ДНК-ВЕКТОРЫ С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ПУТЕМ БЕСКЛЕТОЧНОГО СИНТЕЗА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ зкДНК-ВЕКТОРОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/09 C12N15/63 C12N15/64 C12N15/66 C12N15/86 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно §119(e) Раздела 35 Свода законов США на основании предварительной заявки на патент США № 62/619392, поданной 19 января 2018 г., содержание которой включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 17 января 2019 г., имеет название 080170-091310-WOPT_SL.txt и размер 102804 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[002] Данное изобретение относится к области генной терапии, включая продуцирование невирусных векторов с целью экспрессии трансгена или выделенных полинуклеотидов у субъекта или в клетке. Например, данное изобретение обеспечивает бесклеточные способы синтеза невирусных ДНК-векторов. Данное изобретение также относится к конструктам нуклеиновых кислот, полученным с их помощью, и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Генная терапия направлена на улучшение клинических результатов для пациентов, страдающих либо генетическими мутациями, либо приобретенными заболеваниями, вызванными аберрацией в профиле генной экспрессии. Генная терапия включает лечение или профилактику медицинских состояний, обусловленных дефектными генами или аномальной регуляцией или экспрессией, например, недостаточной экспрессией или избыточной экспрессией, которые могут приводить к нарушению, заболеванию, злокачественному новообразованию и т.д. Например, лечение, предотвращение или облегчение заболевания или нарушения, вызываемого дефектным геном, может быть осуществлено путем доставки пациенту корректирующего генетического материала, или лечение, предотвращение или облегчение может быть осуществлено путем изменения или подавления у пациента дефектного гена, например, с помощью корректирующего генетического материала, приводящего к терапевтической экспрессии указанного генетического материала у указанного пациента.

[004] Генная терапия основана на обеспечении транскрипционной кассеты с активным генным продуктом (иногда называемым трансгеном), который может приводить, например, к положительному эффекту приобретения функции, отрицательному эффекту потери функции, или другому результату. Генная терапия также может быть использована для лечения заболеваний или злокачественных новообразований, вызванных другими факторами. Моногенные нарушения человека можно лечить путем доставки нормального гена в клетки-мишени и его экспрессии в клетках-мишенях. Доставка корректирующего гена в клетки-мишени пациента и его экспрессия могут осуществляться с помощью многочисленных методов, включающих использование сконструированных вирусов и вирусных векторов для доставки генов. Среди множества доступных векторов, полученных из вирусов (например, из рекомбинантного ретровируса, рекомбинантного лентивируса, рекомбинантного аденовируса и т.п.), набирает популярность в качестве многоцелевого вектора для генной терапии рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рААВ).

[005] Аденоассоциированные вирусы (ААВ) принадлежат к семейству Parvoviridae; более конкретно, они составляют род Dependoparvovirus Векторы, происходящие из ААВ (т.е. рекомбинантные ААВ- (рААВ) или ААВ-векторы), являются привлекательным способом доставки генетического материала, поскольку (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр типов неделящихся и делящихся клеток, в том числе миоциты и нейроны; (ii) они лишены вирусных структурных генов, что уменьшает ответы клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например, интерферон-опосредованные ответы; (iii) вирусы дикого типа считаются непатогенными для человека; (iv) в отличие от ААВ дикого типа, который способен интегрироваться в геном клетки-хозяина, у дефектных по репликации векторов ААВ отсутствует ген rep, и они обычно персистируют в виде эписом, что ограничивает риск инсерционного мутагенеза или генотоксичности; и (v) по сравнению с другими векторными системами, ААВ-векторы в целом считаются относительно слабыми иммуногенами и, соответственно, не вызывают значимого иммунного ответа (см. ii), обеспечивая таким образом персистенцию векторной ДНК и, потенциально, долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов.

[006] Однако применение частиц ААВ в качестве вектора для доставки генов имеет несколько серьезных недостатков. Одним существенным недостатком, ассоциированным с рААВ, является ограниченная емкость вирусной упаковки, составляющая приблизительно 4,5 т.п.о. гетерологичной ДНК (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010), вследствие чего использование ААВ-векторов ограничено величиной кодирующей способности белка, составляющей менее 150000 Да. Вторым недостатком является то, что вследствие распространенности инфекции ААВ дикого типа среди населения, кандидаты на генную терапию рААВ должны быть подвергнуты скринингу на наличие нейтрализующих антител, элиминирующих вектор из организма пациента. Третий недостаток связан с иммуногенностью капсида, которая препятствует повторному введению пациентам, не исключенным из первичного лечения. Иммунная система пациента может отвечать на вектор, который эффективно действует в качестве «бустерного» агента, стимулируя иммунную систему, генерирующую высокие титры антител против ААВ, что исключает лечение в будущем. Некоторые недавние сообщения указывают на проблемы с иммуногенностью в ситуациях с использованием высоких доз. Другой заметный недостаток заключается в относительно медленном начале действия ААВ-опосредованной генной экспрессии, с учетом того, что одноцепочечная ДНК ААВ должна быть преобразована в двухцепочечную ДНК до гетерологичной генной экспрессии.

[007] Кроме того, обычные вирионы ААВ с капсидами получают путем введения плазмиды или плазмид, содержащих геном ААВ, гены rep и гены cap (Grimm et al., 1998). Однако, как было обнаружено, такие заключенные в капсиды вирусные ААВ-векторы неэффективно трансдуцируют определенные типы клеток и тканей, и указанные капсиды также индуцируют иммунный ответ.

[008] Соответственно, применение векторов на основе аденоассоциированного вируса (ААВ-векторов) для генной терапии является ограниченным вследствие однократного введения пациентам (из-за иммунного ответа пациентов), ограниченного диапазона трансгенного генетического материала, пригодного для доставки в ААВ-векторах, ввиду минимальной емкости вирусной упаковки (приблизительно 4,5 т.п.о.), и медленной ААВ-опосредованной генной экспрессии.

Были разработаны ДНК-векторы с замкнутыми концами (зкДНК-векторы), которые способны доставлять один или несколько желаемых трансгенов in vivo для терапевтических или других целей, и позволяют избежать описанных выше недостатков ААВ и других систем вирусных векторов. Однако способы получения таких зкДНК-векторов основаны на традиционных способах продуцирования в бактериальных клетках или клетках насекомых. Такие способы могут приводить к загрязнениям (например, загрязнениям нуклеиновыми кислотами) из клеток, используемых для продуцирования векторов, которые неудобно или дорого удалять, и которые могут вызывать нежелательные побочные эффекты при включении в терапевтическую композицию зкДНК. Соответственно, в данной области существует потребность в технологии, которая позволит генерировать рекомбинантные векторы для использования в способах контроля экспрессии генов с минимальными нецелевыми эффектами, например, вносимыми такими загрязнениями или другими артефактами способа очистки. Способы, представленные в данном документе, позволяют уменьшить или избежать таких проблем.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[009] Обычные способы продуцирования вирусной ДНК и ДНК вирусного происхождения типично используют эукариотические клетки, например, клетки млекопитающих или насекомых. Одной из широко используемых клеточных линий насекомых является Sf9. Однако такие клетки не только содержат ферменты и другие белки, которые могут оказывать вредное воздействие на реплицируемую ДНК, но и процесс очистки желаемой ДНК от клеточных лизатов приводит к введению клеточных нуклеиновых кислот, присутствие которых может усложнить очистку желаемого продукта ДНК. Кроме того, такие примеси или загрязняющие вещества могут вызывать ряд вредных и/или нежелательных эффектов у субъекта, которому вводят желаемую ДНК. Кроме того, такие традиционные способы продуцирования на основе клеток могут быть связаны с проблемами, касающимися количества продуцируемого продукта ДНК-вектора, и нередко требуется проведение значительного объема работ по конструированию самой клеточной линии или технологии производства для получения желаемых значений выхода. Описанная в данном документе технология относится к синтетическому способу получения, позволяющему легко продуцировать замкнутые кольцевые ДНК-векторы, содержащие петлю шпильки, такие как, без ограничений, ДНК-векторы с замкнутыми концами (зкДНК-векторы), с более высокой чистотой и в больших количествах, чем в обычных способах, избегая при этом проблем, подробнее изложенных выше.

[0010] Изобретение, описанное в данном документе, обеспечивает синтетические способы получения для продуцирования ДНК-векторов с замкнутыми концами с использованием системы синтетического продуцирования, которая может быть бесклеточной системой. В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор, который может использоваться в способах контроля экспрессии генов в клетке, ткани или системе, или для введения нового генетического материала в желаемую клетку, ткань или систему. В одном конкретном варианте реализации изобретения технология, описанная в данном документе, относится к новым бесклеточным способам получения ДНК-векторов, содержащих модифицированные последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ и, например, один или несколько экспрессируемых трансгенов. Раскрытые в данном документе способы могут быть использованы для получения любого ДНК-вектора с замкнутыми концами, содержащего петлю шпильки, в бесклеточной системе, включая, без ограничения, бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, называемые в данном документе зкДНК-векторами, образованными из одной цепи ДНК с ковалентно-замкнутыми концами (линейная, непрерывная и некапсидированная структура).

[0011] Один представленный пример синтетического способа получения ДНК-вектора с замкнутыми концами с использованием продуцирования зкДНК-вектора, как описано в данном документе, относится к вырезанию цельной молекулы, образующей ДНК-вектор с замкнутыми концами, из двухцепочечного ДНК-конструкта. В таком варианте реализации двухцепочечный конструкт ДНК содержит, в порядке от 5' к 3': первый сайт эндонуклеазы рестрикции; левый (в направлении 5') ITR; экспрессионную кассету; правый (в направлении 3') ITR; и второй сайт эндонуклеазы рестрикции. Затем двухцепочечный конструкт ДНК вводят в контакт с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции для получения двухцепочечных разрывов в обоих сайтах расщепления эндонуклеазами рестрикции. Оба сайта могут быть мишенями одной эндонуклеазы, или сайты могут быть мишенями разных эндонуклеаз, при условии, что сайты рестрикции не присутствуют в матричной области вектора с замкнутыми концами. В результате этого происходит вырезание последовательности, расположенной между сайтами эндонуклеаз рестрикции, из остальной части двухцепочечного ДНК-конструкта. Эта вырезанная молекула будет иметь свободные 5'- и 3'-концы, которые затем лигируют для образования зкДНК-вектора. В некоторых аспектах вырезанную молекулу сначала подвергают отжигу для облегчения образования шпильки перед лигированием свободных 5'- и 3'-концов. В некоторых аспектах нежелательный двухцепочечный остов ДНК-конструкта расщепляют одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, специфичными для уникального сайта расщепления в остове, в результате чего он деградирует и легче удаляется во время очистки.

[0012] Другой пример способа получения ДНК-вектора, например, зкДНК-вектора, с использованием синтетического способа получения, как описано в данном документе, включает сборку различных олигонуклеотидов с образованием полного вектора. В таком варианте реализации ДНК-вектор, например, зкДНК-вектор, получают путем синтеза олигонуклеотида 5'- и олигонуклеотида 3'-ITR, которые в некоторых вариантах реализации имеют шпилечную или другую трехмерную конфигурацию (например, конфигурацию структуры Холлидея), и лигирования олигонуклеотидов 5'- и 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету или последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты. Необязательно, добавляют стадию, на которой олигонуклеотид(ы) подвергают воздействию условий, облегчающих укладку олигонуклеотида в трехмерную конфигурацию перед стадией лигирования. На Фиг. 11B показан пример способа получения зкДНК-вектора, включающий лигирование олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды 5'- и 3'-ITR представляют собой олигонуклеотиды 5'- и 3'-шпильки или имеют структуру шпильки или другую трехмерную конфигурацию (например, T- или Y-образную структуру Холлидея) и могут, необязательно, быть получены путем синтеза ДНК in vitro. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды 5'- и 3'-ITR были расщеплены эндонуклеазой рестрикции для получения комплементарных липких концов к двухцепочечному полинуклеотиду, имеющему соответствующие липкие концы эндонуклеазы рестрикции. В некоторых вариантах реализации конец шпильки олигонуклеотида 5'-ITR имеет липкий конец, который комплементарен 5'-смысловой цепи и 3'-антисмысловой цепи двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации конец шпильки олигонуклеотида 3'-ITR имеет липкий конец, который комплементарен 3'-смысловой цепи и 5'-антисмысловой цепи двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации концы шпильки олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR имеют разные липкие концы эндонуклеазы рестрикции, что может обеспечивать направленное лигирование с каждым концом двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации концы одного или обоих олигонуклеотидов ITR не имеют выступов, и такие олигонуклеотид(ы) ITR лигируют с двухцепочечным полинуклеотидом путем соединения тупых концов. В некоторых аспектах нежелательный двухцепочечный полинуклеотидный остов ДНК расщепляется одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, специфичными для уникального сайта расщепления в остове, чтобы он деградировал и легче удалялся во время очистки.

[0013] Другой пример способа получения ДНК-вектора (например, зкДНК-вектора) включает образование одноцепочечной линейной ДНК, содержащей экспрессионную кассету, и последующее замыкание молекулы ДНК путем лигирования. В этом варианте реализации ДНК-вектор получают путем синтеза, с использованием любых средств, известных в данной области техники, одноцепочечной линейной ДНК, содержащей, в направлении от 5' к 3', первый смысловой ITR, смысловую последовательность экспрессионной кассеты, второй смысловой ITR, второй антисмысловой ITR, антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты и первый антисмысловой ITR, а затем лигирования свободных концов для образования замкнутого зкДНК-вектора. В одном варианте реализации с использованием продуцирования зкДНК-вектора в качестве примера получаемого ДНК-вектора, образующаяся в результате одноцепочечная молекула ДНК для продуцирования зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR.

[0014] В этом примере способа, в одном варианте реализации, могут быть синтезированы олигонуклеотиды, охватывающие что-то одно или больше из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR, второго антисмыслового ITR, антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты и первого антисмыслового ITR. Один или несколько таких олигонуклеотидов могут быть лигированы для образования одноцепочечной молекулы ДНК, как показано выше. После образования одноцепочечной молекулы ДНК свободные 3' и 5'-концы молекулы могут быть соединены путем лигирования, образуя зкДНК-вектор.

[0015] Другой пример способа получения ДНК-вектора с замкнутыми концами заключается в синтезе одноцепочечной последовательности, содержащей по меньшей мере один ITR, фланкирующий последовательность экспрессионной кассеты, которая также содержит антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты. В одном неограничивающем примере зкДНК-вектор получают способом, описанным ниже.

[0016] Предусматривается одноцепочечная последовательность, содержащая, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты.

В одном варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть синтезирована непосредственно любым способом, известным в данной области техники. В другом варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть сконструирована путем соединения с помощью лигирования двух или более олигонуклеотидов, содержащих что-то одно или больше из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты.

[0017] В еще одном варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть получена путем вырезания последовательности из двухцепочечного ДНК-конструкта с последующим разделением цепей из вырезанного двухцепочечного фрагмента. Более конкретно, предусматривается двухцепочечный конструкт ДНК, содержащий первый сайт рестрикции, первый смысловой ITR, смысловую последовательность экспрессионной кассеты, второй смысловой ITR, антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты и второй сайт рестрикции, в порядке от 5' к 3'. Область между двумя сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции вырезают путем расщепления по меньшей мере одной эндонуклеазой рестрикции, распознающей такой сайт (сайты) расщепления. Полученный в результате вырезанный двухцепочечный фрагмент ДНК обрабатывают таким образом, чтобы разделить смысловые и антисмысловые цепи на желаемые фрагменты одноцепочечных последовательностей.

[0018] Одноцепочечную последовательность подвергают стадии отжига, чтобы облегчить формирование одной или нескольких шпилечных петель первым смысловым ITR и/или вторым смысловым ITR, а также комплементарное связывание смысловой последовательности экспрессионной кассеты с антисмысловой последовательностью экспрессионной кассеты. Результатом является замкнутая структура, для формирования которой не требуется лигирование. Параметры и методики отжига хорошо известны в данной области техники.

[0019] Во всех аспектах синтетических способов получения для генерирования ДНК-векторов, как описано в данном документе, стадия лигирования может быть стадией химического лигирования или стадией ферментативного лигирования. В некоторых вариантах реализации лигирование можно проводить с использованием компетентного для лигирования фермента, например, ДНК-лигазы, например, для лигирования липких 5'- и 3'-концов (выступов) или тупых концов. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой фермент лигазы, отличный от белка Rep. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой белок Rep ААВ.

[0020] Во всех аспектах синтетических способов получения ДНК-векторов, раскрытых в данном документе, способ представляет собой способ in vitro. В предпочтительном варианте реализации способ представляет собой бесклеточный способ, т.е. не осуществляется в клетке или в присутствии клетки, например, клетки насекомого.

[0021] Рядовому специалисту в данной области будет понятно, что один или несколько ферментов для синтетического способа производства или один или несколько олигонуклеотидных компонентов могут быть получены из клетки и использованы в способах по изобретению в очищенной форме. Соответственно, в некоторых вариантах реализации синтетический способ получения представляет собой бесклеточный способ, однако фермент рестрикции и/или фермент лигазы могут быть получены из клетки. В одном варианте реализации может присутствовать клетка, такая как бактериальная клетка, содержащая экспрессионный вектор, экспрессирующий одну или несколько эндонуклеаз рестрикции или ферментов лигазы. Таким образом, хотя способы, раскрытые в данном документе, в первую очередь касаются бесклеточных синтетических способов получения ДНК-векторов, раскрытых в данном документе, один вариант реализации также охватывает синтетические способы получения, в которых присутствует клетка, например, бактериальная клетка, но не клетка насекомого, которая может использоваться для экспрессии одного или нескольких ферментов, необходимых в способе.

[0022] Один из аспектов технологии, описанной в данном документе, заключается в использовании синтетических способов продуцирования для получения зкДНК-векторов. зкДНК-векторы, описанные в данном документе, представляют собой бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные из непрерывной цепи комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и не-инкапсидированная структура), которая содержит последовательность 5' инвертированного концевого повтора (ITR) и последовательность 3'-ITR, причем 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь одинаковую симметричную трехмерную организацию относительно друг друга (т.е. симметричные или по существу симметричные) или, альтернативно, 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь различную трехмерную организацию относительно друг друга (т.е. асимметричные ITR). Кроме того, ITR могут принадлежать к одному или разным серотипам. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве (т.е. они одинаковы или являются зеркальными отражениями друг друга). В некоторых вариантах реализации один ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ.

[0023] Соответственно, некоторые аспекты технологии, описанной в данном документе, относятся к синтетическому производству зкДНК-вектора, который содержит последовательности ITR, выбранные из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (ITR) ААВ (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ITR WT-WT, в которой все WT-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной пары модифицированных ITR, причем все mod-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию.

[0024] Аспекты изобретения относятся к синтетическим способам получения для производства зкДНК-векторов, полезных для экспрессии желаемого трансгена в клетке, ткани, органе, системе или у субъекта, как описано в данном документе. В частности, в данном документе предусматриваются способы получения ДНК-векторов с замкнутыми концами, включая, без ограничений, зкДНК-векторы, в бесклеточной среде, тем самым ограничивая количество примесей и предотвращая попадание в процессе производства загрязняющих веществ, которые могут повлиять на эффективность и/или безопасность данного векторного продукта. Такие методы могут быть использованы для синтеза ДНК-вектора, например, зкДНК-вектора, экспрессирующего любой желаемый трансген. Могут быть выбраны трансгены для лечения данного заболевания, обеспечения оптимального состояния здоровья, предотвращения возникновения заболевания, для использования в диагностических целях, или желательные для конкретного применения по мнению специалиста в данной области.

[0025] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, предусматриваемых в данном документе, трансген кодирует представляющий интерес белок, например, причем представляющий интерес белок является рецептором, токсином, гормоном, ферментом или белком клеточной поверхности. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, предусматриваемых в данном документе, представляющий интерес белок является рецептором. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, предусматриваемых в данном документе, представляющий интерес белок является ферментом. Типичные примеры генов, на которые нужно воздействовать, и белков, представляющих интерес, подробно описаны в разделах способов применения и способов лечения данного документа.

[0026] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих пунктов:

1. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий: (i) обеспечение первой одноцепочечной молекулы ITR, содержащей первый ITR; (ii) обеспечение второй одноцепочечной молекулы ITR, содержащей второй ITR; (iii) обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и лигирование 5'- и 3'-концов первой молекулы ITR с первым концом двухцепочечной молекулы, и лигирование 5'- и 3'-концов второй молекулы ITR со вторым концом двухцепочечной молекулы с образованием ДНК-вектора.

2. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий:

контактирование двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего: (i) экспрессионную кассету; (ii) первый ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты; (iii) второй ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты; (iii) и по меньшей мере два сайта расщепления эндонуклеазой рестрикции, фланкирующие ITR таким образом, чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к экспрессионной кассете,

с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые могут расщеплять двухцепочечный конструкт ДНК в сайтах расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания последовательностей между сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции из двухцепочечного ДНК-конструкта; и лигирование 5'- и 3'-концов вырезанной последовательности с образованием ДНК-вектора с замкнутыми концами.

3. Способ получения ДНК-вектора, включающий:

синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR;

образование содержащего шпильку полинуклеотида из одноцепочечной молекулы; и лигирование 5'- и 3'-концов с образованием ДНК-вектора с замкнутыми концами.

4. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий:

синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг молекулы.

5. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий:

обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые могут расщеплять двухцепочечный конструкт ДНК в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции из двухцепочечного полинуклеотида;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

выполнение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами.

6. Способ по любому из предшествующих (proceeding) пунктов, в котором двухцепочечный конструкт ДНК представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо (minicircle) или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором для осуществления вырезания используют одну эндонуклеазу рестрикции.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором для осуществления вырезания используют две разные эндонуклеазы рестрикции.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере что-то одно из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR, второго антисмыслового ITR, антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты и первого антисмыслового ITR является синтезированным.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором одноцепочечную молекулу ДНК конструируют путем синтеза чего-то одного или нескольких из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR, второго антисмыслового ITR, антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты и первого антисмыслового ITR в качестве олигонуклеотидов, и лигирования таких олигонуклеотидов с образованием одноцепочечной молекулы ДНК.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором одноцепочечную молекулу ДНК обеспечивают путем вырезания молекулы из двухцепочечного полинуклеотида ДНК с последующей денатурацией вырезанного двухцепочечного фрагмента для получения одноцепочечной молекулы ДНК.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором стадию образования содержащего шпильку полинуклеотида из одноцепочечной молекулы осуществляют путем отжига одноцепочечной молекулы в условиях, при которых один или несколько ITR образуют петлю шпильки.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором синтезируют по меньшей мере одну из первого ITR и второго ITR.

14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность двухцепочечной экспрессионной кассеты получают путем вырезания из двухцепочечного конструкта ДНК, содержащего последовательность экспрессионной кассеты.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором в двухцепочечном конструкте ДНК последовательность экспрессионной кассеты фланкирует на 5'-конце первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, а на 3'-конце - второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором двухцепочечный конструкт ДНК представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.

17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции являются одинаковыми эндонуклеазами рестрикции.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции являются разными эндонуклеазами рестрикции.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере один из первого ITR и второго ITR отжигают перед лигированием с последовательностью экспрессионной кассеты.

20. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере один из первого ITR и второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты, соответственно.

21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором лигирование выбирают из химического лигирования и лигирования с помощью белка.

22. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором лигирование осуществляют с использованием лигазы Т4 или белка Rep ААВ.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первый ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

24. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором второй ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

25. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере один из первого ITR и второго ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE (Rep-связывающий элемент).

26. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере один из первого ITR и второго ITR представляет собой ITR ААВ или полученный из ААВ ITR.

27. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность первого ITR выбирают из любой из последовательностей левых ITR, приведенных в Таблице 3, Таблице 4B или Таблице 5, или SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность второго ITR выбирают из любой из последовательностей правых ITR, приведенных в Таблице 3, Таблице 4A или Таблице 5, или SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.

29. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.

30. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.

31. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

32. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.

33. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.

34. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность трансгена имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

35. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность трансгена кодирует белок.

36. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок, или цитотоксический белок.

37. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.

38. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.

39. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором зкДНК-вектор является очищенным.

40. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из предшествующих пунктов.

41. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по любому из предшествующих пунктов и, необязательно, эксципиент.

42. Выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-6 или 6-39.

43. Генное лекарственное средство, содержащее выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из предшествующих пунктов.

44. Клетка, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 40.

45. Трансгенное животное, содержащее ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 40.

46. Способ лечения субъекта путем введения ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-5 или 6-39.

47. Способ доставки терапевтического белка субъекту, включающий:

введение субъекту композиции, содержащей ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 40 или полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-5 или 6-39, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует трансген или терапевтический белок.

48. Способ по п. 47, в котором терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело, репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок, или цитотоксический белок.

49. Набор, содержащий ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 40, или полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-5 или 6-39, и наноноситель, упакованный в контейнер со вкладышем.

50. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-5 или 6-39.

51. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-39, содержащий первую одноцепочечную молекулу ITR, содержащую первый ITR, вторую одноцепочечную молекулу ITR, содержащую второй ITR, и по меньшей мере один реагент для лигирования первой одноцепочечной молекулы ITR и второй одноцепочечной молекулы ITR с двухцепочечной полинуклеотидной молекулой.

52. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 2-39, содержащий: (i) двухцепочечный конструкт ДНК, содержащий экспрессионную кассету; первый ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты; второй ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты; и по меньшей мере два сайта расщепления эндонуклеазой рестрикции, фланкирующие ITR, так чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к экспрессионной кассете, причем экспрессионная кассета имеет сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и (ii) по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.

53. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 3-39, содержащий: (i) одноцепочечную молекулу ДНК, включающую, в порядке расположения в направлении от 5' к 3': первый смысловой ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; второй антисмысловой ITR; антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и первый антисмысловой ITR; причем смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и (ii) по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.

54. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 4-39, содержащий: (i) одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую, в порядке расположения в направлении от 5' к 3': первый смысловой ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; и антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; причем смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и (ii) по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.

55. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 5-39, содержащий: (i) двухцепочечный конструкт ДНК, содержащий, в порядке расположения в направлении от 5' к 3': первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; первый смысловой ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; причем смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и (ii) по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.

56. Набор по любому из пп. 49-55, в котором по меньшей мере один реагент для лигирования представляет собой реагент для химического лигирования.

57. Набор по любому из пп. 49-56, в котором по меньшей мере один реагент для лигирования представляет собой реагент для лигирования с помощью белка.

58. Набор по любому из пп. 49-57, в котором лигирование осуществляют путем лигирования с использованием Т4 или белка Rep ААВ.

59. Набор по любому из пп. 49-58, в котором первая одноцепочечная молекула ITR и вторая одноцепочечная молекула ITR содержат на своих концах сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.

60. Набор по любому из пп. 49-59, в котором набор дополнительно содержит по меньшей мере один фермент эндонуклеазы рестрикции.

[0027] В некоторых вариантах реализации один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к синтетически продуцируемому невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектору), причем зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа, при этом, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген, и вектор не заключен в вирусный капсид.

[0028] В некоторых вариантах реализации один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к синтетически продуцируемому невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектору), причем зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между асимметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (асимметричные ITR), при этом по меньшей мере один из асимметричных ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep и, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген, и вектор не заключен в вирусный капсид.

[0029] В некоторых вариантах реализации один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к синтетически продуцируемому невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектору), причем зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между симметричными мутантными последовательностями инвертированных концевых повторов, при этом по меньшей мере один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep и, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген, и вектор не заключен в вирусный капсид.

[0030] Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0031] Варианты реализации данного изобретения, вкратце изложенные выше и описанные более подробно ниже, будут понятны со ссылкой на иллюстративные варианты реализации данного изобретения, представленные на прилагаемых чертежах. Однако прилагаемые чертежи иллюстрируют только типичные варианты реализации данного изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие его объем, поскольку раскрытие может допускать другие, в равной степени эффективные, варианты реализации.

[0032] Фиг. 1А демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего асимметричные ITR. В этом варианте реализации типичный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Экспрессионную кассету фланкируют два инвертированных концевых повтора (ITR) - ITR ААВ2 дикого типа слева от (на 5'-конце) и модифицированный ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, таким образом, два ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, являются асимметричными относительно друг друга.

[0033] Фиг. 1B демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего асимметричные ITR с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - модифицированным ITR слева от (на 5'-конце) и ITR дикого типа справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты.

[0034] Фиг. 1C демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для включения асимметричных ITR, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(A). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставить трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR), которые являются асимметричными относительно друг друга; модифицированный ITR слева от (на 5'-конце) и модифицированный ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, причем 5'-ITR и 3'-ITR оба являются модифицированными ITR, но имеют разные модификации (т.е. они имеют неодинаковые модификации).

[0035] Фиг. 1D демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0036] Фиг. 1Е демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(A). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0037] Фиг. 1F демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего симметричные WT-ITR или по существу симметричные WT-ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, трансген люциферазы, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5' WT-ITR и 3' WT-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0038] Фиг. 1G демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(A). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5' WT-ITR и 3' WT-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0039] На Фиг. 2А представлена Т-образная структура стебель-петля левого ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 52) с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя сайтами связывания Rep (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs). RBE содержит серию из 4 дуплексных тетрамеров, которые, как полагают, взаимодействуют либо с Rep 78, либо с Rep 68. Кроме того, считается, что RBE' взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ITR дикого типа или мутировавшем ITR в конструкте. Области D и D' содержат сайты связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры. Фиг. 2B демонстрирует предложенную катализируемую Rep никующую и лигирующую активности левого ITR дикого типа (SEQ ID NO: 53), включая Т-образную структуру стебель-петля левого ITR ААВ2 дикого типа с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя сайтами связывания Rep (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs), и область D и D', содержащую несколько сайтов связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры.

[0040] На Фиг. 3А продемонстрирована первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащих частей A-A’-плеча, и C-C'- и B-B’-плечи ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 54). Фиг. 3B демонстрирует типичный пример последовательности мутированного ITR (также называемого модифицированным ITR) для левого ITR. Представлена первичная структура (слева) и предсказанная вторичная структура (справа) RBE-участка A-A'-плеча, C-плечо и B-B’-плечо типичного примера мутированного левого ITR (ITR-1, левый) (SEQ ID NO: 113) Фиг. 3C демонстрирует первичную структуру (слева) и вторичную структуру (справа) RBE-содержащей части петли A-A', и B-B'- и C-C'-плеч правого ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 55). Фиг. 3D демонстрирует типичный пример правого модифицированного ITR. Представлена первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части A-A’-плеча, B-B’- и C-плечи типичного примера мутанта правого ITR (ITR-1, правый) (SEQ ID № 114). Любая комбинация левого и правого ITR (например, ITR ААВ2 или другого вирусного серотипа, или синтетических ITR) может быть использована, как описано в данном документе. Каждая из полинуклеотидных последовательностей Фиг. 3A-3D относится к последовательности, используемой для продуцирования зкДНК, как описано в данном документе. Также в каждую из Фиг. 3A-3D включены соответствующие вторичные структуры зкДНК, полученные из конфигураций зкДНК-вектора в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса и предсказанных значений свободной энергии Гиббса.

[0041] Фиг. 4А представляет собой схему, иллюстрирующую один вариант реализации бесклеточного синтеза для получения зкДНК. Продукты способа, представленного на Фиг. 4А, можно выделить и охарактеризовать в соответствии с процессом производства и выделения конечного продукта (downstream process) на Фиг. 4B. Фиг. 4B демонстрирует неограничивающий пример биохимического способа подтверждения продуцирования зкДНК. На Фиг. 4C и Фиг. 4D приведены схематические изображения, описывающие процесс определения присутствия зкДНК, полученной в процессе бесклеточного продуцирования зкДНК, представленном на Фиг. 4A. На Фиг. 4С представлены схематично ожидаемые полосы для типичного примера зкДНК, либо оставленной неразрезанной, либо расщепленной эндонуклеазой рестрикции, а затем подвергнутой электрофорезу на нативном или денатурирующем геле. Крайняя левая схема представляет собой нативный гель и демонстрирует многочисленные полосы, позволяя предположить, что в своей дуплексной и неразрезанной форме зкДНК существует, по меньшей мере, в мономерном и димерном состояниях, наблюдаемых в виде более быстро мигрирующего мономера меньшего размера и более медленно мигрирующего димера, вдвое превышающего мономер по размеру. На втором слева схематическом изображении показано, что при разрезании зкДНК эндонуклеазой рестрикции исходные полосы исчезают и появляются полосы с более быстрой миграцией (например, меньших по размеру фрагментов), соответствующие ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует как фрагмент в два раза большего размера по сравнению с тем, что наблюдается на нативном геле, поскольку комплементарные цепи являются ковалентно связанными. Соответственно, на втором схематическом изображении справа расщепленная зкДНК демонстрирует распределение полос, схожее с наблюдаемым на нативном геле, однако полосы мигрируют как фрагменты, размер которых в два раза больше их аналогов в нативном геле. Крайнее правое схематическое изображение демонстрирует, что неразрезанная зкДНК в денатурирующих условиях мигрирует как одноцепочечное раскрытое кольцо и, соответственно, наблюдаемые полосы соответствуют в два раза большему размеру фрагментов по сравнению с наблюдаемым в нативных условиях при нераскрытом кольце. На этой фигуре «т.п.о.» (kb) используется для указания относительного размера нуклеотидных молекул, основанного, в зависимости от контекста, либо на длине нуклеотидной цепи (например, для одноцепочечных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях), либо на числе пар оснований (например, для двухцепочечных молекул, наблюдаемых в нативных условиях). Фиг. 4D демонстрирует ДНК, имеющую прерывистую структуру. зкДНК может быть разрезана эндонуклеазой рестрикции, имеющей один сайт распознавания на зкДНК-векторе, и генерировать два фрагмента ДНК разных размеров (1 т.п.о. и 2 т.п.о.) как в нейтральных, так и в денатурирующих условиях. Фиг. 4D также демонстрирует зкДНК, имеющую линейную и непрерывную структуру. зкДНК-вектор может быть разрезан эндонуклеазой рестрикции и генерировать два фрагмента ДНК, которые мигрируют как 1 т.п.о. и 2 т.п.о. в нейтральных условиях, но в денатурирующих условиях цепи (stands) остаются связанными и продуцируют одночные цепи, которые мигрируют как 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[0042] Фиг. 5 демонстрирует иллюстративное изображение прогона в денатурирующем геле примеров зкДНК-векторов с (+) или без (-) расщепления эндонуклеазами (EcoRI для зкДНК-конструктов 1 и 2; BamH1 для зкДНК-конструктов 3 и 4; SpeI для зкДНК-конструктов 5 и 6; и XhoI для зкДНК-конструктов 7 и 8). Размеры полос, выделенных звездочкой, были определены и приведены в нижней части изображения.

[0043] Фиг. 6А-6D демонстрируют типичные примеры ITR и олигонуклеотидов для синтеза ITR, предназначенных для использования в вариантах реализации, описанных в данном документе. На Фиг. 6А представлен пример олигонуклеотида (WT-L-oligo-1) для получения 5' WT-ITR с сайтами рестрикции ArvII. Фиг. 6A демонстрирует верхнюю последовательность как SEQ ID NO: 156, идеальную структуру как SEQ ID NO: 134, 158 и 157, соответственно, в порядке упоминания, предсказанную структуру как SEQ ID NO: 134 и WT- L-oligo-1 как SEQ ID NO: 134. На Фиг. 6B представлен пример олигонуклеотида (WT-L-oligo-2) для получения 5' WT-ITR с сайтами рестрикции ArvII. Фиг. 6B раскрывает SEQ ID NO: 135 и 135, соответственно, в порядке упоминания. Фиг. 6C демонстрирует другой типичный пример олигонуклеотида (WT-R-oligo-3) для получения 3' WT-ITR с сайтами рестрикции SbfI. Фиг. 6C раскрывает SEQ ID NO: 159, 136, и 136, соответственно, в порядке упоминания. На Фиг. 6D представлен другой типичный пример олигонуклеотида (MU-R-oligo-1) для получения 3' mod-ITR с сайтами рестрикции DraIII. Фиг. 6D раскрывает SEQ ID NO: 160, 137, и 137, соответственно, в порядке упоминания.

[0044] На Фиг. 7А-7Е представлены типичные ITR и типичные олигонуклеотиды для синтеза зкДНК-векторов с использованием бесклеточного синтеза, как описано в данном документе. Фиг. 7А демонстрирует типичный пример олигонуклеотида (WT-L-oligo-1) для получения 5' WT-ITR с сайтами рестрикции ArvII. Фиг. 7A (8A) раскрывает SEQ ID NO: 138 и 138, соответственно, в порядке упоминания. Фиг. 7B демонстрирует типичный пример олигонуклеотида (WT-L-oligo-2) для получения 5' WT-ITR с сайтами рестрикции ArvII. Фиг. 7В (8B) раскрывает SEQ ID NO: 161, 139 и 139, соответственно, в порядке упоминания. Фиг. 7C демонстрирует другой типичный пример олигонуклеотида (WT-R-oligo-3) для получения 3' WT-ITR с сайтами рестрикции SbfI. Фиг. 7С (8C) раскрывает SEQ ID NO: 140 и 140, соответственно, в порядке упоминания. Фиг. 7D демонстрирует другой типичный пример олигонуклеотида (MU-R-oligo-1) для получения 3' mod-ITR с сайтами рестрикции DraIII. Фиг. 7D (8D) раскрывает SEQ ID NO: 141 и 141, соответственно, в порядке упоминания. Фиг. 7Е демонстрирует другой типичный пример олигонуклеотида (MU-R-oligo-6) (SEQ ID NO: 142) для получения 3' mod-ITR с сайтами рестрикции SbfI. Фиг. 7E (8E) раскрывает SEQ ID NO: 142 и 142, соответственно, в указанном порядке.

[0045] Фиг. 8 демонстрирует типичный пример олигонуклеотида, использованного для получения модифицированного 3'-ITR. Фиг. 8 раскрывает SEQ ID NO: 160 и 162, соответственно, в указанном порядке. Фиг. 9 демонстрирует схему типичного примера ДНК-вектора и его сборку в соответствии с некоторыми вариантами реализации, описанными в данном документе. В частности, олигонуклеотид 5'-ITR лигируют с 5'-концом двухцепочечной молекулы ДНК, олигонуклеотид 3'-ITR лигируют с 3'-концом двухцепочечной молекулы ДНК. Концы олигонуклеотида 5'-ITR комплементарны 5' ('5) смысловой цепи и 3' антисмысловой цепи двухцепочечной молекулы ДНК (т.е. они имеют одинаковый сайт эндонуклеазы рестрикции), и, аналогично, концы олигонуклеотида 3'-ITR являются комплементарными 3' ('3) смысловой цепи и 5' антисмысловой цепи двухцепочечной молекулы ДНК. Фиг. 9 раскрывает SEQ ID NO: 134, 158 и 157, соответственно, в порядке упоминания, с левой стороны, и SEQ ID NO: 163, 137 и 164, соответственно, в порядке упоминания, с правой стороны.

[0046] Фиг. 10А демонстрирует структуру с наименьшей энергией модифицированного ITR («ITR-6 (левый)» SEQ ID NO: 111), а Фиг. 10В демонстрирует структуру с наименьшей энергией модифицированного ITR («ITR-6 (правый)» SEQ ID NO: 112). Предположительно, они образуют структуру шпильки с одним плечом. Прогнозируемые значения их свободных энергий Гиббса для развертывания составляют -54,4 ккал/моль.

[0047] Фиг. 11А демонстрирует схематическое изображение зкДНК-вектора с указанием ITR, содержащего две петли шпильки (области B и C), и область A и D, содержащую RPE и, необязательно, TRS, фланкирующего с обоих сторон кассету, содержащую представляющий интерес ген, необязательной области промотора/энхансера, необязательного элемента посттранскрипционного ответа (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE), и необязательного сигнала полиаденилирования (например, из бычьего гормона роста, BGHpA). Фиг. 11B демонстрирует схематическое изображение различных олигонуклеотидов, которые синтезируют и соединяют для получения готового зкДНК-вектора.

[0048] Фиг. 12 представляет собой схематическое описание типичного примера способа, используемого для получения зкДНК-вектора синтетическим путем.

[0049] Фиг. 13А демонстрирует схематически представленный зкДНК-вектор с двумя ITR ААВ2 дикого типа, который получают синтетическим путем в соответствии с Примером 6. Фиг. 13B демонстрирует хроматограмму, полученную в результате анализа с помощью биоанализатора очищенного зкДНК-вектора с WT/WT-ITR в соответствии с Примером 6. Данные для каждого из пиков хроматограммы приведены в Таблице 8.

[0050] Фиг. 14А демонстрирует схематически представленный зкДНК-вектор с левым ITR ААВ2 дикого типа и правым укороченным мутантом ITR, полученный синтетическим путем в соответствии с Примером 5. Фиг. 14В демонстрирует хроматограмму, полученную в результате анализа с помощью биоанализатора очищенного зкДНК-вектора с WT/мутантным ITR в соответствии с Примером 6. Данные для каждого из пиков хроматограммы приведены в Таблице 9.

[0051] Фиг. 15А демонстрирует схематически представленный зкДНК-вектор с левым усеченным мутантным ITR и отличным от него правым усеченным мутантным ITR, полученный синтетическим путем в соответствии с Примером 6. Фиг. 15B демонстрирует хроматограмму, полученную в результате анализа с помощью биоанализатора очищенного зкДНК-вектора с асимметричными мутантным/мутантным ITR в соответствии с Примером 6. Данные для каждого из пиков хроматограммы приведены в Таблице 10.

[0052] Фиг. 16А демонстрирует схематично представленный зкДНК-вектор с левым ITR ААВ2 дикого типа и правым усеченным мутантным ITR, полученный традиционным способом путем продуцирования клетками Sf9. Фиг. 16B демонстрирует хроматограмму, полученную в результате анализа с помощью биоанализатора очищенного традиционно полученного зкДНК-вектора с WT/мутантным ITR. Данные для каждого из пиков хроматограммы приведены в Таблице 11.

[0053] Фиг. 17 демонстрирует результаты анализов клеточной экспрессии in vitro, приведенных в Примере 7, со сравнением экспрессии трансгена из синтетически продуцируемых зкДНК-векторов и из зкДНК-векторов, продуцируемых Sf9 традиционным способом в клетках HepaRG. Схематическое изображение каждого используемого конструкта представлено непосредственно над изображением, полученным методом флуоресцентной микроскопии для клеток, обработанных этим зкДНК-вектором, через 6 дней после введения указанного зкДНК-вектора путем нуклеофекции (белые пятна представляют клеточные популяции, экспрессирующие трансген GFP).

Фиг. 18А демонстрирует график, показывающий количествено данные визуализации in vivo на 3-й и 7-й день у мышей, получивших синтетические или продуцированные традиционным способом зкДНК-вектора в соответствии с Примером 8. Фиг. 18B демонстрирует необработанные изображения IVIS обработанных мышей (по которым проводились количественные определения для графика, представленного на Фиг. 18A), на 7-й день после введения, и показывает, что большая часть экспрессии люциферазы, как и ожидалось, была локализована в печени независимо от способа получения зкДНК, используемой для лечения мышей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0054] Способы и композиции, представленные в данном документе, частично основаны на открытии синтетического способа получения, полезного для создания ДНК-векторов с замкнутыми концами, включая, без ограничений, зкДНК-векторы, которые содержат меньшее количество примесей и/или имеют более высокий выход по сравнению с ДНК-векторами, продуцируемыми в клеточной линии насекомых, такой как клеточная линия Sf9, и/или в котором процесс производства оптимизирован или сделан более эффективным или экономичным по сравнению с традиционными способами производства на основе клеток. В одном варианте реализации клетки не используются для репликации ДНК-векторов и, таким образом, продуцирование является бесклеточным. Соответственно, в данном документе предложен способ синтеза ДНК-векторов с замкнутыми концами без использования клеток. В некоторых вариантах реализации в данном документе предусматривается способ синтеза ДНК-векторов с замкнутыми концами без использования клеток насекомых. В данном документе также предусматриваются композиции ДНК-векторов с замкнутыми концами, полученные с использованием синтетических способов получения, описанных в данном документе, включая композиции зкДНК-векторов и применение таких ДНК-векторов с замкнутыми концами и зкДНК-векторов.

[0055] Данное изобретение относится к способу in vitro продуцирования ДНК-векторов с замкнутыми концами, соответствующим продуктам ДНК-векторов, полученным способами, описанными в данном документе, и их применению, а также к олигонуклеотидам и наборам, пригодным для использования в способе по изобретению.

[0056] ДНК-векторы с замкнутыми концами, полученные описанными в данном документе способами, имеют преимущество перед другими векторами, заключающееся в том, что их можно более безопасно использовать для экспрессии трансгена в клетке, ткани или у субъекта. Таким образом, нежелательные побочные эффекты могут быть потенциально сведены к минимуму путем создания линейных векторов такими бесклеточными способами, поскольку полученные векторы не содержат загрязнений, связанных с бактериальными клетками или клетками насекомых. Синтетические способы получения также могут обеспечить большую чистоту желаемого вектора. Синтетический способ получения также может быть более эффективным и/или экономичным, чем традиционные способы получения таких векторов на основе клеток.

[0057] Векторы, синтезированные, как описано в данном документе, могут экспрессировать любой желаемый трансген, например, трансген, предназначенный для лечения или исцеления определенного заболевания. Специалист в данной области техники легко поймет, что любой трансген, используемый в традиционных способах генной терапии с обычными рекомбинантными векторами, может быть адаптирован для экспрессии, например, с помощью зкДНК-векторов, полученных синтетическими способами, описанными в данном документе.

I. Определения

[0058] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с данной заявкой, должны иметь значения, общеизвестные рядовым специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, и т.д., описанными в данном документе, которые фактически могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, определяемого исключительно формулой изобретения. Определения распространенных терминов иммунологии и молекулярной биологии можно найти в следующих источниках: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19^th Edition, опубликовано Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6^th Edition, опубликовано Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology, Werner Luttmann, опубликовано Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, опубликовано Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strobe (eds.), John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), содержание которых включено в данный документ посредством ссылок в полном объеме.

[0059] Используемые в данном документе термины «бесклеточное продуцирование», «синтетическое получение ДНК-вектора с замкнутыми концами» и «синтетическое получение» и их грамматические аналоги используются взаимозаменяемо и относятся к продуцированию одной или нескольких молекул способом, который не включает репликацию или другое мультиплицирование молекулы клеткой или внутри клетки или с использованием клеточного экстракта. Синтетическое получение позволяет избежать загрязнения полученной молекулы клеточными загрязнениями (например, клеточными белками или клеточными нуклеиновыми кислотами) и, кроме того, предотвращает нежелательную клеточно-специфическую модификацию молекулы в процессе продуцирования (например, метилирование или гликозилирование или другую посттрансляционную модификацию).

[0060] Используемые в данном документе термины «гетерологичная нуклеотидная последовательность» и «трансген» используются взаимозаменяемо и относятся к представляющей интерес нуклеиновой кислоте (отличной от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид капсида), которая включена в состав и может быть доставлена и экспрессирована с помощью зкДНК-вектора, как описано в данном документе.

[0061] Используемые в данном документе термины «экспрессионная кассета» и «транскрипционная кассета» и «единица экспрессии гена» используются взаимозаменяемо и относятся к линейному фрагменту нуклеиновых кислот, который включает трансген, функционально связанный с одним или несколькими промоторами или другими регуляторными последовательностями, достаточными для прямой транскрипции трансгена, но не содержит последовательности, кодирующие капсид, другие векторные последовательности или области инвертированных концевых повторов. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать одну или несколько цис-действующих последовательностей (например, промоторов, энхансеров или репрессоров), один или несколько интронов и один или несколько посттранскрипционных регуляторных элементов.

[0062] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечные ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. «Олигонуклеотид» обычно относится к полинуклеотидам, содержащим от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов одно- или двухцепочечной ДНК. Однако, для целей данного изобретения, верхний предел длины олигонуклеотида не установлен. Олигонуклеотиды также известны как «олигомеры» или «олиго» (oligo) и могут быть выделены из генов или химически синтезированы способами, известными в данной области. Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» следует понимать как включающие, применительно к описываемым вариантам реализации, одноцепочечные (такие как смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные полинуклеотиды.

[0063] Используемый в данном документе термин «конструкт нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одноцепочечной или двухцепочечной, которая выделена из встречающегося в природе гена, или модифицирована так, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот, способом, не существующим в природе, или является синтетической. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «экспрессионная кассета», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по данному изобретению. «Экспрессионная кассета» включает кодирующую последовательность ДНК, функционально связанную с промотором.

[0064] Под «гибридизуемым» или «комплементарным» или «по существу комплементарным» подразумевается, что нуклеиновая кислота (например, РНК) включает последовательность нуклеотидов, которая позволяет ей нековалентно связываться, т.е. формировать пары оснований по Уотсону-Крику и/или пары оснований G/U, подвергаться «отжигу» или «гибридизироваться» с другой нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности, антипараллельным образом (т.е. нуклеиновая кислота специфически связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой) в соответствующих in vitro и/или in vivo условиях температуры и ионной силы раствора. Как известно в данной области техники, стандартное спаривание оснований по Уотсону-Крику включает спаривание аденина (A) с тимидином (T), спаривание аденина (A) с урацилом (U), и спаривание гуанина (G) с цитозином (C). Кроме того, в данной области техники также известно, что при гибридизации двух молекул РНК (например, дцРНК) гуаниновое (G) основание спаривается с урацилом (U). Например, спаривание оснований G/U частично отвечает за вырожденность (т.е. избыточность) генетического кода в контексте спаривания оснований анти-кодонов тРНК с кодонами в мРНК. В контексте данного изобретения, гуанин (G) связывающего белок сегмента (дуплекса дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению считается комплементарным урацилу (U), и наоборот. Таким образом, когда пара оснований G/U может быть получена в данном нуклеотидном положении со связывающим белок сегментом (дуплекс дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению, это положение не рассматривается как некомплементарное, а считается комплементарным.

[0065] Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме аминокислот любой длины, которая может включать кодируемые и некодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты. и полипептиды, имеющие модифицированные пептидные остовы.

[0066] Последовательность ДНК, которая «кодирует» конкретную РНК или белок генного продукта, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты ДНК, которая транскрибируется в конкретную РНК и/или белок. Полинуклеотид ДНК может кодировать РНК (мРНК), которая транслируется в белок, или полинуклеотид ДНК может кодировать РНК, которая не транслируется в белок (например, тРНК, рРНК или нацеливающую на ДНК РНК; также называемые «некодирующими» РНК или «нкРНК»).

[0067] Используемый в данном документе термин «ген безопасной гавани генома» или «ген безопасной гавани» относится к гену или локусам, в которые последовательность нуклеиновой кислоты может быть вставлена так, чтобы последовательность могла интегрироваться и функционировать предсказуемым образом (например, экспрессировать белок, представляющий интерес) без существенных негативных последствий для активности эндогенного гена или способствования развитию рака. В некоторых вариантах реализации ген безопасной гавани также представляет собой локусы или ген, в которых вставленная последовательность нуклеиновой кислоты может экспрессироваться эффективно и на более высоких уровнях, чем в сайте, не являющемся «безопасной гаванью».

[0068] Используемый в данном документе термин «доставки гена» означает процесс, посредством которого чужеродная ДНК переносится в клетки-хозяева для генно-терапевтического применения.

[0069] Используемый в данном документе термин «концевой повтор» или «TR» включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимально необходимую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Rep-связывающая последовательность («RBS») и сайт концевого разрешения («TRS») вместе составляют «минимально необходимую точку начала репликации» и, соответственно, TR содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. Все TR, являющиеся обратно комплементарными друг другу на данном отрезке полинуклеотидной последовательности, обычно называют «инвертированными концевыми повторами» или «ITR». В контексте вируса, ITR обеспечивают репликацию, упаковку вируса, интеграцию и спасение провируса. Как было неожиданно обнаружено авторами данного изобретения, TR, не являющиеся обратно комплементарными по всей длине, могут, тем не менее, выполнять традиционные функции ITR и, соответственно, термин ITR в данном документе используется по отношению к TR в геноме зкДНК или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области будет понятно, что в зкДНК-векторах сложной конфигурации может присутствовать более двух ITR или асимметричных пар ITR. ITR может представлять собой ITR ААВ или ITR, не принадлежащий ААВ, или может быть получен из ITR ААВ или ITR, не принадлежащего ААВ. Например, ITR может происходить из вируса семейства Parvoviridae, которое охватывает парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собак, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус мышей, свиной парвовирус, парвовирус человека B-19), или шпилька SV40, которая служит точкой начала репликации SV40, может применяться в качестве ITR, который может быть дополнительно модифицирован путем усечения, замены, делеции, вставки и/или добавления. Вирусы семейства Parvoviridae состоят из двух подсемейств: Parvovirinae, инфицирующих позвоночных животных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных животных. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (ААВ), которые способны к репликации у позвоночных животных-хозяев, включая, без ограничений, виды человека, приматов, крупного рогатого скота, собак, лошадей и овец. Для удобства в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' (перед) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ITR" или "левым ITR", а ITR, расположенный со стороны 3' (после) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3'-ITR» или «правый ITR».

[0070] «ITR дикого типа» или «WT-ITR» относится к последовательности встречающейся в природе ITR-последовательности в ААВ или другом депендовирусе, которая сохраняет, например, активность связывания Rep и никующую способность Rep. Нуклеотидная последовательность WT-ITR из любого серотипа ААВ может незначительно отличаться от канонической природной последовательности из-за вырожденности или дрейфа генетического кода и, таким образом, последовательности WT-ITR, пригодные для использования по данному изобретению, включают последовательности WT-ITR, образующиеся в результате естественных изменений, происходящих в процессе продуцирования (например, ошибки репликации).

[0071] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные WT-ITR» или «по существу симметричная пара WT-ITR» относится к паре WT-ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба представляют собой ITR дикого типа, имеющие обратно комплементарные последовательности по всей их длине. Например, ITR можно рассматривать как последовательность дикого типа, даже если она имеет один или несколько нуклеотидов, которые отклоняются от канонической природной последовательности, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую трехмерную структуру последовательности. В некоторых аспектах отклоняющиеся нуклеотиды представляют собой консервативные изменения последовательности. В качестве одного неограничивающего примера последовательность, имеющая идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную, например, с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет (and also has) симметричную трехмерную пространственную организацию с другой WT-ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричные WT-ITR имеют одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве. По существу симметричный WT-ITR можно функционально подтвердить как относящийся к дикому типу (WT), определив, что он имеет функциональный Rep-связывающий сайт (RBE или RBE') и сайт концевого разрешения (trs), который связывается с соответствующим белком Rep. Можно дополнительно проверить другие функции, включая экспрессию трансгена в пермиссивных условиях.

[0072] Используемые в данном документе фразы «модифицированный ITR» или «mod-ITR» или «мутантный ITR» являются взаимозаменяемыми и относятся к ITR, который имеет мутацию по меньшей мере в одном или нескольких нуклеотидах по сравнению с WT-ITR из того же серотипа. Мутация может приводить к изменению одной или нескольких из областей A, C, C', B, B' в ITR, и может приводить к изменению трехмерной пространственной организации (т.е. ее трехмерной структуры в геометрическом пространстве) по сравнению с трехмерной пространственной организацией WT-ITR того же серотипа.

[0073] Используемый в данном документе термин «асимметричные ITR», также называемый «асимметричными парами ITR», относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые не являются обратными комплементами по их полной длине. В качестве одного неограничивающего примера, в асимметричной паре ITR не имеет симметричной трехмерной пространственной организации со своим ITR-партнером, так что их трехмерные структуры имеют разные формы в геометрическом пространстве. Иными словами, в асимметричной паре ITR имеют разную общую геометрическую структуру, т.е. они имеют разную организацию своих A, C-C'- и B-B'-петель в трехмерном пространстве (например, один ITR может иметь короткое плечо C-C’ и/или короткое плечо B-B' по сравнению с ITR-партнером). Различие в последовательностях между двумя ITR может быть связано с добавлением, делецией, усечением или точечной мутацией одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте реализации один ITR асимметричной пары ITR может быть последовательностью ITR ААВ дикого типа, а другой ITR - модифицированным ITR, как определено в данном документе (например, последовательностью ITR не-дикого типа или синтетической). В другом варианте реализации ни один из ITR асимметричной пары ITR не является последовательностью ААВ дикого типа, и указанные два ITR представляют собой модифицированные ITR, которые имеют разные формы в геометрическом пространстве (т.е. разную общую геометрическую структуру). В некоторых вариантах реализации один mod-ITR асимметричной пары ITR может иметь короткое C-C'-плечо, а другой ITR может иметь другую модификацию (например, одно плечо или короткое B-B'-плечо и т.д.), так что они имеют различную трехмерную пространственную организацию по сравнению с парным ему асимметричным mod-ITR.

[0074] Используемый в данном документе термин «симметричные ITR» относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые мутированы или модифицированы относительно последовательностей депендовирусных ITR дикого типа и являются обратно комплементарными по всей их длине. Ни один из ITR не является последовательностью ITR ААВ2 дикого типа (т.е. они представляют собой модифицированные ITR, также называемые мутантными ITR), и может отличаться от последовательности ITR дикого типа вследствие добавления, делеции, замены, усечения нуклеотидов или точечной мутации. Для удобства в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' (перед) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ITR" или "левым ITR", а ITR, расположенный со стороны 3' (после) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3'-ITR» или «правый ITR».

[0075] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные модифицированные ITR» или «по существу симметричная пара mod-ITR» относится к паре модифицированных ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба имеют обратно комплементарные последовательности по всей своей длине. Например, модифицированный ITR может считаться по существу симметричным, даже имея некоторые нуклеотидные последовательности, отклоняющиеся от обратно комплементарной последовательности, если указанные изменения не влияют на свойства и общую форму. В качестве одного неограничивающего примера, последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет (and also has) симметричную трехмерную пространственную организацию с парным к ней модифицированным ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. Иными словами, по существу симметричная пара модифицированных ITR имеет одинаковую организацию A, C-C' и B-B’-петель в трехмерном пространстве. В некоторых вариантах реализации ITR из пары mod-ITR могут иметь разные обратно комплементарные нуклеотидные последовательности, но все же имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию, т.е. оба ITR имеют мутации, которые приводят к одинаковой общей трехмерной форме. Например, один ITR (например, 5'-ITR) в паре mod-ITR может принадлежать к одному серотипу, а другой ITR (например, 3'-ITR) может принадлежать к другому серотипу, однако оба могут иметь одинаковые соответствующие мутации (например, если 5'ITR имеет делецию в области C, родственный модифицированный 3'ITR другого серотипа имеет делецию в соответствующей позиции в области C'), так что пара модифицированных ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. В таких вариантах реализации каждый ITR в модифицированной паре ITR может принадлежать к разным серотипам (например, ААВ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), такой как комбинация ААВ2 и ААВ6, с модификацией в одном ITR, отображаемой в соответствующей позиции в ITR-партнере из другого серотипа. В одном варианте реализации пара по существу симметричных модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR), при условии, что разница в нуклеотидных последовательностях между ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. В качестве неограничивающего примера, mod-ITR имеет идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с каноническим mod-ITR, определенную стандартными средствами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)) или BLASTN с настройками по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то парный ему mod-ITR имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных A и B-B'-петель одинаковой формы в геометрическом пространстве с парным ему mod-ITR.

[0076] Термин «фланкирование» относится к относительному положению одной последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к другой последовательности нуклеиновой кислоты. В общем, в последовательности ABC A и C фланкируют B. То же самое относится к схеме расположения AxBxC. Таким образом, фланкирующая последовательность предшествует или следует за фланкируемой последовательностью, но не обязательно должна быть смежной с, или непосредственно прилегающей к, фланкируемой последовательности. В одном варианте реализации термин фланкирование относится к концевым повторам на каждом конце линейного дуплексного зкДНК-вектора.

[0077] Используемый в данном документе термин «геном зкДНК» относится к экспрессионной кассете, которая дополнительно включает, по меньшей мере, одну область инвертированного концевого повтора. Геном зкДНК может дополнительно содержать одну или несколько спейсерных областей. В некоторых вариантах реализации геном зкДНК включен в виде межмолекулярного дуплексного полинуклеотида ДНК в плазмиду или вирусный геном.

[0078] Используемый в данном документе термин «спейсерная область зкДНК» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в зкДНК-векторе или геноме зкДНК. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК удерживают два функциональных элемента на желаемом расстоянии для оптимальной функциональности. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК обеспечивают или увеличивают генетическую стабильность генома зкДНК в составе, например, плазмиды или бакуловируса. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК облегчают подготовленную генетическую манипуляцию с геномом зкДНК, обеспечивая удобное расположение сайтов клонирования и т.п. Например, в некоторых аспектах олигонуклеотидный «полилинкер», содержащий несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированный так, чтобы он не содержал известных сайтов связывания белка (например, транскрипционного фактора), может быть размещен в зкДНК-геноме для разделения цис-действующих факторов, например, посредством вставок 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.д., между сайтом концевого разрешения и вышележащим регуляторным элементом транскрипции. Аналогично, спейсер может быть включен между сигнальной последовательностью полиаденилирования и 3'-концевым сайтом разрешения.

[0079] Встречающиеся в данном документе термины «Rep-связывающий сайт», «элемент связывания Rep», «RBE» и «RBS» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту связывания белка Rep (например, Rep 78 ААВ или Rep 68 ААВ), который после связывания белком Rep позволяет белку Rep проявлять свою сайт-специфическую эндонуклеазную активность в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и ее обратный комплемент вместе образуют один RBS. Последовательности RBS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), представляющую собой последовательность RBS, идентифицированную в ААВ2. Любая известная последовательность RBS может быть использована в вариантах реализации изобретения, включая другие известные последовательности ААВ RBS и другие известные естественные или синтетические последовательности RBS. Без связи с какой-либо теорией, считается, что нуклеазный домен белка Rep связывается с дуплексной последовательностью нуклеотидов GCTC и, соответственно, на дуплексном олигонуклеотиде 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (SEQ ID NO: 60) происходит прямое связывание и стабильная сборка двух известных белков Rep ААВ. Кроме того, растворимые агрегированные конформеры (т.е. неопределенное число взаимосвязанных белков Rep) диссоциируют и связываются с олигонуклеотидами, которые содержат сайты связывания Rep. Каждый белок Rep взаимодействует как с азотистыми основаниями, так и с фосфодиэфирным остовом каждой цепи. Взаимодействия с азотистыми основаниями обеспечивают специфичность в отношении последовательности, тогда как взаимодействия с фосфодиэфирным остовом являются неспецифическими или менее специфическими в отношении последовательности и стабилизируют комплекс белок-ДНК.

[0080] Используемые в данном документе термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином, с образованием 3'-ОН, который служит субстратом для удлинения ДНК с помощью клеточной ДНК-полимеразы, например, ДНК-полимеразы дельта или ДНК-полимеразы эпсилон. Альтернативно, комплекс Rep-тимидин может участвовать в скоординированной реакции лигирования. В некоторых вариантах реализации TRS охватывает как минимум неспаренный тимидин. В некоторых вариантах реализации эффективность никирования TRS можно контролировать, по меньшей мере отчасти, расстоянием между ним и RBS в пределах одной молекулы. Если акцепторный субстрат представлен комплементарным ITR, итоговый продукт представляет собой внутримолекулярный дуплекс. Последовательности TRS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 61), представляющую собой гексануклеотидную последовательность, идентифицированную в ААВ2. Согласно вариантам реализации данного изобретения, может применяться любая известная последовательность TRS, в том числе другие известные последовательности TRS ААВ и другие известные природные или синтетические последовательности TRS, такие как AGTT (SEQ ID NO: 62), GGTTGG (SEQ ID NO: 63), AGTTGG ( SEQ ID NO: 64), AGTTGA (SEQ ID NO: 65) и другие мотивы, такие как RRTTRR (SEQ ID NO: 66).

[0081] Используемый в данном документе термин «зкДНК-плазмида» относится к плазмиде, которая содержит зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса.

[0082] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, содержащему геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса, который способен размножаться в E.coli в виде плазмиды и, таким образом, функционировать в качестве челночного вектора для бакуловируса.

[0083] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса в составе генома бакуловируса.

[0084] Используемые в данном документе термины «инфицированная зкДНК-бакуловирусом клетка насекомого» и «зкДНК-BIIC» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке-хозяину из беспозвоночного животного (включая, без ограничений, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированной зкДНК-бакуловирусом.

[0085] Используемый в данном документе термин «ДНК-вектор с замкнутыми концами» относится к бескапсидному ДНК-вектору с по меньшей мере одним ковалентно замкнутым концом, причем по меньшей мере часть вектора имеет структуру внутримолекулярного дуплекса.

[0086] Используемые в данном документе термины «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо и относятся к ДНК-вектору с замкнутыми концами, содержащему, по меньшей мере, один концевой палиндром. В некоторых вариантах реализации зкДНК содержит два ковалентно замкнутых конца.

[0087] Как определено в данном документе, «репортеры» относятся к белкам, которые могут использоваться для обеспечения детектируемых показаний. Репортеры обычно продуцируют измеримый сигнал, например, флуоресцентный, цветовой или люминесцентный. Кодирующие последовательности репортерных белков кодируют белки, присутствие которых в клетке или организме легко поддается наблюдению. Например, флуоресцентные белки вызывают флуоресценцию клетки при возбуждении светом с определенной длиной волны, люциферазы приводят к катализу клеткой реакции, которая генерирует свет, а ферменты, такие как β-галактозидаза, превращают субстрат в окрашенный продукт. Типичные примеры репортерных полипептидов, пригодных для экспериментальных или диагностических целей, включают, без ограничения перечисленными, β-лактамазу, β-галактозидазу (LacZ), щелочную фосфатазу (AP), тимидинкиназу (TK), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие флуоресцентные белки, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), люциферазу и другие, хорошо известные в данной области техники.

[0088] Используемый в данном документе термин «эффекторный белок» относится к полипептиду, который обеспечивает детектируемые показания, либо, например, как репортерный полипептид, либо, более предпочтительно, как полипептид, убивающий клетку, например, токсин, или агент, придающий клетке чувствительность к киллингу определенным агентом или при отсутствии определенного агента. Эффекторные белки включают любой белок или пептид, которые непосредственно нацелены на ДНК и/или РНК клетки-хозяина или повреждают их. Например, эффекторные белки могут включать, без ограничения перечисленным, рестрикционную эндонуклеазу, которая нацелена на последовательность ДНК клетки-хозяина (будь то геномный или внехромосомный элемент), протеазу, вызывающую деградацию полипептида-мишени, необходимого для выживания клетки, ингибитор ДНК-гиразы и токсин рибонуклеазного типа. В некоторых вариантах реализации экспрессия эффекторного белка, контролируемая синтетическим биологическим контуром, как описано в данном документе, может принимать участие в качестве фактора в другом синтетическом биологическом контуре, с расширением таким образом диапазона и сложности отклика системы биологического контура.

[0089] Регуляторы транскрипции относятся к активаторам и репрессорам транскрипции, которые либо активируют, либо подавляют транскрипцию гена, представляющего интерес. Промоторы представляют собой области нуклеиновой кислоты, которые инициируют транскрипцию конкретного гена. Активаторы транскрипции обычно связываются поблизости от транскрипционных промоторов и рекрутируют РНК-полимеразу, чтобы прямо инициировать транскрипцию. Репрессоры связываются с промоторами транскрипции и стерически затрудняют инициацию транскрипции РНК-полимеразой. Другие регуляторы транскрипции могут служить либо активатором, либо репрессором, в зависимости от места их связывания и условий в клетке и окружающей среде. Неограничивающие примеры классов регуляторов транскрипции включают, без ограничений, гомеодоменные белки, белки цинкового пальца, белки с мотивом «крылатая спираль» (белки forkhead) и белки лейциновой застежки.

[0090] Используемый в данном документе термин «белок-репрессор» или «белок-индуктор» представляет собой белок, который связывается с элементом регуляторной последовательности и подавляет или активирует, соответственно, транскрипцию последовательностей, функционально связанных с указанным элементом регуляторной последовательности. Предпочтительные белки-репрессоры и индукторы, как описано в данном документе, чувствительны к присутствию или отсутствию по меньшей мере одного вводимого агента или входного воздействия окружающей среды. Предпочтительные белки, как описано в данном документе, являются модульными по форме и содержат, например, отделяемые ДНК-связывающие, и связывающиеся с входными агентами, или откликающиеся на них, элементы или домены.

[0091] Используемый в данном документе термин «носитель» включает любые растворители, дисперсионные среды, основы, покрытия, разбавители, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Вспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в указанные композиции. Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не вызывают токсической, аллергической или аналогичной нежелательной реакции при введении хозяину.

[0092] Используемый в данном документе термин «домен, реагирующий на вводимый агент», представляет собой домен транскрипционного фактора, который связывается с, или иначе отвечает на условие или вводимый агент, обеспечивая отклик слитого с ним ДНК-связывающего домена на наличие указанного условия или входного воздействия. В одном варианте реализации наличие условия или входного воздействия приводит к конформационному изменению в домене, чувствительном к вводимому агенту, или в слитом с ним белке, которое модифицирует транскрипционно-модулирующую активность фактора транскрипции.

[0093] Термин «in vivo» относится к анализам или процессам, которые происходят в организме или в пределах организма, такого как многоклеточное животное. В некоторых аспектах, описанных в данном документе, можно сказать, что способ или применение происходят «in vivo», когда используется одноклеточный организм, такой как бактерия. Термин «ex vivo» относится к способам и применениям, которые осуществляют с использованием живой клетки с интактной мембраной, находящейся вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантатов, культивируемых клеток, в том числе первичных клеток и клеточных линий, трансформированных клеточных линий и экстрагированных тканей или клеток, в том числе клеток крови, среди прочего. Термин «in vitro» относится к анализам и способам, которые не требуют присутствия клетки с интактной мембраной, например, проводимым на клеточных экстрактах, и может относиться к введению программируемого синтетического биологического контура в неклеточную систему, такую как среда, не содержащая клеток или клеточных систем, такая как клеточные экстракты.

[0094] Используемый в данном документе термин «промотор» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты путем направления транскрипции указанной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой гетерологичный ген-мишень, кодирующий белок или РНК. Промоторы могут быть конститутивными, индуцибельными, репрессируемыми, тканеспецифичными или любой их комбинацией. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, которая контролирует инициацию и уровень транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать генетические элементы, в которых может происходить связывание регуляторных белков и молекул, таких как РНК-полимераза и другие транскрипционные факторы. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, промотор может управлять экспрессией транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию самого промотора. В последовательности промотора будет присутствовать сайт инициации транскрипции, а также связывающие белки домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда, содержат «TATA»-боксы и «CAT»-боксы. Для управления экспрессией трансгенов в зкДНК-векторах, описанных в данном документе, могут применяться различные промоторы, в том числе индуцибельные промоторы. Промоторная последовательность может быть ограничена на своем 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается в восходящем направлении (в направлении к 5'-концу), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициирования транскрипции на уровнях, детектируемых выше фона.

[0095] Используемый в данном документе термин «энхансер» относится к цис-действующей регуляторной последовательности (например, 50–1500 пар оснований), которая связывает один или несколько белков (например, белков-активаторов, или фактор транскрипции) для повышения транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии до 1000000 пар оснований выше сайта начала гена или ниже сайта начала гена, который они регулируют. Энхансер может быть расположен в интронной области или в экзонной области не связанного с ним гена.

[0096] Можно сказать, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Выражения «функционально связанный», «функционально расположенный», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» указывают, что промотор находится в корректном функциональном положении и/или ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности. «Инвертированный промотор» в данном документе относится к промотору, последовательность нуклеиновой кислоты которого имеет обратную ориентацию, так чтобы кодирующая цепь становилась некодирующей, и наоборот. Инвертированные промоторные последовательности можно использовать в различных вариантах реализации для регулирования состояния переключателя. Кроме того, в различных вариантах реализации промотор может использоваться совместно с энхансером.

[0097] Промотор может быть естественным образом ассоциирован с геном или последовательностью, что может осуществляться путем выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном данного гена или последовательности. Такой промотор может называться «эндогенным». Аналогично, в некоторых вариантах реализации энхансер может быть естественным образом ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной либо после, либо перед указанной последовательностью.

[0098] В некоторых вариантах реализации кодирующий сегмент нуклеиновой кислоты помещен под контроль «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора», причем оба термина относятся к промотору, который ассоциирован с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, отличной от той, с которой он функционально связан в условиях его естественной среды. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится к энхансеру, который обычно не связан с данной последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «встречающимися в природе», т.е. содержат различные элементы разных транскрипционных регуляторных областей и/или изменяющие экспрессию мутации, введенные с применением способов генетического конструирования, известных в данной области техники. Наряду с получением последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансером синтетическим путем, последовательности промоторов могут быть получены с использованием рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновых кислот, в том числе ПЦР, применительно к синтетическим биологическим контурам и модулям, раскрытым в данном документе (см., например, патент США № 4683202, патент США № 5928906, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрена также возможность применения контрольных последовательностей, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.

[0099] Как описано в данном документе, «индуцибельный промотор» представляет собой промотор, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии, под влиянием, или при контакте с, индуктором или индуцирующим агентом. «Индуктор» или «индуцирующий агент», как определено в данном документе, может быть эндогенным или нормально экзогенным соединением или белком, которые вводят таким образом, чтобы обеспечить их активность по индуцированию транскрипционной активности индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуктор или индуцирующий агент, т.е. химическое вещество, соединение или белок, сам может быть получен в результате транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. индуктор может представлять собой белок-индуктор, экспрессируемый другим компонентом или модулем), который сам может находиться под контролем индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцибельных промоторов включают, без ограничений, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса и длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие реагирующие на стероиды промоторы, реагирующие на рапамицин промоторы и т.п.

[00100] Термины «регуляторные последовательности ДНК», «контрольные элементы» и «регуляторные элементы», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к контрольным последовательностям транскрипции и трансляции, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют транскрипцию некодирующей последовательности (например, нацеливающей на ДНК РНК) или кодирующей последовательности (например, сайт-направленного модифицирующего полипептида или полипептида Cas9/Csn1) и/или регулируют трансляцию кодируемого полипептида.

[00101] «Функционально связанный» относится к размещению в непосредственной близости, при котором описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать по назначению. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. «Экспрессионная кассета» включает гетерологичную последовательность ДНК, которая функционально связана с промотором или другой регуляторной последовательностью, достаточной для направления транскрипции трансгена в зкДНК-векторе. Подходящие промоторы включают, например, тканеспецифичные промоторы. Промоторы также могут иметь происхождение от ААВ.

[00102] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или животному, лечение которого, включая профилактическое лечение, проводится с помощью зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением. Обычно животное представляет собой позвоночное животное, такое как, без ограничения, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. К приматам относятся, без ограничений, шимпанзе, яванские макаки, коаты и макаки, например, макаки-резусы. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, без ограничений, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, кошачьих, например, домашнюю кошку, собачьих, например, собак, лис, волков, птиц, например, кур, эму, страуса, и рыб, например, форель, сома и лосося. В определенных вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, указанным субъектом является млекопитающее, например, примат или человек. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъект может быть младенцем или ребенком. В некоторых вариантах реализации указанный субъект может представлять собой новорожденного или нерожденного субъекта, например, субъекта in utero. Предпочтительно, субъект является млекопитающим. Указанное млекопитающее может быть человеком, не являющимся человеком приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, но не ограничивается этими примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут быть выгодно использованы в качестве субъектов, являющихся животными моделями заболеваний и расстройств. Кроме того, способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы для одомашненных животных и/или домашних животных. Человек может быть любого возраста, пола, принадлежать к любой расе или этнической группе, например, может быть европеоидом (белым), азиатом, африканцем, черным, афроамериканцем, афроевропейцем, испаноамериканцем, представителем ближневосточного этноса и т.д. В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой пациента или другого субъекта в клинических условиях. В некоторых вариантах реализации, указанный субъект уже проходит курс лечения. В некоторых вариантах реализации субъект является эмбрионом, плодом, новорожденным, младенцем, ребенком, подростком или взрослым. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой плод человека, человеческого новорожденного, младенца, ребёнка, подростка или взрослого человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион животного или эмбрион, не принадлежащий человеку, или эмбрион примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человеческий эмбрион.

[00103] Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» включает любой тип клеток, которые являются восприимчивыми к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с использованием конструкта нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии зкДНК по данному изобретению. В качестве неограничивающих примеров клетка-хозяин может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, клетки CD34⁺), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из ряда иммортализованных клеточных линий (например, клетки HepG2). Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой клетку in situ или in vivo в ткани, органе или организме.

[00104] Термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, отличной от его природного источника. Термин «экзогенный» при использовании в данном документе может относиться к нуклеиновой кислоте (например, нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которых они обычно не обнаруживаются, причем введение нуклеиновой кислоты или полипептида в такую клетку или организм является желательным. Альтернативно, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они присутствуют в относительно небольших количествах, причем увеличение количества нуклеиновой кислоты или полипептида в указанных клетке или организме является желательным, например, для создания эктопической экспрессии или уровней. В противоположность этому, термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для биологической системы или клетки.

[00105] Термин «идентичность последовательностей» относится к сродству между двумя нуклеотидными последовательностями. Для целей данного изобретения степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры: штраф за открытие пробела 10, штраф за расширение пробела 0,5 и матрица замещения EDNAFULL (версия EMBOSS NCBI NUC4.4). Выходной параметр Нидла, обозначенный как «самая длинная идентичность» (полученный с использованием параметра -nobrief), используется в качестве процентной идентичности и рассчитываются следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды х 100) / (Длина выравнивания - Общее число пробелов в выравнивании). Длина выравнивания предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 50 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100 нуклеотидов.

[00106] Используемый в данном документе термин «гомология» или «гомологичный» определяется как процент нуклеотидных остатков в гомологичном плече, которые идентичны нуклеотидным остаткам в соответствующей последовательности на хромосоме-мишени после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента гомологии нуклеотидных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как прикладные программы BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность ДНК), например, гомологичное плечо матрицы репарации, считается «гомологичной», когда последовательность является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичной соответствующей нативной или неотредактированной последовательности нуклеиновой кислоты (например, геномной последовательности) клетки-хозяина.

[00107] Термин «гетерологичный», используемый в данном документе, означает нуклеотидную или полипептидную последовательность, которая не обнаружена в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с природной последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, с помощью генной инженерии) для получения химерной нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный полипептид. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с вариантом полипептида (например, с помощью генной инженерии) для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант слитого полипептида.

[00108] «Вектор» или «вектор экспрессии» представляет собой репликон, такой как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, т.е. «вставка», чтобы вызвать репликацию прикрепленного сегмента в клетке. Вектор может представлять собой конструкт нуклеиновой кислоты, предназначенную для доставки в клетку-хозяина или для переноса между различными клетками-хозяевами. В используемом в данном документе значении, вектор может быть вирусным или невирусным по происхождению и/или в конечной форме, однако для целей данного изобретения «вектор» обычно относится к зкДНК-вектору, как этот термин используется в данном документе. Термин «вектор» охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации, когда он связан с надлежащими контрольными элементами, и который может переносить генные последовательности в клетки. В некоторых вариантах реализации вектор может представлять собой вектор экспрессии или рекомбинантный вектор.

[00109] Используемый в данном документе термин «вектор экспрессии» относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в векторе. Экспрессируемые последовательности часто, но не обязательно, будут гетерологичными по отношению к клетке. Вектор экспрессии может содержать дополнительные элементы, например, вектор экспрессии может иметь две системы репликации, что позволяет поддерживать его в двух организмах, например, в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Термин «экспрессия» относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков и, в случае необходимости, в секретировании белков, включая, где это применимо, без ограничений, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и укладку белка, модификацию и процессинг. «Продукты экспрессии» включают РНК, транскрибируемую с гена, и полипептиды, полученные путем трансляции мРНК, транскрибированной с гена. Термин «ген» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (ДНК) в РНК in vitro или in vivo, когда она функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями. Ген может включать или не включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, например, 5'-нетранслируемые (5'UTR) или «лидерные» последовательности и 3'-UTR или «трейлерные» последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами).

[00110] Под «рекомбинантным вектором» подразумевается вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, или «трансген», способный к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в данном документе, в некоторых вариантах реализации можно комбинировать с другими подходящими композициями и терапиями. В некоторых вариантах реализации вектор является эписомальным. Использование подходящего эписомального вектора обеспечивает средства поддержания представляющего интерес нуклеотида у субъекта в многокопийной экстрахромосомной ДНК, тем самым устраняя потенциальные эффекты интеграции хромосом.

[00111] Используемая в данном документе фраза «генетическое заболевание» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или косвенно, вызванному одной или несколькими аномалиями в геноме, особенно, к состоянию, которое присутствует с рождения. Аномалия может быть мутацией, вставкой или делецией. Аномалия может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Генетическим заболеванием могут быть, без ограничений, МДД (мышечная дистрофия Дюшенна), гемофилия, муковисцидоз, хорея Гентингтона, семейная гиперхолестеринемия (дефект рецептора ЛПНП), гепатобластома, болезнь Вильсона, врожденная печеночная порфирия, наследственные нарушения метаболизма печени, синдром Леша-Нихана, серповидноклеточная анемия, талассемии, пигментная ксеродерма, анемия Фанкони, пигментный ретинит, атаксия-телеангиэктазия, синдром Блума, ретинобластома и болезнь Тея-Сакса.

[00112] Используемый в данном документе термин «содержащий» или «содержит» используется в отношении композиций, способов и их соответствующих компонентов, которые важны для способа или композиции, но допускают включение неуточненных элементов, будь то существенных или нет.

[00113] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Этот термин допускает присутствие элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики такого варианта реализации. Использование слова «содержащий» указывает на включение, а не на ограничение.

[00114] Термин «состоящий из» относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, как описано в данном документе, которые исключают любой элемент, не указанный в этом описании варианта реализации.

[00115] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Этот термин допускает наличие дополнительных элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики этого варианта реализации изобретения.

[00116] Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, в том числе сопровождаемые определением «указанный» (в английском тексте - с артиклями «a», «an» и «the»), включают ссылки на формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или несколько способов и/или этапов в данном документе типа и/или таких, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного изобретения, и т.д. Аналогично, предусматривается, что термин «или» включает «и», если из контекста явным образом не следует иное. Хотя при практической реализации или тестировании данного изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Выражение «например» используется в данном документе для описания неограничивающего примера. Так, сокращение «напр.» является синонимом термина «например».

[00117] За исключением рабочих примеров или иных указанных случаев, все числа, отражающие количества ингредиентов или условия реакции согласно данному изобретению, во всех случаях должны пониматься как модифицированные термином «приблизительно». Термин «приблизительно» применительно к процентам может означать ±1%. Данное изобретение дополнительно более подробно объяснено в приведенных ниже примерах, однако объем данного изобретения ими не ограничен.

[00118] Группы альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, раскрытых в данном документе, не должны рассматриваться как ограничения. На каждый член группы можно ссылаться и заявлять его индивидуально или в любой комбинации с другими членами указанной группы или другими элементами, представленными в данном документе. Один или несколько членов группы могут быть включены или удалены из группы по соображениям удобства и/или патентоспособности. При любом таком включении или удалении в данном документе считается, что описание изобретения содержит измененную группу, тем самым удовлетворяя условию письменного описания всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.

[00119] В некоторых вариантах реализации любого из аспектов изобретение, описанное в данном документе, не касается процесса клонирования людей, процессов модификации генетической идентичности зародышевой линии людей, использования человеческих эмбрионов в промышленных или коммерческих целях, или процессов модификации генетической идентичности животных, которые могут причинить им страдания без какой-либо существенной медицинской выгоды для человека или животного, а также животных, возникающих в результате таких процессов.

[00120] Определения других терминов приведены в данном документе в описании различных аспектов изобретения.

[00121] Все патенты и другие публикации, включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки, упомянутые в ланной заявке, явным образом включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с технологией, описанной в данном документе. Эти публикации представлены исключительно по причине их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этом отношении не должно быть истолковано как признание того, что авторы изобретения не обладают правами на более раннее изобретение по отношению к такому раскрытию в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются допущением каким-либо образом признания правильности дат или содержания этих документов.

[00122] Описание вариантов реализации изобретения не должно рассматриваться как исчерпывающее или ограничивающее изобретение точной раскрытой формой. Хотя в данном документе описаны в иллюстративных целях конкретные варианты реализации и примеры раскрытия, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема раскрытия, как будет понятно специалистам в соответствующей области техники. Например, хотя стадии или функции способа представлены в указанном порядке, в альтернативных вариантах реализации функции могут выполняться в другом порядке, или функции могут выполняться по существу одновременно. Принципиальные положения изобретения, представленные в данном документе, могут быть применены к другим процедурам или методам в зависимости от ситуации. Различные варианты реализации, описанные в данном документе, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов реализации. Аспекты раскрытия могут быть модифицированы, при необходимости, для использования составов, функций и концепций вышеупомянутых ссылок и применения для обеспечения дополнительных вариантов реализации изобретения. Кроме того, из соображений биологической функциональной эквивалентности могут быть сделаны некоторые изменения в структуре белка, не влияющие на биологическое или химическое действие в натуральном или количественном отношении. Эти и другие изменения могут быть внесены в раскрытие в свете подробного описания. Все такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.

[00123] Конкретные элементы любого из вышеупомянутых вариантов реализации могут быть объединены или заменены элементами других вариантов реализации. Кроме того, хотя преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации изобретения, были описаны в контексте этих вариантов реализации, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и не все варианты реализации обязательно должны демонстрировать такие преимущества, чтобы попадать в объем раскрытия.

[00124] Описанная в данном документе технология дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не должны рассматриваться как дополнительные ограничения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, и т.д., описанными в данном документе, которые фактически могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предусматривает ограничения объема данного изобретения, определяемого исключительно формулой изобретения.

II. Подробное описание синтетического способа получения кольцевых ДНК-векторов, включая зкДНК-векторы.

[00125] Описанная в данном документе технология направлена в целом на способы получения ДНК-векторов с замкнутыми концами в отсутствие клеток или клеточных линий. Таким образом, полученные векторы имеют меньшее количество примесей, чем сопоставимые векторы, полученные с использованием обычных методологий клеточного продуцирования.

А. Синтетический способ получения в целом

[00126] В некоторых вариантах реализации, в данном документе раскрыт способ синтеза ДНК-векторов с замкнутыми концами, включая зкДНК-векторы, не требующий использования каких-либо микробиологических стадий. В некоторых вариантах реализации способ позволяет синтезировать ДНК-векторы с замкнутыми концами в системе, использующей стадии ферментативного расщепления с помощью эндонуклеаз рестрикции, и стадии лигирования для получения ДНК-векторов с замкнутыми концами. Почти во всех вариантах реализации синтетическая система получения ДНК-вектора представляет собой бесклеточную систему. В некоторых вариантах реализации бесклеточная система представляет собой систему, не содержащую клеток насекомых.

[00127] Рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что один или несколько ферментов для синтетического способа получения одного или нескольких олигонуклеотидных компонентов могут продуцироваться клетками и использоваться в способах по данному изобретению в очищенной форме. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, синтетический способ производства представляет собой бесклеточный способ, однако рестрикционный фермент и/или фермент лигазы может продуцироваться клеткой.

[00128] В одном варианте реализации эндонуклеаза рестрикции и/или компетентный для лигирования белок могут экспрессироваться или обеспечиваются вектором экспрессии в клетке, например, бактериальной клетке. В одном варианте реализации может присутствовать клетка, такая как бактериальная клетка, содержащая экспрессионный вектор, экспрессирующий одну или несколько эндонуклеаз рестрикции или ферментов лигазы. Таким образом, хотя способы, раскрытые в данном документе, в первую очередь касаются бесклеточных синтетических способов получения ДНК-векторов, раскрытых в данном документе, один вариант реализации также охватывает синтетические способы получения, в которых присутствует клетка, например, бактериальная клетка, но не клетка насекомого, которая может использоваться для экспрессии одного или нескольких ферментов, необходимых в способе. В таких вариантах реализации клетка, экспрессирующая эндонуклеазу рестрикции и/или компетентный для лигирования белок, не является клеткой насекомого. Во всех вариантах реализации, в которых клетка присутствует и экспрессирует одну или несколько эндонуклеаз рестрикции или компетентных для лигирования белков, клетка не реплицирует ДНК-вектор с замкнутыми концами. Иными словами, внутриклеточные механизмы клетки не реплицируют ДНК-вектор или не участвуют в его репликации.

[00129] В некоторых вариантах реализации синтез ДНК-векторов с замкнутыми концами (например, зкДНК-векторов), описанных в данном документе, осуществляют в бесклеточном процессе in vitro, начиная с двухцепочечного ДНК-конструкта или одного или нескольких олигонуклеотидов. Двухцепочечный ДНК-конструкт или один или несколько олигонуклеотидов расщепляют эндонуклеазами рестрикции и лигируют с образованием молекул ДНК. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, которые могут быть синтезированы химически, позволяют таким образом избежать использования больших исходных матриц, кодирующих всю желаемую последовательность, которая обычно должна репродуцироваться в бактериях. После синтеза желаемой последовательности ДНК она может быть расщеплена и лигирована с другими олигонуклеотидами, как описано в данном документе. Использование множества олигонуклеотидов при создании ДНК-векторов с замкнутыми концами с использованием способов, описанных в данном документе, обеспечивает возможность применения модульного подхода к получению ДНК-векторов, позволяя редактировать и/или специфически выбирать концевые повторы, например, ITR, также как и расстояние до концевых повторов, а также выбирать последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты в синтетически продуцируемых ДНК-векторах с замкнутыми концами.

Б. Синтетический способ получения ДНК-векторов

[00130] Некоторые способы получения зкДНК-вектора, содержащего различные конфигурации ITR, с использованием клеточных методов описаны в Примере 1 международных заявок PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., и PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которые включены в данный документ посредством ссылок в полном объеме.

[00131] Напротив, способы, предложенные в данном документе, относятся к синтетическому способу получения, например, в некоторых вариантах реализации, к бесклеточному способу получения, и также называются в данном документе «синтетическое получение ДНК-вектора с замкнутыми концами» или «синтетическое получение».

[00132] В данном документе представлен и описан пример синтетического способа получения ДНК-вектора с замкнутыми концами с использованием синтетического продуцирования зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации синтетический способ получения представляет собой бесклеточный способ, например, способ без использования клеток насекомых. В некоторых вариантах реализации синтетический способ получения проводится в отсутствие бакмид или бакуловируса, или обоих. В альтернативных вариантах реализации синтетический способ получения может включать использование клеток, например, бактериальных клеток, например, клеток, экспрессирующих эндонуклеазу рестрикции и/или компетентный для лигирования белок Rep и т.п. В таком варианте реализации клетки могут представлять собой клеточную линию, которая имеет стабильно интегрированную матрицу полинуклеотидного вектора и может использоваться для введения белка эндонуклеазы рестрикции и/или белка, компетентного к лигазе, например, такого как, без ограничений, белок Rep, в реакционную смесь, содержащую олигонуклеотиды, используемые в описанных в данном документе синтетических способах получения.

[00133] Примеры способа получения и выделения зкДНК-векторов, полученных с использованием синтетического способа получения, раскрытого в данном документе, описаны на Фиг. 4A-4E и в конкретных примерах в разделе Примеры ниже.

[00134] Во всех аспектах синтетических способов продуцирования для получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, как описано в данном документе, стадия лигирования может быть стадией химического лигирования или стадией ферментативного лигирования. В некоторых вариантах реализации лигирование можно проводить с использованием компетентного для лигирования фермента, например, ДНК-лигазы, например, для лигирования липких 5'- и 3'-концов (выступов) или тупых концов. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой фермент лигазы, отличный от белка Rep. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой белок Rep ААВ.

[00135] Во всех аспектах синтетических способов получения ДНК-векторов с замкнутыми концами, как описано в данном документе, указанный способ представляет собой способ in vitro. В предпочтительном варианте реализации указанный способ представляет собой бесклеточный способ, т.е. не осуществляется в клетке или в присутствии клетки, например, клетки насекомого. В альтернативных вариантах реализации один или несколько ферментов для синтетического способа получения производства могут продуцироваться или экспрессироваться клеткой, например, клеткой, не принадлежащей насекомому. Например, в некоторых вариантах реализации может присутствовать клетка, такая как бактериальная клетка, содержащая вектор экспрессии, экспрессирующий одну или несколько эндонуклеаз рестрикции или ферментов лигазы. Таким образом, хотя способы, раскрытые в данном документе, в основном относятся к бесклеточным способам синтеза для получения ДНК-векторов с замкнутыми концами, раскрытых в данном документе, также предусматриваются синтетические способы производства, в которых клетка, например, бактериальная клетка, может быть использована для экспрессии одного или нескольких ферментов, необходимых для осуществления способа.

(i) Синтетический способ получения из двухцепочечного ДНК-конструкта

[00136] В одном аспекте ДНК-вектор с замкнутыми концами получают путем вырезания всей молекулы, которая образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, из двухцепочечного ДНК-конструкта с последующим лигированием концов, чтобы замкнуть молекулу. В таком варианте реализации двухцепочечный конструкт ДНК содержит, в порядке от 5' к 3': первый сайт эндонуклеазы рестрикции; левый (в направлении 5') ITR; экспрессионную кассету; правый (в направлении 3') ITR; и второй сайт эндонуклеазы рестрикции. Затем двухцепочечный конструкт ДНК вводят в контакт с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции для получения двухцепочечных разрывов в обоих сайтах расщепления эндонуклеазами рестрикции. Оба сайта могут быть мишенями одной эндонуклеазы, или сайты могут быть мишенями разных эндонуклеаз, при условии, что сайты рестрикции не присутствуют в матричной области вектора с замкнутыми концами. В результате этого происходит вырезание последовательности, расположенной между сайтами эндонуклеаз рестрикции, из остальной части двухцепочечного ДНК-конструкта. Эта вырезанная молекула будет иметь свободные 5'- и 3'-концы, которые затем лигируют для образования ДНК-вектора с замкнутыми концами. Лигирование может быть осуществлено путем использования белка с лигирующими функциями, такого как, например, Rep или фаговый белок, или путем химического лигирования. В некоторых аспектах длина вектора, в направлении от 5' к 3', превышает максимальную длину, о которой известно, что она может быть инкапсидирована в вирионе ААВ. В некоторых аспектах длина составляет более 4,6 т.п.о., или более 5 т.п.о., или более 6 т.п.о. В некоторых аспектах вырезанную молекулу сначала отжигают для облегчения образования шпильки перед лигированием свободных 5'- и 3'-концов. В некоторых аспектах нежелательный двухцепочечный остов ДНК-конструкта расщепляют одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, специфичными для уникального сайта расщепления в остове, в результате чего он деградирует и легче удаляется во время очистки. В некоторых аспектах, вышеупомянутый способ может дополнительно включать стадию нагревания или плавления вырезанной молекулы дцДНК с образованием одноцепочечных полинуклеотидов перед стадией лигирования. В некоторых аспектах два сайта эндонуклеаз рестрикции являются идентичными по последовательностям. В некоторых аспектах два сайта эндонуклеазы рестрикции могут быть расщеплены для получения тупых концов.

(ii) Синтетический способ получения из одноцепочечной молекулы (вариант 1)

[00137] Другой пример способа получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектора, с использованием синтетического способа производства, как описано в данном документе, использует одноцепочечную линейную с замкнутыми концами, и содержит два ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, сначала ориентированный в смысловом направлении, а затем - в антисмысловом. Соответственно, в некоторых вариантах реализации способ включает: а) синтез одноцепочечной молекулы, содержащей, в направлении от 5' к 3': первый смысловой ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; второй антисмысловой ITR; антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и первый антисмысловой ITR; b) облегчение образования по меньшей мере одной петли шпильки в одноцепочечной молекуле; и c) лигирование 5'- и 3'-концов с образованием зкДНК-вектора. В данной области техники известны различные способы синтеза олигонуклеотидов и полинуклеотидов, например, синтез олигонуклеотидов in vitro или in silico, и на стадии а) можно использовать любой способ, известный в данной области. Термины «смысловой» и «антисмысловой» в вышеописанном способе относятся к ориентации структурного элемента полинуклеотида. Смысловой и антисмысловой варианты элемента являются обратно комплементарными друг к другу. Последовательность петли шпильки может быть любой нуклеотидной последовательностью, предпочтительно такой, которая не будет гибридизоваться с образованием дцДНК по всей ее длине. Способы лигирования ДНК с образованием линейных двухцепочечных структур известны в данной области, в неограничивающих примерах используются вирусные белки, например, белки Rep, или фаговый, или оспы (pox), или химическое лигирование.

[00138] В этом варианте реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор, получают посредством обеспечения одноцепочечной линейной последовательности ДНК, кодирующей экспрессионную кассету, фланкируемую смысловым и антисмысловым ITR, которые затем замыкают путем лигирования. При использовании получения зкДНК-вектора в качестве примера продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами, одноцепочечная молекула ДНК для продуцирования зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR.

[00139] В этом иллюстративном способе олигонуклеотиды лигируют в указанном выше порядке, и первый антисмысловой ITR комплементарен первому смысловому ITR и, аналогично, второй антисмысловой ITR и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты являются комплементарными по отношению ко второму смысловому ITR и смысловой последовательности экспрессионной кассеты, соответственно. Стадия лигирования соединяет свободные 5'- и 3'-концы и приводит к образованию ДНК-вектора с замкнутыми концами, т.е. зкДНК.

[00140] Во всех аспектах синтетических способов продуцирования для получения ДНК-векторов с замкнутыми концами, как описано в данном документе, стадия лигирования может быть стадией химического лигирования или стадией ферментативного лигирования. В некоторых вариантах реализации лигирование можно проводить с использованием компетентного для лигирования фермента, например, ДНК-лигазы, например, для лигирования липких 5'- и 3'-концов (выступов) или тупых концов. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой фермент лигазы, отличный от белка Rep. В некоторых вариантах реализации изобретения лигирующий фермент представляет собой белок Rep ААВ.

(iii) Синтетическое продуцирование с использованием олигонуклеотидов 5'- и 3'-ITR

[00141] Другой аспект включает: а) синтез (и/или обеспечение) первой одноцепочечной молекулы ITR, содержащей первый ITR; б) синтез (и/или обеспечение) второй одноцепочечной молекулы ITR, содержащей второй ITR; c) обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и d) лигирование 5'- и 3'-концов первой молекулы ITR с первым концом двухцепочечной молекулы и лигирование 5'- и 3'-концов второй молекулы ITR со вторым концом двухцепочечной молекулы с образованием ДНК-вектора. До стадии лигирования молекулы ITR и/или двухцепочечный полинуклеотид могут быть введены в контакт с рестрикционными ферментами для генерирования совместимых концов, например, выступов, для обеспечения надлежащего лигирования в желаемых положениях. В некоторых вариантах реализации, указанные три элемента снабжены тупыми концами. Лигирование каждого ITR с двухцепочечным полинуклеотидом может проводиться последовательно или одновременно. В одном варианте реализации стадия лигирования включает лигирование одноцепочечного 5'-3'-олигонуклеотида, который образует шпильку.

[00142] В таком варианте реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор, получают путем синтеза олигонуклеотидов 5'- и 3'-ITR, которые, в некоторых вариантах реализации изобретения, образуют шпильку или другую трехмерную конфигурацию (например, конфигурацию T- или Y-образной структуры Холлидея), и лигирования олигонуклеотидов 5'- и 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету или последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты. Необязательно, добавляют стадию, на которой олигонуклеотид(ы) подвергают воздействию условий, облегчающих укладку олигонуклеотида в трехмерную конфигурацию перед стадией лигирования. На Фиг. 11B продемонстрирован пример способа получения зкДНК-вектора, включающего лигирование олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды 5'- и 3'-ITR представляют собой олигонуклеотиды 5'- и 3'-шпильки или имеют другую трехмерную конфигурацию (например, структуру Холлидея) и, необязательно, могут быть обеспечены путем синтеза ДНК in vitro. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды 5'- и 3'-ITR расщепляются эндонуклеазой рестрикции, чтобы они имели липкие концы, комплементарные к соответствующим липким концам эндонуклеазы рестрикции двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации концы шпильки олигонуклеотида 5'-ITR имеют липкий конец, комплементарный 5'-смысловой цепи и 3'-антисмысловой цепи двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации конец шпильки олигонуклеотида 3'-ITR имеет липкий конец, комплементарный 3'-смысловой цепи и 5'-антисмысловой цепи двухцепочечного полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации концы шпильки олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR имеют разные липкие концы эндонуклеазы рестрикции, что позволяет обеспечить направленное лигирование с двухцепочечным полинуклеотидом. В некоторых вариантах реализации концы одного или обоих олигонуклеотидов ITR не имеют выступов, и такие олигонуклеотид(ы) ITR лигируют с двухцепочечным полинуклеотидом путем соединения тупых концов. Молекулы ITR в вышеописанном способе могут быть синтезированы и/или лигированы любым способом, известным в данной области техники. В данной области техники известны различные способы синтеза олигонуклеотидов и полинуклеотидов, например, твердофазный синтез ДНК, синтез фосфорамидитной ДНК и ПЦР. Молекулы ITR также могут быть вырезаны из конструкта ДНК, содержащего ITR. В данной области техники известны различные способы лигирования нуклеиновых кислот, например, химическое лигирование или лигирование с компетентным для лигирования белком, например, лигазой, Rep ААВ или топоизомеразой.

(iv) Синтетический способ получения, не требующий лигирования

[00143] В некоторых вариантах реализации синтетическое продуцирование ДНК-вектора с замкнутыми концами осуществляется путем синтеза одноцепочечной последовательности, содержащей по меньшей мере один ITR, фланкирующий последовательность экспрессионной кассеты, которая также содержит антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты. В одном неограничивающем примере зкДНК-вектор получают способом, описанным ниже.

[00144] Обеспечивают одноцепочечную последовательность, содержащую, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты.

В одном варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть синтезирована непосредственно любым способом, известным в данной области техники. В другом варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть сконструирована путем соединения с помощью лигирования двух или более олигонуклеотидов, содержащих что-то одно или больше из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты.

[00145] В еще одном варианте реализации одноцепочечная последовательность может быть получена путем вырезания последовательности из двухцепочечного ДНК-конструкта с последующим разделением цепей из вырезанного двухцепочечного фрагмента. Более конкретно, обеспечивается двухцепочечный конструкт ДНК, содержащий, в порядке от 5' к 3', первый сайт рестрикции, первый смысловой ITR, смысловую последовательность экспрессионной кассеты, второй смысловой ITR, антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты и второй сайт рестрикции. Область между двумя сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции вырезают путем расщепления по меньшей мере одной эндонуклеазой рестрикции, распознающей такой сайт (сайты) расщепления. Полученный в результате вырезанный двухцепочечный фрагмент ДНК обрабатывают таким образом, чтобы разделить смысловые и антисмысловые цепи на желаемые фрагменты одноцепочечных последовательностей.

[00146] Одноцепочечную последовательность подвергают стадии отжига, чтобы облегчить формирование одной или нескольких шпилечных петель первым смысловым ITR и/или вторым смысловым ITR, а также комплементарное связывание смысловой последовательности экспрессионной кассеты с антисмысловой последовательностью экспрессионной кассеты. В результате получают замкнутую структуру, для формирования которой не требуется лигирование. Параметры и методики отжига хорошо известны в данной области техники.

[00147] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4, ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.

[00148] ДНК-векторы, полученные способами, представленными в данном документе, предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, при определении анализом расщепления рестриктазой (Фиг. 4С). Полагают, что линейная и непрерывная структура является более устойчивой к воздействию клеточных эндонуклеаз, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Таким образом, векторы линейной и непрерывной структуры являются предпочтительными в некоторых вариантах реализации. Непрерывные линейные одноцепочечные ДНК-векторы с внутримолекулярными дуплексами могут иметь ковалентно связанные терминальные концы без последовательностей, кодирующих капсидные белки ААВ. Такие ДНК-векторы структурно отличаются от плазмид, которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновой кислоты бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации, в то время как такие ДНК-векторы имеют комплементарные цепи и представляют собой одну молекулу ДНК. Предпочтительно, векторы могут быть получены без метилирования ДНК-оснований по прокариотическому типу, в отличие от плазмид.

[00149] На Фиг. 5 продемонстрирован гель, подтверждающий получение зкДНК из множества плазмидных конструктов зкДНК с использованием способа, описанного в примерах. Присутствие зкДНК подтверждается характеристическим паттерном полос в геле, как описано для Фиг. 4C выше в Примерах.

C. Выделение и очистка зкДНК-векторов:

[00150] В данном документе описаны способы получения и выделения зкДНК-вектора, являющегося примером ДНК-вектора с замкнутыми концами. Например, ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами, описанными в данном документе, может быть получен или собран в подходящее время после последней реакции лигирования и может быть оптимизирован для достижения высокого выхода продуцирования зкДНК-векторов. ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-векторы, можно очищать любыми способами очистки ДНК, известными специалистам в данной области. В одном варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде молекул ДНК. Как правило, могут применяться любые известные в данной области способы очистки нуклеиновых кислот, а также коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.

[00151] Альтернативно, очистка может осуществляться путем проведения хроматографического разделения реакционной смеси. В качестве одного неограничивающего примера, процесс может быть осуществлен путем загрузки реакционной смеси на ионообменную колонку (например, SARTOBIND Q®), которая удерживает нуклеиновые кислоты, и затем элюирования (например, с помощью раствора 1,2 М NaCl) и проведения дополнительной хроматографической очистки на колонке для гель-фильтрации (например, 6 Fast Flow GE). Затем выделяют ДНК-вектор, например, зкДНК-вектор, например, путем осаждения.

[00152] Присутствие зкДНК-вектора может быть подтверждено путем расщепления ДНК-вектора, выделенного из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа материала расщепленной и нерасщепленной ДНК с использованием гель-электрофореза для подтверждения наличия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК. Фиг. 4B и Фиг. 4C демонстрируют один вариант реализации для идентификации присутствия зкДНК-векторов с замкнутыми концами, продуцируемых способами по данному изобретению.

[00153] Фиг. 5 международной заявки PCT/US18/49996 демонстрирует гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества конструктов зкДНК-плазмид с использованием способа, описанного в примерах. зкДНК подтверждается характерным паттерном полос в геле, как было описано для Фиг. 4C в примерах.

[00154] В некоторых вариантах реализации ДНК-векторы с замкнутыми концами, продуцируемые синтетическими способами получения, раскрытыми в данном документе, могут быть доставлены в клетку-мишень in vitro или in vivo различными пригодными способами, которые обсуждаются в данном документе. Могут применяться или вводиться инъекцией только выделенные векторы. Векторы могут быть доставлены в клетку без помощи реагента для трансфекции или других физических средств. Альтернативно, векторы могут доставляться с использованием реагента для трансфекции или других физических средств, которые облегчают проникновение ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, полилизин-богатых соединений, аргинин-богатых соединений, фосфата кальция, микровезикул, микроинъекций и т.п.

D. Кольцевые ДНК-векторы, продуцируемые с использованием синтетического способа получения

[00155] В данном документе предусматриваются различные in vitro способы получения молекул ДНК и ДНК-векторов с замкнутыми концами. В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор, как описано в данном документе. В альтернативных вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой, например, гантелеобразный (dumbbell) ДНК-вектор или ДНК-вектор с утолщенными концами (dog-bone) (см., например, WO 2010/0086626, содержание которого включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки).

III. зкДНК-вектор в целом

[00156] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, представляет собой зкДНК-вектор, включая зкДНК-векторы, которые могут экспрессировать трансген. зкДНК-векторы, описанные в данном документе, не имеют ограничений по размеру, что позволяет, например, экспрессировать все компоненты, необходимые для экспрессии трансгена, из одного вектора. зкДНК-вектор предпочтительно является дуплексным, например, самокомплементарным, по меньшей мере, на части молекулы, такой как экспрессионная кассета (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой). зкДНК-вектор имеет ковалентно замкнутые концы и, таким образом, устойчив к экзонуклеазному расщеплению (например, экзонуклеазой I или экзонуклеазой III), например, в течение часа при 37 °С.

[00157] Как правило, зкДНК-вектор, полученный с использованием процесса синтеза, описанного в данном документе, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ITR ААВ. Последовательности ITR выбирают из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (mod-ITR) ААВ (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ITR WT-WT, причем каждый из WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной пары модифицированных ITR, причем каждый из mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию.

[00158] В данном документе предусматриваются способы и композиции, содержащие зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, который может дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, систему доставки на основе липосомных наночастиц. В данном документе раскрыты неограничивающие примеры систем липосомных наночастиц, предусматриваемых для использования. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, содержащей зкДНК и ионизируемый липид. Например, в данный документ включен состав липидных наночастиц, который был изготовлен и нагружен зкДНК-вектором, полученным указанным способом, раскрытый в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г.

[00159] зкДНК-векторы, полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, не имеют ограничений по упаковке, накладываемых ограниченным пространством внутри вирусного капсида. Это позволяет вставлять контрольные элементы, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, большие трансгены, множественные трансгены и т.д.

[00160] На Фиг. 1А-1Е представлены схемы неограничивающих примеров зкДНК-векторов или соответствующей последовательности плазмид зкДНК. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в следующем порядке: первый ITR, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй ITR. Экспрессионная кассета может включать одну или несколько регуляторных последовательностей, которые обеспечивают возможность и/или контролируют экспрессию трансгена, например, в тех случаях, когда экспрессионная кассета может содержать что-то одно или несколько из следующего, в указанном порядке: энхансер/промотор, репортер ORF (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(A) BGH).

[00161] Экспрессионная кассета также может содержать внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и/или элемент 2А. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может действовать в качестве промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторный переключатель, которые описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Регуляторные переключатели», для контроля и регуляции экспрессии трансгена, и может включать, при необходимости, регуляторный переключатель, являющийся «аварийным выключателем», обеспечивающим контролируемую гибель клетки, содержащей зкДНК-вектор.

[00162] Экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотидов, или 50000 нуклеотидов, или любой диапазон значений от примерно 4000 до 10000 нуклеотидов или от 10000 до 50000 нуклеотидов, или более 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 75000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 1000 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 5000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру инкапсидированных векторов ААВ, что позволяет доставлять экспрессионную кассету большого размера для обеспечения эффективного трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор лишен специфического для прокариот метилирования.

[00163] Экспрессионная кассета зкДНК может включать, например, экспрессируемую экзогенную последовательность (например, открытую рамку считывания) или трансген, кодирующие белок, который либо отсутствует, либо неактивен, либо недостаточно активен у субъекта-реципиента, или ген, который кодирует белок, имеющий желаемый биологический или терапевтический эффект. Трансген может кодировать продукт гена, который может выполнять функцию коррекции экспрессии дефектного гена или транскрипта. В принципе, экспрессионная кассета может включать любой ген, кодирующий белок, полипептид или РНК, которые либо редуцированы, либо отсутствуют вследствие мутации, либо которые приносят терапевтическую пользу, когда сверхэкспрессия считается входящей в объем изобретения.

[00164] Экспрессионная кассета может содержать любой трансген, полезный для лечения заболевания или расстройства у субъекта. зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может применяться для доставки и экспрессии у субъекта любого представляющего интерес гена, включая, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи (RNAi), зрелые микроРНК (miR) и т.д.), а также экзогенные гены и нуклеотидные последовательности, включая вирусные последовательности в геноме субъекта, например, последовательности вируса ВИЧ и т.п. Предпочтительно, зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, используется в терапевтических целях (например, для медицинских, диагностических или ветеринарных применений), или иммуногенные полипептиды. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор является пригодным для экспрессии у субъекта любого представляющего интерес гена, который включает один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК (siRNA), РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов или РНК (кодирующих или некодирующих, например, миРНК, короткие шпилечные РНК (shRNA), микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR))), антитела, антигенсвязывающие фрагменты или любую их комбинацию.

[00165] Экспрессионная кассета также может кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир)). Экспрессионные кассеты могут включать экзогенную последовательность, которая кодирует репортерный белок для использования в экспериментальных или диагностических целях, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области.

[00166] Последовательности, представленные в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте зкДНК-вектора, описанного в данном документе, могут быть кодон-оптимизированы для целевой клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках позвоночного животного, представляющего интерес, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ Aptagen Gene Forge® (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных.

[00167] В некоторых вариантах реализации трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой терапевтический ген. В некоторых вариантах реализации терапевтический ген представляет собой антитело или фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, например, нейтрализующее антитело или фрагмент антитела и т.п.

[00168] В частности, терапевтический ген представляет собой один или несколько терапевтических агентов, включая, без ограничений, например, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты для использования в лечении, профилактике и/или ослаблении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, повреждения и/или расстройства. Типичные примеры терапевтических генов описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Способ лечения».

[00169] Существует много структурных особенностей зкДНК-векторов, которые отличаются от векторов экспрессии на основе плазмид. зкДНК-векторы, продуцируемые в данном документе синтетическими способами, могут обладать одним или несколькими из следующих признаков: отсутствие исходной (т.е. не вставленной) бактериальной ДНК, отсутствие прокариотической точки начала репликации, самодостаточность, т.е. они не требуют каких-либо последовательностей, кроме двух ITR, включая сайты связывания Rep и концевого разрешения (RBS и TRS), и экзогенной последовательности между ITR, наличие последовательностей ITR, образующих шпильки, и отсутствие метилирования ДНК бактериального типа или какого-либо другого метилирования, связанного с продуцированием в данном типе клеток, и считающегося аномальным у млекопитающего-хозяина. В общем, предпочтительно, чтобы векторы по данному изобретению не содержали какой-либо прокариотической ДНК, но предусматривается, что некоторое количество прокариотической ДНК может быть вставлено в виде экзогенной последовательности, в качестве неограничивающего примера, в области промотора или энхансера. Другой важной особенностью, отличающей зкДНК-векторы от плазмидных экспрессионных векторов, является то, что зкДНК-векторы представляют собой одноцепочечную линейную ДНК с замкнутыми концами, тогда как плазмиды всегда представляют собой двухцепочечную ДНК.

[00170] зкДНК-векторы, полученные способами синтеза, представленными в данном документе, предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, при определении анализом расщепления рестриктазой (Фиг. 4С). Полагают, что линейная и непрерывная структура является более устойчивой к воздействию клеточных эндонуклеаз, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Таким образом, зкДНК-вектор линейной и непрерывной структуры является предпочтительным вариантом реализации. Непрерывный линейный одноцепочечный зкДНК-вектор с внутримолекулярным дуплексом может иметь ковалентно связанные терминальные концы, без последовательностей, кодирующих капсидные белки ААВ. Эти зкДНК-векторы структурно отличаются от плазмид (включая зкДНК-плазмиды, описанные в данном документе), которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновой кислоты бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с образованием двух молекул нуклеиновой кислоты, в то время как зкДНК-векторы, напротив, хотя и имеют комплементарные цепи, представляют собой одну молекулу ДНК и потому остаются единой молекулой даже в денатурированном состоянии. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть получены без метилирования ДНК-оснований по прокариотическому типу, в отличие от плазмид. Таким образом, зкДНК-векторы и зкДНК-плазмиды различаются как по структуре (в частности, линейной или кольцевой), так и по способам, применяемым для получения и очистки этих различных объектов (см. ниже), а также по их характеру метилирования ДНК, которое происходит по прокариотическому типу в зкДНК-плазмидах и по эукариотическому типу в зкДНК-векторе.

[00171] Существует несколько преимуществ использования зкДНК-вектора, как описано в данном документе, по сравнению с экспрессионными векторами на основе плазмид, такие преимущества включают, без ограничений: 1) плазмиды содержат последовательности бактериальной ДНК и подвергаются специфичному для прокариот метилированию, например, метилированию с образованием 6-метиладенозина и 5-метилцитозина, тогда как бескапсидные последовательности ААВ-вектора имеют эукариотическое происхождение и не подвергаются специфическому для прокариот метилированию; в результате бескапсидные ААВ-векторы с меньшей вероятностью будут индуцировать воспалительные и иммунные реакции по сравнению с плазмидами; 2) если плазмиды требуют наличия гена устойчивости в процессе получения, то зкДНК-векторы его не требуют; 3) если кольцевая плазмида не доставляется в ядро при введении в клетку и требует перегрузки для того, чтобы избежать деградации клеточными нуклеазами, то зкДНК-векторы содержат вирусные цис-элементы, т.е. ITR, которые придают устойчивость к нуклеазам и могут быть сконструированы для обеспечения нацеливания и доставки в ядро. Было выдвинуто предположение, что минимальными определяющими элементами, обязательными для функции ITR, являются Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 64) для ААВ2) плюс вариабельная палиндромная последовательность, обеспечивающая возможность образования шпильки; и 4) зкДНК-векторы не имеют часто наблюдаемой в плазмидах прокариотического происхождения чрезмерной представленности динуклеотидов CpG (цитозин-фосфат-гуанин), которые, по имеющимся данным, связываются с представителем Toll-подобного семейства рецепторов, вызывая опосредованный T-клетками иммунный ответ. Напротив, трансдукция бескапсидными ААВ-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами ААВ, с применением различных реагентов для доставки.

IV. ITR

[00172] Как раскрыто в данном документе, зкДНК-векторы содержат трансген или последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), причем последовательности ITR могут быть асимметричной парой ITR или симметричной или по существу симметричной парой ITR, как эти термины определены в данном документе. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может содержать последовательности ITR, которые выбраны из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (mod-ITR) ААВ (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ITR WT-WT, в которой каждый WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной модифицированной пары ITR, в которой каждый mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, при этом способы по данному изобретению могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, система доставки на основе липосомных наночастиц.

[00173] В некоторых вариантах реализации последовательность ITR может быть взята из вирусов семейства Parvoviridae, которое включает в себя два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют насекомых. Подсемейство Parvovirinae (называемое парвовирусами) включает в себя род Dependovirus, представители которого для продуктивной инфекции, в большинстве случаев, нуждаются в коинфекции хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса. Род Dependovirus включает аденоассоциированный вирус (ААВ), обычно инфицирующий человека (например, серотипы 2, 3A, 3B, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, вирусы, связанные с аденоассоциированными вирусами крупного рогатого скота, собак, лошадей и овец). Парвовирусы и другие члены семейства Parvoviridae в общем описаны в Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).

[00174] Хотя ITR, приведенные для иллюстрации в описании и примерах в данном документе, представляют собой WT-ITR ААВ2, специалисту в данной области техники понятно, что, как было указано выше, можно использовать ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как ААВ (например, из генома ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), химерные ITR или ITR из любого синтетического ААВ. В некоторых вариантах реализации ААВ может инфицировать теплокровных животных, например, аденоассоциированные вирусы птиц (AAAV), крупного рогатого скота (BAAV), собак, лошадей и овец. В некоторых вариантах реализации ITR происходит от парвовируса B19 (GenBank, № доступа NC 000883), минутного вируса мышей (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); парвовируса гусей (GenBank, № доступа NC 001701); парвовируса змей 1 (GenBank, № доступа NC 006148). В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR может принадлежать к одному серотипу, а 3' WT-ITR - к другому серотипу, как описано в данном документе.

[00175] Рядовому специалисту в данной области техники известно, что последовательности ITR содержат, в качестве общего структурного элемента, двуцепочечную структуру Холлидея, которая, как правило, представляет собой T-образную или Y-образную шпильку (см., например, Фиг. 2A и Фиг. 3A), при этом каждый WT-ITR образован двумя палиндромными плечами или петлями (B-B' и C-C'), встроенными в палиндромное плечо большего размера (A-A'), и одноцепочечной последовательностью D (где порядок указанных палиндромных последовательностей определяет направление ориентации ITR в одну или другую сторону (flip or flop)). См., например, описание структурного анализа и сравнения последовательностей ITR из разных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6) в Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. Специалист в данной области техники может легко определить последовательности WT-ITR из любого серотипа ААВ для использования в зкДНК-векторе или в зкДНК-плазмиде, на основании приведенных в данном документе примеров последовательностей ITR ААВ2. См., например, сравнение последовательностей ITR из различных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6 и ААВ птиц (AAAV) и ААВ крупного рогатого скота (BAAV)), описанное в Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; где приведен % идентичности левого ITR ААВ2 с левым ITR из других серотипов: ААВ-1 (84%), ААВ-3 (86%), ААВ-4 (79%), ААВ-5 (58%) ААВ-6 (левый ITR) (100%) и ААВ-6 (правый ITR) (82%).

[00176] А. Симметричные пары ITR

[00177] Как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ITR ААВ, причем первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) являются симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, т.е. зкДНК-вектор может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имела одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве. В таком варианте реализации симметричная пара ITR или по существу симметричная пара ITR могут быть модифицированными ITR (например, mod-ITR), которые не являются ITR дикого типа. Пара mod-ITR может иметь одинаковые последовательности, которые содержат одну или несколько модификаций по сравнению с ITR дикого типа, и являются обратно комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации пара модифицированных ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму.

[00178] (i) ITR дикого типа

[00179] В некоторых вариантах реализации симметричные ITR или по существу симметричные ITR относятся к дикому типу (WT-ITR), как описано в данном документе. То есть, оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не должны обязательно быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00180] Соответственно, как описано в данном документе, зкДНК-векторы содержат трансген или гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя фланкирующими последовательностями инвертированного концевого повтора дикого типа (WT-ITR), которые являются либо обратно комплементарными (инвертированными) относительно друг друга, либо, альтернативно, являются по существу симметричными друг относительно друга - т.е. пара WT-ITR имеет симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации последовательность ITR дикого типа (например, WT-ITR ААВ) содержит функциональный сайт связывания Rep (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62).

[00181] В одном аспекте зкДНК-векторы можно получить из векторного полинуклеотида, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR) (например, WT-ITR ААВ). То есть, оба ITR имеют последовательности дикого типа, но не должны обязательно быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR относится к одному серотипу ААВ, а 3' WT-ITR относится к тому же или другому серотипу ААВ. В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR и 3'WT-ITR являются зеркальными отображениями друг друга, т.е. они симметричны. В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR и 3' WT-ITR относятся к одному и тому же серотипу ААВ.

[00182] WT-ITR хорошо известны. В одном варианте реализации два ITR относятся к одному и тому же серотипу ААВ2. В некоторых вариантах реализации можно использовать последовательности дикого типа (WT) из других серотипов. Существует ряд серотипов, которые являются гомологичными, например, ААВ2, ААВ4, ААВ6, ААВ8. В одном варианте реализации могут использоваться близко гомологичные ITR (например, ITR с аналогичной структурой петли). В другом варианте реализации можно использовать ITR WT ААВ с большей степенью различий, например, ААВ2 и ААВ5, и еще в одном варианте реализации можно использовать ITR, который по существу относится к WT, т.е. имеет базовую структуру петли, характерную для WT, но содержит некоторые консервативные изменения нуклеотидов, которые не изменяют или не влияют на свойства. При использовании WT-ITR из одного и того же вирусного серотипа может быть дополнительно использована одна или несколько регуляторных последовательностей. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность представляет собой регуляторный переключатель, который позволяет модулировать активность зкДНК.

[00183] В некоторых вариантах реализации один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к синтетически продуцируемому зкДНК-вектору, при этом зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), причем WT-ITR могут принадлежать к одному и тому же серотипу, разным серотипам, или быть по существу симметричными друг относительно друга (т.е. иметь симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или иметь одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве). В некоторых вариантах реализации симметричные WT-ITR содержат функциональный сайт концевого разрешения и сайт связывания Rep. В некоторых вариантах реализации гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген и при этом вектор не заключен в вирусный капсид.

[00184] В некоторых вариантах реализации WT-ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг относительно друга. Например, последовательности AACG в 5'-ITR может соответствовать CGTT (т.е. обратный комплемент) в соответствующем сайте 3'-ITR. В одном примере смысловая цепь 5'-WT-ITR содержит последовательность ATCGATCG, а соответствующая смысловая цепь 3'-WT-ITR содержит CGATCGAT (т.е. обратный комплемент ATCGATCG). В некоторых вариантах реализации зкДНК, WT-ITR дополнительно содержит сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, сайт связывания Rep.

[00185] Типичные последовательности WT-ITR для использования в зкДНК-векторах, содержащих WT-ITR, приведены в Таблице 2, где представлены пары WT-ITR (5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR).

[00186] В качестве типичного примера, данное изобретение предусматривает синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, содержащий промотор, функционально связанный с трансгеном (например, гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты), с регуляторным переключателем или без него, при этом зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. Фиг. 1F-1G), которая кодирует WT-ITR, причем каждый WT-ITR имеет одинаковое количество пар оснований внутримолекулярных дуплексов в своей вторичной конфигурации шпильки (предпочтительно, исключая делецию любой концевой петли AAA или TTT в этой конфигурации по сравнению с такими референсными последовательностями), и (b) идентифицируется как зкДНК с использованием анализа идентификации зкДНК с помощью электрофореза на агарозном геле в нативном геле и денатурирующих условиях в Примере 1.

[00187] В некоторых вариантах реализации фланкирующие WT-ITR по существу симметричны друг другу. В этом варианте реализации 5' WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а 3' WT-ITR - к другому серотипу ААВ, так что WT-ITR не являются идентичными обратными комплементами. Например, 5' WT-ITR может принадлежать к ААВ2, а 3' WT-ITR - к другому серотипу (например, ААВ1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12). В некоторых вариантах реализации WT-ITR могут быть выбраны из двух разных парвовирусов, выбранных из любых из: ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змеи (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собак, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, парвовируса свиней или ААВ насекомых. В некоторых вариантах реализации такая комбинация WT-ITR является комбинацией WT-ITR из ААВ2 и ААВ6. В одном варианте реализации, WT-ITR являются по существу симметричными, когда один из них является инвертированным относительно другого ITR, идентичного на по меньшей мере 90%, идентичного на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96% ... 97% ... 98% ... 99% ... 99,5%, включая все промежуточные значения, и имеет такую же симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, поскольку они имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, например, имеют одинаковую трехмерную организацию A, C-C', B-B' и D-плеч. В одном варианте реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертирована друг относительно друга и идентична на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96% ... 97% ... 98% ... 99% ... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5´-GCGCGCTCGCTCGCTC-3´ (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs). В некоторых вариантах реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертированы относительно друг друга и являются по меньшей мере на 95% идентичными, по меньшей мере на 96% ... 97% ... 98% ... 99% ... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5´-GCGCGCTCGCTCGCTC-3´ (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs), и в дополнение к вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей формировать вторичную структуру шпильки. Гомология может быть определена стандартными средствами, хорошо известными в данной области техники, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)), BLASTN, при настройках по умолчанию.

[00188] В некоторых вариантах реализации структурным элементом ITR может быть любой структурный элемент, который участвует в функциональном взаимодействии ITR с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). В некоторых вариантах реализации указанный структурный элемент обеспечивает селективность взаимодействия ITR с большим белком Rep, т.е. определяет, по меньшей мере, частично, какой белок Rep функционально взаимодействует с ITR. В других вариантах реализации структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ITR. Каждый структурный элемент может быть, например, вторичной структурой ITR, нуклеотидной последовательностью ITR, расстоянием между двумя или более элементами, или комбинацией любых из вышеперечисленных элементов. В одном варианте реализации указанные структурные элементы выбирают из группы, состоящей из плеча A и A’, плеча B и B’, плеча C и C’, плеча D, сайта связывания Rep (RBE) и RBE’ (т.е. последовательности, комплементарной RBE), и сайта концевого разрешения (trs).

[00189] Только в качестве примера, в Таблице 1 представлены примеры комбинаций WT-ITR.

[00190] Таблица 1: Иллюстративные примеры комбинаций WT-ITR одного и того же серотипа, или разных серотипов, или разных парвовирусов. Указанный порядок не является указанием на положение ITR, например, «ААВ1, ААВ2» демонстрирует, что зкДНК может содержать WT-ITR ААВ1 в положении 5' и WT-ITR ААВ2 в положении 3' или, наоборот, WT-ITR ААВ2 в положении 5' и WT-ITR ААВ1 в положении 3'. Сокращения: ААВ серотипа 1 (ААВ1), ААВ серотипа 2 (ААВ2), ААВ серотипа 3 (ААВ3), ААВ серотипа 4 (ААВ4), ААВ серотипа 5 (ААВ5), ААВ серотипа 6 (ААВ6), ААВ серотипа 7 (ААВ7), ААВ серотипа 8 (ААВ8), ААВ серотипа 9 (ААВ9), ААВ серотипа 10 (ААВ10), ААВ серотипа 11 (ААВ11) или ААВ серотипа 12 (ААВ12); геном ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8 (например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITR теплокровных животных (птичий ААВ (AAAV), ААВ КРС (крупного рогатого скота) (BAAV), ААВ собак, лошадей и овец), ITR из парвовируса B19 (GenBank, № доступа: NC 000883), минутный вирус мышей (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); гуси: парвовирус гусей (GenBank, № доступа: NC 001701); змеи: змеиный парвовирус 1 (GenBank, № доступа: NC 006148).

[00191] Таблица 1

ААВ1, ААВ1 ААВ2, ААВ2 ААВ3, ААВ3 ААВ4, ААВ4 ААВ5, ААВ5 ААВ1, ААВ2 ААВ2, ААВ3 ААВ3, ААВ4 ААВ4, ААВ5 ААВ5, ААВ6 ААВ1, ААВ3 ААВ2, ААВ4 ААВ3, ААВ5 ААВ4, ААВ6 ААВ5, ААВ7 ААВ1, ААВ4 ААВ2, ААВ5 ААВ3, ААВ6 ААВ4, ААВ7 ААВ5, ААВ8 ААВ1, ААВ5 ААВ2, ААВ6 ААВ3, ААВ7 ААВ4, ААВ8 ААВ5, ААВ9 ААВ1, ААВ6 ААВ2, ААВ7 ААВ3, ААВ8 ААВ4, ААВ9 ААВ5, ААВ10 ААВ1, ААВ7 ААВ2, ААВ8 ААВ3, ААВ9 ААВ4, ААВ10 ААВ5, ААВ11 ААВ1, ААВ8 ААВ2, ААВ9 ААВ3, ААВ10 ААВ4, ААВ11 ААВ5, ААВ12 ААВ1, ААВ9 ААВ2, ААВ10 ААВ3, ААВ11 ААВ4, ААВ12 ААВ5, ААВRH8 ААВ1, ААВ10 ААВ2, ААВ11 ААВ3, ААВ12 ААВ4, ААВRH8 ААВ5, ААВRH10 ААВ1, ААВ11 ААВ2, ААВ12 ААВ3, ААВRH8 ААВ4, ААВRH10 ААВ5, ААВ13 ААВ1, ААВ12 ААВ2, ААВRH8 ААВ3, ААВRH10 ААВ4, ААВ13 ААВ5, ААВDJ ААВ1, ААВRH8 ААВ2, ААВRH10 ААВ3, ААВ13 ААВ4, ААВDJ ААВ5, ААВDJ8 ААВ1, ААВRH10 ААВ2, ААВ13 ААВ3, ААВDJ ААВ4, ААВDJ8 ААВ5, ПТИЧИЙ ААВ1, ААВ13 ААВ2, ААВDJ ААВ3, ААВDJ8 ААВ4, ПТИЧИЙ ААВ5, БЫЧИЙ ААВ1, ААВDJ ААВ2, ААВDJ8 ААВ3, ПТИЧИЙ ААВ4, БЫЧИЙ ААВ5, СОБАЧИЙ ААВ1, ААВDJ8 ААВ2, ПТИЧИЙ ААВ3, БЫЧИЙ ААВ4, СОБАЧИЙ ААВ5, ЛОШАДЕЙ ААВ1, ПТИЧИЙ ААВ2, БЫЧИЙ ААВ3, СОБАЧИЙ ААВ4, ЛОШАДЕЙ ААВ5, КОЗИЙ ААВ1, БЫЧИЙ ААВ2, СОБАЧИЙ ААВ3, ЛОШАДЕЙ ААВ4, КОЗИЙ ААВ5, КРЕВЕТОК ААВ1, СОБАЧИЙ ААВ2, ЛОШАДЕЙ ААВ3, КОЗИЙ ААВ4, КРЕВЕТОК ААВ5, СВИНЕЙ ААВ1, ЛОШАДЕЙ ААВ2, КОЗИЙ ААВ3, КРЕВЕТОК ААВ4, СВИНЕЙ ААВ5, НАСЕКОМЫХ ААВ1, КОЗИЙ ААВ2, КРЕВЕТОК ААВ3, СВИНЕЙ ААВ4, НАСЕКОМЫХ ААВ5, ОВЕЦ ААВ1, КРЕВЕТОК ААВ2, СВИНЕЙ ААВ3, НАСЕКОМЫХ ААВ4, ОВЕЦ ААВ5, B19 ААВ1, СВИНЕЙ ААВ2, НАСЕКОМЫХ ААВ3, ОВЕЦ ААВ4, B19 ААВ5, MVM ААВ1, НАСЕКОМЫХ ААВ2, ОВЕЦ ААВ3, B19 ААВ4, MVM ААВ5, ГУСЕЙ ААВ1, ОВЕЦ ААВ2, B19 ААВ3, MVM ААВ4, ГУСЕЙ ААВ5, ЗМЕЙ ААВ1, B19 ААВ2, MVM ААВ3, ГУСЕЙ ААВ4, ЗМЕЙ   ААВ1, MVM ААВ2, ГУСЕЙ ААВ3, ЗМЕЙ     ААВ1, ГУСЕЙ ААВ2, ЗМЕЙ       ААВ1, ЗМЕЙ         ААВ6, ААВ6 ААВ7, ААВ7 ААВ8, ААВ8 ААВ9, ААВ9 ААВ10, ААВ10 ААВ6, ААВ7 ААВ7, ААВ8 ААВ8, ААВ9 ААВ9, ААВ10 ААВ10, ААВ11 ААВ6, ААВ8 ААВ7, ААВ9 ААВ8, ААВ10 ААВ9, ААВ11 ААВ10, ААВ12 ААВ6, ААВ9 ААВ7, ААВ10 ААВ8, ААВ11 ААВ9, ААВ12 ААВ10, ААВRH8 ААВ6, ААВ10 ААВ7, ААВ11 ААВ8, ААВ12 ААВ9, ААВRH8 ААВ10, ААВRH10 ААВ6, ААВ11 ААВ7, ААВ12 ААВ8, ААВRH8 ААВ9, ААВRH10 ААВ10, ААВ13 ААВ6, ААВ12 ААВ7, ААВRH8 ААВ8, ААВRH10 ААВ9, ААВ13 ААВ10, ААВDJ ААВ6, ААВRH8 ААВ7, ААВRH10 ААВ8, ААВ13 ААВ9, ААВDJ ААВ10, ААВDJ8 ААВ6, ААВRH10 ААВ7, ААВ13 ААВ8, ААВDJ ААВ9, ААВDJ8 ААВ10, ПТИЧИЙ ААВ6, ААВ13 ААВ7, ААВDJ ААВ8, ААВDJ8 ААВ9, ПТИЧИЙ ААВ10, БЫЧИЙ ААВ6, ААВDJ ААВ7, ААВDJ8 ААВ8, ПТИЧИЙ ААВ9, БЫЧИЙ ААВ10, СОБАЧИЙ ААВ6, ААВDJ8 ААВ7, ПТИЧИЙ ААВ8, БЫЧИЙ ААВ9, СОБАЧИЙ ААВ10, ЛОШАДЕЙ ААВ6, ПТИЧИЙ ААВ7, БЫЧИЙ ААВ8, СОБАЧИЙ ААВ9, ЛОШАДЕЙ ААВ10, КОЗИЙ ААВ6, БЫЧИЙ ААВ7, СОБАЧИЙ ААВ8, ЛОШАДЕЙ ААВ9, КОЗИЙ ААВ10, КРЕВЕТОК ААВ6, СОБАЧИЙ ААВ7, ЛОШАДЕЙ ААВ8, КОЗИЙ ААВ9, КРЕВЕТОК ААВ10, СВИНЕЙ ААВ6, ЛОШАДЕЙ ААВ7, КОЗИЙ ААВ8, КРЕВЕТОК ААВ9, СВИНЕЙ ААВ10, НАСЕКОМЫХ ААВ6, КОЗИЙ ААВ7, КРЕВЕТОК ААВ8, СВИНЕЙ ААВ9, НАСЕКОМЫХ ААВ10, ОВЕЦ ААВ6, КРЕВЕТОК ААВ7, СВИНЕЙ ААВ8, НАСЕКОМЫХ ААВ9, ОВЕЦ ААВ10, B19 ААВ6, СВИНЕЙ ААВ7, НАСЕКОМЫХ ААВ8, ОВЕЦ ААВ9, B19 ААВ10, MVM ААВ6, НАСЕКОМЫХ ААВ7, ОВЕЦ ААВ8, B19 ААВ9, MVM ААВ10, ГУСЕЙ ААВ6, ОВЕЦ ААВ7, B19 ААВ8, MVM ААВ9, ГУСЕЙ ААВ10, ЗМЕЙ ААВ6, B19 ААВ7, MVM ААВ8, ГУСЕЙ ААВ9, ЗМЕЙ   ААВ6, MVM ААВ7, ГУСЕЙ ААВ8, ЗМЕЙ     ААВ6, ГУСЕЙ ААВ7, ЗМЕЙ       ААВ6, ЗМЕЙ         ААВ11, ААВ11 ААВ12, ААВ12 ААВRH8, ААВRH8 ААВRH10, ААВRH10 ААВ13, ААВ13 ААВ11, ААВ12 ААВ12, ААВRH8 ААВRH8, ААВRH10 ААВRH10, ААВ13 ААВ13, ААВDJ ААВ11, ААВRH8 ААВ12, ААВRH10 ААВRH8, ААВ13 ААВRH10, ААВDJ ААВ13, ААВDJ8 ААВ11, ААВRH10 ААВ12, ААВ13 ААВRH8, ААВDJ ААВRH10, ААВDJ8 ААВ13, ПТИЧИЙ ААВ11, ААВ13 ААВ12, ААВDJ ААВRH8, ААВDJ8 ААВRH10, ПТИЧИЙ ААВ13, БЫЧИЙ ААВ11, ААВDJ ААВ12, ААВDJ8 ААВRH8, ПТИЧИЙ ААВRH10, БЫЧИЙ ААВ13, СОБАЧИЙ ААВ11, ААВDJ8 ААВ12, ПТИЧИЙ ААВRH8, БЫЧИЙ ААВRH10, СОБАЧИЙ ААВ13, ЛОШАДЕЙ ААВ11, ПТИЧИЙ ААВ12, БЫЧИЙ ААВRH8, СОБАЧИЙ ААВRH10, ЛОШАДЕЙ ААВ13, КОЗИЙ ААВ11, БЫЧИЙ ААВ12, СОБАЧИЙ ААВRH8, ЛОШАДЕЙ ААВRH10, КОЗИЙ ААВ13, КРЕВЕТОК ААВ11, СОБАЧИЙ ААВ12, ЛОШАДЕЙ ААВRH8, КОЗИЙ ААВRH10, КРЕВЕТОК ААВ13, СВИНЕЙ ААВ11, ЛОШАДЕЙ ААВ12, КОЗИЙ ААВRH8, КРЕВЕТОК ААВRH10, СВИНЕЙ ААВ13, НАСЕКОМЫХ ААВ11, КОЗИЙ ААВ12, КРЕВЕТОК ААВRH8, СВИНЕЙ ААВRH10, НАСЕКОМЫХ ААВ13, ОВЕЦ ААВ11, КРЕВЕТОК ААВ12, СВИНЕЙ ААВRH8, НАСЕКОМЫХ ААВRH10, ОВЕЦ ААВ13, B19 ААВ11, СВИНЕЙ ААВ12, НАСЕКОМЫХ ААВRH8, ОВЕЦ ААВRH10, B19 ААВ13, MVM ААВ11, НАСЕКОМЫХ ААВ12, ОВЕЦ ААВRH8, B19 ААВRH10, MVM ААВ13, ГУСЕЙ ААВ11, ОВЕЦ ААВ12, B19 ААВRH8, MVM ААВRH10, ГУСЕЙ ААВ13, ЗМЕЙ ААВ11, B19 ААВ12, MVM ААВRH8, ГУСЕЙ ААВRH10, ЗМЕЙ   ААВ11, MVM ААВ12, ГУСЕЙ ААВRH8, ЗМЕЙ     ААВ11, ГУСЕЙ ААВ12, ЗМЕЙ       ААВ11, ЗМЕЙ         ААВDJ, ААВDJ ААВDJ8, AVVDJ8 ПТИЧИЙ, ПТИЧИЙ БЫЧИЙ, БЫЧИЙ СОБАЧИЙ, СОБАЧИЙ ААВDJ, ААВDJ8 ААВDJ8, ПТИЧИЙ ПТИЧИЙ, БЫЧИЙ БЫЧИЙ, СОБАЧИЙ СОБАЧИЙ, ЛОШАДЕЙ ААВDJ, ПТИЧИЙ ААВDJ8, БЫЧИЙ ПТИЧИЙ, СОБАЧИЙ БЫЧИЙ, ЛОШАДЕЙ СОБАЧИЙ, КОЗИЙ ААВDJ, БЫЧИЙ ААВDJ8, СОБАЧИЙ ПТИЧИЙ, ЛОШАДЕЙ БЫЧИЙ, КОЗИЙ СОБАЧИЙ, КРЕВЕТОК ААВDJ, СОБАЧИЙ ААВDJ8, ЛОШАДЕЙ ПТИЧИЙ, КОЗИЙ БЫЧИЙ, КРЕВЕТОК СОБАЧИЙ, СВИНЕЙ ААВDJ, ЛОШАДЕЙ ААВDJ8, КОЗИЙ ПТИЧИЙ, КРЕВЕТОК КОРОВ, СВИНЕЙ СОБАЧИЙ, НАСЕКОМЫХ ААВDJ, КОЗИЙ ААВDJ8, КРЕВЕТОК ПТИЧИЙ, СВИНЕЙ БЫЧИЙ, НАСЕКОМЫХ СОБАЧИЙ, ОВЕЦ ААВDJ, КРЕВЕТОК ААВDJ8, СВИНЕЙ ПТИЧИЙ, НАСЕКОМЫХ БЫЧИЙ, ОВЕЦ СОБАЧИЙ, B19 ААВDJ, СВИНЕЙ ААВDJ8, НАСЕКОМЫХ ПТИЧИЙ, ОВЕЦ БЫЧИЙ, B19 СОБАЧИЙ, MVM ААВDJ, НАСЕКОМЫХ ААВDJ8, ОВЕЦ ПТИЧИЙ, B19 БЫЧИЙ, MVM СОБАЧИЙ, ГУСЕЙ ААВDJ, ОВЕЦ ААВDJ8, B19 ПТИЧИЙ, MVM БЫЧИЙ, ГУСЕЙ СОБАЧИЙ, ЗМЕЙ ААВDJ, B19 ААВDJ8, MVM ПТИЧИЙ, ГУСЕЙ БЫЧИЙ, ЗМЕЙ   ААВDJ, MVM ААВDJ8, ГУСЕЙ ПТИЧИЙ, ЗМЕЙ     ААВDJ, ГУСЕЙ ААВDJ8, ЗМЕЙ       ААВDJ, ЗМЕЙ         ЛОШАДЕЙ, ЛОШАДЕЙ КОЗИЙ, КОЗИЙ КРЕВЕТОК, КРЕВЕТОК СВИНЕЙ, СВИНЕЙ НАСЕКОМЫХ, НАСЕКОМЫХ ЛОШАДЕЙ, КОЗИЙ КОЗИЙ, КРЕВЕТОК КРЕВЕТОК, СВИНЕЙ СВИНЕЙ, НАСЕКОМЫХ НАСЕКОМЫХ, ОВЕЦ ЛОШАДЕЙ, КРЕВЕТОК КОЗИЙ, СВИНЕЙ КРЕВЕТОК, НАСЕКОМЫХ СВИНЕЙ, ОВЕЦ НАСЕКОМЫХ, B19 ЛОШАДЕЙ, СВИНЕЙ КОЗИЙ, НАСЕКОМЫХ КРЕВЕТОК, ОВЕЦ СВИНЕЙ, B19 НАСЕКОМЫХ, MVM ЛОШАДЕЙ, НАСЕКОМЫХ КОЗИЙ, ОВЕЦ КРЕВЕТОК, B19 СВИНЕЙ, MVM НАСЕКОМЫХ, ГУСЕЙ ЛОШАДЕЙ, ОВЕЦ КОЗИЙ, B19 КРЕВЕТОК, MVM СВИНЕЙ, ГУСЕЙ НАСЕКОМЫХ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, B19 КОЗИЙ, MVM КРЕВЕТОК, ГУСЕЙ СВИНЕЙ, ЗМЕЙ   ЛОШАДЕЙ, MVM КОЗИЙ, ГУСЕЙ КРЕВЕТОК, ЗМЕЙ     ЛОШАДЕЙ, ГУСЕЙ КОЗИЙ, ЗМЕЙ       ЛОШАДЕЙ, ЗМЕЙ         ОВЕЦ, ОВЕЦ B19, B19 MVM, MVM ГУСЕЙ, ГУСЕЙ ЗМЕЙ, ЗМЕЙ ОВЕЦ, B19 B19, MVM MVM, ГУСЕЙ ГУСЕЙ, ЗМЕЙ   ОВЕЦ, MVM B19, ГУСЕЙ MVM, ЗМЕЙ     ОВЕЦ, ГУСЕЙ B19, ЗМЕЙ       ОВЕЦ, ЗМЕЙ        

[00192] Только в качестве примера, в Таблице 2 приведены последовательности типичных WT-ITR из некоторых разных серотипов ААВ.

[00193] ТАБЛИЦА 2

[00194] В некоторых вариантах реализации нуклеотидная последовательность WT-ITR может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений в указанных пределах), причем модификация представляет собой замену на комплементарный нуклеотид, например, G на C и наоборот, и T на A и наоборот.

[00195] В некоторых вариантах реализации данного изобретения синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не имеет WT-ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любого из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14. В альтернативных вариантах реализации данного изобретения, если зкДНК-вектор имеет WT-ITR, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из любого из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14, то фланкирующий ITR также относится к дикому типу (WT), и зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, например, как описано в данном документе и в международной заявке PCT/US18/49996 (например, см. Таблицу 11 PCT/US18/49996). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и выбранный WT-ITR имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из любого члена группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14.

зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуры WT-ITR, которые сохраняют функциональные части RBE, trs и RBE'. Фиг. 2А и Фиг. 2B демонстрируют, с использованием для иллюстрации ITR дикого типа, один из возможных механизмов функционирования сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей WT-ITR, которые содержат сайт связывания Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один WT-ITR является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, когда зкДНК-вектор содержит два WT-ITR, являющиеся по существу симметричными друг другу, по меньшей мере один WT-ITR является функциональным, и по меньшей мере один WT-ITR является нефункциональным.

[00196] B. Модифицированные ITR (mod-ITR) в целом для зкДНК-векторов, содержащих асимметричные пары ITR или симметричные пары ITR

[00197] Как описано в данном документе, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может содержать симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR. В обоих случаях один или оба из ITR могут быть модифицированными ITR - различие заключается в том, что в первом случае (т.е. симметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют одинаковые конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч), тогда как во втором случае (т.е. асимметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют разную трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют разные конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч).

[00198] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR представляет собой ITR, который модифицируют путем делеции, вставки и/или замещения по сравнению с последовательностью ITR дикого типа (например, ITR ААВ). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ITR в зкДНК-векторе содержит функциональный сайт связывания Rep (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62). В одном варианте реализации, по меньшей мере, один из ITR является нефункциональным ITR. В одном варианте реализации каждый из разных или модифицированных ITR не представляет собой ITR дикого типа из разных серотипов.

[00199] Конкретные изменения и мутации в ITR подробно описаны в данном документе, но в контексте ITR, «измененных» или «мутированных» или «модифицированных», это указывает на то, что нуклеотиды были вставлены, делетированы и/или замещены относительно дикого типа, референсной или исходной последовательности ITR. Измененный или мутированный ITR может быть рекомбинантным (engineered) ITR. Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к аспекту проведения манипуляций человеком. Например, полипептид считается «рекомбинантным», когда по меньшей мере один аспект полипептида, например, его последовательность, был подвергнут манипуляциям со стороны человека для создания отличий от аспекта, в котором он существует в природе.

[00200] В некоторых вариантах реализации mod-ITR может быть синтетическим. В одном варианте реализации синтетический ITR основан на последовательностях ITR из более чем одного серотипа ААВ. В другом варианте реализации синтетический ITR не включает последовательности на основе ААВ. В еще одном варианте реализации синтетический ITR сохраняет структуру ITR, описанную выше, хотя содержит лишь некоторые последовательности из ААВ или не содержит их. В некоторых аспектах синтетический ITR может взаимодействовать преимущественно с Rep дикого типа или Rep определенного серотипа или, в некоторых случаях, не будет распознаваться Rep дикого типа и будет распознаваться только мутированным Rep.

[00201] Специалист в данной области может определить соответствующую последовательность в других серотипах известными способами. Например, путем определения того, находится ли изменение в области A, A', B, B', C, C' или D, и определения соответствующей области в другом серотипе. Можно использовать BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) или другие программы выравнивания для определения гомологии с настройками по умолчанию для определения соответствующей последовательности. Изобретение дополнительно предусматривает популяции и множества зкДНК-векторов, содержащих mod-ITR из комбинации различных серотипов ААВ, т.е. один mod-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой mod-ITR может принадлежать к другому серотипу. Не желая быть связанными какой-либо теорией, укажем, что в одном варианте реализации один ITR может быть взят из последовательности ITR ААВ2 или быть на ней основан, а другой ITR зкДНК-вектора может быть взят из или быть основан на любой одной или нескольких последовательностях ITR серотипа 1 ААВ (ААВ1), ААВ серотипа 4 (ААВ4), ААВ серотипа 5 (ААВ5), ААВ серотипа 6 (ААВ6), ААВ серотипа 7 (ААВ7), ААВ серотипа 8 (ААВ8), ААВ серотипа 9 (ААВ9), ААВ серотипа 10 (ААВ10), ААВ серотипа 11 (ААВ11) или ААВ серотипа 12 (ААВ12).

[00202] Любой парвовирусный ITR может быть использован как ITR или в качестве базового ITR для модификации. Предпочтительно, парвовирус представляет собой депендовирус. Более предпочтительно, он представляет собой ААВ. Выбранный серотип может быть основан на тканевом тропизме серотипа. ААВ2 обладает широким тканевым тропизмом, ААВ1 нацелен преимущественно на нейрональные ткани и скелетные мышцы, и ААВ5 нацелен преимущественно на нейрональные ткани, пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы. ААВ6 нацелен преимущественно на скелетные мышцы и легкие. ААВ8 нацелен преимущественно на ткани печени, скелетных мышц, сердца и поджелудочной железы. ААВ9 преимущественно нацелен на ткани печени, скелетных мышц (skeletal) и легких. В одном варианте реализации модифицированный ITR основан на ITR ААВ2.

[00203] Более конкретно, способность структурного элемента функционально взаимодействовать с конкретным большим белком Rep может быть изменена путем модификации структурного элемента. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована по сравнению с последовательностью ITR дикого типа. В одном варианте реализации структурный элемент (например, плечо A, плечо A', плечо B, плечо B', плечо C, плечо C', плечо D, RBE, RBE' и trs) ITR может быть удален и заменен структурным элементом дикого типа из другого парвовируса. Например, заменяющая структура может быть взята из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крыпного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадиных, парвовируса креветок, свиного парвовируса или ААВ насекомых. Например, ITR может представлять собой ITR ААВ2, и плечо A или A’, или RBE могут быть заменены структурным элементом из ААВ5. В другом примере ITR может представлять собой ITR ААВ5, а плечи C или C’, RBE и trs могут быть заменены на структурный элемент из ААВ2. В другом примере ITR ААВ может представлять собой ITR ААВ5, в котором плечи B и B’ заменены плечами B и B’ ITR ААВ2.

[00204] Только в качестве примера, в Таблице 3 приведены примеры модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в областях модифицированных ITR, где X указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, инсерцию и/или замену) в указанном отделе относительно соответствующего ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) в любой из областей C и/или C’ и/или B и/или B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е., TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. Например, если модификация приводит к чему-либо из: ITR с одним плечом (например, с единственным плечом C-C’ или единственным плечом B-B’), или с модифицированным плечом C-B’ или плечом C’-B, или ITR с двумя плечами, содержащий по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо C-C’ и/или усеченное плечо B-B’), по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плечей ITR с двумя плечами (причем одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида T (т.е., TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации усеченное плечо C-C’ и/или усеченное плечо B-B’ содержит три последовательных нуклеотида T (т.е., TTT) в концевой петле.

[00205] Таблица 3: Примеры комбинаций модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в разных областях B-B’ и C-C’ или плечах ITR (X указывает на модификацию нуклеотида, например, добавление, делецию или замену по меньшей мере одного нуклеотида в области).

Область B Область B' Область С Область C' X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

[00206] В некоторых вариантах реализации mod-ITR для использования в синтетически продуцируемом зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, как описано в данном документе, может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: между A' и C, между C и C', между C' и B, между B и B', и между B' и A. В некоторых вариантах реализации, при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, вставке и/или замене) в областях C или C' или B или B', все равно сохраняется концевая петля структуры стебель-петля. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е., TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В альтернативных вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида A (т.е., AAA) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: A', A и/или D. Например, в некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А и/или A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области D.

[00207] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений), для получения модифицированного структурного элемента. Примеры конкретных модификаций ITR согласно одному варианту реализации приведены в данном документе (например, SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187 или представлены на Фиг. 7A-7B PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г. (например, SEQ ID NO: 97-98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54 в PCT/US2018/064242). В некоторых вариантах реализации ITR может быть модифицирован (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений). В других вариантах реализации ITR может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичности последовательностей с одним из модифицированных ITR согласно SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или RBE-содержащего отдела плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' согласно SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или приведенных в Таблицах 2-9 (т.е. SEQ ID NO: 110-112, 115-190, 200-468) международной заявки PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00208] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может, например, содержать удаление или делецию всего конкретного плеча, например, всего или части плеча A-A', или всего или части плеча B-B', или всего или части плеча C-C' или, альтернативно, удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований, образующих стебель петли, при условии сохранения присутствия кэпирующей петли на конце стебля (например, одного плеча) (например, см. ITR-21 на Фиг. 7A PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' (см., например, ITR-1 на Фиг. 3B или ITR-45 на Фиг. 7А PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' и удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. Предусматривается любая комбинация удаления пар оснований, например, могут быть удалены 6 пар оснований в плече C-C' и 2 пары оснований в плече B-B'. В качестве иллюстративного примера на Фиг. 3B продемонстрирован пример модифицированного ITR с делецией по меньшей мере 7 пар оснований из каждого из участка C и участка C', заменой нуклеотида в петле в области между C и C', и делецией по меньшей мере одной пары оснований из каждой из области B и областей B', так чтобы модифицированный ITR содержал два плеча, из которых по меньшей мере одно (например, C-C') является усеченным. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR также содержит по меньшей мере одну делецию пары оснований из каждой из области B и областей B', так чтобы плечо B-B' также было усеченным по сравнению с ITR дикого типа.

[00209] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 50 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 30 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR WT. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR имеет от 2 до 20 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа.

[00210] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR не содержит каких-либо нуклеотидных делеций в RBE-содержащей части областей A или A', чтобы не мешать репликации ДНК (например, связыванию с RBE белка Rep или никированию в сайте концевого разрешения). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR, пригодный для использования по данному изобретению, имеет одну или несколько делеций в области B, B', C и/или C, как описано в данном документе.

[00211] В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, содержащий симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR, содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и по меньшей мере один модифицированный ITR, выбранный с нуклеотидной последовательностью, выбранной из любых членов группы, состоящей из: SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187.

[00212] В другом варианте реализации структура структурного элемента может быть модифицирована. Например, структурный элемент (имеет) изменение высоты стебля и/или количества нуклеотидов в петле. Например, высота стебля может составлять примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов или более, или соответствовать любому диапазону значений. В одном варианте реализации стебель может иметь высоту от примерно 5 нуклеотидов до примерно 9 нуклеотидов и функционально взаимодействует с Rep. В другом варианте реализации стебель может иметь высоту около 7 нуклеотидов и функционально взаимодействует с Rep. В другом примере петля может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00213] В другом варианте реализации количество сайтов связывания GAGY или связанных с GAGY сайтов связывания в пределах RBE или расширенного RBE может быть увеличено или уменьшено. В одном примере RBE или расширенный RBE могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более сайтов связывания GAGY или любой диапазон указанных значений. Каждый сайт связывания GAGY может независимо представлять собой точную последовательность GAGY или последовательность, аналогичную GAGY, при условии, что эта последовательность является достаточной для связывания белка Rep.

[00214] В другом варианте реализации интервал между двумя элементами (такими как, без ограничений, RBE и шпилька) может быть изменен (например, увеличен или уменьшен) для изменения функционального взаимодействия с большим белком Rep. Например, указанный интервал может составлять примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00215] Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуру ITR, которая модифицирована относительно структуры ITR ААВ2 дикого типа, раскрытой в данном документе, но все еще сохраняет функциональную часть RBE, trs и RBE´. На Фиг. 2А и Фиг. 2B продемонстрирован один из возможных механизмов работы сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей ITR, которые содержат сайт связывания Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ITR (дикого типа или модифицированный ITR) является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, в тех случаях, когда зкДНК-вектор содержит два модифицированных ITR, которые отличаются друг от друга или асимметричны друг относительно друга, по меньшей мере один модифицированный ITR является функциональным и по меньшей мере один модифицированный ITR является нефункциональным.

[00216] В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не имеет модифицированного ITR, выбранного из любой последовательности, состоящей из или состоящей по существу из: SEQ ID NO: 500-529, как предусматривается в данном документе. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор не имеет ITR, который выбирают из любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 500-529.

[00217] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR (например, левый или правый ITR) синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, описанного в данном документе, имеет модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере. Примеры последовательностей ITR, имеющих модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере, перечислены в Таблице 2 (т.е. SEQ ID NO: 135-190, 200-233); Таблице 3 (например, SEQ ID NO: 234-263); Таблице 4 (например, SEQ ID NO: 264-293); Таблице 5 (например, SEQ ID NO: 294-318 в данном документе); Таблице 6 (например, SEQ ID NO: 319-468; и таблицах 7-9 (например, SEQ ID NO: 101-110, 111-112, 115-134) или Таблице 10A или 10B (например, SEQ ID NO: 9 100, 469-483, 484-499) международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00218] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования в синтетически продуцируемом зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, выбирают из любых или из комбинации ITR, приведенных в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10A-10B международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00219] Дополнительные примеры модифицированных ITR для использования в синтетически продуцируемом зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR в каждом из вышеуказанных классов, представлены в Таблицах 4A и 4B. Предсказанные вторичные структуры правых модифицированных ITR, указанных в Таблице 4A, представлены на Фиг. 7А международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., и предсказанные вторичные структуры левых модифицированных ITR, указанных в Таблице 4B, представлены на Фиг. 7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме.

[00220] В Таблице 4A и Таблице 4B представлены примеры правых и левых модифицированных ITR.

[00221] Таблица 4А: Примеры правых модифицированных ITR. Эти примеры правых модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

 
Таблица 4А: Примеры правых модифицированных ITR
  Конструкт ITR Последовательность SEQ ID NO: ITR-18 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 15 ITR-19 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 16 ITR-20 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 17 ITR-21 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 18 ITR-22 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 19 ITR-23 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 20 ITR-24 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 21 ITR-25 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 22 ITR-26 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 23 ITR-27 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 24 ITR-28 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 25 ITR-29 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 26 ITR-30 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 27 ITR-31 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 28 ITR-32 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 29 ITR-49 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 30 ITR-50 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 31

[00222] Таблица 4B: Примеры левых модифицированных ITR Эти примеры левых модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и комплемент RBE (RBE') GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

 
Таблица 4B: Примеры левых модифицированных ITR  ITR-33 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 32 ITR-34 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 33 ITR-35 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 34 ITR-36 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 35 ITR-37 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 36 ITR-38 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 37 ITR-39 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 38 ITR-40 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 39 ITR-41 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 40 ITR-42 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 41 ITR-43 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 42 ITR-44 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 43 ITR-45 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 44 ITR-46 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 45 ITR-47 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 46 ITR-48 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 47

[00223] В одном варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ITR ААВ, причем первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) являются асимметричными относительно друг друга, т.е. они имеют разную трехмерную пространственную конфигурацию по сравнению друг с другом. В качестве примера варианта реализации, первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может быть мутированным или модифицированным ITR или, наоборот, первый ITR может быть мутированным или модифицированным ITR, а второй ITR - ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации первый ITR и второй ITR оба представляют собой mod-ITR, но имеют разные последовательности, или имеют разные модификации и, таким образом, не являются одинаковыми модифицированными ITR и имеют разные пространственные 3D-конфигурации. Иными словами, зкДНК-вектор с асимметричными ITR содержит ITR, в которых любые изменения в одном ITR относительно WT-ITR не отображаются в другом ITR; или, альтернативно, в которых асимметричные ITR представляют собой (have) модифицированную асимметричную пару ITR, которые могут иметь разные последовательности и разную трехмерную форму друг относительно друга. Типичные примеры асимметричных ITR в зкДНК-векторе и для использования при получении зкДНК-плазмиды представлены в Таблице 4А и 4В.

[00224] В альтернативном варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор содержит два симметричных mod-ITR, т.е. оба ITR имеют одинаковую последовательность, но являются обратными комплементами (инвертированными формами) друг друга. В некоторых вариантах реализации симметричная пара mod-ITR содержит, по меньшей мере, что-то одно из, или любую комбинацию делеции, вставки или замены относительно последовательности ITR дикого типа из того же серотипа ААВ. Добавления, делеции или замены в симметричных ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг к другу. Например, вставка 3 нуклеотидов в C-область 5'-ITR будет отображена вставкой 3 обратно комплементарных нуклеотидов в соответствующем участке C-области 3'-ITR. Исключительно в целях иллюстрации, если в 5'-ITR добавление представляет собой AACG, то в 3'-ITR добавлением будет CGTT в соответствующем сайте. Например, если смысловая цепь 5'-ITR представляет собой ATCGATCG с добавлением AACG между G и A, то в результате будет получена последовательность ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51). Соответствующая смысловая цепь 3'-ITR представляет собой CGATCGAT (обратный комплемент ATCGATCG) с добавлением CGTT (т.е. обратного комплемента AACG) между T и C, что дает последовательность CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (обратный комплемент ATCGAACGATCG) (SEQ ID NO: 51).

[00225] В альтернативных вариантах реализации, пара модифицированных ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но имеют соответствующую или одинаковую симметричную трехмерную форму. Например, один модифицированный ITR может принадлежать к одному серотипу, а другой модифицированный ITR может принадлежать к другому серотипу, но они имеют одинаковую мутацию (например, вставку, делецию или замену нуклеотида) в одной и той же области. Иными словами, только в иллюстративных целях, если 5' mod-ITR принадлежит к ААВ2 и имеет делецию в области C, а 3' mod-ITR принадлежит к ААВ5 и имеет соответствующую делецию в области C', то при условии, что 5' mod-ITR и 3' mod-ITR имеют одинаковую или симметричную трехмерную пространственную организацию, они будут включены для использования по данному изобретению в качестве пары модифицированных ITR.

[00226] В некоторых вариантах реализации по существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то родственный mod-ITR имеет соответствующее делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру оставшихся петель A и B-B' одинаковой формы в геометрическом пространстве со своим родственным mod-ITR. Только в качестве примера, по существу симметричные ITR могут иметь симметричную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, например, когда пару G-C модифицируют, например, в пару C-G, или наоборот, или пару A-T модифицируют в пару T-A, или наоборот. Таким образом, используя приведенный выше иллюстративный пример модифицированного 5'-ITR в виде ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51), и модифицированного 3'-ITR в виде CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (т.е. обратный комплемент ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51)), эти модифицированные ITR будут оставаться симметричными, если, например, 5'-ITR имеет последовательность ATCGAACCATCG (SEQ ID NO: 50), где G в добавлении модифицируют до C, и по существу симметричный 3'-ITR имеет последовательность CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49), без соответствующей модификации T в добавление к A. В некоторых вариантах реализации такая пара модифицированных ITR является по существу симметричной, поскольку пара модифицированных ITR имеет симметричную стереохимию.

[00227] В Таблице 5 приведены примеры симметричных модифицированных пар ITR (т.е. модифицированный левый ITR и симметричный правый модифицированный ITR). Выделенная жирным шрифтом (красная) часть последовательностей идентифицирует частичные последовательности ITR (т.е. последовательности петель A-A', C-C' и B-B'), также показанные на Фиг. 31A-46B. Эти примеры модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 5: Примеры симметричных модифицированных пар ITR ЛЕВЫЙ модифицированный ITR
(модифицированный 5'-ITR) Симметричный ПРАВЫЙ модифицированный ITR
(модифицированный 3'-ITR) SEQ ID NO: 32 (ITR-33 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 15 (ITR-18, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 33 (ITR-34 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 48 (ITR-51, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 34 (ITR-35 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 16 (ITR-19, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 35 (ITR-36 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 17 (ITR-20, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 36 (ITR-37 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 18 (ITR-21, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 37 (ITR-38 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 19 (ITR-22 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 38 (ITR-39 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 20 (ITR-23, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 39 (ITR-40 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 21 (ITR-24, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 40 (ITR-41 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 22 (ITR-25 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 41 (ITR-42 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 23 (ITR-26 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 42 (ITR-43 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 24 (ITR-27 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 43 (ITR-44 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 25 (ITR-28 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 44 (ITR-45 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 26 (ITR-29, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 45 (ITR-46 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 27 (ITR-30, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 46 (ITR-47, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 28 (ITR-31, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 47 (ITR-48, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 29 (ITR-32 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

[00228] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, содержащий пару асимметричных ITR, может содержать ITR с модификацией, соответствующей любой из модификаций последовательностей ITR или частичных последовательностей ITR, приведенных в любой одной или нескольких из Таблиц 4A-4B в данном документе, или последовательностей, представленных на Фиг. 7A или 7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ, или раскрытой в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10A-10B международной заявки PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

V. Типичные примеры зкДНК-векторов

[00229] Как описано выше, данное изобретение относится к синтетически продуцируемым рекомбинантным экспрессионным зкДНК-векторам и зкДНК-векторам, которые кодируют трансген, содержащий любую из: пары асимметричных ITR, пары симметричных ITR или пары по существу симметричных ITR, как описано выше. В некоторых вариантах реализации раскрытие относится к синтетически продуцируемым рекомбинантным зкДНК-векторам, имеющим фланкирующие последовательности ITR и трансген, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе, и зкДНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту трансгена), расположенную между фланкирующими ITR, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты лишена кодирующих последовательностей белка вирусного капсида.

[00230] Синтетически продуцируемый экспрессионный зкДНК-вектор может представлять собой любой зкДНК-вектор, который может быть удобно подвергнут процедурам рекомбинантных ДНК, включая нуклеотидную последовательность (последовательности), как описано в данном документе, при условии, что по меньшей мере один ITR является измененным. Синтетически продуцируемые зкДНК-векторы по данному изобретению совместимы с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен зкДНК-вектор. В определенных вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы могут быть линейными. В определенных вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы могут существовать в виде внехромосомного объекта. В определенных вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать элемент(ы), которые позволяют интегрировать донорную последовательность в геном клетки-хозяина. Используемые в данном документе термины «трансген» и «гетерологичная нуклеотидная последовательность» являются синонимами.

[00231] На Фиг. 1A-1G продемонстрированы схемы функциональных компонентов двух неограничивающих примеров плазмид, полезных для синтетического продуцирования зкДНК-векторов по данному изобретению. Фиг. 1А, 1В, 1D, 1F изображают конструкты зкДНК-векторов или соответствующих последовательностей зкДНК-плазмид, причем первая и вторая последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессируемая трансгенная кассета включает, при необходимости, энхансер/промотор, одно или несколько гомологичных плеч, донорную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE, например, SEQ ID NO: 67) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(A) BGH, например, SEQ ID NO: 68).

[00232] Фиг. 5 изображает гель, подтверждающий продуцирование зкДНК-вектора, полученного с использованием способа синтеза, описанного в данном документе и в примерах. Получение зкДНК-вектора подтверждается характерной электрофореграммой в геле, как было описано для Фиг. 4В выше и в Примерах.

А. Регуляторные элементы

[00233] зкДНК-векторы, описанные в данном документе, и полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, могут содержать пару асимметричных ITR или пару симметричных ITR, как определено в данном документе, и могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может выступать в роли промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, для регулирования экспрессии трансгена, или "аварийный выключатель", который может убивать клетку, содержащую зкДНК-вектор. Регуляторные элементы, включая регуляторные переключатели, которые можно использовать в данном изобретении, более подробно обсуждаются в международной заявке PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00234] В вариантах реализации, вторая нуклеотидная последовательность включает регуляторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность гена функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность пригодна для контроля экспрессии нуклеазы в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность включает подходящую промоторную последовательность, способную направлять транскрипцию гена, функционально связанного с промоторной последовательностью, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу (нуклеазы) по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность, связанную с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей нуклеазу. В некоторых вариантах реализации предусматривается энхансерная последовательность перед промотором для повышения эффективности промотора. В некоторых вариантах регуляторная последовательность включает энхансер и промотор, причем вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, при этом интрон включает один или несколько сайтов расщепления нуклеазой, и промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.

[00235] зкДНК-векторы, полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов, таких как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67) и поли(А) BGH (SEQ ID NO: 68) , Подходящие экспрессионные кассеты для использования в экспрессионных конструктах не имеют ограничений упаковки, накладываемых вирусным капсидом.

(i). Промоторы:

[00236] Специалисту в данной области будет понятно, что промоторы, используемые в синтетически продуцируемых зкДНК-векторах по изобретению, должны быть адаптированы для соответствия конкретным последовательностям, которые они стимулируют. Например, для направляющей РНК может вообще не потребоваться промотор, поскольку его функция заключается в формировании дуплекса со специфической последовательностью-мишенью на нативной ДНК для осуществления события рекомбинации. Напротив, в случае нуклеазы, кодируемой зкДНК-вектором, промотор будет полезен для ее эффективной экспрессии из вектора - и, необязательно, регулируемым образом.

[00237] Кассеты экспрессии по данному изобретению включают промотор, который может влиять на общие уровни экспрессии, а также на клеточную специфичность. Для экспрессии трансгена они могут включать высокоактивный немедленный ранний промотор вирусного происхождения. Экспрессионные кассеты могут содержать тканеспецифичные эукариотические промоторы для ограничения экспрессии трансгена определенными типами клеток и снижения токсических эффектов и иммунных реакций, возникающих в результате нерегулируемой эктопической экспрессии. В предпочтительных вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать синтетический регуляторный элемент, такой как промотор CAG (SEQ ID NO: 72). Промотор CAG включает (i) элемент раннего энхансера цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы и (iii) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика. Альтернативно, экспрессионная кассета может содержать промотор альфа-1-антитрипсина (AAT) (SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74), печень-специфичный (LP1) промотор (SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76) или промотор человеческого фактора элонгации-1 альфа (EF1a) (например, SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 78). В некоторых вариантах реализации указанная экспрессионная кассета включает один или несколько конститутивных промоторов, например, ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно, с энхансером RSV) или немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно, с энхансером CMV, например, SEQ ID NO: 79). Альтернативно, можно использовать индуцибельный промотор, нативный промотор для трансгена, тканеспецифичный промотор или различные промоторы, известные в данной области.

[00238] Подходящие промоторы, в том числе описанные выше, могут быть получены из вирусов и потому могут называться вирусными промоторами, или они могут быть получены из любого организма, включая прокариотические или эукариотические организмы. Подходящие промоторы могут быть использованы для управления экспрессией любой РНК-полимеразой (например, pol I, pol II, pol III). Типичные промоторы включают, без ограничений, ранний промотор SV40, промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса опухоли молочной железы мыши; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленного раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), малый ядерный промотор U6 человека (U6, например, SEQ ID NO: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усиленный промотор U6 (например, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31 (17)), промотор H1 человека (H1) (например, SEQ ID NO: 81 или SEQ ID NO: 155), промотор CAG, промотор человеческого альфа 1-антитипсина (HAAT) (например, SEQ ID NO: 82) и т.п. В некоторых вариантах реализации эти промоторы изменены на своем нижележащем интронсодержащем конце с включением одного или нескольких сайтов расщепления нуклеазой. В некоторых вариантах реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазой, чужеродна промоторной ДНК.

[00239] В одном варианте реализации используемый промотор является нативным промотором гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности для соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и были охарактеризованы. Используемая область промотора может дополнительно включать одну или несколько дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеров (например, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 83).

[00240] Неограничивающие примеры подходящих промоторов для использования в соответствии с данным изобретением включают, например, промотор CAG (SEQ ID NO: 72), промотор HAAT (SEQ ID NO: 82), промотор человеческого EF1-α (SEQ ID NO: 77) или фрагмент промотора EF1a (SEQ ID NO: 78), промотор IE2 (например, SEQ ID NO: 84) и промотор EF1-α крысы (SEQ ID NO: 85), или фрагмент промотора 1E1 (SEQ ID NO: 125).

(ii). Последовательности полиаденилирования:

[00241] Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в синтетически продуцируемый зкДНК-вектор для стабилизации мРНК, экспрессируемой из зкДНК-вектора, и для содействия в ядерном экспорте и трансляции. В одном варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не включает последовательность полиаденилирования. В других вариантах реализации вектор включает по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность полиаденилирования содержит примерно 43 нуклеотида, примерно 40-50 нуклеотидов, примерно 40-55 нуклеотидов, примерно 45-50 нуклеотидов, примерно 35-50 нуклеотидов, или величины, находящиеся в любом диапазоне между указанными значениями.

[00242] Кассеты экспрессии могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области, или ее вариант, такую как встречающаяся в природе последовательность, выделенная из бычьего BGHpA (например, SEQ ID NO: 68) или вируса SV40pA (например, SEQ ID NO: 86), или синтетическая последовательность (например, SEQ ID NO: 87). Некоторые экспрессионные кассеты могут также включать последовательность вышележащего энхансера (USE) позднего поли(А) сигнала SV40. В некоторых вариантах реализации USE может использоваться в комбинации с SV40pA или гетерологичным поли-A-сигналом.

[00243] Кассеты экспрессии могут также включать посттранскрипционный элемент для увеличения экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации для увеличения экспрессии трансгена используется посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67). Можно использовать другие элементы посттранскрипционного процессинга, такие как посттранскрипционный элемент из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). Секреторные последовательности могут быть связаны с трансгенами, например, последовательности VH-02 и VK-A26, например, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89.

(iii). Последовательности ядерной локализации

[00244] В некоторых вариантах реализации вектор, кодирующий направляемую РНК эндонуклеазу, содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах реализации одна или несколько NLS расположены на амино-конце или рядом с ним, на карбокси-конце или рядом с ним, или в их комбинации (например, одна или несколько NLS на амино-конце и/или одна или несколько NLS на карбокси-конце). В случае присутствия более чем одной NLS, каждая из них может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS будет присутствовать в более чем одной копии и/или в сочетании с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. Неограничивающие примеры NLS приведены в Таблице 6.

[00245] Таблица 6: Сигналы ядерной локализации

ИСТОЧНИК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO. большой Т-антиген вируса SV40 PKKKRKV (кодируется последовательностью CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG; SEQ ID NO: 91) 90 нуклеоплазмин KRPAATKKAGQAKKKK 92 с-Мус PAAKRVKLD 93 RQRRNELKRSP 94 hRNPA1 M9 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY 95 домен IBB импортина-альфа RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV 96 белок Т миомы VSRKRPRP 97 PPKKARED 98 человечесский р53 PQPKKKPL 99 мышиный c-abl IV SALIKKKKKMAP 100 NS1 вируса гриппа DRLRR 117 PKQKKRK 118 антиген вируса гепатита дельта RKLKKKIKKL 119 белок Mx1 мыши REKKKFLKRR 120 человеческая полимераза поли(АДФ-рибозы) KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 121 глюкокортикоид (человеческих) рецепторов стероидных гормонов RKCLQAGMNLEARKTKK 122

E. Дополнительные компоненты зкДНК-векторов

[00246] зкДНК-векторы, полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, могут содержать нуклеотиды, которые кодируют другие компоненты для экспрессии генов. Например, чтобы выбрать специфические события нацеливания на гены, защитная shRNA может быть встроена в микроРНК и вставлена в рекомбинантный зкДНК-вектор, предназначенный для сайт-специфической интеграции в высокоактивный локус, такой как локус альбумина. Такие варианты реализации могут обеспечить систему для селекции in vivo и экспансии генно-модифицированных гепатоцитов на любом генетическом фоне, например, описанную в Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016. зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют отобрать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные или подобные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию к ауксотрофам, NeoR и т.п. В некоторых вариантах реализации в донорные последовательности включены маркеры позитивной селекции, такие как NeoR. Маркеры негативной селекции могут быть включены после донорной последовательности, например, последовательность нуклеиновой кислоты HSV-tk, кодирующая маркер негативной селекции, может быть включена в конструкт нуклеиновой кислоты ниже донорной последовательности.

[00247] В вариантах реализации, зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, можно использовать для редактирования генов, например, как описано в международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки, и может включать что-то одно или несколько из: 5'-гомологичного плеча, 3'-гомологичного плеча, сайта полиаденилирования, расположенного выше и вблизи от 5'-гомологичного плеча. Примеры гомологичных плеч представляют собой 5'- и 3'-гомологичные плечи альбумина (SEQ ID NO: 151 и 152) или 5'- и 3'-гомологичные плечи CCR5 (например, SEQ ID NO: 153, 154).

A. Регуляторные переключатели

[00248] Молекулярный регуляторный переключатель представляет собой переключатель, который генерирует измеримое изменение состояния в ответ на сигнал. Такие регуляторные переключатели могут быть эффективно скомбинированы с зкДНК-векторами, полученными с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, для контроля выхода экспрессии трансгена из зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, который служит для тонкой настройки экспрессии трансгена. Например, он может служить для обеспечения функции биосдерживания зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации переключатель представляет собой двухпозиционный (“ON/OFF”) переключатель, который предназначен для запуска или остановки (т.е. прекращения) экспрессии представляющего интерес гена в зкДНК контролируемым и регулируемым образом. В некоторых вариантах реализации переключатель может включать «аварийный выключатель», который может давать указание клетке, содержащей зкДНК-вектор, переходить к запрограммированной клеточной смерти после активации переключателя. Типичные примеры регуляторных переключателей, предусматриваемых для использования в зкДНК-векторе, могут быть использованы для регуляции экспрессии трансгена и более подробно описаны в международной заявке PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

(i) Бинарные регуляторные переключатели

[00249] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, содержит регуляторный переключатель, который может служить для контролируемой модуляции экспрессии трансгена. Например, экспрессионная кассета, расположенная между ITR зкДНК-вектора, может дополнительно содержать регуляторную область, например, промотор, цис-элемент, репрессор, энхансер и т.д., которая функционально связана с представляющим интерес геном, причем указанная регуляторная область регулируется одним или несколькими кофакторами или экзогенными агентами. Только в качестве примера, регуляторные области можно модулировать с помощью низкомолекулярных переключателей или индуцибельных или репрессируемых промоторов. Неограничивающими примерами индуцибельных промоторов являются индуцируемые гормонами или индуцируемые металлом промоторы. Другие типичные индуцибельные промоторы/энхансерные элементы включают, без ограничений, промотор, индуцируемый RU486, индуцируемый экдизоном промотор, индуцируемый рапамицином промотор и металлотионеиновый промотор.

(ii) Регуляторные переключатели на основе малых молекул

[00250] Различные известные в данной области регуляторные переключатели на основе малых молекул известны в данной области и могут быть объединены с синтетически продуцируемыми зкДНК-векторами, раскрытыми в данном документе, для образования зкДНК-вектора, контролируемого регуляторным переключателем. В некоторых вариантах регуляторный переключатель может быть выбран из чего-либо одного или комбинации следующего: пара ортогональный лиганд/ядерный рецептор, например, вариант ретиноидного рецептора/LG335 и GRQCIMFI, вместе с искусственным промотором, контролирующим экспрессию функционально связанного трансгена, как раскрыто в Taylor et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; рекомбинантные рецепторы стероидов, например, модифицированный рецептор прогестерона с усеченным С-концом, который не может связывать прогестерон, но связывает RU486 (мифепристон) (патент США № 5364791); рецептор экдизона дрозофилы (Drosophila) и его экдистероидные лиганды (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517) или переключатель, контролируемый антибиотиком триметопримом (TMP), как описано в Sando R 3^rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель, предназначенный для контроля трансгена, или экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой переключатель активации пролекарства, такой как раскрытый в патентах США №№ 8771679 и 6339070.

(iii) Регуляторные переключатели с «паролем»

[00251] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель может представлять собой «переключатель с паролем» (passcode switch) или «контур с паролем». Переключатели с паролем позволяют обеспечить тонкую настройку контроля экспрессии трансгена из синтетически продуцируемого зкДНК-вектора при возникновении специфические условия, т.е. комбинации условий, наличие которых необходимо для осуществления экспрессии и/или репрессии трансгена. Например, для осуществления экспрессии трансгена необходимо наличие по меньшей мере условий A и B. Регуляторный переключатель с паролем может контролировать наличие любого числа условий, например, по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 или более условий, необходимых для протекания экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации должны быть выполнены по меньшей мере 2 условия (например, условия A, B), а в некоторых вариантах реализации должны быть выполнены по меньшей мере 3 условия (например, A, B и C, или A, B и D). Только в качестве примера, для осуществления экспрессия гена из зкДНК, содержащей регуляторный переключатель с паролем «ABC», должны присутствовать условия A, B и C. Условия A, B и C могут быть следующими; уссловие A представляет собой наличие состояния или заболевания, условие B представляет собой гормональный ответ, и условие C представляет собой ответ на экспрессию трансгена. Например, если трансген редактирует дефектный ген EPO, то условие A - это наличие хронической болезни почек (CKD), условие B выполняется при наличии у субъекта гипоксических состояний в почках, условие C заключается в нарушении рекрутинга эритропоэтин-продуцирующих клеток (EPC) в почках; или, альтернативно, в нарушении активации HIF-2. После повышения уровней кислорода или достижения требуемого уровня EPO, трансген снова отключается до момента выполнения 3 условий, которые его опять включат.

[00252] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель с паролем или «контур с паролем», предусматриваемый для применения в указанном синтетически продуцируемом зкДНК-векторе, содержит гибридные факторы транскрипции (TF) для расширения диапазона и сложности сигналов окружающей среды, используемых для определения условий биосдерживания. В отличие от блокирующего выключателя, который запускает клеточную смерть при наличии заранее определенного условия, «контур с паролем» позволяет обеспечить выживание клеток или экспрессию трансгена при наличии определенного «пароля», и может быть легко перепрограммирован, чтобы позволять экспрессию трансгена и/или выживание клеток только при наличии заранее заданного условия окружающей среды или пароля.

[00253] Любые и все комбинации регуляторных переключателей, раскрытых в данном документе, например, низкомолекулярные переключатели, переключатели на основе нуклеиновых кислот, гибридные переключатели на основе малых молекул и нуклеиновых кислот, посттранскрипционные регуляторные переключатели трансгенов, посттрансляционная регуляция, контролируемые излучением переключатели, опосредуемые гипоксией переключатели и другие регуляторные переключатели, известные специалистам в данной области техники, раскрытые в данном документе, могут применяться в регуляторном переключателе с паролем, как раскрыто в данном документе. Регуляяторные переключатели, предусматриваемые для применения, также описаны в обзорной статье Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015) и обобщены в Таблице 1 статьи Kis. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для применения в системе с паролем может быть выбран из любых переключателей, приведенных в Таблице 11, или их комбинации.

(iv) Регуляторные переключатели на основе нуклеиновых кислот для контроля экспрессии трансгена

[00254] В некоторых вариантах регуляторный переключатель для контроля трансгена, экспрессируемого синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, основан на механизме контроля на основе нуклеиновой кислоты. Типичные примеры механизмов контроля на основе нуклеиновых кислот известны в данной области и предусматриваются для использования. Например, такие механизмы включают в себя рибопереключатели, такие как раскрытые, например, в US 2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, патенте США 9222093 и заявке на европейский патент EP288071, а также в обзоре Villa JK et al. Microbiol Spectr. 2018 May; 6(3). Также включены чувствительные к метаболитам транскрипционные биосенсоры, такие как раскрытые в WO2018/075486 и WO2017/147585. Другие известные в данной области механизмы, предусмотренные для применения, включают сайленсинг указанного трансгена молекулой миРНК или РНК-интерференции (RNAi) (например, miR, мшРНК). Например, зкДНК-вектор может содержать регуляторный переключатель, кодирующий молекулу РНКи, которая комплементарна трансгену, экспрессируемому зкДНК-вектором. При экспрессии такой РНКи, даже при экспрессии трансгена зкДНК-вектором, происходит его сайленсинг за счет действия комплементарной молекулы РНК-интерференции, а при отсутствии экспрессии РНКи, если указанный трансген экспрессируется зкДНК-вектором, сайленсинг указанного трансгена за счет РНК-интерференции не происходит.

[00255] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой тканеспецифический самоинактивирующийся регуляторный переключатель, например, как раскрыто в US2002/0022018, при этом регуляторный переключатель целенаправленно выключает экспрессию трансгена в сайте, где экспрессия трансгена может, напротив, быть неблагоприятной. В некоторых вариантах указанный регуляторный переключатель представляет собой рекомбиназную обратимую систему генной экспрессии, например, как раскрыто в US2014/0127162 и патенте США 8324436.

(v) Посттранскрипционные и посттрансляционные регуляторные переключатели.

[00256] В некоторых вариантах регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, представляет собой систему посттранскрипционной модификации. Например, таким регуляторным переключателем может быть аптазимовый рибопереключатель, который чувствителен к тетрациклину или теофиллину, как раскрыто в US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, патенте EP 2707487 и Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526–534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858. В некоторых вариантах реализации предусмаатривается, что специалист в данной области техники может кодировать как трансген, так и ингибирующую миРНК, которая содержит чувствительный к лиганду (отрицательный переключатель) аптамер, с получением в итоге лиганд-чувствительного положительного переключателя.

(vi) Другие примеры регуляторных переключателей

[00257] Любой известный регуляторный переключатель может быть использован в синтетически продуцируемом зкДНК-векторе для контроля генной экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, в том числе запускаемый изменениями окружающей среды. Дополнительные примеры включают, без ограничений; метод BOC согласно Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); расширение генетического кода и нефизиологическую аминокислоту; переключатели, контролируемые излучением или управляемые ультразвуком (см., например, Scott S. et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7(13): 1121-5; патенты США 5612318; 5571797; 5770581; 5817636; WO1999/025385A1. В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель управляется имплантируемой системой, например, как раскрыто в патенте США 7840263; US2007/0190028A1, где экспрессия гена контролируется одной или несколькими формами энергии, включая электромагнитную энергию, которая активирует промоторы, функционально связанные с трансгеном в зкДНК-векторе.

[00258] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель, предназначенный для использования в синтетически продуцируемом зкДНК-векторе, представляет собой опосредуемый гипоксией или стресс-активируемый переключатель, например, такой, как описано в WO1999060142A2, патентах США 5834306; 6218179; 6709858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, а также элементы FROG, TOAD и NRSE и условно индуцибельные элементы сайленсинга, в том числе элементы ответа на гипоксию (HRE), элементы воспалительного ответа (IRE) и активируемые сдвиговым напряжением элементы (SSAE), например, как раскрыто в патенте США 9394526. Такой вариант реализации подходит для включения экспрессии указанного трансгена из зкДНК-вектора после ишемии или в ишемических тканях и/или опухолях.

(iv) «Аварийные выключатели»

[00259] Другие варианты реализации изобретения относятся к синтетически продуцируемому вектору зкДНК, содержащему "аварийный выключатель". «Аварийный выключатель», как описано в данном документе, позволяет убить клетку, содержащую зкДНК-вектор, или обеспечить ее переход к запрограммированной гибели в качестве способа окончательного удаления введенного зкДНК-вектора из системы субъекта. Специалисту в данной области будет понятно, что использование аварийных выключателей в синтетически продуцируемых зкДНК-векторах по изобретению, как правило, будет связано с нацеливанием зкДНК-вектора на ограниченное число клеток, потеря которых является приемлемой для субъекта, или на тип клеток, апоптоз которых желателен (например, на раковые клетки). Во всех аспектах, «аварийный выключатель», раскрытый в данном документе, предназначен для обеспечения быстрого и надежного уничтожения клеток, содержащих зкДНК-вектор, в отсутствие входного сигнала выживания или другого специфического условия. Другими словами, "аварийный выключатель", кодируемый зкДНК-вектором, описанным в данном документе, может ограничивать выживаемость клетки, содержащей зкДНК-вектор, окружающей средой, определяемой специфическими входными сигналами. Такие «аварийные выключатели» служат для обеспечения биологической функции биосдерживания, при необходимости удаления синтетически продуцируемого зкДНК-вектора у субъекта, или отсутствия экспрессии кодируемого трансгена.

VI. Фармацевтические композиции

[00260] В другом аспекте предложены фармацевтические композиции. Фармацевтическая композиция содержит ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[00261] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть включен в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Например, ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть включен в фармацевтическую композицию, пригодную для желаемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, позволяющей обеспечить высокую концентрацию синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения состава синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектора, в необходимом количестве, в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием, включая зкДНК-вектор, который может быть приготовлен для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в клетки реципиента, приводящей к терапевтической экспрессии в ней трансгена или донорной последовательности. Композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель.

[00262] Фармацевтически активные композиции, содержащие ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, могут быть составлены для доставки трансгена с различными целями в клетку, например, в клетки субъекта.

[00263] Фармацевтические композиции для терапевтических целей обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, позволяющей обеспечить высокую концентрацию синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения состава синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектора, в необходимом количестве, в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00264] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, как раскрыто в данном документе, может быть включен в фармацевтическую композицию, пригодную для местного, системного, интраамниотического, интратекального, внутричерепного, внутриартериального, внутривенного, внутрилимфатического, внутрибрюшинного, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, внутрисердечного, внутрипеченочного, внутрипочечного, интрацеребрального), интратекального, интравезикального, конъюнктивального (например, экстраорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хориоидального, субхориоидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального, например, перорального, ректального, назального) введения. Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция.

[00265] В некоторых аспектах способы, предусматриваемые в данном документе, включают доставку одного или нескольких ДНК-векторов с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, получаемый с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, в клетку-хозяина. В данном документе также предлагаются клетки, продуцируемые такими способами, и организмы (такие как животные, растения или грибы), содержащие или полученные из таких клеток. Методы доставки нуклеиновых кислот могут включать липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, «голую» ДНК и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №№ 5049386, 4946787; и 4897355), и реагенты для липофекции продаются коммерчески (например, трансфектам (Transfectam™) и липофектин (Lipofectin™)). Доставка может осуществляться в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или в ткани-мишени (например, введение in vivo).

[00266] В данной области техники известны различные методы и способы доставки нуклеиновых кислот в клетки.  Так, например, ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть приготовлен в виде композиций липидных наночастиц (ЛНЧ), липидоидов, липосом, липидных наночастиц, липоплексов или наночастиц типа ядро-оболочка.  Как правило, ЛНЧ состоят из молекул нуклеиновой кислоты (например, зкДНК), одного или нескольких ионизируемых или катионных липидов (или их солей), одного или нескольких неионных или нейтральных липидов (например, фосфолипида), молекулы, которая предотвращает агрегацию (например, ПЭГ или конъюгат ПЭГ-липид) и, необязательно, стерола (например, холестерина).

[00267] Другой способ доставки в клетку ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, заключается в конъюгировании нуклеиновой кислоты с лигандом, который интернализуется клеткой. Например, лиганд может связываться с рецептором на поверхности клетки и интернализуется посредством эндоцитоза. Лиганд может быть ковалентно связан с нуклеотидом в нуклеиновой кислоте. Типичные примеры конъюгатов для доставки нуклеиновых кислот в клетку описаны, например, в WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 и WO2017/177326.

[00268] Нуклеиновые кислоты и ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, также могут быть доставлены в клетку путем трансфекции. Пригодные способы трансфекции включают, без ограничений, опосредованную липидами трансфекцию, опосредованную катионными полимерами трансфекцию или осаждение фосфатом кальция. Реагенты для трансфекции хорошо известны в данной области и включают, без ограничений, реагент для трансфекции TurboFect (Thermo Fisher Scientific), реагент Pro-Ject (Thermo Fisher Scientific), белковый реагент для трансфекции TRANSPASS™ P (New England Biolabs), белковый реагент для доставки CHARIOT™ (Active Motif), белковый реагент для трансфекции PROTEOJUICE™ (EMD Millipore), 293-фектин, липофектамин 2000 (LIPOFECTAMINE™ 2000), липофектамин 3000 (LIPOFECTAMINE™ 3000, Thermo Fisher Scientific), липофектамин (LIPOFECTAMINE™, Thermo Fisher Scientific), липофектин (LIPOFECTIN™, Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Базель, Швейцария), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (трансфектам, Promega, Мэдисон, Висконсин), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), трансфектин (TRANSFECTIN™, BioRad, Геркулес, Калифорния), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Валенсия, Калифорния), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, Сан-Диего, Калифорния), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Лафайет, Колорадо), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, Сент-Луис, Миссури), и ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку методами микрофлюидики, известными специалистам в данной области.

[00269] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, также можно вводить непосредственно в организм для трансдукции клеток in vivo. Введение осуществляется любым путем, обычно используемым для введения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или ткани, включая, без ограничения, инъекцию, инфузию, местное применение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот доступны и хорошо известны специалистам в данной области, и, хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, определенный путь часто может обеспечить более быструю и более эффективную реакцию, чем другой путь.

[00270] Способы введения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть доставлен (can be delivered) в гематопоэтические стволовые клетки, например, способами, описанными, например, в патенте США № 5928638.

[00271] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть добавлен к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды. Типичные липосомы и липосомные составы раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и в международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., например, см. раздел, озаглавленный «Фармацевтические композиции».

[00272] Различные способы доставки, известные в данной области, или их модификации, могут быть использованы для доставки ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, in vitro или in vivo. Например, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы доставляются путем транзиентного проникновения в клеточную мембрану с использованием механической, электрической, ультразвуковой, гидродинамической или лазерной энергии таким образом, чтобы облегчить вхождение ДНК в клетки-мишени. Например, зкДНК-вектор может быть доставлен путем транзиентного нарушения клеточной мембраны в результате сдавливания клетки при прохождении через канал с ограниченным размером, или другими способами, известными в данной области техники. В некоторых случаях отдельно взятый зкДНК-вектор вводят прямой инъекцией «голой» ДНК в кожу, вилочковую железу, сердечную мышцу, скелетную мышцу или клетки печени. В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляется с помощью генной пушки. Сферические частицы золота или вольфрама (диаметром 1–3 мкм), покрытые бескапсидными векторами ААВ, могут быть разогнаны до высокой скорости с помощью сжатого газа для проникновения в клетки ткани-мишени.

[00273] Композиции, содержащие ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель, конкретно предусматриваются данным документом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор состоит из липидной системы доставки, например, липосом, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации такие композиции вводят любым путем, желательным для квалифицированного специалиста. Композиции могут быть введены субъекту различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, путем ингаляции, путем буккального введения, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставный, или их комбинации. Для ветеринарного применения композиция может быть введена в виде достаточно приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринарный врач может легко определить режим дозирования и способ введения, которые наиболее подходят для конкретного животного. Композиции можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или другими физическими методами, такими как электропорация («ЭП»), гидродинамические методы или применение ультразвука.

[00274] В некоторых случаях ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляется с помощью гидродинамической инъекции, которая является простым и высокоэффективным методом прямой внутриклеточной доставки любых водорастворимых соединений и частиц во внутренние органы и скелетные мышцы во всей конечности.

[00275] В некоторых случаях ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляется с помощью ультразвука путем создания наноскопических пор в мембране для облегчения внутриклеточной доставки частиц ДНК в клетки внутренних органов или опухолей, поэтому размер и концентрация ДНК-вектора с замкнутыми концами имеют большое значение для эффективности системы. В некоторых случаях ДНК-векторы с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляются магнитофекцией с использованием магнитных полей для концентрирования частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, в клетках-мишенях.

[00276] В некоторых случаях могут быть использованы химические системы доставки, например, с использованием наномерных комплексов, которые включают компактизацию отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты поликатионными наномерными частицами, принадлежащими катионным липосомам/мицеллам, или катионными полимерами. Катионные липиды, используемые для способа доставки, включают, без ограничений, моновалентные катионные липиды, поливалентные катионные липиды, гуанидинсодержащие соединения, соединения - производные холестерина, катионные полимеры (например, поли(этиленимин), поли-L-лизин, протамин, другие катионные полимеры) и гибрид липид-полимер.

[00277] А. Экзосомы:

[00278] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляется упакованным в экзосому. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы эндоцитарного происхождения, которые высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Их поверхность состоит из липидного бислоя клеточной мембраны из донорской клетки, они содержат цитозоль из клетки, продуцирующей экзосому, и экспонируют на поверхности мембранные белки из родительской клетки. Экзосомы продуцируются различными типами клеток, включая эпителиальные клетки, В- и Т-лимфоциты, тучные клетки (МС), а также дендритные клетки (ДК). Некоторые варианты реализации предусматривают использование экзосом диаметром от 10 нм до 1 мкм, от 20 нм до 500 нм, от 30 нм до 250 нм, от 50 нм до 100 нм. Экзосомы могут быть выделены для доставки в клетки-мишени либо с использованием их донорских клеток, либо путем введения в них специфических нуклеиновых кислот. Для получения экзосом, содержащих бескапсидные векторы ААВ по данному изобретению, могут быть использованы различные подходы, известные в данной области техники.

[00279] B. Микрочастицы/наночастицы:

[00280] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляется липидной наночастицей. Обычно липидные наночастицы содержат ионизируемый аминолипид (например, гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат, DLin-MC3-DMA, фосфатидилхолин (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, DSPC), холестерин и липид оболочки (полиэтиленгликоль-димиристолглицерин, PEG-DMG), например, как описано Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.

[00281] В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет средний диаметр от примерно 10 до примерно 1000 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 10 до примерно 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 25 до примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации препарат липидных наночастиц (например, композиция, содержащая множество липидных наночастиц) имеет распределение по размерам, при котором средний размер (например, диаметр) составляет от примерно 70 нм до примерно 200 нм, и более типично средний размер составляет примерно 100 нм или меньше.

[00282] Различные липидные наночастицы, известные в данной области, могут быть использованы для доставки ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе. Например, различные способы доставки с использованием липидных наночастиц описаны в патентах США №№ 9404127, 9006417 и 9518272.

[00283] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, доставляется с помощью наночастиц золота. Как правило, нуклеиновая кислота может быть ковалентно связана с наночастицей золота или нековалентно связана с наночастицей золота (например, связана посредством заряд-зарядного взаимодействия), например, как описано Ding et al. (2014), Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. В некоторых вариантах реализации конъюгаты наночастиц золота с нуклеиновой кислотой получают с использованием способов, описанных, например, в патенте США № 6812334.

[00284] C. Конъюгаты

[00285] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, как раскрыто в данном документе, конъюгирован (например, ковалентно связан) с агентом, который увеличивает клеточное поглощение. «Агент, который увеличивает клеточное поглощение», представляет собой молекулу, облегчающую транспорт нуклеиновой кислоты через липидную мембрану. Например, нуклеиновая кислота может быть конъюгирована с липофильным соединением (например, холестерином, токоферолом и т.д.), проникающим в клетки пептидом (CPP) (например, пенетратином, TAT, Syn1B и т.д.) и полиаминами (например, спермином). Дополнительные примеры агентов, которые увеличивают клеточное поглощение, раскрыты, например, в Winkler (2013), Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.

[00286] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, как раскрыто в данном документе, конъюгируют с полимером (например, полимерной молекулой) или молекулой фолата (например, молекулой фолиевой кислоты) , В общем, доставка нуклеиновых кислот, конъюгированных с полимерами, известна в данной области, например, как описано в WO2000/34343 и WO2008/022309. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, конъюгируют с поли(амидным) полимером, например, как описано в патенте США № 8987377. В некоторых вариантах реализации нуклеиновую кислоту, описанную в данном изобретении, конъюгируют с молекулой фолиевой кислоты, как описано в патенте США № 8507455.

[00287] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, как раскрыто в данном документе, конъюгируют с углеводом, например, как описано в патенте США № 8450467.

[00288] D. Нанокапсула

[00289] Альтернативно, могут быть использованы нанокапсульные композиции ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, как раскрыто в данном документе. В общем случае, нанокапсулы могут захватывать вещества стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных избыточной внутриклеточной нагрузкой полимерами, такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) необходимо разрабатывать с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Предусматривается использование биоразлагаемых полиалкил-цианоакрилатных наночастиц, которые удовлетворяют таким требованиям.

[00290] E. Липосомы

[00291] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть добавлен к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00292] Образование и использование липосом в целом известно специалистам в данной области. Были разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке и временем полувыведения из кровотока (патент США № 5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США №№ 5567434; 5552157; 5565213; 5738868 и 5795587).

[00293] F. Типичные примеры композиций липосом и липидных наночастиц (ЛНЧ)

[00294] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть добавлен к липосомам для доставки в клетку, например, в клетку, нуждающуюся в экспрессии трансгена. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00295] Липидные наночастицы (ЛНЧ), содержащие зкДНК, раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме и предназначена для использования в способах и композициях, раскрытых в данном документе.

[00296] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает композицию липосом, которая включает одно или несколько соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которые могут снижать иммуногенность/антигенность, обеспечивать гидрофильность и гидрофобность соединения (соединений) и уменьшать частоту дозирования. В других случаях, липосомальная композиция просто содержит полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. В таких аспектах молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.

[00297] В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липосом, которая доставляет АФИ с профилем пролонгированного или контролируемого высвобождения на протяжении периода времени от нескольких часов до недель. В некоторых родственных аспектах композиция липосом может содержать водные камеры, ограниченные липидными бислоями. В других родственных аспектах липосомальная композиция инкапсулирует АФИ с компонентами, которые при повышенной температуре претерпевают физический переход с высвобождением АФИ на протяжении периода времени от нескольких часов до недель.

[00298] В некоторых аспектах липосомальная композиция содержит сфингомиелин и один или несколько липидов, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах липосомальная композиция содержит оптисомы.

[00299] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которая включает один или несколько липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида, HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеоилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); EPC (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеоилфосфатидилсерина); POPC (пальмитоилолеоилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диэрукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеоил-sn-глицерофосфоэтаноламина), холестерилсульфата (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеоил-sn-глицерофосфатидилхолина) или любой их комбинации.

[00300] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. В некоторых аспектах общее содержание липидов в липосомной композиции составляет от 2 до 16 мг/мл. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, холестерин и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина и холестерин. В некоторых аспектах пегилированный липид представляет собой ПЭГ-2000-DSPE. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую DPPG, соевый ПК, липидный конъюгат MPEG-DSPE и холестерин.

[00301] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую один или несколько липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, и один или несколько липидов, содержащих функциональную группу этаноламина. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую один или несколько компонентов из: липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, липидов, содержащих функциональную группу этаноламина, и стеринов, например, холестерина. В некоторых аспектах липосомальная композиция содержит DOPC/DEPC; и DOPE.

[00302] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, дополнительно содержащую один или несколько фармацевтических эксципиентов, например, сахарозу и/или глицин.

[00303] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которая является либо однослойной, либо многослойной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которую включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает композицию липосом, размер которых больше, чем у обычных наночастиц, и составляет примерно от 150 до 250 нм. В некоторых аспектах липосомальная композиция представляет собой лиофилизированный порошок.

[00304] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которую готовят и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в данном документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК вне липосомы. Такое добавление повышает рН вне липосом до значения, равного примерно 7,3, и направляет АФИ в липосому. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, имеющую кислый рН внутри липосом. В таких случаях значение рН внутри липосомы может составлять 4-6,9, более предпочтительно, 6,5. В других аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, полученную с использованием технологии внутрилипосомной стабилизации лекарственного средства. В таких случаях используются полимерные или неполимерные сильнозаряженные анионы и внутрилипосомные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.

[00305] В некоторых аспектах раскрытие относится к липидной наночастице, содержащей ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, и ионизируемый липид. Например, композиция липидных наночастиц, которую готовят и нагружают зкДНК, полученной способом, раскрытым в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ. Это может осуществляться путем высокоэнергетического смешивания этанольных растворов липидов с водной зкДНК при низких значениях рН, которые протонируют ионизируемый липид и обеспечивают благоприятную энергетику для ассоциации зкДНК/липид и нуклеации частиц. Частицы могут быть дополнительно стабилизированы путем разбавления водой и удаления органического растворителя. Частицы могут быть сконцентрированы до желаемого уровня.

[00306] Как правило, липидные частицы получают при соотношении общего липида к зкДНК (массовом или весовом) от примерно 10:1 до 30:1. В некоторых вариантах реализации отношение липида к зкДНК (массовое соотношение; отношение мас./мас.) может находиться в диапазоне значений от примерно 1:1 до примерно 25:1, от примерно 10:1 до примерно 14:1, от примерно 3:1 до 15:1, от 4:1 до 10:1, от 5:1 до 9:1, или от 6:1 до 9:1. Количество липидов и зкДНК можно регулировать для обеспечения желаемого отношения N/P, например, отношения N/P, равного 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или выше. Обычно общее содержание липидов в составе липидных частиц может составлять от около 5 до примерно 30 мг/мл.

[00307] Ионизируемый липид обычно используется для конденсации груза нуклеиновой кислоты, например, зкДНК, при низком pH, и для стимулирования ассоциации мембран и их фузогенности. Как правило, ионизируемые липиды представляют собой липиды, содержащие по меньшей мере одну аминогруппу, которая положительно заряжена или становится протонированной в кислых условиях, например, при рН 6,5 или ниже. Ионизируемые липиды также называются в данном документе катионными липидами.

[00308] Типичные примеры ионизирующиеся липидов описаны в международных патентных публикациях РСТ WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740 , WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406 , WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 и WO2013/086354, и публикациях патентов США US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 и US2013/0195920, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00309] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (DLin-MC3-DMA или MC3) имеющий следующую структуру:

.

[00310] Липид DLin-MC3-DMA описан в Jayaraman et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533, содержание которого включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00311] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой липид ATX-002, как описано в WO 2015/074085, содержание которого включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00312] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоса-13,16-диен-1-амин (соединение 32), как описано в WO2012/040184, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00313] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой соединение 6 или соединение 22, как описано в WO 2015/199952, содержание которого включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00314] Без ограничений, ионизируемый липид может составлять 20-90% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, молярное содержание ионизируемого липида может составлять 20-70% (мол.), 30-60% (мол.) или 40-50% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид составляет от примерно 50 % мол. до примерно 90 % мол. от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице.

[00315] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать некатионный липид. Неионные липиды включают амфипатические липиды, нейтральные липиды и анионные липиды. Соответственно, не-катионный липид может быть нейтральным незаряженным, цвиттерионным или анионным липидом. Некатионные липиды обычно используются для усиления фузогенности.

[00316] Типичные примеры некатионных липидов, предназначенные для использования в способах и композициях, содержащих ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, описаны в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которые в полном объеме включены в данный документ.

[00317] Типичные примеры некатионных липидов описаны в публикации международной заявки WO2017/099823 и публикации патента США US2018/0028664, содержание которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00318] Некатионный липид может составлять 0-30% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, содержание некатионного липида составляет 5-20% (мол.) или 10-15% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В различных вариантах реализации молярное отношение ионизируемого липида к нейтральному липиду составляет от примерно 2:1 до примерно 8:1.

[00319] В некоторых вариантах реализации, липидные наночастицы не содержат каких-либо фосфолипидов. В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать такой компонент, как стерол, для обеспечения целостности мембраны.

[00320] Одним примером стерола, который может быть использован в липидной наночастице, является холестерин и его производные. Типичные примеры производных холестерина описаны в международной заявке WO2009/127060 и патентной публикации США US2010/0130588, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00321] Компонент, обеспечивающий целостность мембраны, такой как стерол, может составлять 0-50% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 20-50% (мол.) 30-40% (мол.) от общего содержания липидов в липидной наночастице.

[00322] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ) или конъюгированную молекулу липида. Обычно они используются для ингибирования агрегации липидных наночастиц и/или обеспечения стерической стабилизации. Типичные конъюгированные липиды включают, без ограничений, конъюгаты ПЭГ-липид, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (такие как конъюгаты АТТА-липид), конъюгаты катионный полимер-липид (CPL) и их смеси. В некоторых вариантах реализации конъюгированная липидная молекула представляет собой конъюгат ПЭГ-липид, например, (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированные липиды. Типичные конъюгаты ПЭГ-липид включают, без ограничений, ПЭГ-диацилглицерин (DAG) (такой как 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG)), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer), пегилированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE), ПЭГ-сукцинатдиацилглицерол (PEGS-DAG) (такой как 4-O-(2',3'-ди(тетрадеканоилокси)пропил-1-O)-(w-метокси(полиэтокси)этил)бутандиоат (PEG-S-DMG)), PEG-диалкоксипропилкарбам, N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина натриевая соль, или их смесь. Дополнительные примеры конъюгатов ПЭГ-липид описаны, например, в US5885613, US6287591,
US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 и US2017/0119904, содержимое которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

[00323] В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид представляет собой соединение, раскрытое в US2018/0028664, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00324] В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид раскрыт в US20150376115 или в US2016/0376224, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00325] Конъюгатом ПЭГ-DAA может быть, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил, ПЭГ-димиристилоксипропил, ПЭГ-дипалмитилоксипропил или ПЭГ-дистеарилоксипропил. ПЭГ-липид может представлять собой что-то одно или несколько из ПЭГ-DMG, ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистерилглицерина, ПЭГ-дилаурилгликамида, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистерилгликамида, ПЭГ-холестерина (1-[8'-(холест-5-ен-3β-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метилполи(этиленгликоль), ПЭГ-DMB (простой эфир 3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликоля)) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]. В некоторых примерах ПЭГ-липид может быть выбран из группы, состоящей из ПЭГ-DMG, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000].

[00326] Вместо ПЭГ-липида можно также использовать липиды, конъюгированные с молекулой, отличной от ПЭГ. Например, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (такие как конъюгаты АТТА-липид) и конъюгаты катионный полимер-липид (CPL) могут быть использованы вместо ПЭГ-липида или в дополнение к нему. Типичные примеры конъюгированных липидов, т.е. ПЭГ-липиды, конъюгаты (POZ)-липид, конъюгаты АТТА-липид и (катионный полимер)-липиды, описаны в публикациях международных патентных заявок WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 и WO2010/006282, публикациях заявок на патент США US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 и US20110123453, а также патентов США US5885613, US6287591, US6320017 и US6586559, содержание которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00327] В некоторых вариантах реализации одно или несколько дополнительных соединений могут представлять собой терапевтические средства.  Терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели.  Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели.  Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано в соответствии с целью лечения и желаемым биологическим действием.  Например, если зкДНК в ЛНЧ предназначена для лечения рака, дополнительное соединение может представлять собой противораковое средство (например, химиотерапевтическое средство, таргетную терапию рака (включая, без ограничений, малую молекулу, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство).  В другом примере, если ЛНЧ, содержащие зкДНК, предназначены для лечения инфекции, дополнительное соединение может представлять собой антимикробный агент (например, антибиотик или противовирусное соединение). В еще одном примере, если ЛНЧ, содержащие зкДНК, предназначены для лечения иммунного заболевания или расстройства, дополнительное соединение может представлять собой соединение, которое модулирует иммунный ответ (например, иммунодепрессант, иммуностимулирующее соединение или соединение, модулирующее один или несколько специфических иммунных путей). В некоторых вариантах реализации в композициях и способах по изобретению могут быть использованы различные коктейли разных липидных наночастиц, содержащих разные соединения, такие как зкДНК, кодирующая другой белок, или другое соединение, такое как терапевтическое средство.

[00328] В некоторых вариантах дополнительное соединение представляет собой иммуномодулирующий агент. Например, дополнительное соединение представляет собой иммунодепрессант. В некоторых вариантах дополнительное соединение представляет собой иммуностимулирующий агент.

[00329] В данном документе также предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая инкапсулированный в липидную наночастицу синтетически продуцируемый зкДНК-вектор и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

[00330] В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, дополнительно содержащей один или несколько фармацевтических эксципиентов. В некоторых вариантах реализации композиция липидных наночастиц дополнительно содержит сахарозу, трис, трегалозу и/или глицин.

[00331] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может образовывать комплексы с липидной частью (portion) частицы или быть инкапсулирован в липидной части (position) липидной наночастицы. В некоторых вариантах реализации, ДНК-вектор, в том числе зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть полностью инкапсулирован в липидной части липидной наночастицы, тем самым защищая его от деградации нуклеазой, например, в водном растворе. В некоторых вариантах реализации, находящийся в липидной наночастице ДНК-вектор, в том числе зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, не деградирует существенно после воздействия на липидную наночастицу нуклеазой при 37 °С в течение по меньшей мере примерно 20, 30, 45 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной наночастице существенно не деградирует после инкубации частицы в сыворотке при 37 °С в течение по меньшей мере примерно 30, 45 или 60 минут или по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов.

[00332] В некоторых вариантах реализации липидные наночастицы являются по существу нетоксичными для субъекта, например, для млекопитающего, такого как человек. В некоторых аспектах композиция липидных наночастиц представляет собой лиофилизированный порошок.

[00333] В некоторых вариантах реализации, липидные наночастицы представляют собой твердые частицы сердцевины, имеющие по меньшей мере один липидный бислой. В других вариантах, наночастицы липидов имеют не-двухслойную структуру, т.е. не-ламеллярную (т.е. не-бислойную) морфологию. Без ограничений, не-бислойная морфология может включать, например, трехмерные трубки, стержни, частицы кубической симметрии и т.д. Например, морфология липидных наночастиц (ламеллярных и не-ламеллярных) можно легко оценить и охарактеризовать с использованием, например, анализа методом «Крио-ТЭМ» (криотрансмиссионная электронная микроскопия), как описано в US2010/0130588, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

[00334] В некоторых других вариантах реализации липидные наночастицы, имеющие неламеллярную морфологию, являются электронно-плотными. В некоторых аспектах, изобретение предусматривает липидную наночастицу, которая является либо однослойный, либо мультиламеллярной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены.

[00335] Контролируя состав и концентрацию липидных компонентов, можно контролировать скорость выделения конъюгата липида из липидной частицы по механизму обмена, и, в свою очередь, скорость превращения липидной наночастицы в фузогенную. Кроме того, другие переменные, включая, например, pH, температуру или ионную силу, могут использоваться для изменения и/или контроля скорости, с которой липидная наночастица становится фузогенной. Другие способы, которые можно использовать для контроля скорости, с которой липидная наночастица становится фузогенной, будут очевидны для специалистов в данной области техники на основании описания данного изобретения. Также будет очевидно, что, контролируя состав и концентрацию конъюгата липида, можно контролировать размер липидных частиц.

[00336] Значение pKa составленных композиций катионных липидов может коррелировать с эффективностью ЛНЧ для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), которые оба включены посредством ссылки в полном объеме). Предпочтительный диапазон значений рКа составляет от ок.5 до ок.7. Значение pKa катионного липида в липидных наночастицах может быть определено с использованием анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS).

VII. Методы доставки ДНК-векторов с замкнутыми концами

[00337] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть доставлен в клетку-мишень in vitro или in vivo различными подходящими способами. ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть нанесен или введен инъекцией. ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть доставлен в клетку без помощи реагента для трансфекции или других физических средств. Альтернативно, ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть доставлен с использованием любого известного в данной области реагента для трансфекции или других известных в данной области физических средств, которые облегчают проникновение ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, соединений, богатых полилизином, соединений, богатых аргинином, фосфата кальция, микровезикул. микроинъекции, электропорации и т.п.

[00338] В другом варианте реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в ЦНС (например, в головной мозг или в глаз). Например, зкДНК-вектор может быть введен в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черная субстанция, шишковидная железа), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, в том числе затылочные, височные, теменные и лобные доли, кору, базальные ганглии, гиппокамп и воротное миндалевидное тело (portaamygdala)), лимбическую систему, неокортекс, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик. зкДНК-вектор также можно вводить в различные области глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. зкДНК-вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, посредством люмбальной пункции). Дополнительно, зкДНК-вектор может быть введен в ЦНС внутрисосудисто в ситуациях, когда гематоэнцефалический барьер нарушен (например, опухоль головного мозга или инфаркт головного мозга).

[00339] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть введен в желаемую область (области) ЦНС любым путем, известным в данной области техники, включая, без ограничения, интратекальную, внутриглазную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит), интраназальную, внутриушную, внутриглазную (например, внутристекловидную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтеноновую область) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой к мотонейронам.

[00340] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в жидкой композиции путем прямой инъекции (например, стереотаксической инъекции) в желаемую область или компартмент в ЦНС. В других вариантах реализации, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен путем местного нанесения на желаемую область или путем интраназального введения аэрозольной композиции. Введение в глаз может осуществляться путем местного нанесения капель жидкости. В качестве дополнительной альтернативы, например, зкДНК-вектор может быть введен в виде твердой композиции с замедленным высвобождением (см., например, патент США № 7201898). В других дополнительных вариантах реализации, указанный, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может использоваться для ретроградного транспорта с целью лечения, облегчения и/или предотвращения заболеваний и расстройств, связанных с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз (ALS); спинальная мышечная атрофия (SMA) и т.д.). Например, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть доставлен в мышечную ткань, из которой он может мигрировать в нейроны.

VIII. Дополнительные применения зкДНК-векторов

[00341] Композиции и ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-векторы, полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, можно использовать для экспрессии гена-мишени или трансгена для различных целей. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которую предполагается использовать для создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, профилактики или ослабления болезненных состояний или нарушений у субъекта-млекопитающего. Полученный трансген может быть перенесен субъекту (например, экспрессироваться у субъекта) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации полученный трансген может экспрессироваться у субъекта в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией, активностью продукта гена или неадекватной активацией гена, который полученный трансген подавляет или иным образом вызывает снижение его экспрессии. В других вариантах реализации полученный трансген заменяет или дополняет дефектную копию нативного гена. Специалисту в данной области должно быть понятно, что трансген может не быть открытой рамкой считывания гена, который должен сам транскрибироваться; вместо того, это может быть область промотора или область репрессора гена-мишени, и зкДНК-вектор может модифицировать такую область, модулируя в результате экспрессию представляющего интерес гена.

[00342] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которую предполагается использовать для создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена.

IX. Методы применения

[00343] Полученный синтетическим путем ДНК-вектор с замкнутыми концами, например, зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно также использовать в способе доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, трансгена) в клетку-мишень (например, клетку-хозяина). Указанный способ, в частности, может представлять собой способ доставки трансгена в клетку нуждающегося в этом субъекта и лечения представляющего интерес заболевания. Изобретение позволяет обеспечить экспрессию in vivo трансгена, например, белка, антитела, нуклеиновой кислоты, такой как микроРНК (miRNA) и т.д., кодируемого в зкДНК-векторе, в клетке у субъекта таким образом, чтобы проявлялся терапевтический эффект экспрессии трансгена. Такие результаты наблюдаются как при in vivo, так и при in vitro способах доставки зкДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектора).

[00344] Кроме того, изобретение предусматривает способ доставки трансгена в клетку нуждающегося в этом субъекта, включающий многократное введение синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектора) по изобретению, содержащего указанные представляющие интерес нуклеиновую кислоту или трансген. Поскольку зкДНК-вектор по изобретению не индуцирует иммунный ответ, подобный тому, который обычно наблюдается против инкапсидированных вирусных векторов, такая стратегия многократного введения, вероятно, будет иметь больший успех в системе на основе зкДНК.

[00345] Нуклеиновую кислоту (кислоты) синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектор) вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, внутривенный (например, в составе липосом), прямую доставку в выбранный орган (например, внутрипортальную доставку в печень), внутримышечный и другие парентеральные (parental) пути введения. При необходимости, пути введения могут быть скомбинированы.

[00346] Доставка ДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектора) не ограничивается доставкой гена замены. Например, синтетически продуцируемые ДНК-векторы с замкнутыми концами (например, зкДНК-векторы), как описано в данном документе, могут использоваться с другими системами доставки, предусматриваемыми для обеспечения части генной терапии. Один неограничивающий пример системы, которая может быть скомбинирована с синтетически продуцируемыми зкДНК-векторами в соответствии с данным изобретением, включает системы для отдельной доставки одного или нескольких кофакторов или иммунных супрессоров для эффективной генной экспрессии трансгена.

[00347] Изобретение также предусматривает способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества синтетически продуцируемого ДНК-вектора с замкнутыми концами (например, зкДНК-вектора), необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя указанный, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Выбранный указанный, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, указанный, например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может содержать желаемую экзогенную последовательность ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными, при введении субъекту, направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого этой экзогенной последовательностью ДНК. Например, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

[00348] Синтетически продуцируемые композиции и векторы, предусматриваемые в данном документе, можно использовать для доставки трансгена с различными целями. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которую предполагается использовать для создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена.

[00349] В принципе, экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту или любой трансген, кодирующие белок или полипептид, который либо редуцирован, либо отсутствует из-за мутации, либо который приносит терапевтическую пользу при сверхэкспрессии, и считается входящим в объем изобретения.

[00350] Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не ограничивается одним видом зкДНК-вектора. По существу, в другом аспекте множество зкДНК-векторов, содержащих разные трансгены или один и тот же трансген, но функционально связанные с разными промоторами или цис-регуляторными элементами, могут доставляться одновременно или последовательно к клетке-мишени, ткани, органу или субъекту. Таким образом, эта стратегия может обеспечивать возможность генной терапии или доставки генов с использованием одновременно множества генов. Также возможно разместить разные части трансгена в отдельных зкДНК-векторах (например, разные домены и/или кофакторы, необходимые для функциональности трансгена), которые можно вводить одновременно или в разное время, и которые можно регулировать отдельно, тем самым добавляя дополнительный уровень контроля экспрессии трансгена. Доставка также может осуществляться неоднократно и, что важно для генной терапии в клинических условиях, с последовательно увеличивающимися или уменьшающимися дозами, учитывая отсутствие иммунного ответа хозяина против капсида из-за отсутствия вирусного капсида. Ожидается, что никакой реакции против капсида возникать не будет из-за отсутствия капсида.

[00351] Изобретение также предусматривает способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, как раскрыто в данном документе, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными, при введении субъекту, направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК. Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

X. Способы лечения

[00352] Описанная в данном документе технология также демонстрирует способы получения, а также способы применения раскрытых синтетически продуцируемых зкДНК-векторов различными способами, включая, например, применения, методологии, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии ex situ, in vitro и in vivo.

[00353] В данном документе предложен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (например, мышечную клетку или ткань, или другой тип пораженных клеток) субъекта терапевтически эффективного количества синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый синтетически продуцируемый зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

[00354] В данном документе раскрыты композиции и составы зкДНК-векторов, которые включают один или несколько зкДНК-векторов по данному изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми буферами, разбавителями или эксципиентами. Такие композиции могут быть включены в один или несколько диагностических или терапевтических наборов, для диагностики, профилактики, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, поражения, расстройства, травмы или нарушение функции. В одном аспекте заболевание, поражение, расстройство, травма или нарушение функции представляют собой заболевание, поражение, расстройство, травму или нарушение функции у человека.

[00355] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ введения нуждающемуся в этом субъекту диагностически или терапевтически эффективного количества синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, причем способ включает обеспечение для клетки, ткани или органа нуждающегося в этом субъекта некоторого количества синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, как описано в данном документе; и в течение времени, обеспечивающего возможность эффективной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, обеспечивая тем самым субъекту диагностически или терапевтически эффективное количество белка, пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессируемых зкДНК-вектором. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00356] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ диагностики, предотвращения, лечения или ослабления по меньшей мере одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В общем, способ включает, по меньшей мере, стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких раскрытых синтетически продуцируемых зкДНК-векторов, в количестве и в течение времени, достаточных для диагностики, предотвращения, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00357] Другим аспектом является использование синтетически продуцируемого зкДНК-вектора в качестве инструмента для лечения или ослабления одного или нескольких симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует ряд наследственных заболеваний с известными дефектными генами, которые, как правило, делятся на два класса: состояния дефицита, обычно ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и несбалансированные состояния, в которых могут быть задействованы регуляторные или структурные белки, и которые обычно, но не всегда, наследуются доминантно. При заболеваниях с дефицитными состояниями синтетически продуцируемые зкДНК-векторы могут быть использованы для доставки трансгенов, чтобы ввести нормальный ген в пораженные ткани для заместительной терапии, а также, в некоторых вариантах реализации, для создания животных моделей заболевания с использованием антисмысловых мутаций. При несбалансированных болезненных состояниях синтетически продуцируемые зкДНК-векторы могут быть использованы для создания болезненного состояния в модельной системе, которая затем может использоваться в рамках усилий, направленных на противодействие указанному болезненному состоянию. Таким образом, синтетически продуцируемые зкДНК-векторы и способы, раскрытые в данном документе, позволяют лечить генетические заболевания. В используемом в данном документе значении, болезненное состояние лечат путем частичного или полного устранения дефицита или дисбаланса, которые вызывают заболевание или делают его более тяжелым.

А. Клетки-хозяева:

[00358] В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор доставляет трансген в клетку-хозяина по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека, включая, например, клетки крови, стволовые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD34⁺, клетки печени, раковые клетки, сосудистые клетки, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, глазные клетки или клетки сетчатки, эпителиальные или эндотелиальные клетки, дендритные клетки, фибробласты или любые другие клетки, полученные от млекопитающих, включая, без ограничений, гепатоциты (т.е. клетки печени), клетки легкого, клетки сердца, клетки поджелудочной железы, клетки кишечника, диафрагмальные клетки, почечные клетки (т.е. клетки почек), нервные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, или любой одной или нескольких выбранных тканей субъекта, для которого предусматривается проведение генной терапии. В одном аспекте рассматриваемая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина человека.

[00359] Данное изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как указано выше, включающим синтетически продуцируемые зкДНК-векторы, как описано в данном документе. Таким образом, можно использовать несколько клеток-хозяев в зависимости от цели, как понятно специалисту в данной области. Конструкт или синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, включающий донорную последовательность, вводят в клетку-хозяина так, чтобы донорная последовательность поддерживалась как хромосомный интегрант, как описано ранее. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, возникающих во время репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от донорной последовательности и ее источника. Клетка-хозяин также может быть эукариотической, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растения или грибка.В одном из вариантов реализации клетка-хозяин представляет собой клетку человека (например, первичную клетку, стволовую клетку, или иммортализированную клеточную линию). В некоторых вариантах реализации клетке-хозяину может быть введен синтетически продуцируемый зкДНК-вектор ex vivo, с последующей доставкой субъекту после события генной терапии. Клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, например, соматической клеткой или стволовой клеткой, индуцированной плюрипотентной стволовой клеткой или клеткой крови, например, Т-клеткой или В-клеткой, или клеткой костного мозга. В определенных вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой аллогенную клетку. Например, Т-клеточная геномная инженерия полезна для иммунотерапий рака, модуляции заболевания, такой как терапия ВИЧ (например, нокаут рецептора, такого как CXCR4 и CCR5), и терапий иммунодефицита. Мишенями иммунотерапии могут быть рецепторы ГКГ (главный комплекс гистосовместимости) на В-клетках. В некоторых вариантах реализации генно-модифицированные клетки-хозяева, например, стволовые клетки костного мозга, например, клетки CD34⁺, или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, могут быть трансплантированы обратно пациенту для экспрессии терапевтического белка.

B. Типичные примеры трансгенов и заболевания, подлежащие лечению зкДНК-вектором

[00360] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, также полезен для коррекции дефектного гена. В качестве неограничивающего примера, ген DMD мышечной дистрофии Дюшенна может быть доставлен с использованием синтетически продуцируемых зкДНК-векторов, как раскрыто в данном документе.

[00361] Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или его композиция может использоваться для лечения любого наследственного заболевания. В качестве неограничивающего примера, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или его композиция могут быть использованы, например, для лечения транстиретинового амилоидоза (ATTR), представляющего собой орфанное заболевание, при котором мутантный белок подвергается неправильной укладке и образует агрегаты в нервах, сердце, желудочно-кишечной системе и т.д. В данном документе предусматривается, что указанное заболевание можно лечить путем делеции мутантного гена заболевания (mutTTR) с использованием систем синтетически продуцируемых зкДНК-векторов, описанных в данном документе. Такое лечение наследственных заболеваний может остановить прогрессирование заболевания и может привести к регрессу установленного заболевания или уменьшению по меньшей мере одного симптома заболевания по меньшей мере на 10%.

[00362] В другом варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения дефицита орнитин-транскарбамилазы (дефицит ОТК), гипераммонемии или других нарушений цикла мочевины, которые ухудшают способность новорожденного или ребенка детоксифицировать аммиак. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном документе предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома OTC и/или улучшения качества жизни для субъекта с дефицитом ОТК. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую ОТК, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00363] В другом варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения фенилкетонурии (ФКУ) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент фенилаланин-гидроксилазу, для уменьшения накопления пищевого фенилаланина, который может быть токсичным для пациентов, страдающих фенилкетонурией. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном документе предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, при по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома ФКУ и/или улучшения качества жизнь для субъекта, имеющего ФКУ. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фенилаланин-гидроксилазу, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00364] В другом варианте реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения болезни накопления гликогена (БНГ) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, для коррекции аберрантного синтеза или распада гликогена у субъектов, имеющих БНГ. Неограничивающие примеры ферментов, которые могут быть доставлены и экспрессированы с использованием синтетически продуцируемых зкДНК-векторов и способов, как описано в данном документе, включают гликоген-синтазу, глюкозо-6-фосфатазу, кислую альфа-глюкозидазу, гликоген-ветвящий фермент, мышечную гликогенфосфорилазу, гликогенфосфорилазу печени, мышечную фосфофруктокиназу, киназу фосфорилазы, глюкозный транспортёр-2 (GLUT-2), альдолазу A, бета-енолазу, фосфоглюкомутазу-1 (PGM-1) и гликогенин-1. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном документе предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, при по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома БНГ и/или улучшения качества жизнь для субъекта, имеющего БНГ. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент для коррекции аберрантного накопления гликогена, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.

[00365] Синтетически продуцируемые зкДНК-векторы, описанные в данном документе, также предусматриваются для применения при лечении любого из: врожденного амавроза Лебера (LCA), полиглутаминовых заболеваний, включая polyQ-повторы, и дефицита альфа-1-антитрипсина (A1AT). Врожденный амавроз Лебера - это редкое врожденное заболевание глаз, приводящее к слепоте, которое может быть вызвано мутацией в одном из следующих генов: GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 и/или PRPH2. В данном документе предполагается, что зкДНК-векторы и композиции и способы, описанные в данном документе, могут быть адаптированы для доставки одного или нескольких генов, связанных с LCA, чтобы исправить ошибку в гене (генах), ответственном за симптомы LCA. К полиглутаминовым болезням относятся, без ограничений: денторубральная атрофия, болезнь Гентингтона, спинальная и бульбарная мышечная атрофия и спинно-мозжечковая атаксия типов 1, 2, 3 (также известна как болезнь Мачадо-Джозефа), 6, 7 и 17. Дефицит А1АТ - это генетическое заболевание, которое вызывает дефект продуцирования альфа-1-антитрипсина, что приводит к снижению активности фермента в крови и легких, что, в свою очередь, может привести к эмфиземе или хронической обструктивной болезни легких у пораженных субъектов. В данном документе конкретно предусматривается лечение субъекта с дефицитом A1AT с использованием зкДНК-векторов или их композиций, описанных в данном документе. В данном документе предусматривается, что субъекту, нуждающемуся в лечении, может быть введен зкДНК-вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый белок для лечения LCA, полиглутаминовых заболеваний или дефицита A1AT.

[00366] В других вариантах реализации композиции, содержащие синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно использовать для доставки, в числе прочего, вирусной последовательности, последовательности патогена, хромосомной последовательности, места стыка транслокаций (например, транслокации, связанной с раком), некодирующего РНК-гена или РНК-последовательности, связанного с заболеванием гена.

[00367] Любая представляющая интерес нуклеиновая кислота или ген-мишень могут быть доставлены или экспрессированы синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, как раскрыто в данном документе. Нуклеиновые кислоты-мишени и гены-мишени включают, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи, зрелые микроРНК и т.д.), предпочтительно, терапевтические (например, для медицинского, диагностического или ветеринарного применения) или иммуногенные (например, для вакцин) полипептиды. В определенных вариантах реализации нуклеиновые кислоты-мишени или гены-мишени, на которые нацелены синтетически продуцируемые зкДНК-векторы, описанные в данном документе, кодируют один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов или любую их комбинацию.

[00368] В частности, ген-мишень или трансген для экспрессии синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, как раскрыто в данном документе, может кодировать, например, без ограничений, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты, для применения при лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства. В одном аспекте, заболевание, дисфункция, травма, поражение и/или расстройство представляет собой заболевание, дисфункцию, травму, поражение и/или расстройство человека.

[00369] Экспрессионная кассета также может кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир)). Экспрессионные кассеты могут включать экзогенную последовательность, которая кодирует репортерный белок для использования в экспериментальных или диагностических целях, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области.

[00370] Последовательности, представленные в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или (of) зкДНК-векторе, описанных в данном документе, могут быть кодон-оптимизированы для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках позвоночного животного, представляющего интерес, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ Aptagen Gene Forge® (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных.

[00371] Многие организмы проявляют тенденцию к использованию определенных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Неслучайное использование кодонов (codon preference) или предпочтение кодонов, различия в частоте использования кодонов между организмами, обусловлены вырожденностью генетического кода и хорошо задокументированы для многих организмов. Предпочтение кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции информационной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, зависит, в частности, от свойств транслируемых кодонов и доступности определенных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно является отражением кодонов, наиболее часто используемых в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть отредактированы для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации кодонов.

[00372] Учитывая большое количество доступных последовательностей генов для широкого спектра видов животных, растений и микробов, можно рассчитать относительные частоты использования кодонов (Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).

[00373] Как отмечено в данном документе, синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, может кодировать белок или пептид, или последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты, или терапевтический агент, включая, без ограничений, один или несколько агонистов, антагонистов, антиапоптозных факторов, ингибиторов, рецепторов, цитокинов, цитотоксинов, эритропоэтических агентов, гликопротеинов, факторов роста, рецепторов факторов роста, гормонов, рецепторов гормонов, интерферонов, интерлейкинов, рецепторов интерлейкина, факторов роста нервов, нейроактивных пептидов, рецепторов нейроактивных пептидов, протеаз, ингибиторов протеаз, белковых декарбоксилаз, протеинкиназ, ингибиторов протеинкиназ, ферментов, рецептор-связывающих белков, транспортных белков или одного или нескольких их ингибиторов, серотониновых рецепторов или одного или нескольких ингибиторов их поглощения, серпинов, рецепторов серпина, опухолевых супрессоров, диагностических молекул, химиотерапевтических агентов, цитотоксинов, или любую их комбинацию.

[00374] Синтетически продуцируемые зкДНК-векторы также полезны для устранения экспрессии генов. Например, в одном варианте реализации зкДНК-вектор можно использовать для экспрессии антисмысловой нуклеиновой кислоты или функциональной РНК для индукции нокдауна гена-мишени. В качестве неограничивающего примера, экспрессия рецепторов ВИЧ CXCR4 и CCR5 была успешно уничтожена в первичных Т-клетках человека, см. Schumann et al. (2015), PNAS 112(33): 10437-10442, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Другим геном для направленного ингибирования является PD-1, причем синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может экспрессировать ингибирующую нуклеиновую кислоту или РНКи или функциональную РНК для ингибирования экспрессии PD-1. PD-1 экспрессирует рецептор иммунной контрольной точки клеточной поверхности на хронически активных Т-клетках, что происходит при злокачественных образованиях. См. Schumann et al., выше.

[00375] В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы полезны для коррекции дефектного гена путем экспрессии трансгена, который нацелен на больной ген. Неограничивающие примеры заболеваний или расстройств, поддающихся лечению синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, раскрытым в данном документе, перечислены, вместе с их и их соответствующими генами (along with their and their associated genes), в Таблицах A-C патентной публикации США 2014/0170753, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00376] В альтернативных вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы используются для вставки экспрессионной кассеты для экспрессии терапевтического белка или репортерного белка в гене безопасной гавани, например, в неактивном интроне. В некоторых вариантах реализации беспромоторную кассету вставляют в ген безопасной гавани. В таких вариантах реализации беспромоторная кассета может использовать преимущества регуляторных элементов гена безопасной гавани (промоторов, энхансеров и сигнальных пептидов), неограничивающим примером вставки в локус безопасной гавани является вставка в локус альбумина, которая описана в Blood (2015) 126 (15): 1777-1784, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Инсерция в альбумин имеет то преимущество, что позволяет секретировать трансген в кровь (см., например, Пример 22). Кроме того, геномный сайт безопасной гавани может быть определен с использованием методов, известных в данной области и описанных, например, в Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016) или Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В данном документе специально предусматривается, что сайты безопасной гавани в геноме аденоассоциированного вируса (ААВ) (например, сайт безопасной гавани ААВS1) можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе (см., например, Oceguera-Yanez et al. Methods 101:43-55 (2016) или Tiyaboonchai, A et al. Stem Cell Res 12(3):630-7 (2014), содержание которых включено посредством ссылки в полном объеме). Например, геномный сайт безопасной гавани ААВS1 можно использовать с зкДНК-векторами и композициями, как описано в данном документе, для целей гематопоэтической специфической экспрессии трансгена и сайленсинга генов в эмбриональных стволовых клетках (например, человеческих эмбриональных стволовых клетках) или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPS-клетках). Кроме того, в данном документе предусматривается, что синтетические или коммерчески доступные донорные матрицы гомологично направленной репарации для вставки в сайт безопасной гавани AASV1 на хромосоме 19 можно использовать с зкДНК-векторами или композициями, как описано в данном документе. Например, матрицы гомологично направленной репарации и направляющая РНК приобретены из коммерческих источников, например, у фирмы System Biosciences (Пало-Альто, Калифорния), и клонированы в зкДНК-вектор.

[00377] В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемые зкДНК-векторы используются для экспрессии трансгена или для нокаута или снижения экспрессии гена-мишени в Т-клетке, например, для конструирования Т-клеток с улучшенным адоптивным клеточным переносом и/или терапий CAR-T (Т-клетки с химерными антигенными рецепторами) (см., например, Пример 24). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может экспрессировать трансгены, которые нокаутируют гены. Неограничивающие примеры терапевтически релевантных нокаутов Т-клеток описаны в PNAS (2015) 112(33):10437-10442, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

C. Дополнительные заболевания для использования генной терапии:

[00378] Как правило, зкДНК-вектор, полученный синтетическими способами, как описано в данном документе, можно использовать для доставки любого трансгена в соответствии с приведенным выше описанием для лечения, предотвращения или ослабления симптомов, ассоциированных с любым расстройством, связанным с экспрессией генов. Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, без ограничений: муковисцидоз (и другие заболевания легких), гемофилию A, гемофилию B, талассемию, анемию и другие расстройства крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболические дефекты, дегенеративные заболевания сетчатки (и другие заболевания глаз), митохондриопатии (например, наследственную оптическую нейропатию Лебера (LHON), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, плече-лопаточно-лицевую миопатию (FSHD) и кардиомиопатии), заболевания солидных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца); и т.п. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может быть выгодно использован для лечения индивидуумов с метаболическими расстройствами (например, дефицитом орнитинтранскарбамилазы).

[00379] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно использовать для лечения, ослабления и/или предотвращения заболевания или расстройства, вызванного мутацией в гене или продукте гена. Типичные примеры заболеваний или расстройств, лечение которых может проводиться с применением зкДНК-векторов, включают, без ограничений, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (ФКУ), болезнь накопления гликогена); болезни или расстройства цикла мочевины (например, недостаточность орнитинтранскарбамилазы (ОТК)); болезни или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Хантера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (ПСВХ); заболевания или расстройства крови (например, гемофилию (A и B), талассемию и анемию); раковые заболевания и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, муковисцидоз).

[00380] В еще одном аспекте зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, описанными в данном документе, может использоваться для доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности в ситуациях, когда желательно регулировать уровень экспрессии трансгена (например, трансгенов, кодирующих гормоны или факторы роста, как описано в данном документе).

[00381] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, описанными в данном документе, можно использовать для коррекции аномального уровня и/или функции продукта гена (например, отсутствия или дефекта белка), которые приводят к заболеванию или расстройству. Указанный зкДНК-вектор может продуцировать функциональный белок и/или модифицировать уровни белка для облегчения или ослабления симптомов, являющихся результатом конкретного заболевания или расстройства, или обеспечивать преимущества при конкретном заболевании или расстройстве, вызываемом отсутствием или дефектом белка. Например, лечение дефицита ОТК может осуществляться путем продуцирования функционального фермента ОТК; лечение гемофилии А и В может осуществляться путем изменения уровней фактора VIII, фактора IX и фактора X; лечение ФКУ может осуществляться путем изменения уровня фермента фенилаланингидроксилазы; лечение болезни Фабри или Гоше может осуществляться путем продуцирования функциональной альфа-галактозидазы или бета-глюкоцереброзидазы, соответственно; лечение метахроматической лейкодистрофии (MLD) или мукополисахаридоза II типа (MPSII) может осуществляться путем продуцирования функциональной арилсульфатазы A или идуронат-2-сульфатазы, соответственно; лечение муковисцидоза может осуществляться путем продуцирования функционального трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза; лечение болезни накопления гликогена может осуществляться путем восстановления функции функционального фермента G6Pase; и лечение прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (PFIC) может осуществляться путем продуцирования функциональных генов ATP8B1, ABCB11, ABCB4 или TJP2.

[00382] В альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно использовать для обеспечения антисмысловой нуклеиновой кислоты в клетке in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой молекулу РНКи, экспрессия антисмысловой нуклеиновой кислоты или РНКи в клетке-мишени снижает экспрессию клеткой определенного белка. Соответственно, трансгены, представляющие собой молекулы РНКи или антисмысловые нуклеиновые кислоты, можно вводить для снижения экспрессии конкретного белка у нуждающегося в этом субъекта. Антисмысловые нуклеиновые кислоты также можно вводить в клетки in vitro для регулирования физиологии клеток, например, для оптимизации систем культивирования клеток или тканей.

[00383] В некоторых вариантах реализации типичные примеры трансгенов, кодируемых зкДНК-вектором, продуцируемым синтетическими способами получения, как описано в данном документе, включают, без ограничений: X, лизосомальные ферменты (например, гексозаминидазу A, связанную с болезнью Тея-Сакса, или идуронатсульфатазу, связанную с синдромом Хантера/MPS II), эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу, глобин, лептин, каталазу, тирозингидроксилазу, а также цитокины (например, интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.п.), пептидные факторы роста и гормоны (например, соматотропин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор-3 и 4, нейротрофический фактор мозга (BDNF), глиальный фактор роста (GDNF), трансформирующий фактор роста-α и -β, и т.п.), рецепторы (например, рецептор фактора некроза опухоли). В некоторых примерных вариантах реализации указанный трансген кодирует моноклональное антитело, специфичное в отношении одной или нескольких желаемых мишеней. В некоторых примерных вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует более одного трансгена. В некоторых примерных вариантах реализации трансген кодирует слитый белок, содержащий два разных полипептида, представляющих интерес. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует антитело, в том числе полноразмерное антитело или фрагмент антитела, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой последовательность антигенсвязывающего домена или вариабельного домена иммуноглобулина, как это определено в данном документе. Другие иллюстративные примеры трансгенных последовательностей кодируют продукты суицидных генов (тимидинкиназу, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу и фактор некроза опухоли), белки, придающие устойчивость к лекарственному средству, применяемому в противораковой терапии, и продукты генов-супрессоров опухолей.

[00384] В репрезентативном варианте реализации трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором, продуцируемым синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно использовать для лечения мышечной дистрофии у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает: введение эффективного для лечения, облегчения состояния или профилактики количества зкДНК-вектора, описанного в данном документе, при этом указанный зкДНК-вектор содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую дистрофин, мини-дистрофин, микродистрофин, миостатиновый пропептид, фоллистатин, растворимый рецептор активина типа II, IGF-1, противовоспалительные полипептиды, такие как доминантный мутант I-каппа-B, саркоспан, утрофин, микродистрофин, ламинин-α2, α-саркогликан, β-саркогликан, γ-саркогликан, δ-саркогликан, IGF-1, антитело или фрагмент антитела против миостатина или пропептида миостатина, и/или РНКи против миостатина. В конкретных вариантах реализации указанный синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть введен в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу, как описано в других разделах данного документа.

[00385] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно использовать для доставки трансгена к скелетной, сердечной или диафрагмальной мышце для продуцирования полипептида (например, фермента) или функциональной РНК (например, РНКи, микроРНК, антисмысловой РНК), которая в норме циркулирует в крови, или для системной доставки в другие ткани, с целью лечения, облегчения и/или предотвращения расстройства (например, метаболического расстройства, такого как диабет (например, инсулина), гемофилии (например, VIII), мукополисахаридозного расстройства (например, синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо A, B, C, D, синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами и т.п.) или расстройства лизосомального накопления (такого как болезнь Гоше [глюкоцереброзидаза], болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза] или болезнь Фабри [альфа-галактозидаза A]) или расстройства накопления гликогена (такого как болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза]). Другие подходящие белки для лечения, облегчения и/или предотвращения метаболических нарушений описаны выше.

[00386] В других вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно использовать для доставки трансгена в способе лечения, облегчения и/или предотвращения метаболического нарушения у субъекта, нуждающегося в этом. Иллюстративные примеры метаболических нарушений и трансгенов, кодирующих полипептиды, описаны в данном документе. Необязательно, указанный полипептид секретируется (например, полипептид, который является секретируемым полипептидом в его нативном состоянии или который был модифицирован так, чтобы секретироваться, например, посредством функциональной ассоциации с секреторной сигнальной последовательностью, как известно в данной области).

[00387] Другой аспект изобретения относится к способу лечения, облегчения и/или предотвращения врожденной сердечной недостаточности или заболевания периферических артерий (PAD) у нуждающегося в этом субъекта, причем способ включает введение зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, субъекту-млекопитающему при этом зкДНК-вектор содержит трансген, кодирующий, например, Ca²⁺-АТФазу саркоплазматического эндоретикула (SERCA2a), ангиогенный фактор, ингибитор фосфатазы I (I-1), РНКи против фосфоламбана; ингибиторную или доминантно-негативную молекулу фосфоламбана, такую как фосфоламбан S16E, белок цинкового пальца, который регулирует ген фосфоламбана, β2-адренергический рецептор, β2-адренергическую рецепторную киназу (BARK), PI3-киназу, калсаркан, ингибитор бета-адренергической рецепторной киназы (βARKct), ингибитор 1 протеинфосфатазы 1, S100A1, парвальбумин, аденилатциклазу типа 6, молекулу, которая вызывает нокдаун сопряженной с G-белком рецепторной киназы типа 2, такую как усеченный конститутивно активный βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, калликреин, HIF, тимозин-β4, mir-1, mir-133, mir-206 и/или mir-208.

[00388] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно вводить в легкие субъекта любым подходящим способом, необязательно, путем введения аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, содержащих зкДНК-векторы, которые субъект вдыхает. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли с жидкими частицами, содержащими зкДНК-векторы, могут быть получены любыми подходящими способами, например, с помощью пневматического аэрозольного небулайзера или ультразвукового небулайзера, как известно специалистам в данной области. См., например, патент США № 4501729. Аэрозоли с твердыми частицами, содержащими зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, также могут быть получены с помощью любого генератора медикаментозных аэрозолей с твердыми частицами способами, известными в фармацевтике.

[00389] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно вводить в ткани ЦНС (например, головной мозг, глаз). В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно вводить для лечения, ослабления или предотвращения заболеваний ЦНС, включая генетические нарушения, нейродегенеративные нарушения, психические расстройства и опухоли. Иллюстративные примеры заболеваний ЦНС включают, без ограничений, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, болезнь Лея, болезнь Рефсума, синдром Туретта, первичный боковой склероз, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь Пика, мышечную дистрофию, рассеянный склероз, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, болезнь Бинсвангера, травму вследствие повреждения спинного мозга или головы, болезнь Тея Сакса, болезнь Леша-Нихена, эпилепсию, церебральные инфаркты, нарушения психики, в том числе расстройства настроения (например, депрессию, биполярное аффективное расстройство, устойчивое аффективное расстройство, вторичное расстройство настроения), шизофрению, лекарственную зависимость (например, алкоголизм и зависимость от других веществ), неврозы (например, тревожность, обсессивное расстройство, соматоформное расстройство, диссоциативное расстройство, состояние горя, послеродовую депрессию), психоз (например, галлюцинации и бред), деменцию, паранойю, синдром дефицита внимания, психосексуальные расстройства, нарушения сна, связанные с болью нарушения, связанные с питанием или массой тела нарушения (например, ожирение, кахексию, нервную анорексию и булимию), и раковые заболевания и опухоли ЦНС (например, опухоли гипофиза).

[00390] Глазные расстройства, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, включают офтальмологические расстройства, затрагивающие сетчатку, задний путь и зрительный нерв (например, пигментный ретинит, диабетическую ретинопатию и другие дегенеративные заболевания сетчатки, увеит, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому). Многие офтальмологические заболевания и расстройства связаны с одним или несколькими из трех типов показаний: (1) ангиогенез, (2) воспаление и (3) дегенерация. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, можно применять для доставки антиангиогенных факторов; противовоспалительных факторов; факторов, которые замедляют дегенерацию клеток, способствуют сохранению клеток или способствуют росту клеток, и комбинаций вышеперечисленного. Например, диабетическая ретинопатия характеризуется ангиогенезом. Диабетическую ретинопатию можно лечить путем доставки одного или нескольких антиангиогенных факторов либо внутриглазно (например, в стекловидное тело), либо периокулярно (например, в субтеноновое пространство). Также может осуществляться совместная доставка одного или нескольких нейротрофических факторов либо внутриглазно (например, интравитреально), либо периокулярно. Дополнительные заболевания глаз, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по изобретению, включают географическую атрофию, сосудистую или «влажную» макулярную дегенерацию, болезнь Штаргардта, врожденный амавроз Лебера (LCA), синдром Ушера, эластическую псевдоксантому (PXE), Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP), Х-сцепленный ретиношизис (XLRS), хороидеремию, врожденную нейропатию зрительного нерва Лебера (LHON), ахроматопсию, палочко-колбочковую дистрофию, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, диабетический макулярный отек; раковые заболевания и опухоли глаз.

[00391] В некоторых вариантах реализации воспалительные глазные заболевания или расстройства (например, увеит) можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе. Один или несколько противовоспалительных факторов могут быть экспрессированы путем внутриглазного (например, в стекловидное тело или переднюю камеру) введения зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе. В других вариантах реализации заболевания глаз или нарушения зрения, характеризующиеся дегенерацией сетчатки (например, пигментный ретинит), можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по изобретению. Для лечения таких заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки, можно использовать внутриглазное (например, витреальное введение) зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов. В некоторых вариантах реализации заболевания или расстройства, которые включают как ангиогенез, так и дегенерацию сетчатки (например, возрастную макулярную дегенерацию), можно лечить с помощью зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе. Возрастную макулярную дегенерацию можно лечить путем введения внутриглазно (например, в стекловидное тело) зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов, и/или внутриглазно или периокулярно (например, в субтеноново пространство) одного или нескольких антиангиогенных факторов. Глаукома характеризуется повышенным глазным давлением и потерей ганглиозных клеток сетчатки. Лечение глаукомы включает введение одного или нескольких нейропротекторных агентов, которые защищают клетки от эксайтотоксического повреждения, с использованием зкДНК-вектора, как описано в данном документе. Соответственно, такие агенты включают антагонисты N-метил-D-аспартата (NMDA), цитокины и нейротрофические факторы, которые могут быть доставлены внутриглазно, необязательно, интравитреально, с использованием зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе.

[00392] В других вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может использоваться для лечения судорог, например, для снижения возникновения, частоты или тяжести судорог. Эффективность терапевтического лечения судорог может быть оценена на основании поведенческих признаков (например, дрожь, глазные или ротовые тики) и/или электрографическими способами (большинство судорог характеризуются отличительными электрографическими аномалиями). Таким образом, зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, также можно использовать для лечения эпилепсии, при которой со временем развиваются множественные припадки. В одном репрезентативном варианте реализации соматостатин (или его активный фрагмент) вводят в мозг с использованием зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, для лечения опухоли гипофиза. В соответствии с этим вариантом реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, кодирующий соматостатин (или его активный фрагмент), вводят путем микроинфузии в гипофиз. Аналогично, такое лечение может быть использовано для лечения акромегалии (аномальной секреции гормона роста гипофизом). Последовательности нуклеиновой кислоты (например, GenBank, № доступа J00306) и аминокислотные последовательности (например, GenBank, № доступа P01166; содержит процессированные активные пептиды соматостатин-28 и соматостатин-14) соматостатинов известны в данной области. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор может кодировать трансген, который содержит секреторный сигнал, как описано в патенте США № 7071172.

[00393] Другой аспект изобретения относится к применению зкДНК-вектора, продуцируемого синтетическими способами получения, как описано в данном документе, для получения антисмысловой РНК, РНКи или другой функциональной РНК (например, рибозима) для системной доставки субъекту in vivo. Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может содержать трансген, который кодирует антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим (например, как описано в патенте США № 5878022), РНК, которые влияют на опосредованный сплайсосомой транс-сплайсинг (см. Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; патент США № 6013487; патент США № 6083702), интерферирующие РНК (РНКи), которые опосредуют сайленсинг генов (см. Sharp et al., (2000) Science 287:2431) или другие нетранслируемые РНК, такие как "направляющие" РНК (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; патент США № 5869248, выданный на имя Yuan et al.) и т.п.

[00394] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может дополнительно также содержать трансген, который кодирует репортерный полипептид (например, фермент, такой как зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза). В некоторых вариантах реализации трансген, который кодирует репортерный белок, полезный для экспериментальных или диагностических целей, выбирают из любого из: β-лактамазы, β-галактозидазы (LacZ), щелочной фосфатазы, тимидинкиназы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), люциферазы и других, хорошо известных в данной области. В некоторых аспектах синтетически продуцируемые зкДНК-векторы, содержащие трансген, кодирующий репортерный полипептид, могут использоваться для диагностических целей или в качестве маркеров активности зкДНК-вектора у субъекта, которому они вводятся.

[00395] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может содержать трансген или гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая обладает гомологией в отношении локуса на хромосоме хозяина и рекомбинируется с ним. Этот подход может быть использован для коррекции генетического дефекта в клетке-хозяине.

[00396] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, продуцируемый синтетическими способами получения, как описано в данном документе, может содержать трансген, который можно использовать для экспрессии иммуногенного полипептида у субъекта, например, для вакцинации. Трансген может кодировать любой представляющий интерес иммуноген, известный в данной области, включая, без ограничений, иммуногены вируса иммунодефицита человека, вируса гриппа, белки gag, опухолевые антигены, раковые антигены, бактериальные антигены, вирусные антигены и т.п.

D. Тестирование на успешную экспрессию генов с использованием зкДНК-вектора

[00397] Анализы, хорошо известные в данной области, могут быть использованы для проверки эффективности доставки генов синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, и могут проводиться на моделях как in vitro, так и in vivo. Специалист в данной области может оценивать включение (knock-in) или выключение (knock-out) желаемого трансгена с помощью синтетически продуцируемой зкДНК путем измерения уровней мРНК и белка желаемого трансгена (например, ПЦР с обратной транскрипцией, вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ (ИФА)). Изменения нуклеиновой кислоты с помощью синтетически продуцированной зкДНК (например, точечные мутации или делеция областей ДНК) могут быть оценены путем глубокого секвенирования геномной ДНК-мишени. В одном варианте реализации синтетически продуцируемая зкДНК содержит репортерный белок, который можно использовать для оценки экспрессии желаемого трансгена, например, путем изучения экспрессии репортерного белка с помощью флуоресцентной микроскопии или люминесцентного планшет-ридера. Для применений in vivo, анализы функции белка можно использовать для проверки функциональности данного гена и/или генного продукта, чтобы определить, успешно ли прошла экспрессия гена. Например, предполагается, что точечная мутация в гене трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), которая ингибирует способность CFTR перемещать анионы (например, Cl^-) по анионному каналу, может быть исправлена путем доставки функционального (т.е. немутированного) ген CFTR субъекту с помощью зкДНК-вектора. После введения зкДНК-вектора специалист в данной области может оценить способность анионов перемещаться по анионному каналу, чтобы определить, был ли ген CFTR доставлен и экспрессирован. Специалист сможет определить лучший тест для измерения функциональности белка in vitro или in vivo.

[00398] В данном документе предусматривается, что эффекты генной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора в клетке или у субъекта продолжаться на протяжении по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 20 лет, или могут быть постоянными.

[00399] В некоторых вариантах реализации трансген в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или зкДНК-векторе, описанном в данном документе, может быть кодон-оптимизирован для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных животных, например, мыши или человека (например, гуманизированных), путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значительного числа кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах данного позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и пользовательского синтеза генов Gene Forge® фирмы Aptagen (Aptagen, Inc.) или другой общедоступной базы данных.

XI. Введение

[00400] В конкретных вариантах реализации может быть использовано более одного введения (например, два, три, четыре или более введений) для достижения желаемого уровня экспрессии гена на протяжении периодов времени различной продолжительности, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.д.

[00401] Типичные примеры способов введения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, включают пероральное, ректальное, трансмукозальное, интраназальное, ингаляционное (например, в аэрозоле), буккальное (например, сублингвальное), вагинальное, интратекальное, внутриглазное, чрескожное, интраэндотелиальное введение, внутриматочное (in utero) (или in ovo («в яйцо»)), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, интракраниальное, внутримышечное [в том числе введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу], интраплевральное, интрацеребральное и внутрисуставное), местное (например, на поверхности кожи и слизистых оболочек, в том числе поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатическое введение и т.п., а также прямую инъекцию в ткань или орган (например, в печень, глаз, скелетные мышцы, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу или головной мозг).

[00402] Введение ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может осуществляться в любое место у субъекта, включая, без ограничения, место, выбранное из группы, состоящей из мозга, скелетной мышцы гладкой мышцы, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почки, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаза. Введение синтетически продуцируемого зкДНК-вектора также может осуществляться в опухоль (например, внутрь опухоли или лимфатического узла или возле них). Наиболее подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, лечение, облегчение и/или предотвращение которого проводится, и от природы конкретного используемого зкДНК-вектора. Кроме того, зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, позволяет вводить более одного трансгена в одном векторе или нескольких зкДНК-векторах (например, коктейль зкДНК).

[00403] Введение ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, в скелетные мышцы согласно данному изобретению включает, но не ограничивается этим, введение в скелетные мышцы в конечностях (например, в плече, предплечье, бедре и/или голени), спине, шее, голове (например, язык), грудной клетки, брюшной полости, тазу/промежности и/или пальцах. Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор может быть доставлен в скелетную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечностей (необязательно, перфузии изолированной конечности - ноги и/или руки; см., например, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464), и/или прямой внутримышечной инъекции. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД)) путем перфузии конечности, необязательно, перфузии изолированной конечности (например, путем внутривенного или внутрисуставного введения). В определенных вариантах реализации ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, можно вводить без применения «гидродинамических» методов.

[00404] Введение ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, в сердечную мышцу, включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или перегородку. Синтетически продуцируемый зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как внутриаортальное введение, прямой инъекции в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или перфузии коронарной артерии. Введение в диафрагмальную мышцу может осуществляться любым подходящим способом, в том числе путем внутривенного введения, внутриартериального введения и/или внутрибрюшинного введения. Введение в гладкую мышцу может осуществляться любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. В одном варианте реализации введение может осуществляться в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладкой мышце, рядом с ней и/или на ней.

[00405] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в скелетную мышцу, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или заболевания сердца (например, заболевания периферических артерий (PAD) или застойной сердечной недостаточности).

A. Лечение ex vivo

[00406] В некоторых вариантах реализации клетки извлекают из субъекта, вводят в них ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, и затем клетки возвращают в организм субъекта. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo, с последующим введением обратно субъекту известны в данной области (см., например, патент США № 5399346; описание которого включено в данный документ в полном объеме). Альтернативно, ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в клетки от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и клетки вводят субъекту, нуждающемуся в этом.

[00407] Клетки, трансдуцированные ДНК-вектором с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, предпочтительно вводят субъекту в «терапевтически эффективном количестве» в комбинации с фармацевтическим носителем. Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или обеспечивать исцеление, при условии, что субъект получает некоторую пользу.

[00408] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может кодировать трансген (иногда называемый гетерологичной нуклеотидной последовательностью), представляющий собой любой полипептид, который желательно продуцировать в клетке in vitro, ex vivo или in vivo. Например, в отличие от использования зкДНК-векторов в способе лечения, описанном в данном документе ранее, в некоторых вариантах реализации ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть введен в культивируемые клетки, а продукт экспрессируемого гена - выделен из них, например, для получения антигенов или вакцин.

[00409] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, можно использовать как в ветеринарии, так и в медицине. Подходящие субъекты для способов доставки генов ex vivo, как описано выше, включают как птиц (например, кур, уток, гусей, перепелов, индеек и фазанов), так и млекопитающих (например, людей, крупный рогатый скот, овец, козьих, лошадиных, кошачьих, собачьих и зайцеобразных), причем млекопитающие являются предпочтительными. Люди являются наиболее предпочтительными субъектами. Люди включают новорожденных, детей, подростков и взрослых.

[00410] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу доставки трансгена в клетку. Как правило, в способах in vitro ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть введен в клетку с использованием способов, раскрытых в данном документе, а также других способов, известных в данной области. Раскрытый в данном документе ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в клетку in vivo (например, субъекту), то биологически эффективное количество указанного зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для обеспечения трансдукции и экспрессии указанного трансгена в клетке-мишени.

Б. Диапазоны доз

[00411] Анализы in vivo и/или in vitro, необязательно, можно использовать для определения оптимальных диапазонов доз для использования синтетически продуцируемого зкДНК-вектора. Точная доза для использования в композиции будет также зависеть от пути введения и серьезности состояния и должна определяться по решению специалиста в данной области техники и с учетом обстоятельств каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на животных моделях.

[00412] ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, вводят в количествах, достаточных для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, описанные выше в разделе «Введение», такие как прямая доставка в выбранный орган (например, интрапортальная доставка в печень), пероральная доставка, ингаляция (в том числе интраназальная и внутритрахеальная), интраокулярная, внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриопухолевая доставка; и другие пути парентерального (parental) введения. Пути введения могут быть скомбинированы, при желании.

[00413] Доза количества синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, необходимого для достижения определенного «терапевтического эффекта», будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничений: путь введения нуклеиновой кислоты, уровень экспрессии гена или РНК, необходимый для достижения терапевтического эффекта, конкретного заболевания или расстройства, лечение которого проводится, и стабильности гена (генов), продукта (продуктов) РНК или итогового экспрессируемого белка (белков). Специалист в данной области может легко определить диапазон доз синтетически продуцируемого зкДНК-вектора для лечения пациента с конкретным заболеванием или расстройством на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов, которые хорошо известны в данной области.

[00414] Режим дозирования может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, олигонуклеотид можно вводить неоднократно, например, ежедневно может вводиться несколько доз, или доза может быть пропорционально снижена с учетом диктуемой терапевтической ситуацией необходимости. Специалист в данной области техники легко сможет определить подходящие дозы и схемы введения олигонуклеотидов по данному изобретению, как для введения в клетки, так и для введения субъектам.

[00415] «Терапевтически эффективная доза» будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен с помощью клинических испытаний, и будет зависеть от конкретного применения (нервные клетки потребуют очень небольших количеств, в то время как системные инъекции потребуют больших количеств). Например, для прямой инъекции in vivo в скелетную или сердечную мышцу человека величина терапевтически эффективной дозы будет составлять от примерно 1 мкг до 100 г зкДНК-вектора. Если для доставки ДНК-вектора, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, используются экзосомы или микрочастицы, то терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально, но ожидается, что она должна доставить от 1 мкг до примерно 100 г вектора. Кроме того, терапевтически эффективная доза представляет собой такое количество зкДНК-вектора, которое экспрессирует достаточное количество трансгена для воздействия на субъекта, приводящее к уменьшению одного или нескольких симптомов заболевания, но не затрагивающее в значительной степени нецелевые области или создающее значительные нежелательные побочные эффекты.

[00416] Составление композиций фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителей хорошо известно специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения для использования конкретных композиций, описанных в данном документе, в различных схемах лечения.

[00417] Для трансфекции in vitro эффективное количество ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, для доставки в клетки (1×10⁶ клеток) будет составлять порядка 0,1-100 мкг зкДНК-вектора, предпочтительно, от 1 до 20 мкг, и более предпочтительно - от 1 до 15 мкг или от 8 до 10 мкг. Большие по размеру зкДНК-векторы потребуют более высоких доз. Если используются экзосомы или микрочастицы, эффективная доза in vitro может быть определена экспериментально, однако она должна обеспечивать доставку, в общем, такого же количества зкДНК-вектора.

[00418] Лечение может включать введение разовой дозы или нескольких доз. В некоторых вариантах реализации субъекту можно вводить более одной дозы; фактически, при необходимости можно вводить многократные дозы, поскольку синтетически продуцируемый зкДНК-вектор не вызывает у хозяина иммунного ответа против капсида из-за отсутствия вирусного капсида, а его композиция не содержит нежелательных клеточных загрязнений из-за его синтетического способа получения. Таким образом, специалист в данной области может легко определить подходящее количество доз. Количество вводимых доз может составлять, например, порядка 1-100, предпочтительно 2-20 доз.

[00419] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, укажем, что отсутствие типичного противовирусного иммунного ответа, вызванного введением синтетически продуцируемого зкДНК-вектора, как описано в данном изобретении (т.е. отсутствие капсидных компонентов), позволяет неоднократно вводить синтетически продуцируемый зкДНК-вектор хозяину. В некоторых вариантах реализации число введений гетерологичной нуклеиновой кислоты субъекту находится в диапазоне от 2 до 10 раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). В некоторых вариантах реализации синтетически продуцируемый зкДНК-вектор доставляется субъекту более 10 раз.

[00420] В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в течение календарного дня (например, за 24-часовой период). В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за 2, 3, 4, 5, 6 или 7 календарных дней. В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за календарную неделю (например, 7 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в две недели (например, один раз на протяжении двух календарных недель). В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за календарный месяц (например, один раз на протяжении 30 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за шесть календарных месяцев. В некоторых вариантах реализации дозу синтетически продуцируемого зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в течение календарного года (например, 365 дней или 366 дней в високосном году).

C. Единичные лекарственные формы

[00421] В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма, как правило, будет адаптирована к одному или нескольким конкретным путям введения фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения путем ингаляции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью генератора аэрозоля. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения, для трансбуккального введения или для сублингвального введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, обычно представлено таким количеством указанного соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.

XII. Различные применения

[00422] Композиции и ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая зкДНК-векторы, полученные с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, можно использовать для доставки трансгена с различными целями, как описано выше. В некоторых вариантах реализации трансген может кодировать белок или представлять собой функциональную РНК, а в некоторых вариантах реализации может представлять собой белок или функциональную РНК, которая модифицирована для исследовательских целей, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей одну или несколько мутаций или исправленную последовательность гена, например, для изучения функции гена-мишени. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК для создания животной модели заболевания.

[00423] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, облегчения или предотвращения болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Трансген, экспрессируемый синтетически продуцируемым зкДНК-вектором, вводят пациенту в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с аномальной последовательностью генов, которая может привести к чему-то одному или нескольким из следующего: снижение экспрессии, отсутствие экспрессии или нарушение функции гена-мишени.

[00424] В некоторых вариантах реализации ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, предназначен для использования в способах диагностики и скрининга, в результате которого трансген транзиентно или стабильно экспрессируется в системе клеточной культуры или, альтернативно, в модели трансгенного животного.

[00425] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, обеспечивает способ трансдукции популяции клеток млекопитающих. В общем и широком смысле способ включает, по меньшей мере, стадию введения в одну или несколько клеток популяции композиции, которая содержит эффективное количество одной или нескольких синтетически продуцируемых зкДНК, раскрытых в данном документе.

[00426] Кроме того, данное изобретение предлагает композиции, а также терапевтические и/или диагностические наборы, которые включают один или несколько раскрытых ДНК-векторов с замкнутыми концами, включая композицию зкДНК-вектора, полученного с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, составленную с одним или несколькими дополнительными ингредиентами, или приготовленную в соответствии с одной или несколькими инструкциями по их применению.

[00427] Клетка для введения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть любого типа, включая, без ограничений, нервные клетки (включая клетки периферической и центральной нервной системы, в частности, клетки головного мозга), клетки легкого, клетки сетчатки, эпителиальные клетки (например, клетки кишечного и респираторного эпителия), мышечные клетки, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая островковые клетки), клетки печени, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, зародышевые клетки и т.п. Альтернативно, клетка может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы, клетка может быть стволовой клеткой (например, нервной стволовой клеткой, стволовой клеткой печени). В качестве еще одной альтернативы клетка может быть раковой или опухолевой клеткой. Кроме того, указанные клетки могут происходить из любого вида, как указано выше.

[00428] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих пунктов:

1. Способ получения ДНК-вектора, включающий:

введение в контакт двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего:

экспрессионную кассету;

ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты;

ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты;

и по меньшей мере два сайта эндонуклеазы рестрикции, фланкирующие ITR, так чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к экспрессионной кассете,

с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые могут расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в сайтах эндонуклеазы рестрикции, чтобы вырезать последовательности между сайтами эндонуклеазы рестрикции из ДНК-конструкта; и

лигирование 5'- и 3'-концов вырезанной последовательности с образованием ДНК-вектора, причем по меньшей мере один ITR представляет собой модифицированный ITR.

2. Способ по п. 1, в котором двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.

3. Способ по любому из пп. 1-2, в котором ITR слева от экспрессионной кассетой представляет собой ITR дикого типа.

4. Способ по п. 3, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1, 2 или 5-14.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором ITR справа от экспрессионной кассеты представляет собой модифицированный ITR.

6. Способ по п. 5, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 3.

7. Способ по любому из пп. 1-2, в котором ITR слева от экспрессионной кассеты представляет собой модифицированный ITR.

8. Способ по п. 7, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4.

9. Способ по любому из пп. 7-8, в котором ITR справа от экспрессионной кассеты представляет собой ITR дикого типа.

10. Способ по п. 9, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором ITR является репликационно-компетентным.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором ITR представляет собой ITR ААВ.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором экспрессионная кассета содержит цис-регуляторный элемент.

14. Способ по п. 13, в котором цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из посттранскрипционного регуляторного элемента и поли(А)-сигнала BGH.

15. Способ по п. 14, в котором посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.

17. Способ по п. 16, в котором указанная экспрессионная кассета содержит полинуклеотиды SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 123 или SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором указанная экспрессионная кассета дополнительно содержит экзогенную последовательность.

19. Способ по пп. 1-18, в котором экзогенная последовательность содержит по меньшей мере 2000 или 5000 нуклеотидов.

20. Способ по п. 19, в котором экзогенная последовательность кодирует белок.

21. Способ по п. 20, в котором экзогенная последовательность кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором ДНК-вектор имеет линейную и непрерывную структуру.

23. ДНК-вектор, получаемый способом по любому из пп. 1-22.

24. Фармацевтическая композиция, содержащая: ДНК-вектор по п. 23; и, необязательно, эксципиент.

25. Полинуклеотид для генерирования ДНК-вектора, содержащий:

экспрессионную кассету;

ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты;

ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты;

и по меньшей мере два сайта эндонуклеазы рестрикции, фланкирующие ITR таким образом, чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к экспрессионной кассете, причем по меньшей мере один ITR представляет собой модифицированный ITR.

26. Полинуклеотид по п. 25, в котором полинуклеотид представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или молекулу линейной двухцепочечной ДНК.

27. Полинуклеотид по любому из пп. 25-26, в котором ITR слева от экспрессионной кассеты представляет собой ITR дикого типа.

28. Полинуклеотид по п. 27, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 2.

29. Полинуклеотид по любому из пп. 25-28, в котором ITR справа от экспрессионной кассеты представляет собой модифицированный ITR.

30. Полинуклеотид по п. 29, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 3.

31. Полинуклеотид по любому из пп. 25-26, в котором ITR слева от экспрессионной кассеты представляет собой модифицированный ITR.

32. Полинуклеотид по п. 31, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4.

33. Полинуклеотид по любому из пп. 31-32, в котором ITR справа от экспрессионной кассеты представляет собой ITR дикого типа.

34. Полинуклеотид по п. 33, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.

35. Полинуклеотид по любому из пп. 25-34, в котором ITR дикого типа является репликационно компетентным.

36. Полинуклеотид по любому из пп. 25-35, в котором ITR представляет собой ITR ААВ.

37. Полинуклеотид по любому из пп. 25-36, в котором экспрессионная кассета содержит цис-регуляторный элемент.

38. Полинуклеотид по п. 37, в котором цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из посттранскрипционного регуляторного элемента и поли(А)-сигнала BGH.

39. Полинуклеотид по п. 38, в котором посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

40. Полинуклеотид по любому из пп. 25-39, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.

41. Полинуклеотид по п. 40, в котором указанная экспрессионная кассета содержит полинуклеотиды SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 123 или SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

42. Полинуклеотид по любому из пп. 25-41, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит экзогенную последовательность.

43. Полинуклеотид по п. 42, в котором экзогенная последовательность содержит по меньшей мере 5000 нуклеотидов.

44. Полинуклеотид по п. 43, в котором экзогенная последовательность кодирует белок.

45. Полинуклеотид по п. 44, в котором экзогенная последовательность кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

46. Полинуклеотид по любому из пп. 25-45, в котором ДНК-вектор имеет линейную и непрерывную структуру.

47. Способ получения ДНК-вектора, включающий:

синтез одноцепочечной молекулы, содержащей, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

последовательность шпильки;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR;

образование шпилечного полинуклеотида из одноцепочечной молекулы;

и лигирование 5'- и 3'-концов с образованием ДНК-вектора, причем по меньшей мере один (one at least one) ITR представляет собой модифицированный ITR.

48. Способ по п. 47, в котором указанный первый ITR представляет собой ITR дикого типа.

49. Способ по п. 48, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 2.

50. Способ по любому из пп. 47-49, в котором указанный второй ITR представляет собой модифицированный ITR.

51. Способ по п. 50, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 3.

52. Способ по п. 47, в котором левый первый ITR представляет собой модифицированный ITR .

53. Способ по п. 52, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4.

54. Способ по любому из пп. 52-53, в котором указанный второй ITR представляет собой ITR дикого типа.

55. Способ по п. 54, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.

56. Способ по любому из пп. 47-55, в котором ITR дикого типа является репликационно компетентным.

57. Способ по любому из пп. 47-56, в котором ITR представляет собой ITR ААВ.

58. Способ по любому из пп. 47-57, в котором экспрессионная кассета содержит цис-регуляторный элемент.

59. Способ по пункту 58, в котором цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из посттранскрипционного регуляторного элемента и поли(A)-сигнала BGH.

60. Способ по п. 59, в котором посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

61. Способ по любому из пп. 47-60, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.

62. Способ по п. 61, в котором указанная экспрессионная кассета содержит полинуклеотиды SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 123 или SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

63. Способ по любому из пп. 47-62, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит экзогенную последовательность.

64. Способ по п. 63, в котором экзогенная последовательность содержит по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

65. Способ по п. 63, в котором экзогенная последовательность кодирует белок.

66. Способ по п. 65, в котором экзогенная последовательность кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

67. Способ по любому из пп. 47-66, в котором ДНК-вектор имеет линейную и непрерывную структуру.

68. ДНК-вектор, полученный способом по любому из пп. 47-67.

69. Фармацевтическая композиция, содержащая:

ДНК-вектор по п. 68; и

необязательно, эксципиент.

70. Способ получения ДНК-вектора, включающий:

синтез первой одноцепочечной молекулы ITR, содержащей первый ITR;

синтез второй одноцепочечной молекулы ITR, содержащей второй ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первой молекулы ITR с первым концом двухцепочечной молекулы и лигирование 5'- и 3'-концов второй молекулы ITR со вторым концом двухцепочечной молекулы с образованием ДНК-вектора.

71. Способ по п. 70, в котором двухцепочечный полинуклеотид получают путем вырезания двухцепочечной молекулы из двухцепочечного ДНК-конструкта.

72. Способ по любому из пп. 70-71, в котором первый ITR представляет собой ITR дикого типа.

73. Способ по п. 72, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 2.

74. Способ по любому из пп. 70-73, в котором второй ITR представляет собой модифицированный ITR.

75. Способ по п. 74, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 3.

76. Способ по любому из пп. 70-71, в котором левый первый ITR представляет собой модифицированный ITR.

77. Способ по п. 76, в котором модифицированный ITR содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 4.

78. Способ по любому из пп. 76-77, в котором второй ITR представляет собой ITR дикого типа.

79. Способ по п. 78, в котором ITR дикого типа содержит полинуклеотид SEQ ID NO: 1.

80. Способ по любому из пп. 70-79, в котором ITR дикого типа является репликационно компетентным.

81. Способ по любому из пп. 70-80, в котором ITR представляет собой ITR ААВ.

82. Способ по любому из пп. 70-81, в котором экспрессионная кассета содержит цис-регуляторный элемент.

83. Способ по п. 82, в котором цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из посттранскрипционного регуляторного элемента и поли(A)-сигнала BGH.

84. Способ по п. 83, в котором посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

85. Способ по любому из пп. 70-84, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1 и промотора EF1a.

86. Способ по пп. 70-85, в котором указанная экспрессионная кассета содержит полинуклеотиды SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 123 или SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

87. Способ по любому из пп. 70-86, в котором экспрессионная кассета дополнительно содержит экзогенную последовательность.

88. Способ по пп. 70-87, в котором экзогенная последовательность содержит по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

89. Способ по п. 88, в котором экзогенная последовательность кодирует белок.

90. Способ по п. 88, в котором экзогенная последовательность кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

91. Способ по любому из пп. 70-90, в котором ДНК-вектор имеет линейную и непрерывную структуру.

92. ДНК-вектор, полученный способом по любому из пп. 70-91.

93. Фармацевтическая композиция, содержащая: ДНК-вектор по п. 92; и

необязательно, эксципиент.

94. Способ по любому из пп. 1-22, 47-67 и 70-91, в котором стадия лигировании включает химическое лигирование.

95. Способ по любому из пп. 1-22, 47-67 и 70-91, в котором стадия лигирования включает лигирование с компетентным по лигированию белком.

96. Способ по п. 95, в котором компетентным по лигированию белком является Rep ААВ.

97. Способ по любому из пп. 1, 25, 47 и 70, в котором ITR выбирают из пары ITR, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109 и SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 114; и SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 116, или любой из SEQ ID NO: 1-48, SEQ ID NO: 165-187 или из последовательностей, перечисленных в любой из Таблиц 2, 4A, 4B или 5.

98. Выделенный ДНК-вектор, полученный или получаемый способом, включающим стадии одного из (or) способов, раскрытых в данном документе.

99. Выделенный ДНК-вектор, полученный способом, включающим стадии по любому из пп. 1-22.

100. Выделенный ДНК-вектор, получаемый способом, включающим этапы по любому из пп. 1-22.

101. Выделенный ДНК-вектор, полученный способом, включающим стадии по любому из пп. 47-67.

102. Выделенный ДНК-вектор, получаемый способом, включающим стадии по любому из пп. 47-67.

103. Выделенный ДНК-вектор, полученный способом, включающим стадии по любому из пп. 70-96.

104. Выделенный ДНК-вектор, получаемый способом, включающим стадии по любому из пп. 70-96.

105. Генетическое лекарственное средство, содержащее выделенный ДНК-вектор, как раскрыто в данном документе.

106. Генетическое лекарственное средство, содержащее выделенный ДНК-вектор по любому из пп. 23-46.

107. Генетическое лекарственное средство, содержащее выделенный ДНК-вектор по любому из пп. 97-103.

ПРИМЕРЫ

[00429] Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисту в данной области будет понятно, что ДНК-вектор, включая зкДНК-вектор, полученный с использованием способа синтеза, описанного в данном документе, может быть сконструирован с любыми конфигурациями симметричных или асимметричных ITR, включая любые из ITR дикого типа или модифицированных ITR, как описано в данном документе, и что приведенные далее примеры способов могут быть использованы для конструирования и оценки активности таких зкДНК-векторов. Несмотря на то, что способы иллюстрируются конкретными зкДНК-векторами, они применимы к любому ДНК-вектору, включая любой зкДНК-вектор в соответствии с описанием.

Пример 1. Конструирование зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых

[00430] В целях сравнения в Примере 1 описано получение зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых и матрицы полинуклеотидного конструкта, который также описан в Примере 1 PCT/US18/49996, включенной в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению в соответствии с Примером 1, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. Не ограничиваясь теорией, в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ITR и экспрессионный конструкт, причем по меньшей мере один из ITR модифицирован относительно последовательности ITR дикого типа, реплицируется для получения зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезание («спасение») матрицы из основной цепи матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) посредством белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованная репликация вырезанного зкДНК-вектора.

[00431] Продуцирование зкДНК-векторов в способе с использованием клеток насекомых проиллюстрировано на примере зкДНК-плазмиды, как описано в данном документе. На Фиг. 1А и 1В матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает в себя как левый модифицированный ITR, так и правый модифицированный ITR, со следующими последовательностями между ITR: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования для трансгена; (iii) элемент посттранскрипционного ответа (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA)). Уникальные сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции (R1-R6) (показанные на Фиг. 1A и Фиг. 1B) также были введены между всеми компонентами, чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) встраивают в сайт клонирования для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду pFastBac HT B, полученную от ThermoFisher Scientific.

[00432] Продуцирование зкДНК-бакмид:

[00433] Компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) трансформировали либо тестируемыми, либо контрольными плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бакмиды отбирали путем скрининга с положительной селекцией на основе сине-белого скрининга в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG с антибиотиками для селекции трансформантов и поддержания бакмид и транспозазных плазмид. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, отбирали и культивировали в 10 мл среды.

[00434] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды были выделены из E.coli и трансфицированы в клетки насекомых Sf9 или Sf21 с использованием FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Прилипшие клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах Т25 при 25 °С. Через четыре дня культуральную среду (содержащую вирус Р0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр 0,45 мкм, отделяя частицы инфекционного бакуловируса от клеток или клеточного дебриса.

[00435] Необязательно, первое поколение бакуловируса (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки поддерживали в суспензионных культурах в орбитальном шейкере-инкубаторе при 130 об/мин при 25 °С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигнут диаметра 18-19 нм (по сравнению с диаметром наивных клеток, равным 14-15 нм) и плотности ок. 4.0E+6 клеток/мл. Между 3 и 8 днями после инфицирования частицы бакуловируса P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, затем фильтровали через фильтр 0,45 мкм.

[00436] Собирали зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. Конкретнее, четыре ×20 мл клеточные культуры Sf9 при 2.5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27 °С. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток каждый день в течение 4-5 дней.

[00437] «Rep-плазмиду» продуцировали в экспрессионном векторе pFASTBAC^TM-Dual (ThermoFisher), включающем как Rep78 (SEQ ID NO: 131 или 133) или Rep68 (SEQ ID NO: 130), так и Rep52 (SEQ ID NO: 132) или Rep40 (SEQ ID NO: 129). Rep-плазмиду трансформировали в компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Для образования рекомбинантных бакмид («Rep-бакмид») индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бакмиды отбирали с помощью положительной селекции, которая включала сине-белый скрининг в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бактерицидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Выделенные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл среды для селекции (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне Луриа–Бертани (LB)). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E.coli, и Rep-бакмиды трансфицировали в клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.

[00438] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дней, и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21, и культивировали в 50-500 мл среды. Между 3 и 8 днями после инфицирования частицы бакуловируса P1 в среде собирали либо путем отделения клеток центрифугированием, либо фильтрацией, либо с использованием другого способа фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. Конкретнее, четыре ×20 мл клеточные культуры Sf9 при 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток, каждый день в течение 4-5 дней.

[00439] Получение и характеризация зкДНК-вектора

[00440] Среду для культивирования клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду, либо зкДНК-бакуловирус, и (2) Rep-бакуловирус, описанный выше, добавляли затем к свежей культуре клеток Sf9 (2.5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25 °С. Через 4-5 дней после коинфекции определяли диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности ок. 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и клеточные осадки собирали. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - либо воды, либо буфера. зкДНК-вектор выделяли и очищали от клеток с использованием протокола очистки Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, обработка 0,2 мг массы клеточного осадка на колонку).

[00441] Значения выхода зкДНК-векторов, продуцированных и очищенных из клеток насекомых Sf9, первоначально определяли на основании УФ-поглощения при 260 нм. Оценка зкДНК-векторов на предмет правильной конфигурации с замкнутыми концами может быть проведена с использованием электрофоретической методологии, описанной в Примере 5.

ПРИМЕР 2: Получение зкДНК путем вырезания из двухцепочечной молекулы ДНК

[00442] Один типичный пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода предусматривает вырезание двухцепочечной молекулы ДНК. Вкратце, зкДНК-вектор может быть получен с использованием двухцепочечного ДНК-конструкта, например, см. Фиг. 7A-8E. В некоторых вариантах реализации двухцепочечный конструкт ДНК представляет собой зкДНК-плазмиду, например, см., например, Фиг. 6 в международной патентной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.).

[00443] В некоторых вариантах реализации конструкт для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе.

[00444] В иллюстративных целях, в Примере 3 описано продуцирование зкДНК-векторов на примере ДНК-векторов с замкнутыми концами, получаемых с использованием этого способа. Однако, хотя зкДНК-векторы описаны в этом Примере в качестве примера, чтобы проиллюстрировать in vitro синтетические способы продуцирования для получения ДНК-вектора с замкнутыми концами путем вырезания двухцепочечного полинуклеотида, содержащего ITR и экспрессионную кассету (например, последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты), с последующим лигированием свободных 3'- и 5'-концов, как описано в данном документе, специалисту в данной области известно, что, как показано выше, можно модифицировать двухцепочечную полинуклеотидную молекулу ДНК таким образом, чтобы получить любой желаемый ДНК-вектор с замкнутыми концами. включая, без ограничений, ДНК с утолщенными концами (doggybone), гантелеобразную (dumbbell) ДНК и т.п. Примеры ДНК-векторов, которые могут быть получены с помощью синтетического способа получения, описанного в Примере 3, описаны в разделах, озаглавленных «II D. ДНК-векторы, продуцируемые с использованием синтетического способа получения», «III. зкДНК-векторы в целом» и «IV. Типичные примеры зкДНК-векторов».

[00445] Способ включает (I) вырезание последовательности, кодирующей экспрессионную кассету, из двухцепочечного конструкта ДНК, и (II) образование шпилечных структур в одном или нескольких из ITR, и (III) соединение свободных 5'- и 3'-концов путем лигирования, например, с помощью ДНК-лигазы Т4.

[00446] Двухцепочечный ДНК-конструкт содержит, в порядке от 5' к 3': первый сайт эндонуклеазы рестрикции; левый ITR; экспрессионную кассету; правый ITR; и второй сайт эндонуклеазы рестрикции. Затем двухцепочечный конструкт ДНК вводят в контакт с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции для генерирования двухцепочечных разрывов в обоих сайтах эндонуклеазы рестрикции. Оба сайта могут быть мишенями одной эндонуклеазы, или на каждый сайт могут быть нацелена отдельная эндонуклеаза, при условии, что сайты рестрикции не входят в матрицу зкДНК-вектора. В результате этого происходит вырезание последовательности между сайтами эндонуклеаз рестрикции из остальной части двухцепочечного ДНК-конструкта (см. Фиг. 9). После лигирования образуется ДНК-вектор с замкнутыми концами.

[00447] Один или оба из ITR, используемых в указанном способе, могут представлять собой ITR дикого типа. Также могут использоваться модифицированные ITR, причем модификация может включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов из ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C' (см., например, Фиг. 6-8 и 10), и может иметь две или более петли для шпилек (см., например, Фиг. 6-8) или одну петлю шпильки (см., например, Фиг. 10A-10B). Модифицированный ITR со шпилечной петлей может быть получен путем генетической модификации существующего олигонуклеотида или путем биологического и/или химического синтеза de novo.

[00448] В неограничивающем примере, левый и правый ITR-6, представленные на Фиг. 10A-10B (SEQ ID NO: 111 и 112), включают делеции 40 нуклеотидов в плечах B-B' и C-C' по сравнению с ITR ААВ2 дикого типа. Прогнозируется, что нуклеотиды, оставшиеся в модифицированном ITR, образуют структуру единичной шпильки. Свободная энергия Гиббса разворачивания структуры составляет примерно -54,4 ккал/моль. Также могут быть выполнены другие модификации ITR, включая необязательную делецию функционального сайта связывания Rep или сайта Trs.

ПРИМЕР 3: Продуцирование зкДНК посредством конструирования олигонуклеотидов

[00449] Представлен другой пример метода получения зкДНК-вектора с использованием синтетического способа, который включает сборку различных олигонуклеотидов. В этом примере зкДНК-вектор получают путем синтеза 5'-олигонуклеотида и олигонуклеотида 3'-ITR и лигирования олигонуклеотидов ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. На Фиг. 11B продемонстрирован пример способа лигирования олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету.

[00450] В иллюстративных целях, в Примере 3 описано получение зкДНК-векторов в качестве примера ДНК-векторов с замкнутыми концами, получаемых с использованием этого метода. Однако, хотя в данном Примере представлены зкДНК-векторы в качестве примера, иллюстририрующего in vitro синтетические способы получения ДНК-вектора с замкнутыми концами путем лигирования ITR-олигонуклеотидов с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету (например, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты), как описано в данном документе, специалисту в данной области известно, что можно, как продемонстрировано выше, модифицировать параметры способа таким образом, чтобы получить любой желаемый ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая, без ограничений, ДНК с утолщенными концами (doggybone), гантелеобразную (dumbbell) ДНК и т.п. Примеры ДНК-векторов, которые могут быть получены с помощью синтетического способа получения, описанного в Примере 3, описаны в разделах, озаглавленных «II D. ДНК-векторы, продуцируемые с использованием синтетического способа получения», «III. зкДНК-векторы в целом» и «IV. Типичные примеры зкДНК-векторов».

[00451] Олигонуклеотиды ITR могут быть получены любым методом синтеза ДНК (например, методом синтеза ДНК in vitro) и представлены в виде линейных молекул со свободным 5'-концом и свободным 3'-концом. Олигонуклеотиды ITR могут образовывать вторичные структуры со спаренными основаниями (например, структуры стебель-петля или шпильки), но первичная структура представляет собой линейную одноцепочечную молекулу. В Таблице 7 представлены типичные олигонуклеотиды ITR, которые можно лигировать с 5' и 3' концами двухцепочечного ДНК-конструкта, как показано на Фиг. 11.

[00452] Таблица 7

Синтетический ITR-олигонуклеотид Синтетический ITR-олигонуклеотид SEQ ID NO: WT-L-oligo-1 ctAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGC 134 Распознавание AvrII, размещенное в стебле, для восстановления сайтов связывания rep, при необходимости WT-L-oligo-2 ctaggACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTc 135 Сайт распознавания AvrII расположен в конце стебля WT-R-oligo-3 ggACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTcctgca 136 Сайт распознавания Sbf1 расположен в конце стебля MU-R-oligo-1 GtgCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGcaCTCA 137 Распознавание DraIII, размещенное в стебле, для восстановления сайтов связывания rep, при необходимости MU-R-oligo-2 ggACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTcctgca 138 Сайт распознавания Sbf1 расположен в конце стебля MU-L-oligo-3 ctaggACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTc 139 Сайт распознавания AvrII расположен в конце стебля MU-L-oligo-4 ggACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTcctgca 140 Сайт распознавания Sbf1 расположен в конце стебля [dITR R] MU-L-oligo-5 ctaggACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTc 141 Сайт распознавания AvrII расположен в конце стебля [dITR L] MU-R-oligo-6 ggACTGAGGCCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGCCTCAGTcctgca 142 Сайт распознавания Sbf1 расположен в конце стебля [FL R ITR] FBGR-sense-1 atacctaggcacgcgtgttactagttattaatagtaatcaattacgg 143 3NT выступ-AvrII-5'-смысловой (38 п.о., Tпл. 60C)-праймер FBGR-sense-2 tt
atacctaggggccgcacgcgtgttactag 144 3NT выступ-AvrII-5'-смысловой (20 п.о., Tпл. 62C)-праймер FBGR-as-1 AtaCactcagtgcctgcaggcacgtggtccggagatccagac 145 3NT выступ-DraIII-SbfI-3'-антисмысловой (22 п.о., Tпл. 62C)-праймер

[00453] Как раскрыто в данном документе, олигонуклеотиды ITR могут содержать WT-ITR (например, см. Фиг. 6A, Фиг. 6В), или модифицированные ITR (например, см. Фиг. 7А и Фиг. 7В). Модифицированные ITR могут включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C'. Олигонуклеотиды ITR, содержащие WT-ITR или модифицированные ITR (mod-ITR), как описано в данном документе, для использования в бесклеточном синтезе, могут быть получены путем генетической модификации или биологического и/или химического синтеза. Как было указано в данном описании, олигонуклеотиды ITR в Примерах 2 и 3 могут содержать WT-ITR, или модифицированные ITR (mod-ITR) в симметричных или асимметричных конфигурациях, как обсуждалось в данном документе.

[00454] В процессе синтеза, один или несколько сайтов эндонуклеазы рестрикции могут быть введены в область стебля ITR. На Фиг. 6А-7Е представлены типичные примеры последовательностей и структур олигонуклеотидов ITR, включая варианты реализации с включенными сайтами эндонуклеаз рестрикции.

[00455] Двухцепочечный полинуклеотид, содержащий экспрессионную кассету, представлен в виде линейной молекулы со свободными 5'- и 3'-концами на каждой цепи. Двухцепочечный полинуклеотид может быть получен путем синтеза ДНК, сборки цепи методом ПЦР или вырезания такой молекулы из плазмиды или другого вектора. См., например, Фиг. 11В.

[00456] Затем двухцепочечный полинуклеотид вводят в контакт с олигонуклеотидами 5' и 3'-ITR, либо последовательно, либо одновременно, и олигонуклеотиды ITR лигируют с двухцепочечным полинуклеотидом с образованием зкДНК-вектора. Проводят стандартную реакцию лигирования, например, с использованием ДНК-лигазы Т4.

[00457] В некоторых вариантах, таких как продемонстрированные на Фиг. 11B, олигонуклеотиды ITR и двухцепочечный полинуклеотид могут быть снабжены комплементарными выступами и их концами и/или расщеплены одной и той же эндонуклеазой рестрикции для обеспечения комплементарных выступов. Также может быть выполнено лигирование тупых концов.

[00458] Сборка молекул может проводиться постадийно. Например, олигонуклеотиды отжигают с последующим лигированием отожженных двухцепочечных олигонуклеотидов друг с другом. Для отжига двух цепей олигонуклеотидов, указанные олигонуклеотиды смешивают в равных молярных количествах в подходящем буфере: например, 100 мМ ацетата калия; 30 мМ HEPES, рН 7,5, и нагревают до 94 °С в течение 2 минут и постепенно охлаждают. Для олигонуклеотидов без значительной вторичной структуры стадия охлаждения может заключаться в простом переносе образцов из термостата или водяной бани в условия комнатной температуры. Для олигонуклеотидов с прогнозируемой значительной вторичной структурой благоприятна более постепенная стадия охлаждения/отжига. Ее можно осуществить, поместив раствор олигонуклеотида на водяную баню или в термостат и отключив/выключив устройство. Отожженные олигонуклеотиды можно разбавить не содержащим нуклеазы буфером и хранить в двухцепочечной отожженной форме при 4 °С.

ПРИМЕР 4: Продуцирование зкДНК с использованием одноцепочечной молекулы ДНК

[00459] В другом примере способа продуцирования зкДНК-вектора с использованием синтетического метода используют одноцепочечную линейную ДНК, содержащую два смысловых ITR, фланкирующих смысловую последовательность экспрессионной кассеты, и ковалентно присоединенных к двум антисмысловым ITR, фланкирующим антисмысловую экспрессионную кассету, и концы указанной одноцепочечной линейной ДНК затем лигируют с образованием одноцепочечной молекулы с замкнутыми концами. Один неограничивающий пример включает синтез и/или продуцирование одноцепочечной молекулы ДНК, отжиг частей молекулы с образованием одной линейной молекулы ДНК, которая имеет одну или несколько областей вторичной структуры со спаренными основаниями, и затем лигирование свободных 5'- и 3'-концов друг с другом для образования замкнутой одноцепочечной молекулы.

[00460] В иллюстративных целях, в Примере 4 описано продуцирование зкДНК-векторов, в качестве типичных примеров ДНК-векторов, получаемых с использованием этого способа. Однако, хотя в данном Примере представлены зкДНК-векторы в качестве примера, иллюстририрующего in vitro синтетические способы получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, как описано в данном документе, специалисту в данной области известно, что можно, как продемонстрировано выше, модифицировать параметры способа таким образом, чтобы получить любой желаемый ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая, без ограничений, ДНК с утолщенными концами (doggybone), гантелеобразную (dumbbell) ДНК и т.п. Примеры ДНК-векторов, которые могут быть получены с помощью синтетического способа получения, описанного в Примере 3, описаны в разделах, озаглавленных «II D. ДНК-векторы, продуцируемые с использованием синтетического способа получения», «III. зкДНК-векторы в целом» и «IV. Типичные примеры зкДНК-векторов».

[00461] Типичная одноцепочечная молекула ДНК для продуцирования зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR.

[00462] Молекула одноцепочечной ДНК для использования в типичном примере способа по Примеру 4 может быть получена с использованием любой методологии синтеза ДНК, описанной в данном документе, например, синтеза ДНК in vitro, или путем расщепления конструкта ДНК (например, плазмиды) нуклеазами и плавления полученных фрагментов дцДНК с образованием фрагментов одноцепочечной ДНК (оцДНК).

[00463] Отжиг может быть осуществлен путем снижения температуры до значения ниже расчетных температур плавления пар смысловой и антисмысловой последовательностей. Температура плавления зависит от удельного содержания нуклеотидных оснований (specific nucleotide base content) и характеристик используемого раствора, например, концентрации соли. Специалист в данной области может легко рассчитать температуры плавления для любой данной комбинации последовательности и раствора.

Свободные 5'- и 3'-концы отожженной молекулы могут быть лигированы друг с другом или лигированы с молекулой шпильки с образованием зкДНК-вектора. Типичные примеры подходящих методик лигирования и молекул шпилек описаны в Примерах 2 и 3.

ПРИМЕР 5: Очистка и/или подтверждение продуцирования зкДНК

[00464] Любой из продуктов ДНК-вектора, полученных способами, описанными в данном документе, например, включая способы, описанные в Примерах 1-4, может быть очищен, например, для удаления примесей, неиспользуемых компонентов или побочных продуктов, с использованием способов, общеизвестных специалистам в данной области; и/или могут быть проанализированы для подтверждения того, что продуцируемый ДНК-вектор (в данном случае - зкДНК-вектор) является требуемой молекулой. Примером способа очистки ДНК-вектора, например, зкДНК, является использование протокола очистки Qiagen Midi Plus (Qiagen) и/или очистки на геле.

[00465] Ниже приведен типичный пример способа подтверждения идентичности зкДНК-векторов.

[00466] зкДНК-векторы могут быть оценены путем идентификации с помощью электрофореза на агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как продемонстрировано на Фиг. 4C, причем (a) наличие на денатурирующих гелях характеристических полос, мигрирующих с вдвое большим размером по сравнению с нативными гелями после расщепления эндонуклеазой рестрикции и гель-электрофоретического анализа, и (b) присутствие мономерных и димерных (2x) полос на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала является характерным признаком присутствия зкДНК-вектора.

[00467] Структуры выделенных зкДНК-векторов были дополнительно проанализированы путем расщепления очищенной ДНК эндонуклеазами рестрикции, отобранными для обеспечения а) наличия только одного сайта расщепления в зкДНК-векторах, и b) результирующих фрагментов достаточно большого размера, чтобы их можно было четко увидеть при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как продемонстрировано на Фиг. 4C и 4D, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой могут различаться по размеру их продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как для зкДНК-вектора с непрерывной структурой ожидается образование фрагментов размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00468] Таким образом, для того, чтобы качественно продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы являются ковалентно замкнутыми, как это требуется по определению, образцы расщепляли эндонуклеазой рестрикции, идентифицированной, в контексте специфической последовательности ДНК-вектора, как имеющая один сайт рестрикции, предпочтительно, приводя к образованию двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза в денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК) линейная не-ковалентно замкнутая ДНК будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., тогда как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), поскольку две цепи ДНК связаны, а теперь разворачиваются и имеют вдвое большую длину (хотя являются одноцепочечными). Кроме того, расщепление мономерной, димерной и n-мерной форм ДНК-векторов будет во всех случаях давать фрагменты одинакового размера из-за связывания мультимерных ДНК-векторов «конец-к-концу» (см. Фиг. 4C).

[00469] Используемое в данном документе выражение «анализ для идентификации ДНК-векторов с помощью электрофореза на агарозном геле в нативном геле и денатурирующих условиях» относится к анализу для оценки степени замкнутости зкДНК путем проведения расщепления эндонуклеазой рестрикции с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления.  Далее приведен один такой пример анализа, хотя рядовому специалисту в данной области будет понятно, что возможны многие варианты этого примера, известные в данной области техники.  Эндонуклеазу рестрикции выбирают так, чтобы она представляла собой фермент, создающий один разрез зкДНК-вектора, представляющего интерес, который будет генерировать продукты, имеющие длину приблизительно 1/3 и 2/3 от длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем геле.  Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen PCR или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки GE Healthcare ILUSTRA™ MicroSpin™ G-25, представляют собой некоторые из известных в данной области техники вариантов средств, используемых при расщеплении эндонуклеазами.  Анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции, 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen, элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10-кратного денатурирующего раствора (10× = 0,5 М NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10-кратного красителя, не забуференного, и анализ вместе с ДНК-маркерами молекулярного веса, полученными путем добавления 10-кратного денатурирующего раствора в 4×, в 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и прогонки геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области техники будет понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза в зависимости от размеров и желаемого времени получения результатов.  После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE или TAE и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold.  Затем полосы могут быть визуализированы, например, с применением красителя SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain фирмы Thermo Fisher (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм). Описанный выше способ на основе геля может быть адаптирован для очистки путем выделения зкДНК-вектора из гелевой полосы и обеспечения возможности его ренатурации.

[00470] Оценка чистоты полученного зкДНК-вектора может быть проведена с применением любого известного в данной области способа.  В качестве одного неограничивающего примера способа, вклад зкДНК-плазмиды в общее УФ-поглощение образца можно оценить путем сравнения интенсивности флуоресценции зкДНК-вектора со стандартом. Например, если, на основании определения УФ-поглощения, на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, то это означает присутствие 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ.  Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому полоса соответствует – например, если полный зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае составит 0,25 мкг при введении 1,0 мкг.  Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, затем рассчитывают по уравнению линейной регрессии количество полосы зкДНК-вектора, которое потом можно использовать для определения процента, приходящегося на зкДНК-вектор в общем введенном количестве, или процента чистоты.

ПРИМЕР 6: Конструирование зкДНК-векторов с использованием синтетического подхода

[00471] Следующая процедура была использована в качестве одного из примеров синтетического конструирования зкДНК-векторов, описанных в данном документе. Схематическое изображение зкДНК-вектора представлено на Фиг. 11А, где изображены ITR петли шпильки, фланкирующие кассету с представляющим интерес геном и, необязательно, промотором/энхансером, посттранскрипционным регуляторным элементом и/или последовательностью полиаденилирования. Вкратце, способ конструирования включает конструирование нескольких сегментов зкДНК-вектора с комплементарными выступающими концами ДНК для содействия правильному лигированию и правильному формированию зкДНК-вектора (см. Фиг. 11А и Фиг. 11В), с последующей очисткой для удаления нежелательных продуктов лигирования.

[00472] Более подробно, были сконструированы одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды для каждого ITR, содержащие (a) желаемую структуру ITR (например, дикого типа или мутантную), и (b) область выступа в A-стебле последовательности ITR между последовательностями В и С петли шпильки и элементом RPE, который комплементарен выступу, создаваемому при расщеплении эндонуклеазой в сайте рестрикции, встроенном в олигодезоксинуклеотид («oligo») кассеты, причем лигирование двух областей выступов является желательным. Выступы в каждом из двух олигонуклеотидов ITR обозначены как R1 и R2, соответственно, на фигурах A(B). Каждый олигонуклеотид ITR был синтезирован с использованием традиционных методов, включая очистку в геле или на колонке, с конечной концентрацией от 10 до 100 мкМ в воде, с последующим отжигом при 95 °С в течение 2 минут и быстрым охлаждением на ледяной бане. Синтезированные олигодезоксинуклеотиды для конструирования зкДНК-вектора с ITR ААВ2 дикого типа представляли собой:

[00473] Левый ITR («левый олигонуклеотид-1») (содержащий выступ R1, комплементарный выступу сайта рестрикционного расщепления AvrII):

5’CTAGGACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCСCGGCCTCAGTC3’ (SEQ ID NO: 135) и

Правый ITR («правый олигонуклеотид-2») (содержащий выступ R2, комплементарный выступу сайта рестрикционного расщепления SbfI):
5’GGACTGAGGCCGCCCGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTCCTGCA3' (SEQ ID NO:136).

[00474] Область кассеты (обозначенная как «единица экспрессии гена» на фигурах A(B)) может быть получена любым традиционным методом конструирования нуклеотидов, но в этом примере ее удобно получать с использованием плазмидной продуцирующей системы. Промотор CAG, открытая рамка считывания зеленого флуоресцентного белка (GFP), последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста и области D- и RPE ITR (вместе - SEQ ID NO: 146) были вставлены в родительскую плазмиду (SEQ ID NO: 147).

[00475] Сайты рестрикции в единице экспрессии гена и выступы на каждом из олигонуклеотидов ITR были выбраны таким образом, чтобы они облегчали специфическое лигирование олигонуклеотидов ITR с единицей экспрессии гена в правильной ориентации, благодаря комплементарности выступов. В этом конкретном примере область выступа была сконструирована в левом ITR так, чтобы она была комплементарной к 5' выступу, образующемуся при расщеплении единицы экспрессии гена с помощью AvrII. Однако, терминальные остатки левого олигонуклеотида ITR сами по себе не образуют сайта рестрикции AvrII, таким образом, фермент не расщепляет выступ. Эта же самая область олигонуклеотида образует сайт рестрикции ApaLI в случае гомодимеризации и, таким образом, ApaLI можно использовать для обеспечения расщепления нежелательных гомодимеров левого олигонуклеотида ITR и их возврата в мономерное состояние. Аналогичный подход был применен для правой ITR, причем область выступа была сконструирована комплементарной к выступу, образующемуся при расщеплении в сайте Sbf1, сконструированном на 3'-конце единицы экспрессии гена. Терминальная область олигонуклеотида правого ITR сконструирована так, чтобы она не распознавалась SbfI, а вместо этого образовывала сайт Nhe1 в случае гомодимеризации олигонуклеотидов, так чтобы гомодимеризацию можно было контролировать путем расщепления этим ферментом. Наконец, сайты рестрикции DraIII и BsaI существовали как уникальные сайты в остове исходной плазмиды и использовались для облегчения удаления нежелательного фрагмента остова. Эти различные сайты рестрикции были выбраны для удобства, и специалист в данной области техники может легко сконструировать любую комбинацию сайтов рестрикции для достижения таких же результатов, которые будут совместимы с доступными реагентами и взятыми за основу нуклеотидными конструктами.

[00476] Плазмиды, содержащие единицу экспрессии гена, использовали для трансформации E.coli, и селективное давление для поддержания плазмиды поддерживали путем включения ампициллина в среду с использованием стандартных методик. Плазмидную ДНК собирали с использованием набора для экстракции ДНК (Qiagen) и рекомендованных производителем способов очистки. Вырезание единицы экспрессии гена из плазмиды (стадия 1В, как представлено на Фиг. 12) осуществляли посредством стадии расщепления эндонуклеазой рестрикции. В реакционном объеме 100 мкл объединяли 20 пмоль исходной плазмиды с 3% каждой из трех рестриктаз AvrII, SbfI и ApaLI. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 4 часов.

[00477] Затем лигировали лигонуклеотиды ITR и сегмент ДНК единицы экспрессии гена (стадия 2 на Фиг. 12). Доводили до общего объема 400 мкл, объединяя 20 пмоль реакционной смеси расщепленной родительской плазмиды (100 мкл) со 160 пмоль каждого из левого и правого отожженных олигонуклеотидов ITR, с 10% АТФ-содержащего буфера для лигирования, 2% ДНК-лигазы Т4 и 2% каждой из указанных эндонуклеаз рестрикции: AvrII, SbfI, ApaLI, NheI. Лигаза вызывала лигирование, а ферменты AvrII и SbfI гарантировали отсутствие гомодимеризации единицы экспрессии гена, и ферменты ApaL1 и NheI гарантировали отсутствие гомодимеризации олигонуклеотидов ITR. Реакционную смесь инкубировали от 4 до 16 часов при 22 °С, после чего ДНК-лигазу Т4 инактивировали, нагревая реакционную смесь при 65 °С в течение 20 минут.

[00478] Для удаления оставшейся исходной плазмиды из реакции, смесь обрабатывали ферментами эндонуклеазы рестрикции, о которых было известно, что они разрезают только остов исходной плазмиды, но не олигонуклеотиды ITR или единицу экспрессии гена (см. стадию 3 на Фиг. 12). Соответственно, 400 мкл непосредственно предшествующей реакционной смеси объединяют с 10% рекомендованного производителем буфера рестрикционного фермента, 3% фермента эндонуклеазы рестрикции DraIII и 5% фермента эндонуклеазы рестрикции BsaI, до общего объема реакции 1 мл в воде. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 1-2 часов.

[00479] Затем удаляли нежелательные нелигированные олигонуклеотиды и оставшиеся фрагменты остова исходной плазмиды путем расщепления экзонуклеазой (стадия 4 на Фиг. 12). К 1 мл предшествующей реакции добавляли 10% рекомендованного производителем буфера для экзонуклеазной реакции, 10% АТФ (10 мМ) и 8% экзонуклеазы Т5 и достаточное количество воды, доводя общий объем реакции до 5 мл. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 1-4 часов. Экзонуклеаза Т5 расщепляет одноцепочечную ДНК, таким образом, указанный фермент расщепляет любые олигонуклеотиды или фрагменты остова с нелигированным выступом.

[00480] Реакционную смесь осаждали этанолом (стадия 5 на Фиг. 12) для концентрирования ДНК при подготовке к очистке. Весь 5 мл реакционный объем после расщепления экзонуклеазой Т5 объединяли в общем реакционном объеме >12,5 мл с 10% 3М ацетата натрия и 2,5-кратным объемом этанола. Смесь инкубировали в течение по меньшей мере 20 минут при -80 °C, а затем ДНК осаждали центрифугированием при 4 °C. Осадок промывали 70% этанолом и повторно осаждали центрифугированием. Полученный промытый осадок ДНК ресуспендировали в 1 мл воды. зкДНК-вектор очищали, используя стандартную колонку с диоксиом кремния для очистки ДНК (Zymo Research), удаляя белки и остаточные небольшие фрагменты ДНК (стадия 6 на Фиг. 12).

[00481] Образец полученного очищенного зкДНК-вектора WT/WT-ITR вводили инъекцией со стандартным лэддером и анализировали с помощью биоанализатора (Agilent Technologies), используя рекомендуемые производителем условия и набор (Agilent Technologies, набор DNA-12000). Полученная хроматограмма продемонстрирована на Фиг. 13B. Два самых больших пика соответствуют ожидаемым размерам мономерного и димерного зкДНК-вектора, и очень малые пики наблюдались при ожидаемых размерах димеров олигонуклеотидов, указывая на то, что образец в целом после конечной стадии очистки представлял собой по существу чистый зкДНК-вектор. Сводные данные для пиков на хроматограмме приведены в Таблице 8.

[00482] Таблица 8: Параметры пиков в соответствии с хроматограммой на Фиг. 13B.

Размер [п.н.] Конц. [нг/мкл] Молярность [нмоль/л] Примечания Площадь Выровненное время миграции [с] Высота пика Ширина пика % от общего Скорректированная по времени площадь 50 8,3 251,5 Нижний маркер 17,6 31,65 29,2 1,4 0 54,9 84 0,04 0,7 0,1 33,15 0,2 0,8 0,3 0,4 131 0,4 4,6 1,3 35,25 1,5 1,5 2,9 3,7 165 0,35 3,2 1,2 36,8 1,7 1,2 2,6 3,2 468 0,03 0,1 0,2 49,55 0,3 0,8 0,4 0,3 543 0,02 0,1 0,1 52 0,2 0,6 0,2 0,2 576 0,02 0,1 0,1 52,9 0,2 0,7 0,2 0,2 606 0,01 0 0 53,75 0,1 0,6 0,1 0,1 646 0,05 0,1 0,2 54,85 0,5 0,8 0,5 0,4 673 0,01 0 0,1 55,6 0,2 0,5 0,1 0,1 1352 0,11 0,1 0,7 63,05 0,8 1,4 1,5 1,1 1660 0,09 0,1 0,5 64,4 0,7 1,2 1,2 0,8 2732 0,04 0 0,2 66,75 0,3 1,1 0,5 0,3 4545 4,45 1,5 29 69 40,5 2,2 64 41,8 8543 1,74 0,3 11,4 72,1 15 2,3 25,2 15,7 11568 0,02 0 0,1 73,7 0,2 0,5 0,3 0,1 17000 4,2 0,4 Верхний маркер 26,3 75,3 27,7 2,6 0 34,7 46535 0 0 0 84 0,1 0,5 0 0,1 55701 0 0 0,3 86,7 0,4 1,2 0 0,3

[00483] Эту методологию повторяли несколько раз для различных олигонуклеотидов ITR, что приводило к синтетическому продуцированию разных зкДНК-векторов, включая WT/мутантный зкДНК-вектор, как продемонстрировано на Фиг. 14А, и асимметричный мутантный/мутантный зкДНК-вектор, как продемонстрировано на Фиг. 15А, а также альтернативные варианты зкДНК-вектора, содержащие люциферазу в кассете единицы экспрессии гена вместо зеленого флуоресцентного белка в контексте каждой из этих пар ITR. Полученные на биоанализаторе результаты для конструктов зкДНК с GFP продемонстрированы на Фиг. 14B и Фиг. 15B, соответственно, и были очень схожи с полученными для образца зкДНК-вектора WT/WT (Фиг. 13B). Таблицы с данными пиков для каждого из них приведены ниже в Таблице 9 и Таблице 10, соответственно.

[00484] Таблица 9: Параметры пиков в соответствии с хроматограммой на Фиг. 14B.

Размер [п.н.] Конц. [нг/мкл] Молярность [нмоль/л] Примечания Площадь Выровненное время миграции [с] Высота пика Ширина пика % от общего Скорректированная по времени площадь 50 8,3 251,5 Нижний маркер 15,8 31,65 25,9 1,4 0 48,6 89 0,04 0,7 0,1 33,35 0,2 1,1 0,2 0,3 143 0,17 1,8 0,5 35,79 0,7 1 0,7 1,3 166 0,35 3,2 1 36,84 1,4 1,2 1,5 2,7 281 0,02 0,1 0,1 42,08 0,1 0,6 0,1 0,1 446 0,01 0 0,1 48,66 0,1 0,6 0,1 0,1 561 0,01 0 0,1 52,5 0,2 0,6 0,1 0,1 662 0,02 0 0,1 55,3 0,2 0,6 0,1 0,1 4377 10,41 3,6 57,2 68,81 91 2 83,2 82,1 5725 0,01 0 0 70,06 0,1 0,5 0,1 0,1 8407 1,74 0,3 9,6 72,01 13,1 2,4 13,9 13,2 17000 4,2 0,4 Верхний маркер 22,2 75,3 24,3 2,6 0 29,2 29702 0 0 0,1 79,04 0,2 0,6 0 0,1

[00485] Таблица 10: Параметры пиков в соответствии с хроматограммой на Фиг. 15B.

Размер [п.н.] Конц. [нг/мкл] Молярность [нмоль/л] Примечания Площадь Выровненное время миграции [с] Высота пика Ширина пика % от общего Скорректированная по времени площадь 50 8,3 251,5 Нижний маркер 15,4 31,65 25,4 1,5 0 47,4 81 0,13 2,5 0,4 33 0,5 1,1 0,6 1,1 115 0,91 11,9 2,4 34,55 3,8 1,4 3,6 6,9 146 0,3 3,1 0,8 35,95 1,1 1,5 1,2 2,3 4091 10,19 3,8 55,3 68,5 89,6 1,8 80,8 79,7 7661 1,66 0,3 9 71,5 10 2,1 13,2 12,5 11738 0,08 0 0,4 73,75 0,6 0,8 0,6 0,6 17000 4,2 0,4 Верхний маркер 22,1 75,3 25 2,4 0 29

[00486] зкДНК-вектор (WT/мутантный), полученный традиционным методом из клеток насекомых Sf9 (Фиг. 16А), также был подвергнут анализу на биоанализаторе. Хроматограмма продемонстрировна на Фиг. 16B и, в частности, включает несколько дополнительных видов зкДНК, включая мультимерные и субмономерные пики, в большем количестве, чем наблюдаемых при анализе синтетически продуцируемых зкДНК-векторов. Как видно из сравнения данных параметров пиков в Таблицах 8-11, синтетически продуцируемые образцы содержат >65% мономерного зкДНК-вектора, и в некоторых случаях - >85% мономерного зкДНК-вектора, тогда как образец зкДНК-вектора, продуцируемого Sf9, содержл <35% мономерного зкДНК-вектора и имел многочисленные дополнительные виды зкДНК-векторов, присутствующие в образце.

[00487] Таблица 11: Данные параметров пиков, соответствующих хроматограмме, изображенной на Фиг. 16В.

Размер [п.н.] Конц. [нг/мкл] Молярность [нмоль/л] Примечания Площадь Выровненное время миграции [с] Высота пика Ширина пика % от общего Скорректированная по времени площадь 11 0 0 0,2 27,27 0,3 0,7 0 0,7 19 0 0 0,1 28,18 0,3 0,7 0 0,5 31 0 0 0,1 29,46 0,3 0,6 0 0,5 50 8,3 251,5 Нижний маркер 7,2 31,65 11,8 1,9 0 22,5 137 0,15 1,7 0,2 35,55 0,4 1 0,6 0,6 252 0,02 0,1 0 40,79 0,1 0,5 0,1 0,1 427 0,06 0,2 0,1 47,95 0,2 0,9 0,3 0,2 464 0,05 0,2 0,1 49,39 0,2 0,6 0,3 0,2 580 0,06 0,2 0,1 53,02 0,3 0,9 0,4 0,2 962 0,08 0,1 0,2 60,23 0,4 0,7 0,5 0,3 1789 2,39 2 5,9 64,72 4,2 3,4 17,6 9,3 2889 2,66 1,4 6,8 67,07 5,8 1,7 20,4 10,5 4007 4,25 1,6 11,1 68,41 10,3 1,9 33,4 16,8 6348 1,06 0,3 2,8 70,54 2,9 1,1 8,4 4,1 7985 2,01 0,4 5,3 71,72 3,2 2,4 15,9 7,7 11377 0,27 0 0,7 73,64 1,3 0,7 2,1 1 17000 4,2 0,4 Верхний маркер 10,7 75,3 12,4 2,2 0 14,7 36952 0 0 0,2 81,18 0,3 0,8 0 0,2 59080 0 0 0,1 87,7 0,2 0,5 0 0,1 65791 0 0 0,1 89,67 0,3 0,6 0 0,1 71232 0 0 0,1 91,27 0,3 0,7 0 0,1 110772 0 0 0 102,92 0,1 0,6 0 0

[00488] Чтобы гарантировать, что полученные зкДНК-векторы имеют надлежащую структуру зкДНК-векторов с ковалентно замкнутыми концами, образцы каждого из них расщепляли эндонуклеазой рестрикции, имеющей один сайт рестрикции в зкДНК-векторе, предпочтительно дающей два продукта расщепления неравного размера. После расщепления и электрофореза на денатурирующем геле линейная не-ковалентно замкнутая ДНК будет демонстрировать мигрирующие в геле полосы с размерами, соответствующими двум ожидаемым фрагментам. В отличие от этого, линейная ковалентно замкнутая ДНК (такая как зкДНК-вектор) должна иметь полосы, мигрирующие с размерами, в 2 раза большими для ожидаемых продуктов расщепления, потому что две цепи ДНК связаны и после расщепления приобретают развернутую конфигурацию и вдвое большую длину. Кроме того, расщепление любых мономерных, димерных и мультимерных форм зкДНК-вектора будет давать фрагменты одинакового размера из-за связывания таких мультимерных ДНК-векторов конец-к-концу. При оценке всех синтетических и продуцируемых Sf9 зкДНК-векторов с помощью этого гель-электрофоретического метода, каждый из образцов имел схожий паттерн полос, что указывает на то, что все зкДНК-векторы имели надлежащую структуру с ковалентно замкнутыми концами.

[00489] Специалисту в данной области будет понятно, что количества всех реагентов могут быть оптимизированы для обеспечения продуцирования желаемого количества зкДНК-вектора.

ПРИМЕР 7: зкДНК-векторы экспрессируют трансген в клетках

[00490] Чтобы оценить, способны ли синтетически продуцируемые зкДНК-векторы экспрессировать трансген аналогично зкДНК-векторам, традиционно продуцируемым в Sf9, экспрессию зкДНК-векторов в культивируемых клетках измеряли по степени продуцирования флуоресцентного белка (GFP) и эмиссии флуоресценции. Клетки печени человека (клеточная линия HepaRG, Lonza) высевали в концентрации 7,5 × 10⁴ клеток/мл. Требуемый зкДНК-вектор вводили в культивируемые клетки с использованием коммерчески доступного устройства (Nucleofector™, Lonza) в соответствии с протоколами производителя. 16-луночную полоску, содержащую 150 нг/лунку каждого конструкта, подвергали нуклеофекции в объеме 20 мкл. К подвергнутым нуклеофекции образцам добавляли 80 мкл среды в каждую лунку 96-луночного планшета до конечного объема 100 мкл в каждой лунке. Среду меняли через 24 часа после нуклеофекции, и впоследствии заменяли дважды в неделю. Плазмиду, содержащую зкДНК-вектор, изображенный на Фиг. 14А, использовали в качестве контроля. Флуоресценцию каждой культуры измеряли через 6 дней после нуклеофекции с использованием микроскопа для визуализации живых клеток Essen Bioscience IncuCyte®. Эта система расположена внутри инкубатора и автоматически делает замедленную съемку и флуоресцентные фотографии клеток на протяжении требуемого периода времени.

[00491] Результаты представлены на Фиг. 17. Экспрессия GFP проявляется в виде ярких белых пятен. Клетки, обработанные продуцируемым Sf9 зкДНК-вектором с WT/мутантным ITR, имели экспрессию GFP, схожую с наблюдаемой в клетках, обработанных плазмидой. Все три синтетически продуцируемых зкДНК-вектора (WT/WT, WT/Mut и асимметричный мутантный) продемонстрировали большую величину флуоресценции и количество пятен в анализе по сравнению с плазмидным контролем или зкДНК-вектором, продуцируемым Sf9 традиционным способом. Такое относительное увеличение флуоресценции может быть вызвано, по меньшей мере частично, большей степенью чистоты синтетически продуцируемого материала по сравнению с традиционно получаемым материалом. Результаты демонстрируют, что синтетически продуцированный зкДНК-вектор экспрессирует закодированный трансген по меньшей мере так же и, возможно, лучше, чем зкДНК-вектор, продуцируемый Sf9 традиционным способом, а также, что синтетически полученный материал функционирует, как и ожидалось.

Пример 8. Экспрессия белка из зкДНК-векторов у мышей

[00492] Экспрессию in vivo белка трансгена люциферазы светлячка из синтетически продуцируемых зкДНК-векторов, описанных выше, оценивали in vivo на мышах по сравнению с традиционно полученными эквивалентными зкДНК-векторами. Тридцати самцам мышей CD-1 IGS (Envigo) в возрасте приблизительно четырех недель делали однократное внутривенное введение 0,5 мг/кг в объеме 5 мл/кг (а) продуцированной ЛНЧ-Sf9 зкДНК WT/Mut, (b) продуцированной ЛНЧ-Sf9 зкДНК Mut/Mut (асимметричной), (c) продуцированных ЛНЧ-Sf9 зкДНК-векторов WT/WT, (d) ЛНЧ-синтетических зкДНК-векторов WT/WT, (e) ЛНЧ-синтетической зкДНК WT/Mut, или (f) контроля ЛНЧ-полицитидин (PolyC). Мышей оценивают на протяжении 28 дней после инъекции с забором цельной крови в дни 0, 1 и 28. Визуализация in vivo (IVIS) каждой цельной мыши проводилась в дни 3, 7, 14, 21 и 28 путем введения каждой мыши люциферина в дозе 150 мг/кг (60 мг/мл) путем внутрибрюшинной инъекции в объеме 2,5 мл/кг, с бритьем волосяного покрова мыши при необходимости. В течение пятнадцати минут после каждой инъекции люциферина всех мышей анестезировали и проводили визуализацию. Животных умерщвляли в день 28, извлекали печень и селезенку и визуализировали ex vivo методом IVIS. Экспрессию люциферазы дополнительно оценивали в этих тканях с помощью анализа люциферазы методом ИФО (MAXDISCOVERY®, BIOO Scientific/PerkinElmer) и кПЦР для люциферазы образцов печени.

[00493] Результаты анализов IVIS в дни 3 и 7 продемонстрированы на Фиг. 18А и В (данные для дня 7). Наблюдалась флуоресценция значительно выше фоновых уровней во всех группах мышей, получавших зкДНК. Флуоресценция, обнаруженная у мышей, получавших синтетически продуцируемые зкДНК-вектора, была по меньшей мере такой же сильной, а в некоторых случаях выше, чем флуоресценция у мышей, получавших зкДНК, продуцируемую традиционным способом. Как видно на Фиг. 18В для данных дня 7, большая часть флуоресценции была локализована в печени, как и ожидалось для каждой экспериментальной группы. Этот результат снова демонстрирует, что зкДНК, продуцируемая синтетическими способами, функционирует in vivo подобно зкДНК-векторам, продуцируемым Sf9.

ССЫЛКИ НА ИСТОЧНИКИ

[00494] Все публикации и ссылки, включая, без ограничений, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании и примерах, приведенных в данном документе, настоящим включены посредством ссылки в полном объеме, как если бы для каждой отдельной публикации или ссылки было специально и индивидуально указано про ее включение посредством ссылки в данный документ явным образом. Любая патентная заявка, в отношении которой данная заявка испрашивает приоритет, также включена в данный документ посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылок.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕРЕЙШЕН БИО КО.

<120> ДНК-ВЕКТОРЫ С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), ПОЛУЧАЕМЫЕ ПУТЕМ

БЕСКЛЕТОЧНОГО СИНТЕЗА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ зкДНК-ВЕКТОРОВ

<130> 080170-091310-WOPT

<140>

<141>

<150> 62/619,392

<151> 2018-01-19

<160> 187

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 1

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 2

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 3

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 3

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120

tgcctgcagg 130

<210> 4

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 5

<211> 143

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 5

ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60

agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt 120

gggcaactcc atcactaggg taa 143

<210> 6

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 6

ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60

agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt 120

ggccaactcc atcactagag gtat 144

<210> 7

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 7

ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60

agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120

gccaact 127

<210> 8

<211> 166

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 8

tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc 60

gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc 120

gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag 166

<210> 9

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 9

ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60

cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt 120

gggcaactcc atcactaggg gtat 144

<210> 10

<211> 143

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 10

ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc 60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120

gcgcgcagag agggagtggg caa 143

<210> 11

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 11

atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60

ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg 120

agtgcgcata gagggagtgg ccaa 144

<210> 12

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 12

agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct 60

ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag 120

tggccaa 127

<210> 13

<211> 166

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 13

cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc 60

gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt 120

cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga 166

<210> 14

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 14

atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120

gcgcgcatta gagggagtgg gcaa 144

<210> 15

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 15

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120

<210> 16

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 16

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120

gg 122

<210> 17

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120

gcctgcagg 129

<210> 18

<211> 101

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 18

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101

<210> 19

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 19

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120

gcgcgcagct gcctgcagg 139

<210> 20

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 20

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120

gcgcagctgc ctgcagg 137

<210> 21

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 21

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120

gcagctgcct gcagg 135

<210> 22

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 22

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120

agctgcctgc agg 133

<210> 23

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 23

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120

gcgcgcagct gcctgcagg 139

<210> 24

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 24

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120

gcgcagctgc ctgcagg 137

<210> 25

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 25

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120

gcagctgcct gcagg 135

<210> 26

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 26

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120

agctgcctgc agg 133

<210> 27

<211> 131

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 27

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 120

ctgcctgcag g 131

<210> 28

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 28

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120

gcctgcagg 129

<210> 29

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 29

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 120

ctgcagg 127

<210> 30

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 30

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120

gg 122

<210> 31

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 31

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120

tgcctgcagg 130

<210> 32

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 32

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120

<210> 33

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 33

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120

ct 122

<210> 34

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 34

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120

ct 122

<210> 35

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 35

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120

ggggttcct 129

<210> 36

<211> 101

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 36

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60

gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101

<210> 37

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 37

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120

tccatcacta ggggttcct 139

<210> 38

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 38

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120

catcactagg ggttcct 137

<210> 39

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 39

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120

tcactagggg ttcct 135

<210> 40

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 40

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120

actaggggtt cct 133

<210> 41

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 41

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60

gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120

tccatcacta ggggttcct 139

<210> 42

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 42

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120

catcactagg ggttcct 137

<210> 43

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 43

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60

cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120

tcactagggg ttcct 135

<210> 44

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 44

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120

actaggggtt cct 133

<210> 45

<211> 131

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 45

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120

taggggttcc t 131

<210> 46

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 46

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120

ggggttcct 129

<210> 47

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 47

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60

cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120

ggttcct 127

<210> 48

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 48

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120

gg 122

<210> 49

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 49

cgatcgttcg at 12

<210> 50

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 50

atcgaaccat cg 12

<210> 51

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 51

atcgaacgat cg 12

<210> 52

<211> 165

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 52

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165

<210> 53

<211> 140

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 53

cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60

cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120

cgcagagaga tcactagggg 140

<210> 54

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 54

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91

<210> 55

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 55

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60

ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91

<210> 56

<400> 56

000

<210> 57

<400> 57

000

<210> 58

<400> 58

000

<210> 59

<400> 59

000

<210> 60

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 60

gcgcgctcgc tcgctc 16

<210> 61

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 61

ggttga 6

<210> 62

<211> 4

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 62

agtt 4

<210> 63

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 63

ggttgg 6

<210> 64

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 64

agttgg 6

<210> 65

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 65

agttga 6

<210> 66

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 66

rrttrr 6

<210> 67

<211> 581

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 67

gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60

ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120

actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180

tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240

aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300

attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360

ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420

gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480

ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540

ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581

<210> 68

<211> 225

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 68

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225

<210> 69

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 69

actgaggc 8

<210> 70

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 70

gcctcagt 8

<210> 71

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 71

gagcgagcga gcgcgc 16

<210> 72

<211> 1923

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 72

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540

cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600

attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660

gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720

cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780

aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 840

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 900

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt 960

ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 1020

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc 1080

ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg 1140

aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag 1200

gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260

tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320

gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380

ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440

ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500

taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560

gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620

aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680

cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740

ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc 1800

ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg 1860

acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag 1920

cca 1923

<210> 73

<211> 1272

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 73

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360

taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420

gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480

ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540

tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt 600

gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag 660

cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt 720

ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat 780

cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt 840

ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct 900

gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg 960

cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 1020

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 1080

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 1140

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt 1200

tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac 1260

ctttggaact ga 1272

<210> 74

<211> 1177

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 74

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177

<210> 75

<211> 547

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 75

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540

gaactga 547

<210> 76

<211> 556

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 76

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct 420

tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa 480

aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc 540

caacctttgg aactga 556

<210> 77

<211> 1179

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 77

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720

ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179

<210> 78

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 78

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120

tgcggcgcgc gcagcacctt t 141

<210> 79

<211> 317

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 79

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300

gcctaggctt ttgcaaa 317

<210> 80

<211> 241

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 80

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

c 241

<210> 81

<211> 215

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 81

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180

gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215

<210> 82

<211> 546

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 82

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540

gaactg 546

<210> 83

<211> 576

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 83

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540

gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576

<210> 84

<211> 150

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 84

ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60

gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120

gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150

<210> 85

<211> 1313

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 85

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120

atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180

gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240

tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300

agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360

gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420

gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480

ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540

tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600

gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660

aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720

gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780

aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840

tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900

ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960

gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020

tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080

gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140

tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200

aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260

attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313

<210> 86

<211> 213

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 86

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120

ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180

tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213

<210> 87

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 87

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 88

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 88

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 89

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 89

Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> Вирус обезьян 40

<400> 90

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 91

<211> 21

<212> ДНК

<213> Вирус обезьян 40

<400> 91

cccaagaaga agaggaaggt g 21

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность бипартатного NLS нуклеоплазмина

<400> 92

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400> 93

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400> 94

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 95

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 96

<211> 42

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Домен IBB из последовательности импортина-альфа

<400> 96

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 97

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400> 97

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 98

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестный

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400> 98

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 99

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 100

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 100

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 101

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 101

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60

gcgagcgcgc 70

<210> 102

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 102

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60

gcgagcgcgc 70

<210> 103

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 103

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 104

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 104

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 105

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 105

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 106

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 106

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 107

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 107

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210> 108

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 108

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210> 109

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 109

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60

tgagcgagcg agcgcgc 77

<210> 110

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 110

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60

tgagcgagcg agcgcgc 77

<210> 111

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 111

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51

<210> 112

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 112

gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51

<210> 113

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 113

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210> 114

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 114

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210> 115

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 115

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210> 116

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 116

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210> 117

<211> 5

<212> PRT

<213> Вирус гриппа

<400> 117

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 118

<211> 7

<212> PRT

<213> Вирус гриппа

<400> 118

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> Вирус гепатита дельта

<400> 119

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 120

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 120

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 121

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 122

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 123

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 123

gtttaaac 8

<210> 124

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 124

ttaattaa 8

<210> 125

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 125

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120

tgcggcgcgc gcagcacctt t 141

<210> 126

<400> 126

000

<210> 127

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 127

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 128

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 128

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120

gg 122

<210> 129

<211> 1260

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус - 2

<400> 129

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900

aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 1200

taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga 1260

<210> 130

<211> 1932

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус - 2

<400> 130

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920

cactctctct ga 1932

<210> 131

<211> 1876

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 131

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860

catctttgaa caataa 1876

<210> 132

<211> 1194

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 132

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194

<210> 133

<211> 1876

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 133

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860

catctttgaa caataa 1876

<210> 134

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 134

ctaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg c 51

<210> 135

<211> 65

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 135

ctaggactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60

cagtc 65

<210> 136

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 136

ggactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60

tcctgca 67

<210> 137

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 137

gtgcgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcgcactc a 41

<210> 138

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 138

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt cctgca 56

<210> 139

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 139

ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtc 54

<210> 140

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 140

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacggcctca gtcctgca 48

<210> 141

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 141

ctaggactga ggccgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtc 46

<210> 142

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 142

ggactgaggc ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcgcctcag 60

tcctgca 67

<210> 143

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 143

atacctaggc acgcgtgtta ctagttatta atagtaatca attacgg 47

<210> 144

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 144

atacctaggg gccgcacgcg tgttactag 29

<210> 145

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 145

atacactcag tgcctgcagg cacgtggtcc ggagatccag ac 42

<210> 146

<211> 3754

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 146

cctaggtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 60

tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatcgcggcc gctcaatatt ggccattagc 120

catattattc attggttata tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt 180

gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg 240

gcattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 300

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 360

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 420

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 480

agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 540

gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 600

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 660

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 720

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 780

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 840

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 900

agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960

cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 1020

cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 1080

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1140

gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 1200

gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 1260

gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 1320

gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac 1380

ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1440

ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1500

gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1560

ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1620

cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1680

ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1740

ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1800

cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 1860

accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttttagcct tcttcttttt cctacagctc 1920

ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcatttgt cgacagaatt cctcgaagat 1980

ccgaaggggt tcaagcttgg cattccggta ctgttggtaa agccagttta aacgccgcca 2040

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 2100

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 2160

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 2220

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 2280

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 2340

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 2400

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 2460

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 2520

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 2580

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 2640

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 2700

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt 2760

aattaattaa gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt 2820

gggtatacat ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg 2880

atatgtaatt actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg 2940

ttatttacgc tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac 3000

tgatattctt aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct 3060

gtatctagct attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt 3120

gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt 3180

gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg 3240

gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg 3300

ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc 3360

tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 3420

cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 3480

tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 3540

tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggctcta gagcatggct acgtagataa 3600

gtagcatggc gggttaatca ttaactacac ctgcagcagg aacccctagt gatggagttg 3660

gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc cctgcaggac tgaggccggg cgaccaaagg 3720

tcgcccgacg cccgggcggc ctcagtcctg cagg 3754

<210> 147

<211> 8418

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 147

ggcagctgcg cgctcgctcg ctcacctagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga 60

cctttggtcg cccggcctag gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120

tcactagggg ttccttgtag ttaatgatta acccgccatg ctacttatcg cggccgctca 180

atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg 240

gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaat 300

atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 360

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 420

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 480

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 540

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg 600

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca 660

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 720

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 780

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 840

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 900

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 960

cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg 1020

cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg 1080

acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc 1140

tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc 1200

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg 1260

gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg 1320

ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct 1380

gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt 1440

aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg 1500

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg 1560

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc 1620

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa 1680

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg 1740

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag 1800

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag 1860

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc 1920

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgtttt agccttcttc 1980

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca tttgtcgaca 2040

gaattcctcg aagatccgaa ggggttcaag cttggcattc cggtactgtt ggtaaagcca 2100

gtttaaacgc cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 2160

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 2220

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 2280

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 2340

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 2400

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 2460

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 2520

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 2580

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 2640

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 2700

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 2760

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 2820

acgagctgta caagtaatta attaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 2880

tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 2940

tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3000

taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3060

ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3120

tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3180

gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3240

cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3300

tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3360

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3420

gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3480

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3540

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3600

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg ctctagagca 3660

tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacacctgca gcaggaaccc 3720

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctccctgc aggactgagg 3780

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tcctgcaggg agcgagcgag 3840

cgcgcagctg cctgcacggg cgcgccggta ccgggagatg ggggaggcta actgaaacac 3900

ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc aataaaaaga cagaataaaa 3960

cgcacgggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct 4020

gtcgataccc caccgagacc ccattgggac caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca 4080

ccccaacccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaagc 4140

cctgccatag ccactacggg tacgtaggcc aaccactaga actatagcta gagtcctggg 4200

cgaacaaacg atgctcgcct tccagaaaac cgaggatgcg aaccacttca tccggggtca 4260

gcaccaccgg caagcgccgc gacggccgag gtctaccgat ctcctgaagc cagggcagat 4320

ccgtgcacag caccttgccg tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg 4380

agaccgaaac cttgcgctcg ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc 4440

ccaaggttgc cgggtgacgc acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagttgacat 4500

aagcctgttc ggttcgtaaa ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca 4560

gaaccttgac cgaacgcagc ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg 4620

actgtttttt tgtacagtct atgcctcggg catccaagca gcaagcgcgt tacgccgtgg 4680

gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag 4740

cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt 4800

aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag 4860

ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat cagccggact ccgattacct cgggaacttg 4920

ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct 4980

ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat 5040

ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc 5100

aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac 5160

gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat 5220

atcgacccaa gtaccgccac ctaacaattc gttcaagccg agatcggctt cccggccgcg 5280

gagttgttcg gtaaattgtc acaacgccgc gaatatagtc tttaccatgc ccttggccac 5340

gcccctcttt aatacgacgg gcaatttgca cttcagaaaa tgaagagttt gctttagcca 5400

taacaaaagt ccagtatgct ttttcacagc ataactggac tgatttcagt ttacaactat 5460

tctgtctagt ttaagacttt attgtcatag tttagatcta ttttgttcag tttaagactt 5520

tattgtccgc ccacacccgc ttacgcaggg catccattta ttactcaacc gtaaccgatt 5580

ttgccaggtt acgcggctgg tctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 5640

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5700

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5760

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 5820

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 5880

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 5940

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 6000

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 6060

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 6120

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 6180

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 6240

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 6300

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 6360

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6420

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6480

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 6540

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 6600

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 6660

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 6720

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 6780

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 6840

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 6900

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 6960

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 7020

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 7080

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 7140

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 7200

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 7260

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 7320

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 7380

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 7440

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 7500

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 7560

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 7620

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 7680

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 7740

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 7800

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 7860

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 7920

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 7980

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 8040

gcgtcccatt cgccattcag gctgcaaata agcgttgata ttcagtcaat tacaaacatt 8100

aataacgaag agatgacaga aaaattttca ttctgtgaca gagaaaaagt agccgaagat 8160

gacggtttgt cacatggagt tggcaggatg tttgattaaa aacataacag gaagaaaaat 8220

gccccgctgt gggcggacaa aatagttggg aactgggagg ggtggaaatg gagtttttaa 8280

ggattattta gggaagagtg acaaaataga tgggaactgg gtgtagcgtc gtaagctaat 8340

acgaaaatta aaaatgacaa aatagtttgg aactagattt cacttatctg gttcggatct 8400

cctagtgagc tccctgca 8418

<210> 148

<211> 225

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 148

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225

<210> 149

<211> 1177

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 149

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177

<210> 150

<400> 150

000

<210> 151

<211> 573

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 151

gtaagagttt tatgtttttt catctctgct tgtatttttc tagtaatgga agcctggtat 60

tttaaaatag ttaaattttc ctttagtgct gatttctaga ttattattac tgttgttgtt 120

gttattattg tcattatttg catctgagaa cccttaggtg gttatattat tgatatattt 180

ttggtatctt tgatgacaat aatgggggat tttgaaagct tagctttaaa tttcttttaa 240

ttaaaaaaaa atgctaggca gaatgactca aattacgttg gatacagttg aatttattac 300

ggtctcatag ggcctgcctg ctcgaccatg ctatactaaa aattaaaagt gtgtgttact 360

aattttataa atggagtttc catttatatt tacctttatt tcttatttac cattgtctta 420

gtagatattt acaaacatga cagaaacact aaatcttgag tttgaatgca cagatataaa 480

cacttaacgg gttttaaaaa taataatgtt ggtgaaaaaa tataactttg agtgtagcag 540

agaggaacca ttgccacctt cagattttcc tgt 573

<210> 152

<211> 1993

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 152

acgatcggga actggcatct tcagggagta gcttaggtca gtgaagagaa gaacaaaaag 60

cagcatatta cagttagttg tcttcatcaa tctttaaata tgttgtgtgg tttttctctc 120

cctgtttcca cagacaagag tgagatcgcc catcggtata atgatttggg agaacaacat 180

ttcaaaggcc tgtaagttat aatgctgaaa gcccacttaa tatttctggt agtattagtt 240

aaagttttaa aacacctttt tccaccttga gtgtgagaat tgtagagcag tgctgtccag 300

tagaaatgtg tgcattgaca gaaagactgt ggatctgtgc tgagcaatgt ggcagccaga 360

gatcacaagg ctatcaagca ctttgcacat ggcaagtgta actgagaagc acacattcaa 420

ataatagtta attttaattg aatgtatcta gccatgtgtg gctagtagct cctttcctgg 480

agagagaatc tggagcccac atctaacttg ttaagtctgg aatcttattt tttatttctg 540

gaaaggtcta tgaactatag ttttgggggc agctcactta ctaactttta atgcaataag 600

atctcatggt atcttgagaa cattattttg tctctttgta gtactgaaac cttatacatg 660

tgaagtaagg ggtctatact taagtcacat ctccaacctt agtaatgttt taatgtagta 720

aaaaaatgag taattaattt atttttagaa ggtcaatagt atcatgtatt ccaaataaca 780

gaggtatatg gttagaaaag aaacaattca aaggacttat ataatatcta gccttgacaa 840

tgaataaatt tagagagtag tttgcctgtt tgcctcatgt tcataaatct attgacacat 900

atgtgcatct gcacttcagc atggtagaag tccatattcc tttgcttgga aaggcaggtg 960

ttcccattac gcctcagaga atagctgacg ggaagaggct ttctagatag ttgtatgaaa 1020

gatatacaaa atctcgcagg tatacacagg catgatttgc tggttgggag agccacttgc 1080

ctcatactga ggtttttgtg tctgcttttc agagtcctga ttgccttttc ccagtatctc 1140

cagaaatgct catacgatga gcatgccaaa ttagtgcagg aagtaacaga ctttgcaaag 1200

acgtgtgttg ccgatgagtc tgccgccaac tgtgacaaat cccttgtgag taccttctga 1260

ttttgtggat ctactttcct gctttctgga actctgtttc aaagccaatc atgactccat 1320

cacttaaggc cccgggaaca ctgtggcaga gggcagcaga gagattgata aagccagggt 1380

gatgggaatt ttctgtggga ctccatttca tagtaattgc agaagctaca atacactcaa 1440

aaagtctcac cacatgactg cccaaatggg agcttgacag tgacagtgac agtagatatg 1500

ccaaagtgga tgagggaaag accacaagag ctaaaccctg taaaaagaac tgtaggcaac 1560

taaggaatgc agagagaaga agttgccttg gaagagcata ccaactgcct ctccaatacc 1620

aatggtcatc cctaaaacat acgtatgaat aacatgcaga ctaagcaggc tacatttagg 1680

aatatacatg tatttacata aatgtatatg catgtaacaa caatgaatga aaactgaggt 1740

catggatctg aaagagagca agggggctta catgagaggg tttggaggga ggggttggag 1800

ggagggaggt attattcttt agttttacag ggaacgtagt aaaaacatag gcttctccca 1860

aaggagcaga gcccatgagg agctgtgcaa ggttccccag cttgatttta cctgctcctc 1920

aaattccctt gatttgtttt tattataatg actttactcc tagcttttag tgtcagatag 1980

aaaacatgga agg 1993

<210> 153

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 153

taggaggctg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagaccagc ctgggcaaca 60

tagtgtgatc ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag 120

tccccagcca cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat ggtccaggct 180

gcagtgagcc atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct 240

cacaacaaca acaacaacaa caaaaaggct gagctgcacc atgcttgacc cagtttctta 300

aaattgttgt caaagcttca ttcactccat ggtgctatag agcacaagat tttatttggt 360

gagatggtgc tttcatgaat tcccccaaca gagccaagct ctccatctag tggacaggga 420

agctagcagc aaaccttccc ttcactacaa aacttcattg cttggccaaa aagagagtta 480

attcaatgta gacatctatg taggcaatta aaaacctatt gatgtataaa acagtttgca 540

ttcatggagg gcaactaaat acattctagg actttataaa agatcacttt ttatttatgc 600

acagggtgga acaagatgga ttatcaagtg tcaagtccaa tctatgacat caattattat 660

acatcggagc cctgccaaaa aatcaatgtg aagcaaatcg cagcccgcct cctgcctccg 720

ctctactcac tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg 780

ataaactgca aaaggctgaa gagcatgact gacatctacc tgctcaacct ggccatctct 840

gacctgtttt tccttcttac tgtccccttc tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac 900

tttggaaata caatgtgtca actcttgaca gggctctatt ttataggctt cttctctgga 960

atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt 1020

gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg 1080

gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat 1140

tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca 1200

ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg 1260

ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg 1320

cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt 1350

<210> 154

<211> 1223

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 154

tgacagagac tcttgggatg acgcactgct gcatcaaccc catcatctat gcctttgtcg 60

gggagaagtt cagaaactac ctcttagtct tcttccaaaa gcacattgcc aaacgcttct 120

gcaaatgctg ttctattttc cagcaagagg ctcccgagcg agcaagctca gtttacaccc 180

gatccactgg ggagcaggaa atatctgtgg gcttgtgaca cggactcaag tgggctggtg 240

acccagtcag agttgtgcac atggcttagt tttcatacac agcctgggct gggggtgggg 300

tgggagaggt cttttttaaa aggaagttac tgttatagag ggtctaagat tcatccattt 360

atttggcatc tgtttaaagt agattagatc ttttaagccc atcaattata gaaagccaaa 420

tcaaaatatg ttgatgaaaa atagcaacct ttttatctcc ccttcacatg catcaagtta 480

ttgacaaact ctcccttcac tccgaaagtt ccttatgtat atttaaaaga aagcctcaga 540

gaattgctga ttcttgagtt tagtgatctg aacagaaata ccaaaattat ttcagaaatg 600

tacaactttt tacctagtac aaggcaacat ataggttgta aatgtgttta aaacaggtct 660

ttgtcttgct atggggagaa aagacatgaa tatgattagt aaagaaatga cacttttcat 720

gtgtgatttc ccctccaagg tatggttaat aagtttcact gacttagaac caggcgagag 780

acttgtggcc tgggagagct ggggaagctt cttaaatgag aaggaatttg agttggatca 840

tctattgctg gcaaagacag aagcctcact gcaagcactg catgggcaag cttggctgta 900

gaaggagaca gagctggttg ggaagacatg gggaggaagg acaaggctag atcatgaaga 960

accttgacgg cattgctccg tctaagtcat gagctgagca gggagatcct ggttggtgtt 1020

gcagaaggtt tactctgtgg ccaaaggagg gtcaggaagg atgagcattt agggcaagga 1080

gaccaccaac agccctcagg tcagggtgag gatggcctct gctaagctca aggcgtgagg 1140

atgggaagga gggaggtatt cgtaaggatg ggaaggaggg aggtattcgt gcagcatatg 1200

aggatgcaga gtcagcagaa ctg 1223

<210> 155

<211> 215

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 155

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180

gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accac 215

<210> 156

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 156

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca cctaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctaggtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

<210> 157

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 157

gcgcgctcgc tcgctcacc 19

<210> 158

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 158

ctaggtgagc gagcgagcgc gc 22

<210> 159

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 159

cctgcaggac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60

cctcagtcct gcagg 75

<210> 160

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 160

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagt 60

gcgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcactcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120

tgcctgcagg 130

<210> 161

<211> 142

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 161

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctcc ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg 60

acctttggtc gcccggcctc agtcctaggg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 120

aactccatca ctaggggttc ct 142

<210> 162

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 162

gcgcgctcgc tcgctcactg agtgcgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcact 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210> 163

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 163

gcgcgctcgc tcgctcactg a 21

<210> 164

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 164

gtgagcgagc gagcgcgc 18

<210> 165

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 165

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc 60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210> 166

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 166

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210> 167

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 167

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc 60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210> 168

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 168

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210> 169

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 169

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210> 170

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 170

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210> 171

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 171

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc 60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210> 172

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 172

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc 60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89

<210> 173

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 173

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210> 174

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 174

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87

<210> 175

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 175

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210> 176

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 176

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc 60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85

<210> 177

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 177

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210> 178

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 178

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg 60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83

<210> 179

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 179

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 60

tcagtgagcg agcgagcgcg c 81

<210> 180

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 180

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc 60

tcagtgagcg agcgagcgcg c 81

<210> 181

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 181

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210> 182

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 182

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<210> 183

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 183

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgca g 81

<210> 184

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 184

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgca g 81

<210> 185

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 185

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60

gagcgagcgc gc 72

<210> 186

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 186

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60

cagtgagcga gcgagcgcgc 80

<210> 187

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 187

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60

agtgagcgag cgagcgcgc 79

<---

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Предложены методы синтетического синтеза и бесклеточного синтеза ДНК-векторов с замкнутыми концами (например, зкДНК-векторов), имеющих линейную и непрерывную структуру, для доставки и экспрессии трансгена. Данное изобретение относится к in vitro процессу получения ДНК-векторов с замкнутыми концами, соответствующих продуктов ДНК-векторов, полученных с помощью указанных способов, и их применению, а также к олигонуклеотидам и наборам, используемым в способе по изобретению. ДНК-векторы, полученные с использованием способов, описанных в данном документе, не имеют нежелательных побочных эффектов из-за загрязнений, вносимых в процессе производства в клеточных линиях. 22 н. и 68 з.п. ф-лы, 18 ил., 11 табл., 8 пр.

1. Бесклеточный способ получения невирусного, линейного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), включающий:

обеспечение первого инвертированного концевого повтора (ITR); обеспечение второго ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первого ITR с первым концом двухцепочечного полинуклеотида и лигирование 5'- и 3'-концов второго ITR со вторым концом двухцепочечного полинуклеотида с образованием зкДНК-вектора,

отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют, и причем по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый из первого и второго ITR содержит выступающую область в A-стебле ITR между последовательностями В и С петли шпильки и Rep-связывающим элементом (RВE), причем указанный выступ комплементарен выступу, создаваемому при расщеплении эндонуклеазой в сайте рестрикции, встроенном в последовательность экспрессионной кассеты.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что RВE и области D ITR присутствуют в двухцепочечном полинуклеотиде.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий получение указанной последовательности двухцепочечной экспрессионной кассеты путем вырезания из двухцепочечного конструкта ДНК, содержащего указанную последовательность экспрессионной кассеты.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что двухцепочечный полинуклеотид, содержащий последовательность экспрессионной кассеты, получен путем синтеза ДНК, или сборки цепи методом ПЦР.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в указанном двухцепочечном ДНК-конструкте последовательность экспрессионной кассеты фланкируют на 5'-конце - первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, а на 3'-конце - второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.

7. Способ по п. 4 или 6, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции представляют собой одну и ту же эндонуклеазу рестрикции.

9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанные первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции являются разными эндонуклеазами рестрикции.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR отжигают перед лигированием с последовательностью экспрессионной кассеты.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное лигирование выбирают из химического лигирования и лигирования с использованием белков.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное лигирование осуществляется лигазой Т4 или белком Rep ААВ.

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный второй ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит по меньшей мере один RBE.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность указанного первого ITR представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5-9, и 32-48.

18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что последовательность указанного второго ITR представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, и 15-31.

19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.

20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1, промотора цитомегаловируса (CMV), и промотора EF1a.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.

28. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий очистку указанного зкДНК-вектора.

29. ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен бесклеточным способом по любому из предшествующих пунктов, где бесклеточный способ включает:

обеспечение первого инвертированного концевого повтора (ITR); обеспечение второго ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первого ITR с первым концом двухцепочечного полинуклеотида и лигирование 5'- и 3'-концов второго ITR со вторым концом двухцепочечного полинуклеотида с образованием зкДНК-вектора,

где по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют, и причем по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты, где последовательность экспрессионной кассеты содержит указанную последовательность трансгена.

30. Фармацевтическая композиция для доставки последовательности трансгена, содержащая эффективное количество ДНК-вектора с замкнутыми концами по п. 29 и эксципиент.

31. Бесклеточный способ получения невирусного, линейного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), включающий:

синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг указанной одноцепочечной молекулы ДНК.

32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что по меньшей мере один из первого ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты синтезируют.

33. Способ по п. 31 или 32, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК конструируют путем синтеза одного или нескольких из первого ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты, и лигирования одного или нескольких из первого ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты с образованием одноцепочечной молекулы ДНК.

34. Способ по п. 31 или 32, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК получают путем вырезания молекулы из двухцепочечного ДНК-конструкта с последующей денатурацией вырезанного двухцепочечного фрагмента с получением одноцепочечной молекулы ДНК.

35. Способ по любому из пп. 31-34, отличающийся тем, что указанная стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют петлю шпильки.

36. Способ по любому из пп. 31-35, отличающийся тем, что указанный первый ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

37. Способ по любому из пп. 31-36, отличающийся тем, что указанный второй ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированной ITR.

38. Способ по любому из пп. 31-37, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR содержит по меньшей мере один RBE.

39. Способ по любому из пп. 31-38, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ITR ААВ.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанную последовательность первого ITR выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5-9, и 32-48.

41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанную последовательность второго ITR выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, и 15-31.

42. Способ по любому из пп. 31-41, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.

43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.

44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1, промотора цитомегаловируса (CMV), и промотора EF1a.

46. Способ по любому из пп. 31-45, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.

47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что длина указанной последовательности трансгена составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.

49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

50. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.

51. Способ по любому из пп. 31-50, дополнительно включающий очистку указанного зкДНК-вектора.

52. ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен способом по любому из пп. 31-51, где способ включает:

синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг указанной одноцепочечной молекулы ДНК.

53. Фармацевтическая композиция для доставки последовательности трансгена, содержащая эффективное количество ДНК-вектора с замкнутыми концами по п. 52 и эксципиент.

54. Бесклеточный способ получения невирусного, линейного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), включающий:

обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые способны расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечном конструкте;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, причем стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют по меньшей мере одну петлю шпильки.

55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейный двухцепочечный ДНК-конструкт.

56. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют одну эндонуклеазу рестрикции.

57. Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют две разные эндонуклеазы рестрикции.

58. Способ по любому из пп. 54-57, отличающийся тем, что указанная стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют петлю шпильки.

59. Способ по любому из пп. 54-58, отличающийся тем, что указанный первый ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

60. Способ по любому из пп. 54-59, отличающийся тем, что указанный второй ITR выбирают из группы, состоящей из ITR дикого типа и модифицированного ITR.

61. Способ по любому из пп. 54-60, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR содержит по меньшей мере один Rep-связывающий элемент (RBE), полученный из ITR ААВ.

62. Способ по любому из пп. 54-61, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ITR ААВ.

63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная последовательность первого ITR представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.

64. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная последовательность второго ITR представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.

65. Способ по любому из пп. 54-64, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.

66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.

67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).

68. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора AAT, промотора LP1, промотора цитомегаловируса (CMV), и промотора EF1a.

69. Способ по любому из пп. 54-68, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.

70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что длина указанной последовательности трансгена составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов.

71. Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.

72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.

73. Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.

74. Способ по любому из пп.54-73, дополнительно включающий очистку указанного зкДНК-вектора.

75. ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен способом по любому из пп. 54-74, где способ включает: обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые способны расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечном конструкте;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, причем стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют по меньшей мере одну петлю шпильки.

76. Фармацевтическая композиция для доставки последовательности трансгена, содержащая эффективное количество ДНК-вектора с замкнутыми концами по п. 75 и эксципиент.

77. Выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами(зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен или является получаемым способом, включающим:

обеспечение первого инвертированного концевого повтора (ITR);

обеспечение второго ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первого ITR с первым концом двухцепочечного полинуклеотида и лигирование 5'- и 3'-концов второго ITR со вторым концом двухцепочечного полинуклеотида с образованием зкДНК-вектора,

отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют, и причем по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты.

78. Выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен или является получаемым способом, включающим синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг указанной одноцепочечной молекулы ДНК.

79. Выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК) для доставки последовательности трансгена, причем указанный зкДНК-вектор получен или является получаемым способом, включающим:

обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; первый инвертированный концевой повтор (ITR); смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые способны расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечном конструкте;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, причем стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют по меньшей мере одну петлю шпильки.

80. Клетка, продуцирующая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 77, содержащая указанный ДНК-вектор.

81. Трансгенная мышь в качестве in vivo модели, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 77.

82. Применение ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-28, 31-51, и 54-74, для лечения субъекта, где субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное из группы, состоящей из болезни Фабри, болезни Помпе, болезни Гоше, фенилкетонурии (ФКУ), болезни накопления гликогена; недостаточности орнитинтранскарбамилазы (ОТК); метахроматической лейкодистрофии (МЛД), мукополисахаридоза типа II (MPSII; синдрома Хантера); прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (ПСВХ), болезни Вильсона; гемофилии A и B, талассемии, анемии, такой как серповидноклеточная анемия; муковисцидоза; пигментного ретинита, сосудистой или «влажной» макулярной дегенерации, возрастной макулярной дегенерации, врожденного амавроза Лебера (LCA), синдрома Ушера, болезни Штаргардта, причем последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.

83. Способ доставки терапевтического белка субъекту, включающий:

введение субъекту композиции, содержащей эффективное количество ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-28, 31-51, и 54-74, причем по меньшей мере один трансген кодирует указанный терапевтический белок.

84. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело.

85. Набор для доставки последовательности трансгена, содержащий ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом, включающим:

обеспечение первого инвертированного концевого повтора (ITR);

обеспечение второго ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первого ITR с первым концом двухцепочечного полинуклеотида и лигирование 5'- и 3'-концов второго ITR со вторым концом двухцепочечного полинуклеотида с образованием зкДНК-вектора,

отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют, и причем по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты, и фармацевтически приемлемый носитель, упакованный в контейнер с упаковочным вкладышем.

86. Набор для доставки последовательности трансгена, содержащий ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом, включающим синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг указанной одноцепочечной молекулы ДНК,

и фармацевтически приемлемый носитель, упакованный в контейнер с упаковочным вкладышем.

87. Набор для доставки последовательности трансгена, содержащий ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом, включающим:

обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые способны расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечном конструкте;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, причем стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют по меньшей мере одну петлю шпильки,

и фармацевтически приемлемый носитель, упакованный в контейнер с упаковочным вкладышем.

88. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом, включающим:

обеспечение первого инвертированного концевого повтора (ITR); обеспечение второго ITR;

обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и

лигирование 5'- и 3'-концов первого ITR с первым концом двухцепочечного полинуклеотида и лигирование 5'- и 3'-концов второго ITR со вторым концом двухцепочечного полинуклеотида с образованием зкДНК-вектора,

где по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют, и причем по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит выступающую область, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты,

причем набор содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR), второй ITR, и по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования первого ITR и второго ITR с двухцепочечным полинуклеотидом.

89. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом, включающим:

синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; и

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;

и отжиг указанной одноцепочечной молекулы ДНК, причем набор содержит одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую в порядке расположения в направлении от 5' к 3', первый ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.

90. Набор для продуцирования последовательности трансгена, содержащей ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом, включающим:

обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':

первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

первый инвертированный концевой повтор (ITR);

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;

контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые способны расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечном конструкте;

разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и

проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами, причем стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого ITR и второго ITR образуют по меньшей мере одну петлю шпильки, причем набор содержит двухцепочечный ДНК-конструкт, содержащий в порядке расположения в направлении от 5' к 3': первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, первый ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй ITR; антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, и по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования, упакованный в контейнер с упаковочным вкладышем.