первом введении, или при втором введении, или при любом последующем введении после этого, содержит две последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП), которые представляют собой ИКП ААВ и могут быть, например, ААВ-2 или любым ИКП, выбранным из Таблицы 1 или ААВ1, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИКП содержат функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.В некоторых вариантах реализации фланкирующие ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, являются симметричными, или по существу симметричными, или асимметричными, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП относятся к дикому типу, или оба указанные ИКП относятся к дикому типу. В некоторых вариантах реализации фланкирующие ИКП принадлежат к разным вирусным серотипам. В некоторых вариантах реализации, когда оба фланкирующие ИКП относятся к дикому типу, они могут быть выбраны из любого серотипа ААВ, как указано в Таблице 1.

[0059] В некоторых вариантах реализации фланкирующие ИКП в зкДНК-векторе, при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, могут содержать последовательность, выбранную из последовательностей в Таблицах 2, 4A, 4B или 5 данного документа.

[0060] В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один из ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, является измененным относительно последовательности ИКП ААВ дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию ИКП. В некоторых вариантах реализации один или оба ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, получен из серотипа ААВ, выбранного из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11 и ААВ12.

[0061] В некоторых вариантах реализации один или оба ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, являются синтетическими. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП не являются ИКП дикого типа, или оба указанные ИКП не относятся к дикому типу.

[0062] В некоторых вариантах реализации один или оба из ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, модифицирован путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей ИКП, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'. В некоторых вариантах реализации делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями A, A', B, B', C или C'. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B'. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B', и/или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП содержат единственную структуру стебель-петля в области, обычно содержащей первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'. В некоторых вариантах реализации один или оба указанные ИКП содержат один стебель и две петли в области, обычно содержащей первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'.

[00563] В некоторых вариантах реализации оба ИКП в зкДНК-векторе, вводимом при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, изменены таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда ИКП являются инвертированными относительно друг друга.

[0064] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, вводимый при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, содержит по меньшей мере одну последовательность гетерологичного нуклеотида под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя, например, по меньшей мере одного регуляторного переключателя, выбранного из бинарного регуляторного переключателя, низкомолекулярного регуляторного переключателя, регуляторного переключателя «с паролем», регуляторного переключателя на основе нуклеиновой кислоты, посттранскрипционного регуляторного переключателя, контролируемого излучением или контролируемого ультразвуком регуляторного переключателя, опосредованного гипоксией регуляторного переключателя, регуляторного переключателя воспалительного ответа, активируемого сдвигом регуляторного переключателя и выключателя «kill switch». Регуляторные переключатели раскрыты более подробно ниже в данном документе.

[0065] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводится при первом введении, или втором введении, или любом последующем введении после этого, вводят субъекту с заболеванием или расстройством, выбранным, например, из рака, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного расстройства, гиперхолестеринемии, острого отторжения органа, рассеянного склероза, постменопаузального остеопороза, кожных заболеваний, астмы или гемофилии. В некоторых вариантах реализации субъект с раком имеет солидную опухоль, саркому мягких тканей, лимфому и лейкоз. В некоторых вариантах реализации субъект имеет аутоиммунное заболевание, например, выбранное из ревматоидного артрита и болезни Крона. В некоторых вариантах реализации субъект имеет кожную патологию, например, выбранную из псориаза и атопического дерматита. В некоторых вариантах реализации субъект имеет нейродегенеративное расстройство, например, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона.

[0066] В некоторых вариантах реализации способ, раскрытый в данном документе, дополнительно включает введение субъекту, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дозы зкДНК-вектора для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты (например, трансгена) по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, достигнутым после введения зкДНК-вектора во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии трансгена для достижения желаемого уровня экспрессии.

[0067] В некоторых вариантах реализации предварительно определенная доза зкДНК-вектора, вводимая субъекту во второй или в любой последующий момент времени, представляет собой количество, которое в 2-10 раз превышает дозу композиции зкДНК-вектора, введенную в первый момент времени. В некоторых вариантах реализации предварительно определенная доза композиции зкДНК-вектора, вводимая во второй или любой последующий момент времени, представляет собой количество, которое повышает экспрессию трансгена по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или в 2 до 15 раз, или от 2 до 20 раз, по сравнению с уровнем экспрессии трансгена после введения зкДНК-вектора в первый момент времени или при предшествующем введении. В некоторых вариантах реализации предварительно определенную дозу зкДНК-вектора, вводимую при втором введении или во второй момент времени, определяют по дозовой зависимости для зкДНК-вектора, для достижения желаемого уровня экспрессии трансгена в клетке.

[0068] Эти и другие аспекты изобретения описаны более подробно ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0069] Варианты реализации данного изобретения, вкратце изложенные выше и описанные более подробно ниже, будут понятными со ссылкой на иллюстративные варианты реализации данного изобретения, представленные на прилагаемых чертежах. Однако, прилагаемые чертежи иллюстрируют только типичные варианты реализации данного изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие его объем, поскольку раскрытие может допускать другие в равной степени эффективные варианты реализации.

[0070] Фиг.1А демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего асимметричные ИКП. В этом варианте реализации типичный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка) и BGHpA (сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста). Открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая трансген люциферазы, может быть вставлена в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ИКП) - ИКП ААВ2 дикого типа перед (на 5'-конце) и модифицированным ИКП после (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, таким образом, два ИКП, фланкирующие экспрессионную кассету, являются асимметричными друг относительно друга.

[0071] Фиг.1B демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего асимметричные ИКП с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая трансген люциферазы, может быть вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ИКП) - модифицированным ИКП перед (на 5'-конце) и ИКП дикого типа после (на 3'-конце) экспрессионной кассеты.

[0072] Фиг.1C демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего асимметричные ИКП, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(A). Открытая рамка считывания (ОРС) позволяет вставлять трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ИКП), которые являются асимметричными относительно друг друга - модифицированным ИКП слева от (на 5'-конце) и модифицированным ИКП справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, причем 5'-ИКП и 3'-ИКП оба являются модифицированными ИКП, но имеют разные модификации (т.е. они имеют неодинаковые модификации).

[0073] Фиг.1D демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ИКП или по существу симметричные модифицированные ИКП, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем 5'-модифицированный ИКП и 3'-модифицированный ИКП симметричны или по существу симметричны.

[0074] Фиг.1E демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ИКП или по существу симметричные модифицированные ИКП, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(А). Открытая рамка считывания (ОРС) позволяет вставлять трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем 5'-модифицированный ИКП и 3'-модифицированный ИКП симметричны или по существу симметричны.

[0075] Фиг.1F демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего симметричные ИКП-ДТ или по существу симметричные ИКП-ДТ, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (ИКП-ДТ), причем 5'-ИКП-ДТ и 3'-ИКП-ДТ симметричны или по существу симметричны.

[0076] Фиг.1G демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ИКП или по существу симметричные модифицированные ИКП, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(А). Открытая рамка считывания (ОРС) позволяет вставлять трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (ИКП-ДТ), причем 5'-ИКП-ДТ и 3'-ИКП-ДТ симметричны или по существу симметричны.

[0077] На Фиг.2А представлена Т-образная структура стебель-петля левого ИКП ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 52) с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя Rep-связывающими сайтами (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs). RBE содержит серию из 4 дуплексных тетрамеров, которые, как полагают, взаимодействуют либо с Rep 78, либо с Rep 68. Кроме того, считается также, что RBE' взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ИКП дикого типа, или мутированном ИКП в конструкте. Области D и D' содержат сайты связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры. Фиг.2B демонстрирует предполагаемую катализируемую Rep никующую и лигирующую активности левого ИКП дикого типа (SEQ ID NO: 53), включая Т-образную структуру стебель-петля левого ИКП ААВ2 дикого типа с обозначенными плечом A-A', плечом B-B', плечом C-C', двумя Rep-связывающими сайтами (RBE и RBE'), а также с указанными сайтом концевого разрешения (trs) и областью D и D', содержащей несколько сайтов связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры.

[0078] На Фиг.3А представлена первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащих участков плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' левого ИКП ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 54). Фиг.3B демонстрирует типичный пример последовательности мутированного ИКП (также называемого модифицированным ИКП) для левого ИКП. Представлены первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части плеча A-A', плеча C и плеча B-B’ типичного примера мутированного левого ИКП (ИКП-1, левый) (SEQ ID NO: 113). Фиг.3C демонстрирует первичную структуру (слева) и вторичную структуру (справа) RBE-содержащей части петли A-A' и плеч B-B' и C-C' правого ИКП ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 55). Фиг.3D демонстрирует типичный пример правого модифицированного ИКП. Представлены первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части A-A'-плеча, плеч B-B' и C типичного примера мутантного правого ИКП (ИКП-1, правый) (SEQ ID NO: 114). Может быть использована любая комбинация левого и правого ИКП (например, ИКП ААВ2 или другого вирусного серотипа, или синтетических ИКП), как описано в данном документе. Каждая из полинуклеотидных последовательностей на Фиг.3А-3D относится к последовательностям, используемым в плазмиде или бакмиде/бакуловирусном геноме, применяемых для продуцирования зкДНК, как описано в данном документе. Также каждая из Фиг.3A-3D включает соответствующие предполагаемые вторичные структуры зкДНК, полученные на основании конфигураций зкДНК-вектора в плазмиде или бакмиде/бакуловирусном геноме и предсказанных значений свободной энергии Гиббса.

[0079] Фиг.4А представляет собой схематическое изображение апстрим (начальных стадий) процесса получения инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (BIIC), которые пригодны для продуцирования зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена способом, схематически представленным на Фиг.4 В. На Фиг.4B схематически представлен пример способа получения зкДНК, а на Фиг.4C продемонстрирован биохимический способ и процесс подтверждения получения зкДНК-вектора. На Фиг.4D и Фиг.4Е представлены схематические изображения, описывающие процесс идентификации присутствия зкДНК в ДНК, собранной из клеточных осадков, полученных в процессе продуцирования зкДНК в соответствии с Фиг.4 В. На Фиг.4D схематически представлены ожидаемые полосы для типичного примера зкДНК, нерасщепленной или расщепленной рестрикционной эндонуклеазой, а затем подвергнутой электрофорезу на нативном или денатурирующем геле. Крайняя левая схема соответствует нативному гелю и демонстрирует несколько полос, свидетельствующих о том, что в дуплексной и неразрезанной форме зкДНК существует, по меньшей мере, в мономерном и димерном состояниях, которые проявляются в виде быстрее мигрирующего мономера меньшего размера и медленнее мигрирующего димера с размером, в 2 раза большим, чем у мономера. Второе слева схематическое изображение демонстрирует, что при разрезании зкДНК эндонуклеазой рестрикции исходные полосы исчезают, и появляются более быстро мигрирующие полосы (например, меньшего размера), которые соответствуют ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует как объект вдвое большего размера по сравнению с наблюдаемым на нативном геле, потому что комплементарные цепи ковалентно связаны. Соответственно, на втором справа схематическом изображении расщепленная зкДНК демонстрирует распределение полос, аналогичное наблюдаемому на нативном геле, однако указанные полосы мигрируют как фрагменты, размер которых в два раза больше их эквивалентов в нативном геле. Крайняя правая схема демонстрирует, что неразрезанная зкДНК в денатурирующих условиях мигрирует как одноцепочечное раскрытое кольцо и, поэтому, наблюдаемые полосы имеют в два раза больший размер, чем в нативных условиях, когда кольцо не раскрыто. На данной фигуре «т.п.о.» используется для указания относительного размера нуклеотидных молекул, основанного, в зависимости от контекста, либо на длине нуклеотидной цепи (например, для одноцепочечных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях), либо на числе пар оснований (например, для двуцепочечных молекул, наблюдаемых в нативных условиях). Фиг.4E демонстрирует ДНК, имеющую прерывистую структуру. зкДНК может быть разрезана рестрикционной эндонуклеазой, имеющей один сайт распознавания на зкДНК-векторе, с образованием двух фрагментов ДНК разного размера (1 т.п.о. и 2 т.п.о.) как в нейтральных, так и в денатурирующих условиях. На Фиг.4E также продемонстрирована зкДНК, имеющая линейную и непрерывную структуру. зкДНК-вектор может быть разрезан эндонуклеазой рестрикции и генерирует два фрагмента ДНК, которые мигрируют как 1 т.п.о. и 2 т.п.о. в нейтральных условиях, но в денатурирующих условиях указанные цепи остаются связанными и образуют одиночные цепи, которые мигрируют как 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[0080] Фиг.5 демонстрирует иллюстративное изображение прогона на денатурирующем геле типичных примеров зкДНК-векторов с (+) или без (-) расщепления эндонуклеазами (EcoRI для зкДНК-конструктов 1 и 2; BamH1 для зкДНК-конструктов 3 и 4; SpeI для зкДНК-конструктов 5 и 6 и XhoI для зкДНК-конструктов 7 и 8). Конструкты 1-8 описаны в Примере 1 международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Размеры для полос, помеченных звездочкой, определены и приведены в нижней части чертежа.

[0081] Фиг.6 представляет собой график, демонстрирующий эффект повторной дозы (т.е. бустерного введения) для повышения уровня экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, экспрессирующего люциферазу, присутствующего в композиции, содержащей липосомы. Экспрессию люциферазы измеряли после введения зкДНК-вектора, как описано в Примере 6, и позднее - повторного введения зкДНК-вектора, полученного из зкДНК-вектора, в день 84 или 87. Экспрессию люциферазы оценивали и выявляли во всех трех группах, по меньшей мере, до 132 суток (оценивали наиболее продолжительный период времени). Фиг.6 демонстрирует, что на 80-й день или близко к этому времени уровень экспрессии трансгена у мышей, получивших 1 мг/кг зкДНК-вектора в присутствии липосом (ЛНЧ-зкДНК), немного снижается. Повторное введение зкДНК-вектора в присутствии липосом в день 84 или день 87 можно использовать для продолжения экспрессии трансгена на желаемом предварительно заданном уровне (данные не приведены) или для повышения уровня экспрессии трансгена из зкДНК до более высокого уровня, чем достигнутый в результате предшествующего введения зкДНК-вектора. В данном документе продемонстрировано повышение экспрессии в 7 раз по сравнению с предшествующим уровнем экспрессии трансгена путем введения 3 мг/кг вектора ЛНЧ-зкДНК (LNPceDNA), или 17-кратное повышение уровня экспрессии по сравнению с предшествующим уровнем экспрессии трансгена путем введения 10 мг/кг композиции вектора ЛНЧ-зкДНК.

[0082] На Фиг.7 представлены результаты экспериментов, описанных в Примере 7 и, в частности, продемонстрированы изображения IVIS, полученные для мышей, получавших контроль с ЛНЧ-поли(Ц) (крайняя левая мышь), и четырех мышей, получавших ЛНЧ-зкДНК-люциферазу (все мыши, кроме крайней левой). У четырех мышей, получавших зкДНК, наблюдается значительная флуоресценция в области расположения печени.

[0083] На Фиг.8 представлены результаты эксперимента, описанного в Примере 8. Темные пятна указывают на присутствие белка, образующегося из экспрессируемого зкДНК трансгена, и демонстрируют связь введенных ЛНЧ-зкДНК с гепатоцитами.

[0084] На Фиг.9А-9 В представлены результаты исследований глаз, описанных в Примере 9. На Фиг.9А продемонстрированы репрезентативные изображения IVIS для глаза крысы с введенной инъекцией JetPEI®-зкДНК-люциферазы (вверху слева), по сравнению с глазом той же крысы без введения инъекции (вверху справа), или глаза крысы с введенной инъекцией ДНК плазмиды-люциферазы (внизу слева), и глаза той же крысы без введения инъекции (внизу справа). На Фиг.9 В продемонстрирован график сресуток яркости, наблюдаемой в обработанных глазах или соответствующих необработанных глазах в каждой из экспериментальных групп.Крысы, получавшие зкДНК, продемонстрировали длительную значительную флуоресценцию (и, следовательно, экспрессию трансгена люциферазы) в течение 99 суток, что резко контрастировало с крысами, получавшими плазмиду люциферазы, у которых наблюдалась минимальная относительная флуоресценция (и, следовательно, экспрессия трансгена люциферазы).

[0085] На Фиг.10 и 10 В продемонстрированы результаты исследований персистирования и повторного введения дозы зкДНК мышам Rag2, описанных в Примере 10. Фиг.10А демонстрирует график зависимости полного потока от времени, наблюдаемой у получавших ЛНЧ-зкДНК-Luc мышей c57bl/6 дикого типа, или мышей Rag2. На Фиг.10B продемонстрирован график, показывающий влияние повторной дозы на уровни экспрессии трансгена люциферазы у мышей Rag2, в результате чего после повторной дозы наблюдалась повышенная стабильная экспрессия (стрелка указывает время введения повторной дозы).

[0086] На Фиг.11 продемонстрированы данные исследований экспрессии люциферазы из зкДНК у экспериментальных мышей, описанных в Примере 11, показывающие полный поток в каждой группе мышей за время исследований. Высокие уровни неметилированного CpG коррелировали с более низким полным потоком, наблюдаемым у мышей во времени, тогда как использование специфичного для печени промотора коррелировало с продолжительной стабильной экспрессией трансгена из зкДНК-вектора на протяжении по меньшей мере 77 суток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0087] В данном документе описаны способы и композиции, включающие новые бескапсидные ДНК-векторы с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК) для контролируемой экспрессии трансгена, например, для обеспечения устойчивой экспрессии желаемого трансгена в желаемое время и в течение предварительно определенного периода времени, или для модуляции экспрессии уровня трансгена (включая повышение уровня экспрессии) в клетке, in vivo либо in vitro, причем уровень экспрессии трансгена может быть повышен с помощью по меньшей мере одного (т.е. одного или нескольких) последующих введений (например, бустерного введения или повторной дозы).

[0088] зкДНК-вектор и способы, описанные в данном документе, позволяют поддерживать уровень экспрессии трансгена in vitro и in vivo в клетке-хозяине или у субъекта, т.е. поддерживать экспрессию на желаемом уровне или останавливать любое ухудшение уровня экспрессии путем по меньшей мере одного повторного введения (в данном документе также называемого повторной дозой или бустерным введением) в какой-то момент времени после первоначального введения.

[0089] зкДНК-вектор и способы, раскрытые в данном документе, позволяют повысить уровень экспрессии трансгена от предшествующего уровня in vitro и in vivo, т.е. повысить экспрессию до или выше желаемого уровня, или повысить уровень экспрессии до значения, находящегося в желаемом диапазоне экспрессии, путем по меньшей мере одного повторного введения (в данном документе также называемого повторной дозой или бустерным введением) в какой-то момент времени после первоначального введения.

[0090] Иначе говоря, экспрессия трансгена, экспрессируемого зкДНК, может быть увеличена выше уровня от предшествующего введения. Если предшествующее введение представляло собой начальную дозу (т.е. примирующую дозу), то введение повторной дозы во второй момент времени можно использовать для повышения уровня экспрессии трансгена. Аналогично, если предшествующее введение было вторым введением (т.е., введением повторной дозы), то дополнительное введение повторной дозы можно использовать для повышения уровня экспрессии трансгена до уровня, более высокого, чем при предшествующем введении повторной дозы, или до желаемого уровня или диапазона значений экспрессии. Таким образом, технология, способы и зкДНК-вектор, раскрытые в данном документе, могут использоваться для постепенного контролируемого повышения уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня экспрессии. Такое поэтапное и постепенное повышение уровня экспрессии трансгена выгодно для лечения субъекта, поскольку позволяет титровать уровень экспрессии трансгена у конкретного индивидуума, исходя из потребностей субъекта и/или эффективности зкДНК-вектора и/или экспрессированного трансгена (например, генетического лекарственного средства) у субъекта, без риска введения чрезмерно высокой начальной дозы, превышающей действительно необходимую, и/или без иммунных осложнений, связанных с другими векторами на основе ААВ.

Определения

[0091] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые применительно к данному изобретению, имеют значения, обычно подразумеваемые специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в данном документе, и потому допускает варианты. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения. Определения общепринятых терминов иммунологии и молекулярной биологии можно найти в следующих источниках: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19-е изд., опубликовано Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (ред.), Fields Virology, 6-е изд., опубликовано Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ред.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ред.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology, Werner Luttmann, опубликовано Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (ред.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, опубликовано Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4е изд.., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ред.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ред.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ред.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (ред.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылок.

[0092] Используемые в данном документе термины «гетерологичная нуклеотидная последовательность» и «трансген» используются взаимозаменяемо и относятся к представляющей интерес нуклеиновой кислоте (отличной от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид капсида), которая включена и может быть доставлена и экспрессирована с помощью зкДНК-вектора, как описано в данном документе. Представляющие интерес трансгены включают, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, предпочтительно, терапевтические (например, для медицинских, диагностических или ветеринарных целей) или иммуногенные полипептиды (например, для вакцин). В некоторых вариантах реализации представляющие интерес нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, которые транскрибируются в терапевтическую РНК. Трансгены, включенные для использования в зкДНК-векторах по изобретению, включают, без ограничений, экспрессирующие или кодирующие один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, аптамеров, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, РНКи, микроРНК, днкРНК (длинных некодирующих РНК), антисмысловых олиго- или полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию. Трансген может представлять собой «генетическое лекарственное средство» и охватывает любые из: ингибитора, нуклеиновой кислоты, олигонуклеотида, нуклеиновой кислоты для сайленсинга, микроРНК, РНКи, антагониста, агониста, полипептида, пептида, антитела или фрагментов антител, слитых белков или их вариантов, эпитопов, антигенов, аптамеров, рибосом и т.п.Трансген, используемый в данном документе в зкДНК-векторе, не ограничен по размеру.

[0093] Термин «генетическое лекарственное средство», раскрытый в данном документе, относится к любой структуре ДНК или последовательности нуклеиновой кислоты, которые можно использовать для лечения или предотвращения заболевания или расстройства у субъекта.

[0094] В данном документе термины «экспрессионная кассета» и «транскрипционная кассета» используются взаимозаменяемо и относятся к линейному отрезку нуклеиновых кислот, который включает трансген, функционально связанный с одним или несколькими промоторами или другими регуляторными последовательностями, достаточными для направления транскрипции указанного трансгена, но не включает кодирующие капсид последовательности, другие векторные последовательности или области инвертированных концевых повторов. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать одну или несколько цис-действующих последовательностей (например, промоторов, энхансеров или репрессоров), один или несколько интронов, и один или несколько посттранскрипционных регуляторных элементов.

[0095] Используемый в данном документе термин «концевой повтор», или «КП», включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимально требуемую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Rep-связывающая последовательность (RBS) (также называемая RBE (Rep-связывающий элемент)) и сайт концевого разрешения (TRS) вместе составляют «минимально требуемую точку начала репликации» и, соответственно, концевой повтор (КП) содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. Концевые повторы, являющиеся обратно комплементарными друг к другу, в составе данного отрезка полинуклеотидной последовательности, как правило, называют «инвертированными концевыми повторами», или «ИКП». В контексте вируса, ИКП опосредуют репликацию, упаковку вируса, интеграцию и освобождение провируса. Как было неожиданно обнаружено авторами данного изобретения, концевые повторы, не являющиеся обратно комплементарными по всей их длине, могут, тем не менее, выполнять традиционные функции ИКП и, таким образом, термин ИКП в данном документе относится к КП в геноме зкДНК или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в зкДНК-векторах сложной конфигурации может присутствовать более двух пар ИКП или асимметричных ИКП. ИКП может представлять собой ИКП ААВ или ИКП, не принадлежащий ААВ, или может быть получен из ИКП ААВ или ИКП, не принадлежащего ААВ. Например, ИКП может происходить из вируса семейства Parvoviridae, которое охватывает парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собак, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус мышей, свиной парвовирус, парвовирус человека B-19), или шпилька SV40, служащая точкой начала репликации SV40, может применяться в качестве ИКП, который может быть дополнительно модифицирован путем усечения, замены, делеции, вставки и/или добавления. Семейство вирусов Parvoviridae состоит из двух подсемейств: Parvovirinae, инфицирующих позвоночных животных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (ААВ), которые способны к репликации у позвоночных животных-хозяев, включая, без ограничений, виды человека, приматов, бычьих, собачьих, лошадей и овец.

[0096] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды либо дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечные ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. «Олигонуклеотид» обычно относится к полинуклеотидам, содержащим от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов одно- или двухцепочечной ДНК. Однако для целей данного изобретения верхнего предела длины олигонуклеотида не существует.Олигонуклеотиды также известны как «олигомеры» или «олиго» («oligos») и могут быть выделены из генов или химически синтезированы способами, известными в данной области техники. Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» следует понимать как включающие, применительно к описываемым вариантам реализации, одноцепочечные (такие как смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные полинуклеотиды.

[0097] Используемый в данном документе термин «конструкт нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одноцепочечной или двухцепочечной, которая выделена из встречающегося в природе гена, или модифицирована так, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот способом, не существующим в природе, или является синтетической. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «экспрессионная кассета», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по данному изобретению. «Экспрессионная кассета» включает кодирующую последовательность ДНК, функционально связанную с промотором.

[0098] Под «гибридизуемым», или «комплементарным», или «по существу комплементарным» подразумевается, что нуклеиновая кислота (например, РНК) включает последовательность нуклеотидов, которая позволяет ей нековалентно связываться, т.е. формировать пары оснований по Уотсону-Крику и/или пары оснований G/U, подвергаться «отжигу» или «гибридизироваться» с другой нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности, антипараллельным образом (т.е. нуклеиновая кислота специфически связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой) в пригодных in vitro и/или in vivo условиях температуры и ионной силы раствора. Как известно в данной области техники, стандартное спаривание оснований по Уотсону-Крику включает спаривание аденина (A) с тимидином (T), спаривание аденина (A) с урацилом (U) и спаривание гуанина (G) с цитозином (C). Кроме того, в данной области техники также известно, что при гибридизации двух молекул РНК (например, дцРНК) гуаниновое (G) основание спаривается с урацилом (U). Например, спаривание оснований G/U частично отвечает за вырожденность (т.е. избыточность) генетического кода в контексте спаривания оснований анти-кодонов тРНК с кодонами в мРНК. В контексте данного изобретения, гуанин (G) связывающего белок сегмента (дуплекса дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению считается комплементарным урацилу (U), и наоборот.Таким образом, когда пара оснований G/U может быть получена в данном нуклеотидном положении со связывающим белок сегментом (дуплекс дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению, это положение не рассматривается как некомплементарное, но вместо этого считается комплементарным.

[0099] Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме аминокислот любой длины, которая может включать кодируемые и некодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты, и полипептиды, имеющие модифицированные пептидные остовы.

[00100] Последовательность ДНК, которая «кодирует» конкретную РНК, или генный продукт белка, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты ДНК, которая транскрибируется в конкретную РНК и/или белок. Полинуклеотид ДНК может кодировать РНК (мРНК), которая транслируется в белок, или полинуклеотид ДНК может кодировать РНК, которая не транслируется в белок (например, тРНК, рРНК или нацеливающую на ДНК РНК; также называемые «некодирующими» РНК или «нкРНК»).

[00101] Используемый в данном документе термин «ген безопасной гавани генома» или «ген безопасной гавани» относится к гену или локусам, в которые последовательность нуклеиновой кислоты может быть вставлена так, чтобы последовательность могла интегрироваться и функционировать предсказуемым образом (например, экспрессировать белок, представляющий интерес) без существенных негативных последствий для активности эндогенного гена или развития рака. В некоторых вариантах реализации ген безопасной гавани также представляет собой локусы или ген, в которых вставленная последовательность нуклеиновой кислоты может экспрессироваться эффективно и на более высоких уровнях, чем в сайте, не являющемся «безопасной гаванью».

[00102] Используемый в данном документе термин «доставка гена» означает процесс, посредством которого чужеродная ДНК переносится в клетки-хозяева для генно-терапевтического применения.

[00103] Используемый в данном документе термин «концевой повтор», или «КП», включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимально требуемую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Rep-связывающая последовательность (RBS) (также называемая RBE (Rep-связывающий элемент)) и сайт концевого разрешения («TRS») вместе составляют «минимально требуемую точку начала репликации» и, таким образом, концевой повтор (КП) содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. Концевые повторы, являющиеся обратно комплементарными друг к другу, в составе данного отрезка полинуклеотидной последовательности, как правило, называют «инвертированными концевыми повторами», или «ИКП». В контексте вируса, ИКП опосредуют репликацию, упаковку вируса, интеграцию и освобождение провируса. Как было неожиданно обнаружено авторами данного изобретения, концевые повторы, не являющиеся обратно комплементарными по всей их длине, могут, тем не менее, выполнять традиционные функции ИКП и, таким образом, термин ИКП в данном документе относится к КП в геноме зкДНК или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в зкДНК-векторах сложной конфигурации может присутствовать более двух пар ИКП или асимметричных ИКП. ИКП может представлять собой ИКП ААВ или ИКП, не принадлежащий ААВ, или может быть получен из ИКП ААВ или ИКП, не принадлежащего ААВ. Например, ИКП может происходить из вируса семейства Parvoviridae, которое охватывает парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собак, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус мышей, свиной парвовирус, парвовирус человека B-19), или шпилька SV40, служащая точкой начала репликации SV40, может применяться в качестве ИКП, который может быть дополнительно модифицирован путем усечения, замены, делеции, вставки и/или добавления. Семейство вирусов Parvoviridae состоит из двух подсемейств: Parvovirinae, инфицирующих позвоночных животных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (ААВ), которые способны к репликации у позвоночных животных-хозяев, включая, без ограничений, виды человека, приматов, бычьих, собачьих, лошадей и овец. Для удобства, в данном документе ИКП, расположенный со стороны 5' от (выше) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ИКП" или "левым ИКП", а ИКП, расположенный со стороны 3’ от (ниже) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3’-ИКП» или «правый ИКП».

[00104] «ИКП дикого типа» или «ИКП-ДТ» относится к последовательности встречающейся в природе ИКП-последовательности ААВ или другого депендовируса, которая сохраняет, например, активность связывания Rep и никующую способность Rep.Нуклеотидные последовательности ИКП-ДТ из любого серотипа ААВ могут незначительно отличаться от канонической природной последовательности из-за вырожденности или дрейфа генетического кода и, следовательно, последовательности ИКП-ДТ, пригодные для использования по данному изобретению, включают последовательности ИКП-ДТ, образующиеся в результате естественных изменений, происходящих в процессе продуцирования (например, ошибки репликации).

[00105] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные ИКП-ДТ» или «по существу симметричная пара ИКП-ДТ» относится к паре ИКП-ДТ в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба представляют собой ИКП дикого типа, имеющие обратно комплементарные последовательности по всей их длине. Например, ИКП можно рассматривать как последовательность дикого типа, даже если он имеет один или несколько нуклеотидов, которые отклоняются от канонической природной последовательности, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую трехмерную структуру последовательности. В некоторых аспектах отклоняющиеся нуклеотиды представляют собой консервативные изменения последовательности. В качестве одного неограничивающего примера - последовательность, имеющая степень идентичности последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную, например, с использованием BLAST при настройках по умолчанию), и имеющая также симметричную трехмерную пространственную организацию с другой ИКП-ДТ, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричные ИКП-ДТ имеют одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве. По существу симметричный ИКП-ДТ можно функционально подтвердить как относящийся к дикому типу (ДТ), определив, что он имеет функциональный Rep-связывающий сайт (RBE или RBE') и сайт концевого разрешения (trs), который связывается с соответствующим белком Rep.Можно дополнительно проверить другие функции, включая экспрессию трансгена в пермиссивных условиях.

[00106] Используемые в данном документе фразы «модифицированный ИКП» или «мод-ИКП» или «мутантный ИКП» являются взаимозаменяемыми и относятся к ИКП, который имеет мутацию в по меньшей мере одном или нескольких нуклеотидах по сравнению с ИКП-ДТ из того же серотипа. Мутация может приводить к изменению одной или нескольких из областей A, C, C', B, B' в ИКП, и может приводить к изменению трехмерной пространственной организации (т.е. ее трехмерной структуры в геометрическом пространстве). по сравнению с трехмерной пространственной организацией ИКП-ДТ того же серотипа.

[00107] Используемый в данном документе термин «асимметричные ИКП», также называемые «асимметричными парами ИКП», относится к паре ИКП в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые не являются обратными комплементами по их полной длине. Различие в последовательностях между двумя ИКП может быть связано с добавлением, делецией, усечением или точечной мутацией нуклеотидов. В одном варианте реализации один ИКП пары может представлять собой последовательность ААВ дикого типа, а другой - последовательность, не относящуюся к дикому типу, или синтетическую последовательность. В другом варианте реализации ни один ИКП пары не является последовательностью ААВ дикого типа, и последовательности двух ИКП отличаются друг от друга. Для удобства, в данном документе ИКП, расположенный со стороны 5' от (выше) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ИКП" или "левым ИКП", а ИКП, расположенный со стороны 3’ от (ниже) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3’-ИКП» или «правый ИКП». В качестве одного неограничивающего примера, в асимметричной паре ИКП не имеют симметричной трехмерной пространственной организации со своим ИКП-партнером, и их трехмерные структуры имеют разные формы в геометрическом пространстве. Другими словами, асимметричная пара ИКП имеет разные общие геометрические структуры, т.е. они имеют разную организацию своих A, C-C'- и B-B'-петель в трехмерном пространстве (например, один ИКП может иметь короткое плечо C-C’ и/или короткое плечо B-B' по сравнению с родственным ИКП). Различие в последовательностях между двумя ИКП может быть связано с добавлением, делецией, усечением или точечной мутацией одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте реализации, один ИКП асимметричной пары ИКП может быть последовательностью ИКП ААВ дикого типа, а другой ИКП - модифицированным ИКП, как определено в данном документе (например, последовательностью ИКП не-дикого типа или синтетической). В другом варианте реализации ни один из ИКП асимметричной пары ИКП не является последовательностью ААВ дикого типа, и указанные два ИКП представляют собой модифицированные ИКП, которые имеют разные формы в геометрическом пространстве (т.е. разную общую геометрическую структуру). В некоторых вариантах реализации один мод-ИКП асимметричной пары ИКП может иметь короткое C-C'-плечо, а другой ИКП может иметь другую модификацию (например, одно плечо или короткое B-B'-плечо и т.д.), так что они имеют различную трехмерную пространственную организацию по сравнению с родственным асимметричным мод-ИКП.

[00108] Используемый в данном документе термин «симметричные ИКП» относится к паре ИКП в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые мутированы или модифицированы относительно последовательностей депендовирусных ИКП дикого типа и являются обратными комплементами по всей их длине. Ни один из ИКП не является последовательностью ИКП ААВ2 дикого типа (т.е. они представляют собой модифицированные ИКП, также называемые мутантными ИКП), и может отличаться от последовательности ИКП дикого типа вследствие добавления, делеции, замены, усечения или точечной мутации нуклеотидов. Для удобства, в данном документе ИКП, расположенный со стороны 5' от (выше) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ИКП" или "левым ИКП", а ИКП, расположенный со стороны 3’ от (ниже) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3’-ИКП» или «правый ИКП».

[00109] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные модифицированные ИКП» или «по существу симметричная пара мод-ИКП» относится к паре модифицированных ИКП в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба имеют обратно комплементарные последовательности по всей своей длине. Например, модифицированный ИКП может считаться по существу симметричным, даже имея некоторые нуклеотидные последовательности, отклоняющиеся от обратно комплементарной последовательности, если указанные изменения не влияют на свойства и общую форму. В качестве одного неограничивающего примера, последовательность, имеющая степень идентичности последовательностей по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию со своим родственным модифицированным ИКП, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. Иными словами, по существу симметричная пара модифицированных ИКП имеет одинаковую организацию петель A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве. В некоторых вариантах реализации ИКП из пары мод-ИКП могут иметь разные обратно комплементарные нуклеотидные последовательности, но все же имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию, т.е. оба ИКП имеют мутации, которые приводят к одинаковой общей трехмерной форме. Например, один ИКП (например, 5'-ИКП) в паре мод-ИКП может принадлежать к одному серотипу, а другой ИКП (например, 3'-ИКП) - к другому серотипу, однако оба могут иметь одинаковые соответствующие мутации (например, если 5'-ИКП имеет делецию в области C, то родственный модифицированный 3'-ИКП другого серотипа имеет делецию в соответствующем положении в области C'), так что указанная модифицированная пара ИКП имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. В таких вариантах реализации каждый ИКП в паре модифицированных ИКП может принадлежать к разным серотипам (например, ААВ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), таким как комбинация ААВ2 и ААВ6, причем модификация одного ИКП отображается в соответствующем положении родственного ИКП другого серотипа. В одном варианте реализации пара по существу симметричных модифицированных ИКП относится к паре модифицированных ИКП (мод-ИКП), при условии, что разница в нуклеотидных последовательностях между ИКП не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. В качестве неограничивающего примера, мод-ИКП, имеющий степень идентичности последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с каноническим мод-ИКП, определенную стандартными средствами, хорошо известными специалистам в данной области техники, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)) или BLASTN, с настройками по умолчанию, также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара мод-ИКП имеет одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ИКП в по существу симметричной паре мод-ИКП имеет делецию плеча C-C', то родственный мод-ИКП имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных A и B-B'-петель с одинаковой формой в геометрическом пространстве со своим родственным мод-ИКП.

[00110] Термин «фланкирование» касается относительного положения одной последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к другой последовательности нуклеиновой кислоты. В общем, в последовательности ABC A и C фланкируют B. То же самое верно для расположения AxBxC. Таким образом, фланкирующая последовательность предшествует или следует за фланкируемой последовательностью, но не обязательно должна быть смежной с, или непосредственно прилегающей к, фланкируемой последовательности. В одном варианте реализации термин фланкирование относится к концевым повторам на каждом конце линейного дуплексного зкДНК-вектора.

[00111] Используемый в данном документе термин «геном зкДНК» относится к экспрессионной кассете, которая дополнительно включает по меньшей мере одну область инвертированного концевого повтора. Геном зкДНК может дополнительно содержать одну или несколько спейсерных областей. В некоторых вариантах реализации геном зкДНК включен в виде межмолекулярного дуплексного полинуклеотида ДНК в плазмиду или вирусный геном.

[00112] Используемый в данном документе термин «спейсерная область зкДНК» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в указанном зкДНК-векторе или геноме зкДНК. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК удерживают два функциональных элемента на требуемом расстоянии для оптимальной функциональности. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК обеспечивают или увеличивают генетическую стабильность генома зкДНК в составе, например, плазмиды или бакуловируса. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК облегчают подготовленную генетическую манипуляцию с геномом зкДНК, обеспечивая удобное расположение сайтов клонирования и т.п.Например, в некоторых аспектах олигонуклеотидный «полилинкер», содержащий несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированный так, чтобы он не содержал известных сайтов связывания белка (например, транскрипционного фактора), может быть размещен в геноме зкДНК для разделения цис-действующих факторов, например, со вставками 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.п., между сайтом концевого разрешения и расположенным в направлении 5’ регуляторным элементом транскрипции. Аналогично, спейсер может быть включен между сигнальной последовательностью полиаденилирования и 3'-концевым сайтом разрешения.

[00113] Используемые в данном документе термины «Rep-связывающий сайт», «элемент связывания Rep», «RBE» и «RBS» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту связывания белка Rep (например, Rep 78 ААВ или Rep 68 ААВ), который после связывания белка Rep позволяет белку Rep проявлять свою сайт-специфическую эндонуклеазную активность в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и обратно комплементарная ей последовательность вместе образуют один RBS. Последовательности RBS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), представляющую собой последовательность RBS, идентифицированную в ААВ2. Любая известная последовательность RBS может быть использована в вариантах реализации данного изобретения, включая другие известные последовательности RBS ААВ и другие известные природные или синтетические последовательности RBS. Без ограничения какой-либо теорией, считается, что нуклеазный домен белка Rep связывается с дуплексной нуклеотидной последовательностью GCTC и, соответственно, происходит прямое связывание и стабильная сборка двух известных белков Rep ААВ на дуплексном олигонуклеотиде 5’-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3’ (SEQ ID NO: 60). Кроме того, растворимые агрегированные конформеры (т.е. неопределенное число взаимосвязанных белков Rep) диссоциируют и связываются с олигонуклеотидами, которые содержат сайты связывания Rep.Каждый белок Rep взаимодействует как с азотистыми основаниями, так и с фосфодиэфирным остовом каждой цепи. Взаимодействия с азотистыми основаниями обеспечивают специфичность в отношении последовательности, тогда как взаимодействия с фосфодиэфирным остовом являются неспецифическими или менее специфическими в отношении последовательности и стабилизируют комплекс белок-ДНК.

[00114] Используемые в данном документе термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» используются взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином, с образованием 3'-ОН, который служит субстратом для удлинения ДНК с помощью клеточной ДНК-полимеразы, например, ДНК-полимеразой дельта или ДНК-полимеразой эпсилон. Альтернативно, комплекс Rep-тимидин может принимать участие в скоординированной реакции лигирования. В некоторых вариантах реализации TRS охватывает, как минимум, неспаренное тимидиновое основание. В некоторых вариантах реализации эффективность никирования TRS можно контролировать, по меньшей мере отчасти, посредством расстояния между ним и RBS в пределах одной молекулы. Когда акцепторный субстрат является комплементарным ИКП, то образующийся продукт представляет собой внутримолекулярный дуплекс.Последовательности TRS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 61), представляющую собой гексануклеотидную последовательность, идентифицированную в ААВ2. Любая известная последовательность TRS может быть использована в вариантах реализации данного изобретения, включая другие известные последовательности TRS ААВ и другие известные природные или синтетические последовательности TRS, такие как AGTT (SEQ ID NO: 62), GGTTGG (SEQ ID NO: 63), AGTTGG (SEQ ID NO: 64), AGTTGA (SEQ ID NO: 65) и другие мотивы, такие как RRTTRR (SEQ ID NO: 66).

[00115] Используемый в данном документе термин «зкДНК-плазмида» относится к плазмиде, которая содержит геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса.

[00116] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, включающему геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса, способному размножаться в E.coli в виде плазмиды и, соответственно, выполнять роль челночного вектора для бакуловируса.

[00117] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса в составе генома бакуловируса.

[00118] Используемые в данном документе термины «инфицированная зкДНК-бакуловирусом клетка насекомого» и «зкДНК-BIIC» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке-хозяину из беспозвоночного животного (включая, без ограничений, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированной зкДНК-бакуловирусом.

[00119] Используемый в данном документе термин «ДНК-вектор с замкнутыми концами» относится к бескапсидному ДНК-вектору с по меньшей мере одним ковалентно замкнутым концом, причем по меньшей мере часть вектора имеет структуру внутримолекулярного дуплекса.

[00120] Используемые в данном документе термины «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо и относятся к ДНК-вектору с замкнутыми концами, содержащему по меньшей мере один концевой палиндром. В некоторых вариантах реализации зкДНК содержит два ковалентно замкнутых конца.

[00121] Как определено в данном документе, «репортеры» относятся к белкам, которые могут использоваться для обеспечения детектируемых показаний. Репортеры обычно продуцируют измеримый сигнал, например, флуоресцентный, цветовой или люминесцентный. Кодирующие последовательности репортерных белков кодируют белки, присутствие которых в клетке или организме легко поддается наблюдению. Например, флуоресцентные белки вызывают флуоресценцию клетки при возбуждении светом с определенной длиной волны, люциферазы приводят к катализу клеткой реакции, которая генерирует свет, а ферменты, такие как β-галактозидаза, превращают субстрат в окрашенный продукт.Типичные примеры репортерных полипептидов, пригодных для экспериментальных или диагностических целей, включают, без ограничений, β-лактамазу, β-галактозидазу (LacZ), щелочную фосфатазу (ЩФ), тимидинкиназу (TK), зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) и другие флуоресцентные белки, хлорамфениколацетилтрансферазу (ХАТ), люциферазу и другие, хорошо известные в данной области техники.

[00122] Используемый в данном документе термин «эффекторный белок» относится к полипептиду, который обеспечивает детектируемые показания, либо, например, как репортерный полипептид, либо, более предпочтительно, как полипептид, убивающий клетку, например, токсин, или агент, придающий клетке чувствительность к киллингу определенным агентом или при отсутствии определенного агента. Эффекторные белки включают любой белок или пептид, которые прямо нацелены на ДНК и/или РНК клетки-хозяина или повреждают их. Например, эффекторные белки могут включать, без ограничения перечисленным, рестрикционную эндонуклеазу, которая нацелена на последовательность ДНК клетки-хозяина (геномный или внехромосомный элемент), протеазу, расщепляющую полипептид-мишень, необходимый для выживания клетки, ингибитор ДНК-гиразы и токсин рибонуклеазного типа. В некоторых вариантах реализации экспрессия эффекторного белка, контролируемая синтетическим биологическим контуром, как описано в данном документе, может принимать участие в качестве фактора в другом синтетическом биологическом контуре, с расширением таким образом диапазона и сложности отклика системы биологического контура.

[00123] Регуляторы транскрипции относятся к активаторам и репрессорам транскрипции, которые либо активируют, либо подавляют транскрипцию гена, представляющего интерес.Промоторы представляют собой области нуклеиновой кислоты, которые инициируют транскрипцию конкретного гена. Активаторы транскрипции обычно связываются поблизости от транскрипционных промоторов и рекрутируют РНК-полимеразу, чтобы прямо инициировать транскрипцию. Репрессоры связываются с промоторами транскрипции и стерически препятствуют инициации транскрипции РНК-полимеразой. Другие регуляторы транскрипции могут служить либо активатором, либо репрессором в зависимости от места их связывания и условий в клетке и окружающей среде. Неограничивающие примеры классов регуляторов транскрипции включают, без ограничений, гомеодоменные белки, белки с мотивом «цинковый палец», белки с мотивом «крылатая спираль» (forkhead-белки) и белки с мотивом «лейциновая застежка».

[00124] При использовании в данном документе, «белок-репрессор» или «белок-индуктор» представляет собой белок, который связывается с элементом регуляторной последовательности и подавляет или активирует, соответственно, транскрипцию последовательностей, функционально связанных с указанным элементом регуляторной последовательности. Предпочтительные белки-репрессоры и индукторы, как описано в данном документе, чувствительны к присутствию или отсутствию по меньшей мере одного вводимого агента или входного воздействия окружающей среды. Предпочтительные белки, как описано в данном документе, являются модульными по форме и содержат, например, отделяемые ДНК-связывающие и связывающие вводимые агенты, или откликающиеся на них элементы или домены.

[00125] Используемый в данном документе термин «носитель» включает любые и все возможные растворители, дисперсионные среды, основы, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п.Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Вспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в указанные композиции. Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не приводят к токсической, аллергической или аналогичной нежелательной реакции при введении хозяину.

[00126] Используемый в данном документе термин «домен, реагирующий на вводимый агент», представляет собой домен транскрипционного фактора, который связывает или иначе отвечает на условие или вводимый агент, обеспечивая реакцию присоединенного к нему ДНК-связывающего слитого домена на наличие указанного условия или входного воздействия. В одном варианте реализации наличие условия или входного воздействия приводит к конформационному изменению в чувствительном домене вводимого агента или в слитом с ним белке, что модифицирует транскрипционно-модулирующую активность фактора транскрипции.

[00127] Термин «in vivo» относится к анализам или процессам, которые происходят в организме или внутри организма, такого как многоклеточное животное. В некоторых аспектах, описанных в данном документе, способ или применение могут быть названы происходящими «in vivo» при использовании одноклеточного организма, такого как бактерия. Термин «ex vivo» относится к способам и применениям, которые осуществляют с использованием живой клетки с интактной мембраной, находящейся вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантатов, культивированных клеток, в том числе первичных клеток и клеточных линий, трансформированных клеточных линий, и извлеченных тканей или клеток, в том числе клеток крови и т.п.Термин «in vitro» относится к анализам и способам, не требующим присутствия клетки с интактной мембраной, например, проводимым на клеточных экстрактах, и может относиться к введению программируемого синтетического биологического контура в неклеточную систему, такую как среда, не содержащая клеток или клеточных систем, такая как клеточные экстракты.

[00128] Используемый в данном документе термин «промотор» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты путем направления транскрипции указанной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой гетерологичный целевой ген, кодирующий белок, или РНК. Промоторы могут быть конститутивными, индуцибельными, репрессируемыми, тканеспецифическими, или любой их комбинацией. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, посредством которой контролируются инициация и уровень транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать генетические элементы, в которых может происходить связывание регуляторных белков и молекул, таких как РНК-полимераза, и других транскрипционных факторов. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, промотор может управлять экспрессией транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию самого промотора, или другого промотора, используемого в другом модульном компоненте синтетических биологических контуров, описанных в данном документе. В последовательности промотора будет присутствовать сайт инициации транскрипции, а также связывающие белки домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, однако не всегда, содержат «TATA»-боксы и «CAT»-боксы. Для управления экспрессией трансгенов в зкДНК-векторах, описанных в данном документе, могут применяться различные промоторы, в том числе индуцибельные промоторы. Промоторная последовательность может быть ограничена на своем 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простираться в восходящем направлении (в направлении к 5'-концу), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициирования транскрипции на уровнях, детектируемых выше фона.

[00129] Используемый в данном документе термин «энхансер» относится к цис-действующей регуляторной последовательности (например, 50-1500 пар оснований), которая связывает один или несколько белков (например, белков-активаторов или транскрипционный фактор) для повышения транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии до 1 ООО 000 пар оснований выше сайта начала гена или ниже сайта начала гена, который они регулируют.Энхансер может быть расположен в интронной области или в экзонной области не связанного с ним гена.

[00130] Можно сказать, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует.Выражения «функционально связанный», «функционально расположенный», «с функциональной связью», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» указывают, что промотор находится в корректном функциональном положении и/или ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности. «Инвертированный промотор» в данном документе относится к промотору, последовательность нуклеиновой кислоты которого имеет обратную ориентацию, так чтобы кодирующая цепь становилась некодирующей, и наоборот.Последовательности инвертированных промоторов могут применяться в различных вариантах реализации для регуляции состояния переключателя. Кроме того, в различных вариантах реализации промотор может применяться в сочетании с энхансером.

[00131] Промотор может быть естественным образом ассоциирован с геном или последовательностью, что может быть достигнуто путем выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном данного гена или последовательности. Такой промотор может быть назван «эндогенным». Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации энхансер может быть естественным образом ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты и расположен либо после, либо перед указанной последовательностью.

[00132] В некоторых вариантах реализации кодирующий сегмент нуклеиновой кислоты помещен под контроль «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора», причем оба термина относятся к промотору, который в норме не ассоциирован с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан в его естественных условиях среды. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится к энхансеру, который в норме не связан с данной последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «встречающимися в природе», т.е. содержат различные элементы разных транскрипционных регуляторных областей и/или изменяющие экспрессию мутации, введенные с применением способов генетического конструирования, известных в данной области техники. Наряду с получением последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансером синтетическим путем, промоторные последовательности могут быть получены с использованием рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновых кислот, в том числе ПЦР, применительно к синтетическим биологическим контурам и модулям, раскрытым в данном документе (см., например, патент США №4683202, патент США №5928906, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусматривается также возможность применения контрольных последовательностей, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.

[00133] Как описано в данном документе, «индуцибельный промотор» представляет собой промотор, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии, под влиянием, или при контакте с, индуктором или индуцирующим агентом. «Индуктор» или «индуцирующий агент», как определено в данном документе, может быть эндогенным или экзогенным в норме соединением или белком, которые вводят таким образом, чтобы обеспечить их активность по индуцированию транскрипционной активности индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуктор или индуцирующий агент, т.е. химическое вещество, соединение или белок, может сам быть получен в результате транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. индуктор может представлять собой белок-индуктор, экспрессируемый другим компонентом или модулем), который сам может находиться под контролем индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцибельных промоторов включают, без ограничений, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса и длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие реагирующие на стероиды промоторы, реагирующие на рапамицин промоторы и т.п.

[00134] Термины «регуляторные последовательности ДНК», «контрольные элементы» и «регуляторные элементы», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к контрольным последовательностям транскрипции и трансляции, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют транскрипцию некодирующей последовательности (например, нацеливающей на ДНК РНК) или кодирующей последовательности (например, сайт-направленного модифицирующего полипептида или полипептида Cas9/Csn1) и/или регулируют трансляцию кодируемого полипептида.

[00135] Термин «функционально связанный» относится к расположению в непосредственной близости, при котором описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать по назначению. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. «Экспрессионная кассета» включает в себя гетерологичную последовательность ДНК, которая функционально связана с промотором или другой регуляторной последовательностью, достаточными для направления транскрипции трансгена в зкДНК-векторе. Подходящие промоторы включают, например, тканеспецифические промоторы. Промоторы могут также иметь происхождение от ААВ.

[00136] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или животному, лечение которого, включая профилактическое лечение, проводится с помощью зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением. Обычно указанное животное представляет собой позвоночное животное, такое как, без ограничений, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают, без ограничений, шимпанзе, яванских макак, коат и макак, например, макак-резусов. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, без ограничений, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, виды кошачьих, например, домашнюю кошку, виды собачьих, например, собак, лис, волков, виды птиц, например, кур, эму, страусов, и рыб, например, форель, сома и лосося. В определенных вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, указанным субъектом является млекопитающее, например, примат или человек. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъект может представлять собой младенца или ребенка. В некоторых вариантах реализации указанный субъект может представлять собой новорожденного или нерожденного субъекта, например, субъекта in utero. Предпочтительно, субъект является млекопитающим. Указанное млекопитающее может быть человеком, не являющимся человеком приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, но не ограничивается этими примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут быть выгодно использованы в качестве субъектов, которые представляют животные модели заболеваний и расстройств. Кроме того, способы и композиции, описанные в данном документе, можно использовать для одомашненных животных и/или домашних животных. Человек может быть любого возраста, пола, принадлежать к любой расе или этнической группе, например, может быть европеоидом (белым), азиатом, африканцем, черным, афроамериканцем, афроевропейцем, латиноамериканцем, представителем ближневосточного этноса и т.д. В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой пациента или другого субъекта в клинических условиях. В некоторых вариантах реализации, указанный субъект уже проходит курс лечения. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион, плод, новорожденного, младенца, ребенка, подростка или взрослую особь. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой плод человека, новорожденного, младенца, ребенка, подростка или взрослого человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион животного или эмбрион, не принадлежащий человеку, или эмбрион примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион человека.

[00137] Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» включает любой тип клеток, которые являются восприимчивыми к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п., с использованием конструкта нуклеиновой кислоты или экспрессионного зкДНК-вектора по данному изобретению. В качестве неограничивающих примеров клетка-хозяин может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, клетки CD34⁺), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из ряда иммортализованных клеточных линий (например, клетки HepG2). Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой клетку in situ или in vivo в ткани, органе или организме.

[00138] Термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, отличной от его природного источника. Термин «экзогенный» при использовании в данном документе может относиться к нуклеиновой кислоте (например, нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они обычно не обнаруживаются, причем введение нуклеиновой кислоты или полипептида в такую клетку или организм является желательным. Альтернативно, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они присутствуют в относительно небольших количествах, причем увеличение количества нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке или организме является желательным, например, для создания эктопической экспрессии или уровней. В отличие от этого, термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для биологической системы или клетки.

[00139] Термин «идентичность последовательности» относится к сродству между двумя нуклеотидными последовательностями. Для целей данного изобретения степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры: штраф за открытие пробела 10, штраф за расширение пробела 0,5 и матрица замещения EDNAFULL (версия EMBOSS NCBI NUC4.4). Выходной параметр Нидла, обозначенный как «самая длинная идентичность» (полученный при использовании параметра -nobrief), применяется в качестве процентной идентичности и рассчитывается следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды х 100) / (Длина выравнивания - Общее число пробелов в выравнивании). Длина выравнивания предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 50 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100 нуклеотидов.

[00140] Термин «гомология» или «гомологичный», используемый в данном документе, определяется как процент нуклеотидных остатков, которые идентичны нуклеотидным остаткам в соответствующей последовательности на хромосоме-мишени после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента гомологии нуклеотидных последовательностей может осуществляться различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как прикладные программы BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность ДНК), например, гомологичное плечо, считается «гомологичной», когда последовательность является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичной соответствующей нативной или неотредактированной последовательности нуклеиновой кислоты (например, геномной последовательности) клетки-хозяина.

[00141] Термин «гетерологичный», используемый в данном документе, означает нуклеотидную или полипептидную последовательность, которая не обнаружена в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с природной последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, методами генной инженерии) для получения химерной нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный полипептид. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с вариантом полипептида (например, с помощью генной инженерии) для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант слитого полипептида.

[00142] «Вектор» или «экспрессионный вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, т.е. «вставка», чтобы вызвать репликацию присоединенного сегмента в клетке. Вектор может представлять собой конструкт нуклеиновой кислоты, предназначенный для доставки в клетку-хозяина или для переноса между различными клетками-хозяевами. В используемом в данном документе значении, вектор может быть вирусным или невирусным по происхождению и/или в конечной форме, однако для целей данного изобретения «вектор» обычно относится к зкДНК-вектору, как этот термин используется в данном документе. Термин «вектор» охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации, когда он связан с надлежащими контрольными элементами, и который может переносить генные последовательности в клетки. В некоторых вариантах реализации вектор может представлять собой экспрессионный вектор или рекомбинантный вектор.

[00143] Используемый в данном документе термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в векторе. Экспрессируемые последовательности часто, но не обязательно, будут гетерологичными по отношению к клетке. Экспрессионный вектор может содержать дополнительные элементы, например, экспрессионный вектор может иметь две системы репликации, что позволяет поддерживать его в двух организмах, например, в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Термин «экспрессия» относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков и, в соответствующих случаях, в секретировании белков, включая, где это применимо, без ограничений, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и укладку белка, модификацию и процессинг.«Продукты экспрессии» включают РНК, транскрибируемую с гена, и полипептиды, полученные путем трансляции мРНК, транскрибированной с гена. Термин «ген» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (ДНК) в РНК in vitro или in vivo, когда она функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями. Ген может включать или не включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, например, 5'-нетранслируемые (5'-UTR) или «лидерные» последовательности и 3'-UTR или «трейлерные" последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами).

[00144] Под «рекомбинантным вектором» подразумевается вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, или «трансген», который способен к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в данном документе, в некоторых вариантах реализации можно комбинировать с другими подходящими композициями и терапиями. В некоторых вариантах реализации вектор является эписомальным. Использование подходящего эписомального вектора обеспечивает средства поддержания представляющего интерес нуклеотида у субъекта в многокопийной экстрахромосомной ДНК, тем самым устраняя потенциальные эффекты интеграции хромосом.

[00145] Используемое в данном документе выражение «генетическое заболевание» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или косвенно, вызванному одной или несколькими аномалиями в геноме, особенно, к состоянию, присутствующему с момента рождения. Аномалия может быть мутацией, вставкой или делецией. Аномалия может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Генетическое заболевание может представлять собой, без ограничений, МДД (мышечную дистрофию Дюшенна), гемофилию, муковисцидоз, хорею Гентингтона, семейную гиперхолестеринемию (дефект рецептора ЛПНП), гепатобластому, болезнь Вильсона, врожденную печеночную порфирию, наследственные нарушения метаболизма печени, синдром Леша-Нихана, серповидноклеточную анемию, талассемии, пигментную ксеродерму, анемию Фанкони, пигментный ретинит, атаксию-телеангиэктазию, синдром Блума, ретинобластому и болезнь Тея-Сакса.

[00146] Используемый в данном документе термин «биомаркер» означает любую анализируемую характеристику или композицию, которые можно использовать для идентификации состояния (например, заболевания) или статуса состояния (например, стадии заболевания) у субъекта или в образце. Биомаркером в некоторых примерах, раскрытых в данном документе, может быть ген, характеристики экспрессии которого можно использовать для идентификации состояния или статуса состояния у субъекта или в образце. В других примерах биомаркер может представлять собой продукт гена. В некоторых вариантах реализации термин «биомаркер» относится к полипептиду, экспрессируемому эндогенно у индивидуума или обнаруженному или секвестрированному в биологическом образце от индивидуума.

[00147] Под «продуктом гена» подразумевается транскрипт (например, мРНК), нуклеиновая кислота (например, микроРНК) или белок. Таким образом, в данном документе раскрыты биомаркеры, присутствие, отсутствие или относительное количество которых можно использовать для идентификации состояния или статуса состояния у субъекта или в образце. В одном конкретном примере биомаркером может быть генный продукт, присутствие или отсутствие которого у субъекта является характерным для субъекта, имеющего или не имеющего определенное нейродегенеративное заболевание, имеющего определенный риск развития заболевания (например, нейродегенеративного заболевания), или находящегося на определенной стадии заболевания. В еще одном примере биомаркером может быть генный продукт, повышение или снижение которого указывает на определенное болезненное состояние, особый риск развития заболевания или конкретную стадию заболевания. В другом примере биомаркер может представлять собой группу различных генных продуктов, наличие или отсутствие которых указывает на то, что субъект имеет или не имеет определенное заболевание, имеет определенный риск развития заболевания, или находится на определенной стадии заболевания. В дополнительном примере биомаркером может быть группа генных продуктов, паттерн повышения или снижения экспрессии которых характеризует определенное заболевание или его отсутствие. Кроме того, биомаркером может быть генный продукт или группа генных продуктов, паттерн экспрессии которых характерен для наличия или отсутствия заболевания, или определенного прогноза, или исхода заболевания. Используемый в данном документе биомаркер может быть заменителем других клинических испытаний. Биомаркеры, идентифицированные в данном документе, могут быть измерены для определения уровней, экспрессии, активности, или для выявления вариантов. В значении, используемом во всем тексте данного документа при обсуждении детектирования уровней экспрессии или активности, подразумевается, что это может отражать варианты данного биомаркера. Варианты включают варианты аминокислот или нуклеиновых кислот, или посттрансляционно модифицированные варианты.

[00148] Используемый в данном документе термин «биологический образец» относится к клетке или популяции клеток, или некоторому количеству ткани или жидкости от субъекта. Чаще всего образец берут у субъекта, но термин «биологический образец» может также относиться к клеткам или ткани, анализируемым in vivo, т.е. без извлечения из субъекта. Часто «биологический образец» будет содержать клетки субъекта, но термин может также относиться к неклеточному биологическому материалу, такому как неклеточные фракции крови, слюна или моча, которые можно использовать для измерения экспрессии генов или уровней экспрессии белка. Биологические образцы включают, без ограничений, биопсию тканей, соскобы (например, буккальные соскобы), цельную кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну, клеточную культуру или спинномозговую жидкость. Биологические образцы также включают биопсии тканей, клеточную культуру. Биологический образец или образец ткани может относиться к образцу ткани или жидкости, взятому у индивидуума, включая, без ограничений, кровь, плазму, сыворотку, биопсию опухоли, мочу, стул, мокроту, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, аспираты сосков, лимфатическую жидкость, внешние участки кожи, дыхательные пути, кишечный тракт и мочеполовые пути, слезы, слюну, грудное молоко, клетки (включая, без ограничений, клетки крови), опухоли, органы, а также образцы компонентов in vitro клеточных культур. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой материал, взятый из резекции, бронхоскопической биопсии или толстоигольной биопсии первичной или метастатической опухоли, или клеточный блок из плевральной жидкости. Кроме того, используются образцы тонкоигольных аспиратов. Образцы могут быть либо парафинированными, либо замороженными тканями. Образец может быть получен путем взятия образца клеток у субъекта, но также может быть приготовлен с использованием ранее выделенных клеток (например, выделенных другим человеком), или путем проведения анализа уровня экспрессии трансгена из зкДНК-вектора in vivo. Биологический образец также относится к образцу ткани или жидкости, взятому у индивидуума, включая, без ограничений, кровь, плазму, сыворотку, биопсию опухоли, мочу, стул, мокроту, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, аспираты сосков, лимфатическую жидкость, внешние участки кожи, дыхательные пути, кишечный тракт и мочеполовые пути, слезы, слюну, грудное молоко, клетки (включая, без ограничений, клетки крови), опухоли, органы, а также образцы компонентов in vitro клеточных культур. В некоторых вариантах реализации биологические образцы могут быть приготовлены, например, биологические образцы могут быть свежими, фиксированными, замороженными или залитыми в парафин.

[00149] Используемый в данном документе термин «образец крови» или «кровь» включает, без ограничений, цельную кровь, сыворотку или плазму. В некоторых вариантах реализации образец цельной крови дополнительно перерабатывают в образцы сыворотки или плазмы. Этот термин также включает смесь вышеуказанных образцов.

[00150] Используемый в данном документе термин «ингибитор» относится к любому агенту или объекту, который приводит к ингибированию биологической активности белков. «Снижение» или «ингибирование», при использовании в контексте уровня активности гена, относится к понижению уровня белка или нуклеиновой кислоты, или биологической активности в клетке, клеточном экстракте или клеточном супернатанте. Например, такое ингибирование может быть обусловлено снижением связывания полипептида с его эндогенным лигандом, или неконкурентным связыванием ингибитора с полипептидом для снижения каталитической активности или сродства к лиганду-мишени и т.д. или, альтернативно, снижением стабильности РНК, транскрипции или трансляции, усилением деградации белка, или РНК-интерференцией. Предпочтительно, снижение составляет по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, или даже по меньшей мере примерно 90%, от уровня экспрессии или активности в условиях контрольного эксперимента. Используемый в данном документе термин «ингибирование», относящийся к ингибированию активности белка топоизомеразы I или его вариантов, не обязательно означает полное ингибирование экспрессии и/или активности. Скорее, экспрессия или активность белка, полипептида или полинуклеотида ингибируется в определенной степени и/или в течение времени, достаточного для получения желаемого эффекта.

[00151] Термины «более низкий», «уменьшенный», «уменьшение» или «понижение», или «ингибирование» используются в данном документе, как правило, для обозначения снижения на статистически значимую величину. Однако, во избежание сомнений, «более низкий», «уменьшенный», «уменьшение» или «понижение», или «ингибирование» означают снижение на по меньшей мере 10% по сравнению с референсным уровнем, например, снижение на по меньшей мере примерно 20%, или по меньшей мере примерно 30%, или по меньшей мере примерно 40%, или по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90%, или снижение на величину до 100% включительно (т.е. до уровня отсутствия по сравнению с референсным образцом), или любое снижение в диапазоне 10-100% по сравнению с референсным уровнем.

[00152] Термины «увеличенный», «увеличивать» или «усиливать», или «более высокий», используются в данном документе для обозначения повышения на статически значимую величину; во избежание каких-либо сомнений термины «увеличенный», «увеличивать» или «усиливать», или «более высокий» означают повышение на по меньшей мере 10% по сравнению с референсным уровнем, например, повышение на по меньшей мере примерно 20%, или по меньшей мере примерно 30%, или по меньшей мере примерно 40%, или по меньшей мере примерно 50%, или по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 90%, или повышение на величину до 100% включительно, или любое повышение в диапазоне 10-100% по сравнению с референсным уровнем, или по меньшей мере примерно в 2 раза, или по меньшей мере примерно в 3 раза, или по меньшей мере примерно в 4 раза, или по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, или любое увеличение в диапазоне от 2-кратного до 10-кратного или больше по сравнению с референсным уровнем.

[00153] Под «повышением» экспрессии или активности гена или белка подразумевается положительное изменение уровня или активности белка или полипептида или нуклеиновой кислоты в клетке, клеточном экстракте или клеточном супернатанте. Например, такое повышение может быть связано с повышенной стабильностью, транскрипцией или трансляцией РНК, или пониженной деградацией белка. Предпочтительно, такое повышение составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 100%, по меньшей мере примерно 200% или даже примерно 500% или более, по сравнению с уровнем экспрессии или активности в условиях контрольного эксперимента.

[00154] Используемый в данном документе термин «содержащий» или «содержит» используется в отношении композиций, способов и их соответствующих компонентов, которые важны для способа или композиции, но допускают включение неуточненных элементов, будь то существенных или нет.

[00155] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Этот термин допускает присутствие элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики такого варианта реализации. Использование слова «содержащий» указывает на включение, а не на ограничение.

[00156] Термин «состоящий из» относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, как описано в данном документе, которые исключают любой элемент, не указанный в этом описании варианта реализации.

[00157] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Этот термин допускает наличие дополнительных элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики этого варианта реализации изобретения.

[00158] Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, в том числе сопровождаемые определением «указанный», включают ссылки на формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или несколько способов и/или этапов описанного в данном документе типа и/или таких, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного изобретения и так далее. Аналогично, предполагается, что слово «или» включает «и», если из контекста явным образом не следует иное. Хотя при практической реализации или тестировании данного изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Выражение «например» используется в данном документе для описания неограничивающего примера. Так, сокращение «напр.» является синонимом термина «например».

[00159] За исключением рабочих примеров или иных указанных случаев, все числа, отражающие количества ингредиентов или условия реакции согласно данному изобретению, во всех случаях должны рассматриваться как модифицированные термином «приблизительно». Термин «приблизительно» применительно к процентным величинам может означать±1%. Данное изобретение дополнительно более подробно объяснено в приведенных ниже примерах, однако объем данного изобретения ими не ограничен.

[00160] Группы альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, раскрытых в данном документе, не должны рассматриваться как ограничения. На каждый член группы можно ссылаться и заявлять его индивидуально или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, представленными в данном документе. Один или несколько членов группы могут быть включены или исключены из группы по соображениям удобства и/или патентоспособности. При любом таком включении или исключении в данном документе считается, что описание изобретения содержит группу, измененную таким образом, чтобы она удовлетворяла условию письменного описания всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.

[00161] В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, изобретение, описанное в данном документе, не касается процесса клонирования людей, процессов модификации генетической идентичности зародышевой линии человека, использования эмбрионов человека в промышленных или коммерческих целях, или процессов модификации генетической идентичности животных, которые могут причинить им страдания без какой-либо существенной медицинской выгоды для человека или животного, а также животных, полученных в результате таких процессов.

[00162] Определения других терминов приведены в данном документе в описании различных аспектов изобретения.

[00163] Все патенты и другие публикации, включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и патентные заявки, находящиеся на рассмотрении одновременно с данной, упомянутые в данной заявке, явным образом включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с технологией, описанной в данном документе. Эти публикации представлены исключительно по причине их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ничто в этом отношении не должно истолковываться как признание того, что авторы изобретения не обладают правами на более раннее изобретение по отношению к такому раскрытию в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все утверждения, касающиеся дат, или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются допущением каким-либо образом признания правильности дат или содержания этих документов.

[00164] Описание вариантов реализации изобретения не должно рассматриваться как исчерпывающее или ограничивающее изобретение точной раскрытой формой. Хотя в данном документе описаны в иллюстративных целях конкретные варианты реализации и примеры раскрытия, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема раскрытия, как будет понятно специалистам в соответствующей области техники. Например, хотя стадии или функции способа представлены в указанном порядке, в альтернативных вариантах реализации функции могут выполняться в другом порядке, или функции могут выполняться по существу одновременно. Принципиальные положения изобретения, предоставленные в данном документе, могут быть применены к другим процедурам или методам в зависимости от ситуации. Различные варианты реализации, описанные в данном документе, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов реализации. Аспекты раскрытия могут быть модифицированы, при необходимости, для использования составов, функций и концепций вышеупомянутых ссылок и применения для обеспечения дополнительных вариантов реализации изобретения. Кроме того, из соображений биологической функциональной эквивалентности могут быть сделаны некоторые изменения в структуре белка, не влияющие на биологическое или химическое действие в качественном или количественном отношении. Эти и другие изменения могут быть выполнены в раскрытии в свете подробного описания. Все такие модификации рассматриваются как включенные в объем прилагаемой формулы изобретения.

[00165] Конкретные элементы любого из вышеприведенных вариантов реализации могут быть объединены или заменены элементами других вариантов реализации. Кроме того, хотя преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации изобретения, были описаны в контексте этих вариантов реализации, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и не все варианты реализации должны обязательно демонстрировать такие преимущества, чтобы попадать в объем раскрытия.

[00166] Описанная в данном документе технология дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не следует истолковывать как дополнительные ограничения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в данном документе, и потому допускает варианты. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

I. Способ контролируемой экспрессии трансгена с использованием зкДНК-вектора

[00167] В данном документе описаны способы введения зкДНК-векторов in vivo или in vitro, которые обеспечивают возможность либо (i) устойчивой экспрессии уровня трансгена в течение предварительно определенного периода времени (т.е. поддержание уровней экспрессии трансгена), либо (ii) повышения уровня экспрессии трансгена зависимым от дозы образом, причем указанный способ включает по меньшей мере одно (например, одно или несколько) последовательных введений (например, «бустерное» введение или «повторная доза») зкДНК-вектора.

[00168] Соответственно, технология, описанная в данном документе, относится к введению зкДНК-вектора in vivo, причем уровень экспрессии трансгена поддерживается на желаемом уровне или повышается с помощью одного или нескольких последующих введений (например, бустерного введения или повторной дозы). Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы обеспечивают возможность повышения уровня экспрессии трансгена по сравнению с предшествующим уровнем in vitro и in vivo. Повышение уровня трансгена может осуществляться для достижения желаемого уровня или его превышения, или для повышения уровня экспрессии до величины, лежащей в желаемом диапазоне значений экспрессии, посредством по меньшей мере одного повторного введения (также называемого в данном документе «повторной дозой») в любой момент времени после первоначального введения. В некоторых случаях желаемое повышение должно корректировать естественное снижение этих уровней таким образом, чтобы конечная доза обеспечивала возврат к ранее желаемому уровню, например, к устойчивому уровню дозы. Такое использование введения повторной дозы или повторных доз зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, для повышения уровня экспрессии трансгена, является возможным потому, что зкДНК-вектор не имеет капсида, вызывающего иммунный ответ хозяина (например, вектор не обладает иммуногенными свойствами) и, таким образом, обеспечивает значительные преимущества по сравнению с существующей технологией векторов ААВ, в которой повторные дозы невозможны из-за иммунных ответов или иммунитета к ААВ у хозяина от предшествующего воздействия ААВ или, например, от первоначального введения вектора ААВ. Таким образом, для достижения высокого уровня экспрессии с использованием векторов рААВ обычно требуется начальная высокая доза, а повторные дозы либо невозможны, либо неэффективны из-за проблем, связанных с иммунным ответом. В отличие от этого, одно или несколько повторных введений зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, могут осуществляться для повышения уровня экспрессии трансгена, например, для повышения уровня экспрессии до желаемого уровня экспрессии, или выше желаемого порогового уровня, или до значений в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии.

[00169] Соответственно, данное изобретение относится к способам и зкДНК-векторам для контролируемой экспрессии трансгена для любого из: (i) поддержания или стабилизации уровня экспрессии трансгена на желаемом уровне в течение предварительно определенного периода времени путем повторного введения зкДНК-вектора в один или несколько моментов времени, (ii) повышения уровня экспрессии трансгена путем повторного введения зкДНК-вектора в один или несколько моментов времени, или (iii) дозозависимой экспрессии трансгена в результате введения зкДНК-вектора зависимым от дозы образом (т.е. титруемой экспрессии трансгена). Как описано в данном документе, зкДНК-векторы являются уникальными по сравнению с другими вирусными векторами в том смысле, что зкДНК-вектор можно вводить субъекту многократно, например, на протяжении короткого периода времени (например, нескольких месяцев) или на протяжении длительного периода времени (например, в течение нескольких лет), обеспечивая контролируемую экспрессию трансгена, что позволяет адаптировать генную терапию к потребностям субъекта.

А. Повышенная или дозозависимая контролируемая экспрессия трансгена

(i) Контролируемая экспрессия трансгена: устойчивая экспрессия трансгена путем повторного введения зкДНК-вектора

[00170] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к использованию зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, в способе поддержания или стабилизации уровня экспрессии трансгена в клетке, включающем: (а) введение в клетку, в первый момент времени, первичной дозы зкДНК-вектора для достижения экспрессии трансгена, и (b) введение в клетку во второй момент времени дозы зкДНК-вектора для компенсации какого-либо снижения уровня экспрессии трансгена после введения зкДНК-вектора в первый момент времени.

[00171] Как показано на Фиг.6, уровень экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК, может достигаться и сохраняться (т.е. поддерживаться) в течение по меньшей мере 42 суток, или по меньшей мере 60 суток, или по меньшей мере 80 суток, и может быть увеличен до требуемого предварительно определенного уровня экспрессии с помощью введения повторной дозы во второй или последующие моменты времени после первоначального примирующего введения (например, в момент времени 0). Фиг.6 также демонстрирует, что уровень экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК, может достигаться и сохраняться в течение по меньшей мере 42 суток, или по меньшей мере 60 суток, и может быть увеличен дозозависимым образом с помощью введения повторной дозы, содержащей определенную количество зкДНК-вектора, во второй или последующие моменты времени после первоначального примирующего введения (например, в момент времени 0).

[00172] Экспрессия трансгена обычно происходит в течение примерно 7-20 суток после введения повторной дозы и поддерживает такой уровень экспрессии (т.е. является устойчивой экспрессией) трансгена после введения повторной дозы в течение по меньшей мере примерно 30 суток, или примерно 60 суток, или примерно 90 суток, или примерно 120 суток, или дольше 120 суток после введения второй дозы (т.е. повторной дозы, или введения во второй или последующие моменты времени).

[00173] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу лечения заболевания у субъекта или, альтернативно, к способу контролируемой экспрессии трансгена у субъекта, включающему: (а) введение субъекту, в первый момент времени, примирующей дозы композиции, содержащей зкДНК-вектор, как описано в данном документе, для достижения экспрессии трансгена на первом уровне (или в первом количестве), и (b) введение субъекту, во второй момент времени, дозы или количества зкДНК-вектора для поддержания уровня экспрессии трансгена на желаемом уровне устойчивой экспрессии, причем уровень устойчивой экспрессии представляет собой более высокий уровень экспрессии по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, который достигается при одном лишь начальном (т.е. примирующем) введении зкДНК-вектора в первый момент времени, тем самым проводя лечение заболевания у субъекта.

[00174] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть повторно введен (также называется в данном документе «повторной дозой») для поддержания желаемого уровня экспрессии трансгена, причем зкДНК-вектор содержит две последовательности ИКП (например, симметричную пару ИКП или асимметричную пару ИКП, как описано в данном документе), фланкирующие полинуклеотидную последовательность трансгена, функционально связанную с промотором.

[00175] В некоторых вариантах реализации использование зкДНК-вектора в способе поддержания уровня экспрессии трансгена в клетке обеспечивает экспрессию трансгена на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 42 суток. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 84 суток. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии в течение по меньшей мере 132 суток. Только в иллюстративных целях, зкДНК-вектор, продуцируемый способами, раскрытыми в Примере 1, может поддерживать уровень экспрессии трансгена в мышиной модели с использованием мышей CD-1 IGS на более высоком уровне с суток 7-28 после введения по сравнению с аналогичными ДНК-векторами с замкнутыми концами, полученными другими методами и испытанными на той же мышиной модели.

[00176] В некоторых вариантах реализации повышенная экспрессия трансгена не является дозозависимой или не полностью дозозависимой, но представляет собой устойчивую экспрессию, поскольку повышенная экспрессия трансгена обычно наблюдается в дни 7-20 после введения повторной дозы, и такой уровень повышенной экспрессии трансгена после повторной дозы сохраняется на протяжении по меньшей мере примерно 30 суток, или по меньшей мере примерно 60 суток, или по меньшей мере примерно 90 суток, или по меньшей мере примерно 120 суток, или дольше, чем примерно 120 суток, после введения второй дозы (т.е. повторной дозы или введения во второй или последующие моменты времени).

[00177] Конкретные зависимости доза-ответ для данного зкДНК-вектора или композиции, раскрытых в данном документе, могут быть определены с помощью средств, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая, например, описанные в Примере 6. зкДНК-вектор, описанный в данном документе, можно титровать путем введения дополнительных доз зкДНК-вектора в один или несколько моментов времени после первоначального введения, как будет необходимо для достижения желаемого уровня экспрессии. Можно проводить более одного, 2, 3, 4, 5 или 6 или более повторных введений для титрования уровней экспрессии трансгена до желаемого уровня или около него. Как правило, каждое повторное введение проводят приблизительно за 7 суток до начала наблюдаемого снижения экспрессии трансгена после предшествующего введения. По сути, повторные введения служат для титрования уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня или, иначе говоря, повторные введения позволяют поддерживать уровень экспрессии трансгена в желаемом диапазоне уровней экспрессии, например, в желаемом диапазоне, который является терапевтическим для лечения заболевания или расстройства, или в пределах терапевтического окна композиции.

[00178] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, можно использовать для коррекции уровня экспрессии трансгена in vivo, при которой уровень экспрессии повышается с предшествующего уровня (где предшествующий уровень представляет собой уровень после первичного примирования или введения повторной дозы) до желаемого уровня экспрессии, или в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии, или выше желаемого порогового уровня in vivo, причем повышенный уровень экспрессии поддерживается или сохраняется на протяжении примерно 30-60 суток, или в пределах примерно 40-70 суток, или в пределах примерно 50-80 суток, или в пределах примерно 60-90 суток, или в пределах примерно 70-100 суток, или в пределах примерно 80-110 суток, или в пределах примерно 40-120 суток, или дольше 120 суток после введения повторной дозы зкДНК-вектора.

[00179] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, используемый в описанных в данном документе способах, например, в способе поддержания экспрессии трансгена в клетке и/или лечения субъекта с заболеванием, вводят в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят во второй момент времени через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев, или 6-12 месяцев, или 1-2 года, или 2-3 года, после первого момента времени.

(ii) Контролируемая экспрессия трансгена: повышение экспрессии трансгена путем повторного введения зкДНК-вектора

[00180] В дополнение к введению повторных доз зкДНК-вектора для простого повышения уровня экспрессии трансгена, если уровни экспрессии снизились с течением времени (например, для продолжения или поддержания экспрессии трансгена на желаемом предварительно заданном уровне), в некоторых вариантах реализации способы и композиции для повторного введения зкДНК-вектора могут повышать уровень трансгена дозозависимым образом, т.е. повторная доза определенного количества зкДНК-вектора может вызывать определенное повышение уровня экспрессии трансгена. Иными словами, используя произвольные единицы только в иллюстративных целях, единичная доза зкДНК при повторном введении будет приводить к повышению уровня экспрессии трансгена на 10% по сравнению с предшествующим уровнем, а 2-кратная доза зкДНК-вектора будет приводить к повышению уровня трансгена на 20% по сравнению с предшествующим уровнем, и половинная (0,5) доза зкДНК позволит повысить уровень экспрессии трансгена на 5% по сравнению с предшествующим уровнем.

[00181] Соответственно, в одном варианте реализации зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе для контролируемой экспрессии трансгена, может быть использован для повышения уровня экспрессии трансгена в клетке или у субъекта контролируемым образом. Например, уровень экспрессии трансгена может быть повышен с помощью одного или нескольких последующих введений (например, повторной дозы или бустерного введения) зкДНК-вектора.

[00182] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, обеспечивают возможность дозозависимого или концентрационно-зависимого эффекта при введении повторной дозы зкДНК в один или несколько моментов времени после первоначального примирования, для повышения уровня экспрессии трансгена на определенную величину in vivo. В некоторых вариантах реализации, повышение экспрессии трансгена на определенную величину может доводить уровень экспрессии трансгена in vivo до уровня желаемого порогового значения или выше (или до предварительно определенного уровня) или до значения в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии, причем желательное пороговое значение или желательный диапазон уровней экспрессии превышают уровень экспрессии трансгена после предшествующего введения (т.е. первоначального примирующего введения или предшествующего введения повторной дозы).

[00183] Фиг.6 демонстрирует, что можно легко повысить уровень экспрессии трансгена после введения субъекту повторной дозы (т.е. повторного или бустерного введения) зкДНК-вектора in vivo. В частности, Фиг.6 демонстрирует различные величины повышения уровня экспрессии трансгена после введения субъекту различных концентраций зкДНК-вектора при введении повторной дозы in vivo. В частности, концентрация повторной дозы 3 мг/мл зкДНК обеспечивала 7-кратное повышение экспрессии трансгена, а концентрация повторной дозы 10 мг/кг зкДНК дала 17-кратное повышение экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии без введения повторной дозы с дозозависимым эффектом. Соответственно, технология, описанная в данном документе, относится к по меньшей мере двум введениям зкДНК субъекту in vivo, причем второе или последующие введения приводят к дозозависимому повышению уровня экспрессии трансгена на желаемую величину, а в некоторых вариантах реализации - к достижению желаемого диапазона уровней экспрессии, или желаемого уровня экспрессии, или порогового значения уровня экспрессии, по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, достигнутым при предшествующем введении зкДНК-вектора, или без введения повторной дозы с дозозависимым эффектом. Таким образом, повышение уровня экспрессии трансгена достигается одним или несколькими введением повторной дозы с дозозависимым эффектом для повышения уровня экспрессии трансгена контролируемым образом, т.е. для титрования экспрессии трансгена на основе дозы (или количества) зкДНК при введении повторной дозы.

[00184] Иными словами, введение повторной дозы с дозозависимым эффектом, раскрытое в данном документе, повышает уровень экспрессии трансгена. Повышенная экспрессия трансгена является дозозависимой и устойчивой экспрессией, т.е. экспрессия трансгена на более высоком уровне (вследствие введения повторной дозы с дозозависимым эффектом) сохраняется в течение определенного периода времени, или не снижается, или не опускается ниже уровня экспрессии, наблюдаемого без введения повторной дозы.

[00185] Как правило, каждую повторную дозу с дозозависимым эффектом вводят приблизительно за 7 суток до момента желательного повышения экспрессии трансгена. В сущности, повторные дозы с дозозависимым эффектом служат для титрования уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня, или желаемого диапазона уровней экспрессии, или, иначе говоря, повторные дозы с дозозависимым эффектом обеспечивают повышение уровня экспрессии трансгена на определенную величину выше предшествующего уровня экспрессии, и указанное повышение может происходить при по меньшей мере одном введении повторной дозы с дозозависимым эффектом или, альтернативно, при постепенном увеличении с более чем одним введением повторных доз с дозозависимым эффектом, в результате чего повышение трансгена происходит контролируемо, титруемым способом до экспрессии на уровне, который находится в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии, например, в желательном диапазоне, являющемся терапевтическим для лечения заболевания или расстройства.

[00186] В некоторых вариантах реализации желаемый диапазон уровня экспрессии или желаемый диапазон уровня экспрессии трансгена может представлять собой терапевтически эффективное количество трансгена для эффективного лечения или уменьшения симптома заболевания. Соответственно, в некоторых вариантах реализации для достижения такого терапевтически эффективного количества трансгена можно повысить уровень экспрессии трансгена с использованием одного или нескольких введений повторных доз, как описано в данном документе, для постепенного повышения уровней до терапевтически эффективного количества трансгена. Таким образом, в некоторых вариантах реализации субъекту можно вводить примирующую дозу зкДНК-вектора, который экспрессирует трансген с низким уровнем экспрессии (т.е. в субтерапевтически эффективном количестве), и одно или несколько введений повторных доз можно проводить субъекту в течение некоторого периода времени для повышения уровня экспрессии, пока не будет достигнут желаемый терапевтический эффект.Такая стратегия позволяет организму субъекта адаптироваться к уровню экспрессируемого трансгена и эффективно позволяет титровать или регулировать (в данном случае, путем постепенного повышения) уровень экспрессии трансгена для достижения желаемой терапевтической цели или эффекта и/или предотвращать передозировку лекарственных средств и/или побочные эффекты вследствие сверхэкспрессии трансгена. Альтернативно, в некоторых вариантах реализации субъекту может быть введена примирующая доза зкДНК-вектора, который экспрессирует трансген с желаемым уровнем экспрессии, когда субъект является младенцем или ребенком, обычно, с низким уровнем экспрессии, и одно или несколько введений повторных доз с дозозависимым эффектом может быть проведено субъекту на протяжении некоторого периода времени по мере роста субъекта для повышения уровня экспрессии с целью поддержания терапевтического эффекта.

B. Выбор времени и количества зкДНК-вектора при повторном введении

[00187] Уровень экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, как описано в данном документе, может быть повышен с предшествующего уровня (т.е. уровня экспрессии, достигнутого при первичном примирующем введении в день 0 или предшествующей повторной дозе) путем повторного введения (т.е. (повторной дозы) зкДНК-вектора в один или несколько моментов времени после первоначального введения. Как правило, введение повторной дозы для повышения уровня экспрессии до желаемого уровня или желаемого диапазона уровней экспрессии проводят примерно за 7 суток или более чем за 7 суток до момента желательного повышения экспрессии. В качестве иллюстративного примера, если повышение уровня экспрессии трансгена желательно примерно через 30 суток после предшествующего введения (т.е. примирующего или предшествующего введения повторной дозы), то повторная доза может быть введена через 28 суток или ранее. Аналогично, если повышение экспрессии трансгена желательно через примерно 90 суток (или примерно 3 месяца) после предшествующего введения (т.е. примирующего или предшествующего введения повторной дозы), то повторная доза может быть введена примерно через 83 или 84 дня или ранее, чтобы повышение уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня или до значения в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии произошло через 90 суток или около того, причем желаемый уровень или желаемый диапазон уровней экспрессии превышают уровень экспрессии трансгена, достигнутый после предшествующего введения.

[00188] Как описано в данном документе, поскольку способы и зкДНК-векторы, описанные в данном документе, допускают подход персонализированного генетического лекарственного средства, т.е. постепенного титрования уровня экспрессии трансгена с повторными введениями доз для постепенного увеличения уровней экспрессии, то предусматривается, что 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более 6 повторных доз может быть введено на протяжении некоторого периода времени для повышения уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня или до желаемого диапазона уровней экспрессии, которые превышают уровень экспрессии, достигнутый после предшествующего введения или перед таким повторным введением дозы. Величины постепенного повышения уровня экспрессии трансгена при каждом введении повторной дозы могут быть одинаковыми, т.е. каждое введение повторной дозы может повышать уровень экспрессии трансгена примерно на 10% от предшествующего уровня экспрессии, или могут различаться, т.е. первое введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 10% от предшествующего уровня экспрессии, и второе введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 20% от предшествующего уровня экспрессии. Как правило, каждую повторную дозу вводят приблизительно за 7 суток до момента желаемого повышения экспрессии трансгена. По сути, повторные дозы служат для титрования уровня экспрессии трансгена до желаемого уровня или желаемого диапазона уровней экспрессии или, иначе говоря, повторные дозы позволяют повысить уровень экспрессии трансгена относительно предшествующего уровня экспрессии. и такое повышение может проводиться постепенно с помощью одного или нескольких введений повторных доз, так чтобы трансген экспрессировался на уровне, находящемся в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии, например, в желательном диапазоне, который является терапевтическим для лечения заболевания или расстройства.

[00189] В некоторых вариантах реализации повторная доза для повышения уровня экспрессии трансгена вводится через по меньшей мере примерно 20 суток, или по меньшей мере примерно 30 суток, или по меньшей мере примерно 40 суток, или по меньшей мере примерно 50 суток, или по меньшей мере примерно 60 суток, или примерно 60-90 суток, или примерно 90-120 суток, или примерно 120-150 суток, после предшествующего введения (например, первоначального примирующего введения в день 0 или предшествующего введения повторной дозы) композиции зкДНК.

[00190] В некоторых вариантах реализации технология, описанная в данном документе, относится к повторной дозе зкДНК для повышения экспрессии трансгена in vivo, причем экспрессия трансгена может быть повышена посредством одной или нескольких повторных доз (т.е. повторного введения или бустерного введения) композиции зкДНК. В некоторых вариантах реализации доза (или количество) зкДНК-вектора при введении повторной дозы во второй или последующие моменты времени является такой же или отличается от дозы (т.е. количества) зкДНК при предшествующем введении, или при непосредственно предшествующем введении повторной дозы (первоначальном примирующем введении в день 0 или предшествующем введении повторной дозы). В качестве одного примера, если количество зкДНК, введенного в первый момент времени, составляет 1 мг/кг, то количество при введении повторной дозы во второй или последующие моменты времени может составлять 1 мг/кг, или менее 1 мг/кг, или более 1 мг/кг.В некоторых вариантах реализации повторная доза представлять собой количество, выбранное из любых из следующих значений: примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг, примерно 10 мг/кг, или примерно 2-5 мг/кг, или 5-10 мг/кг, или 10-15 мг/кг, или более 15 мг/кг.

[00191] В некоторых вариантах реализации для повышения уровня экспрессии трансгена посредством одного или нескольких введений повторной дозы (т.е. последовательного введения повторных доз для постепенного повышения уровня экспрессии трансгена), каждое введение повторной дозы может быть одинаковым, т.е. каждое введение повторной дозы может повышать уровень экспрессии трансгена примерно на 10% по сравнению с предшествующим уровнем экспрессии, или может отличаться, т.е. первое введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 10% от предшествующего уровня экспрессии, и второе введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 20% от предшествующего уровня экспрессии.

[00192] В некоторых вариантах реализации, при введении более чем одной повторной дозы, величины повышения уровня экспрессии трансгена при каждом введении повторной дозы могут быть одинаковыми, т.е. каждая введенная повторная доза может повышать уровень экспрессии трансгена примерно на 10% от предшествующего уровня экспрессии, или могут различаться, т.е. первое введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 10% от предшествующего уровня экспрессии, а второе введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно на 20% от предшествующего уровня экспрессии. В некоторых вариантах реализации, при введении более чем одной повторной дозы, величины повышения уровня экспрессии трансгена при каждом введении повторной дозы могут быть одинаковыми, т.е. каждая введенная повторная доза может повышать уровень экспрессии трансгена примерно в 1, или 2, или 3 раза, и т.д., от предшествующего уровня экспрессии, или могут различаться, т.е. первое введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно в 2 раза от предшествующего уровня экспрессии, и второе введение повторной дозы может повысить экспрессию примерно в 6 раз по сравнению с предшествующим уровнем экспрессии, или примерно в 6 раз от уровня экспрессии, достигнутого при первоначальном примирующем введении.

[00193] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят в клетку или субъекту при втором или любом последующем введении (например, при введении повторных доз), представляет собой тот же самый зкДНК-вектор, который был введен при первичном введении (т.е. при первом введении в момент времени 0). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может быть одним и тем же зкДНК-вектором. Только в иллюстративных целях, при повторном введении вирусных векторов, например, векторов ААВ, они обычно отличаются по серотипу от введенных ранее. В противоположность этому, зкДНК-вектор при повторном введении является тем же самым, что и введенный ранее зкДНК-вектор, т.е. зкДНК-вектор не меняется, что эквивалентно многократному введению одного и того же серотипа ААВ.

[00194] При этом, будучи эквивалентом повторного введения одного и того же серотипа зкДНК-вектора, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, который вводят при втором или любом последующем введении (например, при введении повторных доз) после первоначального примирующего введения, отличается, например, другой парой ИКП, другим промотором, функционально связанным с трансгеном, другим трансгеном или модифицированным трансгеном и т.п.В некоторых вариантах реализации, ген трансгена является одним и тем же, или может представлять собой модифицированный трансген.

[00195] В некоторых вариантах реализации интервалы между первым введением (т.е. примирующим введением) зкДНК-вектора и введением повторной дозы (т.е. во второй момент времени или в любой последующий момент времени после этого, например, 3-й, 4-й, 5-й 6-й, 7-й, 8-й, 9-й, 10-й и т.д.) могут составлять не менее 30 суток, или не менее 60 суток, или не менее 80 суток, или от 60 до 90 суток, или от 90 до 120 суток, или примерно 2-3 месяца, или примерно 3-6 месяцев, или примерно 6-12 месяцев, или примерно 1 год, или 1-2 года, или примерно 2 года, или 2-3 года, или примерно 3 года, или 3-4 года, или примерно 5 лет, или 5-6 лет, или 5-10 лет, или 10-20 лет и т.д., после предшествующего введения (т.е. примирующей дозы или предшествующего введения повторной дозы). Как описано в данном документе, в одном варианте реализации введение повторной дозы для повышения уровня экспрессии трансгена проводят примерно за 7 суток или более чем за 7 суток (например, за 8-10 или 14 суток) до того момента, когда повышение экспрессии будет желательным.

[00196] Только в целях иллюстрации, если количество зкДНК-вектора при первоначальном введении в день 0 принять равным произвольной единице 1, то количество зкДНК-вектора при повторном введении во второй, третий, четвертый, пятый, шестой моменты времени может быть выбрано из 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно, 10-кратно, 11-кратно, 12-кратно, 13-кратно, 14-кратно, 15-кратно или 15-20-кратно или 20-50-кратно (или более) увеличенного количества зкДНК-вектора при первоначальном введении в день 0.

[00197] В некоторых вариантах реализации, если количество зкДНК-вектора при первоначальном введении в день 0 приводит к уровню экспрессии, который принимают равным произвольной единице 1, то количество зкДНК-вектора при повторном введении дозы во второй, третий, четвертый, пятый, шестой моменты времени может представлять собой количество зкДНК-вектора, которое приводит к повышению уровня экспрессии трансгена по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз или 15-20 раз, или в 20-50 раз (или более) по сравнению с уровнем экспрессии трансгена при первоначальном введении зкДНК-вектора в день 0.

[00198] В некоторых вариантах реализации повторную дозу вводят таким же образом или таким же путем введения, что и при первоначальном введении зкДНК в день 0. В некоторых вариантах реализации повторную дозу вводят другим способом или другим путем введения, отличными от первоначального введения зкДНК в день 0. В некоторых вариантах реализации, когда за первоначальным введением (т.е. примирующим введением в момент времени 0) следует одна или несколько повторных доз (т.е. бустерные введения), введение может осуществляться путем внутривенного, интраназального или внутримышечного введения, или любым другим пригодным с медицинской точки зрения путем введения композиции, содержащей зкДНК-вектор.

[00199] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может быть введен субъекту в первый момент времени (например, при первоначальном введении, например, в день 0), и в какое-то время после первого момента времени, если это необходимо или желательно. зкДНК-вектор, описанный в данном документе, можно вводить во второй момент времени для титрования уровней трансгена на желаемом уровне (например, выше порогового значения эффективности), или в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии (например, в пределах терапевтического окна композиции). Предусматривается, что субъекту может быть введено более одной дозы зкДНК-вектора, как описано в данном документе, например, повторное введение может быть проведено в любой из одного или нескольких из: второго момента времени, третьего момента времени, четвертого момента времени и т.д. Предусматривается, что дополнительные дозы могут вводиться для поддержания желаемого уровня экспрессии трансгена (т.е. для поддержания или сохранения постоянного уровня экспрессии трансгена). Интервалы между первой и второй или любыми двумя последовательными повторными дозами не должны быть одинаковыми.

C. Предварительно определенные уровни экспрессии трансгена

[00200] В некоторых вариантах реализации предварительно определенный уровень экспрессии трансгена (также называемый желаемым диапазоном уровня экспрессии или желаемым диапазоном уровня экспрессии трансгена) может представлять собой терапевтически эффективное количество трансгена для эффективного лечения или уменьшения симптома заболевания. Соответственно, в некоторых вариантах реализации для достижения такого терапевтически эффективного количества трансгена можно поддерживать уровень экспрессии трансгена и/или повышать уровень экспрессии трансгена, как описано в данном документе, с использованием одного или нескольких введений повторных доз, как описано в данном документе, для постепенного повышения уровней до терапевтически эффективного количества трансгена. Таким образом, в некоторых вариантах реализации субъекту можно вводить примирующую дозу зкДНК-вектора, который экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии, обычно на низком уровне экспрессии (т.е. субтерапевтически эффективном количестве), и одна или несколько повторных доз с дозозависимым эффектом могут быть введены субъекту на протяжении некоторого периода времени для повышения уровня экспрессии, до достижения желаемого терапевтического эффекта. Такая стратегия позволяет организму субъекта адоптироваться к уровню экспрессируемого трансгена и обеспечивает возможность эффективного титрования или регулирования (в данном случае, повышения) уровня экспрессии трансгена при по меньшей мере одном введении повторной дозы с дозозависимым эффектом или более (т.е., по меньшей мере с двумя или более приращениями) для достижения желаемой терапевтической цели или эффекта и/или предотвращения передозировки лекарственных средств и/или побочных эффектов вследствие сверхэкспрессии трансгена. Альтернативно, в некоторых вариантах реализации субъекту может быть введена примирующая доза зкДНК-вектора, который экспрессирует трансген с желаемым уровнем экспрессии, когда субъект является младенцем или ребенком, обычно, с низким уровнем экспрессии, и одно или несколько введений повторных доз с дозозависимым эффектом может быть проведено субъекту на протяжении некоторого периода времени по мере роста субъекта для повышения уровня экспрессии с целью поддержания терапевтического эффекта. Аналогично, в некоторых вариантах реализации субъекту можно вводить примирующую дозу зкДНК-вектора, который экспрессирует трансген на желаемом уровне экспрессии у субъекта, и одно или несколько введений повторных доз с дозозависимым эффектом можно проводить субъекту на протяжении некоторого периода времени, когда субъект набирает вес и т.д., для повышения уровня экспрессии с целью поддержания терапевтического эффекта.

[00201] Таким образом, зкДНК-вектор, как описано в данном документе, вводят субъекту в первый момент времени (например, при первоначальном введении, например, в день 0), а через какое-то время после первого момента времени зкДНК-вектор, как описано в данном документе, вводят во второй момент времени для повышения уровня экспрессии трансгена до предварительно определенного уровня экспрессии трансгена (например, до желаемого уровня или в пределах желаемого диапазона уровней экспрессии), причем предварительно определенный уровень экспрессии трансгена выше уровня экспрессии трансгена до введения повторной дозы. В некоторых вариантах реализации, когда предварительно определенный уровень экспрессии трансгена не обязательно является терапевтически эффективным количеством трансгена, предусматривается, что субъекту может быть введено более одной повторной дозы зкДНК-вектора с дозозависимым эффектом, как описано в данном документе, в любой из одного или нескольких из: второго момента времени, третьего момента времени, четвертого момента времени и т.д., причем трансген повышается до предварительно определенного уровня экспрессии трансгена. Предусматривается, что повторные дозы с дозозависимым эффектом могут быть введены для повышения уровня экспрессии трансгена на определенную величину, которая зависит от дозы зкДНК при повторном введении дозы, и в некоторых вариантах реализации они могут использоваться для постепенного повышения уровней экспрессии для достижения уровня экспрессии, который представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена (например, представляет собой уровень, который вызывает желаемый терапевтический эффект или уменьшает один или несколько симптомов заболевания или расстройства).

[00202] Хотя введение повторной дозы приводит к дозозависимому повышению экспрессии трансгена, в некоторых вариантах реализации эффект введения повторной дозы является синергетическим, т.е. степень повышения экспрессии трансгена превышает сумму величин отдельных введений. Например, как продемонстрировано на Фиг.6, увеличение количества зкДНК-вектора в 3 раза при повторном введении привело к увеличению экспрессии трансгена более чем в 3 раза; и увеличение количества зкДНК-вектора в 10 раз при повторном введении привело к увеличению экспрессии трансгена более чем в 10 раз.

[00203] В конкретных вариантах реализации, описанных в данном документе, для первоначального введения может быть желательным выбор низкой дозы зкДНК на кривой доза-реакция (т.е. в первый момент времени, например, в день 0) и, необязательно, постепенное увеличение дозы (т.е. уровня экспрессии трансгена) посредством одной или нескольких повторных доз с дозозависимым эффектом при втором, третьем, четвертом и т.д. введениях, чтобы вызвать терапевтический эффект при одновременном предотвращении появления неблагоприятных побочных эффектов или непереносимости композиции. В одном варианте реализации соотношение доза-ответ для данного зкДНК-вектора используется для определения и/или оценки оптимальной дозы для эффективного лечения данного заболевания, величина которой находится далеко от предельных значений терапевтического окна композиции. Таким образом, титрование дозы зкДНК-векторов, как описано в данном документе, с использованием начального примирующего введения (например, в день 0) и введения постепенного возрастающих повторных доз с дозозависимым эффектом в последующие моменты времени может обеспечивать максимальный терапевтический эффект экспрессируемого трансгена, одновременно также минимизируя побочные эффекты или нежелательную токсичность.

[00204] Анализы in vivo и/или in vitro могут необязательно применяться при определении оптимальных диапазонов доз зкДНК-вектора при повторных введениях для достижения заданного уровня экспрессии трансгена. Точная доза зкДНК-вектора при первоначальном примирующем введении (например, в момент времени 0), и при каждом повторном введении после этого, будет также зависеть от пути введения и серьезности состояния, и должна определяться по решению специалиста в данной области техники и с учетом обстоятельств каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на животных моделях.

[00205] зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток требуемой ткани и для обеспечения достаточных уровней экспрессии трансгена и чрезмерных нежелательных явлений. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, описанные ниже в разделе «Введение», такие как прямая доставка в выбранный орган (например, интрапортальная доставка в печень), пероральная доставка, ингаляция (в том числе интраназальная и внутритрахеальная доставка), интраокулярная, внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриопухолевая доставка; и другие парентеральные пути введения. Пути введения могут быть скомбинированы, в случае необходимости.

[00206] Доза количества зкДНК-вектора при первоначальном примирующем введении (например, в момент времени 0), и при каждом повторном введении после этого для контролируемой экспрессии трансгена, необходимая для достижения определенного «терапевтического эффекта», будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничений: путь введения нуклеиновой кислоты, уровень экспрессии гена или РНК, необходимый для достижения терапевтического эффекта, конкретное заболевание или расстройство, лечение которого проводят, и стабильность гена (генов), продукта (продуктов) РНК или итогового экспрессируемого белка (белков). Специалист в данной области техники может легко определить диапазон доз зкДНК-вектора для лечения пациента, имеющего конкретное заболевание или расстройство, на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов, хорошо известных в данной области техники.

[00207] Режим введения доз может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, олигонуклеотид может вводиться неоднократно, например, ежедневно может быть введено несколько доз, или доза может быть пропорционально снижена с учетом диктуемой терапевтической ситуацией необходимости. Специалист в данной области техники сможет легко определить подходящие дозы и схемы введения олигонуклеотидов по данному изобретению, как для введения в клетки, так и для введения субъектам.

[00208] «Терапевтически эффективная доза» будет находиться в относительно широком диапазоне значений, который может быть определен с помощью клинических испытаний, и будет зависеть от конкретного применения (нервные клетки потребуют очень небольших количеств, в то время как системные инъекции потребуют значительных количеств). Например, для прямой инъекции in vivo в скелетную или сердечную мышцу человека, величина терапевтически эффективной дозы будет составлять от примерно 1 мкг до 100 г зкДНК-вектора. Если для доставки зкДНК-вектора используются экзосомы или микрочастицы, то терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально, но ожидается, что она должна доставить от 1 мкг до примерно 100 г вектора. Кроме того, терапевтически эффективная доза представляет собой такое количество зкДНК-вектора, которое экспрессирует количество трансгена, достаточное для воздействия на субъекта, приводящего к уменьшению одного или нескольких симптомов заболевания, но не вызывающего значительных нецелевых или нежелательных побочных эффектов.

[00209] Составление композиций фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителей хорошо известно специалистам в данной области техники, как и разработка подходящих режимов введения доз и лечения для применения конкретных композиций, описанных в данном документе, в различных схемах лечения.

[00210] Для трансфекции in vitro эффективное количество зкДНК-вектора, доставляемого в клетки (1×10⁶ клеток), будет составлять порядка 0,1-100 мкг зкДНК-вектора, предпочтительно, от 1 до 20 мкг, и более предпочтительно, от 1 до 15 мкг, или от 8 до 10 мкг.Для зкДНК-векторов большего размера необходимы более высокие дозы. Если используются экзосомы или микрочастицы, эффективная in vitro доза может быть определена экспериментально, однако она должна обеспечивать доставку, в общем, такого же количества зкДНК-вектора.

[00211] Не связываясь какой-либо конкретной теорией, укажем, что отсутствие типичного противовирусного иммунного ответа, вызываемого введением зкДНК-вектора, как описано в данном изобретении (т.е. отсутствие капсидных компонентов), позволяет неоднократно вводить зкДНК-вектор хозяину. Согласно некоторым вариантам реализации, число введений гетерологичной нуклеиновой кислоты субъекту составляет от 2 до 10 раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор доставляется субъекту более 10 раз.

[00212] В конкретных вариантах реализации может быть использовано более одного введения (например, два, три, четыре или более введений) для достижения желаемого уровня экспрессии гена на протяжении периодов времени различной продолжительности, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.д.

[00213] В некоторых вариантах реализации трансген, кодируемый зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, может регулироваться с помощью регуляторного переключателя, индуцибельного или репрессируемого промотора, таким образом, чтобы он экспрессировался у субъекта в течение по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 72 часов, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев/одного года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 15 лет, по меньшей мере 20 лет, по меньшей мере 30 лет, по меньшей мере 40 лет, по меньшей мере 50 лет или более. В одном варианте реализации экспрессия может быть достигнута путем повторного введения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, через предварительно определенные или желательные интервалы времени. Альтернативно, контролируемая экспрессия из зкДНК-вектора, как описано в данном документе, может дополнительно включать компоненты системы редактирования генов (например, CRISPR/Cas, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции), эндонуклеазы с мотивом «цинковый палец» и т.д.), для обеспечения возможности вставки одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих трансген, для по существу постоянного лечения или «исцеления» заболевания. Такие зкДНК-векторы, содержащие компоненты редактирования генов, раскрыты в международной заявке PCT/US18/64242 и могут включать 5'- и 3'-гомологичные плечи (например, последовательности SEQ ID NO: 151-154, или последовательности с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70% или 80% гомологии с ними) для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген, в области безопасной гавани, такие как ген альбумина или ген CCR5, но не включая их.

[00214] Продолжительность лечения зависит от клинического прогресса субъекта и от восприимчивости к терапии. Предусматривается постоянное введение относительно низких поддерживающих доз после начальной более высокой терапевтической дозы.

II. Персонализированная генная терапия

[00215] Как описано в данном документе, способы и зкДНК-векторы, описанные в данном документе, допускают подход персонализированного генетического лекарственного средства, т.е. дозозависимое титрование уровня экспрессии трансгена с использованием повторных доз, например, поэтапно с одним или несколькими введениями повторных доз для повышения уровней экспрессии трансгена на определенную величину при каждом повторном введении. По существу, повторные дозы можно использовать для постепенного титрования уровня экспрессии трансгена. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более 6 повторных доз с дозозависимым эффектом может быть введено для поддержания и/или повышения каждый раз уровня экспрессии трансгена на определенную величину (т.е. при каждой повторной дозе), для повышения уровня экспрессии до желаемого уровня или до желаемого диапазона уровней экспрессии, который выше уровня экспрессии, достигнутого при предшествующем введении или перед таким повторным введением дозы.

[00216] Способность квалифицированного специалиста титровать дозу композиции, содержащей зкДНК-векторы, как описано в данном документе, на основе зависимости доза-ответ для вектора, полезна для лечения заболевания различными способами. Как минимум, квалифицированный специалист может повысить дозу зкДНК-вектора, когда желательно увеличение эффекта (например, экспрессии трансгена). Альтернативно, специалист в данной области техники может выбрать дозу, которая, как известно, обеспечивает уровень экспрессии, который является терапевтическим, на основании предварительного знания зависимости доза-ответ для композиции зкДНК. В некоторых вариантах реализации может быть желательным выбор относительно высокой дозы на кривой доза-ответ, например, для ускорения лечения субъекта, имеющего тяжелые симптомы данного заболевания. Напротив, обычно желателен выбор низкой дозы на кривой доза-эффект и, необязательно, постепенное увеличение дозы, чтобы вызвать терапевтический эффект, одновременно предотвращая возникновение нежелательных побочных эффектов или непереносимости композиции. В одном варианте реализации соотношение доза-ответ для данного зкДНК-вектора используется для определения и/или оценки оптимальной дозы для эффективного лечения данного заболевания, величина которой находится в центральной части терапевтического окна для композиции. Таким образом, титрование дозы зкДНК-векторов, как описано в данном документе, максимально увеличивает терапевтический эффект экспрессируемого трансгена, а также минимизирует побочные эффекты или нежелательную токсичность.

[00217] Только в качестве иллюстративного примера, субъекты с муковисцидозом могут иметь различную степень тяжести заболевания и/или по-разному реагировать на один и тот же уровень экспрессии трансгена гена CFTR1 и/или иметь более низкий или более высокий, по сравнению с нормой, клиренс лекарственного средства, и поэтому постепенное повышение экспрессии трансгена CFTR1 с помощью одного или нескольких повторных введений зкДНК-вектора, содержащего трансген CFTR1, позволяет постепенно повышать уровень экспрессии трансгена CFTR1, т.е. до уровня экспрессии, который эффективно уменьшает один или несколько симптомов заболевания муковисцидозом у данного конкретного субъекта. Ранее такой персонализированный подход или метод титрования для повышения уровня экспрессии трансгена был или неэффективным и/или невозможным из-за иммунных ответов, связанных с другими векторами на основе вирусов, такими как векторы ААВ.

[00218] В некоторых вариантах реализации введение повторной дозы с дозозависимым эффектом обеспечивает контролируемое повышение уровня экспрессии трансгена и, следовательно, способы и композиции, раскрытые в данном документе, позволяют использовать подход персонализированного лекарственного средства к генной терапии. Только в качестве иллюстративного примера, субъекты с муковисцидозом могут иметь различную степень тяжести заболевания и/или по-разному реагировать на один и тот же уровень экспрессии трансгена гена CFTR1 и/или иметь более низкий или более высокий, по сравнению с нормой, клиренс лекарственного средства, и поэтому контролируемое повышение экспрессии трансгена CFTR1 путем введения одной или нескольких повторных доз с дозозависимым эффектом зкДНК-вектора, содержащего трансген CFTR1, позволяет контролируемым образом повышать уровень экспрессии трансгена CFTR1, а в некоторых вариантах реализации контролируемое повышение экспрессии может быть доведено до уровня экспрессии, который эффективно уменьшает один или несколько симптомов заболевания муковисцидозом у данного конкретного субъекта. Ранее такой персонализированный подход или метод титрования для дозозависимого повышения уровня экспрессии трансгена был неэффективным и/или невозможным из-за иммунных ответов, связанных с векторами на основе других вирусов или ААВ.

[00219] Как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации субъекта обследуют в определенный момент времени после первого введения зкДНК-вектора, например, в любой момент времени через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или от 60 до 90 суток, или более 90 суток, после первого введения зкДНК-вектора, для определения титрующей дозы. Например, в некоторых вариантах реализации субъекта обследуют для определения болезненного состояния субъекта после первого введения зкДНК-вектора и/или уровня трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором у субъекта.

[00220] В некоторых вариантах реализации, оценка болезненного состояния представляет собой оценку по меньшей мере одного симптома заболевания у субъекта. Состояние заболевания для любого конкретного заболевания может быть определено врачом или специалистом в данной области техники и включает оценку одного или нескольких клинических симптомов и/или биомаркеров заболевания, включая белковые биомаркеры, биомаркеры микроРНК и мРНК, и другие системы молекулярного профилирования.

[00221] В некоторых вариантах реализации оценка болезненного состояния у субъекта может быть проведена с использованием молекулярного профилирования в сочетании с клинической характеризацией пациента, такой как наблюдения, выполненные врачом (например, такие как код Международной классификации болезней, и даты определения таких кодов), результаты лабораторных исследований, рентгеновские снимки, результаты биопсии, заявления, сделанные пациентом, и любая другая медицинская информация, на которую обычно полагается врач при постановке диагноза при конкретном заболевании. Способы определения болезненного состояния на основе молекулярного профилирования у субъекта раскрыты в патентах и патентных заявках США №№7167734, 9372193, 9383365, 2006/0224191, 2011/0172501, 2009/0104596, 2009/0023149, которые все включены в данный документ в полном объеме.

[00222] В некоторых вариантах реализации способы, описанные в данном документе, можно использовать для титрования зкДНК-вектора субъекту для индивидуального медицинского вмешательства при конкретном заболевании.

[00223] Изучение изменений различных биомаркеров дает информацию о состоянии субъекта, от которого получены биомаркеры. Понимание того, как изменяются биомаркеры (например, увеличиваются, уменьшаются, не изменяются) с прогрессированием заболевания позволяет, путем проведения измерений одного биологического образца в один момент времени, подтвердить (например, наличие или отсутствие заболевания), типизировать заболевание и охарактеризовать болезненное состояние (например, ранняя стадия или «начало», или поздняя стадия или «выздоровление»).

[00224] В некоторых вариантах реализации можно оценивать биомаркеры для оценки состояния прогрессирования заболевания, такого как начало или выздоровление, на основе уровня каждого из биомаркеров, а также тенденции их изменения (увеличение, уменьшение или постоянство) во времени. Профилирующие биомаркеры болезненного состояния субъекта также можно комбинировать с другими методами, такими как отношения стабильных изотопов при естественном дыхании (например, патент США №5912178), для оценки того, является ли человек здоровым или находится в болезненном состоянии. Болезненные состояния выявляются путем измерения изменений в уровнях биомаркеров и, в частности, множества биомаркеров, взаимосвязанных в рамках биологического пути, ассоциированного с болезненным состоянием. В некоторых вариантах реализации конкретное болезненное состояние можно охарактеризовать путем обнаружения и анализа сложных сигналов в спектрах ЯМР для определения биомаркеров, уровни которых меняются по мере прогрессирования заболевания. Такая первоначальная оценка болезненного состояния позволяет «дактилоскопировать» динамические изменения, связанные с прогрессированием заболевания, и помогает оценить текущее состояние развития и процесса заболевания. Когда болезненное состояние идентифицировано, введение зкДНК-вектора может быть адаптировано и/или протитровано для субъекта так, чтобы сократить продолжительность заболевания.

[00225] В некоторых вариантах реализации болезненное состояние можно оценить путем анализа профиля биомаркера в биологическом образце, полученном от субъекта. Конкретные измеряемые биомаркеры определяют из анализа основных биохимических путей, лежащих в основе заболевания, и связанного с ними иммунного ответа хозяина. В одном варианте реализации получают стандартный профиль биомаркера от здорового человека и от человека с заболеванием. Сравнение профиля биомаркера из биологического образца со стандартным профилем биомаркера (здорового и больного) позволяет положительно идентифицировать болезненное состояние. Необязательно, берут второй биологический образец у пациента во второй момент времени или в момент прогрессирования заболевания для определения тенденций изменения профиля биомаркера (например, какие биомаркеры изменяются между первым и вторым образцами), обеспечивая тем самым дополнительную информацию о состоянии заболевания или о состоянии пациента. В некоторых вариантах реализации стандартный профиль биомаркера оценивают в один или несколько из следующих моментов времени: до первого введения зкДНК-вектора, через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или от 60 до 90 суток, или через более чем 90 суток после первого введения зкДНК-вектора, или через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или от 60 до 90 суток, или более чем 90 суток после второго введения (например, повторной дозы) зкДНК-вектора, или через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или от 60 до 90 суток, или через более чем 90 суток после любых последующих введений (например, введений повторных доз) зкДНК-вектора.

[00226] Были определены белковые биомаркеры для диабета, болезни Альцгеймера и рака. (См., например, патенты США №№7125663; 7097989; 7074576; и 6925389, которые включены в данный документ в полном объеме). Могут быть использованы также такие методы обнаружения белковых биомаркеров, как масс-спектрометрия и специфическое связывание с антителами. Высокопроизводительные методы анализа экспрессии с использованием микрочипов могут применяться для биомаркеров мРНК, а также для фокусированных массивов и кПЦР для множества релевантных генов, чтобы идентифицировать связанные со стрессом гены, см., например, WO2007106685A2. ДНК-микрочипы использовались для измерения экспрессии генов в образцах опухолей от пациентов и для облегчения диагностики. Экспрессия генов может выявить наличие рака у пациента, его тип, стадию и происхождение, а также проверить участие генетических мутаций. Экспрессия генов может даже играть определенную роль в прогнозировании эффективности химиотерапии. За последние десятилетия Национальный институт рака США (National Cancer Institute, NCI) протестировал влияние соединений, в том числе химиотерапевтических агентов, на ограничение роста 60 линий раковых клеток человека. NCI также измерил экспрессию генов в этих 60 линиях раковых клеток, используя ДНК-микрочипы. Различные исследования изучали связь между экспрессией генов и эффектом соединения с использованием наборов данных NCI. Критическое время при поиске эффективной химиотерапии для пациентов с раком часто теряют из-за подхода, основанного на методе проб и ошибок. Кроме того, у раковых клеток часто развивается устойчивость к ранее эффективной терапии. В таких ситуациях исход для пациента может быть значительно улучшен путем раннего выявления такой резистентности.

[0001] В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии биомаркера болезненного состояния определяют путем измерения уровня мРНК, транскрибируемой с гена (генов), путем определения уровня белкового продукта гена (генов), или путем определения уровня биологической активности белкового продукта гена (генов). В некоторых вариантах реализации уровень биомаркера (включая биомаркеры микроРНК) болезненного состояния измеряют с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР). Такие методы измерения продуктов экспрессии генов, например, уровня белка, включают ИФА (иммуноферментный анализ), вестерн-блоттинг и иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию с использованием детектирующих реагентов, таких как агенты, связывающие антитела или белки. Альтернативно, пептид может быть обнаружен у субъекта путем введения субъекту меченого антитела против пептида и других типов детектирующих агентов. Например, антитело может быть меченым радиоактивным маркером, присутствие и местонахождение которого у субъекта определяется стандартными методами визуализации.

[0002] В некоторых вариантах реализации продукты экспрессии генов могут быть определены путем измерения уровня экспрессии матричной РНК (мРНК) биомаркера заболевания. Такие молекулы могут быть выделены, получены или амплифицированы из биологического образца, такого как цельная кровь или плазма, например, обогащенная тромбоцитами плазма. Обнаружение экспрессии мРНК известно специалистам в данной области техники и включает, например, без ограничений, процедуры ПЦР, ОТ-ПЦР, нозерн-блоттинг, дифференциальную экспрессию генов, анализ РНК-защиты, анализ на микрочипах, методы гибридизации и т.д. В некоторых вариантах реализации уровень мРНК может быть измерен с использованием количественной ОТ-ПЦР. В целом, процедура ПЦР описывает метод амплификации генов, который включает (i) специфичную для последовательности гибридизацию праймеров со специфическими генами или последовательностями в образце или библиотеке нуклеиновых кислот, (ii) последующую амплификацию, включающую множество циклов отжига, удлинения и денатурации с использованием термостабильной ДНК-полимеразы, и (iii) скрининг продуктов ПЦР на наличие полосы правильного размера. Используемые праймеры представляют собой олигонуклеотиды с достаточной длиной и подходящей последовательностью для обеспечения инициации полимеризации, т.е. каждый праймер специально сконструирован так, чтобы он был комплементарным цепи геномного локуса, которую нужно амплифицировать. В альтернативном варианте реализации уровень мРНК продуктов экспрессии генов, описанных в данном документе, может быть определен с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) и с помощью количественной ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР) или методов ПЦР в реальном масштабе времени. Способы ОТ-ПЦР и кОТ-ПЦР хорошо известны в данной области техники.

[00227] В некоторых вариантах реализации способы измерения одного или нескольких биомаркеров болезненного состояния или уровня экспрессии трансгена из зкДНК-вектора могут быть выбраны из любого из: иммуногистохимического (ИГХ) анализа и/или анализа на микрочипах, микроматриц сравнительной геномной гибридизации (CGH), микроматриц однонуклеотидного полиморфизма (SNP), флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), гибридизации in situ (ISH) и протеомного анализа.

[00228] Используемый в данном документе термин «микрочип» означает устройство, используемое любым способом, позволяющим количественно определить, за один раз, один или несколько рассматриваемых олигонуклеотидов, например, ДНК или РНК или их аналогов. Одним типичный пример класса микрочипов состоит из ДНК-зондов, прикрепленных к поверхности стекла или кварца. Многие микрочипы, например, производимые фирмой «Affymetrix», используют несколько зондов для определения экспрессии одного гена. ДНК-микрочип может содержать олигонуклеотидные зонды, которые представлять собой, например, полноразмерные зкДНК, комплементарные к РНК, или фрагменты зкДНК, которые гибридизуются с частью РНК. Типичные РНК включают мРНК, микроРНК и предшественники микроРНК. Типичные микрочипы также включают «микрочип нуклеиновой кислоты», имеющий множество связанных с субстратом нуклеиновых кислот, причем гибридизация с каждой из множества связанных нуклеиновых кислот определяется отдельно. Подложка может быть твердой или пористой, плоской или неплоской, единой или распределенной. Типичные микрочипы нуклеиновых кислот включают все устройства, обозначенные таким образом в Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Series Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1)(suppl.):1-60 (1999); and Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000). Кроме того, примеры микрочипов нуклеиновых кислот могут включать связанное с субстратом множество нуклеиновых кислот, которые размещены на множестве гранул, а не на единой плоской подложке, как описано, в частности, в Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000). Примеры микрочипов нуклеиновых кислот приведены в патентах США №№6391623, 6383754, 6383749, 6380377, 6379897, 6376191, 6372431, 6351712, 6344316, 6316193, 6312906, 6309828, 6309824, 6306643, 6300063, 6287850, 6284497, 6284465, 6280954, 6262216, 6251601, 6245518, 6263287, 6251601, 6238866, 6228575, 6214587, 6203989, 6171797, 6103474, 6083726, 6054274, 6040138, 6083726, 6004755, 6001309, 5958342, 5952180, 5936731, 5843655, 5814454, 5837196, 5436327, 5412087 и 5405783, которые включены в данный документ посредством ссылки.

[00229] Типичные микрочипы также могут включать «пептидные микрочипы» или «белковые микрочипы», имеющие множество связанных с субстратом полипептидов, причем связывание какого-либо олигонуклеотида, пептида или белка со множеством связанных полипептидов может определяться отдельно. Альтернативно, пептидный микрочип может иметь множество связующих агентов, включая, без ограничений, моноклональные антитела, поликлональные антитела, связующие агенты для фагового дисплея, связующие агенты для дрожжевого двухгибридного анализа, аптамеры, которые могут специфически детектировать связывание специфических олигонуклеотидов, пептидов или белков. Примеры пептидных матриц приведены в международных патентных публикациях №№WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210 и WO 97/42507, и в патентах США №№6268210, 5766960 и 5143854, включенных в данный документ посредством ссылки.

[00230] В некоторых вариантах реализации, если болезненное состояние субъекта остается стабильным или не улучшилось, или когда болезненное состояние у субъекта ухудшилось, например, по сравнению с болезненным состоянием в момент первого введения зкДНК-вектора или в любой момент времени до введения зкДНК-вектора, субъекту вводят вторую дозу зкДНК-вектора, причем, например, в некоторых вариантах реализации, количество вводимого зкДНК-вектора представляет собой титрованную дозу.

[00231] В альтернативных вариантах реализации, если уровень экспрессии трансгена у субъекта снизился с предварительно определенного уровня или понизился от терапевтически эффективного количества, например, упал с начального уровня экспрессии трансгена после первого введения зкДНК-вектора, субъекту вводят вторую дозу зкДНК-вектора, причем, например, в некоторых вариантах реализации количество вводимого зкДНК-вектора представляет собой титрованную дозу. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии трансгена определяют путем измерения уровня трансгена (например, измерения уровня белка и/или уровней мРНК), экспрессируемого из зкДНК-вектора в биологическом образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах реализации биологический образец выбирают из любого из: крови, плазмы, синовиальной жидкости, спинномозговой жидкости (CSF), слюны или образца биопсии ткани.

[00232] В некоторых вариантах реализации, когда зкДНК-вектор экспрессирует репортерный белок в дополнение к трансгену, кодирующему желаемый белок или терапевтический ген, уровень трансгена можно определить путем измерения уровня белка-репортера, экспрессируемого из зкДНК-вектора in vivo, используя методы, общеизвестные специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации титрование зкДНК-вектора определяет уровень трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, и введение субъекту второй дозы зкДНК-вектора для корректировки или модуляции экспрессии трансгена до предварительно определенного желаемого уровня.

III. зкДНК-вектор в целом

[00233] Варианты реализации изобретения основаны на способах и композициях, содержащих линейные дуплексные векторы с замкнутыми концами (зкДНК), которые могут экспрессировать трансген, как описано в данном документе. зкДНК-векторы, как описано в данном документе, не ограничены по размеру, что позволяет, например, экспрессировать все компоненты, необходимые для экспрессии трансгена, из одного вектора. зкДНК-вектор предпочтительно является дуплексным, например, самокомплементарным, по меньшей мере в части молекулы, такой как экспрессионная кассета (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой). зкДНК-вектор имеет ковалентно замкнутые концы и, таким образом, устойчив к экзонуклеазному гидролизу (например, экзонуклеазой I или экзонуклеазой III), например, в течение часа при 37°C. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, транслоцируется в ядро, где может происходить экспрессия трансгена в зкДНК-векторе, например, трансгена генетического лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, транслоцируется в ядро, где может происходить экспрессия трансгена, например, трансгена генетического лекарственного средства, расположенного между двумя ИКП.

[00234] Как правило, зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ИКП) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ИКП ААВ. Последовательности ИКП выбирают из любых из: (i) по меньшей мере, одного ИКП дикого типа (ИКП-ДТ) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора ААВ (мод-ИКП) (например, асимметричных модифицированных ИКП); (ii) двух модифицированных ИКП, причем пара мод-ИКП имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричных модифицированных ИКП), или (iii) пары симметричных или по существу симметричных ИКП ДТ-ДТ, причем каждый из ИКП-ДТ имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) пары симметричных или по существу симметричных модифицированных ИКП, причем каждый из мод-ИКП имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию.

[00235] Данный документ охватывает способы и композиции, содержащие зкДНК-вектор, которые могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, систему доставки на основе липосомных наночастиц. Неограничивающие примеры систем липосомных наночастиц, пригодных для использования, раскрыты в данном документе. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, содержащей зкДНК и ионизируемый липид. Например, состав липидных наночастиц, которые изготовлены и нагружены зкДНК-вектором, полученным указанным способом, раскрыт в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ.

[00236] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, не имеют ограничений, связанных с упаковкой, накладываемых ограниченным пространством внутри вирусного капсида. зкДНК-векторы представляют собой жизнеспособную эукариотически-продуцируемую альтернативу прокариотически-продуцируемым векторам плазмидной ДНК, в отличие от инкапсулированных геномов ААВ. Это позволяет вставлять контрольные элементы, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, большие трансгены, множественные трансгены и т.д.

[00237] Фиг.1А-1Е демонстрируют схемы неограничивающих примеров зкДНК-векторов, или соответствующей последовательности зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ИКП, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй ИКП. Экспрессионная кассета может включать одну или несколько регуляторных последовательностей, которые обеспечивают возможность проведения и/или контролируют экспрессию трансгена, например, в тех случаях, когда экспрессионная кассета может содержать что-то одно или несколько из следующего, в указанном порядке: энхансер/промотор, репортер ОРС (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(A) BGH).

[00238] Экспрессионная кассета также может содержать внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и/или 2А-элемент.Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, микроРНК-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ИКП может выступать в роли промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии указанного трансгена, например, регуляторные переключатели, которые описаны в данном документе в разделе «Регуляторные переключатели», для контроля и регуляции экспрессии указанного трансгена, и может включать, при необходимости, регуляторный переключатель, который представляет собой выключатель «kill switch», позволяющий обеспечивать контролируемую клеточную смерть клетки, содержащей зкДНК-вектор.

[00239] Указанная экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотидов, или 50000 нуклеотидов, или любой диапазон значений в пределах между примерно 4000-10000 нуклеотидов или 10000-50000 нуклеотидов, или более 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 75000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 1000 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 5000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру, характерных для инкапсидированных векторов ААВ, что позволяет доставлять экспрессионную кассету большого размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор лишен специфического прокариотического метилирования.

[00240] Экспрессионная кассета зкДНК может включать, например, экспрессируемую экзогенную последовательность (например, открытую рамку считывания) или трансген, кодирующие белок, который либо отсутствует, либо неактивен, либо обладает недостаточной активностью у субъекта-реципиента, или ген, который кодирует белок, имеющий желаемый биологический или терапевтический эффект.Трансген может кодировать продукт гена, который может выполнять функцию коррекции экспрессии дефектного гена или транскрипта. В принципе, экспрессионная кассета может включать любой ген, кодирующий белок, полипептид или РНК, который либо редуцирован, либо отсутствует из-за мутации, либо который приносит терапевтическую пользу, когда сверхэкспрессия считается включенной в объем изобретения.

[00241] Экспрессионная кассета может содержать любой трансген, полезный для лечения заболевания или расстройства у субъекта. зкДНК-вектор может быть использован для доставки и экспрессии любого представляющего интерес гена у субъекта, включая, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи, зрелые микроРНК и т.д.), а также экзогенные гены и нуклеотидные последовательности, включая вирусные последовательности в геноме субъектов, например, последовательности вируса ВИЧ и т.п.Предпочтительно, зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, используется в терапевтических целях (например, для медицинских, диагностических или ветеринарных применений), или иммуногенные полипептиды. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор пригоден для экспрессии у субъекта любого представляющего интерес гена, который включает один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов или РНК (кодирующих или некодирующих, например, миРНК, короткие шпилечные РНК (кшРНК), микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR)), антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию.

[00242] Экспрессионная кассета также может кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды, или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир)). Экспрессионные кассеты могут включать экзогенную последовательность, кодирующую репортерный белок, который будет использоваться для экспериментальных или диагностических целей, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хлорамфениколацетилтрансфераза (ХАТ), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области техники.

[00243] Последовательности, представленные в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте зкДНК-вектора, описанного в данном документе, могут быть кодон-оптимизированы для целевой клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках позвоночного животного, представляющего интерес, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ «Gene Forge®» фирмы «Aptagen» («Aptagen, Inc.», 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных.

[00244] В некоторых вариантах реализации трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии, как описано в данном документе, представляет собой терапевтический ген. В некоторых вариантах реализации терапевтический ген представляет собой антитело, или фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, или слитый белок. В некоторых вариантах реализации антитело или его слитый белок представляет собой активирующее антитело или нейтрализующее антитело, или фрагмент антитела и т.п.В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии генов содержит антитело или слитый белок, как описано в международном патенте PCT/US19/18016, поданном 14 февраля 2019 г., который включен в данный документ в качестве ссылки.

[00245] В частности, терапевтический ген представляет собой один или несколько терапевтических агентов, включая, без ограничений, например, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы) фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты, для использования в лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства. Типичные примеры терапевтических генов описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Способ лечения».

[00246] Существует много структурных особенностей зкДНК-векторов, которые отличаются от экспрессионных векторов на основе плазмид. зкДНК-векторы могут обладать одной или несколькими из следующих особенностей: отсутствие исходной (т.е. не вставленной) бактериальной ДНК, отсутствие прокариотической точки начала репликации, самодостаточность, т.е. они не требуют каких-либо последовательностей, кроме двух ИКП, включая сайты связывания Rep и концевого разрешения (RBS и TRS), и экзогенной последовательности между ИКП, наличие последовательностей ИКП, образующих шпильки, и отсутствие метилирования ДНК бактериального типа или какого-либо другого метилирования, считающегося аномальным у млекопитающего-хозяина. В целом, предпочтительно, чтобы предложенные векторы не содержали какой-либо прокариотической ДНК, однако предусматривается возможность вставки какой-либо прокариотической ДНК в виде экзогенной последовательности, в качестве неограничивающего примера, в промоторной или энхансерной области. Другой важной особенностью, отличающей зкДНК-векторы от плазмидных экспрессионных векторов, является то, что зкДНК-векторы представляют собой одноцепочечную линейную ДНК с замкнутыми концами, тогда как плазмиды всегда представляют собой двухцепочечную ДНК.

[00247] зкДНК-векторы, полученные способами, представленными в данном документе, предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, при определении с помощью анализа расщепления рестриктазой (Фиг.4D). Линейная и непрерывная структура считается более стабильной при воздействии клеточных эндонуклеаз, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Таким образом, зкДНК-вектор линейной и непрерывной структуры является предпочтительным вариантом реализации. Непрерывный линейный одноцепочечный зкДНК-вектор с внутримолекулярным дуплексом может иметь ковалентно связанные терминальные концы, без последовательностей, кодирующих капсидные белки ААВ. Такие зкДНК-векторы структурно отличаются от плазмид (включая зкДНК-плазмиды, описанные в данном документе), которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновой кислоты бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с образованием двух молекул нуклеиновой кислоты, в то время как зкДНК-векторы, напротив, хотя и имеют комплементарные цепи, представляют собой одну молекулу ДНК и потому остаются единой молекулой даже в денатурированном состоянии. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть получены без метилирования оснований ДНК по прокариотическому типу, в отличие от плазмид. Соответственно, зкДНК-векторы и зкДНК-плазмиды отличаются как структурой (в частности, линейной или кольцевой), так и способами, применяемыми для получения и очистки указанных отличающихся объектов (см. ниже), а также характером метилирования ДНК, которое происходит по прокариотическому типу в зкДНК-плазмидах и по эукариотическому типу в зкДНК-векторе.

[00248] Существует несколько преимуществ использования зкДНК-вектора, как описано в данном документе, по сравнению с экспрессионными векторами на основе плазмид, такие преимущества включают, без ограничений, следующие: 1) плазмиды содержат последовательности бактериальной ДНК и подвергаются специфическому прокариотическому метилированию, например, метилированию с образованием 6-метиладенозина и 5-метилцитозина, тогда как бескапсидные последовательности ААВ-вектора имеют эукариотическое происхождение и не подвергаются специфическому прокариотическому метилированию; в результате бескапсидные ААВ-векторы будут с меньшей вероятностью индуцировать воспалительные и иммунные ответы по сравнению с плазмидами; 2) если плазмиды требуют наличия гена устойчивости в процессе получения, то зкДНК-векторы - нет; 3) если кольцевая плазмида не доставляется в ядро при введении в клетку и требует избыточной нагрузки, чтобы избежать разложения клеточными нуклеазами, то зкДНК-векторы содержат вирусные цис-элементы, т.е. ИКП, придающие устойчивость к нуклеазам, и могут быть сконструированы для нацеливания и доставки в ядро. Было выдвинуто предположение, что минимальными определяющими элементами, обязательными для функции ИКП, являются Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 64) для ААВ2) плюс вариабельная палиндромная последовательность, обеспечивающая возможность образования шпильки; и 4) зкДНК-векторы не имеют часто наблюдаемой в плазмидах прокариотического происхождения чрезмерной представленности динуклеотидов CpG, которые, по имеющимся данным, связываются с представителем Toll-подобного семейства рецепторов, вызывая опосредованный T-клетками иммунный ответ.Напротив, трансдукция бескапсидными ААВ-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами ААВ, с применением различных реагентов для доставки.

IV. ИКП

[00249] Как раскрыто в данном документе, зкДНК-векторы для контролируемой экспрессии трансгена содержат трансген или гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), причем последовательности ИКП могут быть асимметричной парой ИКП или симметричной или по существу симметричной парой ИКП, как эти термины определены в данном документе. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может содержать последовательности ИКП, которые выбраны из любых из: (i) по меньшей мере одного ИКП дикого типа (ДТ) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (мод-ИКП) ААВ (например, асимметричных модифицированных ИКП); (ii) двух модифицированных ИКП, причем пара мод-ИКП имеет различную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричных модифицированных ИКП), или (iii) пары симметричных или по существу симметричных ИКП ДТ-ДТ, в которой каждый ИКП-ДТ имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) пары симметричных или по существу симметричных модифицированных ИКП, в которой каждый мод-ИКП имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, при этом способы по данному изобретению могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, система доставки на основе липосомных наночастиц.

[00250] В некоторых вариантах реализации последовательность ИКП может быть взята из вирусов семейства Parvoviridae, включающего два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют насекомых. Подсемейство Parvovirinae (называемое «парвовирусами») включает род депендовирусов (Dependovirus), представителям которого для продуктивной инфекции, в большинстве условий, требуется коинфекция хелперным вирусом, таким как аденовирус или герпесвирус.Род депендовирусов включает аденоассоциированный вирус (ААВ), обычно инфицирующий человека (например, серотипы 2, 3A, 3B, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы бычьих, собачьих, лошадиных и овечьих). Парвовирусы и другие представители семейства Parvoviridae в общем описаны в Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).

[00251] Хотя ИКП, приведенные для иллюстрации в данном документе в описании и Примерах, представляют собой ИКП-ДТ ААВ2, специалисту в данной области техники известно, что, как было указано выше, можно использовать ИКП из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как ААВ (например, из генома ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), химерные ИКП или ИКП из любого синтетического ААВ. В некоторых вариантах реализации ААВ может инфицировать теплокровных животных, например, аденоассоциированные вирусы птиц (AААВ), бычьих (BААВ), собачьих, лошадиных и овечьих. В некоторых вариантах реализации указанный ИКП взят из парвовируса B19 (GenBank, №доступа NC 000883), мелкого вируса мышей (MVM) (GenBank, №доступа NC 001510); парвовируса гусей (GenBank, №доступа NC 001701); парвовируса змей 1 (GenBank, №доступа NC 006148). В некоторых вариантах реализации 5'-ИКП-ДТ может принадлежать к одному серотипу, а 3'-ИКП-ДТ - к другому серотипу, как описано в данном документе.

[00252] Рядовому специалисту в данной области техники известно, что последовательности ИКП устроены однотипно и содержат двуцепочечную структуру Холлидея, которая, как правило, представляет собой T-образную или Y-образную шпилечную структуру (см., например, Фиг.2A и Фиг.3A), при этом каждый ИКП образован двумя палиндромными плечами или петлями (B-B’ и C-C’), встроенными в палиндромное плечо большего размера (A-A'), и одноцепочечной последовательностью D (где порядок указанных палиндромных последовательностей определяет направление ориентации ИКП). См., например, описание структурного анализа и сравнения последовательностей ИКП из разных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6) в источниках Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. Рядовой специалист в данной области техники может легко определить последовательности ИКП-ДТ из любого серотипа ААВ для применения в зкДНК-векторе или зкДНК-плазмиде, на основании примеров последовательностей ИКП ААВ2, приведенных в данном документе. См., например, сравнение последовательностей ИКП из различных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6 и ААВ птиц (AААВ) и ААВ крупного рогатого скота (BААВ)), описанное в Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; где приведены % идентичности левого ИКП ААВ2 и левых ИКП из других серотипов: ААВ-1 (84%), ААВ-3 (86%), ААВ-4 (79%), ААВ-5 (58%) ААВ-6 (левый ИКП) (100%) и ААВ-6 (правый ИКП) (82%).

А. Симметричные пары ИКП

[00253] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ИКП) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ИКП ААВ, причем первый ИКП (5'-ИКП) и второй ИКП (3'-ИКП) являются симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, т.е. зкДНК-вектор может содержать последовательности ИКП, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имела одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве. В таком варианте реализации пара симметричных ИКП или пара по существу симметричных ИКП может быть модифицированными ИКП (например, мод-ИКП), которые не являются ИКП дикого типа. Пара мод-ИКП может иметь одинаковые последовательности, которые имеют одну или несколько модификаций по сравнению с ИКП дикого типа, и являются обратно комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации пара модифицированных ИКП является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ИКП может иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму.

[00254] (i) ИКП дикого типа

[00255] В некоторых вариантах реализации симметричные ИКП или по существу симметричные ИКП относятся к дикому типу (ИКП-ДТ), как описано в данном документе. То есть, оба ИКП имеют последовательность дикого типа, но не должны обязательно быть ИКП-ДТ, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один ИКП-ДТ может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой ИКП-ДТ может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара ИКП-ДТ является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00256] Соответственно, как описано в данном документе, зкДНК-векторы для контролируемой экспрессии трансгена содержат трансген или гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (ИКП-ДТ), которые являются либо обратно комплементарными (инвертированными) относительно друг друга, либо, альтернативно, являются по существу симметричными друг относительно друга - т.е. пара ИКП-ДТ имеет симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации последовательность ИКП дикого типа (например, ИКП-ДТ ААВ) содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62).

[00257] В одном аспекте зкДНК-векторы для контролируемой экспрессии трансгена можно получить из векторного полинуклеотида, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя инвертированными концевыми последовательностями дикого типа (ИКП-ДТ) (например, ИКП-ДТ ААВ). То есть, оба ИКП имеют последовательность дикого типа, но не должны обязательно быть ИКП-ДТ, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один ИКП-ДТ может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой ИКП-ДТ может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара ИКП-ДТ является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации 5'-ИКП-ДТ относится к одному серотипу ААВ, а 3'-ИКП-ДТ относится к тому же или другому серотипу ААВ. В некоторых вариантах реализации 5'-ИКП-ДТ и 3'-ИКП-ДТ являются зеркальными отображениями друг друга, т.е. они симметричны. В некоторых вариантах реализации 5'-ИКП-ДТ и 3'-ИКП-ДТ относятся к одному и тому же серотипу ААВ.

[00258] ИКП дикого типа (ДТ) хорошо известны. В одном варианте реализации два ИКП относятся к одному и тому же серотипу ААВ2. В некоторых вариантах реализации можно использовать последовательности дикого типа (ДТ) из других серотипов. Существует ряд серотипов, которые являются гомологичными, например, ААВ2, ААВ4, ААВ6, ААВ8. В одном варианте реализации могут использоваться близко гомологичные ИКП (например, ИКП с аналогичной структурой петли). В другом варианте реализации можно использовать ИКП-ДТ ААВ с большей степенью различий, например, ААВ2 и ААВ5, и еще в одном варианте реализации можно использовать ИКП, который по существу относится к ДТ, т.е. он имеет базовую структуру петли, характерную для ДТ, но содержит некоторые консервативные замены нуклеотидов, которые не изменяют его свойства или не влияют на них. При использовании ИКП-ДТ из одного и того же вирусного серотипа может быть дополнительно использована одна или несколько регуляторных последовательностей. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность представляет собой регуляторный переключатель, который позволяет модулировать активность зкДНК.

[00259] В некоторых вариантах реализации один из аспектов технологии, описанной в данном документе, относится к зкДНК-вектору, содержащему по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя последовательности инвертированных концевых повторов дикого типа (ИКП-ДТ), причем ИКП-ДТ могут принадлежать к одному и тому же серотипу, разным серотипам, или быть по существу симметричными друг относительно друга (т.е. иметь симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве или имела одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве). В некоторых вариантах реализации симметричные ИКП-ДТ содержат функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.В некоторых вариантах реализации гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген и при этом вектор не заключен в вирусный капсид.

[00260] В некоторых вариантах реализации ИКП-ДТ являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг относительно друга. Например, последовательности AACG в 5'-ИКП может соответствовать CGTT (т.е. обратный комплемент) в соответствующем сайте 3'-ИКП. В одном примере смысловая цепь 5'-ИКП-ДТ содержит последовательность ATCGATCG, а соответствующая смысловая цепь 3'-ИКП-ДТ содержит CGATCGAT (т.е. обратный комплемент ATCGATCG). В некоторых вариантах реализации зкДНК с ИКП-ДТ дополнительно содержат сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, Rep-связывающий сайт.

[00261] Типичные последовательности ИКП-ДТ для использования в зкДНК-векторах для контролируемой экспрессии трансгена, содержащих ИКП-ДТ, приведены в Таблице 2 данного документа, где представлены пары ИКП-ДТ (5'-ИКП-ДТ и 3'-ИКП-ДТ).

[00262] В качестве типичного примера, данное изобретение предусматривает зкДНК-вектор, содержащий промотор, функционально связанный с трансгеном (например, гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты), с регуляторным переключателем или без него, при этом зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. Фиг.1F-1G), которая кодирует ИКП-ДТ, причем каждый ИКП-ДТ имеет одинаковое количество пар оснований внутримолекулярных дуплексов во вторичной конфигурации своей шпильки (предпочтительно, исключая делецию любой концевой петли AAA или TTT в этой конфигурации по сравнению с такими референсными последовательностями), и (b) идентифицируется как зкДНК с использованием анализа идентификации зкДНК методом электрофореза на агарозном геле с нативным гелем и в денатурирующих условиях, описанным в Примере 1.

[00263] В некоторых вариантах реализации фланкирующие ИКП-ДТ по существу симметричны друг другу. В этом варианте реализации 5'-ИКП-ДТ может принадлежать к одному серотипу ААВ, а 3'-ИКП-ДТ - к другому серотипу ААВ, так что ИКП-ДТ не являются идентичными обратными комплементами. Например, 5'-ИКП-ДТ может принадлежать к ААВ2, а 3' ИКП-ДТ - к другому серотипу (например, ААВ1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12). В некоторых вариантах реализации ИКП-ДТ могут быть выбраны из двух разных парвовирусов, выбранных из любых из: ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, парвовируса свиней или ААВ насекомых. В некоторых вариантах реализации такая комбинация ИКП-ДТ является комбинацией ИКП-ДТ из ААВ2 и ААВ6. В одном варианте реализации, ИКП-ДТ являются по существу симметричными, когда один из них является инвертированным относительно другого ИКП, идентичного на по меньшей мере 90%, идентичного на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%... 97%... 98%... 99%... 99,5%, включая все промежуточные значения, и имеет такую же симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации пара ИКП-ДТ является по существу симметричной, поскольку они имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, например, имеют одинаковую трехмерную организацию A, C-C', B-B' и D-плеч. В одном варианте реализации, по существу симметричная пара ИКП-ДТ инвертирована друг относительно друга и идентична на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96%... 97%... 98%... 99%.... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один ИКП-ДТ сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs). В некоторых вариантах реализации, по существу симметричная пара ИКП-ДТ инвертирована друг относительно друга, и является по меньшей мере на 95% идентичными, по меньшей мере на 96%... 97%... 98%... 99%.... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один ИКП-ДТ сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs), в дополнение к вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей сформировать вторичную структуру шпильки. Гомология может быть определена стандартными средствами, хорошо известными в данной области техники, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)), BLASTN, при настройках по умолчанию.

[00264] В некоторых вариантах реализации структурным элементом ИКП может быть любой структурный элемент, который участвует в функциональном взаимодействии ИКП с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). В некоторых вариантах реализации указанный структурный элемент обеспечивает селективность взаимодействия ИКП с большим белком Rep, т.е. определяет, по меньшей мере отчасти, какой белок Rep функционально взаимодействует с ИКП. В других вариантах реализации структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ИКП. Каждый структурный элемент может быть, например, вторичной структурой ИКП, нуклеотидной последовательностью ИКП, промежуточной последовательностью между двумя или более элементами, или комбинацией любых из вышеперечисленных элементов. В одном варианте реализации указанные структурные элементы выбраны из группы, состоящей из плеча A и плеча A’, плеча B и плеча B’, плеча C и плеча C’, плеча D, Rep-связывающего сайта (RBE) и RBE’ (т.е. последовательности, комплементарной RBE), и сайта концевого разрешения (trs).

[00265] Только в качестве примера, в Таблице 1 представлены примеры комбинаций ИКП-ДТ.

[00266] Таблица 1: Иллюстративные примеры комбинаций ИКП-ДТ одного и того же серотипа, или разных серотипов, или разных парвовирусов. Приведенный порядок не указывает на положение ИКП, например, «ААВ1, ААВ2» означает, что зкДНК может содержать ИКП-ДТ ААВ1 в положении 5' и ИКП-ДТ ААВ2 в положении 3' или, наоборот, ИКП-ДТ ААВ2 в положении 5' и ИКП-ДТ ААВ1 в положении 3'. Сокращения: ААВ серотипа 1 (ААВ1), ААВ серотипа 2 (ААВ2), ААВ серотипа 3 (ААВ3), ААВ серотипа 4 (ААВ4), ААВ серотипа 5 (ААВ5), ААВ серотипа 6 (ААВ6), ААВ серотипа 7 (ААВ7), ААВ серотипа 8 (ААВ8), ААВ серотипа 9 (ААВ9), ААВ серотипа 10 (ААВ10), ААВ серотипа 11 (ААВ11) или ААВ серотипа 12 (ААВ12); геном ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8 (например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ИКП теплокровных животных (птичий ААВ (AААВ), бычий ААВ (ААВ крупного рогатого скота) (BААВ), ААВ собак, лошадей и овец), ИКП парвовируса B19 (GenBank, №доступа: NC 000883), мелкого вируса мышей (MVM) (GenBank, №доступа NC 001510); гуси: парвовирус гусей (GenBank, №доступа NC 001701); змеи: змеиный парвовирус 1 (GenBank, №доступа NC 006148).

[00267] Таблица 1

ААВ1, ААВ1 ААВ2, ААВ2 ААВ3, ААВ3 ААВ4, ААВ4 ААВ5, ААВ5 ААВ1, ААВ2 ААВ2, ААВ3 ААВ3, ААВ4 ААВ4, ААВ5 ААВ5, ААВ6 ААВ1, ААВ3 ААВ2, ААВ4 ААВ3, ААВ5 ААВ4, ААВ6 ААВ5, ААВ7 ААВ1, ААВ4 ААВ2, ААВ5 ААВ3, ААВ6 ААВ4, ААВ7 ААВ5, ААВ8 ААВ1, ААВ5 ААВ2, ААВ6 ААВ3, ААВ7 ААВ4, ААВ8 ААВ5, ААВ9 ААВ1, ААВ6 ААВ2, ААВ7 ААВ3, ААВ8 ААВ4, ААВ9 ААВ5, ААВ10 ААВ1, ААВ7 ААВ2, ААВ8 ААВ3, ААВ9 ААВ4, ААВ10 ААВ5, ААВ11 ААВ1, ААВ8 ААВ2, ААВ9 ААВ3, ААВ10 ААВ4, ААВ11 ААВ5, ААВ12 ААВ1, ААВ9 ААВ2, ААВ10 ААВ3, ААВ11 ААВ4, ААВ12 ААВ5, ААВrh8 ААВ1, ААВ10 ААВ2, ААВ11 ААВ3, ААВ12 ААВ4, ААВrh8 ААВ5, ААВrh10 ААВ1, ААВ11 ААВ2, ААВ12 ААВ3, ААВrh8 ААВ4, ААВrh10 ААВ5, ААВ13 ААВ1, ААВ12 ААВ2, ААВrh8 ААВ3, ААВrh10 ААВ4, ААВ13 ААВ5, ААВ-DJ ААВ1, ААВrh8 ААВ2, ААВrh10 ААВ3, ААВ13 ААВ4, ААВ-DJ ААВ5, ААВ-DJ8 ААВ1, ААВrh10 ААВ2, ААВ13 ААВ3, ААВ-DJ ААВ4, ААВ-DJ8 ААВ5, ПТИЧИЙ ААВ1, ААВ13 ААВ2, ААВ-DJ ААВ3, ААВ-DJ8 ААВ4, ПТИЧИЙ ААВ5, БЫЧИЙ ААВ1, ААВ-DJ ААВ2, ААВ-DJ8 ААВ3, ПТИЧИЙ ААВ4, БЫЧИЙ ААВ5, СОБАЧИЙ ААВ1, ААВ-DJ8 ААВ2, ПТИЧИЙ ААВ3, БЫЧИЙ ААВ4, СОБАЧИЙ ААВ5, ЛОШАДЕЙ ААВ1, ПТИЧИЙ ААВ2, БЫЧИЙ ААВ3, СОБАЧИЙ ААВ4, ЛОШАДЕЙ ААВ5, КОЗИЙ ААВ1, БЫЧИЙ ААВ2, СОБАЧИЙ ААВ3, ЛОШАДЕЙ ААВ4, КОЗИЙ ААВ5, КРЕВЕТОК ААВ1, СОБАЧИЙ ААВ2, ЛОШАДЕЙ ААВ3, КОЗИЙ ААВ4, КРЕВЕТОК ААВ5, СВИНЕЙ ААВ1, ЛОШАДЕЙ ААВ2, КОЗИЙ ААВ3, КРЕВЕТОК ААВ4, СВИНЕЙ ААВ5, НАСЕКОМЫХ ААВ1, КОЗИЙ ААВ2, КРЕВЕТОК ААВ3, СВИНЕЙ ААВ4, НАСЕКОМЫХ ААВ5, ОВЕЦ ААВ1, КРЕВЕТОК ААВ2, СВИНЕЙ ААВ3, НАСЕКОМЫХ ААВ4, ОВЕЦ ААВ5, B19 ААВ1, СВИНЕЙ ААВ2, НАСЕКОМЫХ ААВ3, ОВЕЦ ААВ4, B19 ААВ5, MVM ААВ1, НАСЕКОМЫХ ААВ2, ОВЕЦ ААВ3, B19 ААВ4, MVM ААВ5, ГУСЕЙ ААВ1, ОВЕЦ ААВ2, B19 ААВ3, MVM ААВ4, ГУСЕЙ ААВ5, ЗМЕЙ ААВ1, B19 ААВ2, MVM ААВ3, ГУСЕЙ ААВ4, ЗМЕЙ ° ААВ1, MVM ААВ2, ГУСЕЙ ААВ3, ЗМЕЙ ° ° ААВ1, ГУСЕЙ ААВ2, ЗМЕЙ ° ° ° ААВ1, ЗМЕЙ ° ° ° ° ААВ6, ААВ6 ААВ7, ААВ7 ААВ8, ААВ8 ААВ9, ААВ9 ААВ10, ААВ10 ААВ6, ААВ7 ААВ7, ААВ8 ААВ8, ААВ9 ААВ9, ААВ10 ААВ10, ААВ11 ААВ6, ААВ8 ААВ7, ААВ9 ААВ8, ААВ10 ААВ9, ААВ11 ААВ10, ААВ12 ААВ6, ААВ9 ААВ7, ААВ10 ААВ8, ААВ11 ААВ9, ААВ12 ААВ10, ААВrh8 ААВ6, ААВ10 ААВ7, ААВ11 ААВ8, ААВ12 ААВ9, ААВrh8 ААВ10, ААВrh10 ААВ6, ААВ11 ААВ7, ААВ12 ААВ8, ААВrh8 ААВ9, ААВrh10 ААВ10, ААВ13 ААВ6, ААВ12 ААВ7, ААВrh8 ААВ8, ААВrh10 ААВ9, ААВ13 ААВ10, ААВ-DJ ААВ6, ААВrh8 ААВ7, ААВrh10 ААВ8, ААВ13 ААВ9, ААВ-DJ ААВ10, ААВ-DJ8 ААВ6, ААВrh10 ААВ7, ААВ13 ААВ8, ААВ-DJ ААВ9, ААВ-DJ8 ААВ10, ПТИЧИЙ ААВ6, ААВ13 ААВ7, ААВ-DJ ААВ8, ААВ-DJ8 ААВ9, ПТИЧИЙ ААВ10, БЫЧИЙ ААВ6, ААВ-DJ ААВ7, ААВ-DJ8 ААВ8, ПТИЧИЙ ААВ9, БЫЧИЙ ААВ10, СОБАЧИЙ ААВ6, ААВ-DJ8 ААВ7, ПТИЧИЙ ААВ8, БЫЧИЙ ААВ9, СОБАЧИЙ ААВ10, ЛОШАДЕЙ ААВ6, ПТИЧИЙ ААВ7, БЫЧИЙ ААВ8, СОБАЧИЙ ААВ9, ЛОШАДЕЙ ААВ10, КОЗИЙ ААВ6, БЫЧИЙ ААВ7, СОБАЧИЙ ААВ8, ЛОШАДЕЙ ААВ9, КОЗИЙ ААВ10, КРЕВЕТОК ААВ6, СОБАЧИЙ ААВ7, ЛОШАДЕЙ ААВ8, КОЗИЙ ААВ9, КРЕВЕТОК ААВ10, СВИНЕЙ ААВ6, ЛОШАДЕЙ ААВ7, КОЗИЙ ААВ8, КРЕВЕТОК ААВ9, СВИНЕЙ ААВ10, НАСЕКОМЫХ ААВ6, КОЗИЙ ААВ7, КРЕВЕТОК ААВ8, СВИНЕЙ ААВ9, НАСЕКОМЫХ ААВ10, ОВЕЦ ААВ6, КРЕВЕТОК ААВ7, СВИНЕЙ ААВ8, НАСЕКОМЫХ ААВ9, ОВЕЦ ААВ10, B19 ААВ6, СВИНЕЙ ААВ7, НАСЕКОМЫХ ААВ8, ОВЕЦ ААВ9, B19 ААВ10, MVM ААВ6, НАСЕКОМЫХ ААВ7, ОВЕЦ ААВ8, B19 ААВ9, MVM ААВ10, ГУСЕЙ ААВ6, ОВЕЦ ААВ7, B19 ААВ8, MVM ААВ9, ГУСЕЙ ААВ10, ЗМЕЙ ААВ6, B19 ААВ7, MVM ААВ8, ГУСЕЙ ААВ9, ЗМЕЙ ° ААВ6, MVM ААВ7, ГУСЕЙ ААВ8, ЗМЕЙ ° ° ААВ6, ГУСЕЙ ААВ7, ЗМЕЙ ° ° ° ААВ6, ЗМЕЙ ° ° ° ° ААВ11, ААВ11 ААВ12, ААВ12 ААВrh8, ААВrh8 ААВrh10, ААВrh10 ААВ13, ААВ13 ААВ11, ААВ12 ААВ12, ААВrh8 ААВrh8, ААВrh10 ААВrh10, ААВ13 ААВ13, ААВ-DJ ААВ11, ААВrh8 ААВ12, ААВrh10 ААВrh8, ААВ13 ААВrh10, ААВ-DJ ААВ13, ААВ-DJ8 ААВ11, ААВrh10 ААВ12, ААВ13 ААВrh8, ААВ-DJ ААВrh10, ААВ-DJ8 ААВ13, ПТИЧИЙ ААВ11, ААВ13 ААВ12, ААВ-DJ ААВrh8, ААВ-DJ8 ААВrh10, ПТИЧИЙ ААВ13, БЫЧИЙ ААВ11, ААВ-DJ ААВ12, ААВ-DJ8 ААВrh8, ПТИЧИЙ ААВrh10, БЫЧИЙ ААВ13, СОБАЧИЙ ААВ11, ААВ-DJ8 ААВ12, ПТИЧИЙ ААВrh8, БЫЧИЙ ААВrh10, СОБАЧИЙ ААВ13, ЛОШАДЕЙ ААВ11, ПТИЧИЙ ААВ12, БЫЧИЙ ААВrh8, СОБАЧИЙ ААВrh10, ЛОШАДЕЙ ААВ13, КОЗИЙ ААВ11, БЫЧИЙ ААВ12, СОБАЧИЙ ААВrh8, ЛОШАДЕЙ ААВrh10, КОЗИЙ ААВ13, КРЕВЕТОК ААВ11, СОБАЧИЙ ААВ12, ЛОШАДЕЙ ААВrh8, КОЗИЙ ААВrh10, КРЕВЕТОК ААВ13, СВИНЕЙ ААВ11, ЛОШАДЕЙ ААВ12, КОЗИЙ ААВrh8, КРЕВЕТОК ААВrh10, СВИНЕЙ ААВ13, НАСЕКОМЫХ ААВ11, КОЗИЙ ААВ12, КРЕВЕТОК ААВrh8, СВИНЕЙ ААВrh10, НАСЕКОМЫХ ААВ13, ОВЕЦ ААВ11, КРЕВЕТОК ААВ12, СВИНЕЙ ААВrh8, НАСЕКОМЫХ ААВrh10, ОВЕЦ ААВ13, B19 ААВ11, СВИНЕЙ ААВ12, НАСЕКОМЫХ ААВrh8, ОВЕЦ ААВrh10, B19 ААВ13, MVM ААВ11, НАСЕКОМЫХ ААВ12, ОВЕЦ ААВrh8, B19 ААВrh10, MVM ААВ13, ГУСЕЙ ААВ11, ОВЕЦ ААВ12, B19 ААВrh8, MVM ААВrh10, ГУСЕЙ ААВ13, ЗМЕЙ ААВ11, B19 ААВ12, MVM ААВrh8, ГУСЕЙ ААВrh10, ЗМЕЙ   ААВ11, MVM ААВ12, ГУСЕЙ ААВrh8, ЗМЕЙ     ААВ11, ГУСЕЙ ААВ12, ЗМЕЙ       ААВ11, ЗМЕЙ         ААВ-DJ, ААВ-DJ ААВ-DJ8, AVVDJ8 ПТИЧИЙ, ПТИЧИЙ БЫЧИЙ, БЫЧИЙ СОБАЧИЙ, СОБАЧИЙ ААВ-DJ, ААВ-DJ8 ААВ-DJ8, ПТИЧИЙ ПТИЧИЙ, БЫЧИЙ БЫЧИЙ, СОБАЧИЙ СОБАЧИЙ, ЛОШАДЕЙ ААВ-DJ, ПТИЧИЙ ААВ-DJ8, БЫЧИЙ ПТИЧИЙ, СОБАЧИЙ БЫЧИЙ, ЛОШАДЕЙ СОБАЧИЙ, КОЗИЙ ААВ-DJ, БЫЧИЙ ААВ-DJ8, СОБАЧИЙ ПТИЧИЙ, ЛОШАДЕЙ БЫЧИЙ, КОЗИЙ СОБАЧИЙ, КРЕВЕТОК ААВ-DJ, СОБАЧИЙ ААВ-DJ8, ЛОШАДЕЙ ПТИЧИЙ, КОЗИЙ БЫЧЬЯ, КРЕВЕТОК СОБАЧИЙ, СВИНЕЙ ААВ-DJ, ЛОШАДЕЙ ААВ-DJ8, КОЗИЙ ПТИЧИЙ, КРЕВЕТОК КОРОВ, СВИНЕЙ СОБАЧИЙ, НАСЕКОМЫХ ААВ-DJ, КОЗИЙ ААВ-DJ8, КРЕВЕТОК ПТИЧИЙ, СВИНЕЙ БЫЧИЙ, НАСЕКОМЫХ СОБАЧИЙ, ОВЕЦ ААВ-DJ, КРЕВЕТОК ААВ-DJ8, СВИНЕЙ ПТИЧИЙ, НАСЕКОМЫХ БЫЧИЙ, ОВЕЦ СОБАЧИЙ, B19 ААВ-DJ, СВИНЕЙ ААВ-DJ8, НАСЕКОМЫХ ПТИЧИЙ, ОВЕЦ БЫЧИЙ, B19 СОБАЧИЙ, MVM ААВ-DJ, НАСЕКОМЫХ ААВ-DJ8, ОВЕЦ ПТИЧИЙ, B19 БЫЧИЙ, MVM СОБАЧИЙ, ГУСЕЙ ААВ-DJ, ОВЕЦ ААВ-DJ8, B19 ПТИЧИЙ, MVM БЫЧИЙ, ГУСЕЙ СОБАЧИЙ, ЗМЕЙ ААВ-DJ, B19 ААВ-DJ8, MVM ПТИЧИЙ, ГУСЕЙ БЫЧИЙ, ЗМЕЙ ° ААВ-DJ, MVM ААВ-DJ8, ГУСЕЙ ПТИЧИЙ, ЗМЕЙ ° ° ААВ-DJ, ГУСЕЙ ААВ-DJ8, ЗМЕЙ ° ° ° ААВ-DJ, ЗМЕЙ ° ° ° ° ЛОШАДЕЙ, ЛОШАДЕЙ КОЗИЙ, КОЗИЙ КРЕВЕТОК, КРЕВЕТОК СВИНЕЙ, СВИНЕЙ НАСЕКОМЫХ, НАСЕКОМЫХ ЛОШАДЕЙ, КОЗИЙ КОЗИЙ, КРЕВЕТОК КРЕВЕТОК, СВИНЕЙ СВИНЕЙ, НАСЕКОМЫХ НАСЕКОМЫХ, ОВЕЦ ЛОШАДЕЙ, КРЕВЕТОК КОЗИЙ, СВИНЕЙ КРЕВЕТОК, НАСЕКОМЫХ СВИНЕЙ, ОВЕЦ НАСЕКОМЫХ, B19 ЛОШАДЕЙ, СВИНЕЙ КОЗИЙ, НАСЕКОМЫХ КРЕВЕТОК, ОВЕЦ СВИНЕЙ, B19 НАСЕКОМЫХ, MVM ЛОШАДЕЙ, НАСЕКОМЫХ КОЗИЙ, ОВЕЦ КРЕВЕТОК, B19 СВИНЕЙ, MVM НАСЕКОМЫХ, ГУСЕЙ ЛОШАДЕЙ, ОВЕЦ КОЗИЙ, B19 КРЕВЕТОК, MVM СВИНЕЙ, ГУСЕЙ НАСЕКОМЫХ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, B19 КОЗИЙ, MVM КРЕВЕТОК, ГУСЕЙ СВИНЕЙ, ЗМЕЙ ° ЛОШАДЕЙ, MVM КОЗИЙ, ГУСЕЙ КРЕВЕТОК, ЗМЕЙ ° ° ЛОШАДЕЙ, ГУСЕЙ КОЗИЙ, ЗМЕЙ ° ° ° ЛОШАДЕЙ, ЗМЕЙ ° ° ° ° ОВЕЦ, ОВЕЦ B19, B19 MVM, MVM ГУСЕЙ, ГУСЕЙ ЗМЕЙ, ЗМЕЙ ОВЕЦ, B19 B19, MVM MVM, ГУСЕЙ ГУСЕЙ, ЗМЕЙ ° ОВЕЦ, MVM B19, ГУСЕЙ MVM, ЗМЕЙ ° ° ОВЕЦ, ГУСЕЙ B19, ЗМЕЙ ° ° ° ОВЕЦ, ЗМЕЙ ° ° ° °

[00268] Только в качестве примера, в Таблице 2 приведены последовательности типичных ИКП-ДТ из некоторых разных серотипов ААВ.

[00269] Таблица 2

[00270] В некоторых вариантах реализации нуклеотидная последовательность ИКП-ДТ может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений в указанных пределах), причем модификация представляет собой замену на комплементарный нуклеотид. например, G на C и наоборот, и T на A и наоборот.

[00271] В определенных вариантах реализации данного изобретения синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не имеет ИКП-ДТ, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любой из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14. В альтернативных вариантах реализации данного изобретения, если зкДНК-вектор имеет ИКП-ДТ, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из любого из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14, то фланкирующий ИКП также относится к дикому типу (ДТ), и зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, например, как описано в данном документе и в международной заявке PCT/US18/49996 (например, см. Таблицу 11 в PCT/US18/49996). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и выбранный ИКП-ДТ имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из любого члена группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14.

[00272] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуры ИКП-ДТ, которые сохраняют функциональные части RBE, trs и RBE'. На Фиг.2А и Фиг.2B продемонстрирован, с использованием для иллюстрации ИКП дикого типа, один из возможных механизмов функционирования сайта trs в части структуры ИКП дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей ИКП-ДТ, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИКП-ДТ является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, когда зкДНК-вектор содержит два ИКП-ДТ, которые являются по существу симметричными друг другу, по меньшей мере один ИКП-ДТ является функциональным, и по меньшей мере один ИКП-ДТ является нефункциональным.

B. Модифицированные ИКП (мод-ИКП) в целом для зкДНК-векторов для контролируемой экспрессии трансгена, содержащих асимметричные пары ИКП или симметричные пары ИКП

[00273] Как описано в данном документе, зкДНК-вектор может содержать симметричную пару ИКП или асимметричную пару ИКП. В обоих случаях один или оба из ИКП могут быть модифицированными ИКП - различие заключается в том, что в первом случае (т.е. симметричные мод-ИКП) указанные мод-ИКП имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют одинаковые конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч), тогда как во втором случае (т.е. асимметричные мод-ИКП) указанные мод-ИКП имеют разную трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют разные конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч).

[00274] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП представляет собой ИКП, который модифицируют путем делеции, вставки и/или замещения по сравнению с последовательностью ИКП дикого типа (например, ИКП ААВ). В некоторых вариантах по меньшей мере один из ИКП в зкДНК-векторе содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62). В одном варианте реализации, по меньшей мере один из ИКП является нефункциональным ИКП. В одном варианте реализации каждый из разных или модифицированных ИКП не является ИКП дикого типа из разных серотипов.

[00275] Конкретные изменения и мутации в ИКП подробно описаны в данном документе, но в контексте «измененных» или «мутированных» или «модифицированных» ИКП, эти определения указывают на то, что нуклеотиды были вставлены, удалены и/или замещены относительно принадлежащей к дикому типу, референсной или исходной последовательности ИКП. Измененный или мутированный ИКП может быть рекомбинантным ИКП. Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к аспекту проведения манипуляций человеком. Например, полипептид считается «рекомбинантным», когда по меньшей мере один аспект полипептида, например, его последовательность, был подвергнут манипуляциям со стороны человека для создания отличий от аспекта, в котором он существует в природе.

[00276] В некоторых вариантах реализации мод-ИКП может быть синтетическим. В одном варианте реализации синтетический ИКП основан на последовательностях ИКП из более чем одного серотипа ААВ. В другом варианте реализации синтетический ИКП не включает последовательность на основе ААВ. В еще одном варианте реализации синтетический ИКП сохраняет структуру ИКП, описанную выше, хотя имеет лишь некоторые последовательности из ААВ или не имеет таких последовательностей. В некоторых аспектах синтетический ИКП может взаимодействовать преимущественно с Rep дикого типа или с Rep определенного серотипа, или, в некоторых случаях, не будет распознаваться Rep дикого типа и будет распознаваться только мутированным Rep.

[00277] Специалист в данной области техники может определить соответствующую последовательность в других серотипах известными способами. Например, путем определения того, находится ли изменение в области A, A', B, B', C, C' или D, и определения соответствующей области в другом серотипе. Можно использовать BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) или другие программы выравнивания для определения гомологии с настройками по умолчанию для определения соответствующей последовательности. Данное изобретение дополнительно предусматривает популяции и множества зкДНК-векторов для контролируемой экспрессии трансгена, содержащих мод-ИКП из комбинации различных серотипов ААВ, т.е. один мод-ИКП может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой мод-ИКП может принадлежать к другому серотипу. Не связываясь какой-либо теорией, укажем, что в одном варианте реализации один ИКП может быть взят из последовательности ИКП ААВ2 или быть на ней основан, а другой ИКП зкДНК-вектора может быть взят из или быть основан на любой одной или нескольких последовательностях ИКП серотипа 1 ААВ (ААВ1), серотипа 4 ААВ (ААВ4), серотипа 5 ААВ (ААВ5), серотипа 6 ААВ (ААВ6), серотипа 7 ААВ (ААВ7), серотипа 8 ААВ (ААВ8), серотипа 9 ААВ (ААВ9), серотипа 10 ААВ (ААВ10), серотипа 11 ААВ (ААВ11) или серотипа 12 ААВ (ААВ12).

[00278] Любой парвовирусный ИКП может использоваться как ИКП или в качестве базового ИКП для модификации. Предпочтительно, парвовирус представляет собой депендовирус.Более предпочтительно - ААВ. Выбор серотипа может быть основан на тканевом тропизме серотипа. ААВ2 обладает тропизмом к широкому ряду тканей, ААВ1 преимущественно нацелен на нервную ткань и скелетные мышцы, а ААВ5 преимущественно нацелен на нервную ткань, пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы. ААВ6 преимущественно нацелен на скелетные мышцы и легкие. ААВ8 преимущественно нацелен на печень, скелетные мышцы, сердце и ткани поджелудочной железы. ААВ9 преимущественно направлен на печень, скелетные мышцы и ткани легких. В одном варианте реализации модифицированный ИКП основан на ИКП ААВ2.

[00279] Более конкретно, способность структурного элемента функционально взаимодействовать с конкретным большим белком Rep можно изменить путем модификации структурного элемента. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована по сравнению с последовательностью ИКП дикого типа. В одном варианте реализации структурный элемент (например, плечо A, плечо A', плечо B, плечо B', плечо C, плечо C', плечо D, RBE, RBE' и trs) ИКП может быть удален и заменен структурным элементом дикого типа из другого парвовируса. Например, заменяющая структура может быть взята из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадиных, парвовируса креветок, свиного парвовируса или ААВ насекомых. Например, ИКП может представлять собой ИКП ААВ2, и плечо A или A’, или RBE могут быть заменены структурным элементом из ААВ5. В другом примере, ИКП может представлять собой ИКП ААВ5, а плечи C или C’, RBE и trs могут быть заменены структурным элементом из ААВ2. В другом примере ИКП ААВ может представлять собой ИКП ААВ5, в котором плечи B и B’ заменены плечами B и B’ ИКП ААВ2.

[00280] Только в качестве примера, в Таблице 3 приведены примеры модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, вставки и/или замены) в областях модифицированных ИКП, где X указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, вставку и/или замену) в указанном отделе относительно соответствующего ИКП дикого типа. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) в любой из областей C и/или C’ и/или B и/или B’ сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) в по меньшей мере одной концевой петле. Например, если модификация приводит к чему-либо из: ИКП с единственным плечом (например, с единственным плечом C-C’ или единственным плечом B-B’), или с модифицированным плечом C-B’ или плечом C’-B, или ИКП с двумя плечами, содержащего по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо C-C’ и/или усеченное плечо B-B’), то по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плечей ИКП с двумя плечами (у которого одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации усеченное плечо C-C’ и/или усеченное плечо B-B’ содержит три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) в концевой петле.

[00281] Таблица 3: Примеры комбинаций модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, вставки и/или замены) в разных областях или плечах B-B’ и C-C’ ИКП (X указывает на модификацию нуклеотида, например, добавление, делецию или замену по меньшей мере одного нуклеотида в указанной области).

Область B Область B' Область С Область C' X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

[00282] В некоторых вариантах реализации мод-ИКП для использования в зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ИКП или симметричную пару мод-ИКП, как описано в данном документе, может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: между A' и C, между C и C', между C' и B, между B и B' и между B' и A. В некоторых вариантах реализации, любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) в областях C или C' или B или B' все еще сохраняет концевую петлю структуры стебель-петля. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В альтернативных вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида A (т.е. AAA) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в любой из одной или нескольких областях, выбранных из: A', A и/или D. Например, в некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А и/или A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области D.

[00283] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов или любого диапазона значений) для получения модифицированного структурного элемента. Примеры конкретных модификаций ИКП согласно одному варианту реализации приведены в данном документе (например, SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или представлены на Фиг.7A-7B заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.(например, SEQ ID NO: 97-98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54 в PCT/US2018/064242). В некоторых вариантах реализации ИКП может быть модифицирован (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов или любого диапазона указанных значений). В других вариантах реализации ИКП может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичности последовательностей с одним из модифицированных ИКП из SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или RBE-содержащего отдела плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' согласно SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или приведенных в Таблицах 2-9 (т.е. SEQ ID NO: 110-112, 115-190, 200-468) международной заявки PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00284] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может, например, содержать удаление или делецию всего конкретного плеча, например, всего или части плеча A-A', или всего или части плеча B-B', или всего или части плеча C-C' или, альтернативно, удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований, образующих стебель петли, при условии сохранения присутствия кэпирующей петли на конце стебля (например, одного плеча) (например, см. ИКП-21 на Фиг.7A заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' (см., например, ИКП-1 на Фиг.3B или ИКП-45 на Фиг.7А заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может включать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' и удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. Предусматривается любая комбинация удалений пар оснований, например, могут быть удалены 6 пар оснований в плече C-C' и 2 пары оснований в плече B-B'. В качестве иллюстративного примера, Фиг.3B демонстрирует пример модифицированного ИКП с делецией по меньшей мере 7 пар оснований из каждой из части C и части C', заменой нуклеотида в петле между областью C и C', и делецией по меньшей мере одной пары оснований из каждой из области B и области B', так что модифицированный ИКП содержит два плеча, по меньшей мере одно из которых (например, C-C') является усеченным. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП также содержит по меньшей мере одну делецию пары оснований из каждой из области B и области B', так что плечо B-B' также является усеченным относительно ИКП дикого типа.

[00285] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может иметь от 1 до 50 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ИКП дикого типа. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП может иметь от 1 до 30 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ИКП-ДТ. В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП имеет от 2 до 20 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ИКП дикого типа.

[00286] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП не содержит каких-либо нуклеотидных делеций в RBE-содержащей части областей A или A', чтобы не препятствовать репликации ДНК (например, связыванию белка Rep с RBE или никированию в сайте концевого разрешения). В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП, пригодный для использования по данному изобретению, имеет одну или несколько делеций в области B, B', C и/или C, как описано в данном документе.

[00287] В некоторых вариантах реализации, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, содержащий симметричную пару ИКП или асимметричную пару ИКП, содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и по меньшей мере один модифицированный ИКП, выбранный из имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187.

[00288] В другом варианте реализации структура структурного элемента может быть модифицирована. Например, структурный элемент (имеет) измененную высоту стебля и/или количество нуклеотидов в петле. Например, высота стебля может составлять примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов или более, или соответствовать любому диапазону значений. В одном варианте реализации стебель может иметь высоту от примерно 5 нуклеотидов до примерно 9 нуклеотидов и функционально взаимодействовать с Rep.В другом варианте реализации стебель может иметь высоту около 7 нуклеотидов и функционально взаимодействовать с Rep.В другом примере петля может иметь 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00289] В другом варианте реализации, число сайтов связывания GAGY или связанных с GAGY сайтов связывания в пределах RBE или расширенного RBE может быть увеличено или уменьшено. В одном примере, RBE или расширенный RBE может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более сайтов связывания GAGY или любой диапазон указанных значений. Каждый сайт связывания GAGY может независимо представлять собой точную последовательность GAGY или последовательность, аналогичную GAGY, при условии, что эта последовательность является достаточной для связывания белка Rep.

[00290] В другом варианте реализации промежуток между двумя элементами (такими как, без ограничений, RBE и шпилька) может быть изменен (например, увеличен или уменьшен), для изменения функционального взаимодействия с большим белком Rep.Например, указанный промежуток может составлять приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00291] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуру ИКП, которая модифицирована относительно структуры ИКП ААВ2 дикого типа, раскрытой в данном документе, но все еще сохраняет функциональную часть RBE, trs и RBE'. На Фиг.2А и Фиг.2B продемонстрирован один из возможных механизмов работы сайта trs в части структуры ИКП дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей ИКП, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ИКП (дикого типа или модифицированный ИКП) является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, в тех случаях, когда зкДНК-вектор содержит два модифицированных ИКП, которые отличаются друг от друга или асимметричны друг относительно друга, по меньшей мере один модифицированный ИКП является функциональным и по меньшей мере один модифицированный ИКП является нефункциональным.

[00292] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП (например, левый или правый ИКП) синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, описанного в данном документе, имеет модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере. Примеры последовательностей ИКП, имеющих модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере, перечислены в Таблице 2 (т.е. SEQ ID NO: 135-190, 200-233); Таблице 3 (например, SEQ ID NO: 234-263); Таблице 4 (например, SEQ ID NO: 264-293); Таблице 5 (например, SEQ ID NO: 294-318 в данном документе); Таблице 6 (например, SEQ ID NO: 319-468); и Таблицах 7-9 (например, SEQ ID NO: 101-110, 111-112, 115-134) или Таблице 10A или 10B (например, SEQ ID NO: 9, 100, 469-483, 484-499) международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00293] В некоторых вариантах реализации модифицированный ИКП для использования в зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ИКП или симметричную пару мод-ИКП, выбирают из любых или из комбинации ИКП, приведенных в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9 и 10A-10B заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00294] Дополнительные примеры модифицированных ИКП для использования в зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ИКП или симметричную пару мод-ИКП в каждом из вышеуказанных классов, представлены в Таблицах 4A и 4B. Предсказанные вторичные структуры правых модифицированных ИКП, приведенных в Таблице 4A, представлены на Фиг.7А международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., и предсказанные вторичные структуры левых модифицированных ИКП, приведенных в Таблице 4B, представлены на Фиг.7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00295] В Таблице 4A и Таблице 4B приведены примеры правых и левых модифицированных ИКП.

[00296] Таблица 4А: Примеры модифицированных правых ИКП Эти примеры модифицированных правых ИКП могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 4А: Примеры правых модифицированных ИКП Конструкт ИКП Последовательность SEQ ID NO: ИКП-18 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 15 ИКП-19 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 16 ИКП-20 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 17 ИКП-21 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 18 ИКП-22 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 19 ИКП-23 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 20 ИКП-24 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 21 ИКП-25 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 22 ИКП-26 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 23 ИКП-27 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 24 ИКП-28 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 25 ИКП-29 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 26 ИКП-30 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 27 ИКП-31 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 28 ИКП-32 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 29 ИКП-49 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 30 ИКП-50 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 31

[00297] ТАБЛИЦА 4B: Примеры модифицированных левых ИКП. Эти примеры левых модифицированных ИКП могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и комплемент RBE (RBE') GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 4B: Примеры модифицированных левых ИКП ИКП-33 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 32 ИКП-34 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 33 ИКП-35 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 34 ИКП-36 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 35 ИКП-37 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 36 ИКП-38 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 37 ИКП-39 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 38 ИКП-40 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 39 ИКП-41 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 40 ИКП-42 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 41 ИКП-43 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 42 ИКП-44 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 43 ИКП-45 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 44 ИКП-46 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 45 ИКП-47 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 46 ИКП-48 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 47

[00298] В одном варианте реализации зкДНК-вектор содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ИКП) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ИКП ААВ, причем первый ИКП (5'-ИКП) и второй ИКП (3'-ИКП) являются асимметричными относительно друг друга, т.е. они имеют разную трехмерную пространственную конфигурацию относительно друг друга. В качестве примерного варианта реализации первый ИКП может представлять собой ИКП дикого типа, а второй ИКП может представлять собой мутированный или модифицированный ИКП, или наоборот, когда первый ИКП может представлять собой мутированный или модифицированный ИКП, а второй ИКП может представлять собой ИКП дикого типа. В некоторых вариантах реализации первый ИКП и второй ИКП оба представляют собой мод-ИКП, но имеют разные последовательности, или имеют разные модификации и, таким образом, не являются одинаковыми модифицированными ИКП и имеют разные пространственные 3D-конфигурации. Другими словами, зкДНК-вектор с асимметричными ИКП содержит ИКП, в которых любые изменения в одном ИКП относительно ИКП-ДТ не отображаются в другом ИКП; или, альтернативно, в которых асимметричные ИКП представляют собой асимметричную пару модифицированных ИКП, которые могут иметь разные последовательности и разную трехмерную форму друг относительно друга. Типичные примеры асимметричных ИКП в зкДНК-векторе и для использования при получении зкДНК-плазмиды представлены в Таблице 4А и 4 В.

[00299] В альтернативном варианте реализации, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор содержит два симметричных мод-ИКП, т.е. оба ИКП имеют одинаковую последовательность, но являются обратными комплементами (инвертированными) друг друга. В некоторых вариантах реализации симметричная пара мод-ИКП содержит по меньшей мере одну или любую комбинацию делеции, вставки или замены относительно последовательности ИКП дикого типа из того же серотипа ААВ. Добавления, делеции или замены в симметричном ИКП являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг к другу. Например, вставка 3 нуклеотидов в С-область 5'-ИКП будет отображена во вставке 3 обратно комплементарных нуклеотидов в соответствующий участок С-области 3'-ИКП. Исключительно в целях иллюстрации, если в 5'-ИКП добавление представляет собой AACG, то в 3'-ИКП добавлением будет CGTT в соответствующем сайте. Например, если смысловая цепь 5'-ИКП представляет собой ATCGATCG с добавлением AACG между G и A, то в результате будет получена последовательность ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51). Соответствующая смысловая цепь 3'-ИКП представляет собой CGATCGAT (обратный комплемент ATCGATCG) с добавлением CGTT (т.е. обратного комплемента AACG) между T и C, что приводит к последовательности CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (обратный комплемент ATCGAACGATCG) (SEQ ID NO: 51).

[00300] В альтернативных вариантах реализации модифицированная пара ИКП является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. модифицированная пара ИКП может иметь разные последовательности, но имеет аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. Например, один модифицированный ИКП может принадлежать к одному серотипу, а другой модифицированный ИКП может принадлежать к другому серотипу, но они имеют одинаковую мутацию (например, вставку, делецию или замену нуклеотида) в одной и той же области. Иными словами, только в иллюстративных целях, 5' мод-ИКП может быть взят из ААВ2 и иметь делецию в области C, а 3' мод-ИКП может быть взят из ААВ5 и иметь соответствующую делецию в области C', и при условии, что 5' мод-ИКП и 3' мод-ИКП имеют одинаковую или симметричную трехмерную пространственную организацию, они будут включены для использования по данному изобретению в качестве модифицированной пары ИКП.

[00301] В некоторых вариантах реализации по существу симметричная пара мод-ИКП имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ИКП в по существу симметричной паре мод-ИКП имеет делецию плеча C-C', то родственный мод-ИКП имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру оставшихся A и B-B'-петель одинаковой формы в геометрическом пространстве по сравнению со своим родственным мод-ИКП. Только в качестве примера, по существу симметричные ИКП могут иметь симметричную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, например, когда пару G-C модифицируют, например, в пару C-G, или наоборот, или пару A-T модифицируют в пару T-A, или наоборот.Таким образом, если использовать приведенный выше иллюстративный пример модифицированного 5'-ИКП в виде ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51), и модифицированного 3'-ИКП в виде CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (т.е. обратный комплемент ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51)), то эти модифицированные ИКП будут оставаться симметричными, если, например, 5'-ИКП имеет последовательность ATCGAACCATCG (SEQ ID NO: 50), где G в добавлении модифицируют до C, и по существу симметричный 3'-ИКП имеет последовательность CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49), без соответствующей модификации в добавлении T до A. В некоторых вариантах реализации такая пара модифицированных ИКП является по существу симметричной, поскольку пара модифицированных ИКП имеет симметричную стереохимию.

[00302] В Таблице 5 приведены примеры симметричных модифицированных пар ИКП (т.е. модифицированные левые ИКП и симметричные правые модифицированные ИКП). Выделенная жирным шрифтом (красная) часть последовательностей идентифицирует частичные последовательности ИКП (т.е. последовательности петель A-A', C-C' и B-B'), также показанные на Фиг.31A-46B. Эти примеры модифицированных ИКП могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 5: Примеры симметричных модифицированных пар ИКП ЛЕВЫЙ модифицированный ИКП
(модифицированный 5'-ИКП) Симметричный ПРАВЫЙ модифицированный ИКП
(модифицированный 3'-ИКП) SEQ ID NO: 32 (ИКП-33, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 15 (ИКП-18, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 33 (ИКП-34, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 48 (ИКП-51, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 34 (ИКП-35, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 16 (ИКП-19, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 35 (ИКП-36, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 17 (ИКП-20, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 36 (ИКП-37, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 18 (ИКП-21, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 37 (ИКП-38, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 19 (ИКП-22, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 38 (ИКП-39, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 20 (ИКП-23, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 39 (ИКП-40, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 21 (ИКП-24, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 40 (ИКП-41, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 22 (ИКП-25, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 41 (ИКП-42, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 23 (ИКП-26, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 42 (ИКП-43, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 24 (ИКП-27, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 43 (ИКП-44, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 25 (ИКП-28, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 44 (ИКП-45, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 26 (ИКП-29, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 45 (ИКП-46, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 27 (ИКП-30, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 46 (ИКП-47, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 28 (ИКП-31, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 47 (ИКП-48, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 29 (ИКП-32, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

[00303] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, содержащий пару асимметричных ИКП, может содержать ИКП с модификацией, соответствующей любой из модификаций последовательностей ИКП или частичных последовательностей ИКП, приведенных в любой одной или нескольких из Таблиц 4A-4B в данном документе, или последовательностей, представленных на Фиг.7A-7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ, или раскрытые в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10A-10B международной заявки PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

V. Типичные зкДНК-векторы для контролируемой экспрессии трансгена

[00304] Как описано выше, данное изобретение относится к рекомбинантным экспрессионным зкДНК-векторам и зкДНК-векторам для контролируемой экспрессии трансгена, которые кодируют любую из: пары асимметричных ИКП, пары симметричных ИКП или пары по существу симметричных ИКП, как описано выше. В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к рекомбинантным зкДНК-векторам для контролируемой экспрессии трансгена, имеющим фланкирующие последовательности ИКП и трансген, причем последовательности ИКП являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе, и зкДНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту трансгена), расположенную между фланкирующими ИКП, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты лишена кодирующих последовательностей белка вирусного капсида.

[00305] зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может представлять собой любой зкДНК-вектор, который может быть удобно подвергнут процедурам рекомбинантной ДНК, включающий нуклеотидную последовательность (последовательности), описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере один ИКП был изменен. зкДНК-векторы по данному изобретению совместимы с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен зкДНК-вектор. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы могут быть линейными. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы могут существовать в виде внехромосомного объекта. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать элемент(ы), которые позволяют интегрировать донорную последовательность в геном клетки-хозяина. При использовании в данном документе, «трансген» и «гетерологичная нуклеотидная последовательность» являются синонимами.

[00306] На Фиг.1A-1G продемонстрированы схемы функциональных компонентов двух неограничивающих плазмид, пригодных для получения зкДНК-векторов по данному изобретению. Фиг.1А, 1 В, 1D, 1F изображают конструкт зкДНК-векторов или соответствующих последовательностей зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ИКП, экспрессионную трансгенную кассету, и второй ИКП, при этом первая и вторая последовательности ИКП являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ИКП, экспрессируемый трансген (белок или нуклеиновую кислоту), и второй ИКП, при этом последовательности первого и второго ИКП являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета трансгена включает, при необходимости, энхансер/промотор, одно или несколько гомологичных плеч, донорную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE, например, SEQ ID NO: 67) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(А) BGH, например, SEQ ID NO: 68).

[00307] Фиг.5 изображает гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества плазмидных конструктов с использованием способа, описанного в примерах. Получение зкДНК-вектора подтверждается характерной электрофореграммой в геле, как было описано для Фиг.4А выше и в примерах.

А. Регуляторные элементы.

[00308] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, содержащие асимметричную пару ИКП или симметричную пару ИКП, как определено в данном документе, могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, микроРНК-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации указанный ИКП может выступать в роли промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для регулируемой экспрессии трансгена содержит дополнительные компоненты для регулии экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, для регулирования экспрессии трансгена, или выключатель «kill switch», который может убить клетку, содержащую зкДНК-вектор. Регуляторные элементы, включая регуляторные переключатели, которые можно использовать в данном изобретении, более подробно описаны в международной заявке PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00309] В вариантах реализации, вторая нуклеотидная последовательность включает регуляторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность гена функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность пригодна для контроля экспрессии нуклеазы в клетке-хозяине. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность включает подходящую промоторную последовательность, способную направлять транскрипцию гена, функционально связанного с промоторной последовательностью, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу (нуклеазы) по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность, связанную с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей нуклеазу. В некоторых вариантах реализации, энхансерная последовательность обеспечивается перед промотором для повышения эффективности промотора. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность включает энхансер и промотор, при этом вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, причем интрон включает один или несколько сайтов расщепления нуклеазой, и промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.

[00310] зкДНК-векторы, полученные синтетическим путем или с использованием способа продуцирования на основе клеток, как описано в данном документе в примерах, могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов, таких как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67) и поли(А) BGH (SEQ ID NO: 68). Подходящие экспрессионные кассеты для использования в экспрессионных конструктах не имеют ограничений упаковки, налагаемых вирусным капсидом.

(i). Промоторы

[00311] Специалисту в данной области техники будет понятно, что промоторы, используемые в зкДНК-векторах по изобретению, должны быть адаптированы к конкретным последовательностям, которые они стимулируют.Например, направляющая РНК может вообще не нуждаться в промоторе, поскольку его функция заключается в формировании дуплекса со специфической последовательностью-мишенью на нативной ДНК для осуществления события рекомбинации. Напротив, для нуклеазы, кодируемой зкДНК-вектором, промотор мог бы быть полезным для того, чтобы она могла эффективно экспрессироваться из вектора - и, необязательно, регулируемым образом.

[00312] Экспрессионные кассеты по данному изобретению включают промотор, который может влиять на общие уровни экспрессии, а также на клеточную специфичность. Для экспрессии трансгена они могут включать высокоактивный немедленный ранний промотор вирусного происхождения. Экспрессионные кассеты могут содержать тканеспецифические эукариотические промоторы для ограничения экспрессии трансгена определенными типами клеток и снижения токсических эффектов и иммунных реакций, возникающих в результате нерегулируемой эктопической экспрессии. В предпочтительных вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать синтетический регуляторный элемент, такой как промотор CAG (SEQ ID NO: 72). Промотор CAG включает (i) элемент раннего энхансера цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы, и (iii) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика. Альтернативно, экспрессионная кассета может содержать промотор альфа-1-антитрипсина (AAT) (SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74), печень-специфический (LP1) промотор (SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76) или промотор фактора удлинения-1-альфа (EF1a) человека (например, SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 78). В некоторых вариантах реализации указанная экспрессионная кассета включает один или несколько конститутивных промоторов, например, ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно, с энхансером RSV), или немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно, с энхансером CMV, например, SEQ ID NO: 79). Альтернативно, можно использовать индуцируемый промотор, нативный промотор трансгена, тканеспецифический промотор или различные промоторы, известные в данной области техники.

[00313] Подходящие промоторы, в том числе описанные выше, могут происходить из вирусов и могут, соответственно, называться вирусными промоторами, или они могут происходить из любого организма, в том числе прокариотических или эукариотических организмов. Подходящие промоторы можно использовать для управления экспрессией с помощью любой РНК-полимеразы (например, pol I, pol II, pol III). Типичные промоторы включают, без ограничений, ранний промотор SV40, промотор из длинного концевого повтора (LTR) вируса опухоли молочной железы мышей; аденовирусный большой поздний промотор (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленного раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор U6 малой ядерной РНК человека (U6, например, SEQ ID NO: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усиленный промотор U6 (например, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep.1; 31(17)), промотор H1 человека (H1) (например, SEQ ID NO: 81), промотор CAG, промотор альфа-1-антитрипсина человека (HAAT) (например, SEQ ID NO: 82), и т.п.В некоторых вариантах реализации эти промоторы изменены на содержащем 3′-интрон конце таким образом, чтобы они включали один или несколько сайтов расщепления нуклеазами. В некоторых вариантах реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазой, является чужеродной для ДНК промотора.

[00314] В одном варианте реализации используемый промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и были охарактеризованы. Используемая область промотора может дополнительно включать одну или несколько дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеров (например, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 83), включая энхансер SV40 (SEQ ID NO: 126).

[00315] Неограничивающие примеры подходящих промоторов для использования в соответствии с данным изобретением включают промотор CAG, например, (SEQ ID NO: 72), промотор HAAT (SEQ ID NO: 82), промотор EF1-α человека (SEQ ID NO: 77) или фрагмент промотора EF1a (SEQ ID NO: 78), промотор IE2 (например, SEQ ID NO: 84) и промотор EF1-α крысы (SEQ ID NO: 85) или фрагмент промотора 1E1 (SEQ ID NO: 125).

(ii). Последовательности полиаденилирования

[00316] Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена для стабилизации мРНК, экспрессируемой с указанного зкДНК-вектора, и для содействия ядерному экспорту и трансляции. В одном варианте реализации указанный зкДНК-вектор не содержит последовательности полиаденилирования. В других вариантах реализации указанный вектор включает по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность полиаденилирования содержит примерно 43 нуклеотида, примерно 40-50 нуклеотидов, примерно 40-55 нуклеотидов, примерно 45-50 нуклеотидов, примерно 35-50 нуклеотидов, или в любой диапазон между указанными значениями. В некоторых вариантах реализации, в которых зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может содержать два трансгена, например, в случае контролируемой экспрессии антитела, зкДНК-вектор может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела (например, примером тяжелой цепи является SEQ ID NO: 57) и нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела (например, примером легкой цепью является SEQ ID NO: 58), и могут присутствовать полиаденилирование со стороны 3' от первого трансгена, и IRES (например, SEQ ID NO: 190), расположенный между первым и вторым трансгеном (например, между нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь антитела, и нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь антитела). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, который кодирует более одного трансгена (например, 2, или 3, или больше), может содержать последовательность IRES (внутренний сайт входа в рибосому) (SEQ ID NO: 190), причем последовательность IRES расположена, например, со стороны 3' от последовательности полиаденилирования, так чтобы второй трансген (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент), расположенный со стороны 3' от первого трансгена, транслировался и экспрессировался тем же самым зкДНК-вектором, чтобы указанный зкДНК-вектор мог экспрессировать два или больше трансгенов, кодируемых зкДНК-вектором.

[00317] Кассеты экспрессии могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области техники, или ее вариант, например, встречающуюся в природе последовательность, выделенную из бычьей BGHpA (например, SEQ ID NO: 68), или из вирусной SV40pA (например, SEQ ID NO: 86), или синтетическую последовательность (например, SEQ ID NO: 87). Некоторые экспрессионные кассеты могут также включать последовательность вышележащего энхансера (USE) позднего поли(A)-сигнала SV40. В некоторых вариантах реализации USE можно использовать в комбинации с SV40pA или гетерологичным поли(A)-сигналом.

[00318] Кассеты экспрессии могут также включать посттранскрипционный элемент для повышения экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации для повышения экспрессии трансгена применяют посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67). Могут использоваться другие элементы посттранскрипционного процессинга, такие как посттранскрипционный элемент из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита B (HBV). Секреторные последовательности могут быть связаны с трансгенами, например, последовательностями VH-02 (SEQ ID NO: 88) и VK-A26 (SEQ ID NO: 89), или сигнальной последовательностью IgK (SEQ ID NO: 128), секреторной сигнальной последовательностью Glu (SEQ ID NO: 188), или секреторной сигнальной последовательностью TND (SEQ ID NO: 189).

(iii). Последовательности ядерной локализации

[00319] В некоторых вариантах реализации вектор, кодирующий направляемую РНК эндонуклеазу, содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах реализации одна или несколько NLS расположены на амино-конце или рядом с ним, на карбокси-конце или рядом с ним, или в их комбинации (например, одна или несколько NLS на амино-конце и/или одна или несколько NLS на карбокси-конце). В случае присутствия более чем одной NLS, каждая из них может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS будет присутствовать в более чем одной копии и/или в сочетании с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. Неограничивающие примеры NLS приведены в Таблице 6.

[00320] Таблица 6: Сигналы ядерной локализации

ИСТОЧНИК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO. большой Т-антиген вируса SV40 PKKKRKV (кодируется последовательностью CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG; SEQ ID NO: 91) 90 нуклеоплазмин KRPAATKKAGQAKKKK 92 c-myc PAAKRVKLD 93 RQRRNELKRSP 94 hRNPA1 M9 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY 95 домен IBB импортина-альфа RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV 96 белок Т миомы VSRKRPRP 97 PPKKARED 98 р53 человека PQPKKKPL 99 c-abl IV мыши SALIKKKKKMAP 100 NS1 вируса гриппа DRLRR 117 PKQKKRK 118 антиген вируса гепатита дельта RKLKKKIKKL 119 белок Mx1 мыши REKKKFLKRR 120 полимераза поли(АДФ-рибозы) человека KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 121 глюкокортикоид рецепторов стероидных гормонов (человека) RKCLQAGMNLEARKTKK 122

B. Дополнительные компоненты зкДНК-векторов

[00321] зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать нуклеотиды, которые кодируют другие компоненты для редактирования генов. Например, для выбора специфических событий нацеливания на гены, защитная shRNA может быть встроена в микроРНК и вставлена в рекомбинантный зкДНК-вектор, предназначенный для сайт-специфической интеграции в высокоактивный локус, такой как локус альбумина. Такие варианты реализации могут предоставить систему для селекции in vivo и экспансии генно-модифицированных гепатоцитов на любом генетическом фоне, например, описанную Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016. зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют отбирать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные или подобные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию к ауксотрофам, NeoR и т.п.В определенных вариантах реализации маркеры позитивной селекции, такие как NeoR, включены в донорные последовательности. Маркеры негативной селекции могут быть включены после донорной последовательности, например, последовательность нуклеиновой кислоты HSV-tk, кодирующая маркер негативной селекции, может быть включена в конструкт нуклеиновой кислоты ниже донорной последовательности.

[00322] В вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, полученный с использованием процесса синтеза, как описано в данном документе, может применяться для редактирования генов, например, как раскрыто в международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки, и может включать что-то одно или несколько из: 5'-гомологичного плеча, 3'-гомологичного плеча, сайта полиаденилирования, расположенного выше и близко к 5'-гомологичному плечу. Примерами гомологичных групп являются 5'- и 3'-гомологичные плечи альбумина (SEQ ID NO: 151 и 152) или CCR5 5'- и 3'-гомологичные плечи (например, SEQ ID NO: 153, 154).

C. Регуляторные переключатели

[00323] Молекулярный регуляторный переключатель вызывает измеримое изменение состояния в ответ на сигнал. Такие регуляторные переключатели могут быть успешно скомбинированы с зкДНК-векторами, описанными в данном документе, для контроля результатов экспрессии трансгена из зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена содержит регуляторный переключатель, который служит для точной настройки экспрессии трансгена. Например, он может служить для обеспечения функции биологического сдерживания зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации указанный переключатель представляет собой двухпозиционный переключатель, который сконструирован таким образом, чтобы запускать или останавливать (т.е. прекращать) экспрессию представляющего интерес гена в зкДНК контролируемым и регулируемым образом. В некоторых вариантах реализации указанный переключатель может активировать выключатель «kill switch», который может дать команду клетке, содержащей указанный зкДНК-вектор, запустить механизм запрограммированной клеточной смерти после активации переключателя. Типичные примеры регуляторных переключателей, предусматриваемых для применения в зкДНК-векторе для контролируемой экспрессии трансгена, могут быть использованы для регуляции экспрессии трансгена, и более подробно описаны в международной заявке PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

(i) Бинарные регуляторные переключатели

[00324] В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена содержит регуляторный переключатель, который может служить для контролируемой модуляции экспрессии трансгена. Например, экспрессионная кассета, расположенная между ИКП указанного зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, может дополнительно содержать регуляторную область, например, промотор, цис-элемент, репрессор, энхансер и т.п., функционально связанную с представляющим интерес геном, причем указанную регуляторную область регулируют один или несколько кофакторов или экзогенных агентов. Только в качестве примера, модулирование регуляторных областей могут осуществлять низкомолекулярные переключатели, или индуцибельные или репрессируемые промоторы. Неограничивающими примерами индуцибельных промоторов являются индуцируемые гормонами или индуцируемые металлами промоторы. Другие примеры индуцибельных промоторных/энхансерных элементов включают, без ограничений, RU486-индуцируемый промотор, индуцируемый экдизоном промотор, индуцируемый рапамицином промотор и металлотионеиновый промотор.

(ii) Низкомолекулярные регуляторные переключатели

[00325] Различные известные в данной области техники регуляторные переключатели на основе малых молекул известны специалистам и могут быть скомбинированы с раскрытыми в данном документе зкДНК-векторами для получения зкДНК-вектора, контролируемого регуляторным переключателем. В некоторых вариантах реализации, регуляторный переключатель может быть выбран из чего-либо одного или комбинации следующего: ортогональная пара лиганд/ядерный рецептор, например, вариант ретиноидного рецептора/LG335 и GRQCIMFI, наряду с искусственным промотором, контролирующим экспрессию функционально связанного трансгена, например, как описано в: Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; рекомбинантные стероидные рецепторы, например, модифицированный рецептор прогестерона с усеченным C-концом, который не способен связывать прогестерон, но связывает RU486 (мифепристон) (патент США №5364791); рецептор экдизона из Drosophila и его экдистероидные лиганды (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517); или переключатель, контролируемый антибиотиком триметопримом (TMP), как описано в: Sando R 3^rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8. В некоторых вариантах, указанный регуляторный переключатель для контроля трансгена, или экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой переключатель активации пролекарства, такой как описанный в патентах США №8771679 и №6339070.

(iii) Регуляторные переключатели «с паролем»

[00326] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель может представлять собой «переключатель с паролем» (passcode switch) или «контур с паролем». Переключатели с паролем позволяют обеспечить точную настройку контроля экспрессии указанного трансгена из зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена при возникновении специфических условий - т.е. комбинации условий, наличие которых необходимо для осуществления экспрессии и/или репрессии трансгена. Например, для экспрессии трансгена необходимо наличие по меньшей мере условий A и B. Регуляторный переключатель с паролем может иметь любое количество условий, например, по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 или более условий, необходимых для протекания трансгенной экспрессии. В некоторых вариантах реализации необходимо наличие по меньшей мере 2 условий (например, условий A, B), и в некоторых вариантах реализации необходимо наличие по меньшей мере 3 условий (например, A, B и C, или A, B и D). Только в качестве примера, для генной экспрессии из зкДНК, содержащей регуляторный переключатель с паролем «ABC», должны присутствовать условия A, B и C. Условия A, B и C могут быть следующими; условие A представляет собой присутствие состояния или заболевания, условие B представляет собой гормональный ответ, и условие C представляет собой ответ на трансгенную экспрессию. Например, если трансген редактирует дефектный ген EPO, то условием A является наличие хронической болезни почек (ХБП), условие B выполняется при наличии гипоксического состояния в почках субъекта, условие C заключается в нарушении рекрутинга эритропоэтин-продуцирующих клеток (ЭПК) в почках; или, альтернативно, в нарушении активации HIF-2. После повышения уровней кислорода или достижения требуемого уровня EPO трансген (например, EPO) снова отключается до момента выполнения 3 условий, при которых он опять включится.

[00327] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель с паролем или «контур с паролем», предусматриваемый для применения в указанном зкДНК-векторе для контролируемой экспрессии трансгена, содержит гибридные транскрипционные факторы (ТФ) для увеличения диапазона и сложности сигналов окружающей среды, используемых для задания условий биологического сдерживания. В отличие от блокирующего выключателя, который запускает клеточную смерть при наличии предварительно заданного условия, «контур с паролем» позволяет обеспечить выживание клеток или экспрессию трансгена при наличии определенного «пароля», и может быть легко перепрограммирован, чтобы позволять экспрессию трансгена и/или выживание клеток только при наличии предварительно заданного условия окружающей среды или пароля.

[00328] Любые комбинации регуляторных переключателей, раскрытых в данном документе, например, низкомолекулярных переключателей, переключателей на основе нуклеиновых кислот, гибридных переключателей на основе малых молекул и нуклеиновых кислот, посттранскрипционных регуляторных переключателей трансгенов, посттрансляционной регуляции, контролируемых излучением переключателей, опосредованных гипоксией переключателей и других регуляторных переключателей, известных специалистам в данной области техники, как описано в данном документе, могут применяться в регуляторном переключателе с паролем, раскрытом в данном документе. Регуляторные переключатели, предусматриваемые для применения, также описаны в обзорной статье Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015), и обобщены в Таблице 1 указанной статьи. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для применения в системе с паролем может быть выбран из любых переключателей, приведенных в Таблице 11, или их комбинации.

(iv). Регуляторные переключатели на основе нуклеиновых кислот для контроля трансгенной экспрессии

[00329] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для контроля трансгена, экспрессируемого зкДНК, основан на механизме контроля на основе нуклеиновой кислоты. Типичные примеры механизмов контроля на основе нуклеиновых кислот известны в данной области техники и предусмотрены для применения. Например, такие механизмы включают рибопереключатели, такие как раскрытые, например, в US 2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, патенте США №9222093 и заявке на европейский патент EP288071, а также в обзоре Villa JK et al. Microbiol Spectr., 2018 May;6(3). Также включены реагирующие на метаболиты транскрипционные биосенсоры, такие как описанные в WO2018/075486 и WO2017/147585. Другие известные в данной области техники механизмы, предусмотренные для применения, включают сайленсинг указанного трансгена молекулой миРНК или РНК-интерференции (РНКи) (например, зрелой микроРНК, кшРНК). Например, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может содержать регуляторный переключатель, который кодирует молекулу РНК-интерференции, комплементарную трансгену, экспрессируемому указанным зкДНК-вектором. При экспрессии такой РНКи, даже при экспрессии трансгена зкДНК-вектором, происходит ее сайленсинг под воздействием комплементарной молекулы РНК-интерференции, а при отсутствии экспрессии РНКи, когда зкДНК-вектор экспрессирует указанный трансген, такого сайленсинга трансгена за счет РНК-интерференции не происходит.

[00330] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой тканеспецифический самоинактивирующийся регуляторный переключатель, например, как описано в US2002/0022018, при этом регуляторный переключатель целенаправленно выключает трансгенную экспрессию в сайте, где трансгенная экспрессия иначе может быть неблагоприятной. В некоторых вариантах указанный регуляторный переключатель представляет собой рекомбиназную обратимую систему генной экспрессии, например, как описано в US2014/0127162 и патенте США №8324436.

(v). Посттранскрипционные и посттрансляционные регуляторные переключатели

[00331] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель для контроля трансгена или представляющего интерес гена, экспрессируемого зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, представляет собой систему посттранскрипционной модификации. Например, такой регуляторный переключатель может представлять собой рибопереключатель-аптазим, чувствительный к тетрациклину или теофиллину, как описано в US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, патенте EP 2707487 и Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp.526-534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858. В некоторых вариантах реализации предполагается, что специалист в данной области техники может кодировать как трансген, так и ингибиторную миРНК, которая содержит чувствительный к лиганду (отрицательный переключатель) аптамер, с получением в итоге лиганд-чувствительного положительного переключателя.

(vi). Другие примеры регуляторных переключателей

[00332] Для контроля генной экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, в указанном зкДНК-векторе может применяться любой известный регуляторный переключатель, в том числе запускаемый изменениями окружающей среды. Дополнительные примеры включают, без ограничений; метод BOC согласно Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); расширение генетического кода и нефизиологическую аминокислоту; контролируемые излучением или ультразвуком положительные/отрицательные переключатели (см., например, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5; патенты США №№5612318; 5571797; 5770581; 5817636; и WO1999/025385A1. В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель контролируется имплантируемой системой, например, как раскрыто в патентах США 7840263; US2007/0190028A1, в которых генная экспрессия контролируется одной или несколькими формами энергии, включая электромагнитную энергию, которая активирует промоторы, функционально связанные с трансгеном в зкДНК-векторе.

[00333] В некоторых вариантах регуляторный переключатель, предназначенный для использования в зкДНК-векторе для контролируемой экспрессии трансгена, представляет собой опосредуемый гипоксией или стресс-активируемый переключатель, например, такой, как описано в WO1999060142A2, патентах США №№5834306; 6218179; 6709858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, а также элементы FROG, TOAD и NRSE и условно индуцибельные элементы сайленсинга, в том числе элементы гипоксического ответа (HRE), элементы воспалительного ответа (IRE) и активируемые сдвиговым напряжением элементы (SSAE), например, как раскрыто в патенте США №9394526. Такой вариант реализации подходит для включения экспрессии указанного трансгена из зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена после ишемии или в ишемических тканях, и/или в опухолях.

(iv). Выключатели «kill switch»

[00334] Другие варианты реализации данного изобретения относятся к зкДНК-вектору для контролируемой экспрессии трансгена, содержащему выключатель «kill switch». Выключатель «kill switch», как описано в данном документе, позволяет обеспечить киллинг клетки, содержащей зкДНК-вектор, или ее переход к запрограммированной гибели в качестве способа окончательного устранения введенного зкДНК-вектора из системы субъекта. Специалисту в данной области техники будет понятно, что применение выключателей «kill switch» в зкДНК-векторах согласно данному изобретению, как правило, сопряжено с нацеливанием указанного зкДНК-вектора на ограниченное число клеток, потеря которых является приемлемой для субъекта, или на тип клеток, апоптоз которых желателен (например, на раковые клетки). Во всех аспектах выключатель «kill switch», как раскрыто в данном документе, разработан так, чтобы обеспечивать быстрый и надежный киллинг клетки, содержащей указанный зкДНК-вектор, в отсутствие входного сигнала выживания или другого специфического условия. Другими словами, выключатель «kill switch», кодируемый зкДНК-вектором согласно данному изобретению, может ограничивать выживание клетки, содержащей зкДНК-вектор, окружающей средой, заданной специфическими входными сигналами. Такие выключатели «kill switch» служат для обеспечения функции биологического сдерживания, если требуется либо удалить зкДНК-вектор из субъекта, либо обеспечить отсутствие экспрессии кодируемого трансгена.

VI. Подробное описание способа продуцирования зкДНК-вектора

А. Получение в целом

[00335] Определенные способы получения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, содержащего асимметричную пару ИКП или симметричную пару ИКП, как определено в данном документе, описаны в разделе IV международной заявки PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена для применения в способах и композициях, описанных в данном документе, может быть получен с использованием клеток насекомых, как описано в данном документе. В альтернативных вариантах реализации, (зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена) для применения в способах и композициях, описанных в данном документе, может быть получен синтетическим путем и, в некоторых вариантах реализации, бесклеточным способом, как описано в международной заявке PCT/US19/14122, поданной 18 января 2019 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00336] Как описано в данном документе, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть получен с применением способа, включающего стадии: a) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих полинуклеотидную матрицу экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), лишенную кодирующих последовательностей вирусного капсида, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования указанного зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, при этом указанные клетки-хозяева не содержат кодирующих последовательностей вирусного капсида; и b) сбора и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ИКП для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако вирусные частицы (например, вирионы ААВ) при этом не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, такие как естественным образом накладываемые в ААВ или других вирусных векторах.

[00337] Присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличающихся от полос линейной и прерывистой ДНК.

[00338] В еще одном аспекте изобретение предусматривает применение линий клеток-хозяев, имеющих стабильно интегрированную в собственный геном полинуклеотидную матрицу экспрессионного ДНК-вектора (зкДНК-матрицу), при продуцировании невирусного ДНК-вектора, например, как описано в: Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. Предпочтительно Rep добавляют в клетки-хозяева с величиной МЗ (множественность заражения), равной приблизительно 3. Если линия клеток-хозяев представляет собой линию клеток млекопитающего, например, клетки HEK293, то указанные линии клеток могут содержать стабильно интегрированную полинуклеотидную векторную матрицу, и второй вектор, например, герпесвирусный, может применяться для введения в клетки белка Rep, обеспечивающего эксцизию и амплификацию зкДНК в присутствии Rep и хелперного вируса.

[00339] В одном варианте реализации клетки-хозяева, используемые для получения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, представляют собой клетки насекомых, и бакуловирус используют для доставки как полинуклеотида, который кодирует белок Rep, так и матрицы полинуклеотидного экспрессионного конструкта невирусного ДНК-вектора для зкДНК, например, как описано в Фиг.4A-4C и Примере 1. В некоторых вариантах реализации указанную клетку-хозяина модифицируют таким образом, чтобы она экспрессировала белок Rep.

[00340] зкДНК-вектор затем собирают и выделяют из клеток-хозяев. Время сбора и извлечения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, из клеток может быть выбрано и оптимизировано так, чтобы обеспечить высокопродуктивное получение указанных зкДНК-векторов. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. В одном варианте реализации клетки культивируют в достаточных условиях и собирают через достаточное время после инфекции бакуловирусом для получения зкДНК-векторов, но до начала гибели большинства клеток вследствие токсичности бакуловируса. Указанные ДНК-векторы могут быть выделены с применением наборов для очистки плазмид, таких как наборы «Endo-Free Plasmid» фирмы «Qiagen». Другие способы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для ДНК-векторов. Как правило, могут быть использованы любые способы очистки нуклеиновых кислот.

[00341] ДНК-векторы могут быть очищены любыми средствами для очистки ДНК, известными специалистам в данной области техники. В одном варианте реализации очищенные зкДНК-векторы получают в виде молекул ДНК. В другом варианте реализации очищенные зкДНК-векторы получают в виде экзосом или микрочастиц.

[00342] Присутствие указанного зкДНК-вектора может быть подтверждено путем расщепления векторной ДНК, выделенной из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа как расщепленного, так и нерасщепленного ДНК-материала с применением гель-электрофореза для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от линейной и прерывистой ДНК. Фиг.4C и Фиг.4D иллюстрируют один вариант реализации, касающийся идентификации присутствия зкДНК-векторов с замкнутыми концами, продуцируемых описанными в данном документе способами.

[00343]

B. зкДНК-плазмида

[00344] зкДНК-плазмида представляет собой плазмиду, используемую для последующего получения зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-плазмида может быть сконструирована с применением известных методик для обеспечения по меньшей мере нижеперечисленного, в виде функционально связанных компонентов, в направлении транскрипции: (1) модифицированной последовательности 5’-ИКП; (2) экспрессионной кассеты, содержащей цис-регуляторный элемент, например, промотор, индуцибельный промотор, регуляторный переключатель, энхансеры и т.п.; и (3) модифицированной последовательности 3’-ИКП, причем последовательность 3’-ИКП является симметричной к последовательности 5’-ИКП. В некоторых вариантах реализации указанная экспрессионная кассета, фланкированная ИКП, содержит сайт клонирования для введения экзогенной последовательности. Указанная экспрессионная кассета заменяет кодирующие области rep и cap геномов ААВ.

[00345] В одном аспекте зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена получают из плазмиды, называемой в данном документе «зкДНК-плазмида», кодирующей, в указанном порядке: первый инвертированный концевой повтор (ИКП) аденоассоциированного вируса (ААВ), экспрессионную кассету, содержащую трансген, и мутированный или модифицированный ИКП ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ. В альтернативных вариантах реализации такая зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5’) модифицированный или мутированный ИКП ААВ, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3’) модифицированный ИКП ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ, а 5’- и 3’-ИКП являются симметричными друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5’) модифицированный или мутированный ИКП ААВ, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3’) мутированный или модифицированный ИКП ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ, а модифицированные 5’- и 3’-ИКП имеют одинаковые модификации (т.е. являются обратно комплементарными или симметричными друг относительно друга).

[00346] В дополнительном варианте реализации система зкДНК-плазмиды лишена кодирующих последовательностей вирусного капсидного белка (т.е. она не содержит генов капсида ААВ, а также генов капсидов других вирусов). Кроме того, в конкретном варианте реализации зкДНК-плазмида также лишена кодирующих последовательностей белка Rep ААВ. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации зкДНК-плазмида лишена функциональных генов cap ААВ и rep ААВ, GG-3′ для ААВ2), а также вариабельной палиндромной последовательности, обеспечивающей образование шпильки.

[00347] зкДНК-плазмида по данному изобретению может быть получена с использованием природных нуклеотидных последовательностей геномов любых серотипов ААВ, хорошо известных в данной области техники. В одном варианте реализации, остов плазмиды зкДНК получают из генома ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; из указателя вирусов Kotin and Smith («The Springer Index of Viruses»), доступного по ссылке, поддерживаемой Springer (веб-адрес: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.) (примечание: ссылки на указатель URL или базу данных подразумевают содержание доступного по ссылке ресурса URL или базы данных на фактическую дату подачи данной заявки). В конкретном варианте реализации остов зкДНК-плазмиды получают из генома ААВ2. В другом конкретном варианте реализации, остов зкДНК-плазмиды представляет собой синтетический остов, сконструированный методами генной инженерии с включением на 5’- и 3’-концах ИКП, происходящих из одного из указанных геномов ААВ.

[00348] Плазмида зкДНК может необязательно включать селектируемый или селекционный маркер для использования при создании линии клеток, продуцирующей зкДНК-вектор. В одном варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен ниже 3'-последовательности ИКП (т.е. в направлении 3'). В другом варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен выше 5'-последовательности ИКП (т.е. в направлении 5'). Подходящие селекционные маркеры включают, например, маркеры, придающие устойчивость к лекарственному средству. Селекционными маркерами могут быть, например, ген устойчивости к бластицидину S, канамицину, генетицину и т.п.В предпочтительном варианте реализации селекционный маркер лекарственного средства представляет собой ген устойчивости к бластицидину S.

[00349] Типичную зкДНК (например, рААВ0) продуцируют из плазмиды рААВ. Способ получения вектора рААВ может включать: (а) доставку в клетку-хозяина рААВ-плазмиды, как описано выше, причем как клетка-хозяин, так и плазмида лишены генов, кодирующих капсидный белок, (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих возможность получения генома зкДНК; и (c) сбор клеток и выделение генома ААВ, продуцируемого указанными клетками.

C. Примеры способа получения зкДНК-векторов из зкДНК-плазмид

[00350] В данном документе также предложены способы получения бескапсидных зкДНК-векторов, а именно, способ с достаточно высоким выходом для обеспечения достаточного количества вектора для экспериментов in vivo.

[00351] В некоторых вариантах реализации способ получения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена включает стадии: (1) введения конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего экспрессионную кассету и две симметричных последовательности ИКП в клетку-хозяина (например, клетки Sf9), (2) необязательно, получения клональной клеточной линии, например, с применением селекционного маркера, присутствующего на плазмиде, (3) введения кодирующего Rep гена (путем трансфекции или инфекции бакуловирусом, несущим указанный ген) в указанную клетку насекомого; и (4) сбора указанных клеток и очистки зкДНК-вектора. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий экспрессионную кассету и две последовательности ИКП, описанные выше, для получения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, может иметь форму зкДНК-плазмиды или бакмиды или бакуловируса, полученных с помощью плазмиды зкДНК, как описано ниже. Конструкт нуклеиновой кислоты может быть введен в клетку-хозяина путем трансфекции, вирусной трансдукции, стабильной интеграции или другими способами, известными в данной области техники.

D. Клеточные линии:

[00352] Линии клеток-хозяев, используемые для получения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, могут включать линии клеток насекомых, полученные из Spodoptera frugiperda (совка кукурузная листовая), такие как клетки Sf9, Sf21, или клетки Trichoplusia ni (металловидка серая), или другие линии клеток беспозвоночных, позвоночных, или другие эукариотические клеточные линии, включая клетки млекопитающих. Также могут быть использованы другие клеточные линии, известные специалисту в данной области техники, такие как HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, моноциты, а также зрелые и незрелые дендритные клетки. Линии клеток-хозяев могут быть трансфицированы для стабильной экспрессии зкДНК-плазмиды для продуцирования зкДНК-вектора с высоким выходом.

[00353] зкДНК-плазмиды могут быть введены в клетки Sf9 путем транзиентной трансфекции с использованием реагентов (например, липосом, фосфата кальция) или физических средств (например, электропорации), известных в данной области техники. Альтернативно, могут быть созданы стабильные клеточные линии Sf9 с зкДНК-плазмидой, стабильно интегрированной в геном. Такие стабильные клеточные линии могут быть созданы путем включения селекционного маркера в зкДНК-плазмиду, как описано выше. Если зкДНК-плазмида, используемая для трансфекции клеточной линии, включает селекционный маркер, такой как антибиотик, то клетки, которые были трансфицированы указанной зкДНК-плазмидой и интегрировали ДНК зкДНК-плазмиды в свои геномы, могут быть отобраны путем добавления указанного антибиотика в клеточные ростовые среды. Устойчивые клоны клеток могут быть затем выделены методами разведения отдельных клеток или переноса колоний и размножены.

E. Выделение и очистка зкДНК-векторов

[00354] Примеры способа получения и выделения зкДНК-векторов описаны на Фиг.4А-4Е и в конкретных примерах, приведенных ниже. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы могут быть получены из клетки-продуцента, экспрессирующей белок (белки) Rep ААВ, дополнительно трансформированный зкДНК-плазмидой, зкДНК-бакмидой или зкДНК-бакуловирусом. Плазмиды, пригодные для продуцирования зкДНК-векторов, включают плазмиды, включающие один или несколько белков Rep, и плазмиды, используемые для получения зкДНК-вектора. Типичные плазмиды для продуцирования зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена представляют собой плазмиду, представленную на Фиг.6B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме. Плазмида зкДНК для получения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии антитела раскрыта на Фиг.6A и представляет собой SEQ ID NO: 56 международной заявки PCT/US19/18016, поданной 14 февраля 2019 г., в которой раскрыты типичные примеры зкДНК-плазмид для производства адуканумаба.

[00355] В одном аспекте полинуклеотид, кодирующий белок Rep ААВ (Rep 78 или Rep68), доставляется в клетку-продуцент в плазмиде (Rep-плазмида), бакмиде (Rep-бакмида) или бакуловирусе (Rep-бакуловирус). Rep-плазмида, Rep-бакмида и Rep-бакуловирус могут быть получены способами, описанными выше.

[00356] Способы получения зкДНК-вектора, который представляет собой пример зкДНК-вектора, описаны в данном документе. Экспрессионные конструкты, используемые для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, могут представлять собой плазмиду (например, зкДНК-плазмиды), бакмиду (например, зкДНК-бакмида) и/или бакуловирус (например, зкДНК-бакуловирус). Только в качестве примера, зкДНК-вектор может быть получен из клеток, коинфицированных зкДНК-бакуловирусом и Rep-бакуловирусом. Белки Rep, продуцируемые из Rep-бакуловируса, могут реплицировать зкДНК-бакуловирус для получения зкДНК-векторов. Альтернативно, зкДНК-векторы могут быть получены из клеток, стабильно трансфицированных конструктом, содержащим последовательность, кодирующую белок Rep ААВ (Rep78/52), доставленным в Rep-плазмидах, Rep-бакмидах или Rep-бакуловирусе. зкДНК-бакуловирус может транзиентно трансфицироваться в клетки, реплицироваться белком Rep и продуцировать зкДНК-векторы.

[00357] Бакмида (например, зкДНК-бакмида) может быть трансфицирована в пермиссивные клетки насекомых, такие как клетки Sf9, Sf21, клетки Tni (Trichoplusia ni), клетки High Five, и генерировать зкДНК-бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирус, включающий последовательности, содержащие симметричные ИКП и экспрессионную кассету. Клетки насекомых могут быть снова инфицированы зкДНК-бакуловирусом для получения следующего поколения рекомбинантного бакуловируса. Необязательно, указанная стадия может быть повторена один или несколько раз для получения рекомбинантного бакуловируса в большем количестве.

[00358] Время сбора и извлечения из клеток зкДНК-векторов, описанных в данном документе, может быть выбрано и оптимизировано так, чтобы обеспечить высокопродуктивное получение указанных зкДНК-векторов. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. Обычно, клетки можно собирать по истечении времени после инфицирования бакуловирусом, достаточного для продуцирования зкДНК-векторов (например, зкДНК-векторов), но до того, как большинство клеток начнет погибать из-за токсичности вируса. зкДНК-векторы могут быть выделены из клеток Sf9 с использованием наборов для очистки плазмид, таких как наборы «ENDO-FREE PLASMID®» фирмы «Qiagen». Другие методы, разработанные для выделения плазмиды, также могут быть адаптированы для зкДНК-векторов. Обычно могут быть использованы любые известные в данной области техники способы очистки нуклеиновых кислот, а также коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.

[00359] Альтернативно, очистка может быть осуществлена путем проведения процесса щелочного лизиса клеточного осадка, центрифугирования полученного лизата и проведения хроматографического разделения. В качестве одного неограничивающего примера, указанный процесс может быть осуществлен путем загрузки супернатанта на ионообменную колонку (например, «SARTOBIND Q®), которая удерживает нуклеиновые кислоты, с последующей элюцией (например, 1,2 M раствором NaCl), и проведения дополнительной хроматографической очистки на гель-фильтрационной колонке (например, «6 Fast Flow GE»). Затем бескапсидный ААВ-вектор выделяют, например, путем осаждения.

[00360] В некоторых вариантах реализации очищенные зкДНК-векторы также могут быть получены в виде экзосом или микрочастиц. В данной области техники известно, что многие типы клеток высвобождают не только растворимые белки, но и комплексные грузы с белками/нуклеиновыми кислотами путем шеддинга мембранных микровезикул (Cocucci et al, 2009; EP 10306226.1). Такие везикулы включают микровезикулы (также называемые микрочастицами) и экзосомы (также называемые нановезикулами), которые содержат в качестве груза белки и РНК. Микровезикулы образуются путем непосредственного отпочковывания от плазматической мембраны, а экзосомы высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной. Таким образом, микровезикулы и/или экзосомы, содержащие зкДНК-вектор, могут быть выделены из клеток, которые были трансдуцированы зкДНК-плазмидой или бакмидой или бакуловирусом, сгенерированными с помощью зкДНК-плазмиды.

[00361] Микровезикулы могут быть выделены путем фильтрации или ультрацентрифугирования культуральной среды при 20000×g, а экзосомы - при 100000×g. Оптимальная продолжительность ультрацентрифугирования может быть определена экспериментально и будет зависеть от конкретного типа клеток, из которых выделяют везикулы. Предпочтительно, культуральную среду сначала очищают путем низкоскоростного центрифугирования (например, при 2000×g в течение 5-20 минут), и подвергают центрифужному концентрированию с использованием, например, центрифужной колонки «AMICON®» («Millipore», Уотфорд, Великобритания). Микровезикулы и экзосомы могут быть дополнительно очищены посредством FACS или MACS с использованием специфических антител, которые распознают специфические поверхностные антигены, присутствующие на микровезикулах и экзосомах. Другие способы очистки микровезикул и экзосом включают, без ограничений, иммунопреципитацию, аффинную хроматографию, фильтрацию и использование магнитных шариков, покрытых специфическими антителами или аптамерами. После очистки везикулы промывают, например, забуференным фосфатом солевым раствором. Одним из преимуществ использования микровезикул или экзосом для доставки зкДНК-содержащих везикул является то, что эти везикулы могут быть нацелены на клетки различных типов путем включения в их мембраны белков, распознаваемых специфическими рецепторами на соответствующих типах клеток (см. также EP 10306226).

[00362] Другой аспект данного изобретения относится к способам очистки зкДНК-векторов от линий клеток-хозяев, имеющих стабильно интегрированный в свой геном зкДНК-конструкт.В одном варианте реализации очищенные зкДНК-векторы получают в виде молекул ДНК. В другом варианте реализации очищенные зкДНК-векторы получают в виде экзосом или микрочастиц.

[00363] Фиг.5 международной заявки PCT/US18/49996 демонстрирует гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества зкДНК-плазмидных конструктов с использованием способа, описанного в примерах. зкДНК подтверждается характерным рисунком полос в геле, как описано со ссылкой на Фиг.4D в примерах.

VII. Фармацевтические композиции

[00364] В другом аспекте предложены фармацевтические композиции. Фармацевтическая композиция содержит ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, полученный с использованием способа синтеза, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[00365] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Например, зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для желаемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, позволяющей получить высокую концентрацию зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения состава зкДНК-вектора в необходимом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием, включая зкДНК-вектор, который может быть приготовлен для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в клетки реципиента, приводящей к терапевтической экспрессии в них трансгена или донорной последовательности. Композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель.

[00366] Фармацевтически активные композиции, содержащие зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, могут быть составлены для доставки трансгена для различных целей в клетку, например, в клетки субъекта.

[00367] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит зкДНК-векторы, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Например, зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для желаемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, позволяющей получить высокую концентрацию зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00368] Фармацевтически активные композиции, содержащие зкДНК-вектор, могут быть составлены для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте к клеткам реципиента, приводящей к терапевтической экспрессии в них трансгена. Композиция может также необязательно включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

[00369] Композиции и векторы, представленные в данном документе, могут быть использованы для доставки трансгена с различными целями. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой молекулу для редактирования генов (например, нуклеазу). В некоторых вариантах реализации нуклеаза представляет собой CRISPR-ассоциированную нуклеазу (Cas-нуклеазу).

[00370] Фармацевтические композиции для терапевтических целей обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00371] В определенных обстоятельствах будет желательно доставлять композицию или зкДНК-вектор, как описано в данном документе, в фармацевтических композициях с соответствующим составом, описанных в данном документе, либо подкожно, интрапанкреатически, интраназально, парентерально, внутривенно, внутримышечно, интратекально, системным введением или перорально, внутрибрюшинно или путем ингаляции.

[00372] В данном документе конкретно предполагается, что композиции, описанные в данном документе, содержат зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена при некоторой данной дозе, которая определяется зависимостью доза-ответ зкДНК-вектора, например, при «единичной дозе», от которой при введении можно с уверенностью ожидать создания желаемого эффекта или уровня экспрессии генетического лекарственного средства у типичного субъекта.

[00373] Фармацевтические композиции для терапевтических целей обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, позволяющей обеспечить высокую концентрацию зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00374] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может быть включен в фармацевтическую композицию, пригодную для местного, системного, внутриамниотического, интратекального, внутричерепного, внутриартериального, внутривенного, внутрилимфатического, внутрибрюшинного, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, внутрисердечного, внутрипеченочного, внутрипочечного, интрацеребрального), интратекального, интравезикального, конъюнктивального (например, экстраорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хориоидального, субхориоидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального, например, ректального, назального) введения. Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция.

[00375] В некоторых аспектах способы, предлагаемые в данном документе, включают доставку одного или нескольких зкДНК-векторов, как описано в данном документе, в клетку-хозяина. В данном документе также предлагаются клетки, продуцируемые такими способами, и организмы (такие как животные, растения или грибы), содержащие или полученные из таких клеток. Методы доставки нуклеиновых кислот могут включать липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, липосомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион или липид:нуклеиновая кислота, «голую» ДНК и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №№5049386, 4946787 и 4897355), и реагенты для липофекции продаются коммерчески (например, трансфектам («Transfectam™») и липофектин («Lipofectin™»)). Доставка может осуществляться в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или в ткани-мишени (например, введение in vivo).

[00376] В данной области техники известны различные методики и способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Например, могут быть приготовлены композиции нуклеиновых кислот, таких как зкДНК, в липидных наночастицах (ЛНЧ), липидоидах, липосомах, липидных наночастицах, липоплексах или наночастицах типа ядро-оболочка. Как правило, ЛНЧ состоят из молекул нуклеиновой кислоты (например, зкДНК), одного или нескольких ионизируемых или катионных липидов (или их солей), одного или нескольких неионных или нейтральных липидов (например, фосфолипидов), молекулы, которая предотвращает агрегацию (например, ПЭГ или конъюгат ПЭГ-липид) и, необязательно, стерола (например, холестерина).

[00377] Другим способом доставки нуклеиновых кислот, таких как зкДНК, в клетку, является конъюгация нуклеиновой кислоты с лигандом, который интернализуется клеткой. Например, лиганд может связываться с рецептором на поверхности клетки и интернализоваться посредством эндоцитоза. Лиганд может быть ковалентно связан с нуклеотидом в нуклеиновой кислоте. Типичные примеры конъюгатов для доставки нуклеиновых кислот в клетку описаны, например, в WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 и WO2017/177326.

[00378] Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку путем трансфекции. Пригодные способы трансфекции включают, без ограничений, опосредованную липидами трансфекцию, опосредованную катионными полимерами трансфекцию или осаждение фосфатом кальция. Реагенты для трансфекции хорошо известны в данной области техники и включают, без ограничений, реагент для трансфекции «TurboFect» («Thermo Fisher Scientific»), реагент «Pro-Ject» («Thermo Fisher Scientific»), белковый реагент для трансфекции «TRANSPASS™ P» («New England Biolabs»), белковый реагент для доставки «CHARIOT™» («Active Motif»), белковый реагент для трансфекции «PROTEOJUICE™» («EMD Millipore»), 293-фектин, липофектамин («LIPOFECTAMINE™ 2000»), «LIPOFECTAMINE™ 3000» («Thermo Fisher Scientific»), «LIPOFECTAMINE™» («Thermo Fisher Scientific»), липофектин («LIPOFECTIN™», «Thermo Fisher Scientific»), «DMRIE-C», «CELLFECTIN™» («Thermo Fisher Scientific»), «OLIGOFECTAMINE™» («Thermo Fisher Scientific»), «LIPOFECTACE™», «FUGENE™» («Roche», Базель, Швейцария), «FUGENE™ HD» («Roche»), «TRANSFECTAM™» (трансфектам, «Promega», Мэдисон, Висконсин), «TFX-10™» («Promega»), «TFX-20™» («Promega»), «TFX-50™» («Promega»), трансфектин («TRANSFECTIN™», «BioRad», Геркулес, Калифорния), «SILENTFECT™» («Bio-Rad»), «Effectene™» («Qiagen», Валенсия, Калифорния), «DC-chol» («Avanti Polar Lipids»), «GENEPORTER™» («Gene Therapy Systems», Сан-Диего, Калифорния), «DHARMAFECT 1™» («Dharmacon», Лафайет, Колорадо), «DHARMAFECT 2™» («Dharmacon»), «DHARMAFECT 3™» («Dharmacon»), «DHARMAFECT 4™» («Dharmacon»), «ESCORT™ III» («Sigma», Сент-Луис, Миссури), и «ESCORT™ IV» («Sigma Chemical Co.»). Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку методами микрофлюидики, известными специалистам в данной области техники.

[00379] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно также вводить непосредственно в организм для трансдукции клеток in vivo. Введение осуществляется любым путем, обычно используемым для введения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или ткани, включая, без ограничений, инъекцию, инфузию, местное применение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот являются доступными и хорошо известны специалистам в данной области техники и, хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, определенный путь часто может обеспечить более быструю и более эффективную реакцию, чем другой путь.

[00380] Способы введения вектора нуклеиновой кислоты, например, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, может быть введен в гемопоэтические стволовые клетки, например, способами, описанными, например, в патенте США №5928638.

[00381] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды. Типичные липосомы и липосомные составы, включая, без ограничений, соединения, содержащие функциональные группы полиэтиленгликоля (ПЭГ), раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и в международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., например, см. раздел, озаглавленный «Фармацевтические композиции».

[00382] Различные способы доставки, известные в данной области техники, или их модификации, могут быть использованы для доставки зкДНК-векторов in vitro или in vivo. Например, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы доставляют путем транзиентного проникновения в клеточную мембрану с использованием механической, электрической, ультразвуковой, гидродинамической или лазерной энергии таким образом, чтобы облегчить вхождение ДНК в клетки-мишени. Например, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть доставлен путем транзиентного нарушения клеточной мембраны при проталкивании клетки через канал с ограниченным размером, или другими способами, известными в данной области техники. В некоторых случаях отдельно взятый зкДНК-вектор вводят прямой инъекцией «голой» ДНК в кожу, тимус, сердечную мышцу, скелетную мышцу или клетки печени. В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляют с помощью генной пушки. Сферические частицы золота или вольфрама (диаметром 1-3 мкм), покрытые бескапсидными векторами ААВ, могут быть разогнаны до высокой скорости с помощью газа под давлением для проникновения в клетки ткани-мишени.

[00383] Композиции, содержащие зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена и фармацевтически приемлемый носитель, конкретно предусматриваются данным документом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена приготовлен с композицией липидной системы доставки, например, липосом, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации такие композиции вводят любым путем, который считается желательным квалифицированным специалистом. Композиции могут быть введены субъекту различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, путем ингаляции, путем буккального введения, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставный, или их комбинации. Для ветеринарного применения композиция может быть введена в виде достаточно приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринарный врач может легко определить режим введения доз и способ введения, которые наиболее подходят для конкретного животного. Композиции можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами», или другими физическими методами, такими как электропорация («ЭП»), гидродинамические методы или применение ультразвука.

[00384] В некоторых случаях зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена доставляется гидродинамической инъекцией, которая представляет собой простой и высокоэффективный метод прямой внутриклеточной доставки любых водорастворимых соединений и частиц во внутренние органы и скелетные мышцы во всей конечности.

[00385] В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляют с помощью ультразвука путем создания наноскопических пор в мембране для облегчения внутриклеточной доставки частиц ДНК в клетки внутренних органов или опухолей, поэтому размер и концентрация плазмидной ДНК имеют большое значение для эффективности системы. В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляют магнитофекцией с использованием магнитных полей для концентрирования частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, в клетках-мишенях.

[00386] В некоторых случаях могут применяться химические системы доставки, например, с использованием наномерных комплексов, которые включают компактизацию отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты поликатионными наномерными частицами, принадлежащими к катионным липосомам/мицеллам или катионным полимерам. Катионные липиды, используемые в указанном способе доставки, включают, без ограничений, моновалентные катионные липиды, поливалентные катионные липиды, гуанидин-содержащие соединения, соединения-производные холестерина, катионные полимеры (например, полиэтиленимин, поли-L-лизин, протамин, другие катионные полимеры), и гибриды липид-полимер.

А. Экзосомы

[00387] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, доставляют упакованным в экзосомы. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы эндоцитарного происхождения, которые высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Их поверхность состоит из липидного бислоя из клеточной мембраны донорной клетки, они содержат цитозоль из клетки, продуцирующей экзосому, и экспонируют на поверхности мембранные белки из родительской клетки. Экзосомы продуцируются различными типами клеток, включая эпителиальные клетки, В- и Т-лимфоциты, тучные клетки (ТК), а также дендритные клетки (ДК). Некоторые варианты реализации предусматривают использование экзосом диаметром от 10 нм до 1 мкм, от 20 нм до 500 нм, от 30 нм до 250 нм, от 50 нм до 100 нм. Экзосомы могут быть выделены для доставки в клетки-мишени с использованием либо их донорных клеток, либо путем введения в них специфических нуклеиновых кислот.Для получения экзосом, содержащих бескапсидные векторы ААВ по данному изобретению, могут быть использованы различные подходы, известные в данной области техники.

B. Микрочастицы/наночастицы

[00388] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, доставляют с помощью липидных наночастиц. Как правило, липидные наночастицы содержат ионизируемый аминолипид (например, гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)-бутаноат, DLin-MC3-DMA, фосфатидилхолин (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, DSPC), холестерин и липид оболочки (полиэтиленгликоль-димиристолглицерин, ПЭГ-ДМГ), например, как описано Tam et al. (2013), Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.

[00389] В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет средний диаметр от примерно 10 нм до примерно 1000 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 10 нм до примерно 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 25 нм до примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации препарат липидных наночастиц (например, композиция, содержащая множество липидных наночастиц) имеет распределение по размерам, при котором средний размер (например, диаметр) составляет от примерно 70 нм до примерно 200 нм, и более типично, средний размер составляет примерно 100 нм или меньше.

[00390] Различные липидные наночастицы, известные в данной области техники, могут быть использованы для доставки зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, раскрытого в данном документе. Например, различные способы доставки с использованием липидных наночастиц описаны в патентах США №№9404127, 9006417 и 9518272.

[00391] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, раскрытый в данном документе, доставляют с помощью наночастиц золота. Как правило, нуклеиновая кислота может быть ковалентно связана с наночастицей золота или нековалентно связана с наночастицей золота (например, связана посредством заряд-зарядного взаимодействия), например, как описано Ding et al. (2014), Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. В некоторых вариантах реализации конъюгаты наночастиц золота с нуклеиновой кислотой получают с использованием способов, описанных, например, в патенте США №6812334.

C. Конъюгаты

[00392] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, конъюгирован (например, ковалентно связан) с агентом, который увеличивает клеточное поглощение. «Агент, который увеличивает клеточное поглощение», представляет собой молекулу, которая облегчает транспорт нуклеиновой кислоты через липидную мембрану. Например, нуклеиновая кислота может быть конъюгирована с липофильным соединением (например, холестерином, токоферолом и т.д.), проникающим в клетки пептидом (CPP) (например, пенетратином, TAT, Syn1B и т.д.) и полиаминами (например, спермином). Дополнительные примеры агентов, которые повышают клеточное поглощение, раскрыты, например, в Winkler (2013), Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.

[00393] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, конъюгирован с полимером (например, полимерной молекулой) или молекулой фолата (например, молекулой фолиевой кислоты). В общем, доставка нуклеиновых кислот, конъюгированных с полимерами, известна в данной области техники, например, как описано в WO2000/34343 и WO2008/022309. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, конъюгирован с поли(амидным) полимером, например, как описано в патенте США №8987377. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, описанная в указанном документе, конъюгирована с молекулой фолиевой кислоты, как описано в патенте США №8550455.

[00394] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, конъюгирован с углеводом, например, как описано в патенте США №8450467.

D. Нанокапсулы

[00395] Альтернативно, могут быть использованы нанокапсульные композиции зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе. В общем, вещества могут быть заключены в нанокапсулы стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных избыточной внутриклеточной нагрузкой полимерами, такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) необходимо разрабатывать с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Предусматривается использование биоразлагаемых полиалкил-цианоакрилатных наночастиц, которые удовлетворяют таким требованиям.

Е. Липосомы

[00396] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они функционируют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00397] Образование и применение липосом являются общеизвестными специалистам в данной области техники. Были разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке и временем полувыведения из кровотока (патент США №5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США №№5567434; 5552157; 5565213; 5738868 и 5795587).

F. Типичные композиции липосом и липидных наночастиц (ЛНЧ)

[00398] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку, например, в клетку, нуждающуюся в экспрессии трансгена. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они функционируют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00399] Липидные наночастицы (ЛНЧ), содержащие зкДНК, раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которые включены в данный документ в полном объеме и предназначена для использования в способах и композициях, раскрытых в данном документе.

[00400] В некоторых аспектах липидная наночастица, содержащая зкДНК, представляет собой ионизируемый липид.

[00401] Как правило, липидные частицы получают при соотношении общего липида к зкДНК (массовом или весовом) от примерно 10:1 до 30:1. В некоторых вариантах реализации отношение липида к зкДНК (массовое соотношение; отношение мас./мас.) может находиться в диапазоне значений от примерно 1:1 до примерно 25:1, от примерно 10:1 до примерно 14:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 10:1, от примерно 5:1 до примерно 9:1, или от примерно 6:1 до примерно 9:1. Количество липидов и зкДНК можно регулировать для обеспечения желаемого отношения N/P, например, отношения N/P, равного 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше. Обычно общее содержание липидов в композиции липидных частиц может составлять от примерно 5 до примерно 30 мг/мл. Ионизируемые липиды также называются в данном документе катионными липидами. Типичные примеры ионизируемых липидов описаны в международных патентных публикациях РСТ WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 и WO2013/086354, и публикациях патентов США US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 и US2013/0195920, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00402] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)-бутаноат (DLin-MC3-DMA или MC3), имеющий следующую структуру:

.

VIII. Способы доставки зкДНК-векторов

[00403] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть доставлен в клетку-мишень in vitro или in vivo различными подходящими способами. Могут быть нанесены или инъецированы отдельно взятые зкДНК-векторы. зкДНК-векторы могут быть доставлены в клетку без помощи реагента для трансфекции или других физических средств. Альтернативно, зкДНК-векторы могут быть доставлены с использованием любого известного в данной области техники реагента для трансфекции или других известных в технике физических средств, которые облегчают проникновение ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, соединений, богатых полилизином, соединений, богатых аргинином, фосфата кальция, микровезикул. микроинъекции, электропорации и т.п.

[00404] Напротив, трансдукция бескапсидными ААВ-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать обычными вирионами ААВ, с применением различных реагентов для доставки.

[00405] В другом варианте реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена вводят в ЦНС (например, в головной мозг или в глаз). зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черная субстанция, шишковидная железа), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, в том числе затылочные, височные, теменные и лобные доли, кору, базальные ганглии, гиппокамп и миндалевидное тело, лимбическая система, неокортекс, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик. зкДНК-вектор также можно вводить в различные области глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. зкДНК-вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, посредством люмбальной пункции). Дополнительно, зкДНК-вектор может быть введен в ЦНС внутрисосудисто в ситуациях, когда гематоэнцефалический барьер нарушен (например, опухоль головного мозга или инфаркт головного мозга).

[00406] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен в желаемую область (области) ЦНС любым путем, известным в данной области техники, включая, без ограничения, интратекальную, внутриглазную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит), интраназальную, внутриушную, внутриглазную (например, интравитреальную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтенонову область) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой к мотонейронам.

[00407] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена вводят в жидкой композиции путем прямой инъекции (например, стереотаксической инъекции) в желаемую область или компартмент ЦНС. В других вариантах реализации зкДНК-вектор может применяться путем местного нанесения на желаемую область или путем интраназального введения аэрозольной композиции. Введение в глаз может осуществляться путем местного нанесения капель жидкости. В качестве дополнительной альтернативы зкДНК-вектор может быть введен в виде твердой композиции с замедленным высвобождением (см., например, патент США №7201898). В дополнительных вариантах реализации, зкДНК-вектор может использоваться для ретроградного транспорта для лечения, облегчения и/или предотвращения заболеваний и расстройств, связанных с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз (БАС); спинальная мышечная атрофия (СМА) и т.д.). Например, зкДНК-вектор может быть доставлен в мышечную ткань, из которой он может мигрировать в нейроны.

IX. Дополнительные применения зкДНК-векторов

[00408] Композиции и зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно использовать для экспрессии гена-мишени или трансгена с различными целями. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, профилактики или облегчения болезненных состояний или расстройств у млекопитающего-субъекта. Полученный трансген может быть перенесен субъекту (например, экспрессироваться у субъекта) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации полученный трансген может экспрессироваться у субъекта в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией, активностью продукта гена или неадекватной повышающей регуляцией гена, который полученный трансген подавляет или иным образом вызывает снижение его экспрессии. В других вариантах реализации полученный трансген заменяет или дополняет дефектную копию нативного гена. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что трансген может не быть открытой рамкой считывания гена, который сам должен транскрибироваться; вместо этого, он может быть областью промотора или областью репрессора гена-мишени, и зкДНК-вектор может модифицировать такую область, приводя в результате к модуляции экспрессии гена, представляющего интерес.

[00409] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования при создании животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена.

X. Способы применения

[00410] зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, также может быть использован в способе доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, трансгена) в клетку-мишень (например, клетку-хозяина). Способ, в частности, может представлять собой способ доставки трансгена в клетку нуждающегося в этом субъекта и лечения представляющего интерес заболевания. Изобретение позволяет экспрессировать in vivo трансген, например, белок, антитело, нуклеиновую кислоту, такую как микроРНК и т.д., кодируемый зкДНК-вектором, в клетке у субъекта таким образом, что при этом возникает терапевтический эффект экспрессии трансгена. Такие результаты наблюдаются как при in vivo, так и при in vitro способах доставки зкДНК-вектора.

[00411] Кроме того, изобретение обеспечивает способ доставки трансгена в клетку нуждающегося в этом субъекта, включающий многократное введение зкДНК-вектора по изобретению, содержащего указанную нуклеиновую кислоту или трансген, представляющие интерес, для титрования экспрессии трансгена до желаемого уровня.

[00412] Нуклеиновую кислоту (кислоты) зкДНК-вектора вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, внутривенный (например, в липосомной композиции), прямую доставку в выбранный орган (например, внутрипортальную доставку в печень), внутримышечный и другие парентеральные пути введения. Пути введения могут быть скомбинированы, если это желательно.

[00413] Доставка ДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектора) не ограничивается доставкой замещающих генов. Например, получаемые традиционными методами (например, с использованием способа продуцирования на основе клеток, или полученные методом синтеза ДНК-векторы с замкнутыми концами) (например, зкДНК-векторы), как описано в данном документе, можно использовать вместе с другими системами доставки, предназначенными для обеспечения некоторой части генной терапии. Один неограничивающий пример системы, которая может быть скомбинирована с синтетически продуцируемыми зкДНК-векторами в соответствии с данным изобретением, включает системы, доставляющие по отдельности один или несколько кофакторов или иммуносупрессоров для эффективной генной экспрессии трансгена.

[00414] Изобретение также предусматривает способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Выбранный зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного описания.

[00415] Композиции и векторы, представленные в данном документе, могут быть использованы для доставки трансгена с различными целями. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, несущей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена.

[00416] В принципе, экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту или любой трансген, кодирующий белок или полипептид, который либо редуцирован или отсутствует из-за мутации, либо приносит терапевтическую пользу при сверхэкспрессии, и считается входящей в объем изобретения. Предпочтительно, бактериальная ДНК, кроме находящейся в виде инсерции, не присутствует и, предпочтительно, бактериальная ДНК отсутствует в композициях зкДНК по данному изобретению.

[00417] зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена не ограничивается одним видом зкДНК-вектора. Фактически, в другом аспекте, множественные зкДНК-векторы, содержащие разные трансгены или один и тот же трансген, но функционально связанные с различными промоторами или цис-регуляторными элементами, могут доставляться одновременно или последовательно в клетку-мишень, ткань, орган или субъекту. Таким образом, эта стратегия может обеспечивать возможность генной терапии или доставки множества генов одновременно. Также можно разместить разные части трансгена в отдельных зкДНК-векторах (например, разные домены и/или кофакторы, необходимые для функциональности трансгена), которые можно вводить одновременно или в разное время, и которые можно регулировать по отдельности, тем самым добавляя дополнительный уровень контроля экспрессии трансгена. Доставка также может осуществляться неоднократно и, что важно для генной терапии в клинических условиях, с последующим увеличением или снижением доз, учитывая отсутствие иммунного ответа хозяина против капсида благодаря отсутствию вирусного капсида. Ожидается, что никакой реакции против капсида возникать не будет из-за отсутствия капсида.

[00418] Изобретение также предусматривает способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

XI. Способы лечения

[00419] Описанная в данном документе технология также демонстрирует способы получения, а также способы применения раскрытых зкДНК-векторов различным образом, включая, например, применения, методологии, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии ex situ, in vitro и in vivo.

[00420] В данном документе предусматривается способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (например, мышечную клетку или ткань, или другой тип пораженных клеток) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

[00421] В данном документе раскрыты композиции и составы зкДНК-векторов, которые включают один или несколько зкДНК-векторов по данному изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми буферами, разбавителями или эксципиентами. Такие композиции могут быть включены в один или несколько диагностических или терапевтических наборов для диагностики, профилактики, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, поражения, расстройства, травмы или нарушения функции. В одном аспекте заболевание, поражение, расстройство, травма или нарушение функции представляют собой заболевание, поражение, расстройство, травму или нарушение функции у человека.

[00422] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ введения нуждающемуся в этом субъекту диагностически или терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, причем способ введения в клетку, ткань или орган нуждающегося в этом субъекта некоторого количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе; выполняемого в течение периода времени, обеспечивающего возможность эффективной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, обеспечивает тем самым субъекта диагностически или терапевтически эффективным количеством белка, пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессируемых зкДНК-вектором. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00423] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ диагностики, профилактики, лечения или облегчения по меньшей мере одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, нарушения функции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В общем, способ включает, по меньшей мере, стадию введения нуждающемуся в этом субъекту одного или нескольких раскрытых зкДНК-векторов, в количестве и в течение времени, достаточных для диагностики, профилактики, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, нарушения функции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00424] Другим аспектом является применение зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена в качестве инструмента для лечения или ослабления одного или нескольких симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых известны дефектные гены, и которые, как правило, делятся на два класса: состояния недостаточности, обычно, недостаточности ферментов, которые в общем наследуются рецессивным образом, и разбалансированные состояния, в которые могут быть вовлечены регуляторные или структурные белки, и которые, как правило, но не всегда, наследуются доминантным образом. В случае заболеваний с состояниями недостаточности зкДНК-векторы могут применяться для доставки трансгенов, чтобы ввести в пораженные ткани нормальный ген для проведения заместительной терапии, а также, в некоторых вариантах реализации, для создания животных моделей заболевания с применением антисмысловых мутаций. В случае болезненных состояний разбалансированности, зкДНК-векторы могут применяться для создания болезненного состояния в модельной системе, которая затем может использоваться для противодействия указанному болезненному состоянию. Таким образом, зкДНК-векторы и способы, раскрытые в данном документе, позволяют лечить генетические заболевания. Согласно данному документу, лечение болезненного состояния осуществляют путем частичного или полного устранения недостаточности или разбалансированности, которые вызывают заболевание или увеличивают его тяжесть.

А. Клетки-хозяева

[00425] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена доставляет трансген в клетку-хозяина по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека, включая, например, клетки крови, стволовые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD34⁺, клетки печени, раковые клетки, сосудистые клетки, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, глазные клетки или клетки сетчатки, эпителиальные или эндотелиальные клетки, дендритные клетки, фибробласты или любые другие клетки млекопитающих, включая, без ограничений, гепатоциты (т.е. клетки печени), клетки легкого, клетки сердца, клетки поджелудочной железы, клетки кишечника, диафрагмальные клетки, почечные клетки (т.е. клетки почек), нервные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, или любой одной или нескольких выбранных тканей субъекта, для которого предусматривается проведение генной терапии. В одном аспекте клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека.

[00426] Данное изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как упомянуто выше, включающим зкДНК-векторы, как описано в данном документе. Таким образом, можно использовать несколько клеток-хозяев в зависимости от цели, как будет очевидно специалисту в данной области техники. Конструкт или зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, включающий донорную последовательность, вводят в клетку-хозяина так, чтобы донорная последовательность поддерживалась как интегрированный в хромосому элемент, как было описано ранее. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, возникающих во время репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от донорной последовательности и ее источника. Клетка-хозяин также может представлять собой эукариота, такого как клетка млекопитающего, насекомого, растения или гриба. В одном из вариантов реализации клетка-хозяин представляет собой клетку человека (например, первичные клетки, стволовые клетки, или иммортализированную клеточную линию). В некоторых вариантах клетке-хозяину может быть введен ex vivo зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, с последующей доставкой субъекту после события генной терапии. Клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, например, соматической клеткой или стволовой клеткой, индуцированной плюрипотентной стволовой клеткой или клеткой крови, например, Т-клеткой или В-клеткой, или клеткой костного мозга. В определенных вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой аллогенную клетку. Например, Т-клеточная геномная инженерия полезна для иммунотерапий рака, модуляции заболеваний, такой как терапия ВИЧ (например, нокаут рецептора, такого как CXCR4 и CCR5), и терапий иммунодефицита. Мишенями иммунотерапии могут быть рецепторы ГКГ (главного комплекса гистосовместимости) на В-клетках. В некоторых вариантах реализации генно-модифицированные клетки-хозяева, например, стволовые клетки костного мозга, например, клетки CD34⁺, или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, могут быть трансплантированы пациенту обратно для экспрессии терапевтического белка.

B. Типичные трансгены и заболевания, подлежащие лечению зкДНК-векторами

[00427] зкДНК-векторы также полезны для коррекции дефектного гена. В качестве неограничивающего примера, ген DMD мышечной дистрофии Дюшена может быть доставлен с использованием зкДНК-векторов, как описано в данном документе.

[00428] зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена или его композицию можно использовать для лечения любого наследственного заболевания. В качестве неограничивающего примера, зкДНК-вектор или его композиция могут быть использованы, например, для лечения транстиретинового амилоидоза (ATTR), орфанного заболевания, при котором мутантный белок подвергается неправильной укладке и агрегирует в нервах, сердце, желудочно-кишечной системе и т.д. В данном документе предусматривается, что указанное заболевание можно лечить путем делеции мутантного гена заболевания (mutTTR) с использованием зкДНК-векторных систем, описанных в данном документе. Такое лечение наследственных заболеваний может остановить прогрессирование заболевания и может привести к регрессу установленного заболевания или уменьшению по меньшей мере одного симптома заболевания по меньшей мере на 10%.

[00429] В другом варианте реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена можно использовать для лечения дефицита орнитин-транскарбамилазы (дефицит ОТК), гипераммониемии или других нарушений цикла мочевины, которые ухудшают способность новорожденного или ребенка детоксифицировать аммиак. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома ОТК и/или улучшения качества жизни для субъекта с дефицитом ОТК. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую ОТК, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00430] В другом варианте реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена можно использовать для лечения фенилкетонурии (ФКУ) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент фенилаланин-гидроксилазу, для уменьшения накопления пищевого фенилаланина, который может быть токсичным для пациентов, страдающих фенилкетонурией. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома фенилкетонурии и/или улучшения качества жизнь для субъекта с ФКУ. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фенилаланин-гидроксилазу, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00431] В другом варианте реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена можно использовать для лечения болезни накопления гликогена (БНГ) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, для коррекции аберрантного синтеза или расщепления гликогена у субъектов с БНГ. Неограничивающие примеры ферментов, которые могут доставляться или экспрессироваться с использованием зкДНК-векторов и способов, описанных в данном документе, включают гликогенсинтазу, глюкозо-6-фосфатазу, кислую альфа-глюкозидазу, гликоген-деветвящий фермент, гликоген-ветвящий фермент, мышечную гликогенфосфорилазу, гликогенфосфорилазу печени, мышечную фосфофруктокиназу, киназу фосфорилазы, глюкозный транспортер-2 (GLUT-2), альдолазу A, бета-енолазу, фосфоглюкомутазу-1 (PGM-1) и гликогенин-1. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома БНГ и/или улучшения качества жизни для субъекта с БНГ. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент для коррекции аберрантного накопления гликогена, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00432] Также предусматривается использование описанных в данном документе зкДНК-векторов при лечении любого из: врожденного амавроза Лебера (ВАЛ), полиглутаминовых болезней, включая polyQ-повторы, и дефицита альфа-1-антитрипсина (A1AT). Врожденный амавроз Лебера представляет собой редкое врожденное заболевание глаз, приводящее к слепоте, которое может быть вызвано мутацией в одном из следующих генов: GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 и/или PRPH2. В данном изобретении предусматривается, что зкДНК-векторы и композиции и способы, описанные в данном документе, могут быть адаптированы для доставки одного или нескольких генов, связанных с ВАЛ, для коррекции ошибки в гене (генах), ответственных за симптомы ВАЛ. К полиглутаминовым болезням относятся, без ограничений: денторубральная атрофия, болезнь Гентингтона, спинальная и бульбарная мышечная атрофия и спино-мозжечковая атаксия типов 1, 2, 3 (также известна как болезнь Мачадо-Джозефа), 6, 7 и 17. Дефицит А1АТ - это генетическое заболевание, которое вызывает дефект продуцирования альфа-1-антитрипсина, что приводит к снижению активности фермента в крови и легких, что, в свою очередь, может привести к эмфиземе или хронической обструктивной болезни легких у пораженных субъектов. В данном документе конкретно предусматривается лечение субъекта с дефицитом A1AT с использованием зкДНК-векторов или их композиций, как описано в данном документе. В данном документе предусматривается, что зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый белок для лечения ВАЛ, полиглутаминовых заболеваний или дефицита A1AT, может быть введен нуждающемуся в лечении субъекту.

[00433] В других вариантах реализации, композиции, содержащие зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, можно использовать для доставки, в том числе, вирусной последовательности, последовательности патогена, хромосомной последовательности, места стыка транслокаций (например, транслокации, связанной с раком), некодирующего РНК-гена или РНК-последовательности, связанного с заболеванием гена.

[00434] Любая представляющая интерес нуклеиновая кислота или целевой ген могут быть доставлены или экспрессированы с помощью зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе. Целевые нуклеиновые кислоты и гены включают, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи, зрелые микроРНК и т.д.), предпочтительно, терапевтические (например, для медицинского, диагностического или ветеринарного применения) или иммуногенные (например, для вакцин) полипептиды. В некоторых вариантах реализации целевые нуклеиновые кислоты или гены, на которые нацелены зкДНК-векторы, описанные в данном документе, кодируют один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию.

[00435] В частности, целевой ген или трансген для экспрессии зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, может кодировать, например, без ограничений, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты, для использования при лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства. В одном аспекте, заболевание, дисфункция, травма, поражение и/или расстройство представляет собой заболевание, дисфункцию, травму, поражение и/или расстройство человека.

[00436] Экспрессионная кассета может также кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды, или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR)). Экспрессионные кассеты могут включать экзогенную последовательность, кодирующую репортерный белок, который будет использоваться в экспериментальных или диагностических целях, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хлорамфениколацетилтрансфераза (ХАТ), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области техники.

[00437] Последовательности, представленные в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, описанного в данном документе, могут быть кодон-оптимизированы для целевой клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках позвоночного животного, представляющего интерес, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ «Gene Forge®» фирмы «Aptagen» («Aptagen, Inc.», 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных.

[00438] Многие организмы демонстрируют тенденцию к использованию определенных кодонов при кодировании вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Предпочтение кодонов или неоднозначность кодонов, различия в использовании кодонов между организмами, обусловлены вырожденностью генетического кода и хорошо документированы для многих организмов. Смещение кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, считается зависимой, в частности, от свойств транслируемых кодонов и доступности молекул определенных транспортных РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно отображает кодоны, наиболее часто используемые в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации кодонов.

[00439] Благодаря большому количеству доступных последовательностей генов для широкого спектра видов животных, растений и микробов, можно рассчитать относительные частоты использования кодонов (Nakamura Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).

[00440] Как отмечено в данном документе, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, раскрытый в данном документе, может кодировать белок или пептид, или последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты, или терапевтический агент, включая, без ограничений, один или несколько агонистов, антагонистов, антиапоптозных факторов, ингибиторов, рецепторов, цитокинов, цитотоксинов, эритропоэтических агентов, гликопротеинов, факторов роста, рецепторов факторов роста, гормонов, рецепторов гормонов, интерферонов, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, факторов роста нервов, нейроактивных пептидов, рецепторов нейроактивных пептидов, протеаз, ингибиторов протеаз, белковых декарбоксилаз, протеинкиназ, ингибиторов протеинкиназ, ферментов, рецептор-связывающих белков, транспортных белков или одного или нескольких их ингибиторов, серотониновых рецепторов или одного или нескольких ингибиторов их поглощения, серпинов, рецепторов серпинов, опухолевых супрессоров, диагностических молекул, химиотерапевтических агентов, цитотоксинов, или любую их комбинацию.

[00441] зкДНК-векторы также полезны для прекращения экспрессии генов. Например, в одном варианте реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена можно использовать для экспрессии антисмысловой нуклеиновой кислоты или функциональной РНК для индукции нокдауна гена-мишени. В качестве неограничивающего примера, экспрессия рецепторов ВИЧ CXCR4 и CCR5 была успешно удалена в первичных Т-клетках человека, см. Schumann et al. (2015), PNAS 112 (33): 10437-10442, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки. Другим геном-мишенью для ингибирования является PD-1, причем зкДНК-вектор может экспрессировать ингибирующую нуклеиновую кислоту или РНКи или функциональную РНК для ингибирования экспрессии PD-1. PD-1 экспрессирует рецептор клеточной поверхности иммунной контрольной точки на хронически активных Т-клетках, наблюдающихся при злокачественном образовании. См. Schumann et al. выше.

[00442] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы полезны для коррекции дефектного гена путем экспрессии трансгена, который нацелен на больной ген. Неограничивающие примеры заболеваний или расстройств, поддающихся лечению с помощью зкДНК-вектора, как описано в данном документе, перечислены, вместе с относящимися к ним и связанными с ними генами, в Таблицах A-C патентной публикации США 2014/0170753, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00443] В альтернативных вариантах реализации зкДНК-векторы используются для вставки экспрессионной кассеты для экспрессии терапевтического белка или репортерного белка в гене безопасной гавани, например, в неактивном интроне. В определенных вариантах реализации беспромоторную кассету вставляют в ген безопасной гавани. В таких вариантах реализации, беспромоторная кассета может использовать регуляторные элементы гена безопасной гавани (промоторов, энхансеров и сигнальных пептидов), причем неограничивающим примером вставки в локус безопасной гавани является вставка в локус альбумина, описанная в Blood (2015) 126 (15): 1777-1784, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Инсерция в альбумин имеет то преимущество, что позволяет секретировать трансген в кровь (см., например, Пример 22). Кроме того, сайт безопасной гавани генома может быть определен с использованием методов, известных в данной области техники и описанных, например, в Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016), или Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В данном документе специально предусматривается, что сайты безопасной гавани в геноме аденоассоциированного вируса (ААВ) (например, сайт безопасной гавани AAVS1) можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе (см., например, Oceguera-Yanez et al. Methods 101:43-55 (2016), или Tiyaboonchai, A et al. Stem Cell Res 12(3):630-7 (2014), содержание которых включено посредством ссылки в полном объеме). Например, геномный сайт безопасной гавани AAVS1 можно использовать с векторами и композициями зкДНК, как описано в данном документе, для целей гематопоэз-специфической экспрессии трансгена и сайленсинга генов в эмбриональных стволовых клетках (например, эмбриональных стволовых клетках человека) или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПС-клетках). Кроме того, в данном документе предусматривается, что синтетические или коммерчески доступные донорные матрицы гомологично направленной репарации для вставки в сайт безопасной гавани AAVS1 (AASV1) на хромосоме 19 можно использовать с векторами или композициями зкДНК, как описано в данном документе. Например, матрицы гомологично направленной репарации и направляющая РНК могут быть приобретены из коммерческих источников, например, у фирмы «System Biosciences» (Пало-Альто, Калифорния), и клонированы в зкДНК-вектор.

[00444] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы используются для экспрессии трансгена, или нокаута или снижения экспрессии гена-мишени в Т-клетке, например, для модифицирования Т-клетки для улучшения адоптивной клеточной передачи и/или терапий CAR-T (см., например, Пример 24). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, может экспрессировать трансгены, которые нокаутируют гены. Неограничивающие примеры терапевтически релевантных нокаутов Т-клеток описаны в PNAS (2015) 112(33):10437-10442, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

C. Дополнительные заболевания для проведения генной терапии:

[00445] В общем, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, описанный в данном документе, можно использовать для доставки любого трансгена в соответствии с приведенным выше описанием для лечения, предотвращения или облегчения симптомов, ассоциированных с любым расстройством, связанным с генной экспрессией. Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, без ограничений: муковисцидоз (и другие заболевания легких), гемофилию A, гемофилию B, талассемию, анемию и другие расстройства крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический боковой склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболические дефекты, дегенеративные заболевания сетчатки глаза (и другие заболевания глаз), митохондриопатии (например, наследственную оптическую нейропатию Лебера (НОНЛ), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, плече-лопаточно-лицевую миопатию (ПЛЛМ) и кардиомиопатии), заболевания солидных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца); и т.п.В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть выгодно использованы при лечении индивидуумов с метаболическими нарушениями (например, дефицитом орнитинтранскарбамилазы).

[00446] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, описанный в данном документе, может применяться для лечения, облегчения и/или предотвращения заболевания или расстройства, вызываемого мутацией в гене или генном продукте. Типичные примеры заболеваний или расстройств, лечение которых может проводиться с применением зкДНК-векторов, включают, без ограничений, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (ФКУ), болезнь накопления гликогена); болезни или расстройства цикла мочевины (например, недостаточность орнитинтранскарбамилазы (ОТК)); болезни или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Гунтера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (ПСВХ); заболевания или расстройства крови (например, гемофилию (A и B), талассемию и анемию); раковые заболевания и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, муковисцидоз).

[00447] В еще одном аспекте зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, может применяться для доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности в ситуациях, когда желательна регуляция уровня экспрессии трансгена (например, трансгенов, кодирующих гормоны или факторы роста, как описано в данном документе).

[00448] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, описанный в данном документе, может применяться для коррекции аномального уровня и/или функции генного продукта (например, отсутствия или дефекта белка), которые приводят к заболеванию или расстройству. Указанный зкДНК-вектор может продуцировать функциональный белок и/или модифицировать уровни указанного белка для облегчения или снижения симптомов, являющихся результатом конкретного заболевания или расстройства, или приносить пользу при конкретном заболевании или расстройстве, вызываемом отсутствием или дефектом белка. Например, лечение недостаточности ОТК может осуществляться путем продуцирования функционального фермента ОТК; лечение гемофилии A и B может осуществляться путем модификации уровней фактора VIII, фактора IX и фактора X; лечение фенилкетонурии может осуществляться путем модификации уровней фермента фенилаланингидроксилазы; лечение болезни Фабри или болезни Гоше может осуществляться путем продуцирования функциональной альфа-галактозидазы или бета-глюкоцереброзидазы, соответственно; лечение МЛД или MPSII может осуществляться путем продуцирования функциональной арилсульфатазы A или идуронат-2-сульфатазы, соответственно; лечение муковисцедоза может осуществляться путем продуцирования функционального регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе; лечение гликогеновой болезни может осуществляться путем восстановления функции функционального фермента глюкозо-6-фосфатазы; и лечение ПСВХ может осуществляться путем продуцирования функциональных генов ATP8B1, ABCB11, ABCB4 или TJP2.

[00449] В альтернативных вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут применяться для обеспечения клетки антисмысловой нуклеиновой кислотой in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой молекулу РНК-интерференции (РНКи), экспрессия антисмысловой нуклеиновой кислоты или РНКи в целевой клетке снижает уровень экспрессии конкретного белка указанной клеткой. Соответственно, трансгены, представляющие собой молекулы РНКи или антисмысловые нуклеиновые кислоты, могут вводиться для снижения экспрессии конкретного белка у нуждающегося в этом субъекта. Антисмысловые нуклеиновые кислоты также можно вводить в клетки in vitro для регулирования физиологии клеток, например, для оптимизации систем культивирования клеток или тканей.

[00450] В некоторых вариантах реализации типичные примеры трансгенов, кодируемых зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, включают, без ограничений: X, лизосомальные ферменты (например, гексозаминидазу A, ассоциированную с болезнью Тея-Сакса, или идуронатсульфатазу, ассоциированную с синдромом Гунтера/MPS II), эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу, глобин, лептин, каталазу, тирозингидроксилазу, а также цитокины (например, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.п.), пептидные факторы роста и гормоны (например, соматотропин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста (ТРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста нервов (ФРН), нейротрофический фактор-3 и 4, нейротрофический фактор головного мозга (НФГМ), глиальный фактор роста (ГФР), трансформирующие факторы роста α и β; и т.п.), рецепторы (например, рецептор фактора некроза опухоли).

[00451] В некоторых примерных вариантах реализации указанный трансген кодирует моноклональное антитело, специфическое в отношении одной или нескольких желательных мишеней. Типичные зкДНК-векторы для контролируемой экспрессии антител и слитых белков в способах, описанных в данном документе, раскрыты в международной заявке PCT/US19/18016, поданной 14 февраля 2019 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00452] В некоторых примерных вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует более одного трансгена. В некоторых примерных вариантах реализации указанный трансген кодирует слитый белок, содержащий два разных представляющих интерес полипептида. В некоторых вариантах реализации указанный трансген кодирует антитело, в том числе полноразмерное антитело или фрагмент антитела, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации указанное антитело представляет собой последовательность антигенсвязывающего домена или вариабельного домена иммуноглобулина, как определено в данном документе. Другие иллюстративные примеры трансгенных последовательностей кодируют продукты суицидных генов (тимидинкиназу, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу и фактор некроза опухоли), белки, придающие устойчивость к лекарственным средствам, применяемым в противораковой терапии, и продукты генов-супрессоров опухолей.

[00453] В репрезентативном варианте реализации трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, может применяться для лечения мышечной дистрофии у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает: введение эффективного для лечения, облегчения или предотвращения количества зкДНК-вектора, описанного в данном документе, причем указанный зкДНК-вектор содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую дистрофин, минидистрофин, микродистрофин, пропептид миостатина, фоллистатин, растворимый рецептор активина II типа, ИПФР-1 (инсулиноподобный фактор роста), противовоспалительные полипептиды, такие как доминантный мутант I-каппа-B, саркоспан, утрофин, микродистрофин, ламинин-α2, α-саркогликан, β-саркогликан, γ-саркогликан, δ-саркогликан, ИПФР-1, антитело или фрагмент антитела против миостатина или пропептида миостатина, и/или РНКи против миостатина. В конкретных вариантах реализации указанный зкДНК-вектор может быть введен в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу, как описано в других разделах данного документа.

[00454] В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может применяться для доставки трансгена в скелетную, сердечную или диафрагмальную мышцу, для продуцирования полипептида (например, фермента) или функциональной РНК (например, РНКи, микроРНК, антисмысловой РНК), которые в норме циркулируют в крови, или для системной доставки в другие ткани с целью лечения, облегчения и/или предотвращения расстройства (например, метаболического расстройства, такого как диабет (например, инсулина), гемофилии (например, VIII), мукополисахаридозного расстройства (например, синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Гунтера, синдрома Санфилиппо A, B, C, D, синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами и т.п.) или расстройства лизосомального накопления (такого как болезнь Гоше [глюкоцереброзидаза], болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза] или болезнь Фабри [альфа-галактозидаза A]) или расстройства накопления гликогена (такого как болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза]). Другие подходящие белки для лечения, облегчения и/или предотвращения метаболических расстройств описаны выше.

[00455] В других вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, может применяться для доставки трансгена в способе лечения, облегчения и/или предотвращения метаболического нарушения у нуждающегося в этом субъекта. Иллюстративные примеры метаболических нарушений и трансгенов, кодирующих полипептиды, описаны в данном документе. Необязательно, указанный полипептид секретируется (например, полипептид, который представляет собой секретируемый полипептид в его естественном состоянии, или модифицированный для обеспечения секреции, например, за счет образования функциональной связи с секреторной сигнальной последовательностью, как известно специалистам в данной области техники).

[00456] Другой аспект данного изобретения относится к способу лечения, облегчения и/или предотвращения врожденной сердечной недостаточности или ЗПА у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает введение зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, субъекту-млекопитающему, причем указанный зкДНК-вектор содержит трансген, кодирующий, например, Ca²⁺-АТФазу саркоплазматического эндоретикулума (SERCA2a), ангиогенный фактор, ингибитор фосфатазы I (I-1), РНКи к фосфоламбану; фосфоламбановую ингибиторную или доминантно-негативную молекулу, такую как фосфоламбан S16E, белок с мотивом «цинковый палец», который регулирует ген фосфоламбана, β2-адренергический рецептор, бета-2-адренергическую рецепторную киназу (BARK), PI3-киназу, кальсаркан, ингибитор бета-адренергической рецепторной киназы (βARKct), ингибитор 1 протеинфосфатазы 1, S100A1, парвальбумин, аденилилциклазу типа 6, молекулу, которая осуществляет нокдаун сопряженной с G-белком рецепторной киназы типа 2, такую как усеченный конститутивно активный βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, калликреин, HIF, тимозин-β4, mir-1, mir-133, mir-206 и/или mir-208.

[00457] Описанные в данном документе зкДНК-векторы могут быть введены в легкие субъекта любыми подходящими средствами, необязательно, путем введения аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, содержащих зкДНК-векторы, которые субъект вдыхает.Указанные вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли из жидких частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут быть получены любыми подходящими средствами, например, с помощью пневматического аэрозольного небулайзера или ультразвукового небулайзера, как известно специалистам в данной области техники. См., например, патент США №4501729. Аэрозоли из твердых частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут сходным образом быть получены с помощью любого генератора медикаментозных аэрозолей из твердых частиц, с применением методик, известных в области фармацевтики.

[00458] В некоторых вариантах реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в ткани ЦНС (например, головной мозг, глаз). В конкретных вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно вводить для лечения, облегчения или предотвращения заболеваний ЦНС, в том числе генетических нарушений, нейродегенеративных нарушений, нарушений психики и опухолей. Иллюстративные примеры заболеваний ЦНС включают, без ограничений, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, болезнь Лея, болезнь Рефсума, синдром Туретта, первичный боковой склероз, амиотрофический боковой склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь Пика, мышечную дистрофию, рассеянный склероз, тяжелую миастению, болезнь Бинсвангера, травму в результате повреждения спинного мозга или головы, болезнь Тея-Сакса, болезнь Леша-Нихена, эпилепсию, церебральные инфаркты, нарушения психики, в том числе расстройства настроения (например, депрессию, биполярное аффективное расстройство, устойчивое аффективное расстройство, вторичное расстройство настроения), шизофрению, лекарственную или наркотическую зависимость (например, алкоголизм и зависимости от других веществ), неврозы (например, тревожность, обсессивное расстройство, соматоформное расстройство, диссоциативное расстройство, состояние горя, послеродовую депрессию), психоз (например, галлюцинации и бред), деменцию, паранойю, синдром дефицита внимания, психосексуальные нарушения, нарушения сна, связанные с болью нарушения, связанные с питанием или массой тела нарушения (например, ожирение, кахексию, нервную анорексию и булимию), и раковые заболевания и опухоли ЦНС (например, опухоли гипофиза).

[00459] Глазные расстройства, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по изобретению, включают офтальмологические расстройства, затрагивающие сетчатку, задний путь и зрительный нерв (например, пигментный ретинит, диабетическую ретинопатию и другие дегенеративные заболевания сетчатки глаза, увеит, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому). Многие офтальмологические заболевания и расстройства ассоциированы с одним или несколькими из трех типов признаков: (1) ангиогенез, (2) воспаление и (3) дегенерация. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, можно применять для доставки антиангиогенных факторов; противовоспалительных факторов; факторов, замедляющих дегенерацию клеток, способствующих сохранению клеток или способствующих росту клеток, и комбинаций вышеперечисленного. Например, диабетическая ретинопатия характеризуется ангиогенезом. Диабетическую ретинопатию можно лечить путем доставки одного или нескольких антиангиогенных факторов либо интраокулярно (например, в стекловидное тело), либо периокулярно (например, в область субтенонова пространства). Один или несколько нейротрофических факторов могут быть доставлены совместно, либо интраокулярно (например, интравитреально), либо периокулярно. Дополнительные заболевания глаз, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по данному изобретению, включают географическую атрофию, сосудистую или «влажную» макулодистрофию, болезнь Штаргардта, врожденный амавроз Лебера (ВАЛ), синдром Ушера, эластическую псевдоксантому (ЭПК), Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP), Х-сцепленное расслоение сетчатки (XLRS), хороидеремию, врожденную нейропатию зрительного нерва Лебера (НОНЛ), ахроматопсию, палочко-колбочковую дистрофию, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, диабетический макулярный отек; рак и опухоли глаз.

[00460] В некоторых вариантах реализации воспалительные глазные заболевания или расстройства (например, увеит) можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по данному изобретению. Один или несколько противовоспалительных факторов могут экспрессироваться путем интраокулярного (например, в стекловидное тело или переднюю камеру) введения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе. В других вариантах реализации заболевания глаз или расстройства, характеризующиеся дегенерацией сетчатки (например, пигментный ретинит), можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по данному изобретению. Для лечения таких заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки, можно использовать внутриглазное (например, витреальное введение) зкДНК-вектора, описанного в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов. В некоторых вариантах реализации заболевания или расстройства, которые включают как ангиогенез, так и дегенерацию сетчатки (например, возрастную макулярную дегенерацию), можно лечить с помощью зкДНК-векторов по изобретению. Лечение возрастной макулярной дегенерации может осуществляться путем введения зкДНК-вектора, как описано в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов, интраокулярно (например, в стекловидное тело), и/или кодирующего один или несколько антиангиогенных факторов, интраокулярно или периокулярно (например, в область субтенонова пространства). Глаукома характеризуется повышенным глазным давлением и потерей ганглиозных клеток сетчатки. Лечение глаукомы включает введение одного или нескольких нейропротекторных агентов, которые защищают клетки от эксайтотоксичного повреждения, с использованием зкДНК-вектора, как описано в данном документе. Соответственно, такие агенты включают антагонисты N-метил-D-аспартата (НМДА), цитокины и нейротрофические факторы, которые могут быть доставлены интраокулярно, необязательно, интравитреально, с применением зкДНК-вектора, как описано в данном документе.

[00461] В других вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, можно использовать для лечения судорог, например, для снижения возникновения, частоты или тяжести судорог.Эффективность терапевтического лечения судорог может быть оценена на основании поведенческих признаков (например, дрожь, глазные или ротовые тики) и/или электрографическими средствами (большинство судорог характеризуются отличительными электрографическими аномалиями). Таким образом, зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, описанный в данном документе, также может быть использован для лечения эпилепсии, для которой характерны множественные припадки с течением времени. В одном репрезентативном варианте реализации, соматостатин (или его активный фрагмент) вводят в головной мозг с использованием зкДНК-вектора, как описано в данном документе, для лечения опухоли гипофиза. В соответствии с этим вариантом реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, кодирующий соматостатин (или его активный фрагмент), вводят в гипофиз путем микроинфузии. Аналогично, такое лечение может быть использовано для лечения акромегалии (аномальной секреции гормона роста гипофизом). Последовательность нуклеиновой кислоты (например, GenBank, №доступа J00306) и аминокислотная последовательность (например, GenBank, № доступа P01166; содержит процессированные активные пептиды соматостатин-28 и соматостатин-14) соматостатинов, известна специалистам в данной области техники. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор может кодировать трансген, который содержит секреторный сигнал, как описано в патенте США №7071172.

[00462] Другой аспект изобретения относится к применению зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, для получения антисмысловой РНК, РНКи или другой функциональной РНК (например, рибозима) для системной доставки субъекту in vivo. Соответственно, в некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор может содержать трансген, который кодирует антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим (например, как описано в патенте США №5877022), РНК, которые влияют на опосредованный сплайсосомой транс-сплайсинг (см. Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; патент США №6013487; патент США №6083702), интерферирующие РНК (РНКи), опосредующие сайленсинг генов (см. Sharp et al., (2000) Science 287:2431), или другие нетранслируемые РНК, такие как направляющие РНК (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; патент США №5869248, выданный на имя Yuan et al.), и т.п.

[00463] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может также дополнительно содержать трансген, кодирующий репортерный полипептид (например, фермент, такой как зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза). В некоторых вариантах реализации трансген, который кодирует репортерный белок, пригодный для экспериментальных или диагностических целей, выбирают из любого из: β-лактамазы, β-галактозидазы (LacZ), щелочной фосфатазы, тимидинкиназы, зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ), хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ), люциферазы и других, хорошо известных в данной области техники. В некоторых аспектах зкДНК-векторы, содержащие трансген, кодирующий репортерный полипептид, могут использоваться для диагностических целей или в качестве маркеров активности зкДНК-вектора у субъекта, которому они вводятся.

[00464] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может содержать трансген или гетерологичную нуклеотидную последовательность, обладающую гомологией в отношении локуса на хромосоме хозяина и рекомбинирующуюся с ним. Указанный подход может быть использован для коррекции генетического дефекта в клетке-хозяине.

[00465] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может содержать трансген, который можно использовать для экспрессии иммуногенного полипептида у субъекта, например, для вакцинации. Трансген может кодировать любой представляющий интерес иммуноген, известный в данной области техники, включая, без ограничений, иммуногены вируса иммунодефицита человека, вируса гриппа, белков gag, опухолевых антигенов, раковых антигенов, бактериальных антигенов, вирусных антигенов и т.п.

[00466] D. Тестирование на успешную экспрессию генов с использованием зкДНК-вектора

[00467] Анализы, хорошо известные в данной области техники, могут быть использованы для тестирования эффективности доставки генов с помощью зкДНК-вектора, и могут проводиться на моделях как in vitro, так и in vivo. Специалист в данной области техники может оценить нокин или нокаут желаемого трансгена с помощью зкДНК путем измерения уровней мРНК и белка желаемого трансгена (например, методами ПЦР с обратной транскрипцией, вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА)). Изменения нуклеиновой кислоты с помощью зкДНК (например, точечные мутации или делецию областей ДНК) можно оценить методом глубокого секвенирования геномной ДНК-мишени. В одном варианте реализации зкДНК содержит репортерный белок, который можно использовать для оценки экспрессии желаемого трансгена, например, путем исследования экспрессии репортерного белка методом флуоресцентной микроскопии или с помощью люминесцентного планшет-ридера. Для применений in vivo, анализы функции белка можно использовать при тестировании функциональности данного гена и/или генного продукта для определения успешности экспрессии гена. Например, предусматривается, что точечная мутация в гене CFTR трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (МВТР), ингибирующая способность МВТР перемещать анионы (например, Cl^-) по анионному каналу, может быть скорректирована путем доставки субъекту функционального (т.е. немутированного) гена CFTR с помощью зкДНК-вектора. После введения зкДНК-вектора, специалист в данной области техники может оценить способность анионов перемещаться по анионному каналу, чтобы определить успешность доставки и экспрессии гена CFTR. Специалист сможет определить наилучший тест для измерения функциональности белка in vitro или in vivo.

[00468] В данном документе предусматривается, что эффекты генной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора в клетке или у субъекта могут продолжаться на протяжении по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере четырех месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 20 лет, или могут быть постоянными.

[00469] В некоторых вариантах реализации трансген в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или зкДНК-векторе, описанном в данном документе, может быть кодон-оптимизирован для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных, например, мыши или человека (например, гуманизированных), путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значительного числа кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах данного позвоночного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ «Gene Forge®» фирмы «Aptagen» («Aptagen, Inc.») или другой общедоступной базы данных.

XII. Введение

[00470] Примеры способов введения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, раскрытого в данном документе, включают пероральное, ректальное, трансмукозальное, интраназальное, ингаляционное (например, в аэрозоле), буккальное (например, сублингвальное), вагинальное, интратекальное, внутриглазное, чрескожное, интраэндотелиальное введение, введение in utero (или in ovo), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, интракраниальное, внутримышечное [в том числе введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу], интраплевральное, интрацеребральное и внутрисуставное), местное (например, на поверхности кожи и слизистых оболочек, в том числе поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатическое введение и т.п., а также прямую инъекцию в ткань или орган (например, в печень, глаз, скелетную мышцу, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу или головной мозг).

[00471] Может осуществляться введение указанного зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена в любой место в организме субъекта, включая, без ограничений, место, выбранное из группы, состоящей из головного мозга, скелетной мышцы, гладкой мышцы, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почки, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаза. Может также осуществляться введение указанного зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена в опухоль (например, внутрь опухоли или лимфатического узла, или возле них). Наиболее подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, лечение, облегчение и/или предотвращение которого проводится, и от природы конкретного используемого зкДНК-вектора. Кроме того, зкДНК позволяет вводить более одного трансгена в одном векторе или в нескольких зкДНК-векторах (например, коктейль зкДНК).

[00472] Введение зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, описанного в данном документе, в скелетные мышцы в соответствии с данным изобретением включает, без ограничений, введение в скелетные мышцы конечностей (например, в плече, предплечье, бедре и/или голени), спины, шеи, головы (например, язык), грудной клетки, брюшной полости, таза/промежности и/или пальцев. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в скелетные мышцы путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечности, (необязательно, перфузии изолированной конечности - ноги и/или руки; см., например, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464), и/или прямой внутримышечной инъекции. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД)) путем перфузии конечности, необязательно, перфузии изолированной конечности (например, путем внутривенного или внутрисуставного введения). В определенных вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, можно вводить без использования «гидродинамических» методов.

[00473] Введение зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как описано в данном документе, в сердечную мышцу включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или перегородку. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как интрааортальное введение, прямой инъекции в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или перфузии коронарной артерии. Введение в диафрагмальную мышцу может быть осуществлено любым подходящим способом, в том числе путем внутривенного введения, внутриартериального введения и/или внутрибрюшинного введения. Введение в гладкую мышцу может осуществляться любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. В одном варианте реализации может быть осуществлено введение в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладких мышцах, возле и/или на них.

[00474] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена по данному изобретению вводят в скелетные мышцы, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или заболевания сердца (например, ЗПА или застойной сердечной недостаточности).

А. Лечение ex vivo

[00475] В некоторых вариантах реализации клетки извлекают из субъекта, вводят в них зкДНК-вектор, и затем клетки возвращают в организм субъекта. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo, с последующим введением обратно в организм субъекта, известны в данной области техники (см., например, патент США №5399346; описание которого в полном объеме включено в данный документ). Альтернативно, зкДНК-вектор вводят в клетки от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и указанные клетки вводят нуждающемуся в этом субъекту.

[00476] Клетки, трансдуцированные зкДНК-вектором, предпочтительно вводят субъекту в «терапевтически эффективном количестве» в комбинации с фармацевтическим носителем. Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или обеспечивать исцеление, при условии, что субъект получает некоторую пользу.

[00477] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может кодировать трансген (иногда называемый гетерологичной нуклеотидной последовательностью), представляющий собой любой полипептид, продуцирование которого является желательным в клетке in vitro, ex vivo или in vivo. Например, в отличие от использования зкДНК-векторов в способе лечения, как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в культивированные клетки, и экспрессируемый генный продукт выделен из них, например, для получения антигенов или вакцин.

[00478] зкДНК-векторы могут применяться как в ветеринарии, так и в медицине. Подходящие субъекты для способов доставки генов ex vivo, как описано выше, включают как птиц (например, кур, уток, гусей, перепелов, индеек и фазанов), так и млекопитающих (например, людей, бычьих, овец, козьих, лошадиных, кошачьих, собачьих и зайцеобразных), причем млекопитающие являются предпочтительными. Люди являются наиболее предпочтительными субъектами. Люди включают новорожденных, младенцев, подростков и взрослых.

[00479] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу доставки трансгена в клетку. Как правило, в способах in vitro указанный зкДНК-вектор для контролируемой экспрессии трансгена может быть введен в клетку с применением способов, раскрытых в данном документе, а также других способов, известных в данной области техники. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если зкДНК-вектор вводят в клетку in vivo (например, субъекту), биологически эффективное количество указанного зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для обеспечения трансдукции и экспрессии указанного трансгена в клетке-мишени.

C. Единичные лекарственные формы

[00480] В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма обычно будет адаптирована к одному или нескольким конкретным путям введения фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения путем ингаляции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью генератора аэрозоля. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения, для буккального введения или для сублингвального введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, обычно представлено таким количеством указанного соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.

XIII. Различные варианты применения

[00481] Композиции и зкДНК-векторы, представленные в данном документе, можно использовать для доставки трансгена с различными целями, как описано выше. В некоторых вариантах реализации трансген может кодировать белок или представлять собой функциональную РНК, а в некоторых вариантах реализации может представлять собой белок или функциональную РНК, которая модифицирована для исследовательских целей, например, для создания соматической модели трансгенного животного, несущей одну или несколько мутаций, или откорректированную последовательность гена, например, для изучения функции гена-мишени. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК для создания животной модели заболевания.

[00482] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, облегчения или предотвращения болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором для контролируемой экспрессии трансгена, вводят пациенту в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с аномальной генной последовательностью, которая может приводить к любому одному или нескольким из следующего: снижению экспрессии, отсутствию экспрессии, или нарушению функции гена-мишени.

[00483] В некоторых вариантах реализации предусматривается использование зкДНК-векторов в способах диагностики и скрининга, в которых трансген транзиентно или стабильно экспрессируется в системе клеточной культуры или, альтернативно, в модели трансгенного животного.

[00484] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, обеспечивает способ трансдукции популяции клеток млекопитающих. В общем, указанный способ включает по меньшей мере стадию введения в одну или несколько клеток популяции композиции, содержащей эффективное количество одной или нескольких зкДНК, раскрытых в данном документе.

[00485] Кроме того, данное изобретение предусматривает композиции, а также терапевтические и/или диагностические наборы, которые включают один или несколько раскрытых зкДНК-векторов или композиций зкДНК, составленных с использованием одного или нескольких дополнительных ингредиентов, или подготовленных вместе с одной или несколькими инструкциями по их применению.

[00486] Клетка для введения зкДНК-вектора для контролируемой экспрессии трансгена, как раскрыто в данном документе, может быть любого типа, включая, без ограничений, нервные клетки (включая клетки периферической и центральной нервных систем, в частности, клетки головного мозга), клетки легкого, клетки сетчатки, эпителиальные клетки (например, кишечные и респираторные эпителиальные клетки), мышечные клетки, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая островковые клетки), клетки печени, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, зародышевые клетки и т.п.Альтернативно, клетка может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы, клетка может быть стволовой клеткой (например, нервной стволовой клеткой, стволовой клеткой печени). В качестве еще одной альтернативы, клетка может быть раковой или опухолевой клеткой. Кроме того, указанные клетки могут происходить из любого вида, как указано выше.

[00487] Некоторые варианты реализации технологии, описанной в данном документе, могут быть определены согласно любому из следующих пронумерованных пунктов:

1. Композиция, содержащая зкДНК-вектор, который можно вводить повторными дозами для повышения уровня экспрессии трансгена от предшествующего уровня экспрессии, причем указанный зкДНК-вектор содержит асимметричные или симметричные последовательности ИКП, фланкирующие полинуклеотидную последовательность трансгена, функционально связанную с промотором, при этом по меньшей мере один из ИКП является компетентным по репликации ИКП.

2. Композиция по п.1, в которой зкДНК-вектор экспрессирует трансген в течение периода времени, выбранного из по меньшей мере 42 суток, по меньшей мере 84 суток, и по меньшей мере 132 суток.

3. Композиция по п.1, в которой трансген представляет собой генетическое лекарственное средство, выбранное из любого из: нуклеиновой кислоты, ингибитора, пептида или полипептида, антитела или фрагмента антитела, слитого белка, антигена, антагониста, агониста или молекулы РНКи.

4. Способ повышения уровня экспрессии трансгена в клетке, включающий:

a. введение в клетку в первый момент времени примирующей дозы композиции для достижения экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, и

b. введение в клетку во второй момент времени дозы композиции для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции в первый момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты для достижения желаемого уровня экспрессии,

при этом композиция, вводимая в первый и второй моменты времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейных и прерывистых ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

5. Способ по п.4, в котором две асимметричные или симметричные последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) представляют собой ИКП ААВ.

6. Способ по пп.4-5, в котором ИКП, содержащий функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, представляет собой ИКП ААВ дикого типа.

7. Способ по любому из пп.4-6, в котором ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.

8. Способ по любому из пп.4-7, в котором два асимметричных или симметричных ИКП представляют собой пару ИКП, выбранных из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4; и (ii) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 2.

9. Способ по любому из пп.4-8, в котором зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

10. Способ по любому из пп.4-9, в котором второй момент времени наступает через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после первого момента времени.

11. Способ по любому из пп.4-10, в котором гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтический трансген, а желаемый уровень экспрессии трансгена представляет собой терапевтически эффективное количество.

12. Способ по любому из пп.4-11, в котором зкДНК-вектор получают из векторного полинуклеотида, причем векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), по меньшей мере один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП; присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида и продуцирование ДНК-вектора в клетке насекомого, при этом ДНК-вектор может быть получен с помощью процесса, включающего стадии:

a. инкубации популяции клеток насекомых, несущих векторный полинуклеотид, который лишен последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования бескапсидного невирусного ДНК-вектора в клетках насекомых, причем клетки насекомых не способны продуцировать бескапсидную невирусную ДНК внутри клеток насекомых; и

b. сбора и выделения бескапсидной невирусной ДНК из клеток насекомых;

при этом присутствие бескапсидного невирусного ДНК-вектора, выделенного из клеток насекомых, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клеток насекомых, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК.

13. Способ по любому из пп.4-11, дополнительно включающий введение в клетку, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дозы композиции для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты для достижения желаемого уровня экспрессии,

при этом композиция, вводимая в один или несколько моментов времени после второго момента времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

при этом зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

14. Способ по любому из пп.4-13, в котором зкДНК-вектор, вводимый в любой из: первого, второго или любого последующего момента времени, вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

15. Способ по любому из пп.1-14, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой один и тот же зкДНК-вектор, содержащий один и тот же трансген или модифицированный трансген.

16. Способ по любому из пп.1-15, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же самый трансген или модифицированный трансген.

17. Способ по п.16, в котором другой зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном или модифицированным трансгеном.

18. Способ по любому из пп.1-17, в котором трансген представляет собой генетическое лекарственное средство.

19. Способ лечения заболевания у субъекта, включающий:

a. введение субъекту в первый момент времени примирующей дозы композиции, содержащей невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК) для достижения экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, и

b. введение субъекту во второй момент времени дозы композиции, содержащей невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессия гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции в первый момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты для достижения желаемого уровня экспрессии, тем самым осуществляя лечение заболевания у субъекта,

при этом зкДНК-вектор, вводимый в первый и второй моменты времени, содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями с инвертированным концевым повтором (ИКП) ААВ, причем один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК-вектор при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

20. Способ по п.19, в котором две асимметричные или симметричные последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) представляют собой ИКП ААВ.

21. Способ по п.19-20, в котором ИКП, содержащий функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, представляет собой ИКП ААВ дикого типа.

22. Способ по любому из пп.19-21, в котором ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.

23. Способ по любому из пп.19-22, в котором два асимметричных ИКП представляют собой пару ИКП, выбранных из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4; и (ii) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 2.

24. Способ по любому из пп.19-23, в котором зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

25. Способ по любому из пп.19-24, в котором второй момент времени наступает через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после первого момента времени.

26. Способ по любому из пп.19-25, в котором желаемый уровень экспрессии трансгена, достигаемый после введения композиции во второй момент времени, представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена.

27. Способ по любому из пп.19-26, дополнительно включающий введение субъекту, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дозы композиции, содержащей зкДНК-вектор, для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты до желаемого уровня экспрессии,

при этом композиция, вводимая в один или несколько моментов времени после второго момента времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

28. Способ по любому из пп.19-27, в котором желаемый уровень экспрессии трансгена, достигаемый после введения композиции в один или несколько моментов времени после второго момента времени, представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена.

29. Способ по любому из пп.19-28, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, вводят с фармацевтически приемлемым носителем.

30. Способ по любому из пп.19-29, в котором один или несколько моментов времени после второго момента времени наступают через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после предшествующего момента времени.

31. Способ по любому из пп.19-30, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой один и тот же зкДНК-вектор, содержащий один и тот же трансген или модифицированный трансген.

32. Способ по любому из пп.19-30, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же самый трансген или модифицированный трансген.

33. Способ по п.31, в котором другой зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном или модифицированным трансгеном.

34. Способ по любому из пп.19 или 33, в котором зкДНК-вектор получают из векторного полинуклеотида, причем векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), по меньшей мере один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП; при этом присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида и продуцирование вектора ДНК в клетке насекомого, причем вектор ДНК можно получить с помощью процесса, включающего стадии:

a. инкубации популяции клеток насекомых, несущих векторный полинуклеотид, который лишен последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования бескапсидного невирусного ДНК-вектора в клетках насекомых, причем клетки насекомых не способны продуцировать бескапсидную невирусную ДНК внутри клеток насекомых; и

b. сбора и выделения бескапсидной невирусной ДНК из клеток насекомых;

при этом присутствие бескапсидного невирусного ДНК-вектора, выделенного из клеток насекомых, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клеток насекомых, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК.

35. Способ по любому из пп.19-34, в котором трансген представляет собой генетическое лекарственное средство.

36. Композиция, содержащая зкДНК-вектор, который можно вводить повторными дозами для поддержания уровня устойчивой экспрессии трансгена, причем зкДНК-вектор содержит асимметричные или симметричные последовательности ИКП, фланкирующие полинуклеотидную последовательность трансгена, функционально связанную с промотором, при этом по меньшей мере один из ИКП является компетентным по репликации ИКП.

37. Композиция по п.36, в которой зкДНК-вектор экспрессирует трансген в течение периода времени, выбранного из по меньшей мере 42 суток, по меньшей мере 84 суток, и по меньшей мере 132 суток.

38. Композиция по п.36, в которой трансген представляет собой генетическое лекарственное средство, выбранное из любого из: нуклеиновой кислоты, ингибитора, пептида или полипептида, антитела или фрагмента антитела, антигена, антагониста, агониста или молекулы РНКи.

39. Способ поддержания уровня экспрессии трансгена в клетке, включающий:

a. введение в клетку в первый момент времени примирующей дозы композиции для достижения экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, и

b. введение в клетку во второй момент времени дозы композиции для компенсации какого-либо снижения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты после введения композиции в первый момент времени,

при этом композиция, вводимая в первый и второй моменты времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейных и прерывистых ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

40. Способ по п.39, в котором две асимметричные или симметричные последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) представляют собой ИКП ААВ.

41. Способ по пп.39-40, в котором ИКП, содержащий функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, представляет собой ИКП ААВ дикого типа.

42. Способ по любому из пп.39-41, в котором ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.

43. Способ по любому из пп.39-42, в котором два асимметричных ИКП представляют собой пару ИКП, выбранных из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4; и (ii) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 2.

44. Способ по любому из пп.39-43, в котором зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

45. Способ по любому из пп.39-44, в котором второй момент времени наступает через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после первого момента времени.

46. Способ по любому из пп.39-45, в котором гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует терапевтический трансген, а устойчивый уровень экспрессии трансгена представляет собой терапевтически эффективное количество.

47. Способ по любому из пп.39-46, в котором зкДНК-вектор получают из векторного полинуклеотида, причем векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя асимметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), по меньшей мере один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП; при этом присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида и продуцирование вектора ДНК в клетке насекомого, и вектор ДНК можно получить с помощью процесса, включающего стадии:

a. инкубации популяции клеток насекомых, несущих векторный полинуклеотид, который лишен последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования бескапсидного невирусного ДНК-вектора в клетках насекомых, причем клетки насекомых не способны продуцировать бескапсидную невирусную ДНК внутри клеток насекомых; и

b.сбора и выделения бескапсидной невирусной ДНК из клеток насекомых;

при этом присутствие бескапсидного невирусного ДНК-вектора, выделенного из клеток насекомых, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клеток насекомых, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК.

48. Способ по любому из пп.39-47, дополнительно включающий введение в клетку, в один или несколько моментов времени после второго момента времени, дополнительной дозы композиции для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигаемым после введения композиции во второй момент времени или в предшествующий момент времени, или для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты для поддержания желаемого уровня устойчивой экспрессии,

при этом композиция, вводимая в один или несколько моментов времени после второго момента времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

при этом зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

49. Способ по любому из пп.39-48, в котором зкДНК-вектор, вводимый в любой из первого, второго или любого последующего момента времени, вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

50. Способ по любому из пп.39-49, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой один и тот же зкДНК-вектор, содержащий один и тот же трансген или модифицированный трансген.

51. Способ по любому из пп.39-50, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же самый трансген или модифицированный трансген.

52. Способ по п.51, в котором другой зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном или с модифицированным трансгеном.

53. Способ по любому из пп.1-52, в котором трансген представляет собой генетическое лекарственное средство.

54. Способ лечения заболевания у субъекта, включающий:

a. введение субъекту в первый момент времени примирующей дозы композиции, содержащей невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК) для достижения экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, и

b. введение субъекту во второй момент времени дозы композиции, содержащей невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), для поддержания уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты на желаемом устойчивом уровне по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции в первый момент времени, тем самым обеспечивая лечение заболевания у субъекта,

при этом зкДНК-вектор, вводимый в первый и второй моменты времени, содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями с инвертированным концевым повтором (ИКП) ААВ, причем один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК-вектор при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

55. Способ по п.54, в котором две асимметричные или симметричные последовательности инвертированных концевых повторов (ИКП) представляют собой ИКП ААВ.

56. Способ по п.54 или п.55, в котором ИКП, содержащий функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, представляет собой ИКП ААВ дикого типа.

57. Способ по любому из пп.54-56, в котором ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.

58. Способ по любому из пп.54-57, в котором два асимметричных ИКП представляют собой пару ИКП, выбранных из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4; и (ii) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 2.

59. Способ по любому из пп.54-58, в котором зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом.

60. Способ по любому из пп.54-59, в котором второй момент времени наступает через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после первого момента времени.

61. Способ по любому из пп.54-60, в котором желаемый уровень экспрессии трансгена, достигнутый после введени композиции во второй момент времени, представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена.

62. Способ по любому из пп.54-61, дополнительно включающий введение субъекту в один или несколько моментов времени после второго момента времени дозы композиции, содержащей зкДНК-вектор, для повышения уровня экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с уровнем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, достигнутым после введения композиции во второй момент времени, с целью поддержания требуемого устойчивого уровня экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты,

при этом композиция, вводимая в один или несколько моментов времени после второго момента времени, содержит невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК), причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую трансген, функционально расположенный между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП) ААВ, один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП,

причем зкДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, демонстрирует присутствие характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от контролей линейной и прерывистой ДНК при анализе на неденатурирующем геле.

63. Способ по любому из пп.54-62, в котором желаемый уровень экспрессии трансгена, достигаемый после введения композиции в один или несколько моментов времени после второго момента времени, представляет собой терапевтически эффективное количество трансгена.

64. Способ по любому из пп.54-63, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, вводят с фармацевтически приемлемым носителем.

65. Способ по любому из пп.54-64, в котором один или несколько моментов времени после второго момента времени наступает через по меньшей мере 30 суток, или по меньшей мере 60 суток, или 60-90 суток, или 90-120 суток, или примерно 3-6 месяцев после предшествующего момента времени.

66. Способ по любому из пп.54-65, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой один и тот же зкДНК-вектор, содержащий один и тот же трансген или модифицированный трансген.

67. Способ по любому из пп.54-65, в котором зкДНК-вектор, вводимый в первый, второй или любой последующий момент времени, представляет собой другой зкДНК-вектор, содержащий тот же самый трансген или модифицированный трансген.

68. Способ по п.67, в котором другой зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном или с модифицированным трансгеном.

69. Способ по любому из пп.54-68, в котором зкДНК-вектор получают из векторного полинуклеотида, причем векторный полинуклеотид кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя асимметричными или симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ИКП), по меньшей мере один из ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep, и один из ИКП содержит делецию, вставку или замену относительно другого ИКП; при этом присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида и продуцирование вектора ДНК в клетке насекомого, причем вектор ДНК можно получить с помощью процесса, включающего стадии:

c. инкубации популяции клеток насекомых, несущих векторный полинуклеотид, который лишен последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение периода времени, достаточного для индукции продуцирования бескапсидного невирусного ДНК-вектора в клетках насекомых, причем клетки насекомых не способны продуцировать бескапсидную невирусную ДНК внутри клеток насекомых; и

d. сбора и выделения бескапсидной невирусной ДНК из клеток насекомых;

при этом присутствие бескапсидного невирусного ДНК-вектора, выделенного из клеток насекомых, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клеток насекомых, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК.

70. Способ по любому из пп.54-69, в котором трансген представляет собой генетическое лекарственное средство.

ПРИМЕРЫ

[00488] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что зкДНК-векторы могут быть сконструированы из любых ИКП дикого типа или модифицированных ИКП, описанных в данном документе, и что приведенные далее примеры способов могут быть использованы для конструирования и оценки активности таких зкДНК-векторов. Хотя способы проиллюстрированы конкретными зкДНК-векторами, они применимы к любому зкДНК-вектору в соответствии с описанием.

Пример 1: Конструирование зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых

[00489] Продуцирование зкДНК-векторов с использованием матрицы полинуклеотидного конструкта описано в Примере 1 заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для получения зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус.Без ограничения теорией, укажем, что в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ИКП и экспрессионный конструкт, причем по меньшей мере один из ИКП является модифицированным относительно последовательности ИКП дикого типа, реплицируется с образованием зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезания («освобождения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) посредством белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора.

[00490] В типичном примере способа для получения зкДНК-векторов используется зкДНК-плазмида, как описано в данном документе. На Фиг.1А и 1 В матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ИКП, так и правый модифицированный ИКП, с расположенными между указанными ИКП следующими последовательностями: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) посттранскрипционный элемент отклика (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA). Также между всеми компонентами были введены уникальные сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции (R1-R6) (изображенные на Фиг.1A и Фиг.1B), чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) встраивали в сайт клонирования методами генной инженерии для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду pFastBac HT B, полученную от «ThermoFisher Scientific».

[00491] Продуцирование зкДНК-бакмид

[00492] Компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки «MAX EFFICIENCY® DH10Bac™», «Thermo Fisher») трансформировали либо тестируемыми, либо контрольными плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бактерии отбирали путем скрининга с положительным отбором, основанного на сине-белом скрининге в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащей X-gal и IPTG с антибиотиками для отбора трансформантов, и поддержания бакмиды и плазмид с транспозазой. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, собирали и культивировали в 10 мл среды.

[00493] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды выделяли из E.coli и трансфицировали ими клетки насекомых Sf9 или Sf21 с применением «FugeneHD» для получения инфекционного бакуловируса. Адгезивные клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах T25 при 25°С. Через 4 суток культуральную среду (содержащую вирус P0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, отделяя инфекционные бакуловирусные частицы от клеток или клеточного дебриса.

[00494] Необязательно, первое поколение бакуловируса (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в инкубаторе с орбитальным шейкером при 130 об/мин при 25°С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигнут диаметра 18-19 нм (от диаметра наивных клеток, равного 14-15 нм) и плотности около 4.0E+6 клеток/мл. Через 3-8 суток после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

[00495] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. В частности, 4 × 20 мл культур клеток Sf9 с плотностью 2,5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27 °C. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 суток по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00496] «Rep-плазмида» была получена в экспрессионном векторе «pFASTBAC^TM-Dual» («ThermoFisher»), содержащем либо Rep78 (SEQ ID NO: 131 или 133) и Rep52 (SEQ ID NO: 132), либо Rep68 (SEQ ID NO: 130) и Rep40 (SEQ ID NO: 129). Указанной Rep-плазмидой трансформировали компетентные клетки DH10Bac («MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells» («Thermo Fisher»)), согласно предоставленному производителем протоколу. Рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac индуцировали для получения рекомбинантных бакмид («Rep-бакмиды»). Рекомбинантные бакмиды отбирали с применением положительного отбора, который включал сине-белый скрининг в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селективной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне LB). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E.coli, и указанными Rep-бакмидами трансфицировали клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.

[00497] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 суток и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 и культивации в 50-500 мл среды. Через 3-8 суток после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали, отделяя клетки путем центрифугирования или фильтрации, или используя другой способ фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, 4 × 20 мл культур клеток Sf9 с плотностью 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 суток по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00498] Получение и характеризация зкДНК-вектора

[00499] Как показано на Фиг.4B, затем добавляли культуральную среду для клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, либо (2) Rep-бакуловирус, описанные выше, в свежую культуру клеток Sf9 (2,5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25°С.Через 4-5 суток после коинфицирования определяли диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности около 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и собирали клеточные осадки. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - воды или буфера. зкДНК-вектор выделяли и очищали из клеток с использованием протокола очистки «Qiagen MIDI PLUS™» («Qiagen», обработка 0,2 мг массы клеточного осадка на колонку).

[00500] Значения выхода для зкДНК-векторов, продуцированных и очищенных из клеток насекомых Sf9, первоначально определяли на основании УФ-поглощения при 260 нм.

[00501] Оценка зкДНК-векторов может быть проведена путем идентификации с применением электрофореза на агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как проиллюстрировано на Фиг.4D, где наблюдается (a) присутствие характеристических полос, мигрирующих с вдвое большим размером на денатурирующих гелях по сравнению с нативными гелями после расщепления рестрикционной эндонуклеазой и гель-электрофоретического анализа, и (b) наличие полос мономера и димера (2×) на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала характерно для присутствия зкДНК-вектора.

[00502] Структуры выделенных зкДНК-векторов дополнительно анализировали путем расщепления ДНК, полученной из коинфицированных клеток Sf9 (как описано в данном документе) рестрикционными эндонуклеазами, выбранными на основании a) присутствия только одного сайта разрезания в зкДНК-векторах, и b) получения итоговых фрагментов достаточно большого размера, чтобы они были четко видны при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как продемонстрировано на Фиг.4D и 4E, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой можно различать по размеру их продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как для зкДНК-вектора с непрерывной структурой ожидается образование фрагментов размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00503] Таким образом, для того, чтобы качественно продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ковалентно замкнутые концы, как это требуется по определению, образцы расщепляли эндонуклеазой рестрикции, идентифицированной в контексте последовательности конкретного ДНК-вектора, как имеющая один сайт рестрикции, предпочтительно, приводящая к образованию двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза на денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК), линейная ДНК, не имеющая ковалентно замкнутых концов, будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., в то время как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), так как две цепи ДНК связаны и при разворачивании будут иметь вдвое большую длину (хотя и являются одноцепочечными). Кроме того, при расщеплении мономерных, димерных и n-мерных форм ДНК-векторов все они будут разделяться на фрагменты одинаковых размеров из-за связывания концов мультимерных ДНК-векторов (см. Фиг.4D).

[00504] В данном документе фраза «анализ для идентификации ДНК-векторов с помощью электрофореза на агарозном геле в условиях нативного и денатурирующего геля» относится к анализу для оценки наличия замкнутых концов зкДНК путем проведения расщепления рестрикционной эндонуклеазой с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Один пример такого анализа приведен ниже, хотя специалисту в данной области техники будет понятно, что возможны многие известные в данной области техники варианты указанного примера. Рестрикционную эндонуклеазу выбирают таким образом, чтобы она представляла собой фермент, делающий один разрез представляющего интерес зкДНК-вектора таким образом, чтобы образовывались продукты с длиной, составляющей приблизительно 1/3× и 2/3× длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем геле. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы «Qiagen» или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки «GE Healthcare ILUSTRA(MicroSpin(G-25», являются некоторыми из известных в данной области техники вариантов средств, используемых при расщеплении эндонуклеазами. Анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции, 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы «Qiagen», элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10-кратного денатурирующего раствора (10×=0,5 М NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10-кратного раствора красителя, не забуференного, и проведение анализа вместе с маркерами молекулярного веса ДНК, полученными путем добавления 10-кратного денатурирующего раствора в эксперименте с 4 репликами, на 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и прогонки геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области техники понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза, исходя из размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE (буфер трис-борат-ЭДТА) или TAE (буфер трис-ацетат-ЭДТА) и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с применением красителя «SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain» фирмы «Thermo Fisher» (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм).

[00505] Чистоту полученного зкДНК-вектора можно оценить с помощью любого известного в данной области техники метода. В качестве одного неограничивающего примера способа, вклад зкДНК-плазмиды в общее УФ-поглощение образца можно оценить путем сравнения интенсивности флуоресценции зкДНК-вектора со стандартом. Например, в случае определения УФ-поглощения, если на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, то это соответствует присутствию 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому соответствует полоса - например, если весь зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае составит 0,25 мкг при введении 1,0 мкг.Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, затем рассчитывают количество полосы зкДНК-вектора по уравнению линии регрессии, которое после этого можно использовать для определения процента общего ввода, представленного зкДНК-вектором, или процента чистоты.

[00506] В целях сравнения в Примере 1 описано получение зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых и матрицы полинуклеотидного конструкта, которое также описано в Примере 1 заявки PCT/US18/49996, включенной в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для получения зкДНК-векторов по данному изобретению в соответствии с Примером 1, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус.Без ограничения теорией, укажем, что в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ИКП и экспрессионный конструкт, причем по меньшей мере один из ИКП является модифицированным относительно последовательности ИКП дикого типа, реплицируется с образованием зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезания («освобождения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) посредством белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора.

[00507] Примером способа получения зкДНК-векторов с использованием клетки насекомого является его получение из зкДНК-плазмиды, как описано в данном документе. На Фиг.1А и 1 В матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ИКП, так и правый модифицированный ИКП, с расположенными между указанными ИКП следующими последовательностями: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) посттранскрипционный элемент отклика (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA). Также между всеми компонентами были введены уникальные сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции (R1-R6) (изображены на Фиг.1A и Фиг.1B), чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) встраивали в сайт клонирования методами генной инженерии для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду «pFastBac HT B», полученную от «ThermoFisher Scientific».

[00508] Продуцирование зкДНК-бакмид

[00509] Компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки «MAX EFFICIENCY® DH10Bac™», «Thermo Fisher») трансформировали либо тестируемыми, либо контрольными плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бакмиды отбирали путем скрининга с положительным отбором, основанного на сине-белом скрининге в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) и IPTG (изопропилтиогалактозид) с антибиотиками для отбора трансформантов, и поддержания бакмиды и плазмид с транспозазой. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, собирали и культивировали в 10 мл среды.

[00510] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды выделяли из E.coli и трансфицировали ими клетки насекомых Sf9 или Sf21 с применением «FugeneHD» для получения инфекционного бакуловируса. Адгезивные клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах T25 при 25°С.Через 4 дня культуральную среду (содержащую вирус P0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, отделяя инфекционные бакуловирусные частицы от клеток или клеточного дебриса.

[00511] Необязательно, первое поколение бакуловируса (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в инкубаторе с орбитальным шейкером при 130 об/мин при 25°С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигнут диаметра 18-19 нм (от диаметра наивных клеток, равного 14-15 нм) и плотности около 4.0E+6 клеток/мл. Через 3-8 суток после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

[00512] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. В частности, 4 × 20 мл культуры клеток Sf9 с плотностью 2,5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27 °C. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 суток по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00513] «Rep-плазмида» была получена в экспрессионном векторе «pFASTBAC^TM-Dual» («ThermoFisher»), содержащем либо Rep78 (SEQ ID NO: 131 или 133) и Rep52 (SEQ ID NO: 132), либо Rep68 (SEQ ID NO: 130) и Rep40 (SEQ ID NO: 129). Указанной Rep-плазмидой трансформировали компетентные клетки DH10Bac («MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells» («Thermo Fisher»)), согласно предоставленному производителем протоколу. Индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для получения рекомбинантных бакмид («Rep-бакмиды»). Рекомбинантные бакмиды отбирали с применением положительного отбора, который включал сине-белый скрининг в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селективной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне LB). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E.coli, и указанными Rep-бакмидами трансфицировали клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.

[00514] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 суток и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 и культивации в 50-500 мл среды. Через 3-8 суток после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали, отделяя клетки путем центрифугирования или фильтрации, или используя другой способ фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, 4 × 20 мл культуры клеток Sf9 с плотностью 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 суток по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00515] Получение и характеризация зкДНК-вектора

[00516] Среду для культивирования клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, и (2) Rep-бакуловирус, описанный выше, добавляли затем в свежую культуру клеток Sf9 (2,5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25°С.Через 4-5 суток после коинфицирования определяли диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности около 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и собирали клеточные осадки. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - воды или буфера. зкДНК-вектор выделяли из клеток и очищали с использованием протокола очистки «Qiagen MIDI PLUS™» («Qiagen», обработка 0,2 мг массы клеточного осадка на колонку).

[00517] Значения выхода для зкДНК-векторов, продуцированных и очищенных из клеток насекомых Sf9, первоначально определяли на основании УФ-поглощения при 260 нм. Правильность конфигурации очищенных зкДНК-векторов с замкнутыми концами можно оценить с использованием электрофоретической методологии, описанной в Примере 5.

ПРИМЕР 2: Получение синтетической зкДНК путем вырезания из молекулы двухцепочечной ДНК

[00518] Синтетический способ получения зкДНК-векторов описан в Примерах 2-6 международной заявки PCT/US19/14122, поданной 18 января 2019 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Один типичный пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода предусматривает вырезание двухцепочечной молекулы ДНК. Вкратце, зкДНК-вектор может быть получен с использованием двухцепочечного конструкта ДНК, например, см. Фиг.7А-8Е заявки PCT/US19/14122. В некоторых вариантах реализации двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой зкДНК-плазмиду, см., например, Фиг.6 международной патентной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.).

[00519] В некоторых вариантах реализации конструкт для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе.

[00520] В иллюстративных целях в Примере 2 описано получение зкДНК-векторов в качестве примеров ДНК-векторов с замкнутыми концами, получаемых с использованием этого способа. Однако, хотя зкДНК-векторы описаны в этом Примере в качестве примера, иллюстрирующего in vitro синтетические способы продуцирования для получения ДНК-вектора с замкнутыми концами путем вырезания двухцепочечного полинуклеотида, содержащего ИКП и экспрессионную кассету (например, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты), с последующим лигированием свободных 3'- и 5'-концов, как описано в данном документе, специалисту в данной области техники известно, что, как указано выше, можно модифицировать двухцепочечную полинуклеотидную молекулу ДНК таким образом, чтобы получить любой желаемый ДНК-вектор с замкнутыми концами. включая, без ограничений, ДНК с утолщенными концами («doggybone»), гантелеобразную («dumbbell») ДНК и т.п.

[00521] Способ включает (i) вырезание последовательности, кодирующей экспрессионную кассету, из двухцепочечного конструкта ДНК, и (ii) формирование шпилечных структур в одном или нескольких ИКП, и (iii) соединение свободных 5'- и 3'-концов путем лигирования, например, с помощью ДНК-лигазы Т4.

[00522] Двухцепочечный ДНК-конструкт содержит, в порядке от 5' к 3': первый сайт эндонуклеазы рестрикции; левый ИКП; экспрессионную кассету; правый ИКП; и второй сайт эндонуклеазы рестрикции. Двухцепочечный ДНК-конструкт затем вводят в контакт с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции для генерирования двухцепочечных разрывов в обоих сайтах эндонуклеазы рестрикции. Оба сайта могут быть мишенями одной эндонуклеазы, или каждый сайт может быть мишенью разных эндонуклеаз, при условии, что сайты рестрикции не входят в матрицу зкДНК-вектора. В результате этого происходит вырезание последовательности между сайтами эндонуклеаз рестрикции из остальной части двухцепочечного ДНК-конструкта. После лигирования образуется ДНК-вектор с замкнутыми концами.

[00523] Один или оба ИКП, используемые в указанном способе, могут представлять собой ИКП дикого типа. Также могут использоваться модифицированные ИКП, причем модификация может включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов из ИКП дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C' (см., например, Фиг.3B и 3D), и могут иметь две или более шпилечных петель или одну шпилечную петлю. Модифицированный ИКП со шпилечной петлей может быть получен путем генетической модификации существующего олигонуклеотида или биологическим и/или химическим синтезом de novo.

[00524] В неограничивающем примере, левый и правый ИКП-6 (SEQ ID NO: 111 и 112) включают делеции 40 нуклеотидов в плечах B-B' и C-C' по сравнению с ИКП ААВ2 дикого типа. Прогнозируется, что нуклеотиды, оставшиеся в модифицированном ИКП, образуют единичную шпилечную структуру. Свободная энергия Гиббса расправления структуры составляет около -54,4 ккал/моль. Также могут быть проведены другие модификации ИКП, включая необязательную делецию функционального сайта связывания Rep или сайта Trs.

ПРИМЕР 3: Продуцирование зкДНК посредством конструирования олигонуклеотидов

[00525] Другой пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, включающего сборку различных олигонуклеотидов, представлен в Примере 3 заявки PCT/US19/14122, в котором зкДНК-вектор получают путем синтеза олигонуклеотидов 5'- и 3'-ИКП и лигирования олигонуклеотидов ИКП с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. Фиг.11B заявки PCT/US19/14122 демонстрирует пример способа лигирования олигонуклеотида 5'-ИКП и олигонуклеотида 3'-ИКП с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету.

[00526] Как раскрыто в данном документе, олигонуклеотиды ИКП могут содержать ИКП-ДТ или модифицированные ИКП (например, см. Фиг.6A, 6B, 7A и 7B заявки PCT/US19/14122, которая включена в данный документ в полном объеме). Типичные олигонуклеотиды ИКП включают, без ограничений, SEQ ID NO: 134-145 (например, см. Таблицу 7 в заявке PCT/US19/14122). Модифицированные ИКП могут включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов относительно ИКП дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C'. Олигонуклеотиды ИКП, содержащие ИКП-ДТ или мод-ИКП, как описано в данном документе, предназначенные для использования в бесклеточном синтезе, могут быть получены путем генетической модификации или биологического и/или химического синтеза. Как описано в данном документе, олигонуклеотиды ИКП в Примерах 2 и 3 могут содержать ИКП-ДТ или модифицированные ИКП (мод-ИКП) в симметричных или асимметричных конфигурациях, как обсуждается в данном документе.

ПРИМЕР 4: Продуцирование зкДНК с использованием одноцепочечной молекулы ДНК

[00527] В другом примере способа продуцирования зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, представленном в Примере 4 заявки PCT/US19/14122, используется одноцепочечная линейная ДНК, содержащая два смысловых ИКП, которые фланкируют смысловую последовательность экспрессионной кассеты и ковалентно присоединены к двум антисмысловым ИКП, которые фланкируют антисмысловую экспрессионную кассету, и концы указанной одноцепочечной линейной ДНК затем лигируют с образованием одноцепочечной молекулы с замкнутыми концами. Один неограничивающий пример включает синтез и/или продуцирование молекулы одноцепочечной ДНК, отжиг частей молекулы с образованием одной линейной молекулы ДНК, которая имеет одну или несколько областей вторичной структуры со спаренными основаниями, и затем лигирование свободных 5'- и 3'-концов друг с другом для образования замкнутой одноцепочечной молекулы.

[00528] Типичная одноцепочечная молекула ДНК для продуцирования зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ИКП;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ИКП;

второй антисмысловой ИКП;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ИКП.

[00529] Молекула одноцепочечной ДНК для использования в типичном способе по Примеру 4 может быть получена с использованием любой методологии синтеза ДНК, описанной в данном документе, например, синтезом ДНК in vitro, или путем расщепления конструкта ДНК (например, плазмиды) нуклеазами и плавления полученных фрагментов дцДНК с образованием фрагментов одноцепочечной ДНК (оцДНК).

[00530] Отжиг может осуществляться путем снижения температуры до значения ниже расчетных температур плавления пар смысловой и антисмысловой последовательностей. Температура плавления зависит от содержания конкретных нуклеотидных оснований и характеристик используемого раствора, например, концентрации соли. Специалист в данной области техники может легко рассчитать температуры плавления для любой данной комбинации последовательности и раствора.

[00531] Свободные 5'- и 3'-концы отожженной молекулы могут быть лигированы друг с другом или лигированы с молекулой шпильки с образованием зкДНК-вектора. Типичные примеры подходящих методик лигирования и молекул шпилек описаны в Примерах 2 и 3.

ПРИМЕР 5: Очистка и/или подтверждение продуцирования зкДНК

[00532] Любые из продуктов ДНК-вектора, полученных способами, описанными в данном документе, например, включая способы получения на основе клеток насекомых, описанные в Примере 1, или синтетические способы продуцирования, описанные в Примерах 2-4, могут быть очищены, например, для удаления примесей, неиспользованных компонентов, или побочных продуктов, с использованием методов, общеизвестных квалифицированным специалистам; и/или могут быть проанализированы для подтверждения того, что продуцируемый ДНК-вектор (в данном случае - зкДНК-вектор) является требуемой молекулой. Примером способа очистки ДНК-вектора, например, зкДНК, является использование протокола очистки «Qiagen Midi Plus» (фирмы «Qiagen») и/или очистки на геле.

[00533] Ниже приведен типичный способ подтверждения идентичности зкДНК-векторов.

[00534] Оценка зкДНК-векторов может быть проведена путем идентификации, с применением электрофореза на агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как проиллюстрировано на Фиг.4C и 4D, (a) присутствия характеристических полос, мигрирующих с вдвое большим размером на денатурирующих гелях по сравнению с нативными гелями после расщепления рестрикционной эндонуклеазой и гель-электрофоретического анализа, и (b) наличия полос мономера и димера (2×) на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала, характерного для присутствия зкДНК-вектора.

[00535] Структуры выделенных зкДНК-векторов были дополнительно проанализированы путем расщепления очищенной ДНК эндонуклеазами рестрикции, отобранными для обеспечения а) наличия только одного сайта разреза в зкДНК-векторах, и b) результирующих фрагментов достаточно большого размера, чтобы их было четко видно при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как продемонстрировано на Фиг.4C и 4D, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой можно различить по размеру их продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как для зкДНК-вектора с непрерывной структурой следует ожидать образования фрагментов размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00536] Таким образом, для того, чтобы качественно продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ковалентно замкнутые концы, как это требуется по определению, образцы расщепляли эндонуклеазой рестрикции, идентифицированной в контексте последовательности конкретного ДНК-вектора, как имеющая один сайт рестрикции, предпочтительно, приводящая к образованию двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза на денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК), линейная ДНК, не имеющая ковалентно замкнутых концов, будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., в то время как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), так как две цепи ДНК связаны и при разворачивании будут иметь вдвое большую длину (хотя и являются одноцепочечными). Кроме того, при расщеплении мономерных, димерных и n-мерных форм ДНК-векторов все они будут разделяться на фрагменты одинаковых размеров из-за связывания концов мультимерных ДНК-векторов (см. Фиг.4D и 4E).

[00537] В данном документе фраза «анализ с целью идентификации ДНК-векторов с помощью электрофореза на агарозном геле в нативных и денатурирующих условиях» относится к анализу для оценки наличия замкнутых концов зкДНК путем проведения расщепления рестрикционной эндонуклеазой с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Один пример такого анализа приведен ниже, хотя специалисту в данной области техники будет понятно, что возможны многие известные в данной области техники варианты указанного примера. Рестрикционную эндонуклеазу выбирают таким образом, чтобы она представляла собой фермент, делающий один разрез представляющего интерес зкДНК-вектора, чтобы образовывались продукты с длиной, составляющей приблизительно 1/3× и 2/3× длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем гелях. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы «Qiagen» или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки «GE Healthcare ILUSTRA™ MicroSpin™ G-25», представляют собой некоторые из известных в данной области техники вариантов средств, используемых при расщеплении эндонуклеазами. Анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции, 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы «Qiagen», элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10-кратного денатурирующего раствора (10×=0,5 М NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10-кратного раствора красителя, не забуференного, и проведение анализа вместе с маркерами молекулярного веса ДНК, полученными путем добавления 10-кратного денатурирующего раствора в эксперименте с 4 репликами, на 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и прогонки геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области техники будет понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза в зависимости от размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE (буфер трис-борат-ЭДТА) или TAE (буфер трис-ацетат-ЭДТА) и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с использованием красителя для гелей нуклеиновых кислот «SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain» фирмы «Thermo Fisher» (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм). Вышеописанный способ на основе геля может быть адаптирован для целей проведения очистки путем выделения зкДНК-вектора из полосы геля и обеспечения возможности его ренатурации.

[00538] Оценка чистоты полученного зкДНК-вектора может быть проведена с применением любого способа, известного в данной области техники. В качестве одного неограничивающего примера способа, вклад зкДНК-плазмиды в общее УФ-поглощение образца можно оценить путем сравнения интенсивности флуоресценции зкДНК-вектора со стандартом. Например, в случае определения УФ-поглощения, если на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, то это соответствует присутствию 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому соответствует полоса - например, если весь зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае составит 0,25 мкг при введении 1,0 мкг.Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, затем рассчитывают количество полосы зкДНК-вектора по уравнению линии регрессии, которое после этого можно использовать для определения процента общего ввода, представленного зкДНК-вектором, или процента чистоты.

ПРИМЕР 6: Контролируемая экспрессия трансгена из зкДНК: экспрессия трансгена из зкДНК-вектора in vivo может поддерживаться и/или повышаться путем повторного введения

[00539] зкДНК-вектор получали в соответствии со способами, описанными в Примере 1 выше, с использованием зкДНК-плазмиды, содержащей промотор CAG (SEQ ID NO: 72) и трансген люциферазы (SEQ ID NO: 56), фланкированный асимметричными ИКП (например, 5’-ИКП-ДТ (SEQ ID NO: 2) и 3' мод-ИКП (SEQ ID NO: 3)), и оценивали в различных программах лечения in vivo. Этот зкДНК-вектор использовали во всех последующих экспериментах, описанных в Примерах 6-10. В Примере 6 зкДНК-вектор очищали, готовили композицию с липидными наночастицами (ЛНЧ-зкДНК) и вводили инъекцией в хвостовую вену каждой мыши CD-1® IGS. Липосомы были приготовлены с пригодной смесью липидов, содержащей четыре компонента для образования липосом на основе липидных наночастиц (ЛНЧ), включая катионные липиды, вспомогательные липиды, холестерин и ПЭГ-липиды.

[00540] Для оценки устойчивой экспрессии трансгена in vivo из зкДНК-вектора на протяжении длительного периода времени, ЛНЧ-зкДНК вводили в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) путем внутривенной инъекции в хвостовую вену мышам CDG-1® IGS в возрасте приблизительно 5-7 недель. Была проведена оценка трех групп с разными дозировками: 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг и 1,0 мг/кг, по десять мышей на группу (за исключением группы 1,0 мг/кг, в которой было 15 мышей). Инъекции вводили в день 0. Пять мышей из каждой группы получали инъекцию дополнительной идентичной дозы в день 28. Экспрессию люциферазы измеряли путем визуализации методом IVIS после внутривенного введения мышам CD-1^® IGS («Charles River Laboratories»; мыши дикого типа (ДТ)). Экспрессию люциферазы оценивали с помощью визуализации IVIS после внутрибрюшинного введения 150 мг/кг субстрата люциферина в дни 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 и 42 и регулярно (например, еженедельно, раз в две недели, или через каждые 10 суток, или через каждые 2 недели), в период между днями 42-110. Результаты представлены на Фиг.6. Эта фигура представляет собой график, показывающий экспрессию трансгена люциферазы, измеренную с помощью визуализации IVIS в течение по меньшей мере 132 суток, в соответствии с 3 разными протоколами введения.

[00541] Исследования были продолжены для изучения эффекта повторной дозы, например, повторного введения ЛНЧ-зкДНК, экспрессирующего люциферазу, субъектам, получавшим ЛНЧ-зкДНК. В частности, оценивалась возможность повышения уровней экспрессии путем одного или нескольких дополнительных введений зкДНК-вектора.

[00542] В этом исследовании оценивали биораспределение экспрессии люциферазы из зкДНК-вектора с помощью IVIS у мышей CD-1® IGS после первоначального внутривенного введения 1,0 мг/кг (т.е. примирующей дозы) в дни 0 и 28 (группа A). Второе введение зкДНК-вектора осуществляли путем инъекции в хвостовую вену 3 мг/кг (группа B) или 10 мг/кг (группа C) в 1,2 мл в хвостовую вену в день 84. В этом исследовании использовали по пять (5) мышей CD-1® были в каждой из групп A, B и C. IVIS-визуализацию экспрессии люциферазы у мышей проводили перед введением дополнительных доз в дни 49, 56, 63 и 70, как описано выше, а также после введения повторных доз в день 84 и в дни 91, 98, 105, 112 и 132. Экспрессию люциферазы оценивали и выявляли во всех трех группах A, B и C по меньшей мере до дня 110 (самый продолжительный период оценки).

[00543] Было продемонстрировано, что уровень экспрессии люциферазы повышается с помощью повторной дозы (т.е. повторного введения композиции зкДНК) ЛНЧ-зкДНК-Luc, при определении путем оценки активности люциферазы в присутствии люциферина. Результаты представлены на Фиг.6, представляющей собой график, показывающий экспрессию трансгена люциферазы, измеряемую с помощью визуализации IVIS в течение по меньшей мере 110 суток в соответствии с 3 разными протоколами введения (группы A, B и C). Мыши, не получавшие какой-либо дополнительной повторной дозы (примирующая доза 1 мг/кг (т.е. группа А)), демонстрировали стабильную экспрессию люциферазы, наблюдаемую на протяжении всего исследования. Мыши в группе B, которым вводили повторную дозу 3 мг/кг зкДНК-вектора, демонстрировали примерно семикратное увеличение наблюдаемой светимости по сравнению с мышами в группе C. Неожиданно, мыши, получившие повторную дозу 10 мг/кг зкДНК-вектора, продемонстрировали 17-кратное увеличение наблюдаемой светимости люциферазы по сравнению с мышами, не получавшими какой-либо повторной дозы (группа А).

[00544] Группа A демонстрирует экспрессию люциферазы у мышей CD-1^® IGS после внутривенного введения 1 мг/кг зкДНК-вектора в хвостовую вену в дни 0 и 28. Группы B и C демонстрируют экспрессию люциферазы у мышей CD-1^® IGS, которым вводили 1 мг/кг зкДНК-вектора в первый момент времени (день 0) и вводили повторную дозу зкДНК-вектора во второй момент времени в день 84. Неожиданно, второе введение (т.е. повторная доза) зкДНК-вектора повысило экспрессию по меньшей мере в 7 раз, и даже до 17 раз.

[00545] Неожиданно, 3-кратное увеличение дозы (т.е. количества) зкДНК-вектора при введении повторной дозы в группе В (т.е. при введении повторной дозы 3 мг/кг) привело к 7-кратному увеличению экспрессии люциферазы. Также неожиданно, 10-кратное увеличение количества зкДНК-вектора при введении повторной дозы (т.е. при введении повторной дозы 10 мг/кг) в группе С привело к 17-кратному увеличению экспрессии люциферазы. Таким образом, второе введение (т.е. повторная доза) зкДНК увеличивало экспрессию по меньшей мере в 7 раз, и даже до 17 раз. Это показывает, что повышение экспрессии трансгена от повторной дозы больше, чем ожидалось, и зависит от дозы или количества зкДНК-вектора при введении повторной дозы и, по-видимому, является синергетическим по отношению к начальной экспрессии трансгена после первоначального примирующего введения в день 0. Таким образом, дозозависимое повышение экспрессии трансгена не является аддитивным, скорее, уровень экспрессии трансгена является дозозависимым и сверхпропорционален суммарному количеству введенного зкДНК-вектора в каждый момент времени.

[00546] Обе группы B и C продемонстрировали значительное дозозависимое повышение экспрессии люциферазы по сравнению с контрольными мышами (группа A), которые не получали повторной дозы зкДНК-вектора во второй момент времени. В совокупности, эти данные показывают, что экспрессия трансгена из зкДНК-вектора может быть повышена дозозависимым образом с помощью повторной дозы (т.е. повторного введения) зкДНК-вектора по меньшей мере во второй момент времени.

[00547] Взятые в совокупности, данные на Фиг.6 демонстрируют, что уровень экспрессии трансгена из зкДНК-векторов может поддерживаться на постоянном уровне на протяжении по меньшей мере 84 суток и может быть повышен in vivo после повторной дозы зкДНК-вектора, введенной по меньшей мере во второй момент времени.

ПРИМЕР 7: Устойчивая экспрессия трансгена in vivo зкДНК-векторами, приготовленными в виде композиций в ЛНЧ

[00548] Воспроизводимость результатов, полученных в Примере 6, с другой липидной наночастицей оценивали in vivo на мышах. Мышам вводили в день 0 дозу либо зкДНК-вектора, содержащего трансген люциферазы, управляемый промотором CAG, инкапсулированного в ЛНЧ, отличные от использованных в Примере 6, либо тех же ЛНЧ, содержащих поли(Ц), но без зкДНК или гена люциферазы. Конкретно, самцам мышей CD-1® в возрасте приблизительно 4 недель делали однократную инъекцию 0,5 мг/кг ЛНЧ-TTX (тетродотоксин)-люциферазы или контрольного ЛНЧ-поли(Ц), вводимых внутривенно через боковую хвостовую вену в день 0. В день 14 животным вводили системно люциферин в дозе 150 мг/кг посредством внутрибрюшинной инъекции в дозе 2,5 мл/кг.Примерно через 15 минут после введения люциферина каждое животное визуализировали с использованием системы визуализации in vivo («IVIS»).

[00549] Как показано на Фиг.7, значительная флуоресценция в печени наблюдалась у всех четырех мышей, получивших зкДНК, и у животных наблюдалась очень незначительная флуоресценция помимо места инъекции, что указывает на то, что ЛНЧ опосредуют печень-специфичную доставку конструкта зкДНК, и что доставленный зкДНК-вектор был способен к контролируемой устойчивой экспрессии своего трансгена в течение по меньшей мере двух недель после введения.

ПРИМЕР 8: Устойчивая экспрессия трансгена в печени in vivo после введения зкДНК-вектора

[00550] В отдельном эксперименте оценивали локализацию доставленной с помощью ЛНЧ зкДНК в печени экспериментальных животных. зкДНК-вектор, содержащий представляющий интерес функциональный трансген, инкапсулировали в те же ЛНЧ, что и используемые в Примере 7, и вводили мышам in vivo в дозе 0,5 мг/кг путем внутривенной инъекции. Через 6 часов мышей умерщвляли и отбирали образцы печени, фиксировали формалином и заливали парафином с использованием стандартных протоколов. Проводили эксперименты по in situ гибридизации «RNAscope®» для визуализации зкДНК-векторов в ткани с использованием зонда, специфичного для трансгена зкДНК, и детектирования с использованием хромогенной реакции и окрашивания гематоксилином («Advanced Cell Diagnostics»). На Фиг.8 представлены результаты, указывающие на присутствие зкДНК в гепатоцитах.

ПРИМЕР 9: Устойчивая экспрессия трансгена зкДНК в глазах in vivo

[00551] Устойчивость экспрессии трансгена зкДНК-вектора в тканях, отличных от печени, оценивали для определения переносимости и экспрессии зкДНК-вектора после введения в глаза in vivo. В день 0 самцам крыс Sprague Dawley в возрасте приблизительно 9 недель вводили субретинально 5 мкл либо зкДНК-вектора, содержащего трансген люциферазы, в композиции с реагентом для трансфекции «jetPEI®» («Polyplus»), либо плазмидной ДНК, кодирующей люциферазу, в композиции с «jetPEI®», в обоих случаях в концентрации 0,25 мкг/мкл. В каждой группе были протестированы четыре крысы. Животным давали седативное средство и вводили субретинально в правый глаз исследуемый препарат с помощью иглы калибра 33. Левый глаз каждого животного оставляли интактным. Сразу после инъекции глаза проверяли методом оптической когерентной томографии или визуализации глазного дна, чтобы подтвердить наличие субретинального пузырька. Крысы получали бупренорфин и местную мазь с антибиотиком в соответствии со стандартными процедурами.

[00552] В дни 7, 14, 21, 28 и 35 животным обеих групп вводили системно свежеприготовленный люциферин в дозе 150 мг/кг посредством внутрибрюшинной инъекции в количестве 2,5 мл/кг.Через 5-15 минут после введения люциферина всех животных визуализировали с использованием IVIS под анестезией изофлураном. Полный поток [фотон/с] и средний поток (фотон/с/ср/см²) в представляющей интерес области, охватывающей глаз, были получены при экспозиции 5 минут.Результаты представлены графически в виде сресуток светимости для каждой экспериментальной группы в обработанном глазу («инъецированный») относительно сресуток светимости для каждой экспериментальной группы в необработанном глазу («неинъецированный») (Фиг.9B). Значительная флуоресценция легко детектировалась в глазах с введенным зкДНК-вектором, но была намного слабее в глазах с введенной плазмидой (Фиг.9A). Через 35 суток крыс, которым инъецировали плазмиду, умерщвляли, продолжая исследования крыс, получивших зкДНК, с инъекцией люциферина и визуализацией IVIS в дни 42, 49, 56, 63, 70 и 99. Результаты демонстрируют, что зкДНК-вектор, введенный разовой инъекцией в глаз крысы, опосредует экспрессию трансгена in vivo, и такая экспрессия поддерживалась на высоком уровне на протяжении по меньшей мере 99 суток после инъекции.

ПРИМЕР 10: Длительное введение доз и введение повторных доз зкДНК-вектора мышам Rag2

[00553] В ситуациях, когда один или несколько трансгенов, кодируемых в кассете генной экспрессии зкДНК-вектора, экспрессируются в среде хозяина (например, в клетке или у субъекта), и экспрессированный белок распознается как чужеродный, существует вероятность того, что у хозяина выработается адаптивный иммунный ответ, который может привести к нежелательному исчерпанию продукта экспрессии, которое может быть принято за отсутствие экспрессии. В некоторых случаях это может происходить с репортерной молекулой, которая является гетерологичной для нормальной среды хозяина. Соответственно, экспрессию трансгена зкДНК-вектора оценивали in vivo на мышиной модели Rag2, в которой отсутствуют B- и T-клетки и, следовательно, не вырабатывается адаптивный иммунный ответ на ненативные для мышей белки, такие как люцифераза. Вкратце, нокаутным мышам c57bl/6 и Rag2 вводили в день 0 внутривенно инъекцией в хвостовую вену 0,5 мг/кг инкапсулированного в ЛНЧ зкДНК-вектора, экспрессирующего люциферазу или контроль поли(Ц), а в день 21 некоторым мышам вводили повторную дозу того же самого ЛНЧ-инкапсулированного зкДНК-вектора при том же уровне дозы. Все экспериментальные группы состояли из 4 мышей в каждой. Визуализация IVIS выполнялась после инъекции люциферина, как описано в Примере 9, с недельными интервалами.

[00554] При сравнении полного потока, наблюдаемого в анализах IVIS, флуоресценция, наблюдаемая у мышей дикого типа (косвенная мера присутствия экспрессированной люциферазы), которым вводили ЛНЧ-зкДНК-вектор-Luc, постепенно снижалась после дня 21, в то время как мыши Rag2, которым вводили тот же самый препарат, продемонстрировали относительно постоянную устойчивую экспрессию люциферазы на протяжении 42 суток эксперимента (Фиг.10А). Наблюдаемое снижение у мышей дикого типа примерно в день 21 соответствует временному интервалу, в котором можно ожидать появление адаптивного иммунного ответа. Повторное введение ЛНЧ-зкДНК-вектора мышам Rag2 приводило к заметному увеличению экспрессии, которое устойчиво поддерживалась в течение по меньшей мере 21 дня, на протяжении которых проводились наблюдения в этом исследовании (Фиг.10B). Результаты позволяют предположить, что адаптивный иммунитет может играть определенную роль при экспрессии ненативного белка из зкДНК-вектора у хозяина, и что наблюдаемое снижение экспрессии в период времени 20+суток с момента первоначального введения может указывать на мешающий адаптивный иммунный ответ на экспрессируемую молекулу, а не на снижение экспрессии (или в дополнение к ней). Следует отметить, что этот ответ, как ожидается, будет низким в случае экспрессии у хозяина нативных белков, когда, предположительно, хозяин будет правильно распознавать экспрессированные молекулы как собственные и не будет вырабатывать такой иммунный ответ.

ПРИМЕР 11: Влияние специфической для печени экспрессии и модуляции CpG на устойчивую экспрессию

[00555] Как описано в Примере 10, нежелательный иммунный ответ хозяина может в некоторых случаях искусственно ослаблять то, что иначе могло бы быть устойчивой экспрессией одного или нескольких желательных трансгенов из введенного зкДНК-вектора. Были использованы два подхода к оценке влияния предотвращения и/или ослабления потенциального иммунного ответа хозяина на устойчивую экспрессию из зкДНК-вектора. Во-первых, поскольку вектор зкДНК-Luc, использованный в предшествующих примерах, находился под контролем конститутивного промотора CAG, был получен аналогичный конструкт с использованием специфичного для печени промотора (hAAT) или другого конститутивного промотора (hEF-1), чтобы определить, будет ли устранение длительной экспозиции миелоидных клеток или тканей, не относящихся к печени, снижать любые наблюдаемые иммунные эффекты. Во-вторых, некоторые конструкты зкДНК-люцифераза были сконструированы так, чтобы иметь пониженное содержание CpG, известного триггера иммунной реакции хозяина. Измеряли экспрессию гена люциферазы, кодируемой зкДНК, при введении мышам таких модифицированных зкДНК-векторов с переключением промотора.

[00556] Использовали три разных зкДНК-вектора, каждый из которых кодировал люциферазу в качестве трансгена. Первый зкДНК-вектор имел большое количество неметилированного CpG (около 350) и содержал конститутивный промотор CAG («зкДНК CAG»); второй имел умеренное количество неметилированного CpG (около 60) и содержал специфичный для печени промотор hAAT («зкДНК hAAT с низким содержанием CpG»); и третий представлял собой метилированную форму второго, не содержащую неметилированного CpG, и также содержал промотор hAAT («зкДНК hAAT без CpG»). В остальном зкДНК-векторы были идентичны. Векторы готовили, как описано выше.

[00557] Четыре группы по четыре самца мышей CD-1®, в возрасте приблизительно 4 недель, получали один из зкДНК-векторов, инкапсулированных в ЛНЧ, или контроль поли(Ц). В день 0 каждой мыши делали одну внутривенную инъекцию в хвостовую вену вектора зкДНК 0,5 мг/кг в объеме 5 мл/кг.Вес тела регистрировали в дни -1, -, 1, 2, 3, 7 и еженедельно после этого, до умерщвления мышей. Образцы цельной крови и сыворотки брали в дни 0, 1 и 35. Прижизненную визуализацию проводили в дни 7, 14, 21, 28 и 35, и затем еженедельно с использованием системы визуализации in vivo (IVIS). Для визуализации каждой мыши вводили люциферин в дозе 150 мг/кг посредством внутрибрюшинной инъекции в объеме 2,5 мл/кг.Через 15 минут каждую мышь анестезировали и визуализировали. Мышей умерщвляли в день 93 и собирали терминальные ткани, включая печень и селезенку. Измерения цитокинов проводили через 6 часов после введения дозы в день 0.

[00558] Хотя все получившие зкДНК мыши демонстрировали значительную флуоресценцию в дни 7 и 14, у мышей зкДНК CAG флуоресценция быстро снижалась после дня 14 и более постепенно уменьшалась на протяжении оставшейся части исследования. Напротив, у мышей зкДНК hAAT с низким уровнем CpG и без CpG полный поток оставался на стабильно высоком уровне (Фиг.11). Это позволяет предположить, что направление доставки зкДНК-вектора специфически в печень приводило к устойчивой и длительной экспрессии трансгена из вектора в течение по меньшей мере 77 суток после однократной инъекции. Конструкты с минимизированным содержанием CpG или с полным отсутствием CpG имели сходные профили длительной устойчивой экспрессии, тогда как конструкт конститутивного промотора с высоким содержанием CpG демонстрировал снижение экспрессии с течением времени, что позволяет предположить, что иммунная активация хозяина при введении зкДНК-вектора может играть определенную роль в любом снижении экспрессия, наблюдаемом при введении такого вектора субъекту. Эти результаты обеспечивают альтернативные методы адаптации продолжительности ответа к желаемому уровню путем выбора тканево-ограниченного промотора и/или изменения содержания CpG в зкДНК-векторе в случае наблюдаемого иммунного ответа хозяина - потенциально трансген-специфичного ответа.

ССЫЛКИ НА ИСТОЧНИКИ

[00559] Все публикации и ссылки, включая, без ограничений, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании и примерах, приведенных в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме, как если бы для каждой отдельной публикации или ссылки было специально и индивидуально указано про ее включение посредством ссылки в данный документ.Любая патентная заявка, в отношении которой данная заявка испрашивает приоритет, также включена в данный документ посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылок.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАЛЬНОСТЕЙ

<110>ДЖЕНЕРЕЙШЕН БИО КО.

<120>КОНТРОЛИРУЕМАЯ ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ДНК-ВЕКТОРОВ

С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)

<130>080170-091190-WOPT

<140>

<141>

<150>62/746,762

<151>2018-10-17

<150>62/633,882

<151>2018-02-22

<150>62/633,795

<151>2018-02-22

<150>62/633,757

<151>2018-02-22

<160>190

<170>PatentIn, версия 3.5

<210>1

<211>141

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>1

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210>2

<211>141

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t 141

<210>3

<211>130

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>3

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg 130

<210>4

<211>130

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact

120

aggggttcct 130

<210>5

<211>143

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>5

ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60

agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt

120

gggcaactcc atcactaggg taa 143

<210>6

<211>144

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>6

ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60

agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt

120

ggccaactcc atcactagag gtat 144

<210>7

<211>127

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>7

ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60

agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg

120

gccaact 127

<210>8

<211>166

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>8

tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc 60

gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc

120

gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag 166

<210>9

<211>144

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>9

ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60

cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt

120

gggcaactcc atcactaggg gtat 144

<210>10

<211>143

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>10

ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc 60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga

120

gcgcgcagag agggagtggg caa 143

<210>11

<211>144

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>11

atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60

ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg

120

agtgcgcata gagggagtgg ccaa 144

<210>12

<211>127

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>12

agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct 60

ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag

120

tggccaa 127

<210>13

<211>166

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>13

cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc 60

gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt

120

cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga 166

<210>14

<211>144

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>14

atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga

120

gcgcgcatta gagggagtgg gcaa 144

<210>15

<211>120

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>15

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg

120

<210>16

<211>122

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>16

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg 122

<210>17

<211>129

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg 129

<210>18

<211>101

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>18

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101

<210>19

<211>139

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>19

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg 139

<210>20

<211>137

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>20

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg 137

<210>21

<211>135

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>21

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg 135

<210>22

<211>133

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>22

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg 133

<210>23

<211>139

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>23

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg 139

<210>24

<211>137

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>24

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg 137

<210>25

<211>135

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>25

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg 135

<210>26

<211>133

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>26

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg 133

<210>27

<211>131

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>27

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag

120

ctgcctgcag g 131

<210>28

<211>129

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>28

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg 129

<210>29

<211>127

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>29

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc

120

ctgcagg 127

<210>30

<211>122

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>30

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg 122

<210>31

<211>130

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>31

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg 130

<210>32

<211>120

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>32

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct

120

<210>33

<211>122

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>33

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct 122

<210>34

<211>122

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>34

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct 122

<210>35

<211>129

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>35

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct 129

<210>36

<211>101

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>36

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60

gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101

<210>37

<211>139

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>37

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct 139

<210>38

<211>137

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>38

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct 137

<210>39

<211>135

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>39

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct 135

<210>40

<211>133

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>40

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct 133

<210>41

<211>139

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>41

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60

gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct 139

<210>42

<211>137

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>42

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct 137

<210>43

<211>135

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>43

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60

cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct 135

<210>44

<211>133

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>44

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct 133

<210>45

<211>131

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>45

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac

120

taggggttcc t 131

<210>46

<211>129

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>46

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct 129

<210>47

<211>127

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>47

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60

cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg

120

ggttcct 127

<210>48

<211>122

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>48

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg 122

<210>49

<211>12

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>49

cgatcgttcg at 12

<210>50

<211>12

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>50

atcgaaccat cg 12

<210>51

<211>12

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>51

atcgaacgat cg 12

<210>52

<211>165

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>52

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165

<210>53

<211>140

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>53

cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60

cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg

120

cgcagagaga tcactagggg 140

<210>54

<211>91

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>54

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91

<210>55

<211>91

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>55

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60

ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91

<210>56

<211>1662

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>56

gccgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg 60

gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct

120

ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc

180

gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga

240

atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt

300

atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt

360

atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg

420

aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat

480

taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat

540

gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac

600

tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg

660

agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt

720

ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata

780

tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt

840

caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa

900

agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct

960

cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg

1020

caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat

1080

aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat

1140

accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt

1200

atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg

1260

ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc

1320

ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc

1380

ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc

1440

ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag

1500

atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg

1560

tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag

1620

atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aa 1662

<210>57

<211>453

<212>БЕЛОКБЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)..(1)

<223>Любая аминокислота

<400>57

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210>58

<211>214

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400>58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>59

<211>1310

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>59

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc

120

atgcgctcag ggctgagcgc ggggagagca gagcacacaa gctcatagac cctggtcgtg

180

ggggggagga ccggggagct ggcgcggggc aaactgggaa agcggtgtcg tgtgctggct

240

ccgccctctt cccgagggtg ggggagaacg gtatataagt gcggcagtcg ccttggacgt

300

tctttttcgc aacgggtttg ccgtcagaac gcaggtgagg ggcgggtgtg gcttccgcgg

360

gccgccgagc tggaggtcct gctccgagcg ggccgggccc cgctgtcgtc ggcggggatt

420

agctgcgagc attcccgctt cgagttgcgg gcggcgcggg aggcagagtg cgaggcctag

480

cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc tagcgtggtg tccgcgccgc

540

cgccgcgtgc tactccggcc gcactctggt cttttttttt tttgttgttg ttgccctgct

600

gccttcgatt gccgttcagc aataggggct aacaaaggga gggtgcgggg cttgctcgcc

660

cggagcccgg agaggtcatg gttggggagg aatggaggga caggagtggc ggctggggcc

720

cgcccgcctt cggagcacat gtccgacgcc acctggatgg ggcgaggcct ggggtttttc

780

ccgaagcaac caggctgggg ttagcgtgcc gaggccatgt ggccccagca cccggcacga

840

tctggcttgg cggcgccgcg ttgccctgcc tccctaacta gggtgaggcc atcccgtccg

900

gcaccagttg cgtgcgtgga aagatggccg ctcccgggcc ctgttgcaag gagctcaaaa

960

tggaggacgc ggcagcccgg tggagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaagagggc

1020

ctggtccctc accggctgct gcttcctgtg accccgtggt cctatcggcc gcaatagtca

1080

cctcgggctt ttgagcacgg ctagtcgcgg cggggggagg ggatgtaatg gcgttggagt

1140

ttgttcacat ttggtgggtg gagactagtc aggccagcct ggcgctggaa gtcatttttg

1200

gaatttgtcc ccttgagttt tgagcggagc taattctcgg gcttcttagc ggttcaaagg

1260

tatcttttaa accctttttt aggtgttgtg aaaaccaccg ctaattcaaa 1310

<210>60

<211>16

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>60

gcgcgctcgc tcgctc 16

<210>61

<211>6

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>61

ggttga 6

<210>62

<211>4

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>62

agtt 4

<210>63

<211>6

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>63

ggttgg 6

<210>64

<211>6

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>64

agttgg 6

<210>65

<211>6

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>65

agttga 6

<210>66

<211>6

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>66

rrttrr 6

<210>67

<211>581

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>67

gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60

ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt

120

actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc

180

tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt

240

aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct

300

attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt

360

ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac

420

gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct

480

ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca

540

ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581

<210>68

<211>225

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>68

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225

<210>69

<211>8

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>69

actgaggc 8

<210>70

<211>8

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>70

gcctcagt 8

<210>71

<211>16

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>71

gagcgagcga gcgcgc 16

<210>72

<211>1923

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>72

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc

120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg

180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc

240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat

300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc

360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga

420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg

480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg

540

cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta

600

attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg

660

gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg

720

cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg

780

aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg

840

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc

900

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt

960

ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc

1020

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc

1080

ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg

1140

aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag

1200

gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc

1260

tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg

1320

gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg

1380

ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc

1440

ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg

1500

taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct

1560

gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg

1620

aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc

1680

cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg

1740

ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc

1800

ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg

1860

acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag

1920

cca 1923

<210>73

<211>1272

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>73

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc

120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc

180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc

240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt

300

ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag

360

taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa

420

gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg

480

ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc

540

tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt

600

gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag

660

cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt

720

ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat

780

cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt

840

ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct

900

gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg

960

cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag

1020

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc

1080

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag

1140

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt

1200

tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac

1260

ctttggaact ga 1272

<210>74

<211>1177

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>74

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac

120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac

180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca

240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc

300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag

360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa

420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt

480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga

540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca

600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt

660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta

720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt

780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca

840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca

900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg

960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg

1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca

1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc

1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177

<210>75

<211>547

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>75

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactga 547

<210>76

<211>556

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>76

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt

180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc

240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt

300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc

360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct

420

tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa

480

aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc

540

caacctttgg aactga 556

<210>77

<211>1179

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>77

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt

120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca

180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc

240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt

300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg

360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg

420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct

480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg

540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc

600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga

660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct

720

ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca

780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg

840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg

900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat

960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg

1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa

1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca

1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179

<210>78

<211>141

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>78

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t 141

<210>79

<211>317

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>79

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca

120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa

180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag

240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag

300

gcctaggctt ttgcaaa 317

<210>80

<211>241

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>80

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga

120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat

180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga

240

c 241

<210>81

<211>215

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>81

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc

120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg

180

gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215

<210>82

<211>546

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>82

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactg 546

<210>83

<211>576

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>83

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata

120

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag

180

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc

240

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta

300

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg

360

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt

420

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca

480

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag

540

gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576

<210>84

<211>150

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>84

ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60

gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct

120

gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150

<210>85

<211>1313

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>85

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc

120

atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg

180

gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg

240

tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt

300

agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg

360

gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc

420

gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg

480

ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc

540

tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct

600

gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta

660

aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc

720

gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg

780

aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc

840

tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca

900

ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg

960

gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct

1020

tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc

1080

gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt

1140

tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg

1200

aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt

1260

attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313

<210>86

<211>213

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>86

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag

120

ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt

180

tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213

<210>87

<211>7

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400>87

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210>88

<211>19

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400>88

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210>89

<211>19

<212>БЕЛОК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400>89

Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly

<210>90

<211>7

<212>БЕЛОК

<213>Вирус обезьян 40

<400>90

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210>91

<211>21

<212>ДНК

<213>Вирус обезьян 40

<400>91

cccaagaaga agaggaaggt g 21

<210>92

<211>16

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Последовательность бипартатного NLS нуклеоплазмина

<400>92

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210>93

<211>9

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400>93

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210>94

<211>11

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400>94

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210>95

<211>38

<212>БЕЛОК

<213>Homo sapiens

<400>95

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210>96

<211>42

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Домен IBB из последовательности импортина-альфа

<400>96

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210>97

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400>97

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210>98

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Неизвестно

<220>

<223>Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400>98

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210>99

<211>8

<212>БЕЛОК

<213>Homo sapiens

<400>99

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210>100

<211>12

<212>БЕЛОК

<213>Mus musculus

<400>100

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210>101

<211>70

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>101

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60

gcgagcgcgc 70

<210>102

<211>70

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>102

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60

gcgagcgcgc 70

<210>103

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>103

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>104

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>104

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>105

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>105

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>106

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>106

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>107

<211>83

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>107

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210>108

<211>83

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>108

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210>109

<211>77

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>109

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60

tgagcgagcg agcgcgc 77

<210>110

<211>77

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>110

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60

tgagcgagcg agcgcgc 77

<210>111

<211>51

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>111

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51

<210>112

<211>51

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>112

gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51

<210>113

<211>80

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>113

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210>114

<211>80

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>114

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210>115

<211>79

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>115

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210>116

<211>79

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>116

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210>117

<211>5

<212>БЕЛОК

<213>Вирус гриппа

<400>117

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210>118

<211>7

<212>БЕЛОК

<213>Вирус гриппа

<400>118

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210>119

<211>10

<212>БЕЛОК

<213>Вирус гепатита дельта

<400>119

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210>120

<211>10

<212>БЕЛОК

<213>Mus musculus

<400>120

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210>121

<211>20

<212>БЕЛОК

<213>Homo sapiens

<400>121

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210>122

<211>17

<212>БЕЛОК

<213>Homo sapiens

<400>122

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210>123

<211>8

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>123

gtttaaac 8

<210>124

<211>8

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>124

ttaattaa 8

<210>125

<211>141

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>125

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t 141

<210>126

<211>317

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>126

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca

120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa

180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag

240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag

300

gcctaggctt ttgcaaa 317

<210>127

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>127

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>128

<211>60

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>128

gagacagaca cactcctgct atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac 60

<210>129

<211>1260

<212>ДНК

<213>Аденоассоциированный вирус-2

<400>129

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt

1200

taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga

1260

<210>130

<211>1932

<212>ДНК

<213>Аденоассоциированный вирус-2

<400>130

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat

120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag

180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg

240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg

300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt

360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc

420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa

480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg

540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag

600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact

660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag

720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg

780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc

840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa

900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc

960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag

1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc

1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg

1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc

1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc

1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg

1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag

1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg

1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca

1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg

1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg

1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc

1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt

1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg

1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa

1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga

1920

cactctctct ga 1932

<210>131

<211>1876

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>131

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa 1876

<210>132

<211>1194

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>132

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194

<210>133

<211>1876

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>133

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa 1876

<210>134

<211>51

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>134

ctaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg c 51

<210>135

<211>65

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>135

ctaggactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60

cagtc 65

<210>136

<211>67

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>136

ggactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60

tcctgca 67

<210>137

<211>41

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>137

gtgcgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcgcactc a 41

<210>138

<211>56

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>138

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt cctgca 56

<210>139

<211>54

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>139

ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtc 54

<210>140

<211>48

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>140

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacggcctca gtcctgca 48

<210>141

<211>46

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>141

ctaggactga ggccgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtc 46

<210>142

<211>67

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>142

ggactgaggc ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcgcctcag 60

tcctgca 67

<210>143

<211>47

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>143

atacctaggc acgcgtgtta ctagttatta atagtaatca attacgg 47

<210>144

<211>29

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>144

atacctaggg gccgcacgcg tgttactag 29

<210>145

<211>42

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>145

atacactcag tgcctgcagg cacgtggtcc ggagatccag ac 42

<210>146

<211>3754

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>146

cctaggtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 60

tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatcgcggcc gctcaatatt ggccattagc

120

catattattc attggttata tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt

180

gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg

240

gcattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc

300

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa

360

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac

420

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca

480

agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg

540

gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt

600

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc

660

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat

720

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg

780

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc

840

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg

900

agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc

960

cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc

1020

cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa

1080

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc

1140

gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct

1200

gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg

1260

gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt

1320

gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac

1380

ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt

1440

ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg

1500

gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc

1560

ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg

1620

cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc

1680

ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag

1740

ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg

1800

cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg

1860

accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttttagcct tcttcttttt cctacagctc

1920

ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcatttgt cgacagaatt cctcgaagat

1980

ccgaaggggt tcaagcttgg cattccggta ctgttggtaa agccagttta aacgccgcca

2040

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg

2100

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct

2160

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca

2220

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga

2280

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct

2340

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc

2400

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc

2460

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga

2520

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg

2580

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc

2640

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg

2700

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt

2760

aattaattaa gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt

2820

gggtatacat ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg

2880

atatgtaatt actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg

2940

ttatttacgc tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac

3000

tgatattctt aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct

3060

gtatctagct attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt

3120

gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt

3180

gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg

3240

gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg

3300

ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc

3360

tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc

3420

cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg

3480

tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa

3540

tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggctcta gagcatggct acgtagataa

3600

gtagcatggc gggttaatca ttaactacac ctgcagcagg aacccctagt gatggagttg

3660

gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc cctgcaggac tgaggccggg cgaccaaagg

3720

tcgcccgacg cccgggcggc ctcagtcctg cagg 3754

<210>147

<211>8418

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>147

ggcagctgcg cgctcgctcg ctcacctagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga 60

cctttggtcg cccggcctag gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttccttgtag ttaatgatta acccgccatg ctacttatcg cggccgctca

180

atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg

240

gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaat

300

atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc

360

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc

420

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt

480

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca

540

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg

600

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca

660

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt

720

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt

780

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg

840

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc

900

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag

960

cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg

1020

cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg

1080

acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc

1140

tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc

1200

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg

1260

gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg

1320

ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct

1380

gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt

1440

aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg

1500

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg

1560

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc

1620

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa

1680

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg

1740

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag

1800

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag

1860

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc

1920

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgtttt agccttcttc

1980

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca tttgtcgaca

2040

gaattcctcg aagatccgaa ggggttcaag cttggcattc cggtactgtt ggtaaagcca

2100

gtttaaacgc cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca

2160

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg

2220

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc

2280

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct

2340

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc

2400

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt

2460

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg

2520

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg

2580

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg

2640

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc

2700

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga

2760

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg

2820

acgagctgta caagtaatta attaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc

2880

tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca

2940

tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt

3000

taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat

3060

ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc

3120

tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt

3180

gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg

3240

cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg

3300

tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc

3360

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt

3420

gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt

3480

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca

3540

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga

3600

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg ctctagagca

3660

tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacacctgca gcaggaaccc

3720

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctccctgc aggactgagg

3780

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tcctgcaggg agcgagcgag

3840

cgcgcagctg cctgcacggg cgcgccggta ccgggagatg ggggaggcta actgaaacac

3900

ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc aataaaaaga cagaataaaa

3960

cgcacgggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct

4020

gtcgataccc caccgagacc ccattgggac caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca

4080

ccccaacccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaagc

4140

cctgccatag ccactacggg tacgtaggcc aaccactaga actatagcta gagtcctggg

4200

cgaacaaacg atgctcgcct tccagaaaac cgaggatgcg aaccacttca tccggggtca

4260

gcaccaccgg caagcgccgc gacggccgag gtctaccgat ctcctgaagc cagggcagat

4320

ccgtgcacag caccttgccg tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg

4380

agaccgaaac cttgcgctcg ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc

4440

ccaaggttgc cgggtgacgc acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagttgacat

4500

aagcctgttc ggttcgtaaa ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca

4560

gaaccttgac cgaacgcagc ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg

4620

actgtttttt tgtacagtct atgcctcggg catccaagca gcaagcgcgt tacgccgtgg

4680

gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag

4740

cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt

4800

aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag

4860

ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat cagccggact ccgattacct cgggaacttg

4920

ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct

4980

ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat

5040

ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc

5100

aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac

5160

gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat

5220

atcgacccaa gtaccgccac ctaacaattc gttcaagccg agatcggctt cccggccgcg

5280

gagttgttcg gtaaattgtc acaacgccgc gaatatagtc tttaccatgc ccttggccac

5340

gcccctcttt aatacgacgg gcaatttgca cttcagaaaa tgaagagttt gctttagcca

5400

taacaaaagt ccagtatgct ttttcacagc ataactggac tgatttcagt ttacaactat

5460

tctgtctagt ttaagacttt attgtcatag tttagatcta ttttgttcag tttaagactt

5520

tattgtccgc ccacacccgc ttacgcaggg catccattta ttactcaacc gtaaccgatt

5580

ttgccaggtt acgcggctgg tctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa

5640

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg

5700

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg

5760

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag

5820

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga

5880

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct

5940

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc

6000

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg

6060

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc

6120

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca

6180

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag

6240

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct

6300

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc

6360

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga

6420

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca

6480

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat

6540

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac

6600

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt

6660

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt

6720

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag

6780

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct

6840

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt

6900

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc

6960

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt

7020

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg

7080

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg

7140

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct

7200

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc

7260

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt

7320

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt

7380

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg

7440

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat

7500

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg

7560

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc

7620

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc

7680

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag

7740

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc

7800

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa

7860

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg

7920

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt

7980

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc

8040

gcgtcccatt cgccattcag gctgcaaata agcgttgata ttcagtcaat tacaaacatt

8100

aataacgaag agatgacaga aaaattttca ttctgtgaca gagaaaaagt agccgaagat

8160

gacggtttgt cacatggagt tggcaggatg tttgattaaa aacataacag gaagaaaaat

8220

gccccgctgt gggcggacaa aatagttggg aactgggagg ggtggaaatg gagtttttaa

8280

ggattattta gggaagagtg acaaaataga tgggaactgg gtgtagcgtc gtaagctaat

8340

acgaaaatta aaaatgacaa aatagtttgg aactagattt cacttatctg gttcggatct

8400

cctagtgagc tccctgca 8418

<210>148

<211>225

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>148

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225

<210>149

<211>1177

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>149

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac

120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac

180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca

240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc

300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag

360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa

420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt

480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga

540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca

600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt

660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta

720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt

780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca

840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca

900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg

960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg

1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca

1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc

1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177

<210>150

<211>1326

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>150

ctgcagggcc cactagtgga gccgagagta attcatacaa aaggagggat cgccttcgca 60

aggggagagc ccagggaccg tccctaaatt ctcacagacc caaatccctg tagccgcccc

120

acgacagcgc gaggagcatg cgcccagggc tgagcgcggg tagatcagag cacacaagct

180

cacagtcccc ggcggtgggg ggaggggcgc gctgagcggg ggccagggag ctggcgcggg

240

gcaaactggg aaagtggtgt cgtgtgctgg ctccgccctc ttcccgaggg tgggggagaa

300

cggtatataa gtgcggtagt cgccttggac gttctttttc gcaacgggtt tgccgtcaga

360

acgcaggtga gtggcgggtg tggcttccgc gggccccgga gctggagccc tgctctgagc

420

gggccgggct gatatgcgag tgtcgtccgc agggtttagc tgtgagcatt cccacttcga

480

gtggcgggcg gtgcgggggt gagagtgcga ggcctagcgg caaccccgta gcctcgcctc

540

gtgtccggct tgaggcctag cgtggtgtcc gccgccgcgt gccactccgg ccgcactatg

600

cgttttttgt ccttgctgcc ctcgattgcc ttccagcagc atgggctaac aaagggaggg

660

tgtggggctc actcttaagg agcccatgaa gcttacgttg gataggaatg gaagggcagg

720

aggggcgact ggggcccgcc cgccttcgga gcacatgtcc gacgccacct ggatggggcg

780

aggcctgtgg ctttccgaag caatcgggcg tgagtttagc ctacctgggc catgtggccc

840

tagcactggg cacggtctgg cctggcggtg ccgcgttccc ttgcctccca acaagggtga

900

ggccgtcccg cccggcacca gttgcttgcg cggaaagatg gccgctcccg gggccctgtt

960

gcaaggagct caaaatggag gacgcggcag cccggtggag cgggcgggtg agtcacccac

1020

acaaaggaag agggccttgc ccctcgccgg ccgctgcttc ctgtgacccc gtggtctatc

1080

ggccgcatag tcacctcggg cttctcttga gcaccgctcg tcgcggcggg gggaggggat

1140

ctaatggcgt tggagtttgt tcacatttgg tgggtggaga ctagtcaggc cagcctggcg

1200

ctggaagtca ttcttggaat ttgccccttt gagtttggag cgaggctaat tctcaagcct

1260

cttagcggtt caaaggtatt ttctaaaccc gtttccaggt gttgtgaaag ccaccgctaa

1320

ttcaaa 1326

<210>151

<211>573

<212>ДНК

<213>Mus musculus

<400>151

gtaagagttt tatgtttttt catctctgct tgtatttttc tagtaatgga agcctggtat 60

tttaaaatag ttaaattttc ctttagtgct gatttctaga ttattattac tgttgttgtt

120

gttattattg tcattatttg catctgagaa cccttaggtg gttatattat tgatatattt

180

ttggtatctt tgatgacaat aatgggggat tttgaaagct tagctttaaa tttcttttaa

240

ttaaaaaaaa atgctaggca gaatgactca aattacgttg gatacagttg aatttattac

300

ggtctcatag ggcctgcctg ctcgaccatg ctatactaaa aattaaaagt gtgtgttact

360

aattttataa atggagtttc catttatatt tacctttatt tcttatttac cattgtctta

420

gtagatattt acaaacatga cagaaacact aaatcttgag tttgaatgca cagatataaa

480

cacttaacgg gttttaaaaa taataatgtt ggtgaaaaaa tataactttg agtgtagcag

540

agaggaacca ttgccacctt cagattttcc tgt 573

<210>152

<211>1993

<212>ДНК

<213>Mus musculus

<400>152

acgatcggga actggcatct tcagggagta gcttaggtca gtgaagagaa gaacaaaaag 60

cagcatatta cagttagttg tcttcatcaa tctttaaata tgttgtgtgg tttttctctc

120

cctgtttcca cagacaagag tgagatcgcc catcggtata atgatttggg agaacaacat

180

ttcaaaggcc tgtaagttat aatgctgaaa gcccacttaa tatttctggt agtattagtt

240

aaagttttaa aacacctttt tccaccttga gtgtgagaat tgtagagcag tgctgtccag

300

tagaaatgtg tgcattgaca gaaagactgt ggatctgtgc tgagcaatgt ggcagccaga

360

gatcacaagg ctatcaagca ctttgcacat ggcaagtgta actgagaagc acacattcaa

420

ataatagtta attttaattg aatgtatcta gccatgtgtg gctagtagct cctttcctgg

480

agagagaatc tggagcccac atctaacttg ttaagtctgg aatcttattt tttatttctg

540

gaaaggtcta tgaactatag ttttgggggc agctcactta ctaactttta atgcaataag

600

atctcatggt atcttgagaa cattattttg tctctttgta gtactgaaac cttatacatg

660

tgaagtaagg ggtctatact taagtcacat ctccaacctt agtaatgttt taatgtagta

720

aaaaaatgag taattaattt atttttagaa ggtcaatagt atcatgtatt ccaaataaca

780

gaggtatatg gttagaaaag aaacaattca aaggacttat ataatatcta gccttgacaa

840

tgaataaatt tagagagtag tttgcctgtt tgcctcatgt tcataaatct attgacacat

900

atgtgcatct gcacttcagc atggtagaag tccatattcc tttgcttgga aaggcaggtg

960

ttcccattac gcctcagaga atagctgacg ggaagaggct ttctagatag ttgtatgaaa

1020

gatatacaaa atctcgcagg tatacacagg catgatttgc tggttgggag agccacttgc

1080

ctcatactga ggtttttgtg tctgcttttc agagtcctga ttgccttttc ccagtatctc

1140

cagaaatgct catacgatga gcatgccaaa ttagtgcagg aagtaacaga ctttgcaaag

1200

acgtgtgttg ccgatgagtc tgccgccaac tgtgacaaat cccttgtgag taccttctga

1260

ttttgtggat ctactttcct gctttctgga actctgtttc aaagccaatc atgactccat

1320

cacttaaggc cccgggaaca ctgtggcaga gggcagcaga gagattgata aagccagggt

1380

gatgggaatt ttctgtggga ctccatttca tagtaattgc agaagctaca atacactcaa

1440

aaagtctcac cacatgactg cccaaatggg agcttgacag tgacagtgac agtagatatg

1500

ccaaagtgga tgagggaaag accacaagag ctaaaccctg taaaaagaac tgtaggcaac

1560

taaggaatgc agagagaaga agttgccttg gaagagcata ccaactgcct ctccaatacc

1620

aatggtcatc cctaaaacat acgtatgaat aacatgcaga ctaagcaggc tacatttagg

1680

aatatacatg tatttacata aatgtatatg catgtaacaa caatgaatga aaactgaggt

1740

catggatctg aaagagagca agggggctta catgagaggg tttggaggga ggggttggag

1800

ggagggaggt attattcttt agttttacag ggaacgtagt aaaaacatag gcttctccca

1860

aaggagcaga gcccatgagg agctgtgcaa ggttccccag cttgatttta cctgctcctc

1920

aaattccctt gatttgtttt tattataatg actttactcc tagcttttag tgtcagatag

1980

aaaacatgga agg 1993

<210>153

<211>1350

<212>ДНК

<213>Homo sapiens

<400>153

taggaggctg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagaccagc ctgggcaaca 60

tagtgtgatc ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag

120

tccccagcca cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat ggtccaggct

180

gcagtgagcc atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct

240

cacaacaaca acaacaacaa caaaaaggct gagctgcacc atgcttgacc cagtttctta

300

aaattgttgt caaagcttca ttcactccat ggtgctatag agcacaagat tttatttggt

360

gagatggtgc tttcatgaat tcccccaaca gagccaagct ctccatctag tggacaggga

420

agctagcagc aaaccttccc ttcactacaa aacttcattg cttggccaaa aagagagtta

480

attcaatgta gacatctatg taggcaatta aaaacctatt gatgtataaa acagtttgca

540

ttcatggagg gcaactaaat acattctagg actttataaa agatcacttt ttatttatgc

600

acagggtgga acaagatgga ttatcaagtg tcaagtccaa tctatgacat caattattat

660

acatcggagc cctgccaaaa aatcaatgtg aagcaaatcg cagcccgcct cctgcctccg

720

ctctactcac tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg

780

ataaactgca aaaggctgaa gagcatgact gacatctacc tgctcaacct ggccatctct

840

gacctgtttt tccttcttac tgtccccttc tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac

900

tttggaaata caatgtgtca actcttgaca gggctctatt ttataggctt cttctctgga

960

atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt

1020

gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg

1080

gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat

1140

tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca

1200

ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg

1260

ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg

1320

cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt 1350

<210>154

<211>1223

<212>ДНК

<213>Homo sapiens

<400>154

tgacagagac tcttgggatg acgcactgct gcatcaaccc catcatctat gcctttgtcg 60

gggagaagtt cagaaactac ctcttagtct tcttccaaaa gcacattgcc aaacgcttct

120

gcaaatgctg ttctattttc cagcaagagg ctcccgagcg agcaagctca gtttacaccc

180

gatccactgg ggagcaggaa atatctgtgg gcttgtgaca cggactcaag tgggctggtg

240

acccagtcag agttgtgcac atggcttagt tttcatacac agcctgggct gggggtgggg

300

tgggagaggt cttttttaaa aggaagttac tgttatagag ggtctaagat tcatccattt

360

atttggcatc tgtttaaagt agattagatc ttttaagccc atcaattata gaaagccaaa

420

tcaaaatatg ttgatgaaaa atagcaacct ttttatctcc ccttcacatg catcaagtta

480

ttgacaaact ctcccttcac tccgaaagtt ccttatgtat atttaaaaga aagcctcaga

540

gaattgctga ttcttgagtt tagtgatctg aacagaaata ccaaaattat ttcagaaatg

600

tacaactttt tacctagtac aaggcaacat ataggttgta aatgtgttta aaacaggtct

660

ttgtcttgct atggggagaa aagacatgaa tatgattagt aaagaaatga cacttttcat

720

gtgtgatttc ccctccaagg tatggttaat aagtttcact gacttagaac caggcgagag

780

acttgtggcc tgggagagct ggggaagctt cttaaatgag aaggaatttg agttggatca

840

tctattgctg gcaaagacag aagcctcact gcaagcactg catgggcaag cttggctgta

900

gaaggagaca gagctggttg ggaagacatg gggaggaagg acaaggctag atcatgaaga

960

accttgacgg cattgctccg tctaagtcat gagctgagca gggagatcct ggttggtgtt

1020

gcagaaggtt tactctgtgg ccaaaggagg gtcaggaagg atgagcattt agggcaagga

1080

gaccaccaac agccctcagg tcagggtgag gatggcctct gctaagctca aggcgtgagg

1140

atgggaagga gggaggtatt cgtaaggatg ggaaggaggg aggtattcgt gcagcatatg

1200

aggatgcaga gtcagcagaa ctg 1223

<210>155

<211>215

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>155

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc

120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg

180

gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accac 215

<210>156

<211>141

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>156

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca cctaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctaggtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t 141

<210>157

<211>19

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>157

gcgcgctcgc tcgctcacc 19

<210>158

<211>22

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>158

ctaggtgagc gagcgagcgc gc 22

<210>159

<211>75

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>159

cctgcaggac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60

cctcagtcct gcagg 75

<210>160

<211>130

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>160

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagt 60

gcgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcactcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg 130

<210>161

<211>142

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>161

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctcc ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg 60

acctttggtc gcccggcctc agtcctaggg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc

120

aactccatca ctaggggttc ct 142

<210>162

<211>80

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>162

gcgcgctcgc tcgctcactg agtgcgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcact 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210>163

<211>21

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>163

gcgcgctcgc tcgctcactg a 21

<210>164

<211>18

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>164

gtgagcgagc gagcgcgc 18

<210>165

<211>89

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>165

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc 60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210>166

<211>89

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>166

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210>167

<211>87

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>167

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc 60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210>168

<211>87

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>168

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210>169

<211>85

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>169

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210>170

<211>85

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>170

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210>171

<211>89

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>171

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc 60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210>172

<211>89

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>172

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc 60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210>173

<211>87

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>173

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210>174

<211>87

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>174

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210>175

<211>85

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>175

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210>176

<211>85

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>176

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210>177

<211>83

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>177

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210>178

<211>83

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>178

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210>179

<211>81

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>179

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 60

tcagtgagcg agcgagcgcg c 81

<210>180

<211>81

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>180

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc 60

tcagtgagcg agcgagcgcg c 81

<210>181

<211>79

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>181

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210>182

<211>79

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>182

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210>183

<211>81

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>183

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgca g 81

<210>184

<211>81

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>184

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgca g 81

<210>185

<211>72

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>185

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210>186

<211>80

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>186

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210>187

<211>79

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>187

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210>188

<211>48

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>188

ggagtcaaag ttctgtttgc cctgatctgc atcgctgtgg ccgaggcc 48

<210>189

<211>99

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400>189

attcatacca acttgaagaa aaagttcagc ctcttcatcc tggtctttct cctgttcgca 60

gtcatctgtg tttggaagaa agggagcgac tatgaggcc 99

<210>190

<211>588

<212>ДНК

<213>Искусственная последовательность

<220>

<223>Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400>190

gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60

gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc

120

ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag

180

gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac

240

aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc

300

tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc

360

acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca

420

aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt

480

gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg

540

gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaacc 588

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к применению генетических конструкций, содержащих ДНК с замкнутыми концами (зкДНК-векторы), для контроля экспрессии. Изобретение раскрывает способ поддержания, стабилизации или повышения уровня экспрессии целевого трансгена в клетке или у субъекта за счет по меньшей мере одного последовательного введения дополнительной дозы зкДНК-вектора после первоначального введения. ЗкДНК-вектор, как раскрыто в настоящем изобретении, можно вводить повторно («повторная доза» или «бустерное» введение) для продолжения экспрессии целевого белка у субъекта, причем вторая доза повышает уровень экспрессии целевого белка или пролонгирует ее, при этом такое повторное введение не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения экспрессии целевого белка. 4 н. и 31 з.п. ф-лы, 11 пр., 6 табл., 11 ил.

1. Способ пролонгирования или повышения уровня экспрессии трансгена у субъекта, включающий:

a) введение первой дозы бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем первая доза содержит количество зкДНК-вектора для экспрессии трансгена у субъекта, причем трансген кодирует целевой белок; и

b) введение второй дозы указанного зкДНК-вектора для продолжения экспрессии целевого белка у субъекта, причем вторая доза находится в количестве, которое является таким же, как первая доза, или причем вторая доза в 2-10 раз превышает первую дозу зкДНК-вектора, причем:

вторая доза повышает уровень экспрессии целевого белка или вторая доза пролонгирует экспрессию целевого белка; и

вторая доза не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения экспрессии целевого белка, и

причем указанный способ не является процессом модификации генетической идентичности зародышевой линии человека.

2. Способ повышения экспрессии трансгена у субъекта, включающий:

a) введение первой дозы бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем первая доза содержит количество зкДНК-вектора для экспрессии трансгена у субъекта, причем трансген кодирует целевой белок; и

b) введение второй дозы указанного зкДНК-вектора для продолжения экспрессии целевого белка у субъекта, причем вторая доза находится в количестве, которое является таким же, как первая доза, или причем вторая доза в 2-10 раз превышает первую дозу зкДНК-вектора,

причем:

вторая доза повышает уровень экспрессии целевого белка; и

вторая доза не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения экспрессии целевого белка, и

причем указанный способ не является процессом модификации генетической идентичности зародышевой линии человека.

3. Способ повышения экспрессии трансгена у субъекта, включающий:

a) введение первой дозы бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем первая доза содержит количество зкДНК-вектора для экспрессии трансгена у субъекта, причем трансген кодирует целевой белок; и

b) введение второй дозы указанного зкДНК-вектора для продолжения экспрессии целевого белка у субъекта, причем вторая доза находится в количестве, которое является таким же, как первая доза, или причем вторая доза в 2-10 раз превышает первую дозу зкДНК-вектора,

причем:

вторая доза пролонгирует экспрессию целевого белка; и

вторая доза не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения экспрессии целевого белка, и

причем указанный способ не является процессом модификации генетической идентичности зародышевой линии человека.

4. Способ повышения экспрессии трансгена у субъекта, включающий:

a) введение первой дозы бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), содержащего кассету нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один трансген, связанный с промотором, между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ИКП), причем первая доза содержит количество зкДНК-вектора для экспрессии трансгена у субъекта, причем трансген кодирует целевой белок; и

b) введение второй дозы указанного зкДНК-вектора для продолжения экспрессии целевого белка у субъекта, причем вторая доза находится в количестве, которое является таким же, как первая доза, или причем вторая доза в 2-10 раз превышает первую дозу зкДНК-вектора,

причем:

вторая доза повышает уровень экспрессии целевого белка и вторая доза пролонгирует экспрессию целевого белка; и

вторая доза не вызывает иммунную реакцию, достаточную для предотвращения достижения экспрессии целевого белка, и

причем указанный способ не является процессом модификации генетической идентичности зародышевой линии человека.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная вторая доза предназначена для введения в момент времени, когда уровень экспрессии трансгена снижается.

7. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная вторая доза предназначена для введения через по меньшей мере 90 суток после первого введения или где введения осуществляют по периодическому графику.

8. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный трансген кодирует терапевтический белок, а целевой уровень экспрессии трансгена представляет собой терапевтически эффективное количество терапевтического белка.

9. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный целевой белок представляет собой белок-ингибитор или указанный целевой белок заменяет дефектный белок или белок, который не экспрессируется.

10. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный белок-ингибитор представляет собой антитело или слитый белок.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой индуцибельный или репрессируемый промотор.

12. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор дополнительно включает регуляторный переключатель.

13. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор, который вводят в первой, второй или любой последующей дозе, представляет собой зкДНК-вектор одного и того же типа, содержащий один и тот же трансген или модифицированный трансген.

14. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный второй зкДНК-вектор имеет другой промотор, функционально связанный с тем же самым трансгеном или модифицированным трансгеном.

15. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанные два фланкирующих инвертированных концевых повтора (ИКП) представляют собой ИКП AAB.

16. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из фланкирующих ИКП содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ИКП ААВ представляют собой ИКП ААВ-2.

18. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что: указанные фланкирующие ИКП являются симметричными или асимметричными; указанные фланкирующие ИКП являются симметричными или по существу симметричными; указанные фланкирующие ИКП являются асимметричными; или указанные фланкирующие ИКП получают из разных вирусных серотипов.

19. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что один или оба из указанных фланкирующих ИКП содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 5-48.

20. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных фланкирующих ИКП изменяют относительно последовательности ИКП ААВ дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ИКП.

21. Способ по п. 1, отличающийся тем, что один или оба из указанных фланкирующих ИКП получают из серотипа ААВ, выбранного из группы, состоящей из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ 10, ААВ 11 и ААВ 12.

22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что: один или оба из указанных фланкирующих ИКП являются синтетическими; один или оба указанные фланкирующие ИКП не относятся к дикому типу; оба указанные фланкирующие ИКП не относятся к дикому типу; один из указанных фланкирующих ИКП представляет собой ИКП дикого типа; или оба указанные фланкирующие ИКП представляют собой ИКП дикого типа.

23. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что один или оба указанные фланкирующие ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей ИКП, выбранных из А, A’, В, В’, С, С’, D и D’.

24. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, которая, в ИКП дикого типа, содержит области А, А’, В, В’, С или С’.

25. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что: один или оба указанные фланкирующие ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, которая, в ИКП дикого типа, содержит области В и В’;

один или оба указанные фланкирующие ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, которая, в ИКП дикого типа, содержит области С и С’; или

один или оба указанные фланкирующие ИКП модифицируют путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению части структуры стебель-петля, которая, в ИКП дикого типа, содержит области В и В’, и/или части структуры стебель-петля, которая, в ИКП дикого типа, содержит области С и С’.

26. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что один или оба указанные фланкирующие ИКП содержат единственную структуру стебель-петля в области, которая, в ИКП дикого типа, содержит первую структуру стебель-петля, образуемую областями В и В’, и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями С и С’, или один или оба указанные ИКП содержат один стебель и две петли в области, которая, в ИКП дикого типа, содержит первую структуру стебель-петля, образуемую областями В и В’, и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями С и С’.

27. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что оба фланкирующие ИКП изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ИКП инвертированы друг относительно друга.

28. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор дополнительно включает по меньшей мере один регуляторный переключатель.

29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что по меньшей мере один регуляторный переключатель выбран из группы, состоящей из бинарного регуляторного переключателя, низкомолекулярного регуляторного переключателя, регуляторного переключателя «с паролем», регуляторного переключателя на основе нуклеиновой кислоты, посттранскрипционного регуляторного переключателя, контролируемого излучением или контролируемого ультразвуком регуляторного переключателя, опосредованного гипоксией регуляторного переключателя, регуляторного переключателя воспалительного ответа, активируемого сдвигом регуляторного переключателя и выключателя «kill switch».

30. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из рака, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного расстройства, гиперхолестеринемии, острого отторжения органа, рассеянного склероза, постменопаузального остеопороза, кожного заболевания, астмы и гемофилии.

31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что:

указанный рак выбран из солидной опухоли, саркомы мягких тканей, лимфомы и лейкоза; указанное аутоиммунное заболевание выбрано из ревматоидного артрита и болезни Крона; указанное кожное заболевание выбрано из псориаза и атопического дерматита, или указанное нейродегенеративное расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера.

32. Способ по п. 30, дополнительно включающий введение субъекту последующей дозы указанного зкДНК-вектора после второй дозы, причем последующая доза предназначена для повышения уровня экспрессии трансгена по сравнению с уровнем экспрессии трансгена, достигнутым после второй дозы, или для повышения уровня экспрессии трансгена для достижения целевого уровня экспрессии.

33. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный трансген представляет собой или кодирует генетическое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, ингибитора, пептида или полипептида, антитела или фрагмента антитела, слитого белка, антигена, антагониста, агониста и молекулы РНКи.

34. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанная вторая или последующая доза зкДНК-вектора выбрана из

количества, которое повышает экспрессию трансгена по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или в 2-15 раз, или в 2-20 раз, по сравнению с экспрессией трансгена после введения первой или предшествующей дозы зкДНК-вектора.

35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанную вторую или последующую дозу зкДНК-вектора определяют по дозовой зависимости между дозой зкДНК-вектора и уровнем экспрессии трансгена из зкДНК-вектора для достижения целевого уровня экспрессии трансгена в клетке.