МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), СОДЕРЖАЩАЯ СИММЕТРИЧНЫЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ КОНЦЕВЫЕ ПОВТОРЫ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/63 C12N15/85 C12N15/86 A61P7/00 A61P35/00 A61P25/00 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/757872, поданной 9 ноября 2018 г., и предварительной заявке на патент США №62/757892, поданной 9 ноября 2018 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее изобретение относится к области генной терапии, в том числе к доставке регуляторных переключателей на основе ДНК с замкнутыми концами в целевую клетку, ткань, орган или организм.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0003] Перечень последовательностей для настоящей заявки был подан в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII с названием файла «05320 Sequence_Listing.txt», датой создания 8 ноября 2019 г. и размером 204 Кб (209 626 байтов). Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде, полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Целью генной терапии является улучшение клинических исходов у пациентов, страдающих либо генетическими мутациями, либо приобретенными заболеваниями, вызываемыми аберрациями в профиле генной экспрессии. Генная терапия включает лечение или предотвращение медицинских состояний, обусловленных дефектными генами или аномальной регуляцией или экспрессией, например, недостаточной экспрессией или избыточной экспрессией, которые могут приводить к расстройству, заболеванию, злокачественному новообразованию и т.п. Например, лечение, предотвращение или облегчение заболевания или расстройства, вызываемого дефектным геном, может быть осуществлено путем доставки пациенту корректирующего генетического материала, приводящей к терапевтической экспрессии указанного генетического материала у указанного пациента. Генная терапия основана на обеспечении транскрипционной кассеты с активным генным продуктом (иногда называемым трансгеном), например, что может приводить к положительному эффекту приобретения функции, отрицательному эффекту утраты функции или другому исходу, такому как, например, онколитический эффект. Генную терапию можно также применять для лечения заболевания или злокачественного новообразования, вызываемого другими факторами. Лечение моногенных расстройств у человека может осуществляться путем доставки нормального гена в целевые клетки и его экспрессии в целевых клетках. Доставка и экспрессия корректирующего гена в целевые клетки (клетки-мишени) пациента могут быть осуществлены с применением многочисленных способов, в том числе с применением полученных методами генной инженерии вирусов и вирусных векторов для доставки генов. Среди множества доступных векторов вирусного происхождения (например, из рекомбинантного ретровируса, рекомбинантного лентивируса, рекомбинантного аденовируса и т.п.) рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) набирает популярность в качестве универсального вектора для генной терапии. При этом по мере совершенствования технологии и достижения высокоэффективного переноса и экспрессии генов становится все более важной возможность регуляции такой экспрессии как на временном, так и на пространственном уровне.

[0005] Аденоассоциированные вирусы (AAV) принадлежат к семейству Parvoviridae; более конкретно, они составляют род Dependoparvovirus. Геном AAV состоит из линейной од но цепочечной молекулы ДНК, которая содержит приблизительно 4, 7 килобаз (кб) и состоит из двух основных открытых рамок считывания (ORF), кодирующих неструктурный белок Rep (репликация) и структурный белок Cap (капсид). В гене cap была идентифицирована вторая ORF, которая кодирует активирующий сборку белок (ААР). ДНК, фланкирующие кодирующие области AAV, представляют собой две последовательности действующих в цис-положении инвертированных концевых повторов (ITR) длиной приблизительно 145 нуклеотидов, с прерывистыми палиндромными последовательностями, которые могут укладываться в энергетически стабильные шпилечные структуры, функционирующие в качестве праймеров при репликации ДНК. Как правило, последовательности дикого типа одинаковы, но инвертированы относительно друг друга. Наряду с ролью в репликации ДНК указанные последовательности ITR, как было показано, вовлечены в интеграцию вирусной ДНК в клеточный геном, «спасение» из генома хозяина или плазмиды, и заключение в капсид вирусной нуклеиновой кислоты в зрелых вирионах (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).

[0006] Векторы, происходящие из AAV (т.е., рекомбинантные AAV - (rAVV) или AAV-векторы), перспективны для доставки генетического материала, поскольку (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр типов неделящихся и делящихся клеток, в том числе миоциты и нейроны; (ii) они лишены вирусных структурных генов, что снижает ответы клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например, опосредованные интерферонами ответы; (iii) вирусы дикого типа считаются непатогенными для человека; (iv) в отличие от AAV дикого типа, который способен к интеграции в геном клетки-хозяина, у дефектных по репликации AAV-векторов отсутствует ген rep, и они обычно персистируют в виде эписом, что, соответственно, ограничивает риск инсерционного мутагенеза или генотоксичности; и (v) по сравнению с другими векторными системами AAV-векторы в целом считаются более слабыми иммуногенами, и, соответственно, они не запускают значимого иммунного ответа (см. (ii)), обеспечивая таким образом персистенцию векторной ДНК и, потенциально, долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов. AAV-векторы могут также быть получены и введены в составы с высокими титрами, и доставлены путем внутриартериальных, внутривенных, или внутрибрюшинных инъекций, что обеспечивает распределение вектора и перенос генов в значимые мышечные области посредством однократной инъекции у грызунов (Goyenvalle et al., 2004; Fougerousse et al., 2007; Koppanati et al., 2010; Wang et al., 2009) и собак. В клиническом исследовании лечения спинальной мышечной дистрофии типа 1 AAV-векторы доставляли системно с целью воздействовать на головной мозг, что приводило к очевидным клиническим улучшениям.

[0007] Однако применение частиц AAV в качестве вектора для доставки генов имеет ряд серьезных недостатков. Один существенный недостаток, ассоциированный с rAAV, заключается в ограниченной вирусной пакующей емкости, составляющей приблизительно 4,5 кб гетерологичной ДНК (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010). В результате применение AAV-векторов было ограничено емкостью для кодирования белка менее чем 150000 Да. Второй недостаток заключается в том, что ввиду распространенности инфекции AAV дикого типа в популяции кандидаты для генной терапии rAAV должны проходить скрининг на присутствие нейтрализующих антител, элиминирующих вектор из организма пациента. Третий недостаток связан с иммуногенностью капсида, которая препятствует повторному введению пациентам, которые не были отстранены от начального лечения. Иммунная система пациента может отвечать на вектор, который фактически выступает в роли «бустерной» прививки, стимулируя иммунную систему, генерирующую высокие титры антител против AAV, которые исключают возможность лечения в будущем. В некоторых недавних сообщениях выражены опасения, касающиеся иммуногенности в ситуациях, подразумевающих применение высоких доз. Другой заметный недостаток заключается в относительно медленном начале опосредованной AAV генной экспрессии, принимая во внимание то, что одноцепочечная ДНК AAV должна быть преобразована в двухцепочечную ДНК до экспрессии гетерологичного гена. Хотя были предприняты попытки обойти указанную проблему путем конструирования двухцепочечных ДНК-векторов, указанная стратегия дополнительно ограничивает размер трансгенной экспрессионной кассеты, которая может быть интегрирована в AAV-вектор (McCarty, 2008; Varenika et al., 2009; Foust et al., 2009).

[0008] Кроме того, стандартные вирионы AAV с капсидами получают путем введения плазмиды или плазмид, содержащих геном AAV, гены rep и гены cap (Grimm et al., 1998). При введении указанных хелперных плазмид в транс-положение происходит «спасение» генома AAV (т.е. высвобождение с последующей амплификацией) из генома хозяина и его дальнейшее заключение в капсид (вирусные капсиды) с получением биологически активных AAV-векторов. Однако, как было обнаружено, такие заключенные в капсиды вирусные AAV-векторы неэффективно трансдуцируют определенные типы клеток и тканей. Указанные капсиды также индуцируют иммунный ответ.

[0009] Соответственно, применение векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV-векторов) для генной терапии ограничено из-за существующего иммунитета у определенных пациентов, ограничено однократным введением пациентам, у которых до этого не было иммунитета (ввиду развившегося у пациентов иммунного ответа), ограниченным диапазоном трансгенного генетического материала, подходящего для доставки в AAV-векторах ввиду минимальной вирусной пакующей емкости упаковки (приблизительно 4, 5 Кб) ассоциированного капсида AAV, а также медленной опосредованной AAV генной экспрессией. Применение клинической генной терапии с использованием rAAV дополнительно затруднено вариабельностью среди пациентов, которую нельзя предсказать на основании дозовой зависимости в сингенных моделях на мышах или других видах моделей.

[0010] Рекомбинантные бескапсидные AAV-векторы могут быть получены в виде выделенной линейной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессируемые области трансгена и области промотора, фланкированные двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV дикого типа, включая сайты связывания Rep и сайты концевого разрешения. Указанные рекомбинантные AAV-векторы не содержат последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV, и могут быть одноцепочечными, двуцепочечными или дуплексными, где один или оба конца ковалентно связаны посредством двух палиндромных последовательностей ITR дикого типа (например, WO2012/123430, патент США 9598703). Они позволяют избежать многих проблем опосредованной AAV генной терапии за счет значительно более высокой емкости трансгена, быстрого начала экспрессии трансгена и отсутствия особенностей векторов на основе AAV, которые, как правило, приводят к формированию иммунитета и быстрому выведению указанных векторов. Однако постоянная экспрессия трансгена может быть нежелательной в некоторых случаях.

[0011] Все еще имеется значительная неудовлетворенная потребность в контролируемых рекомбинантных ДНК-векторах с усовершенствованными свойствами для получения и/или экспрессии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Согласно настоящему изобретению предложены, в целом, невирусные бескапсидные ДНК-векторы с ковалентно замкнутыми концами (называемые в настоящем документе «ДНК-вектором с замкнутыми концами» или «зкДНК-вектором»). Описанные в настоящем документе зкДНК-векторы представляют собой бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные непрерывной цепью комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и не заключенная в капсид структура), которые содержат последовательность 5'-концевого инвертированного повтора (ITR) и последовательность 3' ITR, одинаковые, однако обратно-комплементарные друг относительно друга, т.е. указанные последовательности являются симметричными или по существу симметричными. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), при этом вся гетерологичная нуклеотидная последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя. Согласно другим вариантам реализации технология, описанная в настоящем документе, относится к зкДНК-вектору, содержащему две модифицированные последовательности инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, причем указанные модифицированные ITR симметричны друг другу и фланкируют подлежащий экспрессии трансген. ЗкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут быть продуцированы в эукариотических клетках и, соответственно, не содержать прокариотических модификаций ДНК и загрязнения бактериальным эндотоксином в клетках насекомых.

[0013] В одном аспекте невирусные бескапсидные ДНК-векторы с ковалентно закрытыми концами предпочтительно представляют собой линейные дуплексные молекулы и могут быть получены из полинуклеотида вектора, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя симметричными модифицированными последовательностями инвертированных концевых повторов (например, mod-ITR) (например, AAV ITR). Таким образом, оба ITR имеют одну и ту же последовательность, однако являются обратно-комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. Согласно альтернативным вариантам реализации пара модифицированных ITR является по существу симметричной согласно определению в настоящем документе, т.е. указанная пара модифицированных ITR может иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. Например, один модифицированный ITR может принадлежать к одному серотипу, а другой модифицированный ITR может принадлежать к другому серотипу, однако они содержат одинаковую мутацию (например, инсерцию, делецию или замену нуклеотида) в одной и той же области. Иными словами, исключительно в иллюстративных целях, 5' mod-ITR может быть взят из AAV2 и включать делецию в области С, а 3' mod-ITR может быть взят из AAV5 и содержать соответствующую делецию в области С'; при условии, что указанные 5' mod-ITR и 3' mod-ITR имеют одинаковую или симметричную трехмерную пространственную организацию, они предусмотрены в качестве модифицированной пары ITR для применения согласно настоящему изобретению.

[0014] Согласно некоторым вариантам реализации пара модифицированных ITR содержит по меньшей мере одну делецию, инсерцию или замену или любую комбинацию перечисленного относительно последовательности ITR дикого типа из AAV того же серотипа. Добавления, делеции или замены в симметричном ITR одинаковы, но обратно-комплементарны друг другу. Например, инсерция 3 нуклеотидов в С-область 5'-ITR будет соответствовать инсерции трех обратно-комплементарных нуклеотидов в соответствующий участок С-области 3'-ITR. Исключительно для наглядности, если добавление в 5'-ITR представлено AACG, то добавлением в 3'-ITR будет CGTT в соответствующем сайте. Например, если смысловая цепь 5' ITR представляет собой ATCGATCG, добавление AACG между G и А приводит к получению в результате последовательности ATCGAACGATCG. Соответствующая смысловая цепь 3' ITR представлена CGATCGAT (обратный комплемент ATCGATCG) с добавлением CGTT (т.е. обратного комплемента AACG) между Т и С, что приводит к получению последовательности CGATCG7TCGAT (обратный комплемент ATCGA4CGATCG), т.е. зеркальное отображение модификации 5' ITR. Согласно некоторым вариантам реализации указанные модифицированные ITR содержат сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, сайт связывания Rep. Согласно некоторым вариантам реализации указанные модифицированные ITR не содержат сайта концевого разрешения и/или сайта связывания репликационного белка (RPS), например, сайта связывания Rep.

[0015] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит: (1) экспрессионную кассету, содержащую цис-регуляторный элемент, промотор и по меньшей мере один трансген; или (2) промотор, функционально связанный по меньшей мере с одним трансгеном, и (3) две самокомплементарные симметричные последовательности, например, симметричные модифицированные ITR, фланкирующие указанную экспрессионную кассету, причем указанный зкДНК-вектор не ассоциирован с капсидным белком.

[0016] Согласно одному варианту реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, цис-регуляторные элементы и/или регуляторные переключатели, которые более подробно описаны в настоящем документе в разделе с названием «Регуляторные переключатели», для контроля и регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторный переключатель, например, «аварийный выключатель», позволяющий обеспечить контролируемую смерть клетки, содержащей зкДНК-вектор. Указанные цис-регуляторные элементы включают, не ограничиваясь перечисленными, промотор, рибопереключатель, инсулятор, miR-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ITR может действовать как промотор для трансгена.

[0017] Согласно некоторым вариантам реализации указанные две самокомплементарные последовательности могут представлять собой модифицированные последовательности ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как AAV (например, AAV1-AAV12). Может быть использован любой серотип AAV, в том числе, но не ограничиваясь указанным, модифицированную последовательность AAV2 ITR, в которой сохранен сайт связывания Rep (RBS), такой как 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), и сайт концевого разрешения (trs), наряду с вариабельной палиндромной последовательностью, обеспечивающей формирование вторичной шпилечной структуры. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR представляет собой синтетическую последовательность ITR, в которой может быть сохранен функциональный сайт связывания Rep (RBS), такой как 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), и сайт концевого разрешения (TRS), наряду с вариабельной палиндромной последовательностью, обеспечивающей формирование вторичной шпилечной структуры. Согласно некоторым примерам в модифицированных последовательностях ITR сохранена последовательность RBS, trs, а также структура и положение связывающего Rep элемента, образующего участок концевой петли одной из шпилечных вторичных структур ITR из соответствующей последовательности ITR дикого типа, например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, и 10, 11 и 12.

[0018] Примеры модифицированных последовательностей ITR для применения в зкДНК-векторах, содержащих симметричные модифицированные ITR, приведены в таблице 4 в настоящем документе, где показаны пары ITR (модифицированный 5' ITR и симметричный модифицированный 3' ITR). Примеры модифицированных последовательностей ITR для применения в зкДНК-векторах выбирают из любых следующих модифицированных пар ITR: SEQ ID NO: 484 (ITR-33, левый) и SEQ ID NO: 469 (ITR-18, правый); SEQ ID NO: 485 (ITR-34, левый) и SEQ ID NO: 95 (ITR-51, правый); SEQ ID NO: 486 (ITR-35, левый) и SEQ ID NO: 470 (ITR-19, правый); SEQ ID NO: 487 (ITR-36, левый) и SEQ ID NO: 471 (ITR-20, правый); SEQ ID NO: 488 (ITR-37, левый) и SEQ ID NO: 472 (ITR-21, правый); SEQ ID NO: 489 (ITR-38, левый) и SEQ ID NO: 473 (ITR-22, правый); SEQ ID NO: 490 (ITR-39, левый) и SEQ ID NO: 474 (ITR-23, правый); SEQ ID NO: 491 (ITR-40, левый) и SEQ ID NO: 475 (ITR-24, правый); SEQ ID NO: 492 (ITR-41, левый) и SEQ ID NO: 476 (ITR-25, правый); SEQ ID NO: 493 (ITR-42, левый) и SEQ ID NO: 477 (ITR-26, правый); SEQ ID NO: 494 (ITR-43, левый) и SEQ ID NO: 478 (ITR-27, правый); SEQ ID NO: 495 (ITR-44, левый) и SEQ ID NO: 479 (ITR-28, правый); SEQ ID NO: 496 (ITR-45, левый) и SEQ ID NO: 480 (ITR-29, правый); SEQ ID NO: 497 (ITR-46, левый) и SEQ ID NO: 481 (ITR-30, правый); SEQ ID NO: 498 (ITR-47, левый) и SEQ ID NO: 482 (ITR-31, правый); SEQ ID NO: 499 (ITR-48, левый) и SEQ ID NO: 483 (ITR-32, правый).

[0019] Согласно некоторым вариантам реализации примеры модифицированных последовательностей ITR для применения в зкДНК-векторах содержат частичные последовательности ITR, выбранного из следующих пар последовательностей: SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 и SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 и SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 и SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 и SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 и SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 и SEQ ID NO: 546, также показанных на фиг. 6В-21В.

[0020] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать ITR с модификацией в каждом ITR, соответствующей любой из модификаций в последовательностях ITR или частичных последовательностях ITR, приведенных в таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10А-10В в PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., причем фланкирующая последовательность ITR симметрична (например, обратно-комплементарна) ей или по существу симметрична согласно определению в настоящем документе, т.е., ITR имеют симметричную трехмерную пространственную организацию.

[0021] В неограничивающем типовом примере согласно настоящему изобретению предложен ДНК-вектор с замкнутыми концами, содержащий промотор, функционально связанный с трансгеном, с регуляторным переключателем или без него, отличающийся тем, что указанная зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. фиг. 1А-В), которая кодирует симметричные ITR, причем каждый модифицированный ITR содержит одинаковое число пар оснований во внутримолекулярных дуплексах во вторичной шпилечной конфигурации (предпочтительно исключая делению какой-либо концевой петли ААА или ТТТ в указанной конфигурации относительно указанных референсных последовательностей), и (b) идентифицирована как зкДНК с применением анализа для идентификации зкДНК с применением электрофореза в агарозном геле в нативном геле и в денатурирующих условиях в примере 1.

[0022] Согласно одному варианту реализации фланкирующие модифицированные ITR по существу симметричны друг другу. Согласно указанному варианту реализации модификация идентична - добавление, замена или делеция одинаковы, однако указанные ITR не представляют собой идентичные обратные комплементы. Согласно такому варианту реализации указанная пара модифицированных ITR по существу является симметричными, имея симметричную трехмерную пространственную организацию, однако не содержит идентичных обратно-комплементарных нуклеотидных последовательностей. Иначе говоря, согласно некоторым вариантам реализации указанные ITR из пары mod-ITR могут содержать разные обратно-комплементарные последовательности нуклеотидов, но все же иметь одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию - то есть оба ITR содержат мутации, которые приводят к формированию одной и той же общей трехмерной формы. Например, один ITR (например, 5' ITR) в паре mod-ITR может быть взят из одного серотипа, а другой ITR (например, 3' ITR) - из другого серотипа, однако оба могут содержать одинаковую соответствующую мутацию (например, если 5' ITR содержит делецию в области С, когнатный модифицированный 3' ITR из другого серотипа содержит делецию в соответствующем положении в области С'), так что указанная пара модифицированных ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. Согласно таким вариантам реализации каждый ITR в паре модифицированных ITR может быть взят из разных серотипов (например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), как, например, в комбинации AAV2 и AAV6, причем модификация в одном ITR отражена в аналогичном положении в когнатном ITR из другого серотипа. Согласно одному варианту реализации пара по существу симметричных модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR) при условии, что различие нуклеотидных последовательностей указанных ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. Например, mod-ITR, последовательность которого по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности канонического mod-ITR по оценке с применением стандартных способов, хорошо известных в данной области техники, таких как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), BLASTN с параметрами, установленными по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерная структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара mod-ITR содержит одинаковые петли А, С-С' и В-В' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR содержит делецию в плече С-С', то когнатный mod-ITR содержит соответствующую делецию в петле С-С', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных петель А и В-В' с такой же формой в геометрическом пространстве, что и у когнатного mod-ITR.

[0023] Согласно некоторым вариантам реализации указанный структурный элемент ITR может представлять собой любой структурный элемент, который вовлечен в функциональное взаимодействие указанного ITR с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). Согласно некоторым вариантам реализации указанный структурный элемент обеспечивает избирательность взаимодействия ITR с большим белком Rep, т.е., по меньшей мере частично определяет, какой белок Rep функционально взаимодействует с указанным ITR. Согласно другим вариантам реализации указанный структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ITR. Каждый структурный элемент может представлять собой, например, вторичную структуру ITR, нуклеотидную последовательность ITR, промежуточную последовательность между двумя или более элементами, или комбинацию чего-либо из вышеперечисленного. Согласно одному варианту реализации указанные структурные элементы выбраны из группы, состоящей из плеча А и плеча А', плеча В и плеча В', плеча С и плеча С', плеча D, сайта связывания Rep (RBE) и RBE' (т.е., комплементарной RBE последовательности), и сайта концевого разрешения (trs).

[0024] В частности, указанный ITR может быть модифицирован структурно. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована относительно последовательности ITR дикого типа. Согласно одному варианту реализации указанный структурный элемент (например, плечо А, плечо А', плечо В, плечо В', плечо С, плечо С', плечо D, RBE, RBE' и trs) ITR может быть удален и заменен на структурный элемент дикого типа из другого парвовируса. Например, заменяющая структура может быть взята из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), бычьего парвовируса, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, свиного парвовируса или AAV насекомых. Например, ITR может представлять собой AAV2 ITR, а плечо А или А', или RBE может быть заменено структурным элементом из AAV5. Согласно другому примеру указанный ITR может представлять собой AAV5 ITR, а плечи С или С', RBE и trs могут быть заменены структурным элементом из AAV2. Согласно другому примеру AAV ITR может представлять собой AAV5 ITR, в котором плечи В и В' заменены плечами В и В' AAV2 ITR.

[0025] В неограничивающем примере в таблице 3 приведены примеры модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, вставки и/или замены) в областях модифицированных ITR, где Х указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, вставку и/или замену) в указанном фрагменте относительно соответствующего ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, инсерция и/или замена) в любой из областей С, и/или С', и/или В, и/или В' сохраняются три последовательных нуклеотида Т (т.е., ТТТ) по меньшей мере в одной концевой петле. Например, если модификация приводит к получению чего-либо из: ITR с единственным плечом (например, с единственным плечом С-С' или с единственным плечом В-В') или с модифицированным плечом С-В' или С'-В, или ITR с двумя плечами, содержащего по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо С-С' и/или усеченное плечо В-В'), то по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плеч ITR с двумя плечами (где одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида Т (т.е. ТТТ) по меньшей мере в одной концевой петле. Согласно некоторым вариантам реализации усеченное плечо С-С' и/или усеченное плечо В-В' содержит три последовательных нуклеотида Т (т.е., ТТТ) в концевой петле.

[0026] Технология, описанная в настоящем документе, также относится к зкДНК-вектору, который способен доставлять и кодировать один или более трансгенов в целевой клетке, например, если указанный зкДНК-вектор содержит мультицистронную последовательность, или если указанный трансген и его природный геномный контекст (например, трансген, интроны и эндогенные нетранслируемые области) вместе включены в указанный зкДНК-вектор. Указанные трансгены могут представлять собой кодирующие белок транскрипты, некодирующие транскрипты, или и то, и другое. Указанный зкДНК-вектор может содержать несколько кодирующих последовательностей и неканонический сайт инициации трансляции или более одного промотора для экспрессии кодирующих белок транскриптов, некодирующих транскриптов или и первого, и второго. Указанный трансген может содержать последовательность, кодирующую более одного белка, или может представлять собой последовательность некодирующего транскрипта. Указанная экспрессионная кассета может содержать, например, более чем 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10 000 нуклеотидов или 20 000 нуклеотидов, или 30 000 нуклеотидов, или 40 000 нуклеотидов, или 50 000 нуклеотидов, или любое число в диапазоне приблизительно от 4000 до 10 000 нуклеотидов или от 10 000 до 50 000 нуклеотидов, или более чем 50 000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру заключенных в капсид AAV-векторов, что позволяет доставлять экспрессионную кассету значительного размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгенов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор лишен специфического для прокариот метилирования.

[0027] Указанная экспрессионная кассета может также содержать участок внутренней посадки рибосомы (IRES) и/или 2А-элемент. Цис-регуляторные элементы включают, не ограничиваясь перечисленными, промотор, рибопереключатель, инсулятор, miR-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ITR может действовать в качестве промотора для трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена. Например, дополнительный регуляторный компонент может представлять собой регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе, в том числе, но не ограничиваясь указанным, «аварийный выключатель», который способен убивать инфицированную зкДНК клетку, при необходимости, и другие индуцируемые и/или репрессируемые элементы.

[0028] Описанная в настоящем документе технология также обеспечивает новые способы доставки и эффективной избирательной экспрессии одного или более трансгенов с применением указанных зкДНК-векторов. ЗкДНК-вектор может поглощаться клетками-хозяевами, а также транспортироваться в ядро в отсутствие капсида AAV. Кроме того, зкДНК-векторы, описанные в настоящем документе, не имеют капсида и, соответственно, избегают иммунного ответа, который может возникать в ответ на капсид-содержащие векторы.

[0029] Аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения зкДНК-векторов, описанных в настоящем документе. Другие варианты реализации относятся к зкДНК-вектору, полученному с применением способа согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации указанный бескапсидный невирусный ДНК-вектор (зкДНК-вектор) получают из плазмиды (называемой в настоящем документе «зкДНК-плазмидой»), содержащей матричную полинуклеотидную экспрессионную конструкцию, содержащую в указанном порядке: первый 5' инвертированный концевой повтор (например, AAV ITR); экспрессионную кассету; и 3' ITR (например, AAV ITR), при этом 5' и 3' ITR представляют собой модифицированные ITR относительно ITR дикого типа, и указанные модификации одинаковы друг относительно друга, т.е., указанные ITR симметричны (т.е., представляют собой зеркально отображенные структуры) друг относительно друга.

[0030] ЗкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может быть получен несколькими способами, которые будут понятны среднему специалисту в данной области техники после прочтения настоящего документа. Например, матричная полинуклеотидная экспрессионная конструкция, используемая для получения зкДНК-векторов согласно настоящему описанию, может представлять собой зкДНК-плазмиду (например, см. таблицу 7 или фиг. 1В или 6В), зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. Согласно одному варианту реализации указанная зкДНК-плазмида содержит сайт рестрикционного клонирования (например, SEQ ID NO: 7), функционально расположенный между ITR, куда может быть инсертирована экспрессионная кассета, содержащая, например, промотор, функционально связанный с трансгеном, например, репортерным геном и/или терапевтическим геном). Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы получают из полинуклеотидной матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса), содержащей модифицированные симметричные 5' и 3' ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, при этом модификация представляет собой что-либо одно или более из делеции, инсерции и/или замены относительно последовательностей AAV2 или AAV3 ITR дикого типа.

[0031] В пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, полинуклеотидная матрица, содержащая по меньшей мере один модифицированный ITR, реплицируется, продуцируя зкДНК-векторы. Продуцирование зкДНК-вектора проходит в два этапа: во-первых, вырезание («высвобождение») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловирусного генома и т.п.) посредством белков Rep; и, во-вторых, опосредованной Rep репликации вырезанного зкДНК-вектора. Белки Rep и сайты связывания Rep у различных серотипов AAV хорошо известны специалистам в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет понятно, как выбрать белок Rep серотипа, который связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты и реплицирует ее, на основе по меньшей мере одного функционального ITR. Например, если репликативно-компетентный модифицированный ITR взят из серотипа AAV2, соответствующий Rep будет взят из серотипа AAV, который работает с указанным серотипом, например, AAV2 ITR для Rep AAV2 или AAV4, но не для Rep AAV5, который не будет работать. После репликации зкДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами продолжает накапливаться в пермиссивных клетках, и зкДНК-вектор предпочтительно является достаточно стабильным во времени в присутствии белка Rep в стандартных условиях репликации, например, для накопления в количестве, составляющем по меньшей мере 1 пг/клетку, предпочтительно по меньшей мере 2 пг/клетку, предпочтительно, по меньшей мере 3 пг/клетку, более предпочтительно по меньшей мере 4 пг/клетку, еще более предпочтительно по меньшей мере 5 пг/клетку.

[0032] Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к способу, включающему следующие этапы: а) инкубация популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих указанную матричную полинуклеотидную экспрессионную конструкцию (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая не содержит последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в эффективных условиях и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, причем указанные клетки-хозяева не содержат последовательностей, кодирующих вирусный капсид; и b) сбор и выделение указанного зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако экспрессии вирусных частиц (например, вирионов AAV) не происходит. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, накладываемые вир ионами.

[0033] Присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа расщепленного материала ДНК на денатурирующем и неденатурирующем гелях для подтверждения присутствия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

[0034] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя фланкирующими последовательностями симметричных инвертированных концевых повторов (симметричными ITR), причем указанные симметричные ITR не являются ITR дикого типа и каждый из фланкирующих ITR содержит одинаковую симметричную модификацию. В соответствии с одним вариантом реализации указанные симметричные последовательности ITR являются синтетическими. Согласно некоторым вариантам реализации указанные ITR выбирают из любых перечисленных в таблице 4. Согласно некоторым вариантам реализации каждый из указанных симметричных ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из А, А', В, В', С, С', D и D'. Согласно некоторым вариантам реализации указанная делеция, инсерция и/или замена приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями А, А', В, В' С или С'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями В и В'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции всей структуры «петля-на-стебле» или ее части, обычно образуемой областями С и С'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR модифицирован делецией, инсерцией и/или заменой, которая приводит к делеции части структуры «петля-на-стебле», обычно образуемой областями В и В' и/, или части структуры «петля-на-стебле», обычно образуемой областями С и С'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR содержит единственную структуру «петля-на-стебле» в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR содержит единственный стебель и две петли в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'. Согласно некоторым вариантам реализации симметричный ITR содержит единственный стебель и единственную петлю в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С'. Согласно некоторым вариантам реализации указанные симметричные ITR представляют собой модифицированный AAV2 ITR, содержащий последовательности нуклеотидов, выбранные из: ITR на фиг. 7А-22В или в таблице 4 в настоящем документе, и ITR, последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична ITR, приведенным в таблице 4 или представленным на фиг 7А-22В. Согласно некоторым вариантам реализации вся гетерологичная нуклеотидная последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.

[0035] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен невирусный бескапсидный ДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), при этом вся гетерологичная нуклеотидная последовательность или ее часть находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности WT-ITR представляют собой симметричные последовательности WT-ITR или по существу симметричные последовательности WT-ITR. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности WT-ITR выбирают из любых комбинаций WT-ITR, приведенных в таблице 1. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность фланкирующего WT-ITR по меньшей мере на 95% идентична ITR, приведенному в таблице 1 или таблице 2, и все замены представляют собой консервативные замены нуклеиновых кислот, которые не влияют на структуру WT-ITR. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один регуляторный переключатель выбирают из любых регуляторных переключателей или из комбинации регуляторных переключателей, перечисленных в таблице 5, или в разделе с названием «Регуляторные переключатели» в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор при расщеплении рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализе путем нативного и денатурирующего гель-электрофореза, демонстрирует характерные полосы линейной и непрерывной ДНК по сравнению с контрольной линейной и прерывистой ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности ITR основаны на последовательностях из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV). Согласно некоторым вариантам реализации указанные ITR основаны на последовательностях из аденоассоциированного вируса (AAV). Согласно некоторым вариантам реализации указанные ITR основаны на последовательностях из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12. Согласно некоторым вариантам реализации указанный вектор находится в наноносителе. Согласно некоторым вариантам реализации указанный наноноситель содержит липидную наночастицу (ЛНЧ).

[0036] В соответствии с некоторыми аспектами и вариантами реализации настоящего изобретения указанный зкДНК-вектор получают способом, включающим следующие этапы: (а) инкубация популяции клеток насекомых, несущих экспрессионную конструкцию зкДНК, в присутствии по меньшей мере одного белка Rep, при этом указанная экспрессионная конструкция зкДНК кодирует зкДНК-вектор, в эффективных условиях и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках насекомых; и (b) выделение указанного зкДНК-вектора из клеток насекомых. Согласно некоторым вариантам реализации указанную экспрессионную конструкцию зкДНК выбирают из зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды и зкДНК-бакуловируса. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка насекомого экспрессирует по меньшей мере один белок Rep. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (AAV). Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один белок Rep взят из AAV серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.

[0037] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена экспрессионная конструкция зкДНК, которая кодирует зкДНК-вектор согласно любым аспектам и вариантам реализации настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации указанная конструкция представляет собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус.

[0038] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая экспрессионную конструкцию зкДНК согласно любым описанным здесь аспектам или вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка-хозяин экспрессирует по меньшей мере один белок Rep. Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один белок Rep взят из вируса, выбранного из парвовируса, депендо вируса и аденоассоциированного вируса (AAV). Согласно некоторым вариантам реализации указанный по меньшей мере один белок Rep взят из AAV серотипа, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.

[0039] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения зкДНК-вектора, включающий (а) инкубацию клетки-хозяина согласно любым аспектам и вариантам реализации настоящего изобретения в эффективных условиях и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора; и (b) выделение указанной зкДНК из клеток-хозяев.

[0040] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ лечения, предотвращения, облегчения, мониторинга или диагностики заболевания или расстройства у субъекта, при этом указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор согласно любым аспектам и вариантам реализации настоящего изобретения, отличающийся тем, что указанную по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность выбирают для лечения, предотвращения, облегчения, диагностики или мониторинга заболевания или расстройства. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, при ее транскрипции или трансляции, корректирует аномальное количество эндогенного белка у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, при ее транскрипции или трансляции, корректирует аномальную функцию или активность эндогенного белка или пути у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует или содержит нуклеотидную молекулу, выбранную из группы, состоящей из РНКи, киРНК, миРНК, днкРНК и антисмыслового олиго- или полинуклеотида. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует белок. Согласно некоторым вариантам реализации указанный белок представляет собой маркерный белок (например, а репортерный белок). Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует агонист или антагонист эндогенного белка или пути, ассоциированного с указанным заболеванием или расстройством. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует антитело. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из метаболического заболевания или расстройства, заболевания или расстройства ЦНС, заболевания или расстройства глаз, заболевания или расстройства крови, заболевания или расстройства печени, иммунного заболевания или расстройства, инфекционного заболевания, заболевания или расстройства мышц, рака; и заболевания или расстройства, основанного на аномальном уровне и/или функции генного продукта. Согласно некоторым вариантам реализации указанное метаболическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из диабета, расстройства лизосомального накопления, мукополисахаридного расстройства, заболевания или нарушения цикла мочевины, и болезни или расстройства накопления гликогена. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство лизосомального накопления выбрано из группы, состоящей из болезни Гоше, болезни Помпе, метахроматической лейкодистрофии (MLD), фенилкетонурии (PKU) и болезни Фабри. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или нарушение цикла мочевины представляет собой дефицит орнитинтранскарбамилазы (ОТС). Согласно некоторым вариантам реализации указанное мукополисахаридное расстройство выбрано из группы, состоящей из синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо, синдрома Моркио и синдрома Марото-Лами. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство ЦНС выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона, болезни Канавана, синдрома Лея, болезни Рефсума, синдрома Туретта, первичного бокового склероза, амиотрофического бокового склероза, прогрессирующей мышечной атрофии, болезни Пика, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, тяжелой миастении, болезни Бинсвангера, травмы, обусловленной повреждением спинного мозга или головы, болезни Тея-Сакса, болезни Леша-Нихена, эпилепсии, церебрального инфаркта, психических расстройств, шизофрении, лекарственной или наркотической зависимости, неврозов, психозов, деменции, паранойи, расстройства дефицита внимания, расстройств сна, болевых расстройств, расстройств пищевого поведения или массы тела, а также рака и опухолей ЦНС. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство глаз выбрано из группы, состоящей из офтальмологического расстройства, затрагивающего сетчатку, задний путь и/или зрительный нерв. Согласно некоторым вариантам реализации указанное офтальмологическое расстройство, затрагивающее сетчатку, задний путь и/или зрительный нерв, выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, макулярной дегенерации, в том числе возрастной макулярной дегенерации, географической атрофии и сосудистой или «влажной» формы макулярной дегенерации, глаукомы, увеита, пигментного ретинита, болезни Штаргардта, врожденного амавроза Лебера (LCA), синдрома Ушера, эластической псевдоксантомы (РХЕ), х-хромосомного пигментного ретинита (XLRP), х-хромосомного расслоения сетчатки (XLRS), хороидеремии, врожденной нейропатии зрительного нерва Лебера (LHON), ахроматопсии, палочко-колбочковой дистрофии, эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, диабетического макулярного отека и рака и опухолей глаз. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство крови выбрано из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, талассемии, анемии и рака крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство печени выбрано из группы, состоящей из прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза (PFIC) и рака печени, а также опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание или расстройство представляет собой кистозный фиброз. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0041] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ доставки терапевтического белка субъекту, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор согласно любым аспектам и вариантам реализации настоящего изобретения, при этом указанная по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок. Согласно некоторым вариантам реализации указанный терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело. Согласно некоторым вариантам реализации указанный терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фермента, эритропоэтина, ангиостатина, эндостатина, супероксиддисмутазы, глобина, лептина, каталазы, тирозингидроксилазы, цитокина, регулятора трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR), пептидного фактора роста и гормона.

[0042] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий зкДНК-вектор согласно любым аспектам и вариантам реализации настоящего изобретения, и наноноситель, упакованные в контейнер с вкладышем в упаковку.

[0043] В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения предложен набор для получения зкДНК-вектора, отличающийся тем, что указанный набор содержит экспрессионную конструкцию, содержащую по меньшей мере один сайт рестрикции для инсерции по меньшей мере одной гетерологичной нуклеотидной последовательности или регуляторного переключателя, или и первого, и второго, причем указанный по меньшей мере один сайт рестрикции, функционально расположенный либо между (i) последовательностями симметричных инвертированных концевых повторов (симметричных ITR), при этом указанные симметричные ITR не являются ITR дикого типа, либо между (ii) двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR). Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор подходит для получения зкДНК-вектора в соответствии с любым из аспектов и вариантов реализации настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор дополнительно содержит популяцию клеток насекомых, которая не содержит последовательностей, кодирующих вирусный капсид, которые в присутствии белка Rep могут индуцировать продуцирование указанного зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор дополнительно содержит вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере один белок Rep, отличающийся тем, что указанный вектор подходит для экспрессии указанного по меньшей мере одного белка Rep в клетке насекомого.

[0044] Указанные и другие аспекты настоящего изобретения подробнее описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0045] На фиг. 1А приведен пример структуры зкДНК-вектора. Согласно указанному варианту реализации указанный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытую рамку считывания (ORF), кодирующую трансген (например, люциферазу), инсертируют в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя симметричными инвертированными концевыми повторами (ITR) - то есть модифицированный 5' ITR и модифицированный 3' ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, симметричны друг другу.

[0046] На фиг. 1В приведен пример структуры зкДНК-вектора (или соответствующей последовательности, присутствующей в примере зкДНК-плазмиде) с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, открытую рамку считывания (ORF) для инсерции трансгена, посттранскрипционный элемент (WPRE) и поли(А)-сигнал. Открытая рамка считывания (ORF) позволяет инсертировать трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Указанная экспрессионная кассета фланкирована двумя симметричными инвертированными концевыми повторами (ITR) - то есть модифицированный ITR выше (на 5'-конце) и модифицированный ITR ниже (на 3'-конце) указанной экспрессионной кассеты, причем и 5' ITR, и 3' ITR представляют собой модифицированные ITR, но содержат одинаковые модификации (т.е., они представляют собой зеркально отображенные друг относительно друга структуры, т.е., симметричны друг другу).

[0047] На фиг. 2А приведен пример структуры зкДНК-вектора. Согласно указанному варианту реализации указанный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытую рамку считывания (ORF), кодирующую трансген (например, люциферазу), инсертируют в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Указанная экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR) то есть 5' WT-ITR и 3' WT-ITR, фланкирующими указанную экспрессионную кассету.

[0048] На фиг. 2В приведен пример структуры зкДНК-вектора (или соответствующей последовательности, присутствующей в примере зкДНК-плазмиды) с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, открытую рамку считывания (OKF) для инсерции трансгена, посттранскрипционный элемент (WPRE) и поли(А)-сигнал. Открытая рамка считывания (OKF) позволяет инсертировать трансген в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Указанная экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами WT (WT-ITR) - то есть WT-ITR выше (на 5'-конце) и WT-ITR ниже (на 3'-конце) указанной экспрессионной кассеты, причем указанные 5' WT-ITR и 3' WT-ITR могут быть взяты из одного серотипа или из разных серотипов.

[0049] На фиг. 3А показана Т-образная структура «петля-на-стебле» левого ITR дикого типа из AAV2 (SEQ ID NO: 538) с указанными плечом А-А', плечом В-В', плечом С-С', двумя сайтами связывания Rep (RBE и RBE'); также показан сайт концевого разрешения (trs). RBE содержит ряд из 4 дуплексных тетрамеров, предположительно, взаимодействующих с Rep 78 либо с Rep 68. Кроме того, RBE' также предположительно взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ITR дикого типа или мутированном ITR в указанной конструкции. Области D и D' содержат сайты связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры. На фиг. 3В показана предполагаемая катализируемая Rep никирующая и лигирующая активность в левом ITR дикого типа (SEQ ID NO: 539), в том числе Т-образная структура «петля-на-стебле» левого ITR дикого типа AAV2 с указанием плеча А-А', плеча В-В', плеча С-С', двух сайтов связывания Rep (RBE и RBE'); также показан сайт концевого разрешения (trs), и области D и D', содержащие несколько сайтов связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры.

[0050] На фиг. 4А представлена первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) содержащих RBE частей плеча А-А', плеча С-С' и плеча В-В' левого ITR AAV2 дикого типа (SEQ ID NO: 540). На фиг. 4В показан пример последовательности мутированного ITR (также называемого модифицированным ITR) для левого ITR. Показана первичная структура (слева) и предсказанная вторичная структура (справа) RBE-части плеча А-А', плеча С и плеча В-В' из примера мутированного левого ITR (ITR-1, левый) (SEQ ID NO: 113). На фиг. 4С показана первичная структура (слева) и вторичная структура (справа) содержащей RBE части петли А-А', и плечи В-В' и С-С' правого ITR дикого типа AAV2 (SEQ ID NO: 541). На фиг. 4D показана первичная структура (слева) и вторичная структура (справа) содержащей RBE части петли А-А, плеча В-В' и плеча С-С' правого AAV2 ITR дикого типа (SEQ ID NO: 541). На фиг. 4Е показан пример правого модифицированного ITR. Представлены первичная структура (слева) и предсказанная вторичная структура (справа) содержащей RBE части плеча А-А', плеча В-В' и плеча С примера мутантного правого ITR (ITR-1, правый) (SEQ ID NO: 114). Может быть использована любая комбинация левого и правого ITR (например, AAV2 ITR другого вирусного серотипа или синтетических ITR) при условии, что левый ITR симметричен или обратно-комплементарен правому ITR. Каждая из полинуклеотидных последовательностей на фиг. 3A-3D относится к последовательности, используемой в плазмиде или бакмиде/бакуловирусном геноме, используемых для продуцирования зкДНК согласно описанию в настоящем документе. Также в каждую из фиг. 4А-4Е включены соответствующие вторичные структуры зкДНК, полученные на основании конфигураций зкДНК-вектора в плазмиде или бакмиде/бакуловирусном геноме и предсказанных значений свободной энергии Гиббса.

[0051] На фиг. 5А приведено схематическое изображение «апстрим»-процесса получения инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (ВИС), которые подходят для получения зкДНК способом, схематически представленным на фиг. 5В. На фиг. 5В схематически представлен пример способа получения зкДНК, а фиг. 5С иллюстрирует биохимический способ и процесс подтверждения получения зкДНК-вектора. На фиг. 5D и фиг. 5Е представлены схематические изображения, описывающие способ идентификации присутствия зкДНК в ДНК, собранной из клеточных осадков, полученных в процессе получения зкДНК в соответствии с фиг. 4В. На фиг. 5Е показана ДНК, имеющая прерывистую структуру. зкДНК может быть разрезана рестрикционной эндонуклеазой, имеющей один сайт распознавания на зкДНК-векторе, с образованием двух фрагментов ДНК разного размера (1 кб и 2 кб) как в нейтральных, так и в денатурирующих условиях. На фиг. 5Е также показана зкДНК, имеющая линейную и непрерывную структуру. Указанный зкДНК-вектор может быть разрезан рестрикционной эндонуклеазой с образованием двух фрагментов ДНК, которые мигрируют в виде фрагментов размером 1 кб и 2 кб в нейтральных условиях, однако в денатурирующих условиях указанные цепи остаются соединенными и образуют одиночные цепи, которые мигрируют и образуют одиночные цепи, которые мигрируют в виде фрагментов размером 2 кб и 4 кб. На фиг. 5D схематически показаны ожидаемые полосы для примера зкДНК, либо оставленной нерасщепленной, либо расщепленной рестрикционной эндонуклеазой, после чего подвергнутой электрофорезу на нативном геле или на денатурирующем геле. На крайней схеме слева показан нативный гель и несколько полос, указывающих на то, что в дуплексной и неразрезанной форме зкДНК существует по меньшей мере в мономерном и димерном состояниях, которые проявляются в виде быстрее мигрирующего мономера меньшего размера и медленнее мигрирующего димера с размером, в 2 раза большим, чем у мономера. Второе слева схематическое изображение демонстрирует, что при разрезании зкДНК рестрикционной эндонуклеазой, исходные полосы исчезают, и появляются быстрее мигрирующие полосы (например, меньшего размера), которые соответствуют ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует в виде объекта вдвое большего размера по сравнению с наблюдаемым на нативном геле, поскольку комплементарные цепи ковалентно связаны. Соответственно, на второй справа схеме расщепленная зкДНК демонстрирует распределение полос, аналогичное наблюдаемому на нативном геле, однако указанные полосы мигрируют как фрагменты, размер которых в два раза больше их эквивалентов на нативном геле. Крайняя справа схема демонстрирует, что неразрезанная зкДНК в денатурирующих условиях мигрирует в виде одноцепочечного раскрытого кольца, и, соответственно, наблюдаемые полосы имеют в два раза больший размер, чем наблюдаемые в нативных условиях, когда кольцо не раскрыто. На указанной фигуре «кб» используется для указания относительного размера нуклеотидных молекул, основанного, в зависимости от контекста, либо на длине нуклеотидной цепи (например, для одноцепочечных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях), либо на числе пар оснований (например, для двуцепочечных молекул, наблюдаемых в нативных условиях).

[0052] На фиг. 6А представлен пример Rep-бакмиды в плазмиде pFBDLSR содержащей последовательности нуклеиновых кислот для белков Rep Rep52 и Rep78. Указанный пример Rep-бакмиды содержит: фрагмент промотора IE1 (SEQ ID NO: 66); нуклеотидную последовательность Rep78, в том числе последовательность Kozak (SEQ ID NO: 67), последовательность промотора полиэдрина Rep52 (SEQ ID NO: 68) и нуклеотидную последовательность Rep58, начиная с последовательности Козак gccgccacc) (SEQ ID NO: 69). На фиг. 6В приведена схема примера зкДНК-плазмиды с модифицированным левым ITR (L-модифицированным ITR), промотором CAG, трансгеном люциферазы, WPRE и последовательностью полиаденилирования, и модифицированным правым ITR (R-модифицированный ITR), причем указанные L-модифицированный ITR и R-модифицированный ITR симметричны друг другу. На фиг. 6С приведена схема примера зкДНК-плазмиды с левым WT-ITR (L-WT-ITR), промотором CAG, трансгеном люциферазы, WPRE и последовательностью полиаденилирования, и правым WT-ITR (R-WT ITR).

[0053] На фиг. 7А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-33 (левый)» SEQ ID NO: 101); на фиг. 7В показан когнатный симметричный правый ITR (ITR-18, правый) с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-18 (правый)» SEQ ID NO: 102). И ITR-33 (левый), и ITR-18 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с единственным плечом (т.е. единственным плечом С-С').

[0054] На фиг. 8А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-34 (Левый)» SEQ ID NO: 103); на фиг. 8В показан когнатный симметричный правый ITR (ITR-51, правый) с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-51 (Правый)» SEQ ID NO: 96). И ITR-34 (левый), и ITR-51 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с единственным плечом (т.е. единственным плечом В-В').

[0055] На фиг. 9А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-35 (Левый)» SEQ ID NO: 105), а на фиг. 9В показан когнатный симметричный правый ITR (ITR-19, правый) с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированный правого ITR («ITR-35 (правый)» SEQ ID NO: 105). И ITR-35 (левый), и ITR-19 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с единственным плечом (т.е. единственным плечом С-С').

[0056] На фиг. 10А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-36 (Левый)» SEQ ID NO: 454), а на фиг. 10В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-20 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-20 (Правый)» SEQ ID NO: 116). И ITR-36 (левый), и ITR-20 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0057] На фиг. 11А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-37 (Левый)» SEQ ID NO: 111), а на фиг. 11В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-21 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-21 (Правый)» SEQ ID NO: 112). И ITR-37 (левый), и ITR-21 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с единственным стеблем (например, единственную структуру «петля-на-стебле» в области, которая обычно содержит первую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями В и В', и вторую структуру «петля-на-стебле», образуемую областями С и С').

[0058] На фиг. 12А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-38 (Левый)» SEQ ID NO: 117), а на фиг. 12В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-22 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-22 (Правый)» SEQ ID NO: 118). И ITR-38 (левый), и ITR-22 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо В-В' является усеченным).

[0059] На фиг. 13А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-39 (Левый)» SEQ ID NO: 119), а на фиг. 13В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-23 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-23 (Правый)» SEQ ID NO: 120). И ITR-39 (левый), и ITR-23 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо В-В' является усеченным).

[0060] На фиг. 14А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-40 (Левый)» SEQ ID NO: 121), а на фиг. 14В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-24 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-24 (Правый)» SEQ ID NO: 122). И ITR-40 (левый), и ITR-24 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо В-В' является усеченным).

[0061] На фиг. 15А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-41 (Левый)» SEQ ID NO: 107), а на фиг. 15В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-25 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-25 (Правый)» SEQ ID NO: 108). И ITR-41 (левый), и ITR-25 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо В-В' является усеченным).

[0062] На фиг. 16А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-42 (Левый)» SEQ ID NO: 123), а на фиг. 16В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-26 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-26 (Правый)» SEQ ID NO: 124). И ITR-42 (левый), и ITR-26 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является удлиненным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0063] На фиг. 17А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-43 (Левый)» SEQ ID NO: 125), а на фиг. 17В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-27 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-27 (Правый)» SEQ ID NO: 126). И ITR-43 (левый), и ITR-27 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является удлиненным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0064] На фиг. 18А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-44 (Левый)» SEQ ID NO: 127), а на фиг. 18В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-28 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-28 (Правый)» SEQ ID NO: 128). И ITR-44 (левый), и ITR-28 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0065] На фиг. 19А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-45 (Левый)» SEQ ID NO: 129), а на фиг. 19В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-29 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-29 (Правый)» SEQ ID NO: 130). И ITR-45 (левый), и ITR-29 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0066] На фиг. 20А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-46 (Левый)» SEQ ID NO: 131), а на фиг. 20В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-30 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-30 (Правый)» SEQ ID NO: 132). И ITR-46 (левый), и ITR-30 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0067] На фиг. 21А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-47 (Левый)» SEQ ID NO: 133), а на фиг. 21В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-31 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-31 (Правый)» SEQ ID NO: 134). И ITR-47 (левый), и ITR-31 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0068] На фиг. 22А показана предсказанная структура с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного левого ITR («ITR-48 (Левый)» SEQ ID NO: 547), а на фиг. 22В показан когнатный симметричный правый ITR («ITR-32 (правый)») с предсказанной структурой с наименьшей энергией содержащей RBE части плеча А-А' и частей С-С' и В-В' примера модифицированного правого ITR («ITR-32 (Правый)» SEQ ID NO: 546). И ITR-48 (левый), и ITR-32 (правый) согласно прогнозу образуют структуру с двумя плечами, одно из которых является усеченным (например, плечо С-С' является усеченным).

[0069] На фиг. 23 показана люциферазная активность клеток насекомых Sf9 GlycoBac, трансфицированных 16 зкДНК с вариантами симметричных мутантных ITR из таблицы 4 (также см. таблицу 7 для полных конструкций). ЗкДНК-вектор содержал ген люциферазы, фланкированный симметричными мутантными ITR, выбранными из таблицы 4. «Ложные» условия представлены только реагентами для трансфекции, без донорной ДНК.

[0070] На фиг. 24А и фиг. 24В показана активность GFP в клетках насекомых Sf9 GlycoBac, трансфицированных конструкцией WT/WT ITR, описанной в примере 4. ЗкДНК-вектор содержал ген GFP, фланкированный ITR дикого типа (WT ITR). На фиг. 24А представлено изображение, полученное с использованием флуоресцентной микроскопии при 40-кратном увеличении клеток Sf9, трансфицированных зкДНК-вектором с WT/WT ITR GFP, а затем инфицированных Rep-вирусом. На фиг. 24В приведено изображение в светлом поле при 40-кратном увеличении тех же клеток, что и на изображении «А». На фиг. 24С приведено изображение в светлом поле при 40-кратном увеличении контрольные клетки, трансфицированных WT/WT ITR, но не инфицированных Rep-вирусом. Указанные клетки не генерировали какого-либо флуоресцентного сигнала.

[0071] На фиг. 25 показан нативный агарозный гель (1% агароза) с предполагаемой зкДНК с ITR дикого типа. На дорожке 1 представлен лэддер 1 кб Plus DNA, а на дорожке 2 представлена зкДНК, полученная с применением плазмиды, содержащей кассету с ITR дикого типа, обе дорожки взяты из одного и того же геля. Ожидается, что мономерные GFP зкДНК имеют размер примерно 4 кб, а димер примерно 8 кб.

[0072] На фиг. 26 показан денатурирующий гель с зкДНК, содержащими ITR дикого типа. На дорожке 1 представлен лэддер 1 кб Plus DNA, на дорожке 2 представлена зкДНК дикого типа, которую не разрезали эндонуклеазой, а на дорожке 3 представлена та же зкДНК дикого типа, но разрезанная ферментом - рестрикционной эндонуклеазой ClaI. Все образцы взяты из одного геля.

[0073] На фиг. 27 показана потенциальная вторичная структура симметричных ITR из конструкции-388 (мутантные) и конструкции-393 (дикого типа AAV2).

[0074] На фиг. 28 показаны изменения массы тела мышей CD-1, получавших лечение ЛНЧ + поли(С) (контроль); ЛНЧ + продуцированные в Sf9 асимметричные зкДНК, содержащие WT AAV2 ITR слева и усеченный ITR справа; ЛНЧ + синтетические зкДНК, содержащие WT AAV2 ITR, симметричные с обеих сторон, левой и правой; ЛНЧ + синтетические зкДНК, содержащие асимметричные ITR, WT AAV2 ITR слева и усеченный ITR справа; продуцированные в Sf9 зкДНК с мутантными ITR симметричные с обеих сторон, левой и правой (конструкция-388); и зкДНК содержащие дикого типа AAV2 ITR, симметричные с обеих сторон конструкции, левой и правой (конструкция-393; продуцированные в Sf9).

[0075] На фиг. 29А и 29В приведены изображения экспрессии люциферазы in vivo на день 14 у мышей CD-1, получавших лечение: (1) ЛНЧ + поли(С) (контроль; сверху слева); (2) ЛНЧ + зкДНК с мутантными ITR, расположенными симметрично как с левой, так и с правой стороны конструкции (Конструкция-388), продуцированной в Sf9 (наверху справа); и зкДНК, содержащими симметричные AAV2 ITR дикого типа, продуцированные в Sf9 (Конструкция-393; нижняя средняя панель).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0076] Одним из самых больших затруднений при разработке терапевтических средств, в частности, при редких заболеваниях, является значительное число индивидуальных состояний. Около 350 миллионов человек в мире живут с редкими заболеваниями, которые определены Национальными институтами здравоохранения как расстройство или состояние, диагностированное менее чем у 200 000 человек. Приблизительно 80 процентов указанных редких расстройств имеют генетическое происхождение, и приблизительно для 95 процентов из них отсутствует одобренное FDA лечение.

[0077] Среди преимуществ описанных в настоящем документе зкДНК-векторов обеспечение способа, который может быть быстро адаптирован для множества заболеваний, и, в частности, для редких моногенных заболеваний, что может существенно изменить текущее положение в области лечения многих генетических расстройств или заболеваний. Кроме того, описанные в настоящем документе зкДНК-векторы содержат регуляторный переключатель, что позволяет контролировать экспрессию гена после доставки.

I. Определения

[0078] Если в настоящем документе не указано иное, научные и технические термины, используемые применительно к настоящему изобретению, имеют стандартные значения, известные специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в настоящем документе, и, соответственно, предусматривает различные варианты. Терминология в настоящем документе служит исключительно для описания конкретных вариантов реализации, а не для ограничения объема настоящего изобретения, который определяет исключительно формула изобретения. Определения стандартных терминов в области иммунологии и молекулярной биологии можно найти в следующих источниках: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, опубликован Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.). Fields Virology, 6th Edition, опубликован Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, опубликован Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ed.). Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликован VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology, Wemer Luttmann, опубликован Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, опубликован Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al.. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons. Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), содержание каждого из которых полностью включено посредством ссылки в настоящий документ.

[0079] В настоящем документе термины «введение», «введенный» и их варианты относятся к введению композиции или агента (например, нуклеиновых кислот, в частности, зкДНК) субъекту и включают одновременное и последовательное введение одной или более композиций или одного или более агентов. «Введение» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским методам, к плацебо и к экспериментальным методам. «Введение» также включает лечение in vitro и ex viva. Введение композиции или агента субъекту осуществляют любым подходящим путем, в том числе перорально, через легкие, интраназально, парентерально (внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно), ректально, введение в лимфатическую систему, внутрь опухоли или местно. Введение включает самостоятельное введение и введение другим лицом. Введение может быть осуществлено любым подходящим путем. Подходящий путь введения позволяет композиции или агенту выполнять предполагаемую функцию. Например, если подходящим путем является внутривенный, композицию вводят путем введения указанной композиции или агента в вену субъекта.

[0080] В настоящем контексте термин «антитело» используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют требуемую антигенсвязывающую активность. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает тот же антиген, с которым связывается интактное антитело. Согласно одному варианту реализации антитело или его фрагмент содержит цепь иммуноглобулина или фрагмент антитела и по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Примеры антител или их фрагментов включают, не ограничиваясь перечисленными, Fv, scFv, Fab-фрагмент, Fab', F(ab')₂, Fab'-SH, однодоменное антитело (dAb), тяжелую цепь, легкую цепь, тяжелую и легкую цепь, полное антитело (например, включающее все из Fc, Fab, тяжелых цепей, легких цепей, вариабельных областей и т.п.), биспецифическое антитело, диатело, линейное антитело, од но цепочечное антитело, интратело, моноклональное антитело, химерное антитело, мультиспецифическое антитело или мультимерное антитело. Антитело или его фрагмент может относиться к любому классу, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и любому их подклассу, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Кроме того, антитело может быть получено от любого млекопитающего, например, приматов, людей, крыс, мышей, лошадей, коз и т.д. Согласно одному варианту реализации указанное антитело представляет собой антитело человека или гуманизированное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело представляет собой модифицированное антитело. Согласно некоторым вариантам реализации компоненты антитела могут экспрессироваться отдельно, таким образом, чтобы после экспрессии белковых компонентов происходила самосборка антитела. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело «гуманизировано» для снижения иммуногенных реакций у человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело обладает требуемой функцией, например, взаимодействие с нужным белком и его ингибирование для лечения заболевания или симптома заболевания. Согласно одному варианту реализации указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область или область Fc.

[0081] В настоящем документе термин «антигенсвязывающий домен» молекулы антитела относится к части молекулы антитела, например, молекулы иммуноглобулина (Ig), которая принимает участие в связывании антигена. Согласно вариантам реализации указанный сайт связывания антигена образован остатками аминокислот вариабельных (V) областей тяжелой (Н) и легкой (L) цепей. Три высоконеоднородных участка в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей, называемые гипервариабельными областями, располагаются между более консервативными фланкирующими отрезками, называемыми «каркасными областями» (FR). FR представляют собой аминокислотные последовательности, которые в естественных условиях расположены между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и примыкают к ним. Согласно вариантам реализации в молекуле антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены друг относительно друга в трехмерном пространстве таким образом, что они образуют антигенсвязывающую поверхность, комплементарную трехмерной поверхности связываемого антигена. Указанные три гипервариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей называются «определяющими комплементарность областями» или «CDR». Каркасная область и CDR были определены и описаны, например, в источниках: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, и Chothia, С.et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Каждая вариабельная цепь (например, вариабельная тяжелая цепь и вариабельная легкая цепь), как правило, состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в последовательности аминокислот, в направлении от аминоконца к карбоксильному концу, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

[0082] В настоящем документе выражение «антитерапевтический иммунный ответ против нуклеиновой кислоты», «противовекторный иммунный ответ против вектора-переносчика», «иммунный ответ против терапевтической нуклеиновой кислоты», «иммунный ответ против вектора-переносчика» или т.п., относится к любому нежелательному иммунному ответу против терапевтической нуклеиновой кислоты, вирусной или невирусной по происхождению. Согласно некоторым вариантам реализации нежелательный иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ против собственно вектора-переносчика вируса. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммунный ответ является специфическим в отношении вектора-переносчика, который может представлять собой двухцепочечную ДНК, од но цепочечную РНК или двухцепочечную РНК. Согласно другим вариантам реализации указанный иммунный ответ является специфическим в отношении последовательности вектора-переносчика. Согласно другим вариантам реализации указанный иммунный ответ является специфическим в отношении содержания CpG в векторе-переносчике.

[0083] В настоящем документе «носитель» включает все возможные растворители, дисперсионные среды, основы, покрытия, разбавители, антибактериальные и антимикотические агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Также в указанные композиции вспомогательные активные ингредиенты могут быть включены. Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не приводят к токсической, аллергической или аналогичной нежелательной реакции при введении хозяину.

[0084] В настоящем документе термин «зкДНК» относится к бескапсидной замкнутой линейной двухцепочечной (дц) дуплексной ДНК для невирусного переноса генов, синтетической или другой. Подробное описание кДНК приведено в международной заявке PCT/US2017/020828, поданной 3 марта 2017 г., содержание которой полностью явным образом включено в настоящий документ посредством ссылки. Некоторые способы получения зкДНК-вектора, содержащего различные последовательности и конфигурации инвертированных концевых повторов (ITR), с использованием клеточных методов описаны в примере 1 в международной заявке PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., и международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Некоторые способы получения синтетических зкДНК-векторов содержащие различные последовательности и конфигурации ITR, описаны, например, в международной заявке PCT/US2019/14122, поданной 18 января 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В настоящем документе термины «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой линейную дуплексную с замкнутыми концами (CELiD) CELiD ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой миникольцо на основе ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой минималистичный вектор для иммунологически определенной генной экспрессии (MIDGE). Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой служебную ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой гантелеобразную линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую две шпилечные структуры ITR на 5'- и 3'-концах экспрессионной кассеты. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК представляет собой ДНК Doggybone™.

[0085] В настоящем документе термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, содержащему зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса, который способен размножаться в Е. coli в виде плазмиды, и, соответственно, может выполнять роль челночного вектора для бакуловируса.

[0086] В настоящем документе термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит геном зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса в составе генома бакуловируса.

[0087] В настоящем документе термины «инфицированная зкДНК-бакуловирусом клетка насекомого» и «зкДНК-BIIC» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке-хозяину беспозвоночного животного (включая, без ограничений, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированной зкДНК-бакуловирусом.

[0088] В настоящем документе термин «геном зкДНК» относится к экспрессионной кассете, которая дополнительно включает по меньшей мере одну область инвертированного концевого повтора. ЗкДНК-геном может дополнительно содержать одну или более спейсерных областей. Согласно некоторым вариантам реализации геном зкДНК включают в виде межмолекулярного дуплексного ДНК-полинуклеотида в плазмиду или вирусный геном.

[0089] В настоящем документе термин «зкДНК-плазмида» относится к плазмиде, которая содержит геном зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса.

[0090] В настоящем документе термины «ДНК-вектор с замкнутыми концами», «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо и относятся к невирусному бескапсидному ДНК-вектору по меньшей мере с одним ковалентно-замкнутым концом (т.е., с внутримолекулярным дуплексом). Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК содержит два ковалентно замкнутых конца.

[0091] В настоящем документе термин «спейсерная область зкДНК» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в указанном зкДНК-векторе или зкДНК-геноме. Согласно некоторым вариантам реализации спейсерные области зкДНК удерживают два функциональных элемента на требуемом расстоянии для оптимальной функциональности. Согласно некоторым вариантам реализации спейсерные области зкДНК обеспечивают или повышают генетическую стабильность зкДНК-генома в составе, например, плазмиды или бакуловируса. Согласно некоторым вариантам реализации спейсерные области зкДНК облегчают подготовленные генетические манипуляции с зкДНК-геномом, обеспечивая удобное расположение для сайтов клонирования и т.п. Например, согласно определенным аспектам олигонуклеотидный «полилинкер», содержащий несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированный так, чтобы он не содержал известных сайтов связывания белка (например, транскрипционного фактора), может быть размещен в зкДНК-геноме для разделения цис-действующих факторов, например, путем инсерции 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.п. между сайтом концевого разрешения и расположенным в направлении 5' регуляторным элементом транскрипции. Аналогичным образом, спейсер может быть встроен между сигнальной последовательностью полиаденилирования и 3'- сайтом концевого разрешения.

[0092] В настоящем документе выражение «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» активного агента или терапевтического агента, такого как терапевтическая нуклеиновая кислота, представляет собой количество, достаточное для получения требуемого эффекта, например, ингибирование экспрессии целевой последовательности по сравнению с уровнем экспрессии, детектируемым в отсутствие терапевтической нуклеиновой кислоты. Подходящие анализы для измерения экспрессии целевого гена или целевой последовательности включают, например, исследование уровней белка или РНК с применением методик, известных специалистам в данной области техники, таких как дот-блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in situ, ИФА ELISA, иммунопреципитация, функциональный ферментный анализ, а также фенотипические анализы, известные специалистам в данной области.

[0093] В настоящем документе термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, не являющейся его природным источников. Термин «экзогенный» в настоящем документе может относиться к нуклеиновой кислоте (например, нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или к полипептиду, которые были введены посредством процесса, включающего действия человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они обычно не обнаруживаются, и введение нуклеиновой кислоты или полипептида в такую клетку или организм является желательным. Как вариант, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, которые были введены посредством процесса, включающего действия человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, где они присутствуют в относительно незначительных количествах, и увеличение количества нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке или организме является желательным, например, для получения эктопической экспрессии или уровней. И напротив, в настоящем документе термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для биологической системы или клетки.

[0094] В настоящем документе термин «эффекторный белок» относится к полипептиду, который обеспечивает детектируемые показания, либо, например, в виде репортерного пептида, либо, более предпочтительно, в виде полипептида, который убивает клетку, например, токсина или агента, придающего клетке чувствительность к киллингу при воздействии определенным агентом или при отсутствии определенного агента. Эффекторные белки включают любой белок или пептид, который прямо нацелен на ДНК и/или РНК клетки-хозяина или повреждает их. Например, эффекторные белки могут включать, не ограничиваясь перечисленными, рестрикционную эндонуклеазу, которая нацелена на последовательность ДНК клетки-хозяина (геномный или внехромосомный элемент), протеазу, расщепляющую полипептид-мишень, необходимый для выживания клетки, ингибитор ДНК-гиразы и токсин рибонуклеазного типа. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия эффекторного белка, контролируемая синтетической биологической цепью согласно описанию в настоящем документе, может принимать участие в качестве фактора в другой синтетической биологической цепи, с расширением таким образом диапазона и сложности отклика системы биологической цепи.

[0095] В настоящем документе термины «экспрессионная кассета» и «транскрипционная кассета» используются взаимозаменяемо и относятся к линейному отрезку нуклеиновых кислот, который содержит трансген, функционально связанный с одним или несколькими промоторами или другими регуляторными последовательностями, достаточными для направления транскрипции указанного трансгена, но не содержит кодирующие капсид последовательности, другие векторные последовательности или области инвертированных концевых повторов. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать одну или более действующих в уме-положении последовательностей (например, промоторов, энхансеров или репрессоров), один или более интронов, и один или более посттранскрипционных регуляторных элементов.

[0096] В настоящем документе термин «фланкирующий» относится к относительному положению одной последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к другой последовательности нуклеиновой кислоты. Как правило, в последовательности АВС, В фланкирована А и С. То же самое верно для расположения АхВхС. Соответственно, фланкирующая последовательность предшествует фланкируемой последовательности или следует за ней, но не обязательно должна быть смежной с фланкируемой последовательностью или непосредственно прилегать к ней. Согласно одному варианту реализации термин «фланкирующий» относится к концевым повторам на каждом конце линейного одноцепочечного синтетического AAV-вектора.

[0097] В настоящем документе термин «полноразмерное антитело» относится к молекуле иммуноглобулина (Ig) (например, IgG-антителу), например, встречающейся в природе и образующейся в результате нормальных процессов рекомбинации фрагментов иммуноглобулиновых генов.

[0098] В настоящем документе термин «функциональный фрагмент антитела» относится к фрагменту, который связывается с тем же антигеном, что и распознаваемый интактным (например, полноразмерным) антителом. Термины «фрагмент антитела» или «функциональный фрагмент» также включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как «Fv»-фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, или рекомбинантным од но цепочечным полипептидным молекулам, в которых легкие и тяжелые вариабельные области связаны пептидным линкером («scFv-белки»). Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент антитела не содержит частей антител без антигенсвязывающей активности, таких как Fc-фрагменты или отдельные остатки аминокислот.

[0099] В настоящем документе термины «пропуск» и «разрыв» используются взаимозаменяемо и относятся к прерванной части синтетические ДНК-вектора согласно настоящему описанию, создавая отрезок части одноцепочечной ДНК в двухцепочечной в других местах зкДНК. Длина пропуска может составлять от одной 1 пары оснований до 100 пар оснований в одной цепи дуплексной ДНК. Типичные пропуски, разработанные и созданные с применением способов, описанных в настоящем документе, и синтетические векторы, полученные указанными способами, могут иметь длину, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 пар оснований. Примеры пропусков в настоящем описании могут иметь длину от 1 пар оснований до 10 пар оснований, от 1 до 20 пар оснований, от 1 до 30 пар оснований.

[00100] В настоящем документе термин «ген» используется в широком смысле для обозначения любого сегмента нуклеиновой кислоты, связанного с экспрессией определенных РНК или белка, in vitro или in vivo. Соответственно, гены включают области, кодирующие экспрессируемые РНК (которые, как правило, включают последовательности, кодирующие полипептиды) и, часто, регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Гены могут быть получены из различных источников, в том числе путем клонирования из представляющего интерес источника или синтеза на основании известной или предсказанной информации о последовательности, и может включать последовательности, разработанные таким образом, чтобы иметь конкретные требуемые параметры.

[00101] В настоящем документе выражение «генетическое заболевание» или «генетическое расстройство» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или непрямо вызываемому одной или более аномалиями в геноме, в том числе и в частности, к состоянию, присутствующему с рождения. Указанная аномалия может представлять собой мутацию, инсерцию или делецию в гене. Указанная аномалия может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность.

[00102] В настоящем документе термин «гетерологичный» относится к нуклеотидной или полипептидной последовательности, которая не обнаруживается в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно.

[00103] В настоящем документе термины «гетерологичная нуклеотидная последовательность» и «трансген» используются взаимозаменяемо и относятся к представляющей интерес нуклеиновой кислоте (отличной от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид капсида), которая встроена в зкДНК-вектор и может быть доставлена и экспрессирована зкДНК-вектором согласно описанию в настоящем документе. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть соединена с встречающейся в природе последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, путем генетического конструирования) с образованием химерной нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный полипептид. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть соединена с вариантом полипептида (например, путем генетического конструирования) с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый вариант полипептида. Представляющие интерес трансгены включают, не ограничиваясь перечисленным, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, предпочтительно, терапевтические (например, для применения в медицинских, диагностических или ветеринарных целях) или иммуногенные полипептиды (например, для вакцин). Согласно некоторым вариантам реализации представляющие интерес нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, которые транскрибируются в терапевтическую РНК. Трансгены, предусмотренные для применения в зкДНК-векторах согласно настоящему описанию, включают, не ограничиваясь перечисленными, трансгены, которые экспрессируют или кодируют один или более полипептидов, пептидов, рибозимов, аптамеров, пептидных нуклеиновых кислот, киРНК, РНКи, миРНК, днкРНК, антисмысловых олиго- или полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию.

[00104] В настоящем документе термин «гомология» или «гомологичный» относится к проценту нуклеотидных остатков в плече гомологии, которые идентичны нуклеотидным остаткам в соответствующей последовательность на целевой хромосоме после выравнивания последовательностей и введения пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента гомологии нуклеотидной последовательности может быть достигнуто различными путями, известными в данной области техники, например, с применением компьютерного программного обеспечения в открытом доступе, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на всем протяжении сравниваемых последовательностей. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность ДНК), например, плечо гомологии матрицы репарации, считают «гомологичным», если указанная последовательность по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или более идентична соответствующей нативной или нередактированной последовательности нуклеиновой кислоты (например, геномная последовательность) клетки-хозяина.

[00105] В настоящем документе термин «клетка-хозяин» относится к любому типу клеток, который восприимчив к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п., с помощью терапевтических нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию. В неограничивающих примеров клетка-хозяин может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, CD34⁺ клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из ряда иммортализованных линий клеток (например, клетки HepG2). Как вариант, клетка-хозяин может представлять собой клетку in situ или in vivo в ткани, органе или организме. Кроме того, клетка-хозяин может представлять собой целевую клетку, например, субъекта-млекопитающего (например, пациента-человека, нуждающегося в генной терапии).

[00106] В настоящем документе «последовательность вариабельного домена иммуноглобулина» относится к последовательности аминокислот, которая может образовывать структуру вариабельного домена иммуноглобулина. Например, указанная последовательность может включать полностью или частично последовательность аминокислот встречающегося в природе вариабельного домена. Например, указанная последовательность может включать или не включать одну, две или более N- или С-концевых аминокислот, или может включать другие изменения, которые совместимы с образованием структуры белка.

[00107] Согласно описанию в настоящем документе «индуцируемый промотор» представляет собой промотор, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии индуктора или индуцирующего агента, под влиянием индуктора или индуцирующего агента или контакте с индуктором или индуцирующим агентом. «Индуктор» или «индуцирующий агент» согласно определению в настоящем документе может быть эндогенным или в норме экзогенным соединением или белком, который вводят таким образом, чтобы он был активен в отношении индукции транскрипционной активности индуцируемого промотора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный индуктор или индуцирующий агент, т.е., химическое вещество, соединение или белок, сам может быть результатом транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е., индуктор может представлять собой индукторный белок, экспрессируемый другим компонентом или модулем), который сам может быть под контролем или представлять собой индуцируемый промотор. Согласно некоторым вариантам реализации индуцируемый промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцируемых промоторов включают, не ограничиваясь перечисленными, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний аденовирусный промотор; длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие отвечающие на стероиды промоторы, промоторы, отвечающие на рапамицин и т.п.

[00108] В настоящем документе «отвечающий на входной агент домен» представляет собой домен транскрипционного фактора, который связывает или другим образом отвечает на условие или входной агент так, что соединенный ДНК-связываюший слитый домен приобретает способность отвечать на присутствие указанного условия или входного агента. Согласно одному варианту реализации присутствие указанного условия или входного агента приводит к конформационному изменению в отвечающем на входной агент домене, или в белке, с которым он слит, которое модифицирует модулирующую транскрипцию активность транскрипционного фактора.

[00109] Термин «in vivo» относится к анализам или способам, которые реализуют на организме или в организме, таком как многоклеточное животное. Согласно некоторым описанным здесь аспектам может быть указано, что способ или применение реализуют «in vivo», если используется одноклеточный организм, такой как бактерия. Термин «ех vivo» относится к способам и применению, которые реализуют с использованием живой клетки с интактной мембраной, находящейся вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантаты, культивируемые клетки, в том числе первичные клетки и линии клеток, трансформированные линии клеток, и экстрагированные ткани или клетки, включая, в том числе, клетки крови.

[00110] Термин «in vitro» относится к анализам и способам, которые не требуют присутствия клетки с интактной мембраной, например, клеточных экстрактов, и могут относиться к введению программируемой синтетической биологической цепи в бесклеточной системе, такой как среда, не содержащая клеток мом клеточных систем, таких как клеточные экстракты.

[00111] В настоящем документе термин «локальная доставка» относится к доставке активного агента, такого как интерферирующая РНК (например, киРНК), прямо в целевой сайт внутри организма. Например, агент может быть локально доставлен путем прямой инъекции в сайт заболевания, такой как опухоль или другой целевой сайт, такой как сайт воспаления или целевой орган, такой как печень, сердце, поджелудочная железа, почка и т.п.

[00112] В настоящем документе выражения «модифицированный ITR» или «mod-ITR « или «мутантный ITR» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к ITR, который содержит мутацию по меньшей мере в одном или более нуклеотидах по сравнению с WT-ITR из того же серотипа. Указанная мутация может приводить к изменению в одной или более из областей А, С, С', В, В' в ITR, и может приводить к изменению трехмерной пространственной организации (т.е. трехмерной структуры в геометрическом пространстве) по сравнению с трехмерной пространственной организацией WT-ITR из того же серотипа.

[00113] В настоящем документе термин «нкДНК» или «никированная зкДНК» относится к ДНК с замкнутыми концами, содержащей разрыв или пропуск размером 1-100 пар оснований в области «стебля» или спейсерной области 5', расположенной выше открытой рамки считывания (например, промотор и трансген для экспрессии).

[00114] В настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» относится к полимеру, содержащему по меньшей мере два нуклеотида (т.е., дезоксирибонуклеотида или рибонуклеотида) в о дно цепочечной или двуцепочечной форме, и включает ДНК, РНК и их гибриды. ДНК может находиться в форме, например, антисмысловых молекул, плазмидной ДНК, дуплексов ДНК-ДНК, предварительно конденсированной ДНК, продуктов ПЦР, векторов (Р1, РАС, ВАС, YAC, искусственные хромосомы), экспрессионных кассет, химерных последовательностей, хромосомной ДНК, или производных и комбинаций указанных групп. ДНК может находиться в форме миникольца, плазмиды, бакмиды, минигена, служебной ДНК (линейного ковалентно замкнутого ДНК-вектора), линейной дуплексной ДНК с замкнутыми концами (CELiD или зкДНК), ДНК Doggybone™, гантелеобразную ДНК, минималистичного вектора для иммунологически определенной генной экспрессии (MIDGE), вирусного вектора или невирусных векторов. РНК может находиться в форме короткой интерферирующей РНК (киРНК), дцРНК - субстрата Dicer, малой шпилечной РНК (мшРНК), асимметричной интерферирующей РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), мРНК, рРНК, тРНК, вирусной РНК (вРНК) и их комбинаций. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки остова или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют связывающие свойства, аналогичные свойствам референсной нуклеиновой кислоты. Примеры таких аналогов и/или модифицированных остатков включают, без ограничения, фосфотиоаты, фосфородиамидат-морфолиновый олигомер (морфолино), фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2'-O-метил рибонуклеотиды, закрытую нуклеиновую кислоту (LNA™) и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК). За исключением конкретно указанных ограничений термин охватывает известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют связывающие свойства, аналогичные свойствам референсной нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, подразумевается также, что конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также охватывает консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные замены кодонов), аллели, ортологи, однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и комплементарные последовательности, а также последовательность, указанная явным образом.

[00115] В настоящем документе «нуклеотиды» содержат сахар дезоксирибозу (ДНК) или рибозу (РНК), основание и фосфатную группу. Нуклеотиды соединены между собой указанными фосфатными группами.

[00116] В настоящем документе выражения «терапевтическое средство с нуклеиновой кислотой», «терапевтическая нуклеиновая кислота» и «ТНК» используются взаимозаменяемо и относятся к любому варианту терапевтического средства с использованием нуклеиновых кислот в качестве активного компонента терапевтического агента для лечения заболевания или расстройства. В настоящем документе указанные выражения относятся к терапевтическим средствам на основе РНК и терапевтическим средствам на основе ДНК. Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе РНК включают мРНК, антисмысловую РНК и олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры, интерферирующие РНК (РНКи), дцРНК субстрата Dicer, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричные интерферирующие РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК). Неограничивающие примеры терапевтических средств на основе ДНК включают миникольцо ДНК, миниген, вирусную ДНК (например, геном лентивируса или AAV) или невирусные синтетические ДНК-векторы, линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами (зкДНК / CELiD), плазмиды, бакмиды, ДНК-векторы Doggybone™, минималистичный вектор для иммунологически определенной генной экспрессии (MIDGE)-вектор, невирусный служебный ДНК-вектор (линейный ковалентно замкнутый ДНК-вектор) или гантелеобразный минимальный ДНК-вектор («гантелеобразная ДНК»).

[00117] Термин «промотор» в настоящем документе относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты за счет управления транскрипцией указанной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой гетерологичный целевой ген, кодирующий белок или РНК. Про моторы может быть конститутивным, индуцируемым, репрессируемым, тканеспецифическим или представлять собой любую комбинацию перечисленного. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, в которой осуществляется контроль инициации и скорости транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие транскрипционные факторы. Согласно некоторым вариантам реализации описанных в настоящем документе аспектов промотор может управлять экспрессией транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию самого про мотора, или экспрессию другого промотора, используемого в другом модульном компоненте синтетических биологических цепей, описанных в настоящем документе. В последовательности промотора расположен сайт инициации транскрипции, а также связывающие белки домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, однако не всегда содержат «ТАТА»-боксы и «САТ»-боксы. Различные промоторы, в том числе индуцируемые промоторы, могут применяться для управления экспрессией трансгенов в зкДНК-векторах согласно описанию в настоящем документе.

[00118] Термин «энхансер» в настоящем документе относится к действующей в цис-положении (цис-действующей) регуляторной последовательности (например, размером 50-1500 пар оснований), которая связывает один или более белков (например, белки-активаторы или транскрипционный фактор) для усиления транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии до 1 000 000 пар оснований в 5'-направлении от сайта начала гена или в 3'-направлении от сайта начала гена, который они регулируют. Энхансер может быть расположен в пределах интронной области или в экзонной области неродственного гена.

[00119] Может быть сказано, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. В настоящем документе «функционально связанный» относится к сочетанию, описанные таким образом компоненты которого взаимосвязаны, что позволяет им функционировать предполагаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью в том случае, если указанный промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. Выражения «функционально связанный», «функционально расположенный», «функционально связанный», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» показывают, что промотор находится в корректном функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для контроля транскрипционной инициации и/или экспрессии указанной последовательности. «Инвертированный промотор» в настоящем документе относится к промотору, последовательность нуклеиновой кислоты в котором располагается в обратной ориентации, так что цепь, которая была смысловой, становится некодирующей цепью, и наоборот. Последовательности инвертированных промоторов могут применяться, согласно различным вариантам реализации, для регуляции состояния переключателя. Кроме того, согласно различным вариантам реализации промотор может применяться в сочетании с энхансером.

[00120] Промотор может быть представлен промотором, в естественных условиях, ассоциированным с геном или последовательностью, а также может быть получен путем выделения некодирующих 5' последовательностей, расположенных в 5' направлении от кодирующего сегмента и/или экзона определенного гена или последовательности. Такой промотор может называться «эндогенным». Аналогичным образом, согласно некоторым вариантам реализации энхансер может быть представлен энхансером, в естественных условиях ассоциированным с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной либо в 5'-3', либо в 3'-5' направлении от указанной последовательности.

[00121] Согласно некоторым вариантам реализации кодирующий сегмент нуклеиновой кислоты расположен под контролем «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора»; оба указанных термина относятся к промотору, в норме не ассоциированному с кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой промотор функционально связан в естественной среде. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится к энхансеру, в норме не ассоциированному с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты в естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «встречающимися в природе», т.е., содержат другие элементы других транскрипционных регуляторных областей, и/или мутации, которые изменяют экспрессию, полученные с помощью способов генетического конструирования, которые известны в данной области техники. Наряду с получением последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансеров синтетическим путем, последовательности промоторов могут быть получены с применением технологии рекомбинантного клонирования и/или амплификации нуклеиновой кислоты, в том числе ПЦР, применительно к синтетическим биологическим цепям и модулям согласно описанию в настоящем документе (см., например, патент США №4683202, патент США №5928906, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрена также возможность применения контрольных последовательностей, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в безъядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.

[00122] В настоящем документе термины «сайт связывания Rep, «связывающий Rep элемент, «RBE» и «RBS» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту связывания для белка Rep (например, AAV Rep 78 или AAV Rep 68), который после связывания белком Rep позволяет белку Rep осуществлять сайт-специфическую эндонуклеазную активность в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и ее обратный комплемент вместе образуют один RBS. Последовательности RBS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), последовательность RBS, идентифицированная в AAV2. Любая известная последовательность RBS может применяться во вариантах реализации настоящего изобретения, в том числе другие известные последовательности RBS AAV и другие известные встречающиеся в естественной среде или синтетические последовательности RBS. Без связи с какой-либо теорией считается, что нуклеазный домен белка Rep связывается с дуплексной нуклеотидной последовательностью GCTC, и, соответственно, два известных белка Rep AAV прямо связываются с дуплексным олигонуклеотидом 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (SEQ ID NO: 531), и обеспечивают стабильную сборку на нем. Кроме того, растворимые агрегированные конформеры (т.е., неопределенное число взаимосвязанных белков Rep) диссоциируют и связываются с олигонуклеотидами, которые содержат сайты связывания Rep. Каждый белок Rep взаимодействует и с азотистыми основаниями, и с фосфодиэфирным остовом на каждой цепи. Взаимодействия с азотистыми основаниями обеспечивают специфичность в отношении последовательности, тогда как взаимодействия с фосфодиэфирным остовом неспецифичны или менее специфичны с отношении последовательностей и стабилизируют комплекс белка с ДНК.

[00123] В настоящем документе термин «репортер» относится к белку, который может быть использован для получения детектируемого показателя. Репортеры обычно генерируют измеряемый сигнал, например, флуоресценцию, цвет или люминесценцию. Кодирующие последовательности репортерных белков кодируют белки, присутствие которых в клетке или в организме легко наблюдать. Например, флуоресцентные белки заставляют клетку флуоресцировать при возбуждении светом с конкретной длиной волны, люциферазы заставляют клетку катализировать реакцию, которая генерирует свет, а ферменты, такие как β-галактозидаза, преобразуют субстрат в окрашенный продукт. Примеры репортерных полипептидов, подходящих для применения в экспериментальных или диагностических целях включают, не ограничиваясь перечисленными, β-лактамазу, β-галактозидазу (LacZ), щелочную фосфатазу (АР), тимидинкиназу (ТК), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие флуоресцентные белки, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), люциферазу и другие, хорошо известные в данной области техники.

[00124] В настоящем документе «белок-репрессор» («репрессорный белок») или «белок-индуктор» представляет собой белок, который связывается с элементом регуляторной последовательности и репрессирует или активирует, соответственно, транскрипцию последовательностей, функционально связанных с указанным элементом регуляторной последовательности. Предпочтительные репрессорные и индукторные белки согласно описанию в настоящем документе чувствительны к присутствию или отсутствию по меньшей мере одного входного агента или фактора внешней среды. Предпочтительные белки согласно описанию в настоящем документе являются модульными по форме, содержащими, например, разделяемые ДНК-связывающие и связывающие или отвечающие на входной агент элементы или домены.

[00125] В настоящем документе термин «идентичность последовательностей» относится к сходству между двумя последовательностями нуклеотидов. Для целей настоящего изобретения степень идентичности последовательностей двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры: штраф за открытие пропуска 10, штраф за продление пропуска 0,5 и матрица замены EDNAFULL (версия EMBOSS от NCBI NUC4.4). Выходной показатель Needle, называемый «наибольшей длиной идентичного фрагмента» (полученный с применением опции «-nobrief») используют в качестве процента идентичности и вычисляют следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды×100)/(Длина выравнивания Общее число пропусков в выравнивании). Длина выравнивания составляет предпочтительно по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов, предпочтительнее по меньшей мере 50 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов.

[00126] В настоящем документе термины «смысловой» и «антисмысловой» относятся к ориентации структурного элемента в полинуклеотиде. Смысловой и антисмысловой варианты элемента обратно-комплементарны друг другу.

[00127] В настоящем документе термин «спейсерная область» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в векторе или геноме. Согласно некоторым вариантам реализации спейсерные области AAV держат два функциональных элемента на требуемом расстоянии для оптимальной функциональности. Согласно некоторым вариантам реализации указанные спенсерные области обеспечивают или повышают генетическую стабильность вектора или генома. Согласно некоторым вариантам реализации спейсерные области облегчают подготовленные генетические манипуляции с геномом, обеспечивая удобное расположение для сайтов клонирования и пропуск расчетного числа пар оснований. Например, согласно определенным аспектам олигонуклеотидный «полилинкер» или «сайт множественного клонирования», содержащий несколько сайтов рестрикционной эндонуклеазы, или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированная так, чтобы не содержать сайтов связывания известного белка (например, транскрипционного фактора), может быть размещен в векторе или геноме для разделения цис-действующих факторов, например, может быть инсертирован 6-мер, 12-мер, 18-мер, 24-мер, 48-мер, 86-мер, 176-мер и т.п.

[00128] Термин «субъект» в настоящем документе относится к человеку или животному, для которого предложено лечение, в том числе профилактическое лечение, зкДНК-вектором в соответствии с настоящим изобретением. Обычно указанное животное представляет собой позвоночное, такое как, не ограничиваясь перечисленными, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают, не ограничиваясь перечисленными, шимпанзе, яванского макака, паукообразных обезьян и макак, например, макака-резус. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, не ограничиваясь перечисленными, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, кошачьих, например, домашних кошек, собачьих, например, собак, лисиц, волков, виды птиц, например, курицу, эму, страуса, и рыб, например, форель, сома и лосося. Согласно определенным вариантам реализации аспектов, описанных в настоящем документе, указанный субъект представляет собой млекопитающее, например, примата или человека. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъект может представлять собой младенца или ребенка. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект может представлять собой новорожденного или нерожденного субъекта, например, субъект находится in utero. Предпочтительно, указанный субъект представляет собой млекопитающее. Указанное млекопитающее может представлять собой человека, не являющегося человеком примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову, однако указанные примеры не являются ограничивающими. Млекопитающие, отличные от человека, могут быть целесообразным образом использованы в качестве субъектов в моделях заболеваний и расстройств на животных. Кроме того, описанные в настоящем документе способы и композиции могут применяться для одомашненных животных и/или животных-компаньонов. Субъект-человек может быть любого возраста, пола, принадлежать к любой расе или этнической группе, например, представлять собой европеоида (белая раса), азиата, африканца, чернокожего, афроамериканца, афро-европейца, латиноамериканца, иметь ближневосточное происхождение и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации субъект может представлять собой пациента или другого субъекта в клинических условиях. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект уже проходит лечение.

[00129] В настоящем документе термин «по существу симметричные модифицированные ITR» или «пара по существу симметричных mod-ITR «относится к паре модифицированных ITR в пределах одного зкДНК-генома или зкДНК-вектора, последовательности обоих из которых обратно-комплементарны по всей длине. Например, модифицированный ITR может считаться по существу симметричным, если он содержит некоторые нуклеотидные последовательности, отличающиеся от обратно-комплементарной последовательности, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую форму. Один неограничивающий пример представлен последовательностью, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична канонической последовательности (по оценке в BLAST при использовании параметров, устанавливаемых по умолчанию), а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию в отношении когнатного модифицированного ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. Иными словами, пара по существу симметричных модифицированных ITR содержит одинаково организованные в трехмерном пространстве петли А, С-С' и В-В'. Согласно некоторым вариантам реализации ITR из пары mod-ITR могут содержать разные обратно-комплементарные нуклеотидные последовательности, но все же иметь одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию то есть оба ITR содержат мутации, которые приводят к одной и той же общей трехмерной форме. Например, один ITR (например, 5' ITR) в паре mod-ITR может быть взят из одного серотипа, а другой ITR (например, 3' ITR) может взят из другого серотипа, тем не менее, оба могут иметь одинаковую соответствующую мутацию (например, в том случае, если указанный 5' ITR содержит делецию в области С, когнатный модифицированный 3' ITR из другого серотипа содержит делецию в соответствующем положении в области С'), таким образом, указанная пара модифицированных ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. Согласно таким вариантам реализации каждый ITR в паре модифицированных ITR может быть взят из разных серотипов (например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12) например, комбинации AAV2 и AAV6, причем модификация в одном ITR отражена в аналогичном положении в когнатном ITR из другого серотипа. Согласно одному варианту реализации по существу симметричная пара модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR) при условии, что различие нуклеотидных последовательностей указанных ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. Неограничивающий пример представлен mod-ITR, последовательность которого по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична каноническому mod-ITR по оценке с применением стандартных способов, хорошо известных в данной области техники, таких как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) или BLASTN, при параметрах, устанавливаемых по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерная структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара mod-ITR содержит одинаковые петли А, С-С' и В-В' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR содержит делецию плеча С-С', то когнатный mod-ITR содержит соответствующую делецию плеча С-С', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных петель, А и В-В', той же формы в геометрическом пространстве, что и когнатный mod-ITR.

[00130] В настоящем документе термин «по существу симметричные WT-ITR» или «пара по существу симметричных WT-ITR» относится к паре WT-ITR в составе одного зкДНК-генома или зкДНК-вектора, где оба ITR представляют собой ITR дикого типа, которые имеют обратно-комплементарную последовательность по всей длине. Например, ITR может считаться последовательностью дикого типа, даже если он содержит один или более нуклеотидов, отличающихся от нуклеотидов в канонической встречающейся в природе последовательности, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую трехмерную структуру последовательности. Согласно некоторым аспектам указанные отличающиеся нуклеотиды представляют собой консервативные изменения последовательностей. Неограничивающий пример представлен последовательностью, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной канонической последовательности (по оценке, например, с помощью BLAST при параметрах, устанавливаемых по умолчанию), а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию относительно другого WT-ITR, так что их трехмерная структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве. Указанный по существу симметричный WT-ITR содержит такие же петли А, С-С' и В-В' в трехмерном пространстве. Может быть функционально подтверждено, что по существу симметричный WT-ITR является WT, путем определения наличия в нем функционального сайта связывания Rep (RBE или RBE') и сайта концевого разрешения (trs), который спаривается с соответствующим белком Rep.Могут быть необязательно протестированы другие функции, в том числе трансгенная экспрессия в пермиссивных условиях.

[00131] В настоящем документе термин «супрессировать», «снижать», «влиять», «ингибировать» и/или «уменьшать» (и другие подобные термины) обычно относится к акту уменьшения, прямо или непрямо, концентрации, уровня, функции, активности, поведения относительно естественного, ожидаемого, среднего, или относительно контрольного состояния.

[00132] В настоящем документе термин «симметричный ITR» относится к паре ITR в составе одного зкДНК-генома или зкДНК-вектора, мутированных или модифицированных относительно последовательностей депендовирусного ITR дикого типа, и обратно-комплементарных по всей длине. Ни один из ITR не является последовательностью ITR AAV2 дикого типа (т.е. они представлены модифицированным ITR, также называемым мутантным ITR), и могут содержать отличия последовательности от ITR дикого типа ввиду добавления, делеции, замены, усечения или точечных мутаций нуклеотидов. Для удобства в настоящем документе ITR, расположенный в 5' направлении (выше) относительно экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется «5' ITR» или «левым ITR», a ITR, расположенный в 3' направлении (ниже) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется «3' ITR» или «правым ITR».

[00133] В настоящем документе термины «синтетический AAV-вектор» и «получение AAV-вектора синтетическим путем» относятся к AAV-вектору и способам его получения синтетическим путем в полностью бесклеточной среде.

[00134] В настоящем документе термин «концевой повтор» или «TR» включает любой вирусный концевой повтор или любую синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимальную требуемую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Связывающая Rep последовательность («RBS») (также называемая RBE (связывающий Rep элемент)) и сайт концевого разрешения («TRS») вместе образуют «минимальную требуемую точку начала репликации» и, соответственно, TR содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. Каждый из TR, обратно-комплементарных друг относительно друга в пределах определенного отрезка полинуклеотидной последовательности, как правило, называют «инвертированным концевым повтором» или «ITR». В контексте вируса ITR опосредуют репликацию, упаковку вируса, интеграцию и «спасение» провируса. Как было неожиданным образом обнаружено в рамках настоящего изобретения, ITR, отличные от депендовирусных ITR дикого типа, все же способны выполнять традиционные функции ITR дикого типа, и, соответственно, термин ITR в настоящем документе относится к TR в зкДНК-геноме или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в комплексных конфигурациях зкДНК-вектора может присутствовать более двух ITR или симметричных пар ITR. Указанный ITR может представлять собой AAV ITR или ITR не из AAV, или может происходить из AAV ITR или из ITR не из AAV. Например, указанный ITR может происходить из семейства Parvoviridae, куда входят парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собачьих, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус мышей, свиной парвовирус, парвовирус человека В-19), или шпилька SV40, которая служит в качестве точки начала репликации SV40, может быть использована как ITR, который дополнительно может быть модифицирован путем усечения, замены, делеции, инсерции и/или добавления. Семейство вирусов Parvoviridae состоит из двух подсемейств: Parvovirmae, инфицирующих позвоночных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных. Как правило, указанные ITR состоят приблизительно из 145 нуклеотидов и в природе инвертированы друг относительно друга. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (AAV), которые способны к репликации у позвоночных хозяев, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, человека, приматов, крупного рогатого скота, собачьих, лошадей и овец.

[00135] В настоящем документе термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» используются взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином, образуя 3' ОН, который служит субстратом для удлинения ДНК с помощью клеточной ДНК-полимер азы, например, ДНК-полимеразы дельта или ДНК-полимеразы эпсилон. Как вариант, комплекс Rep-тимидин может принимать участие в скоординированной реакции лигирования. Согласно некоторым вариантам реализации TRS охватывает, как минимум, неспаренное тимидиновое основание. Согласно некоторым вариантам реализации никирующую эффективность TRS по меньшей мере отчасти можно контролировать за счет расстояния между ним и RBS в пределах одной молекулы. Если акцепторный субстрат представляет собой комплементарный ITR, итоговый продукт представляет собой внутримолекулярный дуплекс. Последовательности TRS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 45), гексануклеотидную последовательность, идентифицированную в AAV2. Любая известная последовательность TRS может быть использована во вариантах реализации настоящего изобретения, в том числе другие известные последовательности TRS AAV и другие известные природные или синтетические последовательности TRS, такие как AGTT (SEQ ID NO: 46), GGTTGG (SEQ ID NO: 47), AGTTGG (SEQ ID NO: 48), AGTTGA (SEQ ID NO: 49), и другие мотивы, такие как RRTTRR (SEQ ID NO: 50).

[00136] В настоящем документе термин «транскрипционный регулятор» относится к транскрипционным активаторам и репрессорам, которые либо активируют, либо репрессируют транскрипцию гена, представляющего интерес. Промоторы представляют собой области нуклеиновой кислоты, которые инициируют транскрипцию конкретного гена. Транскрипционные активаторы, как правило, связываются поблизости от транскрипционных промоторов и привлекают РНК-полимеразу для прямой инициации транскрипции. Репрессоры связываются с транскрипционными промоторами и стерически затрудняют инициацию транскрипции РНК-полимеразой. Другие транскрипционные регуляторы могут служить либо активаторами, либо репрессорами в зависимости от места их связывания и условий в клетке и в окружающей среде. Неограничивающие примеры классов транскрипционных регуляторов включают, не ограничиваясь перечисленными, белки гомеодомена, белки с цинковыми пальцами, белки с мотивом «крылатая спираль» (белки Forkhead) и белки с лейциновой молнией.

[00137] В настоящем документе термины «лечить» и/или «лечение» включают подавление, по существу ингибирование, замедление или обращение прогрессирования состояния, по существу облегчение клинических симптомов состояния или по существу предотвращение появления клинических симптомов состояния, получение благоприятных или требуемых клинических результатов. Лечение также относится к достижению чего-либо одного или более из: (а) уменьшения тяжести расстройства; (b) ограничения развития симптомов, характерных для расстройства или расстройств, лечение которых проводят; (с) ограничения ухудшения симптомов характерных для расстройства или расстройств, лечение которых проводят; (d) ограничения рецидивирования расстройства или расстройств у пациентов, ранее имевших указанное расстройство или расстройства; и (е) ограничения рецидивирования симптомов у пациентов, ранее не имевших симптомов указанного расстройства или расстройств.

[00138] Благоприятные или требуемые клинические результаты, такие как фармакологические и/или физиологические эффекты, включают, не ограничиваясь перечисленными, предотвращение наступления заболевания, расстройства или состояния у субъекта, который может быть предрасположен к указанному заболеванию, расстройству или состоянию, но еще не испытывает симптомов или у него еще не проявляются симптомы указанного заболевания (профилактическое лечение), облегчение симптомов указанного заболевания, расстройства или состояния, уменьшение степени заболевания, расстройства или состояния, стабилизацию (т.е., отсутствие ухудшения) указанного заболевания, расстройства или состояния, предотвращение распространения указанного заболевания, расстройства или состояния, задержку или замедление указанного заболевания, расстройства или состояния прогрессирование, облегчение или временное облегчение указанного заболевания, расстройства или состояния, и комбинации перечисленного, а также увеличение продолжительности выживания по сравнению с ожидаемым выживанием без лечения.

[00139] В настоящем документе термины «терапевтическое количество», «терапевтически эффективное количество», «эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» активного агента (например, липидной частицы с зкДНК согласно описанию в настоящем документе) используются взаимозаменяемо и относятся к количеству, достаточному для обеспечения предполагаемого преимущества лечения. При этом уровни дозы основаны на различных факторах, в том числе на типе повреждения, возрасте, массе тела, поле, медицинском состоянии пациента, тяжести состояния, пути введения и конкретного используемого активного агента.. Соответственно, схема дозирования может значительно варьировать, однако может быть определена обычным путем лечащим врачом с применением стандартных способов. Кроме того, термины «терапевтическое количество», «терапевтически эффективные количества» и «фармацевтически эффективные количества» включают профилактические или превентивные количества композиций согласно настоящему изобретению. При профилактическом или превентивном применении настоящего изобретения фармацевтические композиции или медикаменты вводят пациенту, подверженному или по иным причинам имеющему риск развития заболевания, расстройства или состояния, в достаточном количестве, чтобы исключить или снизить риск, уменьшить тяжесть или задержать начало указанного заболевания, расстройства или состояния, в том числе биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы указанного заболевания, расстройства или состояния, его осложнения, и промежуточные патологические фенотипы, возникающие в ходе развития указанного заболевания, расстройства или состояния. Обычно предпочтительно применение максимальной дозы, то есть самой высокой безопасной дозы в соответствии с некоторым медицинским заключением. Термины «доза» и «дозировка» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.

[00140] В настоящем документе термин «терапевтический эффект» относится к последствиям лечения, результаты которого считаются желательными и благоприятными. Терапевтический эффект может включать, прямо или непрямо, остановку, уменьшение или элиминацию заболевания. Терапевтический эффект может также включать, прямо или непрямо, остановку, уменьшение или элиминацию прогрессирования проявлений заболевания.

[00141] Для любого терапевтического агента описанное в настоящем документе терапевтически эффективное количество может быть изначально определено исходя из предварительных исследований in vitro и/или в моделях на животных. Терапевтически эффективная доза может также быть определена на основании данных для людей. Применяемая доза может быть скорректирована на основании относительных биодоступности и эффективности вводимого соединения. Коррекция дозы для достижения максимальной эффективности на основе описанных выше способов и других хорошо известных способов находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники. Общие принципы определения терапевтической эффективности, с которыми можно ознакомиться в главе 1 руководства: Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001), включенного в настоящий документ посредством ссылки, обобщены ниже.

[00142] Фармакокинетические принципы обеспечивают основу модификации схемы дозирования для получения требуемой степени терапевтической эффективности с минимумом неприемлемых нежелательных явлений. В ситуациях, когда концентрация лекарственного средства в плазме может быть измерена и связана с терапевтическим окном, могут быть получены дополнительные рекомендации по модификации дозировки.

[00143] В настоящем документе термины «вектор» или «экспрессионный вектор» относятся к репликону, такому как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может быть прикреплен другой сегмент ДНК, т.е. «вставка» «трансген» или «экспрессионная кассета», таким образом, чтобы обеспечить экспрессию или репликацию прикрепленного сегмента («экспрессионной кассеты») в клетке. Вектор может представлять собой конструкцию нуклеиновой кислоты, разработанную для доставки в клетку-хозяина или для передачи между разными клетками-хозяевами. Согласно настоящему изобретению вектор может быть вирусным или невирусным по происхождению в итоговой форме. При этом для целей настоящего изобретения «вектор» относится, как правило, к синтетическому AAV-вектору или никированному зкДНК-вектору. Соответственно, термин «вектор» охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации при связывании с надлежащими контрольными элементами и который может переносить генные последовательности в клетки. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может представлять собой рекомбинантный вектор или экспрессионный вектор.

[00144] В настоящем документе выражение «рекомбинантный вектор» относится к вектору, который включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, или «трансген», который способен к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в настоящем документе, могут, согласно некоторым вариантам реализации, быть скомбинированы с другими подходящими композициями и вариантами терапии. Согласно некоторым вариантам реализации указанный вектор является эписомным. Применение подходящего эписомного вектора обеспечивает способ сохранения представляющей интерес нуклеотидной последовательности у субъекта в высоком числе копий экстрахромосомной ДНК, с элиминацией таким образом потенциальных эффектов хромосомной интеграции.

[00145] В настоящем документ «ITR дикого типа» или «WT-ITR» относится к последовательности из встречающейся в природе последовательности ITR в AAV или другом депендовирусе, которая сохраняет, например, связывающую активность в отношении Rep и никирующую способность в отношении Rep. Нуклеотидная последовательность WT-ITR из любого серотипа AAV может незначительно отличаться от канонической встречающейся в природе последовательности из-за вырожденности генетического кода или дрейфа, и, соответственно, последовательности WT-ITR, предусмотренные для применения в настоящем документе, включают последовательности WT-ITR, образованные в результате встречающихся в природе изменений, происходящих в ходе процесса продуцирования (например, ошибки репликации).

[00146] В настоящем документе термин «содержащий» («включающий») или «содержит» («включает») используется в отношении композиций, способов и их соответствующего компонента (компонентов), существенных для указанного способа или композиции, но допускающих включение не указанных элементов, существенных или нет.

[00147] В настоящем документе термин «состоящий по существу из» относится к элементам, необходимым для определенного варианта реализации. Указанный термин допускает присутствие элементов, не влияющих существенным образом на основную и новую или функциональную характеристику (характеристики) указанного варианта реализации.

[00148] Термин «состоящий из» относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам согласно описанию в настоящем документе, которые не включают каких-либо элементов, не указанных в приведенном описании варианта реализации.

[00149] В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения термины в единственном числе включают их эквиваленты во множественном числе, если иное явным образом не следует из контекста. Соответственно, например, «способ» включает один или более способов, и/или этапов типа, описанного в настоящем документе, и/или таких, которые будут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения настоящего описания, и т.п. Аналогичным образом термин «или» включает «и», если из контекста явным образом не следует иное. Хотя при практической реализации или тестировании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, ниже описаны подходящие способы и материалы. Выражение «например» в настоящем документе указывает на неограничивающий пример. Соответственно, выражение «например» синонимично выражению «к примеру».

[00150] В настоящем документе термины «такой как», «например» и т.п. относятся к примерам вариантов реализации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

[00151] Если не указано, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют обычное значение, известное специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Хотя при практической реализации и тестировании настоящего изобретения могут применяться любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, предпочтительные материалы и способы описаны в настоящем документе.

[00152] За исключением рабочих примеров или если указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов или условий реакции, используемые в настоящем документе, следует понимать как модифицированные термином «приблизительно» во всех случаях. Термин «приблизительно» при использовании применительно к процентам может означать ± 1%. Настоящее изобретение дополнительно подробно разъяснено на приведенных ниже примерах, однако они не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

[00153] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными методиками, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в настоящем документе и, таким образом, может варьировать. Терминология, используемая в настоящем документе, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.

II. ДНК-векторы с замкнутыми концами (зкДНК)

[00154] Согласно настоящему изобретению предложены новые невирусные бескапсидные молекулы зкДНК с ко валентно замкнутыми концами (зкДНК). зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе не имеют ограничений по упаковке, налагаемых ограниченным пространством внутри вирусного капсида. зкДНК-векторы представляют собой перспективную продуцируемую в эукариотах альтернативу продуцируемым в прокариотах плазмидным ДНК-векторам, отличную от инкапсулированных геномов AAV. Это позволяет осуществлять инсерцию контрольных элементов, например, регуляторных переключателей согласно описанию в настоящем документе, больших трансгенов, нескольких трансгенов и т.п., и включение нативных генетических регуляторных элементов в трансген, при необходимости.

[00155] Существует множество структурных признаков зкДНК-векторов, которые отличают их от экспрессионных векторов на основе плазмид. зкДНК-векторы могут обладать одним или более из следующих признаков: отсутствие оригинальной (т.е. не инсертированной) бактериальной ДНК, отсутствие прокариотической точки начала репликации, автономность, т.е., они не требуют каких-либо последовательностей, кроме двух ITR, включая связывающие Rep сайты и сайты концевого разрешения (RBS и TRS), и экзогенной последовательности между ITR, присутствие последовательностей ITR, которые образуют шпильки, эукариотического происхождения (т.е., они продуцируются в эукариотических клетках), и отсутствие метилирования ДНК бактериального типа или, по сути, любого другого метилирования, воспринимаемого как аномальное хозяином- млекопитающим. В общем случае, предпочтительно, если предложенные векторы не содержат какой-либо прокариотической ДНК, однако предусмотрено, что определенная прокариотическая ДНК может быть инсертирована в качестве экзогенной последовательности, согласно неограничивающему примеру, в промоторной или энхансерной области. Другим важным признаком, отличающим зкДНК-векторы от плазмидных экспрессионных векторов заключается в том, что зкДНК-векторы представляют собой од но цепочечную линейную ДНК с замкнутыми концами, тогда как плазмиды всегда представляют собой двуцепочечную ДНК.

[00156] Применение зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с экспрессионными векторами на основе плазмид. Такие преимущества включают, не ограничиваясь перечисленными, следующие: 1) плазмиды содержат последовательностей бактериальной ДНК и подвергаются специфическому прокариотическому метилированию, например, метилированию с получением 6-метил-аденозина и 5-метил-цитозина, тогда как последовательности бескапсидного AAV-вектора имеют эукариотическое происхождение и не подвергаются специфическому прокариотическому метилированию; в результате бескапсидные AAV-векторы с меньшей вероятностью индуцируют воспалительные и иммунные ответы по сравнению с плазмидами; 2) плазмиды требуют присутствия гена устойчивости в процессе продуцирования, а зкДНК-векторы не требуют; 3) кольцевая плазмида не доставляется в ядро при введении в клетку и требует избыточного дозирования, чтобы избежать разложения клеточными нуклеазами, тогда как зкДНК-векторы содержат вирусные цис-элементы, т.е., модифицированные ITR, придающие устойчивость к нуклеазам, и могут быть разработаны для нацеливания и доставки в ядро. Выдвинуто предположение, что минимальные определяющие элементы, обязательные для функции ITR, представлены сайтом связывания Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) для AAV2) и сайтом концевого разрешения (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 48) для AAV2) плюс вариабельная палиндромная последовательность, обеспечивающее образование шпилек. Напротив, трансдукция бескапсидными AAV-векторами согласно описанию в настоящем документе может быть эффективно нацелена на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами AAV с применением различных реагентов для доставки.

[00157] зкДНК-векторы предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, по оценке с применением анализа расщепления рестрикционным ферментом и электрофоретического анализа (фиг. 5D). Считается, что линейная и непрерывная структура более устойчива к атаке клеточными эндонуклеазами, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Соответственно, зкДНК-вектор, имеющий линейную и непрерывную структуру, представляет собой предпочтительный вариант реализации. Непрерывный линейный одноцепочечный зкДНК-вектор с внутримолекулярным дуплексом может иметь ко валентно связанные концы без последовательностей, кодирующих белки капсида AAV. Указанные зкДНК-плазмиды структурно отличаются от плазмид (включая зкДНК-плазмиды, описанные в настоящем документе), которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновых кислот бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с получением двух молекул нуклеиновой кислоты, тогда как, напротив, зкДНК-векторы, содержащие комплементарные цепи, представлены единственной молекулой ДНК и, соответственно, даже после денатурации остаются в виде единственной молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут быть продуцированы без метилирования оснований ДНК по прокариотическому типу, в отличие от плазмид. Соответственно, зкДНК-векторы и зкДНК-плазмиды различаются как структурой (в частности, линейной или кольцевой), а также способами, используемыми для получения и очищения указанных разных объектов (см. ниже), а также метилированием ДНК, которое происходит по прокариотическому типу в случае зкДНК-плазмид и эукариотическому типу в случае зкДНК-вектора.

[00158] Согласно настоящему изобретению предложены невирусные бескапсидные молекулы зкДНК с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК). Указанные невирусные бескапсидные молекулы зкДНК могут продуцироваться в пермиссивных клетках-хозяевах с экспрессионной конструкции (например, с зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса, или линией клеток в интегрированном состоянии), содержащей гетерологичный ген (трансген), расположенный между двумя симметричными последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), при этом указанные ITR не являются ITR дикого типа и симметричны относительно друг друга. Таким образом, указанные ITR являются модифицированными ITR, a последовательность 3' ITR представляет собой обратный комплемент последовательности 5' ITR, и наоборот. Согласно некоторым вариантам реализации ITR модифицируют путем делеции, инсерции и/или замены относительно последовательности ITR дикого типа (например, AAV ITR). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения (trs) и сайт связывания Rep. зкДНК-вектор предпочтительно является дуплексным, например, самокомплементарным, по меньшей мере на протяжении части молекулы, такой как экспрессионная кассета (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой наподобие плазмиды). зкДНК-вектор имеет ковалентно замкнутые концы и, таким образом, устойчив к экзонуклеазному расщеплению (например, расщеплению экзонуклеазой I или экзонуклеазой III), например, в течение часа при 37°С.

[00159] Согласно одному аспекту зкДНК-вектор содержит в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету согласно описанию в настоящем документе) и второй AAV ITR. Согласно одному варианту реализации указанный первый ITR (5' ITR) и второй ITR (3' ITR) асимметричны друг другу, то есть имеют разную трехмерную пространственную конфигурацию. В примера варианта реализации первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, или наоборот, где первый ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, а второй ITR - ITR дикого типа. Согласно одному варианту реализации указанные первый ITR и второй ITR оба являются мутированными или модифицированными, но представляют собой разные последовательности, или содержат разные модификации, или представляют собой неидентичные мутированные или модифицированные ITR, и имеют разные трехмерные пространственные конфигурации. Иными словами, зкДНК-вектор с асимметричными ITR содержит ITR, отличающиеся тем, что какие-либо изменения в одном ITR относительно WT-ITR не отражаются в другом ITR; или, как вариант, тем, что асимметричные ITR в паре мутированных или модифицированных асимметричных ITR могут иметь разную последовательность и разную трехмерную форму.

[00160] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор содержит в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету согласно описанию в настоящем документе) и второй AAV ITR, причем первый ITR и второй ITR симметричны друг другу, то есть они представляют собой одну и ту же последовательность, но обратно-комплементарны друг другу. То есть зкДНК-вектор может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, такую, чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или содержала одинаковые петли А, С-С' и В-В' в трехмерном пространстве. Согласно такому варианту реализации пара симметричных ITR или пара по существу симметричных ITR может быть представлена мутированными или модифицированными ITR, которые не являются ITR дикого типа. В примере варианта реализации первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, или наоборот, когда первый ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, а второй ITR ITR дикого типа. Согласно одному варианту реализации оба указанных ITR, первый ITR и второй ITR, модифицированы, но представляют собой разные последовательности, или содержат разные модификации, или представляют собой неидентичные модифицированные ITR, и имеют разную трехмерную пространственную конфигурацию. В другом примере варианта реализации первый ITR (или 5 TTR) может представлять собой модифицированный ITR, например, SEQ ID NO: 484 (т.е. ITR-33, левый), а второй ITR (или 3' ITR) может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, например, SEQ ID NO: 469 (т.е. ITR-18, правый). Иными словами, зкДНК-вектор с асимметричными ITR содержит ITR, отличающиеся тем, что какие-либо изменения в одном ITR относительно WT-ITR не отражаются в другом ITR; или, как вариант, где асимметричные ITR в паре модифицированных асимметричных ITR могут иметь разную последовательность и разную трехмерную форму. ITR в паре мутированных или модифицированных ITR могут иметь одинаковую последовательность, которая содержит одну или более модификаций относительно ITR дикого типа, и являться обратно-комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. Согласно одному варианту формулы реализации ITR в паре модифицированных ITR по существу являются симметричными согласно определению в настоящем документе, то есть ITR в паре модифицированных ITR могут иметь разную последовательность, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. Согласно некоторым вариантам реализации типа симметричные ITR или по существу симметричные ITR представляют собой ITR дикого типа (WT-ITR) согласно описанию в настоящем документе. Соответственно, оба ITR имеют последовательность дикого типа, однако не обязательно должны представлять собой WT-ITR из одного и того же серотипа AAV. Согласно одному варианту реализации один WT-ITR может быть взят из одного серотипа AAV, а другой WT-ITR может быть взят из другого серотипа AAV. Согласно такому варианту реализации ITR в паре WT-ITR по существу симметричны согласно определению в настоящем документе, то есть они могут содержать модификацию одного или более консервативных нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00161] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) дикого типа, представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету согласно описанию в настоящем документе) и второй AAV ITR, причем первый WT-ITR и второй WT-ITR взяты из одного и того же серотипа AAV или из разных серотипов AAV. В примере варианта реализации первый WT-ITR (или 5 'WT-ITR) может быть взят из AAV 2, а второй WT-ITR (или 3' WT-ITR) может быть взят из AAV6. Примеры WT-ITR в зкДНК-векторе и для применения при получении зкДНК-плазмиды представлены ниже в разделе, названном «ITR», и в таблице 1 в настоящем документе.

[00162] Последовательности ITR дикого типа согласно настоящему изобретению представляют собой последовательности ДНК, включенные в экспрессионную конструкцию (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакуловирус) для продуцирования зкДНК-вектора.

[00163] Согласно некоторым вариантам реализации описанный в настоящем документе зкДНК-вектор содержит экспрессионную кассету с трансгеном, который может представлять собой, например, регуляторную последовательность, последовательность, кодирующую нуклеиновую кислоту (например, такую как miR или антисмысловая последовательность), или последовательность, кодирующую полипептид (например, такую как трансген). Согласно одному варианту реализации указанный трансген может быть функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые обеспечивают или контролируют экспрессию трансгена. Согласно одному варианту реализации указанный полинуклеотид содержит первую последовательность WT-ITR и вторую последовательность WT-ITR, при этом представляющая интерес нуклеотидная последовательность фланкирована указанными первой и второй последовательностями WT-ITR.

[00164] Примеры ITR обсуждаются ниже в разделе, названном «ITR», и в таблицах 2 и 5 в настоящем документе, или в таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10А-10В из PCT/US 18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., где фланкирующие последовательности ITR являются симметричными (например, обратно-комплементарными) или по существу симметричными.

[00165] Последовательности ITR согласно настоящему изобретению представляют собой последовательности ДНК, включенные в экспрессионную конструкцию (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду, зкДНК-бакуловирус) для продуцирования зкДНК-вектора. Соответственно, последовательности ITR, фактически содержащиеся в зкДНК-векторе, продуцированном с зкДНК-плазмиды или другой экспрессионной конструкции, может быть идентичны или не идентичны последовательностям ITR согласно настоящему изобретению в результате встречающихся в природе изменений (в том числе консервативных и неконсервативных модификаций), возникающих в процессе продуцирования (например, в результате ошибки репликации).

[00166] Согласно некоторым вариантам реализации описанный в настоящем документе зкДНК-вектор, содержащий экспрессионную кассету с трансгеном, который представляет собой терапевтическую последовательность нуклеиновой кислоты, может быть функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые обеспечивают или контролируют экспрессию указанного трансгена. Согласно одному варианту реализации указанный полинуклеотид содержит первую последовательность ITR и вторую последовательность ITR, отличающиеся тем, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность фланкирована первой и второй последовательностями ITR, и указанные первая и вторая последовательности ITR асимметричны друг другу или симметричны друг другу.

[00167] Согласно одному варианту реализации экспрессионная кассета расположена между двумя ITR и содержит, в указанном порядке, что-либо одно или более из перечисленного: промотор, функционально связанный с трансгеном, посттранскрипционный регуляторный элемент; и сигнал полиаденилирования и терминации. Согласно одному варианту реализации указанный промотор является регулируемым - индуцируемым или репрессируемым. Промотор может представлять собой любую последовательность, которая облегчает транскрипцию трансгена. Согласно одному варианту реализации указанный промотор представляет собой промотор CAG (например, SEQ ID NO: 03) или его вариант. Указанный посттранскрипционный регуляторный элемент представляет собой последовательность, которая модулирует экспрессию трансгена, в неограничивающем примере - любую последовательность, образующую третичную структуру, которая усиливает экспрессию трансгена, представляющего собой молекулу терапевтической нуклеиновой кислоты.

[00168] Согласно одному варианту реализации указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит WPRE (например, SEQ ID NO: 8). Согласно одному варианту реализации указанный сигнал полиаденилирования и терминации содержат BGHpolyA (например, SEQ ID NO: 9). Дополнительно может быть использован любой цис-регуляторный элемент, известный в данной области техники, или их комбинация, например, энхансерная 5'-последовательность позднего сигнала полиаденилирования SV40 (USE) или другие элементы посттранскрипционного процессинга, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). Согласно одному варианту реализации длина экспрессионной кассеты в 5'-3' направлении больше известной максимальной длины последовательности, заключаемой в капсид вириона AAV. Согласно одному варианту реализации указанная длина составляет более 4,6 килобаз, или более 5 килобаз, или более 6 килобаз, или более 7 килобаз. Различные примеры экспрессионных кассет представлены в настоящем документе.

[00169] Указанная экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10 000 нуклеотидов, или 20 000 нуклеотидов, или 30 000 нуклеотидов, или 40 000 нуклеотидов, или 50 000 нуклеотидов, или любое число нуклеотидов в диапазоне значений примерно от 4000 до 10000 нуклеотидов, или 10 000-50 000 нуклеотидов, или более 50 000 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета может содержать трансген (например, последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты), имеющий длину в диапазоне от 500 до 50 000 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета может содержать трансген (например, последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты), имеющий длину в диапазоне от 500 до 75 000 нуклеотиды длиной. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета может содержать трансген (например, последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты), имеющий длину в диапазоне от 500 до 10 000 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета может содержать трансген (например, последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты), имеющий длину в диапазоне от 1000 до 10 000 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета может содержать трансген (например, последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты), имеющий длину в диапазоне от 500 до 5 000 нуклеотидов. Указанные зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру, характерных для заключенных в капсиды AAV-векторов, что позволяет доставлять экспрессионную кассету значительного размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгенов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор не содержит специфического для прокариот метилирования.

[00170] Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета также может содержать участок внутренней посадки рибосомы (IRES) и/или элемент 2А. Цис-регуляторные элементы включают, не ограничиваясь перечисленными, промотор, рибопереключатель, инсулятор, miR-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. Согласно некоторым вариантам реализации ITR может выступать в роли промотора для трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты, регулирующие экспрессию трансгена, например, регуляторный переключатель, описанный в настоящем документе в разделе, названном «Регуляторные переключатели», для управления экспрессией трансгена и ее регуляции, и может содержать, если требуется, регуляторный переключатель, который представляет собой «аварийный выключатель» для обеспечения контролируемой гибели клетки, содержащей зкДНК-вектор.

[00171] На фиг. 1А-1В приведены схематические изображения неограничивающих примеров зкДНК-векторов или соответствующих последовательностей зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемую трансгенную кассету и второй ITR, при этом первая и вторая последовательности ITR мутированы относительно соответствующей последовательности AAV2 ITR дикого типа, и указанные мутации одинаковы (т.е. модифицированные ITR симметричны). Экспрессируемая трансгенная кассета предпочтительно включает один или более следующих элементов, в указанном порядке: энхансер/промотор, ORF-репортер (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(А) BGH).

[00172] На фиг. 2А-2В приведены схематические изображения неограничивающих примеров зкДНК-векторов или соответствующих последовательностей зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены с плазмиды, кодирующей в указанном порядке: первый WT-ITR, экспрессируемая трансгенная кассета и второй WT-ITR. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности первого и второго ITR представлены последовательностью AAV2 ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности первого и второго ITR выбраны из любой комбинации WT-ITR из представленных в таблице 1. Указанная экспрессируемая трансгенная кассета предпочтительно включает, в указанном порядке, что-либо одно или более из следующего: энхансер/промотор или регуляторный переключатель, ORF-репортер (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(А) BGH).

[00173] На фиг. 1А-1С из международной заявки PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г. и включенной в настоящий документ посредством ссылки полностью, приведено схематическое изображение неограничивающего примера зкДНК-векторов или соответствующей последовательности зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемую трансгенную кассету и второй ITR, причем по меньшей мере одна из последовательностей первого и/или второго ITR мутированным относительно соответствующей последовательности AAV2 ITR дикого типа. Указанная экспрессируемая трансгенная кассета предпочтительно включает в указанном порядке, что-либо одно или более из следующего: энхансер/промотор, ORF-репортер (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(А) BGH).

Терапевтические нуклеиновые кислоты

[00174] Указанная экспрессионная кассета может содержать любой представляющий интерес трансген. Трансгены, представляющие интерес, включают, не ограничиваясь перечисленными, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи, miR и т.п.) предпочтительно терапевтические (например, для применения в медицинских, диагностических или ветеринар ных целях) или иммуногенные полипептиды (например, для вакцин) полипептиды. Согласно некоторым вариантам реализации трансгены в экспрессионной кассете кодируют один или более полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, киРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов или любой комбинации перечисленного.

[00175] Иллюстративные терапевтические нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут включать, не ограничиваясь перечисленным, минигены, плазмиды, миникольца, короткую интерферирующую РНК (киРНК), микроРНК (миРНК), антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), рибозимы, двуцепочечную ДНК с замкнутыми концами (например, зкДНК, CELiD, линейную ковалентно замкнутую ДНК («служебную»), ДНК doggybone™, протеломерную ДНК с закрытыми концами или гантелеобразную линейную ДНК), дцРНК -субстрат Dicer, малую шпилечную РНК (мшРНК), асимметричную интерферирующую РНК (аиРНК), микроРНК (миРНК), мРНК, тРНК, рРНК и вирусные ДНК-векторы, вирусный РНК-вектор; и любую комбинацию перечисленного.

[00176] киРНК или миРНК, которые могут понижающе регулировать внутриклеточные уровни конкретных белков посредством процесса, называемого РНК-интерференцией (РНКи), также предусмотрены настоящим изобретением в качестве терапевтических средств на основе нуклеиновых кислот. После того, как киРНК или миРНК введена в цитоплазму клетки-хозяина, указанные двухцепочечные РНК-конструкции связываются с белком, называемым RISC. Комплекс RISC удаляет смысловую цепь миРНК или миРНК. Комплекс RISC в комбинации с комплементарной мРНК расщепляет мРНК и высвобождает разрезанные цепи. РНКи обусловлена специфическим разрушением мРНК, что приводит к понижающей регуляции соответствующего белка.

[00177] Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) и рибозимы, которые ингибируют трансляцию мРНК в белок, могут быть терапевтическими средствами на основе нуклеиновых кислот. В случае антисмысловых конструкций указанные одноцепочечные дезоксинуклеиновые кислоты имеют последовательность, комплементарную последовательности мРНК целевого белка, и способны связываться с мРНК посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику. Указанное связывание предотвращает трансляцию целевой мРНК и/или запускает разрушение транскрипта мРНК РНКазой Н. В результате антисмысловой олигонуклеотид характеризуется повышенной специфичностью действия {то есть понижающей регуляцией специфического белка, связанного с заболеванием).

[00178] Согласно любому из предложенных здесь способов терапевтическая нуклеиновая кислота может быть представлена терапевтической РНК. Указанная терапевтическая РНК может быть представлена ингибитором трансляции мРНК, агентом РНК-интерференции (РНКи), каталитически активной молекулой РНК (рибозимом), транспортной РНК (тРНК) или РНК, которая связывает транскрипт мРНК (ASO), белок или другой молекулярный лиганд (аптамер). Согласно любому из предложенных здесь способов агент РНКи может представлять собой двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, микро РНК, короткую интерферирующую РНК, короткую шпилечную РНК или образующий триплекс олигонуклеотид.

[00179] Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген представляет собой терапевтический ген или маркерный белок. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген представляет собой агонист или антагонист. Согласно некоторым вариантам реализации указанный антагонист представляет собой миметик антитела или фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, например, нейтрализующее антитело или фрагмент антитела и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует антитело, в том числе полноразмерное антитело или фрагмент антитела согласно определению в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело представляет собой антигенсвязывающий домен или последовательность вариабельного домена иммуно глобулина согласно определению в настоящем документе.

В частности, указанный трансген может кодировать один или более терапевтических агентов, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, например, белок (белки), полипептид (полипептиды), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты для применения при лечении, профилактике и/или облегчении одного или более симптомов заболеваний, дисфункции, повреждения и/или расстройства. Примеры трансгенов описаны в настоящем документе в разделе, названном «Способ лечения».

III. Инвертированные концевые повторы (ITR)

[00180] Согласно описанию в настоящем документе, в соответствии с одним вариантом реализации указанные зкДНК-векторы представляют собой бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные непрерывной цепью комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и не заключенная в капсид структура), которые содержат последовательность инвертированного 5'-концевого повтора (ITR) и последовательность инвертированного 3' ITR, которые отличаются друг от друга или являются асимметричными. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности ITR представлены последовательностями ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности ITR не являются последовательностями ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации указанные последовательности ITR представляют собой модифицированные последовательности ITR.

[00181] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы содержат гетерологичный ген, расположенный между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), которые либо являются обратно-комплементарными (инвертированными) друг относительно друга, или, как вариант, по существу являются симметричными - то есть ITR в паре WT-ITR имеют симметричную трехмерную пространственную организацию. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность ITR дикого типа (например, AAV WT-ITR) содержит функциональные сайты связывания Rep (RBS; 5'-CCCCGCTCGCTCGCTC-3'для AAV2, SEQ ID NO: 531) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 46).

[00182] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы содержат гетерологичный ген, расположенный между двумя фланкирующими последовательностями модифицированных инвертированных концевых повторов (mod-ITR), которые являются обратно-комплементарными (инвертированными) друг относительно друга, или по существу симметричны согласно определению в настоящем документе (т.е. содержат аналогичные модификации), и не являются ITR дикого типа. Указанные обратно-комплементарные ITR называются симметричными ITR. Указанные ITR представляют собой модифицированные относительно существующих встречающихся в природе парвовирусных ITR дикого типа (например, AAV ITR) путем делеция, инсерции и/или замены; и могут включать функциональный сайт связывания Rep (RBS; например 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3 'для AAV2, SEQ ID NO: 531) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 46).

[00183] Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность ITR может быть взята из вирусов семейства Parvoviridae, которое включает два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют насекомых. Подсемейство Parvovirinae (называемое парвовирусами) включает род Dependovirus, представители которого, в большинстве случаев, нуждаются в коинфицировании хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса, для продуктивной инфекции. Род Dependovirus включает аденоассоциированный вирус (AAV), который обычно инфицирует людей (например, серотипы 2, 3А, 3В, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы крупного рогатого скота, собачьих, лошадей, овец). Общее описание парвовирусов и других представителей семейства Parvoviridae приведено в источнике: Kenneth I. Bems, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," глава 69 издания «FIELDS VIROLOGY» (3 издание, 1996). Специалисту в данной области будет понятно, что ITR любого известного парвовируса можно использовать в композициях и способах согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанные ITR взяты из депендовируса, такого как AAV (например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, геном AAV-DJ и AAV-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), химерные ITR или ITR из любых синтетических AAV. Согласно некоторым вариантам реализации указанный AAV способен инфицировать теплокровных животных, например, представлен аденоассоциированными вирусами птиц (AAAV), крупного рогатого скота (BAAV), собачьих, лошадей и овец. Согласно некоторым вариантам реализации ITR взят из парвовируса В19 (номер доступа GenBank: NC 000883), мелкого вируса мышей (MVM) (номер доступа GenBank NC 001510); парвовируса гусей (номер доступа в GenBankNC 001701); парвовируса змей 1 (номер доступа GenBank NC 006148).

[00184] Согласно некоторым вариантам реализации выбор серотипа может быть основан на тканевом тропизме указанного серотипа. AAV2 характеризуется широким тканевым тропизмом, AAV1 преимущественно нацелен на нейроны и скелетные мышцы, а AAV5 преимущественно нацелен на нейроны, пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторы. AAV6 преимущественно нацелен на скелетные мышцы и легкие. AAV8 преимущественно нацелен на ткани печени, скелетных мышц, сердца и поджелудочной железы. AAV9 преимущественно нацелен на ткань печени, скелета и легких. Согласно некоторым вариантам реализации указанный серотип представлен AAV2.

[00185] Специалисту в данной области техники известно, что последовательности ITR имеют общую структуру, содержащую двухцепочечную структуру Холлидея, которая, как правило, представляет собой Т-образную или Y-образную шпилечную структуру (см., например, фиг. 3А и фиг. 4А), при этом каждый ITR образован двумя палиндромными плечами или петлями (В-В' и С-С'), погруженными в палиндромное плечо большего размера (А-А'), и а одноцепочечную последовательность D (при этом порядок указанных палиндромных последовательностей определяет ориентацию ITR), и, соответственно, можно сконструировать модифицированные последовательности ITR из любого серотипа AAV для применения в зкДНК-векторе или зкДНК-плазмиде на основе примеров последовательностей AAV2 ITR согласно настоящему изобретению. См., например, структурный анализ и сравнение последовательностей ITR из разных серотипов AAV (AAV1-AAV6), описанных в источниках: Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14.

[00186] Соответственно, хотя в качестве примеров ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированных ITR) в зкДНК-векторах согласно описанию в настоящем документе используют AAV2 ITR, зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может быть получен с ITR или основан на ITR любого известного серотипа AAV, включая, например, серотип AAV 1 (AAV1), серотип AAV 2 (AAV2), серотип AAV 4 (AAV4), серотип AAV 5 (AAV5), серотип AAV 6 (AAV6), AAV серотип 7 (AAV7), AAV серотип 8 (AAV8), AAV серотип 9 (AAV9), AAV серотип 10 (AAV10), AAV серотип 11 (AAV11) или AAV серотип 12 (AAV12). Специалист в данной области техники сможет определить соответствующую последовательность в других серотипах известными способами. Согласно настоящему изобретению также предложены популяции и совокупности зкДНК-векторов, содержащих ITR из комбинации разных серотипов AAV - то есть один ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR) может быть взят из одного серотипа AAV, а другой ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR) может быть взят из другого серотипа. Без связи с какой-либо теорией, согласно одному варианту реализации один ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR) может быть взят из последовательности AAV2 ITR или основан на последовательности AAV2 ITR, а другой ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR) зкДНК-вектора может быть взят из любых одной или более последовательностей или основан на любых одной или более последовательностях AAV ITR серотипа 1 (AAV1), AAV серотипа 4 (AAV4), AAV серотипа 5 (AAV5), AAV серотипа 6 (AAV6), AAV серотипа 7 (AAV7), AAV серотипа 8 (AAV8), AAV серотипа 9 (AAV9), AAV серотипа 10 (AAV10), AAV серотипа 11 (AAV11) или AAV серотипа 12 (AAV12).

[00187] В настоящем документе описаны конкретные изменения и мутации в WT-ITR в результате которых зкДНК может включать WT-ITR которые по существу симметричны, то есть имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, если пару G-C модифицируют, например, путем замены на пару C-G или наоборот, или если пару А-Т модифицируют путем замены на пару Т-А, или наоборот. Соответственно, если использовать приведенный выше иллюстративный пример 5' WT-ITR, содержащей последовательность ATCGATCG, и 3' WT-ITR, содержащей CGATCGAT (т.е., обратный комплемент ATCGATCG), указанные WT-ITR по существу были бы симметричными, если, например, 5' WT-ITR имел бы последовательность ATCGA4CG, где Т модифицирован путем замены на А, а по существу симметричный 3' WT-ITR имел бы последовательность GCATCGAT, без модификации А с заменой на Т. Согласно некоторым вариантам реализации ITR в такой паре WT-ITR по существу являются симметричными, поскольку они имеют симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00188] Конкретные изменения и мутации в ITR подробно описаны в настоящем документе, однако в контексте ITR «измененный», «мутированный» или «модифицированный» означает, что нуклеотиды были инсертированы, делетированы и/или заменены относительно последовательности ITR дикого типа или встречающейся в природе последовательности ITR, где два ITR, фланкирующие трансген или гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержат одинаковые модификации или по существу симметричны согласно определению в настоящем документе, т.е. имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве. Измененный или мутированный ITR может представлять собой сконструированный ITR. В настоящем документе «сконструированный» относится к признаку, который подвергается манипуляциям человека. Например, полипептид считают «сконструированным», если по меньшей мере один признак полипептида, например, его последовательность, был подвергнут манипуляциям человека для получения признака, который отличается от встречающегося в природе.

[00189] Согласно некоторым вариантам реализации ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR) может быть синтетическим. Согласно одному варианту реализации синтетический ITR основан на последовательностях ITR более чем из одного серотипа AAV. Согласно другому варианту реализации синтетический ITR не включает последовательностей на основе AAV. Согласно еще одному варианту реализации, синтетический ITR сохраняет описанную выше структуру ITR хотя и содержит только часть или не содержит последовательности, происходящей из AAV. Согласно некоторым аспектам синтетический ITR может преимущественно взаимодействовать с Rep дикого типа или Rep конкретного серотипа, или в некоторых случаях его не распознают Rep дикого типа, а распознает только мутированный Rep. Согласно некоторым вариантам реализации ITR представляет собой синтетическую последовательность ITR которая сохраняет функциональные сайты связывания Rep (RBS), такие как 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', и сайт концевого разрешения (TRS) наряду с вариабельной палиндромной последовательностью, обеспечивающей образование шпилечной вторичной структуры. Согласно некоторым примерам модифицированная последовательность ITR сохраняет последовательность RBS, trs, и структуру и положение связывающего элемента Rep, образующего концевую петлевую часть одной из шпилечных вторичных структур ITR как в соответствующей последовательности AAV2ITR дикого типа. Примеры последовательностей ITR для применения в зкДНК-векторах раскрыты в таблицах 2-9, 10А и 10В, SEQ ID NO: 2, 52, 101-449 и 545-547, и частичные последовательности ITR представлены на фиг. 26А - 26В из РСТ-заявки № PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать ITR с модификацией в ITR, соответствующей любой из модификаций в последовательностях ITR или частичных последовательностях ITR, представленных в любой одной или более из таблиц 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10А и 10В из РСТ-заявки № PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г.

[00190] Согласно одному варианту реализации фланкирующие ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированные ITR) по существу симметричны друг другу. Если ITR представляют собой модифицированные ITR модификации являются идентичными представляют собой одинаковые добавление, замену или делецию, однако указанные ITR не являются идентичными обратными комплементами. Например, указанные ITR (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированные ITR) могут быть взяты из разных серотипов (например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), например, представлены комбинацией AAV2 и AAV6, с модификацией в аналогичном положении.

[00191] Согласно одному варианту реализации указанные по существу симметричные ITR, когда один ITR инвертирован относительно другого ITR по меньшей мере на 80% идентичны, по меньшей мере на 90% идентичны, по меньшей мере на 95% идентичны, по меньшей мере на 96% идентичны, по меньшей мере на 97% идентичны, по меньшей мере на 98% идентичны, или по меньшей мере на 99% идентичны, или % идентичности соответствует любому промежуточному значению. Гомология может быть определена стандартными способами, хорошо известными в данной области техники, например, с применением BLAST («Basic Local Alignment Search Tool»), BLASTN с параметрами, установленными по умолчанию. ITR считаются по существу симметричными, если общая геометрия их петель А В и С аналогична. Согласно некоторым вариантам реализации ITR в паре WT-ITR по существу симметричны, поскольку имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, например, имеют одинаковую трехмерную организацию плеч А С-С'. В-В' и D. Согласно одному варианту реализации ITR в паре по существу симметричных WT-ITR инвертированы друг относительно друга и по меньшей мере на 95% идентичны, по меньшей мере на 96%… на 97%… 98%… 99%…99,5% идентичны друг другу, или % идентичности соответствует любому промежуточному значению, и один из WT-ITR сохраняет сайт связывания Rep (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) и сайт концевого разрешения (trs). Согласно некоторым вариантам реализации а по существу симметричные WT-ITR пара инвертированы друг относительно друга и по меньшей мере на 95% идентичны, по меньшей мере 96%…97%… 98%… 99%…99,5% идентичны друг другу, или % идентичности соответствует любому промежуточному значению, и один из WT-ITR сохраняет сайт связывания Rep (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) и сайт концевого разрешения (trs), наряду с вариабельной палиндромной последовательность, обеспечивающей образование шпилечной вторичной структуры.

[00192] Согласно одному варианту реализации пара по существу симметричных модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR) при условии, что различие нуклеотидных последовательностей указанных ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. Например, mod-ITR последовательность которого по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности канонического mod-ITR по оценке с применением стандартных способов, хорошо известных в данной области техники, например, с применением BLAST («Basic Local Alignment Search Tool»), BLASTN с использованием параметров, установленных по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерная структура имеет такую же форму в геометрическом пространстве. ITR в паре по существу симметричных mod-ITR содержит одинаковые петли А С-С' и В-В' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в паре по существу симметричных mod-ITR содержит делению в плече С-С, то когнатный mod-ITR содержит соответствующую делецию в плече С-С, а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных петель А и В-В', принимающую такую же форму в геометрическом пространстве, что и у когнатного mod-ITR. В неограничивающем примере по существу симметричные ITR могут иметь симметричные стереохимические характеристики, так что их структура принимает одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, например, если модифицирована пара G-С, например, заменена на пару C-G или наоборот, или модифицирована пара А-Т с заменой на пару Т-А, или наоборот. Соответственно, в приведенном выше иллюстративном примере модифицированного 5' ITR с последовательностью ATCGAACGATCG, и модифицированного 3' ITR с последовательностью CGATCGTTCGAT (т.е., обратным комплементом ATCGAACGATCG), указанные модифицированные ITR все же остаются симметричными при условии, что, например, 5' ITR имел последовательность ATCGLAACCATCG, где дополнительно модифицирован G с заменой на С, а по существу симметричный 3' ITR имеет последовательность CGATCGTTCGAT, без аналогичной модификации Т помимо А. Согласно некоторым вариантам реализации ITR в такой паре модифицированных ITR по существу симметричны, поскольку указанная пара модифицированных ITR имеет симметричные стереохимические характеристики.

[00193] Согласно некоторым вариантам реализации ITR из пары mod-ITR могут иметь другие обратно-комплементарные нуклеотидные последовательности, но все же имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию - то есть оба ITR содержат мутации, которые приводят к образованию одной и той же общей трехмерной формы. Например, один ITR (например, 5 'ITR) в паре mod-ITR может быть взят из одного серотипа, а другой ITR {например, 3' ITR) может быть взят из другого серотипа, однако оба ITR могут содержать одинаковую соответствующую мутацию (например, в том случае, если 5'ITR содержит делецию в области С, когнатный модифицированный 3'ITR из другого серотипа содержит делецию в аналогичном положении в области С), таким образом, что ITR в паре модифицированных ITR имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. Пара по существу симметричных mod-ITR содержит одинаковые петли А, С-С' и В-В' в трехмерном пространстве. В неограничивающем примере в том случае, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR содержит делецию в плече С-С, то когнатный mod-ITR содержит соответствующую делецию в плече С-С, а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных петель А и В-В', принимающую такую же форму в геометрическом пространстве, что и когнатный mod-ITR. Согласно другому примеру в том случае, если 5' mod-ITR содержит делецию одной или более нуклеиновых кислот в области В, то когнатный модифицированный 3'-ITR содержит делецию в соответствующем положении нуклеотида в плече В'.

[00194] Специалисту в данной области хорошо известно, что если 5 'mod-ITR имеет модификацию в области А, родственный 3'ITR будет иметь модификацию в соответствующем положении в области А'; если 5' mod-ITR содержит модификацию в области С, когнатный 3'ITR будет содержать модификацию в соответствующем положении в области С, или наоборот, если 5' mod-ITR содержит модификацию в области С, когнатный 3 'ITR будет содержать модификацию в соответствующем положении в области С; если 5' mod-ITR содержит модификацию в области В, когнатный 3'ITR будет содержать модификацию в соответствующем положении в области В', или наоборот, если 5' mod-ITR содержит модификацию в области В', когнатный 3'ITR будет содержать модификацию в соответствующем положении в области В; и если 5' mod-ITR содержит модификацию в области А', когнатный 3'mod-ITR будет содержать модификацию в соответствующем положении в области А, таким образом, указанные mod-ITR симметричны или по существу симметричны согласно определению в настоящем документе, соответственно, пара модифицированных ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00195] Согласно некоторым вариантам реализации в тех случаях, когда симметричные модифицированные ITR являются по существу симметричными, отличие нуклеотидной последовательности фланкирующего симметричного модифицированного ITR относительно другого ITR заключается в том, что изменение представляет собой замену одной нуклеиновой кислоты на консервативную нуклеиновую кислоту. Согласно некоторым вариантам реализации в тех случаях, когда симметричные модифицированные ITR являются по существу симметричными, отличие нуклеотидной последовательности фланкирующего симметричного модифицированного ITR относительно другого ITR заключается в том, что изменение представляет собой замену одной, или двух, или трех нуклеиновых кислот на комплементарную нуклеиновую кислоту, причем указанные изменения могут располагаться последовательно, или, как вариант, рассредоточены по ITR или расположены в ITR прерывистым образом. Согласно некоторым вариантам реализации в тех случаях, когда ITR в паре симметричных модифицированных ITR являются по существу симметричными согласно определению в настоящем документе, ITR может содержать замену: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых кислот на комплементарные нуклеиновые кислоты относительно фланкирующего по существу симметричного модифицированного ITR, при условии, что указанное различие нуклеотидных последовательностей двух по существу симметричных модифицированных ITR не влияет на свойства или общую форму, и что они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве.

[00196] В качестве ITR или в качестве базового ITR для модификации может быть использован любой ITR парвовируса (например, ITR дикого типа (WT) или модифицированный ITR). Предпочтительно, указанный парвовирус представляет собой депендовирус. Более предпочтительно указанный парвовирус представляет собой AAV. Выбор серотипа может быть основан на тканевом тропизме указанного серотипа. AAV2 характеризуется широким тканевым тропизмом, AAV1 преимущественно нацелен на нейроны и скелетные мышцы, a AAV5 преимущественно нацелен на нейроны, пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторы. AAV6 преимущественно нацелен на скелетные мышцы и легкие. AAV8 преимущественно нацелен на ткани печени, скелетных мышц, сердца и поджелудочной железы. AAV9 преимущественно нацелен на ткань печени, скелета и легких. Согласно одному варианту реализации указанный модифицированный ITR основан на AAV2 ITR.

[00197] Согласно некоторым вариантам реализации указанный векторный полинуклеотид содержит пару WT-ITR выбранную из группы, представленной в таблице 1. В таблице 1 приведены примеры комбинаций WT-ITR из одного серотипа или разных серотипов, или разных парвовирусов. Приведенный порядок не указывает на положение ITR, например, «AAV1, AAV2» показывает, что зкДНК может содержать WT- AAV1 ITR в положении 5', a WT- AAV2 ITR в положении 3', или наоборот, WT- AAV2ITR в положении 5', a WT- AAV1 ITR в положении 3'. Сокращения: AAV серотипа 1 (AAV1), AAV серотипа 2 (AAV2), AAV серотипа 3 (AAV3), AAV серотипа 4 (AAV4), AAV серотипа 5 (AAV5), AAV серотипа 6 (AAV6), AAV серотипа 7 (AAV7), AAV серотипа 8 (AAV8), AAV серотипа 9 (AAV9), AAV серотипа 10 (AAV10), AAV серотипа 11 (AAV11), или AAV серотипа 12 (AAV12); AAVrh8, AAVrh10, геном AAV-DJ и AAV-DJ8 (Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITR теплокровных животных (птичий AAV (AAAV), бычий AAV (BAAV), собачий, лошадиный и овечий AAV), ITR из парвовируса В19 (№ доступа GenBank: NC 000883), мелкий вирус мышей (MVM) (№доступа GenBank NC 001510); гусиный: парвовирус гусей (№ доступа GenBank NC 001701); змеиный: парвовирус змей 1 (№ доступа GenBank NC 006148).

[00198] Согласно некоторым вариантам реализации указанный векторный полинуклеотид или указанные невирусные бескапсидные ДНК-векторы с ковалентно замкнутыми концами содержат пару WT-ITR, выбранных из WT-ITR приведенных в таблице 2. В неограничивающем примере в таблице 2 приведены последовательности примеров WT-ITR из разных серотипов AAV.

[00199] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный зкДНК-вектор не содержит WT-ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любой из последовательностей в таблице 2. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор не содержит WT-ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любой из: SEQ ID NO: 558-567, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 1.

[00200] Согласно альтернативным вариантам реализации настоящего изобретения в том случае, если зкДНК-вектор содержит WT-ITR содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из: SEQ ID NO: 558 567, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 1, фланкирующий ITR также представляет собой WT ITR и зкДНК содержит регуляторный переключатель, например, согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе, а выбранный WT-ITR содержит любую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 558-567, SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO: 1.

[00201] ЗкДНК-вектор, описанный в настоящем документе, может включать структуры WT-ITR, которые сохраняют функциональные части RBE, trs и RBE'. На фиг. 3А и фиг. 3В показан, на примере ITR дикого типа, один из возможных механизмов функционирования сайта trs в составе части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит одну или более последовательностей полинуклеотидов функциональных WT-ITR которые содержат сайт связывания Rep (например, RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) для AAV2) и сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT (SEQ ID NO: 46)). Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере один WT-ITR является функциональным. Согласно альтернативным вариантам реализации в том случае, если зкДНК-вектор содержит два WT-ITR которые по существу симметричны друг другу, по меньшей мере один WT-ITR является функциональным и по меньшей мере один WT-ITR является нефункциональным. Согласно альтернативным вариантам реализации в тех случаях, когда зкДНК-вектор содержит два модифицированных ITR, симметричных друг другу, по меньшей мере один модифицированный ITR является функциональным и по меньшей мере один модифицированный ITR является нефункциональным. Указанные зкДНК могут содержать регуляторный переключатель, например, согласно описанию здесь и дополнительному подробному описанию в разделе V ниже.

[00202] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор не содержит модифицированного ITR, выбранного из любой последовательности, состоящей или по существу состоящей из: SEQ ID NO: 500-529 согласно настоящему описанию. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор не содержит ITR который выбран из любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 500-529.

[00203] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит пару ITR выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 484 (ITR-33, левый) и SEQ ID NO: 469 (ITR-18, правый); SEQ ID NO: 485 (ITR-34, левый) и SEQ ID NO: 95 (ITR-51, правый); SEQ ID NO: 486 (ITR-35, левый) и SEQ ID NO: 470 (ITR-19, правый); SEQ ID NO: 487 (ITR-36, левый) и SEQ ID NO: 471 (ITR-20, правый); SEQ ID NO: 488 (ITR-37, левый) и SEQ ID NO: 472 (ITR-21, правый); SEQ ID NO: 489 (ITR-38, левый) и SEQ ID NO: 473 (ITR-22, правый); SEQ ID NO: 490 (ITR-39, левый) и SEQ ID NO: 474 (ITR-23, правый); SEQ ID NO: 491 (ITR-40, левый) и SEQ ID NO: 475 (ITR-24, правый); SEQ ID NO: 492 (ITR-41, левый) и SEQ ID NO: 476 (ITR-25, правый); SEQ ID NO: 493 (ITR-42, левый) и SEQ ID NO: 477 (ITR-26, правый); SEQ ID NO: 494 (ITR-43, левый) и SEQ ID NO: 478 (ITR-27, правый); SEQ ID NO: 495 (ITR-44, левый) и SEQ ID NO: 479 (ITR-28, правый); SEQ ID N0:496 (ITR-45, левый) и SEQ ID N0:480 (ITR-29, правый); SEQ ID NO: 497 (ITR-46, левый) и SEQ ID NO: 481 (ITR-30, правый); SEQ ID NO: 498 (ITR-47, левый) и SEQ ID NO: 482 (ITR-31, правый); SEQ ID NO: 499 (ITR-48, левый) и SEQ ID NO: 483 (ITR-32, правый).

[00204] Согласно одному варианту реализации каждого из указанных аспектов указанный зкДНК-вектор или указанные невирусные бескапсидные ДНК-векторы с ковалентно замкнутыми концами содержат пару симметричных ITR, выбранных из ITR, содержащих частичные последовательности ITR, представленные на фиг. 6В - 21В, или выбранных из комбинаций: SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 и SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 и SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 и SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 и SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 и SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 и SEQ ID NO: 546.

[00205] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать ITR с модификацией в ITR соответствующей любым из модификаций в последовательностях ITR или частичных последовательностях ITR представленных в таблице 5, или последовательностях, представленных на фиг. 7А - 22В в настоящем документе или в таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10А-10В в PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., при этом фланкирующая последовательность ITR является симметричной (например, обратно-комплементарной) ей или по существу симметричной.

[00206] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК может образовывать внутримолекулярную дуплексную вторичную структуру. В неограничивающем примере вторичная структура первого ITR и симметричного второго ITR представлена в контексте ITR дикого типа (см., например, фиг. 2А, 2В, 4С) и/или модифицированных структур ITR (см., например, фиг. 7А - 22В). Вторичные структуры выводят или предсказывают на основании последовательностей ITR плазмиды, используемой для получения зкДНК-вектора. Примеры вторичных структур пар модифицированных симметричных ITR, в которых удалена часть структуры «петля-на-стебле», приведены на фиг. 7А - 22В. Примеры вторичных структур модифицированных ITR содержащих единственный стебель и две петли, приведены на фиг. 10А - 10В, 12А-12В, 13А-13В, 13А-22В. Примеры вторичной структуры модифицированного ITR с единственным стеблем и единственной петлей приведены на фиг. 7А - 7В (например, с единственной петлей С-С) и фиг 8А - 8В (например, с единственной петлей В-В'). Примеры вторичной структуры модифицированного ITR с единственным стеблем вместо двух петель приведены на фиг. 11А - 11В. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вторичная структура может быть выведена, как показано в настоящем документе, с использованием термодинамических методов, основанных на правилах ближайшего соседа, которые предсказывают стабильность структуры, количественно определяемую изменением свободной энергии укладки. Например, указанная структура может быть предсказана путем нахождения структуры с наименьшей свободной энергией. Согласно некоторым вариантам реализации для предсказания структуры ITR может быть использован алгоритм, описанный в источнике: Reuter, J.S., & Mathews, D.H. (2010) RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bio informatics. 11, 129, и реализованный в программном обеспечении RNAstructure (доступно в сети Интернет по адресу: «rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html"). Указанный алгоритм может также включать как параметры изменения свободной энергии при 37°С, так и параметры изменения энтальпии, полученные из экспериментальной литературы, что позволяет прогнозировать стабильность конформации при произвольной температуре. С применением программного обеспечения для анализа структуры РНК могут быть предсказаны некоторые из модифицированных структур ITR в виде модифицированных Т-образных структур типа «петля-на-стебле» с расчетной свободной энергией Гиббса(ΔС) для разворачивания в физиологических условиях, представленными на фиг. 7А - 22В. С применением программного обеспечения для анализа структуры РНК предсказаны три типа модифицированных ITR имеющие более высокую свободную энергию Гиббса для разворачивания, чем ITR дикого типа AAV2 (-92, 9 ккал/моль); указанные ITR представлены следующими: (а) модифицированные ITR со структурой с единственным плечом/единственной неспаренной петлей согласно настоящему изобретению, согласно прогнозу имеющие свободную энергию Гиббса для разворачивания в диапазоне от -85 до -70 ккал/моль. (b) предсказано, что модифицированные ITR имеющие структуру с единственной шпилькой, описанные в настоящем документе, будут иметь свободную энергию Гиббса для разворачивания в диапазоне от -70 до -40 ккал/моль. (с) предсказано, что модифицированные ITR, имеющие структуру с двумя плечами, описанные в настоящем документе, будут иметь свободную энергию Гиббса для разворачивания в диапазоне от -90 до -70 ккал/моль. Без связи с какой-либо теорией, структуры с более высокой свободной энергией Гиббса будут легче разворачиваться для репликации белками репликации Rep 68 или Rep 78. Таким образом, модифицированные ITR имеющие более высокую свободную энергию Гиббса для разворачивания - например, структура с одним плечом / одной непарной петлей, структура с одной шпилькой, усеченная структура - демонстрируют тенденцию к более эффективной репликации, чем ITR дикого типа.

[00207] Согласно одному варианту реализации левый ITR зкДНК-вектор а модифицирован или мутирован относительно структуры AAV ITR дикого типа, а правый ITR симметричен (обратно-комплементарен) ему и содержит такие же мутации. Согласно одному варианту реализации правый ITR зкДНК-вектора модифицирован относительно структуры AAV ITR дикого типа, а левый ITR симметричен (обратно-комплементарен) ему и содержит такие же мутации. Согласно такому варианту реализации модификация ITR (например, левого или правого ITR) может быть получена путем делеции, инсерции или замены одного или более нуклеотидов ITR дикого типа, происходящего из генома AAV.

[00208] Используемые согласно настоящему изобретению ITR могут быть разрешаемыми и неразрешаемыми, и выбранные для применения в зкДНК-векторах ITR предпочтительно представляют собой последовательности AAV, причем предпочтительными являются последовательности из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9. Разрешаемые AAV ITR не обязательно представлены последовательностью ITR дикого типа (например, эндогенная последовательность AAV ITR или последовательность AAV ITR дикого типа может быть изменена путем инсерции, делеции, усечения и/или введения миссенс-мутаций), при условии, что указанный концевой повтор опосредует требуемые функции, например, репликацию, упаковку, интеграцию вируса и/или «спасение» провируса, и т.п.Как правило, но не обязательно, ITR взяты из одного серотипа AAV, например, обе последовательности ITR зкДНК-вектора взяты из AAV2. Как описано выше, согласно некоторым вариантам реализации ITR в паре модифицированных ITR по существу симметричны, то есть имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, но не содержат идентичных обратно-комплементарных нуклеотидных последовательностей. В таких вариантах реализации оба ITR в паре модифицированных ITR могут быть взяты из разных серотипов (например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), например, комбинации AAV2 и AAV6, причем модификация одного ITR отражена в соответствующем положении когнатного ITR из другого серотипа. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные ITR могут представлять собой синтетические последовательности, которые функционируют как инвертированные концевые повторы AAV, такие как «DD-последовательность» согласно описанию в патенте США №5478745, Samulski et al.

[00209] Согласно одному варианту реализации зкДНК может включать структуру ITR, которая мутирована относительно одного из ITR дикого типа согласно описанию в настоящем документе, однако при этом мутантный или модифицированный ITR сохраняет функциональный сайт связывания Rep (RBE или RBE') и сайт концевого разрешения (trs). Согласно одному варианту реализации указанный мутантный зкДНК ITR включает функциональный сайт белка репликации (RPS-1), и при продуцировании используют репликативно-компетентный белок, который связывает сайт RPS-1.

[00210] Согласно одному варианту реализации по меньшей мере один из ITR представляет собой дефектный ITR в отношении связывания Rep и/или никирования Rep.Согласно одному варианту реализации указанный дефект представлен по меньшей мере 30%, согласно другим вариантам реализации - по меньшей мере 35%…, 50%.., 65%…, 75%…, 85%…, 90%…, 95%…, 98%…, недостаточностью функции относительно ITR дикого типа или ее полным отсутствием, или недостаточностью функции, соответствующей какому-либо промежуточному значению. Клетки-хозяева не экспрессируют вирусные капсидные белки и полинуклеотидная векторная матрица не содержит каких-либо последовательностей, кодирующих вирусный капсид. Согласно одному варианту реализации указанные полинуклеотидные векторные матрицы и клетки-хозяева, которые не содержат генов капсида AAV и итогового белка, также не кодируют или экспрессируют генов капсидов других вирусов. Кроме того, согласно конкретному варианту реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты также не содержит последовательностей, кодирующих белок Rep AAV.

[00211] Согласно некоторым вариантам реализации структурный элемент ITR может быть представлен любым структурным элементом, который вовлечен в функциональное взаимодействие ITR с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). Согласно некоторым вариантам реализации указанный структурный элемент обеспечивает селективность взаимодействия ITR с большим белком Rep, т.е., определяет по меньшей мере частично, какой белок Rep функционально взаимодействует с указанным ITR. Согласно другим вариантам реализации указанный структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ITR. Каждый структурный элемент может представлять собой, например, вторичную структуру ITR нуклеотидную последовательность ITR. промежуточную последовательность между двумя или более элементами; или комбинацию любых вышеперечисленных элементов. Согласно одному варианту реализации указанные структурные элементы выбраны из группы, состоящей из плеча А и плеча А', плеча В и плеча В', плеча С и плеча С, плеча D, связывающего Rep сайта (RBE) и RBE' (т.е. последовательности, комплементарной RBE), и сайта концевого разрешения (trs).

[00212] Конкретнее, указанный ITR может быть структурно модифицирован. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована по сравнению с последовательностью ITR дикого типа. Согласно одному варианту реализации структурный элемент (например, плечо А, плечо А', плечо В, плечо В', плечо С, плечо С, плечо D. RBE, RBE' и trs) ITR может быть удален и заменен структурным элементом дикого типа из другого парвовируса. Например, структура для замены может быть взята из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, свиного парвовируса или AAV насекомых. Например, указанный ITR может представлять собой AAV2 ITR а плечо А или А' или RBE может быть заменено на структурный элемент из AAV5. Согласно другому примеру указанный ITR может представлять собой AAV5 ITR а плечи С или С, RBE и trs могут быть заменены на структурный элемент из AAV2. Согласно другому примеру указанный AAV ITR может представлять собой AAV5 ITR где плечи В и В' заменены на плечи В и В' AAV2 ITR.

[00213] Исключительно для примера в таблице 3 приведены иллюстративные модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, инсерция и/или замена) в областях модифицированных ITR где X указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, инсерцию и/или замену) в указанном участке относительно соответствующего ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в любой из областей С и/или С, и/или В, и/или В' сохраняется три последовательных нуклеотида Т (т.е. ТТТ) по меньшей мере в одной концевой петле. Например, если указанная модификация приводит к чему-либо из: ITR с единственным плечом (например, с единственным плечом С-С' или единственным плечом В-В'), или с модифицированным плечом С-В' или плечом С'-В, или ITR с двумя плечами, содержащему по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо С-С' и/или усеченное плечо В-В'), то по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плеч ITR с двумя плечами (у которого одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида Т (т.е. ТТТ) по меньшей мере в одной концевой петле. Согласно некоторым вариантам реализации усеченное плечо С-С' и/или усеченное плечо В-В' содержит три последовательных нуклеотида Т (т.е. ТТТ) в концевой петле.

[00214] В таблице 3 приведены примеры комбинаций модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в разных областях или плечах В-В' и С-С' ITR (X указывает на модификацию нуклеотида, например, добавление, делецию или замену по меньшей мере одного нуклеотида в указанной области).

[00215] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3, и также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида в любой одной или более областях, выбранных из: области между А' и С, между С и С', между С и В, между В и В' и между В' и А. Согласно некоторым вариантам реализации при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замене) в области С, или С', или В, или В', все же сохраняется концевая петля структуры «петля-на-стебле». Согласно некоторым вариантам реализации при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замене) между С и С' и/или В и В' сохраняются три последовательных нуклеотида Т (т.е., ТТТ) по меньшей мере в одной концевой петле. Согласно альтернативным вариантам реализации при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замене) между С и С' и/или В и В' сохраняются три последовательных нуклеотида А (т.е., AAA) по меньшей мере в одной концевой петле. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения согласно настоящему изобретению может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3. а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, инсерцию и/или замену) в любой одной или более областей, выбранных из: А', А и/или D. Например, согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, инсерцию и/или замену) в области А. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, инсерцию и/или замену) в области А'. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, инсерцию и/или замену) в области А и/или А'. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать любую из комбинаций модификаций, представленных в таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, инсерцию и/или замену) в области D.

[00216] Согласно одному варианту реализации нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20, или более нуклеотидов, или любого числа нуклеотидов в промежуточном диапазоне) с получением модифицированного структурного элемента. Согласно одному варианту реализации примеры конкретных модификаций симметричных ITR приведены в настоящем документе (например, пары симметричных модифицированных ITR, идентифицированные в таблице 4.

[00217] Согласно некоторым вариантам реализации ITR может быть модифицирован (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20, или более нуклеотидов, или любого числа нуклеотидов в промежуточном диапазоне). Согласно другим вариантам реализации последовательность ITR может быть по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или более идентична последовательности одной из модифицированных ITR из таблице 4 (например, или содержащей RBE части плеча А-А' и плечам С-С' и В-В' симметричных модифицированных пар, выбранных из группы, состоящей из, например, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 и SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 и SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 и SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 и SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 и SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 и SEQ ID NO: 546.

[00218] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может, например, включать удаление или делецию конкретного плеча полностью, например, полные или частичные удаление или делецию плеча А-А', или полные или частичные удаление или делецию плеча В-В', или полные или частичные удаление или делецию плеча С-С', или, как вариант, удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований, образующих стебель петли, при условии сохранения итоговой петли, которой завершается стебель (например, единственного плеча) (например, см. ITR-6). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча В-В'. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча С-С'. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча С-С' и удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча В-В'. Предусмотрена любая комбинация удаления пар оснований, например, 6 пар оснований могут быть удалены в плече С-С' и 2 пары оснований в плече В-В'. Иллюстративный пример представлен модифицированным ITR с делецией по меньшей мере 7 пар оснований как в С-части, так и в С-части, заменой нуклеотида в петле между областями С и С', и делецией по меньшей мере одной пары оснований как в области В, так и в области В' таким образом, чтобы модифицированный ITR содержал два плеча, причем по меньшей мере одно плечо (например, С-С') является усеченным. Обратим внимание, что в указанном примере, поскольку модифицированный ITR содержит по меньшей мере одну делецию пар оснований в каждой из областей В и В ', плечо В-В' также усечено по сравнению с WT ITR.

[00219] Согласно некоторым вариантам реализации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более комплементарный пар оснований удаляют как из С-части, так и из С'-части плеча С-С', таким образом, что плечо С-С' становится усеченным. Иначе говоря, при удалении основания из С-части плеча С-С', удаляют комплементарную пару оснований из С'-части, с усечением таким образом плеча С-С'. Согласно таким вариантам реализации удаляют 2, 4, 6, 8 или более пар оснований из плеча С-С', таким образом, что плечо С-С' становится усеченным. Согласно альтернативным вариантам реализации удаляют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из С-части плеча С-С' таким образом, чтобы сохранилась только С'-часть плеча. Согласно альтернативным вариантам реализации удаляют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из С-части плеча С-С таким образом, чтобы сохранилась только С-часть плеча.

[00220] Согласно некоторым вариантам реализации удаляют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более комплементарных пар оснований как из В-части, так и из В'-части плеча В-В' таким образом, чтобы плечо В-В' становится усеченным. Иначе говоря, при удалении основания из В-части плеча В-В' удаляют комплементарную пару оснований из В'-части, с усечением таким образом плеча В-В'. Согласно таким вариантам реализации удаляют 2, 4, 6, 8 или более пар оснований из плеча В-В' таким образом, что плечо В-В' становится усеченным. Согласно альтернативным вариантам реализации удаляют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из В-части плеча В-В' таким образом, чтобы сохранилась только В'-часть плеча. Согласно альтернативным вариантам реализации удаляют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из В'-части плеча В-В' таким образом, чтобы сохранилась только В-часть плеча.

[00221] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может содержать от 1 до 50 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может содержать от 1 до 30 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности WT ITR. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR содержит от 2 до 20 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа.

[00222] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR образует две противопоставленных продольно-симметричных «петли-на-стебле», например, петля С-С' имеет длину, отличную от длины петли В-В'. Согласно некоторым вариантам реализации одна из противопоставленных продольно-симметричных петель-на-стебле модифицированного ITR содержит часть стебля С-С' и/или В-В' с длиной в диапазоне от 8 до 10 пар оснований, и петлевую часть (например, между С-С' или между В-В'), которая содержит от 2 до 5 неспаренных дезоксирибонуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации одна из продольно-симметричных петель-на-стебле модифицированного ITR содержит часть стебля С-С и/или В-В' длиной менее 8 или менее 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 пар оснований и петлевую часть (например, между С-С или между В-В'), которая содержит 0 5 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR с продольно-асимметричной петлей-на-стебле содержит часть стебля С-С и/или В-В' длиной менее чем 3 пары оснований.

[00223] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR не содержит каких-либо делеций нуклеотидов в содержащей RBE части областей А или А', чтобы не мешать репликации ДНК (например, связыванию с RBE белка Rep, или никированию в сайте концевого разрешения). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR, предусмотренный для применения в настоящем документе, содержит одну или более делеций в области В, В', С и/или С согласно описанию в настоящем документе. Несколько неограничивающих примеров модифицированных ITR показаны на фиг. 6В - 21В.

[00224] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию плеча В-В', таким образом, сохраняется плечо С-С', например, см. примеры ITR-33 (левый) и ITR-18 (правый), приведенные на фиг. 7А - 7В, или ITR-35 (левый) и ITR-19 (правый) (фиг. 9А - 9В). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию плеча С-С', таким образом, сохраняется плечо В-В', например, см. примеры ITR-34 (левый) и ITR-51 (правый), приведенные на фиг. 8А - 8В. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию плеча В-В' и плеча С-С, таким образом, чтобы сохранялась единственная петля-на-стебле, например, см. примеры ITR-37 (левый) и ITR-21 (правый), приведенные на фиг. 11А - 11В. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию области С, таким образом, чтобы сохранялись усеченная С-петля и плечо В-В', например, см. примеры ITR-36 (левый) и ITR-20 (правый), приведенные на фиг. 10А - 10В; ITR-42 (левый) и ITR-26 (правый) (фиг. 16А - 16В); ITR-43 (левый) и ITR-27 (правый) (фиг. 17А - 17В); ITR-44 (левый) и ITR-28 (правый) (фиг. 18А - 18В); ITR-45 (левый) и ITR-29 (правый) (фиг. 19А - 19В); ITR-46 (левый) и ITR-23 (правый) (фиг. 20А - 20В); ITR-47 (левый) и ITR-31 (правый) (фиг. 21А - 21В); ITR-48 (левый) и ITR-32 (правый) (фиг. 22А - 22В). Аналогичным образом, согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию области В, таким образом, чтобы сохранялись усеченная В-петля и плечо С-С', например, см. примеры ITR-38 (левый) и ITR-22 (правый), приведенные на фиг. 12А - 12В; ITR-39 (левый) и ITR-23 (правый) (фиг. 13А - 13В); ITR-40 (левый) и ITR-24 (правый) (фиг. 14А - 14В) и ITR-41 (левый) и ITR-25 (правый) (фиг. 15А - 15В).

[00225] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированный ITR может включать делецию пар оснований в любой одной или более из: С-части, С'-части, В-части или В'-части, таким образом, чтобы между частями С-В' и частями С'-В происходило спаривание комплементарных оснований с получением единственного плеча, например, см. ITR-10 (правый) и ITR-10 (левый).

[00226] Согласно некоторым вариантам реализации наряду с модификацией в одном или более нуклеотидов в области С, С', В и/или В', модифицированный ITR для применения в настоящем документе может содержать модификацию (например, делецию, замену или добавление) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 нуклеотидов в любой одной или более областей, выбранных из: области между А' и С, между С и С', между С' и В, между В и В' и между В' и А. Например, нуклеотид А между В' и С в модифицированном правом ITR может быть заменен на G, С или А или делетирован, или может быть добавлен один или более нуклеотидов; нуклеотид Т между С' и В в модифицированном левом ITR может быть заменен на G, С или А или делетирован, или может быть добавлен один или более нуклеотидов.

[00227] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный зкДНК-вектор не содержит модифицированного ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любой из: SEQ ID NO: 550 557. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный зкДНК-вектор не содержит модифицированного ITR, содержащего нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из: SEQ ID NO: 550-557.

[00228] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе и выбранный модифицированный ITR имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из любой последовательности из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 550-557.

[00229] Согласно другому варианту реализации структура структурного элемента может быть модифицирована. Например, в указанном структурном элементе изменена высота стебля и/или число нуклеотидов в петле. Например, высота стебля может составлять приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов или более, или быть равна любому числу нуклеотидов в промежуточном диапазоне. Согласно одному варианту реализации высота стебля может составлять от приблизительно 5 нуклеотидов до приблизительно 9 нуклеотидов и функционально взаимодействует с Rep. Согласно другому варианту реализации высота стебля может составлять приблизительно 7 нуклеотидов и он функционально взаимодействует с Rep. Согласно другому примеру петля может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или 10 нуклеотидов или более, или любое число нуклеотидов в промежуточном диапазоне.

[00230] Согласно другому варианту реализации число сайтов связывания GAGY или связанных с GAGY сайтов связывания в пределах RBE или расширенного RBE может быть увеличено или уменьшено. Согласно одному примеру RBE или расширенный RBE может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более сайтов связывания GAGY, или любое их количество в диапазоне указанных значений. Каждый сайт связывания GAGY может независимым образом представлять собой точную последовательность GAGY или последовательность, аналогичную GAGY, при условии, что эта последовательность является достаточной для связывания белка Rep.

[00231] Согласно другому варианту реализации промежуточная последовательность между двумя элементами (такими как, без ограничений, RBE и шпилька) может быть изменен (например, увеличен или уменьшен), для изменения функционального взаимодействия с большим белком Rep. Например, указанная промежуточная последовательность может содержать приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов или более, или любое количество нуклеотидов в диапазоне указанных значений.

[00232] В таблице 4 приведены примеры симметричных модифицированных пар ITR (т.е. модифицированные левые ITR и симметричные правые модифицированные ITR). Выделенная жирным шрифтом (красного цвета) часть последовательностей соответствует частичным последовательностям ITR (т.е. последовательностям петель А-А', С-С и В-В'), также показанным на фиг. 7А - 22В. Указанные примеры модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) и RBE' (т.е., комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536).

[00233] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе не содержит модифицированных ITR, имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из любой последовательности из группы SEQ ID No: 550, 551. 552, 553, 553, 554, 555, 556 и 557.

IV. Регуляторные элементы

[00234] ЗкДНК-векторы могут быть получены из экспрессионных конструкций, которые дополнительно содержат специфическую комбинацию цис-регуляторных элементов. Указанные цис-регуляторные элементы включают, не ограничиваясь перечисленными, промотор, рибопереключатель, инсулятор, miR-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ITR может действовать как промотор для трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели согласно описанию в настоящем документе, для регулирования экспрессии трансгена, или «аварийный выключатель», который способен убить клетку, содержащую указанный зкДНК-вектор.

[00235] Указанные зкДНК-векторы могут быть получены из экспрессионных конструкций, которые дополнительно содержат конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов, таких как посттранскрипционный регуляторный элемент WHP (WPRE) (например, SEQ ID NO: 8) и поли(А) BGH (SEQ ID NO: 9). Подходящие экспрессионные кассеты для применения в экспрессионных конструкциях не имеют налагаемых вирусным капсидом ограничений упаковки.

[00236] Промоторы: Экспрессионные кассеты согласно настоящему изобретению включают промотор, который может влиять на общие уровни экспрессии, а также на клеточную специфичность. В случае трансгенной экспрессии они могут включать высокоактивный немедленный ранний промотор вирусного происхождения. Экспрессионные кассеты могут содержать тканеспецифические эукариотические промоторы для ограничения трансгенной экспрессии конкретными типами клеток и снижения токсических эффектов и иммунных ответов, обусловленных нерегулируемой эктопической экспрессией.

[00237] Подходящие промоторы, в том числе описанные выше, могут происходить из вирусов и. соответственно, могут называться вирусными промоторами, или они могут происходить из любого организма, в том числе прокариотических или эукариотических организмов. Для управления экспрессией с помощью любой РНК-полимер азы (например, pol I, pol II, pol III) могут применяться подходящие промоторы. Примеры промоторов включают, не ограничиваясь перечисленными, ранний промотор SV40, промотор длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мышей (LTR); основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленного раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), малый ядерный промотор U6 человека (U6, например, SEQ ID NO: 18) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усиленный промотор U6 (например, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31 (17)), промотор H1 человека (H1) (например, SEQ ID NO: 19), промотор CAG. промотор альфа-1-антитрипсина человека (hAAT) (например, SEQ ID NO: 21); и т.п. Согласно вариантам реализации указанные промоторы изменяют на содержащем нитрон 3'-конце так, чтобы они включали один или более сайтов расщепления нуклеазами. Согласно некоторым вариантам реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазой, является чужеродной для ДНК промотора.

[00238] Согласно некоторым вариантам реализации промотор может содержать одну или более специфических регуляторных последовательностей транскрипции для дополнительного усиления экспрессии, и/или для пространственного и/или временного изменения экспрессии. Промотор может также включать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут быть локализованы на расстоянии нескольких тысяч пар оснований от сайта старта транскрипции. Промотор может происходить из источников, включающих вирусы, бактерии, грибы, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально в отношении клетки, ткани или органа, где происходит экспрессия, или в отношении стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние стимулы, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, оператор/промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV IE, а также промоторы, перечисленные ниже. Такие промоторы и/или энхансеры можно применять для экспрессии любого представляющего интерес гена, например, молекул для редактирования генов, донорной последовательности, терапевтических белков и т.п.Например, указанный вектор может содержать промотор, который функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический белок. Указанный промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью терапевтического белка, может представлять собой промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), например, промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), промотор вируса Молони, промотор вируса лейкоза птиц (ALV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Согласно некоторым вариантам реализации промотор также может представлять собой промотор гена человека, такого как убиквитин С человека (hUbC), актин человека, миозин человека, гемоглобин человека, мышечный креатин человека или металлотионеин человека. Промотор также может представлять собой тканеспецифичный промотор, такой как специфический для печени промотор, такой как промотор альфа-1-антитрипсина человека (НААТ), природный или синтетический. Согласно одному варианту реализации доставку в печень можно обеспечить с использованием специфического нацеливания на эндогенный АроЕ композиции, содержащей зкДНК-вектор, которую направляют в гепатоциты за счет рецептора липопротеина низкой плотности (ЛНП), присутствующего на поверхности гепатоцитов.

[00239] Согласно одному варианту реализации используемый промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и были охарактеризованы. Используемая область промотора может дополнительно включать одну или более дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеров (например, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23).

[00240] Неограничивающие примеры подходящих промоторов для применения согласно настоящему изобретению включают промотор CAG, например (SEQ ID NO: 3), промотор hAAT (SEQ ID NO: 21), промотор EF1-α человека (SEQ ID NO: 6) или фрагмент промотора EF1a (SEQ ID NO: 15), промотор IE2 (например, SEQ ID NO: 20) и промотор EF1-α крысы (SEQ ID NO: 24).

[00241] Согласно некоторым вариантам реализации экспрессионная кассета может содержать синтетический регуляторный элемент, такой как промотор CAG (SEQ ID NO: 3). Промотор CAG содержит (i) ранний энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы, и (iii) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика. Как вариант, экспрессионная кассета может содержать промотор hAAT (SEQ ID NO: 21), промотор альфа-1-антитрипсина (ААТ) (SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 74), специфический для печени (LP1) промотор (SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 16), промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1α) человека или его фрагмент (например, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 15), промотор EF1α крысы (SEQ ID NO: 24) или промотор IE2 (SEQ ID NO: 20). Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета включает один или более конститутивных промоторов, например, ретровирусный LTR-промотор вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV) или немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV, например, SEQ ID NO: 22). Как вариант, может применяться индуцируемый промотор, нативный для трансгена промотор, тканеспецифический промотор или различные промоторы, известные в данной области техники.

[00242] Последовательности полиаденилирования: Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в зкДНК-вектор для стабилизации мРНК, экспрессируемой с зкДНК-вектора, и содействия ядерному экспорту и трансляции. Согласно одному варианту реализации указанная зкДНК-вектор не содержит последовательности полиаденилирования. Согласно другим вариантам реализации указанный вектор включает по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность полиаденилирования содержит приблизительно 43 нуклеотидов, приблизительно 40-50 нуклеотидов, приблизительно 40-55 нуклеотидов, приблизительно 45-50 нуклеотидов, приблизительно 35-50 нуклеотидов или любое число нуклеотидов в любом промежуточном диапазоне.

[00243] Экспрессионные кассеты могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области техники, или ее вариант, например, встречающуюся в природе последовательность, выделенную из BGHpA крупного рогатого скота (например, SEQ ID NO: 74) или вируса SV40pA (например, SEQ ID NO: 10), или синтетическую последовательность (например, SEQ ID NO: 27). Некоторые экспрессионные кассеты также включают последовательность 5'-энхансера позднего поли(А)-сигнала (USE) SV40. Согласно некоторым вариантам реализации указанные USE могут применяться в комбинации с SV40pA или гетерологичным поли(А)-сигналом.

[00244] Указанные экспрессионные кассеты могут также включать посттранскрипционный элемент для повышения экспрессии трансгена. Согласно некоторым вариантам реализации для повышения экспрессии трансгена используют посттранскрипционный регуляторный элемент (WPRE) вируса гепатита сурков (WHP) (например, SEQ ID NO: 8). Могут применяться другие элементы посттранскрипционного процессинга, такие как посттранскрипционный элемент гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). С трансгенами могут быть связаны секреторные последовательности, например, последовательности VH-02 и VK-A26, например, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.

[00245] Согласно одному варианту реализации клетки-хозяева не экспрессируют белки вирусного капсида, и полинуклеотидная векторная матрица не содержит каких-либо последовательностей, кодирующих вирусный капсид. Согласно одному варианту реализации полинуклеотидная векторная матрица не содержит ни генов капсида AAV, ни генов капсида других вирусов. Согласно одному варианту реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты также не содержит последовательностей, кодирующих белок Rep AAV. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению не содержит функциональных генов cap AAV или rep AAV.

V. Регуляторные переключатели

[00246] Молекулярный регуляторный переключатель это переключатель, который генерирует измеряемое изменение состояния в ответ на сигнал. Такие регуляторные переключатели могут быть благоприятным образом скомбинированы с зкДНК-векторами, описанными в настоящем документе, для контроля выхода зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор содержит регулятор, который служит для точной настройки экспрессии трансгена. Например, он может служить для обеспечения функции биологического сдерживания зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный переключатель представляет собой «двухпозиционный» переключатель, который сконструирован таким образом, чтобы запускать или останавливать (т.е. прекращать) экспрессию представляющего интерес гена в зкДНК контролируемым и регулируемым образом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный переключатель может включать «аварийный выключатель», который может давать клетке, содержащей указанный зкДНК-вектор, команду для запуска механизма запрограммированной клеточной смерти после активации переключателя.

A. Бинарные регуляторные переключатели

[00247] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор содержит регулятор, который может служить для контролируемой модуляции экспрессии трансгена. Согласно такому варианту реализации указанная экспрессионная кассета, локализованная между ITR зкДНК-вектора, может дополнительно содержать регуляторную область, например, промотор, цис-элемент, репрессор, энхансер и т.п., функционально связанную с представляющим интерес геном, причем указанную регуляторную область регулирует один или более кофакторов или экзогенных агентов. Соответственно, согласно одному варианту реализации транскрипция и экспрессия представляющего интерес гена с зкДНК-вектора будет происходить только тогда, когда в клетке присутствуют указанные один или более кофакторов или экзогенных агентов. Согласно другому варианту реализации один или более кофакторов или экзогенных агентов могут применяться для дерепрессии транскрипции и экспрессии представляющего интерес гена.

[00248] Любые нуклеиновокислотные регуляторные области, известные специалисту в данной области техники, могут применяться в зкДНК-векторе, разработанном так, чтобы содержать регуляторный переключатель. В неограничивающем примере регуляторные области могут модулировать низкомолекулярные переключатели или индуцируемые или репрессируемые промоторы. Неограничивающие примеры индуцируемых промоторов представлены индуцируемыми гормонами или индуцируемыми металлами промоторами. Другие примеры индуцируемых промоторных/энхансерных элементов включают, не ограничиваясь перечисленными, индуцируемый RU486 промотор, индуцируемый экдизоном промотор, индуцируемый рапамицином промотор и промотор металлотионеина. Предусмотрено применение классических переключателей на основе тетрациклина или других антибиотиков, в том числе описанных в источнике: (Fussenegger et al., Nature Biotechnol. 18: 1203-1208 (2000)).

B. Низкомолекулярные регуляторные переключатели

[00249] Различные известные из уровня техники регуляторные переключатели на основе малых молекул известны в данной области техники и могут быть скомбинированы с зкДНК-векторами согласно описанию в настоящем документе с образованием контролируемого регуляторным переключателем зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель может быть выбранного из чего-либо одного или из комбинации следующего: ортогональная пара лиганд/ядерный рецептор, например, вариант ретиноидного рецептора / LG335 и GRQCIMFI, наряду с искусственным промотором, контролирующим экспрессию функционально связанного трансгена, например, согласно описанию в источнике: Taylor, et al. ВМС Biotechnology 10 (2010): 15; сконструированные стероидные рецепторы, например, модифицированный рецептор прогестерона с усечением на С-конце, который не способен связывать прогестерон, но связывает RU486 (мифепристон) (Патент США №5364791); рецептор экдизона из Drosophila и их экдистероидные лиганды (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517; или переключатель, управляемый антибиотиком триметопримом (ТМР), согласно описанию в источнике: Sando R 3^rd; Nat Methods. 2013, 10(11): 1085-8.

[00250] Другие регуляторные переключатели на основе малых молекул, известные специалисту в данной области техники, также предусмотрены для применения для контроля трансгенной экспрессии зкДНК и включают, не ограничиваясь перечисленными, описанные в источнике: Buskirkef al., Cell; Chem and Biol., 2005; 12(2); 151-161; чувствительный к абсцизовой кислоте положительный переключатель; такой как описанный в источнике: Liang, F.-S., et al., (2011) Science Signaling, 4(164); чувствительные к экзогенному L-аргинину положительные переключатели, такие как описанные в источнике: Hartenbach, et al. Nucleic Acids Research, 35(20), 2007, синтетические чувствительные к желчным кислотам положительные переключатели, такие как описанные в источнике: Rossger et al., Metab Eng. 2014, 21: 81-90; чувствительные к биотину положительные переключатели, такие как описанные в источнике: Weber et al., Metab. Eng. 2009 Mar; 11(2): 117-124; регуляторные переключатели с двойным входным сигналом, чувствительные к пищевым добавкам бензоату/ванилину, такие как описанные в источнике: Xie et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42(14); e116; чувствительные к 4-гидрокситамоксифену переключатели, такие как описанные в источнике: Giuseppe et al., Molecular Therapy, 6(5), 653 - 663; и чувствительные к флавоноиду (флоретину) регуляторные переключатели, такие как описанные в источнике: Gitzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009 Jun 30; 106(26): 10638-10643.

[00251] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля трансгена или экспрессируемый зкДНК-вектором представляет собой переключатель для активации пролекарств, такой как описанные в патентах США 8771679 и 6339070.

[00252] Примеры регуляторных переключателей для применения в зкДНК-векторах включают, не ограничиваясь перечисленными, представленные в таблице 5.

С. Регуляторные переключатели «с кодом доступа»

[00253] Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель может представлять собой «переключатель с кодом доступа» или «цепь с кодом доступа». Переключатели с кодом доступа позволяют точно настроить контроль экспрессии трансгена с зкДНК-вектора при возникновении конкретных условий то есть для осуществления трансгенной экспрессии и/или репрессии должна выполняться комбинация условий. Например, для осуществления экспрессии трансгена должны возникнуть по меньшей мере условия А и В. Регуляторный переключатель с кодом доступа может требовать выполнения любого количества условий, например, для осуществления трансгенной экспрессии должны возникнуть по меньшей мере 2 условия, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 или более условий. Согласно некоторым вариантам реализации должны возникнуть по меньшей мере 2 условия (например, условия А В); согласно некоторым вариантам реализации должны возникнуть по меньшей мере 3 условия (например, А В и С, или А В и D). Согласно неограничивающему примеру для осуществления генной экспрессии с зкДНК, содержащей регуляторный переключатель с кодом доступа «АВС», должны выполняться условия А, В и С. Условия А, В и С могут быть следующими; условие А представлено наличием состояния или заболевания, условие В представляет собой гормональный ответ, а условие С представляет собой ответ на трансгенную экспрессию. В неограничивающем типовом примере, когда трансген представлен инсулином, условие А выполняется в том случае, если субъект страдает диабетом, условие В - высокий уровень сахара в крови, а условие С - уровень эндогенного инсулина при его недостаточной экспрессии. Как только уровень сахара снижается или достигается требуемый уровень инсулина, трансген (например, инсулин) «отключается» до тех пор, пока снова не возникнут указанные 3 условия, «включающие» его повторно. В другом типовом примере, в том случае, если трансген представлен ЕРО, условием А является наличие хронической болезни почек (ХПН), условие В выполняется при гипоксических состояниях в почках субъекта, условие С выполняется при нарушении рекрутинга эритропоэтин-продуцирующих клеток (ЕРС) в почках; или, как вариант, нарушении активации HIF-2. Как только повышается уровень кислорода или достигается требуемый уровень ЕРО, трансген (например, ЕРО) «отключается» до тех пор, пока снова не возникнут указанные 3 условия, «включающие» его повторно.

[00254] Регуляторные переключатели с кодом доступа подходят для точной настройки экспрессии трансгена с зкДНК-вектора. Например, регуляторный переключатель с кодом доступа может быть модульным, то есть он содержит несколько переключателей, например, тканеспецифический индуцируемый промотор, который включается только в присутствии определенного уровня метаболита. Согласно такому варианту реализации для осуществления трансгенной экспрессии с зкДНК-вектора индуцируемый агент должен присутствовать (условие А) в клетках требуемого типа (условие В), а уровень метаболита должен быть равен, быть выше или быть ниже определенного порогового значения (условие С). Согласно альтернативным вариантам реализации указанный регуляторный переключатель с кодом доступа может быть разработан таким образом, чтобы трансгенная экспрессия «включалась» при выполнении условий А и В, но «выключалась» при выполнении условия С. Такой вариант реализации полезен, когда выполнение условия С является прямым результатом экспрессии трансгена то есть условие С используется в качестве положительной обратной связи для отключения трансгенной экспрессии с зкДНК-вектора, после того как указанный трансген оказал достаточный требуемый терапевтический эффект.

[00255] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель с кодом доступа, предусмотренный для применения в зкДНК-векторе, раскрыт в WO 2017/059245, где описан переключатель, называемый «переключателем с кодом доступа» («Passcode switch») или «цепью с кодом доступа» («Passcode circuit») или «аварийным выключателем с кодом доступа» («Passcode kill switch»), который представляет собой синтетическую биологическую цепь, задействующую гибридные транскрипционные факторы (ТФ) для конструирования комплексных требований к условиям среды для выживания клеток. Регуляторные переключатели с кодом доступа описанные в WO 2017/059245, в частности, подходят для применения в зкДНК-векторах, поскольку являются модульными и настраиваемыми, как в отношении условий окружающей среды, контролирующих активацию цепи, так и в отношении выходных модулей, контролирующих судьбу клеток. Кроме того, в частности, «цепь с кодом доступа» подходит для применения в зкДНК-векторах, так как без надлежащих молекул «кода доступа» он позволяет трансгенной экспрессии происходить только при выполнении необходимых заранее заданных условий. В том случае, если с клеткой произойдет что-либо непредусмотренное или по какой-то причине больше не будет нужна трансгенная экспрессия, может быть запущен соответствующий «аварийный выключатель» (т.е. переключатель-блокиратор).

[00256] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель с кодом доступа или «цепь с кодом доступа», предусмотренный для применения в зкДНК-векторе, содержит гибридные транскрипционные факторы (ТФ) для расширения диапазона и сложности сигналов среды, используемых для задания условий биологического сдерживания. В отличие от переключателя-блокиратора, который запускает клеточную смерть при выполнении заранее заданного условия, «цепь с кодом доступа» обеспечивает выживание клеток или трансгенную экспрессию в присутствии конкретного «кода доступа» и может быть легко перепрограммирована, чтобы обеспечивать трансгенную экспрессию и/или выживание клеток только при выполнении заранее заданного условия среды или присутствии кода доступа.

[00257] Согласно одному аспекту система «с кодом доступа», которая ограничивает рост клеток присутствием заранее заданного набора из по меньшей мере двух выбранных агентов, включает одну или более нуклеиновокислотных конструкций, кодирующих модули экспрессии, включающие: i) модуль экспрессии токсина, который кодирует токсин, токсичный для клетки-хозяина, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая токсин, функционально связана с промотором Р1, репрессия которого происходит при связывании первого гибридного репрессорного белка hRP1; ii) модуль экспрессии первого гибридного репрессорного белка, который кодирует первый гибридный репрессорный белок hRP1, отличающийся тем, что экспрессию hRP1 контролирует логический И-элемент, образуемый двумя гибридными транскрипционными факторами hTF1 и hTF2, связывание или активность которых зависят от агентов А1 и А2, соответственно, таким образом, что для экспрессии hRP1 необходимы оба агента А1 и А2, при этом в отсутствие А1 или А2 экспрессия hRP1 недостаточна для репрессии модуля промотора токсина Р1 и продуцирования токсина, так что клетка-хозяин погибает. В указанной системе все гибридные факторы, hTF1, hTF2 и hRP1, содержат чувствительный к среде модуль из одного транскрипционного фактора и модуль распознавания ДНК из другого транскрипционного фактора, что делает связывание соответствующего регуляторного переключателя с кодом доступа чувствительным к присутствию агента среды, А1 или А2, который отличается от агента, с которым соответствующие субъединицы обычно связываются в природе.

[00258] Соответственно, зкДНК-вектор может содержать «регуляторную цепь с кодом доступа», которая требует присутствия и/или отсутствия конкретных молекул для активации выходного модуля. Согласно некоторым вариантам реализации в тех случаях, когда гены, кодирующие клеточные токсины, помещают в выходной модуль, указанная регуляторная цепь с кодом доступа может быть использована не только для регуляции трансгенной экспрессии, но и для создания механизма «аварийного выключателя», в котором цепь убивает клетку в том случае, если указанная клетка ведет себя нежелательным образом (например, покидает конкретную среду, определяемую сенсорными доменами, или дифференцирует в клетку другого типа). В одном неограничивающем примере модульная структура гибридных транскрипционных факторов, архитектура цепи и выходной модуль позволяют переконфигурировать цепь для восприятия других сигналов среды, реакции на сигналы среды иным образом и контроля других функций в клетке, наряду с индуцируемой клеточной смертью, как известно в данной области техники.

[00259] Для регуляторного переключателя с кодом доступа согласно описанию в настоящем документе могут применяться любые комбинации регуляторных переключателей согласно описанию в настоящем документе, например, низкомолекулярные переключатели, переключатели на основе нуклеиновых кислот, гибридные переключатели на основе малых молекул и нуклеиновых кислот, переключатели для посттранскрипционной регуляции трансгенов, посттрансляционные регуляторы, контролируемые излучением переключатели, опосредованные гипоксией переключатели и другие регуляторные переключатели, известные специалистам в данной области техники. Регуляторные переключатели, предусмотренные для применения, также описаны в обзорной статье Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015) и обобщены в таблице 1 из статьи Kis. Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для применения в системе с кодом доступа может быть выбран из любых переключателей в таблице 5 или их комбинации.

D. Регуляторные переключатели на основе нуклеиновых кислот для контроля трансгенной экспрессии.

[00260] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля трансгена, экспрессируемого зкДНК, основан на механизме контроля на основе нуклеиновых кислот. Примеры механизмов контроля на основе нуклеиновых кислот известны в данной области техники и предусмотрены для применения. Например, такие механизмы включают рибопереключатели, такие как описанные, например, в US 2009/0305253, US 2008/0269258. US 2017/0204477, WO 2018026762 A1, патенте США US 9222093 и заявке ЕР 288071, а также раскрыты в обзорной работе Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May; 6(3). Также включены транскрипционные биосенсоры, отвечающие на метаболиты, такие как описанные в источнике: WO 2018/075486 и WO 2017/ 147585. Другие известные в данной области техники механизмы, предусмотренные для применения, включают сайленсинг трансгена с помощью молекулы миРНК или РНКи (например, miR мшРНК). Например, зкДНК-вектор может содержать регуляторный переключатель, который кодирует молекулу РНКи, комплементарную трансгену, экспрессируемому зкДНК-вектором. При экспрессии такой РНКи даже в том случае, когда зкДНК-вектор экспрессирует трансген, будет происходить его сайленсинг под действием комплементарной молекулы РНКи, а если РНКи не экспрессируется при экспрессии трансгена зкДНК-вектором, сайленсинг трансгена под действием РНКи не происходит. Такой пример молекулы РНКи, контролирующей генную экспрессию, или используемой в качестве регуляторного переключателя, описан в US 2017/0183664. Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель содержит репрессор, который блокирует экспрессию трансгена с зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации указанный положительный/отрицательный переключатель представляет собой переключатель на основе малой активирующей транскрипцию РНК («Small transcription activating RNA», STAR), например, такую как описанная в источниках: Chappell J. etal., Nat Chem Biol. 2015 Mar; 11(3):214-20; и Chappell et al., Microbiol Spectr. 2018 May; 6(3. Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой переключатель типа «toehold», такой как описанный в источниках: US2009/0191546, US2016/0076083, WO 2017/087530, US2017/0204477, WO 2017/075486 и Green et al, Cell, 2014; 159(4); 925-939.

[00261] Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой тканеспецифический самоинактивирующийся регуляторный переключатель, например, согласно описанию в US 2002/0022018, отличающийся тем, что он преднамеренно отключает трансгенную экспрессию в сайте, где в противном случае трансгенная экспрессия могла бы быть неблагоприятной. Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель представляет собой обратимую с помощью рекомбиназы систему генной экспрессии, например, согласно описанию в US 2014/0127162 и патенте США 8324436.

[00262] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой гибрид механизма контроля на основе нуклеиновых кислот и низкомолекулярной регуляторной системы. Такие системы хорошо известны специалистам в данной области техники и предусмотрены для применения в настоящем документе. Примеры таких регуляторных переключателей включают, не ограничиваясь перечисленными, систему LTRi или систему «Lac-Tet-RNAi», например, согласно описанию в источниках: US 2010/0175141, Deans Т. et al., Cell., 2007, 130(2); 363-372, WO 2008/051854 и патент США 9388425.

[00263] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, включает циклическую перестановку согласно описанию в патенте США 8338138. Согласно такому варианту реализации указанный молекулярный переключатель является мультистабильным, т.е. способен переключаться между по меньшей мере двумя состояниями, или, как вариант, бистабильным, т.е. находится либо в "выключенном", либо во "включенном" состоянии, например, способен или неспособен испускать свет, способен или неспособен связываться или нет, способен или неспособен катализировать, способен или неспособен переносить электроны, и так далее. Согласно другому аспекту в молекулярном переключателе используют слитую молекулу, за счет чего указанный переключатель способен переключаться между более чем двумя состояниями. Например, в ответ на конкретное пороговое состояние, демонстрируемое инсерционной последовательностью или акцепторной последовательностью, соответствующая другая последовательность слитой молекулы может демонстрировать диапазон состояний (например, диапазон связывающей активности, диапазон ферментного катализа и т.п.). Соответственно, вместо переключения между «включенным» и «выключенным» состоянием слитая молекула может демонстрировать дифференцированный ответ на стимул.

[00264] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель на основе нуклеиновой кислоты может быть выбран из любого переключателя или комбинации переключателей из таблицы 5.

Е. Посттранскрипционный и посттрансляционные регуляторные переключатели.

[00265] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой систему посттранскрипционной модификации. Например, такой регуляторный переключатель может представлять собой аптазимный рибопереключатель, чувствительный к тетрациклину или теофиллину, согласно описанию в US 2018/0119156, GB 201107768, WO 2001/064956A3, патенте ЕР 2707487 и Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2; 5. pii: e18858. Согласно некоторым вариантам реализации предполагается, что специалист в данной области техники может закодировать как трансген, так и ингибиторную киРНК, которая содержит чувствительный к лиганду аптамер (отрицательный переключатель), в результате чего будет сформирован положительный переключатель, чувствительный к лиганду.

[00266] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой систему посттрансляционной модификации. Согласно альтернативным вариантам реализации представляющий интерес ген или белок экспрессируется в виде пропротеина или пре-пропротеина, или содержит сигнальный элемент ответа (SRE) или дестабилизирующий домен (DD), присоединенный к экспрессируемому белку, что предотвращает корректную укладку и/или активность белка до тех пор, пока не произойдет посттрансляционная модификация. В случае дестабилизирующего домена (DD) или SRE указанный дестабилизирующий домен посттрансляционно расщепляется в присутствии экзогенного агента или малой молекулы. Специалист в данной области техники сможет использовать такие способы контроля согласно описанию в патенте США 8173792 и заявке РСТ WO 2017180587. Другие переключатели посттранскрипционного контроля, предусмотренные для применения в зкДНК-векторе для контроля активности функционального трансгена, раскрыты в источниках: Rakhit et al., Chem Biol. 2014; 21 (9): 1238-52 и Navarro et al., ACS Chem Biol. 2016; 19; 11 (8): 2101-2104A.

[00267] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель для контроля представляющего интерес трансгена или гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой систему посттрансляционной модификации, которая встраивает чувствительные к лиганду интеины в кодирующую последовательность трансгена таким образом, чтобы указанный трансген или экспрессируемый белок оставался ингибированным до сплайсинга. Например, это было продемонстрировано с применением 4-гидрокситамоксифена и тиреоидного гормона (см., например, патенты США 7541450, 9200045; 7192739, Buskirk, et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jul 20; 101(29): 10505-10510; ACS Synth Biol. 2016 Dec 16; 5(12): 1475-1484; и 2005 Feb; 14(2): 523 532. Согласно некоторым вариантам реализации посттранскрипционный регуляторный переключатель может быть выбран из любого переключателя или их комбинации из таблицы 5.

F. Другие примеры регуляторных переключателей

[00268] Любой известный регуляторный переключатель может быть использован в зкДНК-векторе для контроля генной экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, включая переключатели, запускаемые изменениями окружающей среды. Дополнительные примеры включают, не ограничиваясь перечисленными: метод ВОС Сузуки и соавторов (Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); расширение генетического кода и нефизиологическая аминокислота; управляемые излучением или ультразвуком положительные/отрицательные переключатели (см., например, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7(13): 1121-5; патенты США 5612318; 5571797; 5770581; 5817636; и WO 1999/025385 Al. Согласно некоторым вариантам реализации указанный регуляторный переключатель контролирует имплантируемая система, например, согласно патенту США 7840263; US 2007/0190028 A1, где генную экспрессию контролирует одна или более форм энергии, в том числе электромагнитная энергия, которая активирует промоторы, функционально связанные с трансгеном в зкДНК-векторе.

[00269] Согласно некоторым вариантам реализации а регуляторный переключатель, предусмотренный для применения в зкДНК-векторе, представляет собой опосредуемый гипоксией или активируемый стрессом переключатель, например, такой как описанные в источниках: WO 1999060142 А2, патенты США 5834306; 6218179; 6709858; US 2015/0322410; Greco et al, (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S3 68, а также элементы FROG, TOAD и NRSE и индуцируемые условиями элементы сайленсинга, в том числе элементы ответа на гипоксию (HRE), элементы ответа на воспаление (IRE) и активируемые сдвиговым напряжением элементы (SSAE), например, согласно описанию в патенте США 9394526. Такой вариант реализации подходит для "включения" экспрессии трансгена с зкДНК-вектора после ишемии или в ишемических тканях и/или в опухолях.

[00270] Согласно некоторым вариантам реализации регуляторный переключатель, предусмотренный для применения в зкДНК-векторе, представляет собой оптогенетический (например, контролируемый светом) регуляторный переключатель, например, такой как один из переключателей, которые рассмотрены в источнике: Poleskaya et al., ВМС Neurosci. 2018; 19 (Suppl 1): 12, и также предусмотрены для применения согласно настоящему изобретению. Согласно таким вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать генетические элементы, которые являются светочувствительными и могут регулировать трансгенную экспрессию в ответ на свет в видимом диапазоне длин волн (например, синий свет, ближняя ИК-область спектра). зкДНК векторы, содержащие оптогенетические регуляторные переключатели, подходят для экспрессии трансгена в местоположениях в организме, доступных для таких источников света, например, в коже, глазах, мышцах и т.п., и могут также быть использованы при экспрессии зкДНК-векторов во внутренних органах и тканях, куда световой сигнал может быть доставлен подходящим способом (например, с помощью имплантируемого устройства согласно описанию в настоящем документе). Такие оптогенетические регуляторные переключатели включают применение светочувствительных элементов или индуцируемых светом транскрипционных эффекторов (LITE) (например, согласно описанию в 2014/0287938), системы Light-On (например, согласно описанию в источнике: Wang et al., Nat Methods. 2012 Feb 12; 9(3):266-9; которая, как сообщалось, позволяет in vivo контролировать экспрессию трансгена инсулина, системы Сrу2/CIB1 (например, согласно описанию в источнике: Kennedy et al., Nature Methods; 7, 973-975 (2010); и системы FKF1/GIGANTEA (например, согласно описанию в источнике: Yazawa et al., Nat Biotechnol. 2009 Oct; 27(10):941-5).

G. «Аварийные выключатели»

[00271] Другие варианты реализации настоящего изобретения относятся к зкДНК-вектору, содержащему «аварийный выключатель». «Аварийный выключатель» согласно описанию в настоящем документе позволяет убить клетку, содержащую указанный зкДНК-вектор, или обеспечить ее программируемую клеточную смерть в качестве способа окончательного удаления введенного зкДНК-вектора из системы субъекта. Специалисту в данной области техники будет понятно, что применение «аварийных выключателей» в зкДНК-векторах согласно настоящему изобретению, как правило, сопряжено с нацеливанием зкДНК-вектора на ограниченное число клеток, потеря которого является приемлемой для субъекта, или на тип клеток, апоптоз которых желателен (например, на раковые клетки). Во всех аспектах «аварийный выключатель» согласно описанию в настоящем документе разработан таким образом, чтобы обеспечить быстрый и надежный киллинг клетки, содержащей зкДНК-вектор, в отсутствие входящего сигнала выживания или другого заданного условия. Другими словами, «аварийный выключатель», кодируемый зкДНК-вектором согласно настоящему документу, может ограничивать выживание клетки, содержащей зкДНК-вектор, средой, задаваемой специфическими входными сигналами. Такие «аварийные выключатели» служат для обеспечения функции биологического сдерживания, если требуется либо удалить зкДНК-вектор из субъекта, либо обеспечить отсутствие экспрессии с него кодируемого трансгена. Соответственно, «аварийные выключатели» представляют собой синтетические биологические цепи в зкДНК-векторе, сопрягающие сигналы внешней среды с обусловленным выживанием клетки, содержащей указанный зкДНК-вектор. Согласно некоторым вариантам реализации разные зкДНК-векторы может быть разработаны так, что они имеют разные «аварийные выключатели». Это обеспечивает возможность контролировать, киллинг каких клеток, экспрессирующих трансген, происходит при использовании коктейлей зкДНК-векторов.

[00272] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать «аварийный выключатель», который представляет собой модульную цепь биологического сдерживания. Согласно некоторым вариантам реализации «аварийный выключатель», предусмотренный для применения в зкДНК-векторе, описан в WO 2017/059245, где описан переключатель, называемый «аварийным блокиратором», который содержит по меньшей мере две репрессируемые последовательности, расположенные взаимно ингибирующим образом, так что сигнал окружающей среды репрессирует активность второй молекулы в конструкции (например, связывающий малые молекулы транскрипционный фактор используют, чтобы обеспечить состояние «выживания» за счет репрессии продуцирования токсина). В клетках, содержащих зкДНК-вектор, содержащий «аварийный блокиратор», после потери сигнала окружающей среды цепь окончательно переключается в состояние «блокировки», при котором происходит дерепрессия токсина, приводящая к продуцированию токсина, что убивает клетку. Согласно другому варианту реализации предложена синтетическая биологическая цепь, называемая «цепью с кодом доступа»» или «аварийным выключателем с кодом доступа», где использованы гибридные транскрипционные факторы (ТФ) для конструирования комплексных требований к условиям среды для выживания клеток. «Аварийные блокираторы» и «аварийные выключатели с кодом доступа», описанные в WO 2017/059245, в частности, подходят для применения в зкДНК-векторах, поскольку они являются модульными и настраиваемыми, как в отношении условий окружающей среды, контролирующих активацию цепи, так и в отношении выходных модулей, контролирующих судьбу клеток. При правильном подборе токсинов, которые включают, не ограничиваясь указанным, эндонуклеазу, например, EcoRI, «цепи с кодами доступа», присутствующие в зкДНК-векторе, можно применять не только для уничтожения клетки-хозяина, содержащей вектор кДНК, но также для разрушения ее генома и сопутствующих плазмид.

[00273] Другие «аварийные выключатели», известные специалисту в данной области техники, предусмотрены для применения в зкДНК-векторе согласно описанию в настоящем документе, например, согласно описанию в US 2010/0175141; US 2013/0009799; US 2011/0172826; US2013/0109568, а также «аварийные выключатели», описанные в источниках: Jusiak et al, Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine; 2014; 1-56; Kobayashi et al, PNAS, 2004; 101; 8419-9; Marchisio et al, Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319; и Reinshagen et al, Science Translational Medicine, 2018, 11.

[00274] Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может содержать нуклеиновокислотную конструкцию «аварийного выключателя», которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую эффекторный токсин или репортерный белок, причем экспрессию эффекторного токсина (например, белка смерти) или репортерного белка контролирует заранее заданное условие. Например, заранее заданным условием может быть присутствие агента окружающей среды, такого как, например, экзогенный агент, без которого клетка по умолчанию будет экспрессировать эффекторный токсин (например, белок смерти) и погибнет. Согласно альтернативным вариантам реализации заранее заданным условием является присутствие двух или более агентов окружающей среды, например, клетка выживет только при поступлении двух или более необходимых экзогенных агентов, и без какого-либо из них клетка, содержащая зкДНК-вектор, погибнет.

[00275] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор модифицируют так, чтобы он содержал «аварийный выключатель» для уничтожения клеток, содержащих указанный зкДНК-вектор, для эффективного прекращения in vivo экспрессии трансгена, экспрессируемого указанным зкДНК-вектором (например, терапевтического гена, белка или пептида, и т.е.). В частности, также зкДНК-вектор генетически сконструирован для экспрессии белка-переключателя, который не функционирует в клетках млекопитающих в нормальных физиологических условиях. Клетки, экспрессирующие белок-переключатель, будут уничтожены только после введения лекарственного средства или воздействия условия внешней среды, специфически нацеленных на указанный белок-переключатель, и, соответственно, тогда будет прекращена экспрессия терапевтического белка или пептида. Например, сообщалось, что клетки, экспрессирующие HSV-тимидинкиназу, могут погибать при введении таких лекарственных средств, как ганцикловир и цитозиндезаминаза. См., например, Dey and Evans, Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), в источнике: Targets in Gene Therapy, под редакцией You (2011); и Beltinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999). Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может содержать «аварийный выключатель» киРНК, называемый DISE (смерть, вызываемая элиминацией гена выживания, «Death Induced by Survival gene Elimination») (Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658. Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo).

[00276] Согласно некоторым аспектам «аварийный блокиратор» представляет собой биологическую цепь или систему, придающую клеточному ответу чувствительность к заранее определенному условию, такому как отсутствие агента в среде, где растут клетки, например, экзогенного агента. Такая цепь или система может содержать нуклеиновую кислоту, содержащую экспрессионные модули, которые образуют аварийную регуляторную цепь, чувствительную к заранее заданному условию, при этом указанная конструкция содержит:

i) модуль экспрессии первого репрессорного белка, отличающегося тем, что указанный первый репрессорный белок связывает нуклеиновую кислоту связывающего элемента первого репрессорного белка, и репрессирует транскрипцию с кодирующей последовательности, содержащей указанный связывающий элемент первого репрессорного белка, при этом репрессорная активность первого репрессорного белка чувствительна к ингибированию первым экзогенным агентом, присутствие или отсутствие которого определяет заранее заданное условие;

ii) модуль экспрессии второго репрессорного белка, отличающегося тем, что второй репрессорный белок связывает нуклеиновую кислоту связывающего элемента второго репрессорного белка и репрессирует транскрипцию с кодирующей последовательности, содержащей указанный связывающий элемент второго репрессорного белка, при этом второй репрессорный белок отличается от первого репрессорного белка; и

iii) модуль экспрессии эффектора, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эффекторный белок, функционально связанный с генетическим элементом, содержащим связывающий элемент второго репрессорного белка, так что экспрессия второго репрессорного белка вызывает репрессию экспрессии эффектора с модуля экспрессии эффектора, при этом второй модуль экспрессии содержит элемент, связывающий нуклеиновую кислоту первого репрессорного белка, который обеспечивает репрессию транскрипции второго репрессорного белка, если указанный элемент связан первым репрессорным белком; соответствующие модули образуют регуляторную цепь таким образом, что в отсутствие первого экзогенного агента, первый репрессорный белок продуцируется с модуля экспрессии первого репрессорного белка и репрессирует транскрипцию с модуля экспрессии второго репрессорного белка, так что подавление экспрессии эффектора вторым репрессорным белком устраняется, что обеспечивает экспрессию эффекторного белка, но в присутствии первого экзогенного агента активность первого репрессорного белка ингибирована, что разрешает экспрессию второго репрессорного белка, который поддерживает экспрессию эффекторного белка в «выключенном» состоянии, таким образом, первый экзогенный агент в цепи необходим для поддержания экспрессии эффекторного белка в «выключенном» состоянии, и удаление или отсутствие первого экзогенного агента приводит к экспрессии эффекторного белка по умолчанию.

[00277] Согласно некоторым вариантам реализации указанный эффектор представляет собой токсин или белок, который индуцирует программу клеточной смерти. Может быть использован любой белок, токсичный для клетки-хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации указанный токсин убивает только те клетки, в которых происходит его экспрессия. Согласно другим вариантам реализации указанный токсин убивает и другие клетки того же организма-хозяина. Для использования в «аварийном блокираторе» подходят любые из множества продуктов, которые приводят к клеточной смерти. В частности, целесообразно использование агентов, которые ингибируют репликацию ДНК, трансляцию белка или другие процессы или, например, разрушают нуклеиновую кислоту клетки-хозяина. Для идентификации эффективного механизма уничтожения клеток-хозяев при активации цепи, было протестировано несколько генов токсинов, которые непосредственно повреждают ДНК или РНК клетки-хозяина. Тестировали эндонуклеазу ecoRI²¹, ингибитор ДНК-гиразы ccdB²² и токсин рибонуклеазного типа mazF²³, поскольку они подробно описаны, являются нативными для Е. coli и обеспечивают диапазон механизмов уничтожения. Чтобы повысить надежность цепи и обеспечить независимый способ обуславливаемой цепью смерти клеток, указанная система может быть дополнительно адаптирована для экспрессии, например, нацеленной протеазы или нуклеазы, которая дополнительно взаимодействует с репрессором, который поддерживает ген смерти в "выключенном" состоянии. При утрате или отмене сигнала выживания репрессия гена смерти устраняется еще эффективнее за счет, например, активного разложения репрессорного белка или его транскрипта. В неограничивающем примере использовали протеазу mƒ -Lon не только для разложения LacI, но и для нацеливания на важные белки для их разложения. Метка разложения mƒ-Lon pdt#1 может быть присоединена к 3'-концу пяти важных генов, белковые продукты которых, в частности, чувствительны к разложению mƒ-Lon²⁰; жизнеспособность клеток измеряли после удаления АТс. Среди протестированных важных целевых генов ген биосинтеза пептидогликана murC обеспечивал наиболее выраженный и быстрый фенотип клеточной смерти (доля выживших клеток < 1 × 10^-4 не более чем через 6 часов).

[00278] В настоящем документе термин «заранее заданный входной сигнал» относится к агенту или состоянию, которое известным образом влияет на активность полипептида транскрипционного фактора. Обычно такие агенты способны связывать полипептид транскрипционного фактора и/или изменять его конформацию, тем самым модифицируя активность указанного полипептида транскрипционного фактора. Примеры заранее заданных входных сигналов включают, не ограничиваясь перечисленными, входные агенты среды, не требуемые для выживания определенного организма-хозяина (т.е. в отсутствие синтетической биологической цепи согласно описанию в настоящем документе). Условия, которые могут обеспечивать заранее заданный входной сигнал, включают, например, температуру, например, если активность одного или более факторов чувствительна к температуре, присутствие или отсутствие света, в том числе света с длинами волн определенного спектра, и концентрацию газа, соли, металла или минерала. Входные агенты среды включают, например, малую молекулу, биологические агенты, такие как феромоны, гормоны, факторы роста, метаболиты, питательные вещества и т.п., и их аналоги; концентрации химических веществ, побочные продукты среды, ионы металлов и другие такие молекулы или агенты; уровни света; температуру; механическое напряжение или давление; или электрические сигналы, такие как токи и напряжения.

[00279] Согласно некоторым вариантам реализации используют репортеры для количественной оценки силы или активности сигнала, принимаемого модулями или программируемыми синтетическими биологическими цепями согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации репортеры могут быть слиты внутри рамки с другими кодирующими последовательностями для идентификации локализации белка в клетке или организме. Люциферазы могут применяться в качестве эффекторных белков в различных вариантах реализации настоящего изобретения, например, для изменения низких уровней генной экспрессии, поскольку клетки, как правило, практически не имеют или совершенно не имеют фоновой люминесценции в отсутствие люциферазы. Согласно другим вариантам реализации ферменты, которые продуцируют окрашенные субстраты, можно количественно оценивать с применением спектрофотометров или других позволяющих измерять поглощение инструментов, в том числе планшет-ридеров. Как и люциферазы, такие ферменты, как β-галактозидаза, могут применяться для измерения низких уровней генной экспрессии, поскольку они имеют тенденцию усиливать слабые сигналы. Согласно некоторым вариантам реализации эффекторный белок может представлять собой фермент, который может разлагать или иным образом уничтожать определенный токсин. Согласно некоторым вариантам реализации эффекторный белок может представлять собой фермент-одоратор, который превращает субстрат в продукт, имеющий запах. Согласно некоторым вариантам реализации эффекторный белок может представлять собой фермент, который фосфорилирует или дефосфорилирует либо малые молекулы, либо другие белки, или фермент, который метилирует или деметилирует другие белки или ДНК.

[00280] Согласно некоторым вариантам реализации эффекторный белок может представлять собой рецептор, лиганд, или литический белок. Рецепторы, как правило, имеют три домена: внеклеточный домен для связывания лигандов, таких как белки, пептиды или малые молекулы, трансмембранный домен и внутриклеточный или цитоплазматический домен, который часто может участвовать в каком-либо явлении при передаче сигнала, таком как фосфорилирование. Согласно некоторым вариантам реализации в качестве эффекторных белков используют последовательности генов транспортеров, каналов или насосов. Неограничивающие примеры и последовательности эффекторных белков для применения с «аварийными выключателями» согласно описанию в настоящем документе можно найти в Реестре стандартных биологических компонентов во всемирной сети Интернет по адресу: parts.igem.org.

[00281] В настоящем документе «белок-модулятор» представляет собой белок, который модулирует экспрессию с целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Белки-модуляторы включают, например, транскрипционные факторы, в том числе транскрипционные активаторы и репрессоры, а также белки которые связываются или модифицируют транскрипционный фактор и влияют на его активность. Согласно некоторым вариантам реализации белок-модулятор включает, например, протеазу, которая разлагает белковый фактор, вовлеченный в регуляцию экспрессии с последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Предпочтительные белки-модуляторы включают модульные белки, в которых, например, связывающие ДНК и связывающие входной агент, или ответные элементы или домены разделены и могут быть перенесены, так что, например, слияние связывающего ДНК домена первого белка-модулятора с отвечающим на входной агент доменом второго белка-модулятора приводит к образованию нового белка, который связывает последовательность ДНК, распознаваемую первым белком, но чувствителен к входному агенту, на который в норме отвечает второй белок. Соответственно, в настоящем документе термин «полипептид-модулятор», более конкретно - «репрессорный полипептид» включает, наряду с указанными полипептидами, например, «(репрессорный) полипептид LacI», варианты или производные таких полипептидов, которые отвечают на другой входной агент или вариант входного агента. Соответственно, в случае полипептида LacI предусмотрены мутанты или варианты LacI, которые связываются с агентами, не являющимися лактозой или IPTG. В данной области техники известен широкий спектр таких агентов.

[00282] Таблица 5. Примеры регуляторных переключателей ^bВозможность включения эффектором; отличная от удаления эффектора, который обеспечивает выключенное состояние. ^cВозможность выключения эффектором; отличная от удаления эффектора, который обеспечивает включенное состояние. ^dЛиганд или другой физический стимул (например, температура, электромагнитное излучение, электричество), который стабилизирует переключатель либо во включенном, либо в выключенном состоянии. ^eОтносится к референсному числу, указанному в источнике: Kis et al., J R Soc Interface. 12:20141000 (2015), содержание которого вместе с цитируемыми источниками включено в настоящий документ посредством ссылки.

VI. Получение зкДНК-вектора

А. Получение в общем случае

[00283] Получение зкДНК-вектора описано в разделе IV PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки. Согласно описанию в настоящем документе указанный зкДНК-вектор может быть получен с применением способа, включающего следующие этапы: а) инкубация популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих матричную полинуклеотидную экспрессионную конструкцию (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая не содержит последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для индукции и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования указанного зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, при этом указанные клетки-хозяева не содержат последовательностей, кодирующих вирусный капсид; и b) сбор и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако вирусные частицы (например, вирионы AAV) при этом не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, такие как естественным образом присутствующие в AAV-векторах или других вирусных векторах.

[00284] Присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

[00285] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложено применение линий клеток-хозяев, которые стабильно интегрировали в собственный геном полинуклеотидную матрицу экспрессионного ДНК-вектора (зкДНК-матрицу), для получения невирусного ДНК-вектора, например, согласно описанию в источнике: Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. Предпочтительно Rep добавляют к клеткам-хозяевам с MOI (множественность заражения), равной приблизительно 3. Если линия клеток-хозяев представляет собой линию клеток млекопитающего, например, клетки НЕК293, то указанные линии клеток могут содержать стабильно интегрированную полинуклеотидную векторную матрицу, а второй вектор, например, герпесвирусный, может применяться для введения в клетки белка Rep, обеспечивающего вырезание и амплификацию зкДНК в присутствии Rep и хелперного вируса.

[00286] Согласно одному варианту реализации клетки-хозяева, используемые для получения зкДНК-векторов, описанных в настоящем документе, представляют собой клетки насекомых, и для доставки как полинуклеотида, который кодирует белок Rep, так и матричной полинуклеотидной экспрессионной конструкции невирусного ДНК-вектора для зкДНК используют бакуловирус, например, согласно описанию на фиг. 4А - 4С и в примере 1. Согласно некоторым вариантам реализации клетку-хозяина модифицируют таким образом, чтобы она экспрессировала белок Rep.

[00287] Затем зкДНК-вектор собирают и выделяют из клеток-хозяев. Время сбора и извлечения зкДНК-векторов, описанных в настоящем документе, из клеток может быть выбрано и оптимизировано так, чтобы обеспечить получение указанных зкДНК-векторов с высоким выходом. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. Согласно одному варианту реализации клетки культивируют в достаточных условиях и собирают через достаточное время после инфекции бакуловирусом, чтобы получить зкДНК-векторы, но до начала гибели большинства клеток вследствие токсичности бакуловируса. Указанные ДНК-векторы могут быть выделены с применением наборов для очищения плазмид, таких как наборы без эндотоксина для выделения плазмид (Endo-Free Plasmid Kits) от Qiagen. Другие способы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для ДНК-векторов. Как правило, могут быть использованы любые способы очищения нуклеиновых кислот.

[00288] Указанные ДНК-векторы могут быть очищены любыми способами очищения ДНК, известными специалистам в данной области техники. Согласно одному варианту реализации получают очищенные зкДНК-векторы в виде молекул ДНК. Согласно другому варианту реализации получают очищенные зкДНК-векторы в виде экзосом или микрочастиц.

[00289] Присутствие зкДНК-вектора может быть подтверждено путем расщепления векторной ДНК, выделенной из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа как расщепленного, так и нерасщепленного ДНК-материала с применением гель-электрофореза для подтверждения присутствия характерных полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК. Фиг. 4С и фиг. 4D иллюстрируют один вариант реализации идентификации присутствия зкДНК-векторов с замкнутыми концами, продуцируемых описанными в данном документе способами.

В. зкДНК-плазмида

[00290] зкДНК-плазмида представляет собой плазмиду, используемую для последующего получения зкДНК-вектора. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-плазмида может быть сконструирована с применением известных методов для обеспечения наличия по меньшей мере следующих функционально связанных компонентов в направлении транскрипции: (1) последовательности 5' ITR согласно описанию в настоящем документе (например, последовательности 5' ITR дикого типа или модифицированной); (2) экспрессионной кассеты, содержащей цис-регуляторный элемент, например, промотор, индуцируемый промотор, регуляторный переключатель, энхансер и т.п.; и (3) последовательности 3'-ITR согласно описанию в настоящем документе (например, последовательности 3' ITR дикого типа или модифицированной), причем последовательность 3'-ITR является симметричной относительно последовательности 5'-ITR. Согласно некоторым вариантам реализации указанная экспрессионная кассета, фланкированная ITR содержит сайт клонирования для введения экзогенной последовательности. Указанная экспрессионная кассета заменяет кодирующие области rep и cap геномов AAV.

[00291] Согласно одному аспекту зкДНК-вектор получают из плазмиды, называемой в настоящем документе «зкДНК-плазмидой», кодирующей в указанном порядке: первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессионную кассету, содержащую по меньшей мере трансген и регуляторный переключатель, и мутированный или модифицированный AAV ITR, при этом указанная зкДНК-плазмида не содержит последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV. Согласно альтернативным вариантам реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный AAV ITR экспрессионную кассету, содержащую по меньшей мере трансген и регуляторный переключатель, и второй (или 3') модифицированный AAV ITR причем указанная зкДНК-плазмида не содержит последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV, а 5'- и 3'-ITR симметричны друг другу. Согласно альтернативным вариантам реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный AAV ITR экспрессионную кассету, содержащую по меньшей мере трансген и регуляторный переключатель, и второй (или 3') мутированный или модифицированный AAV ITR, причем указанная зкДНК-плазмида не содержит последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV, а модифицированные 5'- и 3'-ITR содержат одинаковые модификации (т.е. являются обратно-комплементарными или симметричными друг относительно друга). Согласно альтернативным вариантам реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный AAV ITR экспрессионную кассету, содержащую по меньшей мере трансген и регуляторный переключатель, и второй (или 3') WT AAV ITR причем указанная зкДНК-плазмида не содержит последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV, а 5'- и 3'-ITR симметричны друг другу. Согласно альтернативным вариантам реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует в указанном порядке: первый (или 5') WT AAV ITR экспрессионную кассету, содержащую по меньшей мере трансген и регуляторный переключатель, и второй (или 3') WT AAV ITR причем указанная зкДНК-плазмида не содержит последовательностей, кодирующих капсидный белок AAV, а 5'- и 3'-ITR симметричны друг другу.

[00292] Согласно дополнительному варианту реализации система зкДНК-плазмиды не содержит последовательностей, кодирующих вирусноый капсидный белок (т.е. не содержит генов капсида AAV, а также генов капсидов других вирусов). Кроме того, согласно конкретному варианту реализации зкДНК-плазмида также не содержит последовательностей, кодирующих белок Rep AAV. Соответственно, согласно предпочтительному варианту реализации зкДНК-плазмида лишена функциональных генов cap AAV и rep AAV, GG-3' для AAV2), а также вариабельной палиндромной последовательности, обеспечивающей образование шпильки.

[00293] зкДНК-плазмида согласно настоящему изобретению может быть получена с использованием природных нуклеотидных последовательностей геномов любых серотипов AAV, хорошо известных в данной области техники. Согласно одному варианту реализации остов зкДНК-плазмиды происходит из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV 11, AAV 12, AAVrh8, AAVrh10, генома AAV-DJ и AAV-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC 001729; NC 001829; NC 006152; NC 006260; NC 006261; справочник Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses, доступный по электронному адресу размещения, поддерживаемому Springer (веб-адрес:

oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.) (примечание: ссылки на электронный адрес размещения или базу данных подразумевают содержание, доступное по электронному адресу размещения или в базе данных на фактическую дату подачи настоящей заявки). Согласно конкретному варианту реализации остов зкДНК-плазмиды получают из генома AAV2. Согласно другому конкретному варианту реализации остов зкДНК-плазмиды представляет собой синтетический остов, сконструированный методами генной инженерии с включением на 5'- и 3'-концах ITR, происходящих из одного из указанных геномов AAV.

[00294] зкДНК-плазмида может необязательно включать селектируемый или селективный маркер для использования при создании линии клеток, продуцирующей зкДНК-вектор. Согласно одному варианту реализации указанный селективный маркер может быть инсертирован ниже (то есть в направлении 3') относительно последовательности 3'ITR. Согласно другому варианту реализации указанный селективный маркер может быть инсертирован выше (т.е., в направлении 5') относительно последовательности 5'ITR. Подходящие селективные маркеры включают, например, маркеры, придающие устойчивость к лекарственному средству. Селекционными маркерами могут быть, например, гены устойчивости к бластицидину S, канамицину, генетицину и т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации селективный маркер для отбора по чувствительности к лекарственному средству представляет собой ген устойчивости к бластицидину S.

[00295] Пример зкДНК (например, rAAVO) продуцируют с плазмиды rAAV. Способ получения вектора rAAV может включать: (а) доставку в клетку-хозяина плазмиды rAAV, как описано выше, при этом как клетка-хозяин, так и плазмида не содержат генов, кодирующих капсидный белок, (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продуцирование генома зкДНК; и (с) сбор клеток и выделение генома AAV, продуцированного указанными клетками.

С. Пример способа получения зкДНК-векторов из зкДНК-плазмид

[00296] В настоящем документе также предложены способы получения бескапсидных зкДНК-векторов, в частности, способ с достаточно высоким выходом для обеспечения достаточного количества вектора для экспериментов in vivo.

[00297] Согласно некоторым вариантам реализации способ получения зкДНК-вектора включает следующие этапы: (1) введение нуклеиновокислотной конструкции, содержащей экспрессионную кассету и две симметричных последовательности ITR в клетку-хозяина (например, клетки Sf9), (2) необязательно, получение клональной линии клеток, например, с применением селективного маркера, присутствующего в плазмиде, (3) введение кодирующего Rep гена (путем трансфекции или инфекции бакуловирусом, несущим указанный ген) в указанную клетку насекомого; и (4) сбор клеток и очищение зкДНК-вектора. Нуклеиновокислотная конструкция, содержащая экспрессионную кассету и две последовательности ITR описанных выше, для получения бескапсидного AAV-вектора, может находиться в форме cfAAV-плазмиды, или бакмиды, или бакуловируса, полученных из cfAAV-плазмиды согласно приведенному ниже описанию. Указанная нуклеиновокислотная конструкция может быть введена в клетку-хозяина путем трансфекции, вирусной трансдукции, стабильной интеграции или других способов, известных в области данной техники.

D. Линии клеток

[00298] Линии клеток-хозяев, используемые для продуцирования зкДНК-вектора, могут включать линии клеток насекомых, полученные из Spodoptera frugiperda, такие как клетки Sf9 Sf21 или клетки Trichoplusia ni, или линии клеток других беспозвоночных животных, позвоночных животных или других эукариот, в том числе клетки млекопитающих. Также могут быть использованы другие линии клеток, известные специалисту в данной области техники, такие как HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, моноциты, а также зрелые и незрелые дендритные клетки. Линии клеток-хозяев могут быть трансфицированы для стабильной экспрессии зкДНК-плазмиды для продуцирования зкДНК-вектора с высоким выходом.

[00299] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-плазмиды могут быть введены в клетки Sf9 путем транзиентной трансфекции с применением реагентов (например, липосомальных, фосфата кальция) или физических способов (например, электропорации), известных в данной области техники. Как вариант, могут быть созданы стабильные линии клеток Sf9, которые стабильно интегрировали в геном зкДНК-плазмиду. Такие стабильные линии клеток могут быть созданы путем включения селективного маркера в зкДНК-плазмиду согласно описанию выше. Если зкДНК-плазмида, используемая для трансфекции линии клеток, включает селективный маркер, такой как антибиотик, клетки, которые были трансфицированы зкДНК-плазмидой и интегрировали зкДНК-плазмиду в геном, могут быть отобраны путем добавления антибиотика в среду для роста клеток. Затем устойчивые клоны клеток могут быть выделены с помощью методов разведения отдельных клеток или переноса колоний и размножены.

E. Выделение и очищение зкДНК-векторов

[00300] Примеры способа получения и выделения зкДНК-векторов представлены на фиг. 4А - 4Е и в конкретных примерах ниже. зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут быть получены из клеток-продуцентов, экспрессирующих белок (белки) AAV Rep, дополнительно трансформированных зкДНК-плазмидой, зкДНК-бакмидой или зкДНК-бакуловирусом. Плазмиды, подходящие для получения зкДНК-векторов, включают плазмиды, показанные на фиг. 9А (подходят для получения Rep BIIC), фиг. 9В (плазмида, используемая для получения зкДНК-вектора).

[00301] Согласно некоторым вариантам реализации полинуклеотид кодирует белок Rep AAV (Rep 78 68), доставляемый в клетку-продуцент в плазмиде (Rep-плазмида), бакмиде (Rep-бакмида) или бакуловирусе (Rep-бакуловирус). Rep-плазмида, Rep-бакмида и Rep-бакуловирус могут быть получены описанными выше способами.

[00302] Способы получения зкДНК-вектора, который представляет собой пример зкДНК-вектора, описаны в настоящем документе. Экспрессионные конструкции, используемые для получения зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению, могут представлять собой плазмиду (например, зкДНК-плазмиды), бакмиду (например, зкДНК-бакмиду) и/или бакуловирус (например, зкДНК-бакуловирус). В неограничивающем примере зкДНК-вектор может быть получен из клеток, коинфицированных зкДНК-бакуловирусом и Rep-бакуловирусом. Белки Rep продуцированные с Rep-бакуловируса, могут реплицировать зкДНК-бакуловирус с получением зкДНК-векторов. Как вариант, зкДНК-векторы могут быть получены из клеток, стабильно трансфицированных конструкцией, содержащей последовательность, кодирующую белок Rep AAV (Rep78/52), доставляемой в Rep-плазмидах, Rep-бакмидах или Rep-бакуловирусе. зкДНК-Бакуловирусом можно транзиентно трансфицировать клетки, он может быть реплицирован белком Rep и может продуцировать зкДНК-векторы.

[00303] Бакмидой (например, зкДНК-бакмидой) могут быть трансфицированы пермиссивные клетки насекомых, такие как Sf9, Sf21, клетки Tni (Trichoplusia ni), клетки High Five, и указанная бакмида продуцирует зкДНК-бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирус, включающий последовательности, содержащие симметричные ITR и экспрессионную кассету. Затем клетки насекомых могут быть инфицированы зкДНК-бакуловирусом для получения нового поколения рекомбинантного бакуловируса. Необязательно, указанный этап может быть повторен один или более раз для получения большего количества рекомбинантного бакуловируса.

[00304] Время для сбора зкДНК-векторов, описанных в настоящем документе, из клеток, может быть выбрано и оптимизировано для достижения продуцирования зкДНК-векторов с высоким выходом. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.п. Как правило, клетки могут быть собраны по прошествии достаточного времени после инфицирования бакуловирусом для продуцирования зкДНК-векторов (например, зкДНК-векторов), но до того, как большинство клеток начнут умирать вследствие токсичности вируса. зкДНК-векторы можно выделить из клеток Sf9 с использованием наборов для очищения плазмид, таких как наборы ENDO-FREE PLASMID® от Qiagen. Другие методы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для зкДНК-векторов. Как правило, можно использовать любые известные в данной области способы очищения нуклеиновых кислот, а также коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.

[00305] Как вариант, очищение может быть проведено путем щелочного лизиса клеточного осадка, центрифугирования полученного лизата и выполнения хроматографического разделения. В одном неограничивающем примере указанный процесс может быть осуществлен путем загрузки супернатанта на ионообменную колонку (например, SARTOBIND Q®), которая задерживает нуклеиновые кислоты, с последующим элюированием (например, 1,2 М раствором NaCl) и дальнейшего хроматографического очищения на гель-фильтрационной колонке (например, на 6 Fast Flow GE). Затем выделяют бескапсидный вектор AAV, например, путем осаждения.

[00306] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы могут также быть очищены в форме экзосом, или микрочастиц. В данной области техники известно, что многие типы клеток высвобождают не только растворимые белки, но и сложные белковые/нуклеиновокислотные грузы путем шеддинга мембранных микровезикул (Cocucci et al, 2009; ЕР 10306226.1). Такие везикулы включают микровезикулы (также называемые микрочастицами) и экзосомы (также называемые нановезикулами); и первые, и вторые содержат в качестве груза белки и РЫК. Микровезикулы образуются в результате прямого отпочковывания от плазматической мембраны, а экзосомы высвобождаются во внеклеточную среду при слиянии мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной. Соответственно, содержащие зкДНК-вектор микровезикулы и/экзосомы могут быть выделены из клеток, трансдуцированных с зкДНК-плазмидой, или бакмидой, или бакуловирусом, полученными с применением зкДНК-плазмиды.

[00307] Микровезикулы можно выделить, выполнив фильтрацию или ультрацентрифугирование культуральной среды при 20 000 × g, а экзосомы - при 100 000 × g. Оптимальная продолжительность ультрацентрифугирования может быть определена экспериментально и зависит от конкретного типа клеток, из которых выделяют везикулы. Предпочтительно, культуральную среду сначала очищают низкоскоростным центрифугированием (например, при 2000 × g в течение 5-20 минут) и подвергают центрифугированию с использованием, например, спин-колонки AMICON® (Millipore, Уотфорд, Великобритания). Микровезикулы и экзосомы могут быть дополнительно очищены с помощью FACS или MACS с применением специфических антител, распознающих специфические поверхностные антигены, присутствующие на микровезикулах и экзосомах. Другие методы очищения микровезикул и экзосом включают, не ограничиваясь перечисленными, иммунопреципитацию, аффинную хроматографию, фильтрацию и магнитные гранулы, покрытые специфическими антителами или аптамерами. После очищения везикулы промывают, например, физиологическим раствором с фосфатным буфером. Одним из преимуществ использования микровезикул или экзосом для доставки везикул, содержащих зкДНК, является то, что эти везикулы могут быть нацелены на различные типы клеток за счет включения в их мембраны белков, распознаваемых специфическими рецепторами на соответствующих типах клеток. (См. также ЕР 10306226)

[00308] Другой аспект настоящего изобретения относится к способам очищения зкДНК-векторов из линий клеток-хозяев, которые стабильно интегрировали конструкцию зкДНК в геном. Согласно одному варианту реализации зкДНК-векторы очищают в виде молекул ДНК. Согласно другому варианту реализации зкДНК-векторы очищают в виде экзосом или микрочастиц.

[00309] На фиг. 5 из PCT/US18/49996 показан гель, подтверждающий получение зкДНК с нескольких конструкций зкДНК-плазмид с применением способа, описанного в разделе примеров. Присутствие зкДНК подтверждает характерный паттерн полос на геле, описанный в настоящем документе.

VII. Фармацевтические композиции

[00310] Согласно другому аспекту предложены фармацевтические композиции. Указанная фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[00311] ДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту для доставки in vivo в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, указанная фармацевтическая композиция содержит а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе и фармацевтически приемлемый носитель. Например, зкДНК-векторы описанные в настоящем документе могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для требуемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусмотрена пассивная трансдукция ткани путем внутривенной или внутриартериальной инфузии под высоким давлением, а также внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или

внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть введены в состав раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем введения соединения зкДНК-вектора в необходимом количестве в соответствующий буфер с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией.

[00312] Фармацевтически активные композиции, содержащие зкДНК-вектор, могут быть введены в состав для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в клетки реципиента, что приводит к терапевтической экспрессии в них указанного трансгена. Указанная композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель.

[00313] зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может быть введен в фармацевтическую композицию, подходящую для местного, системного, внутриамниотического, интратекального, интракраниального, внутриартериального, внутривенного, внутрилимфатического, внутрибрюшинного, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, внутрисердечного, внутрипеченочного, внутри почечного, интрацеребрального), интратекального, интравезикального, конъюнктивальное (например, внеорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хориоидального, субхориоидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального (например, перорального, ректального, назального) введение. Также предусмотрены пассивная трансдукция ткани посредством внутривенной или внутриартериальной инфузии под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция.

[00314] Фармацевтические композиции для терапевтических целей, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Указанная композиция может быть введена в состав раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер вместе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией.

[00315] В данной области техники известны различные методы и способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Например, нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, могут быть введены в состав липидных наночастиц (ЛНЧ), липидоидов, липосом, липидных наночастиц, липоплексов или наночастиц типа ядро/оболочка. Как правило, ЛНЧ состоят из молекул нуклеиновой кислоты (например, зкДНК), одного или более ионизируемых или катионных липидов (или их солей), одного или более неионогенных или нейтральных липидов (например, фосфолипида), молекулы, которая предотвращает агрегацию (например, ПЭГ или ПЭГ-липидного конъюгата), и необязательно стерола (например, холестерина).

[00316] Другой способ доставки нуклеиновых кислот, таких как зкДНК, в клетку, заключается в конъюгировании нуклеиновой кислоты с лигандом, который интернализуется указанной клеткой. Например, указанный лиганд может связывать рецептор на поверхности клетки и интернализоваться посредством эндоцитоза. Указанный лиганд может быть ко валентно связан с нуклеотидом в нуклеиновой кислоте. Примеры конъюгатов для доставки нуклеиновых кислот в клетку описаны, например, в WO 2015/006740, WO 2014/025805, WO 2012/037254, WO 2009/082606, WO 2009/073809, WO 2009/018332, WO 2006/112872, WO 2004/090108, WO 2004/091515 и WO 2017/177326.

[00317] Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, могут также быть доставлены в клетку путем трансфекции. Подходящие способы трансфекции включают, не ограничиваясь перечисленными, опосредованную липидами трансфекцию, опосредованную катионным полимером трансфекцию или осаждение фосфатом кальция. Реагенты для трансфекции хорошо известны в данной области техники и включают, не ограничиваясь перечисленными, TurboFect Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject Reagent (Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P Protein Transfection Reagent (New England Biolabs), CHARIOT™ Protein Delivery Reagent (Active Motif), PROTEOJUICE™ Protein Transfection Reagent (EMD Millipore), реагент 293fectin, липофектамин LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), липофектин LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMPJE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECT ACE™, FUGENE™ (Roche, Базель, Швейцария), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™(трансфектам, Promega, Мэдисон, Висконсин), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), TRANSFECTIN™ (BioRad, Геркулес, Калифорния), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Валенсия, Калифорния), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, Сан-Диего, Калифорния), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Лафайет, Колорадо), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку с помощью способов микрофлюидики, известных специалистам в данной области техники.

[00318] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот in vivo или ex vivo включают электропорацию, липофекцию (см. патенты США №5049386; 4946787 и коммерчески доступные реагенты, такие как Transfectam™ и Lipofectin™), микроинъекцию, биолистику, виросомы, липосомы (см., например, источники: Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патенты США, №4186183, №4217344, №4235871, №4261975, №4485054, №4501728, №4774085, №4837028 и №4946787), иммунолипосомы, микропузырьки (Frenkel et al. Ultrasound Med. Biol. (2002) 28(6): 817-22; Tsutsui et al, Cardiovasc. Ultrasound (2004) 2:23), конъюгаты поликатионов или липидов с нуклеиновой кислотой, депротеинизированную ДНК и усиленное агентами поглощение ДНК. Сонопорация с использованием, например, системы Sonitron 2000 (Rich-Mar) также может быть использована для доставки нуклеиновых кислот.

[00319] зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут также быть введены прямо в организм для трансдукции клеток in vivo. Введение осуществляют любым из путей, обычно используемых для приведения молекулы в максимальный контакт с клетками крови или тканей, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, инъекцию, инфузию, местное нанесение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот доступны и хорошо известны специалистам в данной области техники, и хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, конкретный путь часто может обеспечить более быструю и более эффективную реакцию по сравнению с другим путем введения.

[00320] Способы введения нуклеиновокислотного зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе могут включать доставку в гематопоэтические стволовые клетки, например, способами, описанными, например, в патенте США №5928638.

[00321] Для доставки зкДНК-векторов in vitro или in vivo могут быть использованы различные способы доставки, известные в данной области техники, или их модификации. Например, согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы доставляют путем транзиентного проникновения через клеточную мембрану с использованием механической, электрической, ультразвуковой, гидродинамической или лазерной энергии для облегчения входа ДНК в целевые клетки. Например, зкДНК-вектор может быть доставлен путем транзиентного разрыва клеточной мембраны путем продавливания клетки через канал ограниченного размера или другими способами, известными в данной области техники. В некоторых случаях прямо вводят зкДНК-вектор по отдельности в виде депротеинизированной ДНК в клетки кожи, вилочковой железы, сердечной мышцы, скелетных мышц или печени.

[00322] В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляют с помощью генной пушки. Сферические частицы золота или вольфрама (диаметром 1-3 мкм), покрытые бескапсидными AAV-векторами, могут быть разогнаны до высокой скорости с помощью сжатого газа для проникновения в клетки целевой ткани.

[00323] Согласно некоторым вариантам реализации для доставки зкДНК-векторов используют электропорацию. Электропорация вызывает временную дестабилизацию клеточной мембраны клеток целевой ткани в результате введения в ткань пары электродов, так что молекулы ДНК из среды вокруг дестабилизированной мембраны могут проникать в цитоплазму и нуклеоплазму указанной клетки. Электропорацию использовали in vivo для многих типов тканей, таких как кожа, легкие и мышцы.

[00324] В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляют путем гидродинамической инъекции, которая представляет собой простой и высокоэффективный способ прямой внутриклеточной доставки любых водорастворимых соединений и частиц во внутренние органы и скелетные мышцы во всей конечности.

[00325] В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляют с помощью ультразвука, создавая наноскопические поры в мембране для облегчения внутриклеточной доставки частиц ДНК в клетки внутренних органов или опухолей, поэтому размер и концентрация плазмидной ДНК имеют большое значение для эффективности системы.. В некоторых случаях зкДНК- векторы доставляют путем магнитофекции с использованием магнитных полей для концентрации частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, в целевых клетках.

[00326] В некоторых случаях могут быть использованы химические системы доставки, например, с использованием наномерных комплексов, которые включают уплотнение отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты поликатионными наномерными частицами, в составе катионных липосом/мицелл или катионных полимеров. Катионные липиды, используемые для способа доставки, включают, помимо прочего, одновалентные катионные липиды. поливалентные катионные липиды, соединения, содержащие гуанидин, производные холестерина, катионные полимеры (например, поли(этиленимин), поли-L-лизин, протамин, другие катионные полимеры) и липид-полимерный гибрид.

А. Экзосомы

[00327] Согласно некоторым вариантам реализации а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе доставляют путем упаковки в экзосому. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы эндоцитарного происхождения, которые высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Их поверхность состоит из липидного бислоя клеточной мембраны донорной клетки, они содержат цитозоль из клетки, которая продуцировала экзосому, и экспонируют на поверхности мембранные белки родительской клетки. Экзосомы продуцируются различными типами клеток, в том числе эпителиальными клетками, В- и Т-лимфоцитами, тучными клетками (МС), а также дендритными клетками (DC). Согласно некоторым вариантам реализации предусмотрены для применения экзосомы с диаметром от 10 нм до 1 мкм, от 20 нм до 500 нм, от 30 нм до 250 нм, от 50 до 100 нм. Экзосомы могут быть выделены для доставки в целевые клетки либо с применением донорных клеток, либо путем введения в них конкретных нуклеиновых кислот. Различные подходы, известные в данной области техники, могут применяться для получения экзосом, содержащих бескапсидные AAV-векторы согласно настоящему изобретению.

В. Микрочастицы/Наночастицы

[00328] Согласно некоторым вариантам реализации а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе доставляют на липидной наночастице. Обычно липидные наночастицы содержат ионизируемый аминолипид (например, гептатриаконта-6, 9, 28, 31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат, DLin-MC3-DMA, фосфатидилхолин(1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, DSPC), холестерин и липид оболочки (полиэтиленгликоль- димиристоилглицерин, ПЭГ-ДМГ), например, как описано в источнике: Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanopartides for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.

[00329] Согласно некоторым вариантам реализации липидная наночастица имеет средний диаметр от приблизительно 10 до приблизительно 1000 нм. Согласно некоторым вариантам реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 300 нм. Согласно некоторым вариантам липидная наночастица имеет диаметр от приблизительно 10 до приблизительно 300 нм. Согласно некоторым вариантам реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 200 нм. Согласно некоторым вариантам липидная реализация наночастица имеет диаметр от приблизительно 25 до приблизительно 200 нм. Согласно некоторым вариантам реализации состав с липидными наночастицами (например, композиция, содержащая совокупность липидных наночастиц) характеризуется распределением по размерам со средним размером частиц (например, диаметром) от приблизительно 70 нм до приблизительно 200 нм; чаще средний размер составляет приблизительно 100 нм или менее.

[00330] Различные известные в данной области техники липидные наночастицы могут применяться для доставки зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе. Например, различные способы доставки с применением липидных наночастиц описаны в патентах США №9404127, №9006417 и №9518272.

[00331] Согласно некоторым вариантам реализации а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе доставляют на золотой наночастице. Как правило, нуклеиновая кислота может быть ковалентно связана с золотой наночастицей или нековалентно связана с золотой наночастицей (например, связана заряд-зарядным взаимодействием), например, согласно описанию в источнике: Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. Согласно некоторым вариантам реализации конъюгаты золотых наночастиц и нуклеиновой кислоты получают с использованием способов, описанных, например, в патенте США №6812334.

C. Конъюгаты

[00332] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе конъюгирован (например, ковалентно связан с агентом, который повышает поглощение клетками. «Агент, который повышает поглощение клетками» представляет собой молекулу, которая облегчает транспорт нуклеиновой кислоты через липидную мембрану. Например, нуклеиновая кислота может быть конъюгирована с липофильным соединением (например, холестерином, токоферолом и т.п.), проникающим в клетки пептидом (СРР) (например, пенетратином, TAT, Syn1B и т.п.) и полиаминами (например, спермином). Дополнительные примеры агентов, которые повышают поглощение клетками, раскрыты, например, в источнике: Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.

[00333] Согласно некоторым вариантам реализации а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе конъюгирован с полимером (например, полимерной молекулы) или молекулой фолата (например, молекулой фолиевой кислоты). В целом, доставка нуклеиновых кислот, конъюгированных с полимерами, известна в данной области техники, например, описана в WO 2000/34343 и WO 2008/022309. Согласно некоторым вариантам реализации а зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе конъюгирован с поли(амидным) полимером, например, согласно описанию в Патенте США №8987377. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновая кислота, описанная в настоящем документе, конъюгирована с молекулой фолиевой кислоты согласно описанию в в патенте США №8507455.

[00334] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе конъюгирован с углеводом, например, согласно описанию в патенте США №8450467.

D. Нанокапсула

[00335] Как вариант, могут применяться нанокапсульные составы зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе. Как правило, нанокапсулы могут захватывать вещества стабильным и воспроизводимым образом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных внутриклеточной перегрузки полимерами, такие ультратонкие частицы (размером около 0,1 мкм) необходимо конструировать с использованием полимеров, способных разлагаться in vivo. Предусмотрены для применения биоразлагаемые наночастицы полиалкилцианоакрилата, которые отвечают указанным требованиям.

E. Липосомы

[00336] зкДНК-векторы в соответствии с настоящим изобретением могут быть добавлены в липосомы для доставки в клетку или целевой орган субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, имеющие по крайней мере один липидный бислой. Липосомы часто используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают за счет слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомальные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, хотя указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00337] Получение и применение липосом в целом известно специалистам в данной области техники. Были разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке и временем полужизни в циркуляторной системе (патент США №5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосомальных и подобных липосомальным составов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США №5567434; №5552157; №5565213; №5738868 и №5795587).

[00338] Липосомы успешно применялись с некоторыми типами клеток, которые обычно устойчивы к трансфекции с использованием других процедур. Кроме того, липосомы свободны от ограничений по длине ДНК, типичных для систем доставки на основе вирусов. Липосомы эффективно применялись для введения генов, лекарственных средств, радиотерапевтических агентов, вирусов, транскрипционных факторов и аллостерических эффекторов в различные культивируемые линии клеток и в организм животных. Кроме того, было завершено несколько успешных клинических испытаний для изучения эффективности опосредованной липосомами доставки лекарственных средств.

[00339] Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде, и спонтанно образуют мультиламеллярные концентрические бислойные везикулы (также называемые многослойными везикулами (MLV). MLV обычно имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию малых однослойных везикул (SUV) с диаметром в диапазоне от 200 до 500 ангстрем, содержащих водный раствор в ядре.

[00340] Согласно некоторым вариантам реализации липосома содержит катионные липиды. Термин «катионный липид» включает липиды и синтетические липиды, имеющие как полярные, так и неполярные домены, которые могут быть положительно заряженными при физиологических значениях рН или около них, и которые связываются с полианионами, такими как нуклеиновые кислоты, и способствуют доставке нуклеиновых кислот в клетки. Согласно некоторым вариантам реализации катионные липиды включают насыщенные и ненасыщенные алкильные и алициклические простые эфиры и сложные эфиры аминов, амидов или их производных. Согласно некоторым вариантам реализации катионные липиды включают линейные, разветвленные алкильные, алкенильные группы или любую комбинацию вышеперечисленного. Согласно некоторым вариантам реализации катионные липиды содержат от 1 до примерно 25 атомов углерода (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам реализации катионные липиды содержат более 25 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам реализации прямоцепочечные или разветвленные алкильные или алкеновые группы содержат шесть или более атомов углерода. Катионный липид может также содержать, согласно некоторым вариантам реализации, одну или более алициклических групп. Неограничивающие примеры алициклических групп включают холестерин и другие стероидные группы. Согласно некоторым вариантам реализации политических липидов с использованием одного или более противоионов. Примеры противоионов (анионов) включают, не ограничиваясь перечисленными, Cl-, Br-, I-, F-, ацетат, трифторацетат, сульфат, нитрит и нитрат.

[00341] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения липосомальный состав включает одно или более соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которая может снижать иммуногенность / антигенность, обеспечивать гидрофильность и гидрофобность соединения (соединений) и снижать частоту дозирования. Липосомальный состав также может просто включать полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. Согласно таким аспектам молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.

[00342] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который доставляет АФИ с профилем продленного высвобождения или контролируемого высвобождения в течение периода от часов до недель. Согласно некоторым родственным аспектам указанный липосомальный состав может включать водные камеры, которые связаны липидными бислоями. Согласно другим родственным аспектам в указанном липосомальном составе инкапсулирован АФИ с компонентами, которые претерпевают физический переход при повышенной температуре, высвобождая таким образом АФИ, в течение периода от часов до недель.

[00343] Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит сфингомиелин и один или более липидов согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит оптисомы.

[00344] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который включает один или более липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонил-метоксиполиэтиленгликоля-2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), конъюгиро ванного с MPEG (метоксиполиэтиленгликоль) липид а, HSPC (гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин); ПЭГ (полиэтиленгликоль); DSPE (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламин); DSPC (дистеароилфосфатидилхолин); DOPC (диолеилфосфатидилхолин); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерин); ЕРС (яичный фосфатидилхолин); DOPS (диолеилфосфатидилсерин); РОРС (пальмитоилолеилфосфатидилхолин); SM (сфингомиелин); MPEG (метоксиполиэтиленгликоль); DMPC (димиристоилфосфатидилхолин); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерин); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерин); DEPC (диэрукоилфосфатидилхолин); DOPE (диолеил-sn-глицеро-фосфоэтаноламин), сульфата холестерина (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), DOPC (диолеил-sn-глицеро-фосфатидилхолин) или любой комбинации перечисленного.

[00345] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. Согласно некоторым аспектам общее содержание липидов в липосомальном составе составляет 2-16 мг/мл. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, липид, содержащий этаноламиновую функциональную группу, и пегилированный липид. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, липид, содержащий этаноламиновую функциональную группу, и пегилированный липид в молярном соотношении 3:0,015:2 соответственно. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, холестерин и пегилированный липид. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу и холестерин. Согласно некоторым аспектам указанный пегилированный липид представляет собой PEG-2000-DSPE. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий DPPG, соевый PC, конъюгат липида с MPEG-DSPE и холестерин.

[00346] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий один или более липидов, содержащих фосфатидилхолиновую функциональную группу и один или более липидов, содержащих этаноламиновую функциональную группу. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий что-либо одно или более из: липидов, содержащих фосфатидилхолиновую функциональную группу, липидов, содержащих этаноламиновую функциональную группу, и стеролов, например, холестерина. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит DOPC/ DEPC; и DOPE.

[00347] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, дополнительно содержащий одно или более фармацевтических вспомогательных веществ, например, сахарозу и/или глицин.

[00348] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, имеющий униламеллярную или мультиламеллярную структуру. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который содержит мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, относительный размер частиц которого больше, чему обычных наночастиц и составляет приблизительно от 150 до 250 нм. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав представляет собой лиофилизированный порошок.

[00349] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который получают и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в настоящем документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК, вне липосомы Указанное добавление повышает значение рН вне липосом до приблизительно 7,3 и стимулирует вход АФИ в липосому. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, имеющий значения рН, кислотные внутри липосом. В таких случаях значение рН внутри липосом может составлять 4-6,9 и более предпочтительно - рН 6,5. Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, полученный с применением технологии внутрилипосомальной стабилизации лекарственных средств. В таких случаях используют полимерные или неполимерные высокозаряженные анионы и внутрилипосомальные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.

[00350] Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.

[00351] Неограничивающие примеры катионных липидов включают звездчатые дендримеры полиэтиленимина и полиамидоамина (РАМАМ), липофектин (комбинация DOTMA и DOPE), липофектазу, липофектамин (LIPOFECTAMTNE™, например, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, цитофектин (Gilead Sciences, Фостер-Сити, Калифорния) и эуфектины (JBL, Сан-Луис-Обиспо. Калифорния). Примеры катионных липосом могут быть получены из N-[1-(2,3-диолеолокси)-пропил]-N,N,N-триметилхлорида аммония (DOTMA), N-[1-(2,3-диолеолокси)-пропил]-N,N,N-триметиламмония метилсульфата (DOTАР), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина (DC-Chol), 2,3,-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия трифторацетата (DOSPA), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметил-гидроксиэтиламмония бромида; и

диметилдиоктадециламмония бромида (DDAB). Нуклеиновые кислоты (например, CELiD) могут также быть введены в комплексы, например, с поли(L-лизином) или авидином, и липиды, например, стерил-поли(L-лизин), могут быть включены или не включены в указанную смесь.

[00352] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе доставляют с применением катионного липида, описанного в патенте США №8158601, или полиаминного соединения или липида согласно описанию в патенте США №8034376.

F. Примеры композиций с липосомами и липидными наночастицами (ЛНЧ)

[00353] зкДНК-векторы в соответствии с настоящим изобретением могут быть добавлены в липосомы для доставки в клетку, нуждающуюся в редактировании гена, например, нуждающуюся в донорной последовательности. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы часто используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают за счет слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомальные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, хотя указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00354] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который включает одно или более соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которые могут снижать иммуногенность/ антигенность, обеспечивать гидрофильность и гидрофобность указанному соединению (соединениям) и снижение частоты его дозирования. Как вариант, указанный липосомальный состав включает просто полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. Согласно таким аспектам молекулярная масса функциональной группы ПЭГ или ПЭГ может составлять от 62 Да до приблизительно 5000 Да.

[00355] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, доставляющий АФИ в соответствии с профилем продленного высвобождения или контролируемого высвобождения на протяжении периода от нескольких часов до недель. Согласно некоторым родственным аспектам указанный липосомальный состав может включать водные камеры, которые связаны липидными бислоями. Согласно другим родственным аспектам указанный липосомальный состав инкапсулирует АФИ с компонентами, которые претерпевают физический переход при повышенной температуре, который высвобождает АФИ в течение периода от нескольких часов до недель.

[00356] Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит сфингомиелин и один или более липидов согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит оптисомы.

[00357] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который включает один или более липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль-2000)-1, 2-дистеароил-кп-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида. HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); ЕРС (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеилфосфатидилсерина); РОРС (пальмитоилолеилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диэрукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), сульфат холестерина (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеил-sn-глицеро-фосфатидилхолина) или любой комбинации перечисленного.

[00358] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. Согласно некоторым аспектам общее содержание липидов в липосомальном составе составляет 2-16 мг/мл. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, липид, содержащий этаноламиновую функциональную группу, и пегилированный липид. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, липид, содержащий этаноламиновую функциональную группу, и пегилированный липид, в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу, холестерин и пегилированный липид. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий липид, содержащий фосфатидилхолиновую функциональную группу и холестерин. Согласно некоторым аспектам указанный пегилированный липид представлен PEG-2000-DSPE. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий DPPG, соевый ФХ, конъюгат липида с MPEG-DSPE и холестерин.

[00359] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий один или более липидов, содержащих фосфатидилхолиновую функциональную группу, и один или более липидов, содержащих этаноламиновую функциональную группу. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий что-либо одно или более из: липидов, содержащих фосфатидилхолиновую функциональную группу, липидов, содержащих этаноламиновую функциональную группу, и стеролов, например, холестерина. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав содержит DOPC/ DEPC; и DOPE.

[00360] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, дополнительно содержащий одно или более фармацевтических вспомогательных веществ, например, сахарозу и/или глицин.

[00361] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав с униламеллярной или мультиламеллярной структурой. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который содержит мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, относительный размер частиц которого больше, чему обычных наночастиц и составляет приблизительно от 150 до 250 нм. Согласно некоторым аспектам указанный липосомальный состав представляет собой лиофилизированный порошок.

[00362] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, который получают и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в настоящем документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК, вне липосомы. Указанное добавление повышает значение рН вне липосом до приблизительно 7,3 и стимулирует вход АФИ в липосому. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, имеющий значения рН, кислотные внутри липосом. В таких случаях значение рН внутри липосом может составлять 4-6,9 и более предпочтительно рН 6,5. Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, полученный с применением технологии внутрилипосомальной стабилизации лекарственных средств. В таких случаях используют полимерные или неполимерные высокозаряженные анионы и внутрилипосомальные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.

[00363] Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен липосомальный состав, содержащий фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный липосомальный состав представляет собой состав, описанный в приведенной ниже таблице 6.

[00364] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложена липидная наночастица, содержащая зкДНК и ионизируемый липид. Например, состав с липидными наночастицами, который получают и нагружают зкДНК, полученной способом согласно описанию в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в настоящий документ. Это может осуществляться путем интенсивного смешивания этанольных растворов липидов с водным раствором зкДНК при низких рН, при котором происходит протонирование ионизируемого липида и обеспечиваются благоприятные энергетические характеристики для связывания зкДНК/липида и нуклеации частиц. Частицы могут быть дополнительно стабилизированы путем разбавления водой и удаления органического растворителя Частицы могут быть сконцентрированы до желаемого уровня.

[00365] Как правило, липидные частицы получают с соотношением (массовым или весовым) общего содержания липида и зкДНК примерно от 10:1 до 30:1. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соотношение липида и зкДНК (массовое соотношение; соотношение по массе) может находиться в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 14:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1, или приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1. Количества липидов и зкДНК могут быть скорректированы, чтобы обеспечить требуемое соотношение N/P, например, соотношение N/P, равное 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более. Как правило, общее содержание липидных частиц в составе может варьировать от приблизительно 5 мг/мл до приблизительно 30 мг/мл.

[00366] Ионизируемый липид, как правило, используют для конденсации груза нуклеиновой кислоты, например, зкДНК, при низком рН, и для стимуляции связывания мембран и фузогенности Как правило, ионизируемые липиды представляют собой липиды, содержащие по меньшей мере одну аминогруппу, которая положительно заряжена или становится протонированной в кислых условиях, например, при рН 6,5 или ниже. Ионизируемые липиды также называют катионными липидами в настоящем документе.

[00367] Примеры ионизируемых липидов описаны в патентных публикациях РСТ WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, и WO2013/086354, а также патентных публикациях США US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458, и US2013/0195920, содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки полностью.

[00368] Согласно некоторым вариантам реализации указанный ионизируемый липид представляет собой МСЗ (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)- гептатриаконта-6, 9, 28, 31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино) бутаноат (DLin-MC3-DMA или МС3), имеющий следующую структуру:

[00369] Липид DLin-MC3-DMA описан в источнике: Jayaraman et al, Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки полностью.

[00370] Согласно некоторым вариантам реализации указанный ионизируемый липид представляет собой липид АТХ-002, имеющий следующую структуру:

[00371] Липид АТХ-002 описан в WO2015/074085, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00372] Согласно некоторым вариантам реализации указанный ионизируемый липид представляет собой (13Z, 16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоза-13, 16-диен-1-амин (соединение 32), имеющий следующую структуру:

[00373] Соединение 32 описано в WO2012/040184, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00374] Согласно некоторым вариантам реализации указанный ионизируемый липид представляет собой соединение 6 или соединение 22, имеющее следующую структуру:

[00375] Соединения 6 и 22 описаны в WO2015/199952, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00376] Без ограничения, ионизируемый липид может содержать 20-90% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, ионизируемый липид молярное содержание может составлять 20-70% (мол.), 30-60% (мол.) или 40-50% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Согласно некоторым вариантам реализации ионизируемый липид содержит от приблизительно 50 мол. % до приблизительно 90 мол. % от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице.

[00377] Согласно некоторым аспектам указанная липидная наночастица может дополнительно содержать некатионный липид. Неионогенные липиды включают амфипатические липиды, нейтральные липиды и анионные липиды. Соответственно, указанный некатионный липид может представлять собой нейтральный незаряженный, цвиттерионный или анионный липид. Некатионные липиды, как правило, используют для усиления фузогенности.

[00378] Примеры некатионных липидов включают, не ограничиваясь перечисленными, дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламин, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеилфосфатидилэтаноламин 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), монометил-фосфатидилэтанoламин такие как 16-О-монометил-ФЭ), диметилфосфатидилэтаноламин (такой как 16-O-диметил-ФЭ), 18-1-транс-ФЭ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилхолин-этаноламин (SOPE), гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин (HSPC), фосфатидилхолин яйца (ЕРС), диопеипфосфатидипсерин(DОРS), сфингомиелин (SM), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DМРС), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), диэрукоилфосфатидилхолин (DEPC), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (POPG), диелаидоил-фосфатидилэтаноламин (DEPE), лецитин, фосфатидилэтаноламин, пизолецитин, лизофосф атидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, сфингомиелин, офингомиелин яйца (ESM), кефалин, кардиолипин, фосфатидную кислоту, цереброзиды, дицетилфосфат, лизофосфатидилхолин, дилинолеилфосфатидилхолин, или их смеси. Следует понимать, что могут быть использованы также другие диацилфосфатидилхолиновые и диацилф осфатидилэтаноламиновые фосфолипиды. Ацильные группы в указанных липидах представляют собой предпочтительно ацильные группы, происходящие из жирных кислот, содержащих углеродные цепи С₁₀-С₂₄, например, лауроил, миристоил, папьмитоил, стеароил или олеоил.

[00379] Другие примеры некатионных липидов, подходящих для применения в указанных липидных наночастицах, в ключают не содержащие фосфора липиды, такие как, например, стеариламин, додециламин, гексадециламин, ацетилпальмитат, глицерилрицинолеат, гексадецилстеарат, изопропилмиристат, амфотерные акриловые полимеры, триэтаноламин-лаурилсульфат, алкиларилсульфатные полиэтилоксилированные амиды жирных кислот, дноктадецилдиметиламмония бромид, церамид, сфингомиелин и т.п.

[00380] Согласно некоторым вариантам реализации указанный некатионный липид представляет собой фосфолипид. Согласно некоторым вариантам реализации указанный некатионный липид выбирают из DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, РОРС, DOPE и SM. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации указанный некатионный липид представляет собой DPSC.

[00381] Примеры некатионных липидов описаны в PCТ-публикации W02017Л099823 и патентной публикации СШA US 2018/0028664, содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки Согласно некоторым примерам указанный некатионный липид представляет собой олеиновую кислоту или соединение формулы (I),

, формулы (II) или формулы (IV), , согласно определению в US 2018/0028664, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00382] Указанный некатионный липид может содержать 0-30% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, содержание некатионного липида составляет 5-20% (мол.) или 10-15% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Согласно различным вариантам реализации молярное соотношение ионизируемого липида и нейтрального липида варьирует от приблизительно 2:1 до приблизительно 8:1.

[00383] Согласно некоторым вариантам реализации указанные липидные наночастицы не содержат каких-либо фосфолипидов.

[00384] Согласно некоторым аспектам указанная липидная наночастица может дополнительно содержать такой компонент, как стерол, для обеспечения целостности мембраны.

[00385] Один пример стерола, который подходит для применения в указанной липидной наночастице, представлен холестерином и его производными. Неограничивающие примеры производных холестерина включают полярные аналоги, такие как 5α-холестанол, 5α-копростанол, холестерил-(2'-гидрокси)-этиловый простой эфир, холестерил-(4'-гидрокси)-бутиловый простой эфир и 6- кетохолестанол; неполярные аналоги, такие как 5α-холестан, холестенон, 5α-холестанон, 5β-холестанон и холестерилдеканоат; и их смеси. Согласно некоторым вариантам реализации указанное производное холестерина представляет собой полярный аналог, такой как холестерил-(4'-гидрокси)- бутиловый простой эфир.

[00386] Примеры производных холестерина описаны в РСТ-публикации WO2009/127060 и патентной публикации CIIIAUS2010/0130588, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00387] Указанный компонент, обеспечивающий целостность мембраны, такой как стерол, может содержать 0-50% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Согласно некоторым вариантам реализации такой компонент составляет 20-50% (мол.) 30 40% (мол.) от общего содержания липидов в липидной наночастице.

[00388] Согласно некоторым аспектам указанная липидная наночастица может дополнительно содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ) или конъюгированную молекулу липида. Как правило, их используют для ингибирования агрегации липидных наночастиц и/или обеспечения стерической стабилизации. Примеры конъюгированных липидов включают, не ограничиваясь перечисленными, конъюгаты ПЭГ и липидов, конъюгаты полиоксазолина (POZ) с липидами, конъюгаты полиамидов с липидами (такие как конъюгаты АТТА с липидами), конъюгаты катионных полимерных липидов (CPL); и смеси перечисленного. Согласно некоторым вариантам реализации указанная молекула конъюгированного липида представляет собой конъюгат ПЭГ с липидами, например, (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированный липид.

[00389] Примеры конъюгатов ПЭГ и липидов включают, не ограничиваясь перечисленными, ПЭГ-диацилглицерин (DAG) (такой как 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-ДМГ)), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-керамид (Сеr), пегилированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ), ПЭГ-сукцинатдиацилглицерин (PEGS-DAG) (такой как 4-O-(2',3'-ди(тетрадеканоилокси)пропил-1-О-(w-метокси(полиэтокси)этил) бутандиоат (PEG-S-DMG)), ПЭГ-диалкоксипропилкарбам, N-(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль 2000)-1, 2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина натриевую соль, или смесь перечисленного. Дополнительные примеры коньюгатов ПЭГ и липидов описаны, например, в US 5, 885, 613, US 6, 287, 591, US200 3/0077829, US 2003/007 7829, US2005/0175682, US 2008/002005 8, US2011/0117125, US2010/0130588, US 2016/0376 224 и US2017/0119904, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00390] Согласно не которым вариантам реализации коньюгат ПЭГ и липида представляет собой соединение формулы (III), формулы (III-а-I), формулы (Ш-а-2), формулы (III-b-1), формулы (III-b-2), или формулы (V) согласно определению в US2018/0028664, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссыпки.

[00391] Согласно некоторым вариантам реализации ПЭГ-липид представляет собой соединение формулы (II), , согласно определению в US20150376115 или в US2016/0376224, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ посредством с сылки

[00392] Коньюгат ПЭГ-DAА может представлять собой, напршмр, ПЭГ-дилаурилоксипропил, ПЭГ-димиристилоксипропил, ПЭГ-дипальмитилоксипропил или ПЭГ-дистеарилоксипропил. Указанный ПЭГ-липид может представлять собой что-либо одно или более из ПЭГ-ДМГ, ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистерилглицерина, ПЭГ-дилаурилгликамида, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистерилгликамида, ПЭГ-холестерина(1-[8'-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метил-поли(этиленгликоля), ПЭГ-ДМБ (3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метил-поли(этиленгликоль)эфира) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000]. Согласно некоторым примерам указанный ПЭГ-липид может быть выбран из группы, состоящей из ПЭГ-ДМГ, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000],

[00393] Липиды, конъюгированные с молекулой, отличной от ПЭГ, могут также быть использованы вместо ПЭГ-липида. Например, конъюгаты полиоксазолина (POZ) и липидов, конъюгаты полиамида и липида (такие как конъюгаты АТТА и липидов), и конъюгаты катионных полимерных липидов (CPL) могут примениться вместо или вместе с ПЭГ-липидом.

[00394] Примеры конъюгированных липидов, т.е., ПЭГ-липиды, конъюгаты (POZ) с липидами, конъюгаты АТТА и липидов и конъюгаты катионных полимерных липидов описаны в опубликованных патентных РСТ-публикациях W01996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104, и WO2010/006282, опубликованных заявках на патент США US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115,US2016/0376224,US2016/0317458, US2013/0303587,US2013/0303587, и US20110123453, и патентах СШАUS5885613, US6287591, US6320017 и US6586559, содержание каждого из которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки

[00395] Указанный ПЭГ или конъюгированный липид может составлять 0-20% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице. Согласно некоторым вариантам реализации содержание ПЭГ или коньюгированного липида составляет 0,5-10% или 2-5% (мол.) от общего содержания липида, присутствующего в липидной наночастице.

[00396] Молярные соотношении ионизируемого липида, некатионного липида, стерола и ПЭГ/коньюгированного липида может варьировать в зависимости от обстоятельств. Например, указанная липидная частица может содержать 30-70% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 0-60% холестерина от молярного содержании или от общей массы композиции, 0-30% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции и 1-10% конъюгированного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Предпочтительно указанная композиция содержит 30-40% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 40-50% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции и 10-20% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанная композиция содержит 50-75% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 20-10% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции; и 5-10% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции, и 1-10% конъюгированного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Указанная композиция может содержать 60-70% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 25-35% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции, и 5-10% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Указанная композиция может также содержать до 90% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, и 2-15% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Указанный состав может также представлять собой состав с липидными наночастицами, например, содержащий 8-30% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 5-30% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции, и 0-20% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции; 4-25% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 4-25% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 2-25% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции, 10-35% конъюгата липида от молярного содержания или от общей массы композиции, и 5% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции; или 2-30% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 2-30% некатионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции, 1-15% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции, 2-35% конъюгата липида от молярного содержания или от общей массы композиции, и 1-20% холестерина от молярного содержания или от общей массы композиции; или даже до 90% ионизируемого липида от молярного содержания или от общей массы композиции и 2-10% некатионных липидов от молярного содержания или от общей массы композиции, или даже 100% катионного липида от молярного содержания или от общей массы композиции. Согласно некоторым вариантам реализации указанный состав с липидными частицами содержит ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и Пегилированный липид в молярном соотношении 50:10:38,5:1,5. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанный состав с липидными частицами содержит ионизируемый липид, холестерин и Пегилированный липид в молярном соотношении 60:38,5:1,5.

[00397] Согласно некоторым вариантам реализации указанная липидная частица содержит ионизируемый липид, некатионный липид (например, фосфолипид), стерол (например, холестерин) и Пегилированный липид, причем молярное соотношение липидов варьирует от 20 до 70 молярных процентов для ионизируемого липида, при целевых 40-60%, молярный процент некатионного липида варьирует от 0 до 30 при целевых 0 15%, молярный процент стерола варьирует от 20 до 70% при целевых 30 50%, а молярный процент пегилированного липида варьирует от 1 до 6% при целевых 2-5%.

[00398] Липидные наночастицы (ЛНЧ), содержащие зкДНК, раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в настоящий документ полностью, и предусмотрены для применения в способах и композициях согласно описанию в настоящем документе.

[00399] Размер липидных наночастиц может быть определен методом квазиупругого рассеяния света с применением Malvern Zetasizer Nano ZS (Малверн, Великобритания), и их диаметр составляет приблизительно 50-150 нм, приблизительно 55-95 нм или приблизительно 70-90 нм.

[00400] рКа катионных липидов в составах может быть сопоставлена с эффективностью ЛНЧ для доставки нуклеиновых кислот (см. источники: Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), оба из которых полностью включены посредством ссылки в настоящий документ). Предпочтительный диапазон рКа от приблизительно 5 до приблизительно 7. рКа каждого катионного липида в липидных наночастицах определяют с применением анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS). Липидные наночастицы, содержащие катионный липид/DSPC/ холестерин/ПЭГ-липид (50/10/38,5/1,5 мол. %) в ФСБ при общей концентрации липидов 0,4 мМ, могут быть получены с применением поточного способа согласно описанию в настоящем документе и в другие источниках. TNS могут быть получены в виде стокового раствора с концентрацией 100 мкМ в дистиллированной воде. Везикулы могут быть разведены до концентрации липидов 24 мкМ в 2 мл забуференных растворов, содержащих 10 мМ HEPES, 10 мM MES, 10 мМ аммония ацетата, 130 мМ NaCl, где рН варьирует от 2, 5 до 11. Аликвота раствора TNS может быть добавлена для достижения конечной концентрации 1 мкМ; после перемешивания на вортексе измеряют интенсивность флуоресценции при комнатной температуре на спектрофотометре SLM Aminco Series 2 Люминесценцию при длинах волн возбуждения и излучения 321 нм и 445 нм. Для анализа данных флуоресценции может применяться метод наилучшего соответствия с использованием сигмоидной функции; рКа измеряют как значение рН, получая полумаксимальную интенсивность флуоресценции.

[00401] Относительная активность может быть определена путем измерения экспрессии люциферазы в печени через 4 часа после введения путем инъекции в хвостовую вену. Сравнивают активность при дозе 0, 3 и 1,0 мг зкДНК/кг и выражают в виде нг люциферазы на грамм печени при измерении через 4 часа после введения.

[00402] Без ограничений, липидная наночастица согласно настоящему изобретению включает липидный состав, который может применяться для доставки бескапсидного невирусного ДНК-вектора в представляющий интерес целевой сайт (например, клетку, ткань, орган и т.п.). Как правило, указанная липидная наночастица содержит бескапсидный невирусный ДНК-вектор и ионизируемый липид или его соль.

[00403] Согласно некоторым вариантам реализации указанная липидная частица содержит ионизируемый липид / некатионный липид / стерол / конъюгированный липид в молярном соотношении приблизительно 50:10:38,5:1,5.

[00404] Согласно некоторым вариантам реализации указанная липидная частица содержит ионизируемый липид / некатионный липид / стерол / конъюгированный липид в молярном соотношении приблизительно 50, 0:7,0:40,0:3,0.

[00405]

[00406] Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложен состав с липидными наночастицами, содержащий фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.

[00407] Согласно некоторым вариантам реализации могут также быть включены один или более дополнительных соединений. Указанные соединения могут вводиться по отдельности или указанные дополнительные соединения могут быть включены в липидные наночастицы согласно настоящему изобретению. Другими словами, указанные липидные наночастицы могут содержать другие соединения наряду с зкДНК, или по меньшей мере вторую зкДНК, отличную от первой. Без ограничений, другие дополнительные соединения могут быть выбраны из группы, состоящей из малых или больших органических или неорганических молекул, моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов, пептидов, белков, аналогов пептидов и их производных, пептидомиметиков, нуклеиновых кислот, аналогов и производных нуклеиновых кислот, экстракта, приготовленного из биологических материалов, или любых комбинаций перечисленного.

[00408] Согласно некоторым вариантам реализации указанные одно или более дополнительных соединений могут быть представлены терапевтическим агентом. Указанный терапевтический агент может быть выбран из любого класса, подходящего для применения в терапевтических целях. Другими словами, указанный терапевтический агент может быть выбран из любого класса, подходящего для применения в терапевтических целях. Другими словами, указанный терапевтический агент может быть выбран в соответствии с терапевтической целью и требуемым биологическим действием. Например, если зкДНК в составе ЛНЧ подходит для лечения рака, указанное дополнительное соединение может представлять собой противораковый агент (например, химиотерапевтический агент, направленную противораковую терапию (в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, малую молекулу, антитело или конъюгат антитела с лекарственным средством). Согласно другому примеру в том случае, если ЛНЧ, содержащая зкДНК, подходит для лечения инфекции, указанное дополнительное соединение может представлять собой антимикробный агент (например, антибиотик или противовирусное соединение). Согласно еще одному примеру в том случае, если ЛНЧ, содержащая зкДНК, подходит для лечения иммунного заболевания или расстройства, указанное дополнительное соединение может представлять собой соединение, которое модулирует иммунный ответ (например, иммуносупрессор, иммуностимулирующее соединение, или соединение, модулирующее один или более конкретных иммунных путей). Согласно некоторым вариантам реализации в композициях и способах согласно настоящему изобретению могут применяться другие коктейли с другими липидными наночастицами, содержащими другие соединения, такие как зкДНК, кодирующая другой белок или другое соединение, такое как терапевтическое средство.

[00409] Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное соединение представляет собой иммуномодулирующий агент.Например, указанное дополнительное соединение представляет собой иммуносупрессор. Согласно некоторым вариантам реализации указанное дополнительное соединение является иммуностимулирующим.

[00410] Также согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанную липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

[00411] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен состав с липидными наночастицами, дополнительно содержащий одно или более фармацевтических вспомогательных веществ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный состав с липидными наночастицами дополнительно содержит сахарозу, Tris, трегалозу и/или глицин.

[00412] Как правило, липидные наночастицы согласно настоящему изобретению имеют средний диаметр, выбранный так, чтобы обеспечивать предполагаемый терапевтический эффект. Соответственно, согласно некоторым аспектам указанная липидная наночастица имеет средний диаметр от приблизительно 30 нм до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 нм до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм, чаще всего от приблизительно 85 нм до приблизительно 105 нм, и предпочтительно приблизительно 100 нм. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложены липидные частицы, относительный размер которых больше стандартных наночастиц и составляет приблизительно от 150 до 250 нм. Размер липидных наночастиц может быть определен методом квазиупругого рассеяния света с применением, например, системы Malvern Zetasizer Nano ZS (Малверн, Великобритания).

[00413] В зависимости от предполагаемого применения липидных частиц пропорции компонентов могут варьировать и эффективность доставки конкретного состава может быть измерена с применением, например, анализа параметра высвобождения эндосомы (ERP).

[00414] зкДНК может быть введена в состав комплекса с липидной частью частицы или инкапсулирована в положении липида в липидной наночастице. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК может быть полностью инкапсулирована в положении липида в липидной наночастице, что защищает ее от разложения нуклеазой, например, в водном растворе. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК в липидной наночастице по существу не разлагается после воздействия на указанную липидную наночастицу нуклеазой при 37°С в течение по меньшей мере приблизительно 20, 30, 45, или 60 минут. Согласно некоторым вариантам реализации указанная зкДНК в липидной наночастице по существу не разлагается после инкубации указанной частицы в сыворотке при 37°С в течение по меньшей мере приблизительно 30, 45 или 60 минут или по меньшей мере приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов.

[00415] Согласно некоторым вариантам реализации указанные липидные наночастицы по существу нетоксичны для субъекта, например, млекопитающего, такого как человек. [00416] Согласно некоторым аспектам указанный состав с липидными наночастицами представляет собой лиофилизированный порошок.

[00417] Согласно некоторым вариантам реализации липидные наночастицы представляют собой частицы с твердой сердцевиной, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Согласно другим вариантам реализации указанные липидные наночастицы имеют небислойную структуру, т.е., имеют неламеллярную (т.е., небислойную) морфологию. Без ограничений, небислойная морфология может включать, например, трехмерные трубки, стрежни, структуры с кубической симметрией и т.п. Неламеллярная морфология (т.е., небислойная структура) липидных частиц может быть определена с применением аналитических техник, известных и используемых специалистами в данной области техники. Такие техники включают, не ограничиваясь перечисленными, трансмиссионную криоэлектронную микроскопию («крио-ТЭМ»), дифференциальную сканирующую калориметрию («ДСК»), рентгеновскую дифракцию и т.п. Например, морфология указанных липидных наночастиц (ламеллярных или неламеллярных) может легко быть оценена и охарактеризована с применением, например, анализа крио-ТЭМ согласно описанию в US2010/0130588, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[00418] Согласно некоторым дополнительным вариантам реализации указанные липидные наночастицы с неламеллярной морфологией являются электронно-плотными.

[00419] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложена липидная наночастица с униламеллярной или мультиламеллярной структурой. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложен состав с липидными наночастицами, который содержит мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены.

[00420] Контролируя состав и содержание липидных компонентов, можно контролировать скорость, с которой липидный конъюгат высвобождается из липидной частицы, и, в свою очередь, скорость, с которой липидная наночастица становится фузогенной. Кроме того, другие параметры, включая, например, рН, температуру или ионную силу, могут применяться для изменения и/или контроля скорости, с которой липидная наночастица становится фузогенной. Другие способы, которые могут применяться для контроля скорости, с которой указанная липидная наночастица становится фузогенной, будут очевидны для специалистов в данной области техники после ознакомления с указанным описанием. Также очевидно, что можно контролировать размер липидных частиц путем контроля состава и концентрации липидного конъюгата.

[00421] рКа катионных липидов в составах может быть сопоставлена с эффективностью ЛНЧ для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (20 1 0), оба из которых полностью включены посредством ссылки в настоящий документ). Предпочтительный диапазон рКа от приблизительно 5 до приблизительно 7. рКа каждого катионного липида в липидных наночастицах определяют с применением анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS).

[00422] Инкапсуляция зкДНК в липидных частицах может быть определена путем проведения анализа методом исключения не проникающего через мембрану флуоресцентного красителя, в котором используют краситель, флуоресценция которого усиливается при связывании с нуклеиновой кислотой, например, анализ Oligreen^® или PicoGreen^®. Как правило, инкапсуляцию определяют путем добавления красителя к указанному составу с липидными частицами, измерения итоговой флуоресценции и сравнения с флуоресценцией, наблюдаемой при добавлении небольшого количества неионогенного детергента. Опосредованное детергентом разрушение липидного бислоя высвобождает инкапсулированную зкДНК, что позволяет ей взаимодействовать с не проникающим через мембрану красителем. Инкапсуляция зкДНК может быть рассчитана по формуле Е=(I₀-I)/I₀, где I и I₀ относится к интенсивности флуоресценции до и после добавления детергента.

VIII. Способы доставки зкДНК-векторов

[00423] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор может быть доставлен в целевую клетку in vitro или in vivo различными подходящими способами. Могут применяться или вводиться зкДНК-векторы по отдельности. зкДНК-векторы могут быть доставлены в клетку без помощи реагента для трансфекции или другого физического способа. Как вариант, зкДНК-векторы могут быть доставлены с применением любого известного в данной области техники реагента для трансфекции или другого известного в данной области техники физического способа, который облегчает вход ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, богатых полилизином соединений, богатых аргинином соединений, фосфата кальция, микровезикул, микроинъекции, электропорации и т.п.

[00424] Напротив, трансдукция бескапсидными AAV-векторами согласно описанию в настоящем документе может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые сложно трансдуцировать стандартными вирионами AAV с применением различных реагентов для доставки.

[00425] Согласно другому варианту реализации зкДНК-вектор вводят в ЦНС (например, в головной мозг или в глаз). Указанный зкДНК-вектор может быть введен в спинной мозг, ствол мозга (продолговатый мозг, мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, питуитарную железу, черную субстанцию, шишковидная железа), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, включая затылочные, височные, теменные и лобные доли, кору, базальные ганглии, гиппокамп и миндалину), лимбическую систему, новую кору, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик четверохолмия. Указанный зкДНК-вектор может также быть доставлен в другие области глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. Указанный зкДНК-вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, путем люмбальной пункции). Также указанный зкДНК-вектор может быть введен в ЦНС путем внутрисосудистого введения в ситуациях, когда гематоэнцефалический барьер нарушен (например, опухоль головного мозга или инфаркт головного мозга).

[00426] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может быть введен в требуемую область (области) ЦНС любым путем, известным в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленным, интратекальную, внутриглазную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит). интраназальную, внутриушную, внутриглазную (например, внутристекловидную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтенонову область) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой к двигательным нейронам.

[00427] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор вводят в виде жидкого состава путем прямой инъекции (например, стереотаксической инъекции) в требуемую область или компартмент ЦНС. В других вариантах реализации зкДНК-вектор может применяться путем местного нанесения на нужную область или путем интраназального введения аэрозольного состава. Введение в глаза может осуществляться путем местного внесения жидких капель. В качестве дополнительной альтернативы зкДНК-вектор может быть введен в виде твердого состава с замедленным высвобождением (см., например, патент США №7201898). Согласно дополнительным вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может быть использован для ретроградного транспорта для лечения, облегчения и/или предотвращения заболеваний и расстройств, связанных с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз (БАС); спинальная мышечная атрофия (СМА) и т.п.). Например, указанный зкДНК-вектор может быть доставлен в мышечную ткань, из которой он может мигрировать в нейроны.

IX. Дополнительные варианты применения зкДНК-векторов

[00428] Композиции и зкДНК-векторы согласно настоящему описанию можно использовать для доставки трансгена с различными целями. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели на трансгенных животных, несущих трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере указанный трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания модели заболевания на животных. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует один или более пептидов, полипептидов или белков, которые подходят для лечения, профилактики или облегчения болезненных состояний или расстройств у субъекта - млекопитающего. Указанный трансген может быть перенесен в организм субъекта (например, экспрессироваться у субъекта) в количестве, достаточном для лечения заболевания, ассоциированного с пониженной экспрессией, недостаточной экспрессией или дисфункцией гена. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген может быть перенесен в организм субъекта (например, экспрессироваться у субъекта) в количестве, достаточном для лечения заболевания, ассоциированного с повышенной экспрессией, активностью продукта гена или неадекватной стимулирующей регуляцией гена, который супрессирует или экспрессию которого снижает иным образом указанный трансген. Согласно некоторым вариантам реализации указанная трансген используют для нокаутирования эндогенного гена.

X. Способы применения

[00429] ЗкДНК-вектор согласно настоящему изобретению также можно использовать в способе доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности в целевую клетку. Указанный способ, в частности, может представлять собой способ доставки представляющего интерес терапевтического гена в клетку нуждающегося в этом субъекта. Настоящее изобретение позволяет осуществлять экспрессию in vivo полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого терапевтической экзогенной последовательностью ДНК в клетках субъекта таким образом, чтобы происходила экспрессия указанного полипептида, белка или олигонуклеотида на терапевтических уровнях. Указанные результаты наблюдаются как в in vivo, так и в in vitro режимах доставки зкДНК-вектора.

[00430] Способ доставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку субъекта может включать введение указанному субъекту зкДНК-вектора согласно настоящему изобретению, содержащего указанную представляющую интерес нуклеиновую кислоту. Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ доставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетку нуждающегося в этом субъекта, включающий многократное введение зкДНК-вектора согласно настоящему изобретению, содержащего указанную нуклеиновую представляющую интерес кислоту. Поскольку вектор кДНК согласно настоящему изобретению не индуцирует иммунного ответа, такую стратегию многократного введения не будет нарушать ответ иммунной системы хозяина против зкДНК-вектора согласно настоящему изобретению, в отличие от ситуации, которая наблюдается с заключенными в капсиды векторами.

[00431] Нуклеиновую кислоту (кислоты) зкДНК-вектора вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток нужной ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, внутривенный (например, в липосомном составе), прямую доставку в выбранный орган (например, внутрипортальную доставку в печень), внутримышечный и другие парентеральные пути введения. Пути введения могут быть скомбинированы, если требуется.

[00432] зкДНК-вектор не ограничен одним видом зкДНК-вектора. Следовательно, согласно другому аспекту несколько зкДНК-векторов, содержащих разные экзогенные последовательности ДНК, могут быть одновременно или последовательно доставлены в целевые клетку, ткань, орган или организм субъекта. Соответственно, указанная стратегия может обеспечивать экспрессию нескольких генов. Доставка также может осуществляться неоднократно и, что важно для генной терапии в клинических условиях, с последующим увеличением или снижением доз, учитывая отсутствие иммунного ответа хозяина против капсида благодаря отсутствию вирусного капсида.

[00433] Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом целевую клетку (в частности, в мышечную клетку или ткань) указанного субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя указанный зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Предложенный зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, подходящую для лечения заболевания. В частности, указанный зкДНК-вектор может содержать требуемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными, при введении субъекту, направлять транскрипцию требуемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого экзогенной последовательностью ДНК. Указанный зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как описано выше и в других разделах настоящего документа.

XI. Способы лечения

[00434] Описанная в настоящем документе технология также демонстрирует способы получения, а также способы применения раскрытых зкДНК-векторов разнообразными путями, включая, например, варианты применения, методы, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии ex situ, in vitro и in vivo.

[00435] Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом целевую клетку (например, мышечную клетку или ткань, или другой тип пораженных клеток) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя указанный зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Предложенный зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, подходящую для лечения заболевания. В частности, указанный зкДНК-вектор может содержать требуемую экзогенную последовательность ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию требуемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого указанной экзогенной последовательность ДНК при введении субъекту. Указанный зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как описано выше и в других разделах настоящего документа.

[00436] Любой трансген может быть доставлен с помощью зкДНК-векторов согласно описанию в настоящем документе. Трансгены, представляющие интерес, включают нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, РНКи, miR и т.п.), предпочтительно терапевтические (например, для медицинского, диагностического или ветеринарного применения) или иммуногенные (например, для вакцин) полипептиды.

[00437] Согласно некоторым вариантам реализации трансгены, которые требуется экспрессировать с помощью зкДНК-векторов, описанных в настоящем документе, экспрессируют или кодируют один или более полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, киРНК, РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов. антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую комбинацию перечисленного.

[00438] В частности, указанный трансген может кодировать один или более терапевтических агентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, например, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также варианты и/или активные фрагменты перечисленного, агонисты, антагонисты, миметики для применения при лечении, профилактике и/или облегчении одного или более симптомов заболевания, дисфункции, повреждения и/или расстройства. Согласно одному аспекту заболевание, дисфункция, травма, повреждение и/или расстройство представляет собой заболевание, дисфункцию, травму, повреждение и/или расстройство у человека.

[00439] Как отмечено в настоящем документе, указанный трансген может кодировать терапевтический белок или пептид, или последовательность терапевтический нуклеиновой кислоты или терапевтический агент, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, один или более агонистов, антагонистов, антиапоптотических факторов, ингибиторов, рецепторов, цитокинов, цитотоксинов, эритропоэтических агентов, гликопротеинов, факторов роста, рецепторов факторов роста, гормонов, рецепторов гормонов, интерферонов, интерлейкинов, рецепторов интерлейкина, факторов роста нервов, нейроактивных пептидов, рецепторов нейроактивных пептидов, протеаз, ингибиторов протеаз, протеиндекарбоксилаз, протеинкиназ, ингибиторов протеинкиназ, ферментов, связывающих рецепторы белков, транспортных белков или одного или более их ингибиторов, рецепторов серотонина или одного или более ингибиторов его поглощения, серпинов, рецепторов сер пинов, супрессоров опухоли, диагностических молекул, химиотерапевтических агентов, цитотоксинов, или любой комбинации перечисленного.

[00440] Согласно некоторым вариантам реализации трансген в экспрессионной кассете, экспрессионной конструкции или зкДНК-векторе, описанном в настоящим документе, может быть кодон-оптимизирован для клетки-хозяина. В настоящем документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация кодонов» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных, например, мыши или человека (например, гуманизированные последовательности), путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значимого числа кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах указанного позвоночного. У различных видов наблюдается конкретный систематический перевес определенных кодонов для конкретных аминокислот.Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность оригинального транслируемого белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с применением, например, платформы для оптимизации кодонов и индивидуализированного синтеза генов Gene Forge® от Aptagen (Aptagen, Inc.) или другой общедоступной базы данных.

[00441] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор экспрессирует трансген в рассматриваемой клетке-хозяине. Согласно некоторым вариантам реализации рассматриваемая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина человека, в том числе, например, клетки крови, стволовые клетки, гемопоэтические клетки, CD34⁺ клетки, клетки печени, раковые клетки, сосудистые клетки, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, клетки глаза или клетки сетчатки, эпителиальные или эндотелиальные клетки, дендритные клетки, фибробласты или любые другие клетки, происходящие из организма млекопитающего, включая, без ограничений, гепатоциты (т.е. клетки печени), клетки легкого, клетки сердца, клетки поджелудочной железы, клетки кишечника, диафрагмальные клетки, почечные клетки (т.е. клетки почек), нервные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, или любой одной или более выбранных тканей субъекта, у которого предусмотрено проведение генной терапии. Согласно одному аспекту рассматриваемая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина человека.

[00442] В настоящем документе раскрыты композиции и составы зкДНК-векторов, которые включают один или более зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми буферами, разбавителями или вспомогательными веществами. Такие композиции могут быть включены в один или более диагностических или терапевтических наборов для диагностики, предотвращения, лечения или облегчения одного или более симптомов заболевания, повреждения, расстройства, травмы или дисфункции. Согласно одному аспекту указанное заболевание, повреждение, расстройство, травма или дисфункция представляют собой заболевание, повреждение, расстройство, травму или дисфункцию у человека.

[00443] Другой аспект технологии, описанной в настоящем документе, предусматривает способ обеспечения нуждающегося в этом субъекта диагностически или терапевтически эффективным количеством зкДНК-вектора, причем указанный способ включает введение в клетку, ткань или орган нуждающегося в этом субъекта некоторого количества зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе в течение периода времени, обеспечивающего возможность экспрессии трансгена с зкДНК-вектора, с обеспечением таким образом субъекта диагностически или терапевтически эффективным количеством белка, пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессируемых указанным зкДНК-вектором. Согласно дополнительному аспекту указанный субъект представляет собой человека.

[00444] Согласно другому аспекту технологии, описанной в настоящем документе, предложен способ диагностики, предотвращения, лечения или облегчения по меньшей мере одного или более симптомов заболевания, расстройства, нарушения функции, повреждения, аномального состояния или травмы у субъекта. В общем и широком смысле указанный способ включает, по меньшей мере, этап введения нуждающемуся в этом субъекту одного или более раскрытых зкДНК-векторов, в количестве и в течение времени, достаточных для диагностики, предотвращения, лечения или облегчения одного или более симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, повреждения, аномального состояния или травмы у субъекта. Согласно дополнительному аспекту указанный субъект представляет собой человека.

[00445] Другой аспект представлен применением указанного зкДНК-вектора в качестве инструмента для лечения или снижения одного или более симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых известны дефектные гены, и которые, как правило, делят на два класса: состояния недостаточности, как правило, недостаточности ферментов, которые обычно наследуются по рецессивному типу, и состояния дисбаланса, в которые могут быть вовлечены регуляторные или структурные белки, и которые, как правило, но не всегда, наследуются по доминантному типу. В случае заболеваний с состояниями недостаточности зкДНК-векторы могут применяться для доставки трансгенов с целью введения нормального гена в пораженные ткани для заместительной терапии, а также, согласно некоторым вариантам реализации, для создания моделей заболевания на животных с применением антисмысловых мутаций. В случае болезненных состояний дисбаланса зкДНК-векторы могут применяться для создания болезненного состояния в модельной системе, которую впоследствии можно использовать в рамках борьбы с указанным болезненным состоянием. Соответственно, зкДНК-векторы и способы согласно описанию в настоящем документе позволяют лечить генетические заболевания. Согласно настоящему документу лечение болезненного состояния осуществляют путем частичного или полного устранения недостаточности или дисбаланса, которые вызывают заболевание или делают его более тяжелым.

[00446] В целом, зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе можно использовать для доставки любого трансгена для лечения, предотвращения или облегчения симптомов, ассоциированных с любым расстройством, связанным с генной экспрессией. Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, не ограничиваясь перечисленными: кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемию и другие расстройства системы крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический боковой склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболические дефекты, дегенеративные заболевания сетчатки глаза (и другие заболевания глаза), митохондриопатии (например, наследственную оптическую нейропатию Лебера (LHON), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, плече-лопаточно-лицевую миопатию (FSHD) и кардиомиопатии), заболевания цельных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца); и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы, описанные в настоящем документе, могут быть благоприятным образом использованы при лечении индивидуумов с метаболическими расстройствами (например, недостаточностью орнитинтранскарбамилазы).

[00447] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор, описанный в настоящем документе, может применяться для лечения, облегчения и/или предотвращения заболевания или расстройства, вызываемого мутацией в гене или генном продукте. Примеры заболеваний или расстройств, лечение которых может проводиться с применением указанных зкДНК-векторов, включают, не ограничиваясь перечисленными, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (ФКУ), болезнь накопления гликогена); болезни или расстройства цикла мочевины (например, недостаточность ор нитинтранскарбамилазы (ОТС)); заболевания или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическая лейкодистрофия (MLD), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Гунтера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (PFIC); заболевания или расстройства системы крови (например, гемофилию (А и В), талассемию и анемию); рак и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, кистозный фиброз).

[00448] В еще одном дополнительном аспекте зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может применяться для доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности в ситуациях, когда требуется регуляция уровня трансгенной экспрессии (например, экспрессии трансгенов, кодирующих гормоны или факторы роста, согласно описанию в настоящем документе). В одном из примеров указанный трансген может ингибировать путь, который контролирует экспрессию или активность целевого гена. В другом примере указанный трансген может усиливать активность пути, который контролирует экспрессию или активность целевого гена.

[00449] Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор, описанный в настоящем документе, может применяться для коррекции аномального уровня и/или функции генного продукта (например, отсутствия или дефекта белка), который приводит к заболеванию или расстройству. Указанный зкДНК-вектор может продуцировать функциональный белок и/или модифицировать уровни указанного белка для облегчения или снижения симптомов, возникающих в результате конкретного заболевания или расстройства, вызываемого отсутствием или дефектом белка или обеспечивать преимущество при указанном заболевании или расстройстве. Например, лечение недостаточности ОТС может осуществляться путем продуцирования функционального фермента ОТС; лечение гемофилии А и В может осуществляться путем модификации уровней фактора VIII, фактора IX и фактора X; лечение ФКУ может осуществляться путем модификации уровней фермента фенилаланингидроксилазы; лечение болезни Фабри или болезни Гоше может осуществляться путем продуцирования функциональной альфа-галактозидазы или бета-глюкоцереброзидазы, соответственно; лечение MLD или MPSII может осуществляться путем продуцирования функциональной арилсульфатазы А или идуронат-2-сульфатазы, соответственно; лечение кистозного фиброза может осуществляться путем продуцирования функционального регулятора трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе; лечение болезни накопления гликогена может осуществляться путем восстановления функции функционального фермента глкжозо-6-фосфатазы; и лечение PFIC может осуществляться путем получения функциональных генов АТР8В1, АВСВ11, АВСВ4 или TJP2.

[00450] Согласно альтернативным вариантам реализации зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут применяться для обеспечения клетки антисмысловой нуклеиновой кислотой in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой молекулу РНКи. экспрессия антисмысловой нуклеиновой кислоты или РНКи в целевой клетке снижает уровень экспрессии конкретного белка указанной клеткой. Соответственно, трансгены, представляющие собой молекулы РНКи или антисмысловые нуклеиновые кислоты, могут быть введены для снижения уровня экспрессии конкретного белка у нуждающегося в этом субъекта. Антисмысловые нуклеиновые кислоты также можно вводить в клетки in vitro для регуляции физиологии клеток, например, для оптимизации систем культивирования клеток или тканей.

[00451] Согласно некоторым вариантам реализации примеры трансгенов, кодируемых указанным зкДНК-вектором, включают, не ограничиваясь перечисленными: лизосомальные ферменты (например, гексозаминидазу А, ассоциированную с болезнью Тея-Сакса, или идуронатсульфатазу, ассоциированную с синдромом Гунтера /MPS II), эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу, глобин, лептин, каталазу, тирозингидроксилазу, а также цитокины (например, интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.п.), пептидные факторы роста и гормоны (например, соматотропин, инсулин, инсулиноподобный фактор роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста (ТФР), эпидермальный фактор роста ЭФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста нервов (ФРН), нейротрофические факторы 3 и 4, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), глиальный фактор роста (GDNF), трансформирующие факторы роста α и β, и т.п.), рецепторы (например, рецептор фактора некроза опухоли). В некоторых примерах вариантов реализации указанный трансген кодирует моноклональное антитело, специфическое в отношении одной или более требуемых мишеней. В некоторых примерах вариантов реализации указанный зкДНК-вектор кодирует более одного трансгена. В некоторых примерах вариантов реализации указанный трансген кодирует слитый белок, содержащий два разных представляющих интерес полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует антитело, в том числе полноразмерное антитело или фрагмент антитела согласно определению в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанное антитело представляет собой последовательность антигенсвязывающего домена или вариабельного домена иммуноглобулина согласно определению в настоящем документе. Другие иллюстративные примеры трансгенных последовательностей кодируют продукты генов суицида (тимидинкиназу, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром Р450, дезоксицитидинкиназу и фактор некроза опухоли), белки, предающие устойчивость к лекарственному средству, применяемому в противораковой терапии, и продукты генов-супрессоров опухолей.

[00452] Согласно репрезентативному варианту реализации экспрессируемый указанным зкДНК-вектором трансген может применяться для лечения мышечной дистрофии у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает: введение эффективного для лечения, облегчения или предотвращения количества зкДНК-вектора, описанного в настоящем документе, причем указанный зкДНК-вектор содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую дистрофии, минидистрофин, микродистрофин, пропептид миостатина, фоллистатин, растворимый рецептор активина II типа, ИФР-1, противовоспалительные полипептиды, такие как доминантный мутант I-каппа-В, саркоспан, утрофин, микродистрофин, ламинин-α2, α-саркогликан, β-саркогликан, γ-саркогликан, δ-саркогликан, ИФР-1, антитело или фрагмент антитела против миостатина или пропептида миостатина, и/или РНКи, направленная против миостатина. Согласно конкретным вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может быть введен в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу согласно описанию в тексте настоящего документа.

[00453] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может применяться для доставки трансгена в скелетную, сердечную или диафрагмальную мышцу, для продуцирования полипептида (например, фермента) или функциональной РНК (например, РНКи, микроРНК, антисмысловой РНК), которая в норме циркулирует в крови, или для системной доставки в другие ткани для лечения, облегчения и/или предотвращения расстройства (например, метаболического расстройства, такого как диабет (например, инсулина), гемофилии (например, VIII), а мукополисахаридозного расстройства (например, синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо А, В, С, D. синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами и т.п.) или расстройства лизосомального накопления (такого как болезнь Гоше [глюкоцереброзидаза], болезнь Помпе [лизосомальная кислая α-глюкозидаза] или болезнь Фабри [α-галактозидаза А]) или расстройства накопления гликогена (такого как болезнь Помпе [лизосомальная кислая α-глюкозидаза]). Другие подходящие белки для лечения, облегчения и/или предотвращения метаболических расстройств описаны выше.

[00454] Согласно другим вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может применяться для доставки трансгена в способе лечения, облегчения и/или предотвращения метаболического расстройства у нуждающегося в этом субъекта. Иллюстративные примеры метаболических расстройств и трансгенов, кодирующих полипептиды, описаны в настоящем документе. Необязательно, указанный полипептид секретируется (например, полипептид, который представляет собой секретируемый полипептид в естественном состоянии, или полипептид, сконструированный таким образом, чтобы обеспечить его секрецию, например, за счет достижения функциональной связи с секреторной сигнальной последовательностью, как известно специалистам в данной области техники).

[00455] Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения, облегчения и/или предотвращения врожденной сердечной недостаточности или заболевания периферических артерий (ЗПА) у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает введение зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе субъекту-млекопитающему, причем указанный зкДНК-вектор содержит трансген, кодирующий, например, Са²⁺-АТФазу саркоплазматического эндоретикулума (SERCA2a), ангиогенный фактор, ингибитор фосфатазы I (1-1), РНКи к фосфоламбану; фосфоламбановую ингибиторную или доминантно-негативную молекулу, такую как фосфоламбан S16E, белок с цинковыми пальцами, который регулирует ген фосфоламбана, β2- адренергический рецептор, бета-2-адренергическую рецепторную киназу (βARK), РI3-киназу, кальсаркан, ингибитор бета-адренергической рецепторной киназы (βARKct), ингибитор 1 протеинфосфатазы 1, S100A1, парвальбумин, аденилилциклазу типа 6, молекулу, которая осуществляет нокдаун сопряженной с G-белком рецепторной киназы типа 2, такую как усеченный конститутивно активный βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, калликреин, HIF, тимозин-β4, mir-1, mir-133, mir-206 и/или mir-208.

[00456] зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе могут быть введены в легкие субъекта любым подходящим способом, необязательно путем введения аэрозольной суспензии респирабельных частиц, содержащих зкДНК-векторы, которую указанный субъект вдыхает. Указанные респирабельные частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли из жидких частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут быть получены любыми подходящими способами. например, с применением пневматического аэрозольного небулайзера или ультразвукового небулайзера, как известно специалистам в данной области техники. См., например, патент США №4501729. Аэрозоли из твердых частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут сходным образом быть получены с помощью любого генератора медикаментозных аэрозолей из твердых частиц с применением методов, известных в области фармацевтики.

[00457] Согласно некоторым вариантам реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в ткани ЦНС (например, головной мозг, глаз). Согласно конкретным вариантам реализации зкДНК-векторы согласно описанию в настоящем документе можно вводить для лечения, облегчения или предотвращения заболеваний ЦНС, в том числе генетических расстройств, нейродегенеративных расстройств, расстройств психики и опухолей. Иллюстративные примеры заболеваний ЦНС включают, не ограничиваясь перечисленными, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, болезнь Лея, болезнь Рефсума, синдром Туретта, первичный боковой склероз, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь Пика, мышечную дистрофию, рассеянный склероз, тяжелую миастению, болезнь Бинсвангера, травму вследствие повреждения спинного мозга или головы, болезнь Тея-Сакса, болезнь Леша-Нихана, эпилепсию, церебральные инфаркты, психиатрические расстройства, в том числе расстройства настроения (например, депрессию, биполярное аффективное расстройство, устойчивое аффективное расстройство, вторичное расстройство настроения), шизофрению, лекарственную зависимость (например, алкоголизм и зависимость от других веществ), неврозы (например, тревожность, обсессивное расстройство, соматоформное расстройство, диссоциативное расстройство, переживание горя, послеродовую депрессию), психоз (например, галлюцинации и бред), деменцию, паранойю, синдром дефицита внимания, психосексуальные расстройства, нарушения сна, болевые расстройства, расстройства пищевого поведения или массы тела (например, ожирение, кахексия, нервная анорексия и булимия), а также раковые заболевания и опухоли ЦНС (например, опухоли гипофиза).

[00458] Глазные расстройства, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению, включают офтальмологические расстройства, затрагивающие сетчатку, задний путь и зрительный нерв (например, пигментный ретинит, диабетическую ретинопатию и другие дегенеративные заболевания сетчатки глаза, увеит, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому). Многие офтальмологические заболевания и расстройства ассоциированы с одним или более из трех типов признаков: (1) ангиогенез, (2) воспаление и (3) дегенерация. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе можно использовать для доставки антиангиогенных факторов; противовоспалительных факторов; факторов, которые замедляют дегенерацию клеток, способствуют сохранению клеток или способствуют росту клеток, и комбинаций вышеперечисленного. Диабетическая ретинопатия, например, характеризуется ангиогенезом. Лечение диабетической ретинопатии можно проводить путем доставки одного или более антиангиогенных факторов либо интраокулярно (например, в стекловидное тело), либо периокулярно (например, в область субтенонова пространства). Также могут быть доставлены совместно один или более нейротрофических факторов, либо интраокулярно (например, интравитреально), либо периокулярно. Дополнительные заболевания глаз, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению, включают географическую атрофию, сосудистую или «влажную» форму макулодистрофии, болезнь Штаргардта, врожденный амавроз Лебера (LCA), синдром Ушера, эластическую псевдоксантому (РХЕ), Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP), Х-сцепленное расслоение сетчатки (XLRS), хороидеремию, врожденную нейропатию зрительного нерва Лебера (НОНЛ), ахроматопсию, палочко-колбочковую дистрофию, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, диабетический макулярный отек; рак и опухоли глаз.

[00459] Согласно некоторым вариантам реализации с применением зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению можно лечить, облегчать или предотвращать воспалительные заболевания или расстройства глаз (например, увеит). Один или более противовоспалительных факторов могут экспрессироваться в результате интраокулярного введения (например, в камеру стекловидного тела или переднюю камеру) зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе. Согласно другим вариантам реализации можно лечить, облегчать или предотвращать с применением зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению заболевания или расстройства глаз, характеризующиеся дегенерацией сетчатки (например, пигментный ретинит). Для лечения таких связанных с дегенерацией сетчатки заболеваний можно применять внутриглазное (например, витреальное введение) зкДНК-вектора, описанного в настоящем документе, кодирующего один или более нейротрофических факторов. Согласно некоторым вариантам реализации с применением зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению можно лечить заболевания или расстройства, в которые вовлечены как ангиогенез, так и дегенерация сетчатки (например, возрастную макулярную дегенерацию). Лечение возрастной макулярной дегенерации может осуществляться путем интраокулярного введения (например, в стекловидное тело) зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе, кодирующего один или более нейротрофических факторов, и/или интраокулярного или периокулярного введения (например, в область субтенонова пространства) зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе, кодирующего один или более антиангиогенных факторов. Глаукома характеризуется повышенным глазным давлением и потерей ганглионарных клеток сетчатки. Варианты лечения глаукомы включают введение одного или более нейропротекторных агентов, которые защищают клетки от эксайтотоксичного повреждения, с применением зкДНК-вектор а согласно описанию в настоящем документе. Соответственно, такие агенты включают антагонисты N-метил-D-аспартата (NMDA), цитокины и нейротрофические факторы, которые могут быть доставлены интраокулярно, необязательно - интравитреально, с применением зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе.

[00460] Согласно другим вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе можно применять для лечения судорог, например, для снижения возникновения, частоты или тяжести судорог. Эффективность терапевтического лечения судорог может быть оценена на основании поведенческих признаков (например, дрожи, глазных или ротовых тиков) и/или электрографическими способами (большинство судорог характеризуются отличительными электрографическими аномалиями). Таким образом, зкДНК-вектор, описанный в настоящем документе, также можно применять для лечения эпилепсии, для которой характерны множественные припадки во временной перспективе. Согласно одному репрезентативному варианту реализации соматостатин (или его активный фрагмент) вводят в головной мозг с применением зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе для лечения опухоли гипофиза. В соответствии с указанным вариантом реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе, кодирующий соматостатин (или его активный фрагмент), вводят в гипофиз путем микроинфузии. Аналогичным образом, такое лечение можно применять для лечения акромегалии (аномальной секреции гормона роста гипофизом). Последовательности нуклеиновой кислоты (например, №доступа GenBank J00306) и последовательность аминокислот (например, №доступа GenBank Р01166; содержит процессированные активные пептиды соматостатин-28 и соматостатин-14) соматостатинов известны специалистам в данной области техники. Согласно конкретным вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может кодировать трансген, который содержит секреторный сигнал, согласно описанию в патенте США №7071172.

[00461] Другой аспект настоящего изобретения относится к применению зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе для получения антисмысловой РНК, РНКи или другой функциональной РНК (например, рибозима) для системной доставки субъекту in vivo. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может содержать трансген, который кодирует антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим (например, согласно описанию в патенте США №5877022), РНК, которые влияют на опосредованный сплайсосомой транс-сплайсинг (см. Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; патент США №6013487; патент США №6083702), интерферирующие РНК (РНКи), опосредующие сайленсинг генов (см. Sharp et al., (2000) Science 287:2431), или другие нетранслируемые РНК, такие как «гидовые» РНК (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; патент США №5869248, выданный Yuan с соавторами); и т.п.

[00462] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может дополнительно также содержать трансген, который кодирует репортерный полипептид (например, фермент, такой как зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза). Согласно некоторым вариантам реализации трансген, который кодирует репортерный белок, подходящий для экспериментальных или диагностических целей, выбирают из любого из следующих трансгенов: β-лактамазы, β-галактозидазы (LacZ), щелочной фосфатазы, тимидинкиназы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), люциферазы и других генов, хорошо известных в данной области техники. Согласно некоторым аспектам зкДНК-векторы, содержащие трансген, кодирующий репортерный полипептид, могут быть использованы в диагностических целях или в качестве маркеров активности зкДНК-вектора у субъекта, которому их вводят.

[00463] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может содержать трансген или гетерологичную нуклеотидную последовательность, который(ая) обладает гомологией в отношении локуса на хромосоме хозяина и рекомбинирует с ним. Указанный подход может быть использован для коррекции генетического дефекта в клетке-хозяине.

[00464] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может содержать трансген, который можно применять для экспрессии иммуногенного полипептида у субъекта, например, для вакцинации. Указанный трансген может кодировать любой представляющий интерес иммуноген, известный в данной области техники, включая, без ограничений, иммуногены вируса иммунодефицита человека, вируса гриппа, белки gag, опухолевые антигены, раковые антигены, бактериальные антигены, вирусные антигены и т.п.

XII. Введение

[00465] Согласно конкретным вариантам реализации может быть проведено более одного введения (например, два, три, четыре или более введений) для достижения желаемого уровня экспрессии гена на протяжении периода времени с интервалами различной продолжительности, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.п.

[00466] Примеры способов введения зкДНК-вектора, описанного в настоящем документе, включают пероральное, ректальное, трансмукозальное, интраназальное, ингаляционное (например, в аэрозоле), буккальное (например, сублингвальное), вагинальное, интратекальное, внутриглазное, чрескожное, интраэндотелиальное введение, введение in utero (или in ovo), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутричерепное, внутримышечное [в том числе введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу], внутриплевральное, интрацеребральное и внутрисуставное), местное (например, введение на поверхность кожи и слизистых оболочек, в том числе поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатическое введение и т.п., а также прямую инъекцию в ткань или орган (например, в печень, глаз, скелетную мышцу, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу или головной мозг).

[00467] Введение указанного зкДНК-вектора субъекту может осуществляться на любом участке, включая, без ограничений, участок, выбранный из группы, состоящей из головного мозга, скелетной мышцы, гладкой мышцы, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почки, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаза. Также может осуществляться введение зкДНК-вектора в опухоль (например, внутрь опухоли или лимфатического узла или рядом с ними). Наиболее подходящий путь в том или ином конкретном случае зависит от природы и тяжести состояния, лечение, облегчение и/или предотвращение которого проводят, и от природы конкретного используемого зкДНК-вектора. Кроме того, зкДНК позволяет вводить более одного трансгена в единственном векторе или в нескольких зк ДНК-вектор ах (например, в коктейле зкДНК).

[00468] Введение зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе в скелетные мышцы в соответствии с настоящим изобретением включает, без ограничений, введение в скелетные мышцы конечностей (например, плеча, предплечья, бедра и/или голени), спины, шеи, головы (например, языка), грудной клетки, брюшной полости, таза/промежности и/или пальцев. зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может быть доставлен в скелетные мышцы путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечности (необязательно, изолированной перфузии конечности, ноги и/или руки; см., например, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464) и/или прямой внутримышечной инъекции. Согласно конкретным вариантам реализации зкДНК-вектор, описанный в настоящем документе, вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД)) путем перфузии конечности, необязательно, изолированной перфузии конечности (например, путем внутривенного или внутрисуставного введения). Согласно вариантам реализации зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе можно вводить без использования «гидродинамических» методов.

[00469] Введение зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе в сердечную мышцу включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или перегородку. зкДНК-вектор согласно описанию в настоящем документе может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как интрааортальное введение, путем прямой инъекции в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или путем перфузии коронарной артерии. Введение в диафрагмальную мышцу может быть проведено любым подходящим способом, в том числе путем внутривенного введения, внутриартериального введения и/или внутрибрюшинного введения. Введение в гладкую мышцу может быть проведено любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. Согласно одному варианту реализации может быть проведено введение в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладких мышцах, возле и/или на них.

[00470] Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор в соответствии с данным изобретением вводят в скелетную мышцу, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или болезни сердца (например, ЗПА или застойной сердечной недостаточности).

А. Лечение ex vivo

[00471] Согласно некоторым вариантам реализации клетки извлекают из субъекта, вводят в них зкДНК-вектор, а затем возвращают в организм указанного субъекта. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo с последующим введением обратно в организм субъекта известны в данной области техники (см., например, патент США №5399346; содержание которого полностью включено в настоящий документ). Как вариант, зкДНК-вектор вводят в клетки, полученные от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и указанные клетки вводят нуждающемуся в этом субъекту.

[00472] Клетки, трансдуцированные зкДНК-вектором, предпочтительно вводят субъекту в «терапевтически эффективном количестве» в комбинации с фармацевтическим носителем. Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или обеспечивать исцеление, при условии, что для субъекта они в какой-то мере благоприятны.

[00473] Согласно некоторым вариантам реализации указанный зкДНК-вектор может кодировать трансген (иногда называемый гетерологичной нуклеотидной последовательностью), который представляет собой любой полипептид, который требуется продуцировать в клетке in vitro, ex vivo или in vivo. Например, в отличие от использования зкДНК-векторов в способе лечения согласно описанию в настоящем документе, согласно некоторым вариантам реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в культивированные клетки, и экспрессируемый генный продукт выделен из них, например, для получения антигенов или вакцин.

[00474] Указанные зкДНК-векторы могут применяться как в ветеринарии, так и в медицине. Подходящие субъекты для способов доставки генов ex vivo согласно описанию выше включают как птиц (например, кур, уток, гусей, перепелов, индеек и фазанов), так и млекопитающих (например, человека, крупный рогатый скот, овец, коз, лошадей, кошачьих, собачьих и зайцеобразных), и предпочтительными являются млекопитающие. Субъекты-люди являются наиболее предпочтительными. Субъекты-люди включают новорожденных, младенцев, детей и подростков, и взрослых людей.

[00475] Один аспект технологии, описанной в настоящем документе, относится к способу доставки трансгена в клетку. Как правило, в способах in vitro указанный зкДНК-вектор может быть введен в клетку с применением способов, раскрытых в настоящем документе, а также других способов, известных в данной области техники. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если указанный зкДНК-вектор вводят в клетку in vivo (например, субъекту), биологически эффективное количество указанного зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для обеспечения трансдукции и экспрессии указанного трансгена в целевой клетке.

В. Диапазоны доз

[00476] Необязательно могут быть использованы анализы in vivo и/или in vitro для определения оптимальных диапазонов дозировок для применения. Точная доза для использования в составе также зависит от пути введения и тяжести состояния и должна определяться на основании решения специалиста в данной области техники и с учетом обстоятельств каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых зависимости от дозы, полученных в тест-системах in vitro или в моделях на животных.

[00477] зкДНК-вектор вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток требуемой ткани и обеспечения достаточных уровней переноса генов и экспрессии без чрезмерных нежелательных явлений. Стандартные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, не ограничиваясь перечисленными, описанные ниже в разделе «Введение», такие как прямая доставка в выбранный орган (например, интрапортальная доставка в печень), пероральная доставка, ингаляция (в том числе интраназальная и внутритрахеальная доставка), интраокулярная внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриопухолевая доставка; и другие парентеральные пути введения. Пути введения могут быть скомбинированы, если требуется.

[00478] Доза количества зкДНК-вектора, необходимая для достижения определенного «терапевтического эффекта», будет варьировать в зависимости от нескольких факторов, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными: от пути введения нуклеиновой кислоты, уровня экспрессии гена или РНК, необходимого для достижения терапевтического эффекта, конкретного заболевания или расстройства, лечение которого проводят, и стабильности гена (генов), РНК-продукта (продуктов) или итогового экспрессируемого белка (белков). Специалист в данной области техники легко сможет определить диапазон доз зкДНК-вектора для лечения пациента, имеющего конкретное заболевание или расстройство, на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов, хорошо известных в данной области техники.

[00479] Режим дозирования может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, олигонуклеотид может вводиться неоднократно, например, ежедневно может вводиться несколько доз, или доза может быть пропорционально снижена с учетом диктуемой терапевтической ситуацией необходимости. Специалист в данной области техники сможет легко определить подходящие дозы и схемы введения олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению, как для введения в клетки, так и для введения субъектам.

[00480] «Терапевтически эффективная доза» находится в относительно широком диапазоне значений, который может быть определен в ходе клинических испытаний и зависит от конкретного применения (нервные клетки потребуют очень незначительных количеств, тогда как для системных инъекций потребуются значительные количества). Например, для прямой инъекции in vivo в скелетную или сердечную мышцу человека терапевтически эффективная доза будет составлять примерно 1 мкг - 100 г зкДНК-вектор а. Если для доставки зкДНК-вектора используют экзосомы или микрочастицы, то терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально, но ожидается, что она должна обеспечивать доставку от 1 мкг до примерно 100 г вектора.

[00481] Приготовление фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и растворов носителей хорошо известно специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения для применения конкретных композиций, описанных в данном документе, в различных схемах лечения.

[00482] Для трансфекции in vitro эффективное количество зкДНК-вектора, которое нужно доставить в клетки (1×10⁶ клеток), составляет порядка 0,1-100 мкг зкДНК-вектора, предпочтительно от 1 до 20 мкг, и более предпочтительно от 1 до 15 мкг, или от 8 до 10 мкг.Для зкДНК-векторов большего размера требуются более высокие дозы. Если используются экзосомы или микрочастицы, эффективная доза in vitro может быть определена экспериментально, однако она должна, в целом, обеспечивать доставку такого же количества зкДНК-вектора.

[00483] Лечение может включать введение одной дозы или нескольких доз. Согласно некоторым вариантам реализации субъекту может быть введено более одной дозы; фактически, дозы могут вводиться многократно по мере необходимости, поскольку зкДНК-вектор не вызывает у хозяина иммунного ответа против капсида ввиду отсутствия вирусного капсида. Следовательно, специалист в данной области может легко определить подходящее количество доз. Количество вводимых доз может составлять, например, примерно 1-100, предпочтительно 2-20 доз.

[00484] Без связи с какой-либо конкретной теорией отметим, что отсутствие типичного противовирусного иммунного ответа при введении зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе (т.е. отсутствие капсидных компонентов) позволяет вводить зкДНК-вектор хозяину неоднократно. Согласно некоторым вариантам реализации число введений гетерологичной нуклеиновой кислоты субъекту составляет от 2 до 10 раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-вектор доставляют субъекту более 10 раз.

[00485] Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в календарный день (например, за 24-часовой период). Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в 2, 3, 4, 5, 6, или 7 календарных дней. Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в календарную неделю (например, 7 календарных дней). Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза в две недели (например, один раз за период, равный двум календарным неделям). Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в календарный месяц (например, один раз в 30 календарных дней). Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в шесть календарных месяцев. Согласно некоторым вариантам реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в календарный год (например, за 365 дней или 366 дней в високосном году).

С.Единичные лекарственные формы

[00486] Согласно некоторым вариантам реализации указанные фармацевтические композиции могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма, как правило, адаптирована для одного или более конкретных путей введения фармацевтической композиции. Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма адаптирована для введения путем ингаляции. Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя.. Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. Согласно некоторым вариантам реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью генератора аэрозоля. Согласно некоторым вариантам реализации единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения, для буккального введения или для сублингвального введения. Согласно некоторым вариантам реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. Согласно некоторым вариантам реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция представлена составом для местного введения. Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, обычно представлено таким количеством указанного соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.

XIII. Различные варианты применения

[00487] зкДНК-векторы и композиции, описанные в данном документе, можно применять для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности терапевтической нуклеиновой кислоты) в клетку-хозяина. Согласно некоторым вариантам реализации зкДНК-векторы и композиций согласно описанию в настоящем документе можно применять для введения последовательности нуклеиновой кислоты (например, последовательности терапевтической нуклеиновой кислоты) в клетку-хозяина, при этом экспрессия указанной последовательности терапевтической нуклеиновой кислоты находится под контролем регулируемого переключателя. Согласно одному варианту реализации введение последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина с применением зкДНК-векторов согласно описанию в настоящем документе можно отслеживать с помощью подходящих биомаркеров от получающих лечение пациентов для оценки экспрессии гена.

[00488] Согласно некоторым вариантам реализации указанные зкДНК-векторы можно использовать множеством способов, включая, например, варианты применения, методы, диагностические процедуры и/или режимы генной терапии ex situ, in vitro и in vivo.

[00489] Согласно некоторым вариантам реализации композиции и зкДНК-векторы согласно настоящему изобретению можно использовать для доставки трансгена с различными целями, как описано выше. Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует белок или функциональную РНК, который(ая) предназначен(а) для применения в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, несущего трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере указанный трансген кодирует белок или функциональную РНК, который(ая) предназначен(а) для применения с целью создания модели заболевания на животных.

[00490] Согласно некоторым вариантам реализации указанный трансген кодирует один или более пептидов, полипептидов или белков, которые подходят для лечения, облегчения или предотвращения болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Указанный трансген может быть перенесен в организм пациента (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, ассоциированного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией указанного гена.

[00491] Согласно некоторым вариантам реализации предусмотрено применение указанных зкДНК-векторов в способах диагностики и скрининга, где трансген транзиентно или стабильно экспрессируют в системе культуры клеток или, как вариант, в модели на трансгенных животных.

[00492] Согласно другому аспекту описанная в настоящем документе технология обеспечивает способ трансдукции популяции клеток млекопитающих. В общем и широком смысле указанный способ включает, по меньшей мере, этап введения в одну или более клеток популяции композиции, которая содержит эффективное количество одной или более зкДНК согласно описанию в настоящем документе.

[00493] Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены композиции, а также терапевтические и/или диагностические наборы, которые включают один или более раскрытых зкДНК-векторов или одну или более раскрытых композиций зкДНК, в составах, полученных с использованием одного или более дополнительных ингредиентов, или подготовленных вместе с одной или более инструкциями по их применению.

[00494] Согласно некоторым вариантам реализации клетка для предполагаемого введения зкДНК-вектора согласно описанию в настоящем документе может представлять собой клетку любого типа, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, нервные клетки (включая клетки периферической и центральной нервной системы, в частности, клетки головного мозга), клетки легкого, клетки сетчатки, эпителиальные клетки (например, кишечные и респираторные эпителиальные клетки), мышечные клетки, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая островковые клетки), клетки печени, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, зародышевые клетки и т.п. Как вариант, указанная клетка может представлять собой любую клетку-предшественника. Согласно дополнительному варианту указанная клетка может представлять собой стволовую клетку (например, нервную стволовую клетку, стволовую клетку печени). Согласно еще одному дополнительному варианту клетка может представлять собой раковую или опухолевую клетку. Кроме того, указанные клетки могут происходить из любого вида, как указано выше.

ПРИМЕРЫ

[00495] Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения. ПРИМЕР 1: Конструирование зкДНК-векторов

[00496] Получение зкДНК-векторов с использованием матрицы полинуклеотидной конструкции описано в примере 1 из PCT/US18/49996. Например, матрица полинуклеотидной конструкции, используемая для получения зкДНК-векторов согласно настоящему изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус.Без ограничения теорией, в пермиссивной клетке-хозяине в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидной конструкции, содержащая два симметричных ITR и экспрессионную конструкцию, где по меньшей мере один из ITR модифицирован относительно последовательности ITR дикого типа, реплицируется с получением зкДНК-векторов. Получение зкДНК-вектора проходит в два этапа: во-первых, вырезание («спасение») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.п.) посредством белков Rep, и, во-вторых, опосредованная Rep репликация вырезанного зкДНК-вектора.

[00497] Примером способа получения зкДНК-векторов является зкДНК-плазмида согласно описанию в настоящем документе. На фиг.1А и 1В матрица полинуклеотидной конструкции каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ITR так и правый модифицированный ITR с расположенными между указанными ITR следующими последовательностями: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) посттранскрипционный элемент ответа (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA). Также между всеми компонентами были введены уникальные сайты распознавания рестрикционными эндонуклеазами (R1-R6) (показаны на фиг. 1А и фиг. 1В) для облегчения введения новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкции. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 7) и R4 (PacI) ТТААТТАА (SEQ ID NO: 542) встраивают в сайт клонирования для введения открытой рамки считывания трансгена. Указанные последовательности клонировали в плазмиду pFastBac НТ В, полученную от ThermoFisher Scientific.

[00498] Вкратце, ряд зкДНК-векторов получали из конструкций зкДНК-плазмид, показанных в таблице 7, используя способ, показанный на фиг. 5А-5С, и последовательности ITR, показанные в таблице 4. В таблице 7 указано количество соответствующих полинуклеотидных последовательностей для каждого компонента, включая последовательности, активные в качестве сайта белка репликации (RPS) (например, сайта связывания Rep) на любом конце промотора, функционально связанного с трансгеном. Номера в таблице 7 относятся к SEQ ID NO в настоящем документе, соответствующим последовательностям каждого компонента. Плазмиды из таблицы 7 были сконструированы с WPRE, содержащим SEQ ID NO: 8, за которым следует BGHpA, содержащий SEQ ID NO: 9 в нетранслируемой 3'-области между трансгеном и правым ITR.

[00499] Согласно другим вариантам реализации ряд зкДНК-векторов получали из конструкций зкДНК-плазмид, содержащих AAV2 5' и 3' WT-ITR с применением способа, представленного на фиг. 5А-5С. Согласно некоторым вариантам реализации конструкция для получения зкДНК-векторов содержит промотор, который представляет собой регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе, например, индуцируемый промотор.

Получение зкДНК-бакмид

[00500] Как показано на фиг. 5А, компетентные клетки DHlOBac (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher) трансформировали либо тестируемой, либо контрольной плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бакмиды отбирали путем скрининга с положительной селекцией на основе сине-белого скрининга в E.coli (маркер Ф80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG с антибиотиками для отбора трансформантов и поддержания бакмид и транспозазных плазмид. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, отбирали и культивировали в 10 мл среды.

[00501] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды выделяли из E.coli и трансфицировали ими клетки насекомых Sf9 или Sf21 с использованием FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Адгезивные клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах Т25 при 25°С.Через 4 дня культуральную среду (содержащую вирус Р0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, отделяя инфекционные бакуловирусные частицы от клеток или клеточного дебриса.

[00502] Необязательно, первое поколение бакуловируса (Р0) амплифицировали путем инфицирования необработанных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки поддерживали в суспензионных культурах в инкубаторе с орбитальным шейкером при 130 об/мин и 25°С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигнут диаметра 18-19 нм (в отличие от диаметра необработанных клеток, равного 14-15 нм) и плотности приблизительно 4,0Е+6 клеток/мл. Через 3-8 дней после инфицирования частицы бакуловируса Р1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

[00503] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкции, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. В частности, 4×20 мл культуры клеток Sf9 с плотностью 2,5Е+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000. 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27°С. Инфективность определяли ежедневно на протяжении 4-5 дней по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00504] Как показано на фиг. 5А, получали «Rep-плазмиду» согласно, например, фиг. 9А в экспрессионном векторе pFASTBAC™-Dual (ThermoFisher), содержащем как Rep78 (SEQ ID NO: 13) или Rep68 (SEQ ID NO: 12), так и Rep52 (SEQ ID NO: 14) или Rep40 (SEQ ID NO: 11).

[00505] Указанной Rep-плазмидой трансформировали компетентные клетки DHlOBac (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells (Thermo Fisher)), следуя предоставленному производителем протоколу. Индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для получения рекомбинантных бакмид («Rep-бакмиды»). Рекомбинантные бакмиды отбирали путем положительного отбора, который включал-сине-белый скрининг в Е. coli (маркер Ф80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селективной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне LB). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E.coli, и указанными Rep-бакмидами трансфицировали клетки насекомых Sf9 или S121 для получения инфекционного бакуловируса.

[00506] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дней и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (Р0) амплифицировали путем инфицирования необработанных клеток насекомых Sf9 или Sf21 и культивирования в 50-500 мл среды. Через 3-8 дней после инфицирования бакуловирусные частицы Р1 в среде собирали, отделяя клетки путем центрифугирования или фильтрации, или используя другой способ фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, 4×20 мл культуры клеток Sf9 с плотностью 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфективность определяли ежедневно на протяжении 4-5 дней по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

Получение и описание характеристик зкДНК-вектора

[00507] Как показано на фиг. 5В, затем культур ал ьную среду для клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, либо (2) Rep-бакуловирус, описанные выше, добавляли в свежую культуру клеток Sf9 (2,5Е+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25°С. Через 4-5 дней после коинфицирования детектировали диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности, составляющей приблизительно 70 80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и собирали клеточные осадки. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - либо воды, либо буфера. зкДНК-вектор выделяли из клеток и очищали с использованием протокола очищения Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, обработка 0,2 мг массы клеточного осадка на колонку).

[00508] Значения выхода для зкДНК-векторов, продуцированных и очищенных из клеток насекомых Sf9, первоначально определяли на основании поглощения в УФ-диапазоне при 260 нм.

[00509] Оценка зкДНК-векторов может быть проведена путем идентификации с применением электрофореза на агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, что иллюстрирует фиг. 5D, где (а) присутствие характеристических полос, мигрирующих как фрагменты вдвое большего размера на денатурирующих гелях по сравнению с нативными гелями после расщепления рестрикционной эндонуклеазой и гель-электрофоретического анализа, и (b) наличие полос мономера и димера (2×) на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала характерно для присутствия зкДНК-вектора.

[00510] Структуры выделенных зкДНК-векторов дополнительно анализировали путем расщепления ДНК, полученной из коинфицированных клеток Sf9 (согласно описанию в настоящем документе) рестрикционными эндонуклеазами, выбранными на основании а) присутствия только одного сайта разрезания в зкДНК-векторах, и b) получения итоговых фрагментов достаточно большого размера, чтобы они были четко видны при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 и.о.). Как продемонстрировано на фиг. 5D и 5Е. линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой можно различить по размеру продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., а зкДНК-вектор с непрерывной структурой фрагменты размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00511] Таким образом, для того, чтобы качественным образом продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ко валентно замкнутые концы, как требует их определение, образцы расщепляли рестрикционной эндонуклеазой, идентифицированной в контексте последовательности конкретного ДНК-вектора, как эндонуклеаза с одним сайтом рестрикции, предпочтительно, обеспечивающая образование двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза на денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК), линейная ДНК, не являющаяся ковалентно замкнутой, будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., в то время как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п. о. и 4000 п.о.), так как две цепи ДНК связаны, а после разворачивания будут иметь вдвое большую длину (хотя и будут одноцепочечными). Кроме того, при расщеплении мономерных, димерных и n-мерных форм ДНК-векторов все они будут разделяться на фрагменты одинаковых размеров из-за связанных между собой концов мультимерных ДНК-векторов (см. фиг. 5D).

[00512] В настоящем документе фраза «анализ для идентификации ДНК-векторов с помощью электрофореза на агарозном геле в условиях нативного и денатурирующего геля» относится к анализу для оценки наличия замкнутых концов зкДНК путем проведения расщепления рестрикционной эндонуклеазой с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Один пример такого анализа приведен ниже, хотя специалисту в данной области техники будет понятно, что возможно осуществление многих известных в данной области техники вариантов указанного примера. Рестрикционную эндонуклеазу выбирают таким образом, чтобы это был фермент, выполняющий единственный разрез представляющего интерес зкДНК-вектора с образованием продуктов, длина которых составляет приблизительно 1/3 × и 2/3 × длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем гелях. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очищения продуктов ПЦР от Qiagen или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25, являются примерами известных в данной области техники средств для расщепления эндонуклеазами. Указанный анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей рестрикционной эндонуклеазой (эндонуклеазами), 2) внесение, например, в набор для очищения продуктов ПЦР от Qiagen, элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10х денатурирующего раствора (10×=0,5 М NaOH, 10 мМ EDTA), добавление 10х не забуференного раствора красителя и проведение анализа вместе с лэддерами ДНК, полученными путем добавления 10х денатурирующего раствора к 4х, на 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ EDTA и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и проведение геля в присутствии 1х денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ EDTA). Специалисту в данной области техники будет понятно, какое напряжение следует использовать для проведения электрофореза в зависимости от размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели подсушивают и нейтрализуют в 1х ТВЕ или ТАЕ и переносят в дистиллированную воду или 1×ТВЕ/ТАЕ с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с применением красителя SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain от Thermo Fisher (концентрат 10 000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм).

[00513] Чистота полученного зкДНК-вектора может быть оценена с применением любого известного в данной области техники способа. Согласно одному неограничивающему примеру способа вклад зкДНК-плазмиды в общее поглощение УФ образцом может быть рассчитан путем сравнения интенсивности флуоресцентности зкДНК-вектора и стандарта. Например, если на основании поглощения УФ определено, что на гель загружено 4 мкг зкДНК-вектора, а интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. при известной массе 1 мкг, значит, масса зкДНК-вектора равна 1 мкг, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества поглощающего УФ материала. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому соответствует полоса например, если общее количество зкДНК-вектора соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность указанной полосы на графике будет соответствовать 25% от общего введенного количества, что в данном случае составит 0,25 мкг при введении 1,0 мкг. Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения стандартной кривой, рассчитывают количество для полосы зкДНК-вектора по уравнению линии регрессии, которое затем можно использовать для определения процента от общего введенного количества, представленного зкДНК-вектором, или процента чистоты.

Получение зкДНК-бакмид

[00514] Компетентные клетки DHlOBac (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher) трансформировали либо тестируемой, либо контрольной плазмидой в соответствии с протоколом из инструкций производителя. Индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид. Рекомбинантные бакмиды отбирали путем скрининга с положительным отбором на основе сине-белого скрининга в E.coli (маркер Ф80dlacZAM15 обеспечивает а-комплементацию гена α-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG с антибиотиками, для отбора трансформантов и поддержания бакмиды и транспозазных плазмид. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген бета-галактозида, собирали и культивировали в 10 мл среды.

[00515] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды выделяли из Е. coli и трансфицировали ими клетки насекомых Sf9 или Sf21 с применением FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Адгезивные клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах Т25 при 25°С. Через 4 дня культуральную среду (содержащую вирус Р0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, отделяя инфекционные бакуловирусные частицы от клеток или клеточного дебриса.

[00516] Необязательно, первое поколение бакуловируса (Р0) амплифицировали путем инфицирования необработанных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в инкубаторе с орбитальным шейкером при 130 об/мин и 25°С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигали диаметра 18-19 нм (в отличие от диаметра необработанных клеток, равного 14-15 нм) и плотности около 4,0Е+6 клеток/мл. Через 3-8 дней после инфицирования бакуловирусные частицы Р1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

[00517] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкции, собирали и определяли инфекционную активность, или титр бакуловируса. В частности, 4×20 мл культуры клеток Sf9 с плотностью 2,5Е+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25 27°С. Инфективность определяли ежедневно на протяжении 4-5 дней по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.

[00518] «Rep-плазмиду» продуцировали в экспрессионном векторе pFASTBAC™-Dual (ThermoFisher), содержащем как Rep78 или Rep68, так и Rep52 или Rep40. Указанной Rep-плазмидой трансформировали компетентные клетки DH10Bac (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells (Thermo Fisher)), согласно предоставленному производителем протоколу. Индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для получения рекомбинантных бакмид («Rep-бакмид»). Рекомбинантные бакмиды отбирали путем положительного отбора, который включал сине-белый скрининг в Е. coli (маркер Ф80dlacZΔM15 обеспечивает а-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селективной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне LB). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E.coli, и указанными Rep-бакмидами трансфицировали клетки насекомых Sf9 или Sf21 для продуцирования инфекционного бакуловируса.

[00519] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дня и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (Р0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых S19 или Sf21 и культивирования в 50-500 мл среды. Через 3-8 дней после инфицирования частицы бакуловируса Р1 в среде собирали либо путем разделения клеток с помощью центрифугирования, либо с помощью фильтрации, либо с применением другого способа фракционирования. Собирали Rep-бакуловирус и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, 4×20 мл культур клеток Sf9 при плотности 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфективность определяли ежедневно в течение 4-5 дней по скорости увеличения диаметра клетки и остановке клеточного цикла, а также изменения жизнеспособности клеток,.

ПРИМЕР 2: Получение синтетической зкДНК путем вырезания из двуцепочечной молекулы ДНК

[00520] Синтетическое получение зкДНК-векторов описано в примерах 2-6 международной заявки PCT/US19/14122, поданной 18 января 2019 г., которая включена в настоящий документ полностью посредством ссылки. Один из примеров способа получения зкДНК-вектора с применением синтетического метода включает вырезание двуцепочечной молекулы ДНК. Вкратце, зкДНК-вектор может быть получен с применением двуцепочечной конструкции ДНК, например, см. фиг. 7А-8Е из PCT/US19/14122. Согласно некоторым вариантам реализации указанная двуцепочечная конструкция ДНК представляет собой зкДНК-плазмиду, например, см. фиг. 6 в международной патентной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.).

[00521] Согласно некоторым вариантам реализации конструкция для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе.

[00522] Для целей наглядности в примере 1 описано получение зкДНК-векторов в качестве примера ДНК-векторов с замкнутыми концами, создаваемых с применением указанного способа. Тем не менее, хотя зкДНК-векторы описаны в этом примере для иллюстрации синтетических способов продуцирования in vitro с получением ДНК-вектора с замкнутыми концами путем вырезания двуцепочечного полинуклеотида, содержащего ITR и экспрессионную кассету (например, гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты), с последующим лигированием свободных 3'- и 5'-концов, согласно описанию в настоящем документе, специалисту в данной области техники известно, что, как показано выше, можно модифицировать двухцепочечную полинуклеотидную молекулу ДНК таким образом, чтобы получить любой требуемый ДНК-вектор с замкнутыми концами, включая, без ограничений, служебную ДНК, ДНК Doggybone™, гантелеобразную ДНК и т.п. Примеры зкДНК-векторов для получения трансгенов и терапевтических белков могут быть продуцированы с применением синтетического способа получения, описанного в примере 2.

[00523] Указанный способ включает (i) вырезание последовательности, кодирующей экспрессионную кассету, из двухцепочечной конструкции ДНК, и (ii) образование шпилечных структур в одном или более ITR; и (iii) соединение свободных 5'- и 3'-концов путем лигирования, например, с помощью ДНК-лигазы Т4.

[00524] Указанная двухцепочечная конструкция ДНК содержит, в направлении от 5' к 3'-концу: первый сайт рестрикции эндонуклеазой; 5' ITR; экспрессионную кассету; 3' ITR; и второй сайт рестрикции эндонуклеазой. Указанная двухцепочечная конструкция ДНК затем приводят в контакт с одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами для получения двухцепочечных разрывов в обоих сайтах рестрикции эндонуклеазой. На оба сайта может быть нацелена одна эндонуклеаза, или на каждый сайт может быть нацелена отдельная эндонуклеаза, при условии, что сайты рестрикции не входят в матрицу для зкДНК-вектора. В результате происходит вырезание последовательности между сайтами рестрикции эндонуклеазами из остальной части двухцепочечной конструкции ДНК (см. фиг. 9 из PCT/US19/14122). После лигирования образуется ДНК-вектор с замкнутыми концами.

[00525] Один или оба ITR, используемые в указанном способе, могут представлять собой ITR дикого типа. Также могут быть использованы модифицированные ITR, причем указанная модификация может включать делецию, инсерцию или замену одного или более нуклеотидов из ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо В и В' и/или плечо С и С (см., например, фиг. 6-8 и 10, фиг. 11В из PCT/US19/14122), и могут содержать две или более шпилечных петель (см., например, фиг. 6-8, фиг. 11В из PCT/US 19/14122) или единственную шпилечную петлю (см., например, фиг. 10А-10В, фиг. 11 В из PCT/US 19/14122). Модифицированный ITR со шпилечной петлей может быть получен путем генетической модификации существующего олигонуклеотида или путем биологического и/или химического синтеза de novo.

ПРИМЕР 3: Получение зкДНК путем конструирования олигонуклеотидов

[00526] Другой пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, который включает сборку различных олигонуклеотидов, представлен в примере 3 из PCT/US 19/14122, где зкДНК-вектор получают путем синтеза олигонуклеотида 5' и олигонуклеотида 3'-ITR и лигирования указанных олигонуклеотидов ITR с двуцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. На фиг. 11В из PCT/US 19/14122 представлен пример способа лигирования олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR с двуцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету.

[00527] Согласно некоторым вариантам реализации конструкция для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель, описанный в настоящем документе.

[00528] Олигонуклеотиды ITR могут содержать WT-ITR согласно описанию в настоящем документе или могут включать модифицированные ITR согласно описанию в настоящем документе. Модифицированные ITR могут включать делецию, инсерцию или замену одного или более нуклеотидов относительно ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо В и В' и/или плечо С и С. Олигонуклеотиды ITR содержащие WT-ITR или mod-ITR согласно описанию в настоящем документе, предназначенные для использования в бесклеточном синтезе, могут быть получены путем генетической модификации или биологического и/или химического синтеза. Как описано в настоящем документе, олигонуклеотиды ITR в примерах 2 и 3 могут содержать WT-ITR или модифицированные ITR (mod-ITR) в симметричных или асимметричных конфигурациях, согласно обсуждению в настоящем документе.

ПРИМЕР 4: Получение зкДНК с использованием одноцепочечной молекулы ДНК [00529] В другом примере способа продуцирования зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, представленного в примере 4 заявки PCT/US 19/14122, используют одно цепочечную линейную ДНК, содержащую два смысловых ITR которые фланкируют смысловую последовательность экспрессионной кассеты и ковалентно присоединены к двум антисмысловым ITR которые фланкируют антисмысловую экспрессионную кассету, а концы указанной одноцепочечной линейной ДНК затем лигируют с образованием одноцепочечной молекулы с замкнутыми концами. Один неограничивающий пример включает синтез и/или продуцирование молекулы одноцепочечной ДНК, отжиг частей указанной молекулы с образованием одной линейной молекулы ДНК, которая содержит одну или более областей вторичной структуры со спаренными основаниями, с последующим лигированием свободных 5'- и 3'-концов между собой с образованием замкнутой одноцепочечной молекулы.

[00530] Согласно некоторым вариантам реализации конструкция для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель согласно описанию в настоящем документе.

[00531] Олигонуклеотиды ITR могут содержать WT-ITR согласно описанию в настоящем документе, или могут содержать модифицированные ITR согласно описанию в настоящем документе.

[00532] Пример одноцепочечной молекулы ДНК для получения зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3'-концу: смысловой первый ITR; смысловую последовательность экспрессионной кассеты; смысловой второй ITR; антисмысловой второй ITR; антисмысловой последовательность экспрессионной кассеты; и антисмысловой первый ITR.

[00533] Одноцепочечная молекула ДНК для применения в иллюстративном способе из примера 4 может быть получена любым методом синтеза ДНК, описанным в настоящем документе. например, синтеза ДНК in vitro, или получена путем расщепления конструкции ДНК (например, плазмиды) нуклеазами и плавления полученных фрагментов дцДНК с получением фрагментов оцДНК.

[00534] Отжиг может осуществляться путем снижения температуры до уровня ниже рассчитанной температуры плавления пар смысловой и антисмысловой последовательностей. Температура плавления зависит от содержания конкретных нуклеиновых оснований и характеристик используемого раствора, например, от концентрации соли. Температуры плавления для любой определенной комбинации последовательности и раствора легко может рассчитать специалист в данной области техники.

[00535] Свободные 5' и 3'-концы отожженной молекулы могут быть лигированы друг с другом или лигированы со шпилечной молекулой с образованием зкДНК-вектора. Подходящие примеры методов лигирования и шпилечных молекул описаны в примерах 2 и 3.

ПРИМЕР 5: зкДНК-векторы экспрессируют трансген люциферазы in vitro

[00536] Конструкции получали путем введения открытой рамки считывания, кодирующей репортерный ген люциферазы, в сайт клонирования конструкций зкДНК-плазмиды: конструкция-15-30, (см. выше в таблице 7), или конструкций, содержащих AAV2 WT-ITR, включая кодирующую последовательность люциферазы. Клетки НЕK293 культивировали и трансфицировали 100 нг, 200 нг или 400 нг плазмидных конструкций 15 30, с применением FUGENE® (Promega Corp.) в качестве агента для трансфекции. Экспрессию люциферазы с каждой из плазмид определяли на основании люциферазной активности в каждой культуре клеток, подтверждающей, что люциферазная активность была результатом генной экспрессии с плазмид.

ПРИМЕР 6: Экспрессия трансгенного белка люциферазы in vivo с зкДНК-векторов.

[00537] In vivo экспрессию белка трансгена с зкДНК-векторов, продуцированных с конструкций, описанных выше, оценивали на мышах. зкДНК-векторы, полученные из конструкций зкДНК-плазмид, были протестированы и продемонстрировали продолжительную и устойчивую трансгенную экспрессию люциферазы в модели на мышах после гидродинамической инъекции конструкции зкДНК без липосом и повторного дозирования (на день 28), и долговечность (до дня 42) зкДНК экзогенной люциферазы светлячков. В других экспериментах экспрессию люциферазы из выбранных зкДНК-векторов оценивают in vivo, причем указанные зкДНК-векторы содержат трансген люциферазы и: i) модифицированный 5' ITR и симметричный модифицированный 3TTR выбранный из любой симметричной пары, представленной в таблице 4, или пары модифицированных ITR представленной на фиг. 7А-22 В; или ii) AAV2 5' WT-ITR и AAV2 3' WT-ITR.

[00538] In vivo экспрессию белка трансгена с зкДНК-векторов, продуцированных с конструкций с AAV2 WT-ITR согласно описанию выше, оценивают на мышах. зкДНК-вектор, полученный из конструкций зкДНК-плазмид, был протестирован и продемонстрировал продолжительную и устойчивую трансгенную экспрессию люциферазы в модели на мышах после гидродинамической инъекции конструкции зкДНК без липосом и повторного дозирования (на день 28) и долговечность (до дня 42) зкДНК экзогенной люциферазы светлячков. В других экспериментах экспрессию люциферазы из выбранных зк ДНК-векторов оценивают in vivo, причем указанные зкДНК-векторы содержат трансген люциферазы, AAV2 5' WT-ITR и AAV2 3'WT-ITR.

[00539] Экспрессия люциферазы in vivo: Самцам мышей CD-I IGS в возрасте 5-7 недель (Charles River Laboratories) вводят 0,35 мг/кг зкДНК-вектора, экспрессирующего люциферазу, в объеме 1,2 мл путем внутривенного (в/в) гидродинамического введения в хвостовую вену на день 0. Экспрессию люциферазы оценивают с помощью визуализации IVIS в дни 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 и 42. Вкратце, мышам внутрибрюшинной инъецируют 150 мг/кг субстрата люциферина, а затем оценивают люминесценцию всего тела с помощью визуализации IVIS®.

[00540] Визуализацию IVIS проводят на день 3, день 4, день 7, день 14, день 21, день 28, день 31, день 35 и день 42, и визуализируют собранные органы ex vivo после умерщвления на день 42.

[00541] На протяжении исследования животных ежедневно взвешивают и проводят мониторинг общего состояния здоровья и самочувствия. При умерщвлении кровь каждого животного собирают путем терминальной пункции сердца, разделяют на две части и обрабатывают для получения 1) плазмы и 2) сыворотки, причем плазму мгновенно замораживают, а сыворотку используют для панели анализов на ферменты печени, после чего мгновенно замораживают.Кроме того, собирают печень, селезенки, почки и паховые лимфатические узлы (LN) и визуализируют ex vivo с применением IVIS.

[00542] Экспрессию люциферазы в печени оценивают с применением набора для люциферазного ИФА-анализа MAXDISCOVERY® Luciferase ELISA assay (ВЮО Scientific/PerkinElmer), кПЦР на люциферазу образцов печени, гистопатологии образцов печени и/или панели анализов на ферменты печени в сыворотке (VetScanVS2; Abaxis Preventive Care Profile Plus).

ПРИМЕР 7: Образование и анализ WT/WT зкДНК

[00543] ITR дикого типа AAV типа II использовали для изучения образования зкДНК и способности экспрессировать кодируемый указанной зкДНК трансген. Конструирование вектора, анализ образования зкДНК и оценку трансгенной экспрессии зкДНК в культуре клеток человека подробнее описаны ниже.

Конструирование WT/WT ITR

[00544] Плазмиду с кассетой AAV ITR типа II дикого типа разрабатывали in silico и затем оценивали в клетках Sf9 насекомых. Указанная кассета содержала репортерный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) под управлением последовательности промотора р10 для экспрессии в клетках насекомых.

[00545] Суспензионные культуры Sf9 поддерживали на среде Sf900 III (Gibco) в вентилируемых флаконах для тканевых культур объемом 200 мл. Культуры пересевали каждые 48 часов и перед каждым пересевом измеряли количество клеток и показатели роста с помощью счетчика ViCell Counter (Beckman Coulter). Культуры поддерживали в условиях встряхивания (размах 1 секунда дуги, 130 об/мин) при 27°С.

[00546] зкДНК-векторы получали и конструировали согласно описанию в примере 1 выше. Вкратце, как показано на фиг. 4В, клетки Sf9, трансдуцированные плазмидной конструкцией, оставляли для адгезивного роста на 24 часа в стационарных условиях при 27°С. Через 24 часа трансфицированные клетки Sf9 инфицировали вектором Rep через инфицированные бакуловирусом клетки насекомых (ВIIС). ВIIС были предварительно проанализированы для определения характеристик инфективности и использовались в конечном разведении 1: 2000. ВIIС, разведенные 1:100 в среде для клеток насекомых Sf900, добавляли в каждую лунку с предварительно трансфицированными клетками. ВIIС без Rep-вектора добавляли в подгруппу лунок в качестве отрицательного контроля. Содержимое планшетом перемешивали путем аккуратного встряхивания на качалочной мешалке для планшетов в течение 2 минут. Затем клетки культивировали в течение дополнительных 48 часов при 27°С в стационарных условиях. Все экспериментальные и контрольные конструкции анализировали в трех повторностях.

[00547] Через 48 часов 96-луночный планшет вынимали из инкубатора, в течение непродолжительного времени уравновешивали до комнатной температуры и визуально исследовали на экспрессию GFP с применением флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные изображения и изображения в светлом поле захватывали при 40-кратном увеличении. Как и ожидалось, отрицательный контроль (образец, который обрабатывали в отсутствие содержащих бакуловирус с Rep клеток) не демонстрировал значимой экспрессии GFP. Устойчивая экспрессия GFP наблюдалась в образце вектора WT/WT ITR GFP, что указывает на успешную трансфекцию трансгеном, кодируемым зкДНК. Результаты представлены на фиг. 24А-24В. Как и ожидалось, отрицательный контроль (образец, который обрабатывали в отсутствие содержащих бакуловирус с Rep клеток) не демонстрировал значимой экспрессии GFP. Устойчивая экспрессия GFP наблюдалась в образце вектора дикого типа, что указывает на успешную трансфекцию трансгеном, кодируемым зкДНК, и его экспрессию.

Анализ образования зкДНК

[00548] Чтобы убедиться, что зкДНК, полученная в предыдущем исследовании, имела ожидаемую структуру с закрытыми концами, проводили эксперименты для получения достаточного количества зкДНК, которая впоследствии могла бы быть протестирована на надлежащую структуру. Вкратце, суспензионные культуры Sf9 трансфицировали ДНК WT/WT ITR. Культуры высевали с плотностью 1,25×10⁶ клеток/мл в культуральные флаконы Эрленмейера с ограниченным газообменом. Комплексы ДНК:липид для трансфекции получали с использованием реагента для трансфекции FuGene® в соответствии с инструкциями производителя. Готовили смеси комплексов и инкубировали таким же образом, как описано выше для анализа на планшетах, с увеличением объемов пропорционально количеству трансфицируемых клеток. Как и в случае анализа с репортерным геном, использовали соотношение 4,5:1 (объем реагента/масса ДНК). Параллельно с экспериментальными культурами готовили ложнотрансфицированные (только реагенты для трансфекции) и необработанные контрольные культуры. После добавления реагентов для трансфекции культуры оставляли для восстановления в течение 10-15 минут при комнатной температуре с легким вращением, после чего переносили в инкубатор со встряхиванием и температурой 27°С. После 24 часов инкубации при встряхивании проводили подсчет клеток и измеряли показатели роста для всех флаконов (экспериментальных и контрольных) с помощью счетчика ViCell (Beckman Coulter). Все флаконы (за исключением контроля роста) инфицировали ВIIС, содержащими Rep-вектор, в конечном разведении 1:5000. Также получали положительный контроль с использованием установленной процедуры двойного инфицирования ВИС для получения зкДНК. Для культуры с двойной инфекцией высевали количество клеток, равное среднему количеству жизнеспособных клеток во всех экспериментальных культурах. Контрольная культура с двойной инфекцией была инфицирована ВИС с Rep и репортерным геном в конечном разведении 1: 5000 для каждого образца, соответственно. После инфицирования культуры снова помещали в инкубатор в ранее описанные условия со встряхиванием. Количество клеток, показатели роста и жизнеспособности измеряли ежедневно для всех флаконов в течение 3 дней после инфицирования. Измерения в момент времени Т=0 проводили после того, как вновь инфицированным культурам давали возможность восстановиться в течение приблизительно 2 часов в условиях инкубации со встряхиванием. Через 3 дня клетки собирали посредством центрифугирования в течение 15 минут. Супернатант утилизировали, регистрировали массу осадка и замораживали осадок при -80°С до экстракции ДНК.

[00549] Предполагаемую неочищенную зкДНК экстрагировали из всех флаконов (экспериментальных и контрольных) с использованием набора для очищения Qiagen Plasmid Plus Midi Purification Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя для «высокого выхода». Количественное определение элюатов проводили с использованием данных измерения оптической плотности, полученных с помощью NanoDrop OneC (ThermoFisher). Полученные экстракты зкДНК хранили при 4°С.

[00550] Вышеописанные экстракты зкДНК проводили по нативному агарозному гелю (1% агароза, 1х буфер ТАЕ), приготовленному с использованием разведения SYBR Safe Gel Stain (ThermoFisher Scientific) 1: 10000, вместе с ДНК-лэддером на 1 кб Tracklt Plus DNA. Затем гель визуализировали с помощью Gbox Mini Imager в УФ/синем свете. Согласно приведенному ранее описанию, ожидается, что в образцах зкДНК, проводимых по нативным гелям, будет две первичных полосы: полоса, соответствующая примерно 4000 пар оснований, представляющая мономерное вещество, и полоса, соответствующая примерно 8000 пар оснований, соответствующая димерному веществу. Был протестирован образец дикого типа и он демонстрировал ожидаемые полосы мономера и димера на нативном агарозном геле. Результаты для репрезентативного образца указанных конструкций представлены на фиг.25. Предполагаемую неочищенную зкДНК и контрольные экстракты, полученные в малом масштабе, дополнительно анализировали с применением парного рестрикционного расщепления и денатурирующего агарозного геля для подтверждения двуцепочечной структуры ДНК, указывающей на зкДНК. Ожидается, что у зкДНК дикого типа имеется единственный сайт рестрикции Clal; поэтому, если она правильно сформирована, то образует два характерных фрагмента при расщеплении Clal. Высокоточную рестрикционную эндонуклеазу Clal (New England Biolabs) использовали для расщепления экстракта предполагаемой зкДНК в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты ложнотрансфицированных и контрольных культур не анализировали, поскольку спектрофотометрическое количественное определение с применением NanoDrop (ThermoFisher), а также анализ на нативном агарозном геле показал, что в элюатах отсутствуют детектируемый зкДНК/плазмидо-подобный продукт.Расщепленный материал очищали с применением набора для ПЦР Qiagen PCR Clean-up Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя, за исключением того, что очищенный расщепленный материал элюировали в воде без нуклеаз вместо буфера для элюирования от Qiagen. Щелочной агарозный гель (0,8% щелочная агароза) уравновешивали в буфере для уравновешивания (1 мМ EDTA, 200 мМ NaOH) в течение ночи при 4°С. 10х денатурирующий раствор (50 мМ NaOH, 1 мМ EDTA) добавляли к образцам очищенных расщепленных зкДНК и соответствующих нерасщепленных зкДНК (в общем сложности 1 мкг), и образцы нагревали при 65°С в течение 10 минут. 10х нагрузочный краситель (бромфеноловый синий, 50% глицерина) добавляли к каждому денатурированному образцу и перемешивали. Лэддер Plus DNA Tracklt 1 кб (ThermoFisher Scientific) также загружали на гель в качестве референсной ДНК. Прогон на геле проводили в течение ~ 18 часов при 4°С и постоянном напряжении (25 В) с последующим промыванием деионизированной Н₂О и нейтрализацией в буфере 1xTAE (Tris-ацетат, EDTA), рН 7,6, в течение 20 минут при аккуратном помешивании. Затем гель переносили в раствор 11x ТАЕ / 1x SYBR Gold примерно на 1 час при аккуратном помешивании. Затем гель визуализировали с помощью Gbox Mini Imager (Syngene) в УФ/синем свете. Ожидалось, что неразрезанные денатурированные образцы будут мигрировать на уровне примерно 9000 пар оснований, а образцы, обработанные ClaI -- давать две полосы, одну на уровне примерно 2000 пар оснований и другую на уровне примерно 6000 пар оснований.

[00551] Две значимых полосы были видны на каждой дорожке с обработанными ClaI образцами, мигрировавшими на денатурирующем геле с ожидаемыми размерами, что резко отличается от нерасщепленного образца, который мигрировал с ожидаемым размером примерно 9000 пар оснований. На фиг. 26 показаны результаты для репрезентативного образца, где видны две полосы со значениями выше фоновых для расщепленного образца, в отличие от единственной полосы, наблюдаемой в случае нерасщепленного образца. Соответственно, в указанном образце, по-видимому, корректно формировалась зкДНК.

Функциональная экспрессия в культуре клеток человека

[00552] Для оценки функциональности WT/WT ITR зкДНК, полученной в процессе мелкомасштабного производства, клетки НЕK293 трансфицируют образцами WT/WT зкДНК. Активно делящиеся клетки НЕК293 высевают в 96-луночные микротитрационные планшеты с плотностью 3×10⁶ клеток на лунку (80% конфлюэнтность) и инкубируют в течение 24 часов в ранее описанных условиях для адгезивных культур НЕK293. Через 24 часа проводят трансфекцию 200 нг неочищенной полученной в малом масштабе зкДНК с применением липофектамина (Invitrogen, ThermoFisher Scientific). Комплексы для трансфекции получают в соответствии с инструкциями производителя, и для трансфекции ранее высеянных клеток НЕK293 используют комплекс для трансфекции в общем объеме 10 мкл. Все экспериментальные конструкции и контроля анализируют в трех повторностях. Трансфицированные клетки инкубируют в описанных ранее условиях в течение 72 часов. Через 72 часа 96-луночный планшет извлекают из инкубатора и ненадолго оставляют для уравновешивания до комнатной температуры. Анализ на GFP экспрессию осуществляют согласно описанию выше. Суммарную люминесценцию определяют с помощью микропланшетного ридера SpectraMax М Series. Данные для повторностей усредняют. Экспрессия GFP в культуре клеток человека показывает, что зкДНК была корректно образована и экспрессирована для каждого образца в контексте клеток человека.

ПРИМЕР 8: «Прогонный» скрининг симметричных мутантов ITR

[00553] Проводили дополнительные анализы взаимосвязи структуры ITR с образованием зкДНК. Конструировали серию мутантов для изучения влияния специфических структурных изменений на образование зкДНК и способность экспрессировать кодируемый указанной зкДНК трансген. Конструирование мутантов, анализ образования зкДНК и оценку трансгенной экспрессии зкДНК в культуре клеток человека выполняли способами, аналогичными описанным выше.

Конструирование мутантных ITR [00554] Библиотеку из 16 плазмид с уникальными кассетами симметричных мутантных AAV ITR типа II разрабатывали in silico, а затем проводили оценку на клетках насекомых S19 и клетках эмбриональной почки человека (НЕК293). Каждая кассета ITR содержала репортерный ген либо люциферазы (LUC), либо зеленого флуоресцентного белка (GFP) под управлением последовательности промотора р 10 для экспрессии в клетках насекомых, и последовательности промотора CAG для экспрессии в клетках млекопитающих. Мутации в последовательность ITR создавали симметрично в правой и левой областях ITR. Библиотека содержала 16 правосторонних двойных мутантов согласно описанию в таблице 4 в настоящем документе; предсказанные структуры показаны на фиг. 7А-22В.

[00555] Суспензионные культуры Sf9 поддерживали на среде Sf900 III (Gibco) в вентилируемых флаконах для тканевых культур объемом 200 мл. Культуры пересевали каждые 48 часов и перед каждым пересевом измеряли количество клеток и показатели роста с помощью счетчика ViCell Counter (Beckman Coulter). Культуры поддерживали в условиях встряхивания (размах 1 секунда дуги, 130 об/мин) при 27°С. Адгезивные культуры клеток НЕK293 поддерживали в среде GlutiMax DMEM (модифицированной по Дульбекко среде Игла, Gibco) с 1% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% пенициллина-стрептомицина (PenStrep) в культуральных флаконах объемом 250 мл при 37°С с 5% СО₂. Культуры обрабатывали трипсином и пересевали каждые 96 часов. Для каждого пересева использовали разведение 1:10 из флакона с 90 100% конфлюэнтностью.

[00556] зкДНК-векторы получали и конструировали согласно описанию в примере 1 выше. Вкратце, как показано на фиг. 5В, клетки Sf9, трансдуцированные плазмидными конструкциями, оставляли для адгезивного роста в течение 24 часов в стационарных условиях при 27°С. Через 24 часа трансфицированные клетки Sf9 инфицировали Rep-вектором посредством инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (ВIIС). ВIIС предварительно анализировали для определения характеристик инфективности и использовали в итоговом разведении 1:2000. ВIIС в разведении 1:100 в среде для клеток насекомых Sf900 добавляли в каждую лунку с предварительно инфицированными клетками. ВIIС без Rep-вектора добавляли в подгруппу лунок в качестве отрицательного контроля. Содержимое планшетом перемешивали путем аккуратного встряхивания на качалочной мешалке для планшетов в течение 2 минут. Затем клетки культивировали в течение дополнительных 48 часов при 27°С в стационарных условиях. Все экспериментальные и контрольные конструкции анализировали в трех повторностях.

[00557] Через 48 часов 96-луночный планшет извлекали из инкубатора, оставляли на непродолжительное время для уравновешивания до комнатной температуры и анализировали экспрессию люциферазы (OneGlo Luciferase Assay (Promega Corporation)). Суммарную люминесценцию измеряли с применением микропланшетного ридера SpectraMax М Series. Данные для повторностей усредняли. Люциферазная активность для конструкций с симметричными мутантными ITR из таблицы 7 представлена на фиг. 23. Как и ожидалось, три отрицательных контрольных образца (только среда, ложная трансфекция без донорской ДНК, образец, который был обработан в отсутствие клеток с содержащим Rep бакуловирусом) демонстрировали отсутствие значимой экспрессии люциферазы. Устойчивая экспрессия люциферазы наблюдалась в каждом из мутантных образцов, что указывает на то, что для каждого образца трансфекция кодируемым зкДНК трансгеном была успешной и он экспрессировался независимо от мутации.

ПРИМЕР 9: Оценка In vivo экспрессии люциферазы с зкДНК-конструкции с симметричными мутантными ITR

Мыши CD-1 (N=30, самцы, возрастом приблизительно 4 недель) получали лечение различными типами зкДНК, продуцированными в Sf9, а также синтетическими способами, описанными выше. В частности, сравнивали экспрессию in vivo зкДНК-конструкции, содержащей мутантные ITR и с левой, и с правой стороны в симметричной конфигурации (Конструкция-388) (см. фиг. 27; левая панель) и зкДНК-конструкции, содержащей AAV ITR дикого типа и с левой, и с правой стороны (Конструкция-393) (см. фиг. 27; правая панель). Указанные конструкции продуцировали в клетках Sf9 согласно описанию выше и вводили в состав ЛНЧ. Кроме того, продуцированные в Sf9 зкДНК, содержащие асимметричную конфигурацию ITR AAV2ITR дикого типа с левой стороны и усеченный мутантный ITR с правой стороны конструкции, также вводили в состав ЛНЧ и использовали в качестве контроля. Кроме того, полученные синтетическим путем зкДНК содержащие либо симметричную, либо асимметричную конфигурацию ITR, также тестировали на уровни экспрессии.

Осмотр животных в клетках проводили ежедневно; клинические наблюдения осуществляли через 1, 6 и 24 часа после дозирования. Массу тела всех животных регистрировали в заданные точки времени (см. фиг. 28), зкДНК вводили в дозе 5 мл/кг на день 0 путем в/б введения через боковую хвостовую вену. Животные получали дозу люциферина 150 мг/кг (60 мг/мл) путем внутрибрюшинной (в/б) инъекции в объеме 2,5 мл/кг. В пределах 15 минут после введения люциферина у всех животных проводили визуализацию IVIS и измерения. Как показано на фиг. 28, процент изменения массы тела у животных, дозированных конструкцией-388, был аналогичен проценту у животных, получавших лечение конструкцией-393 на день 6 (фиг. 28). Результат измерений методом IVIS, который отражает уровни экспрессии люциферазы, представлен на фиг. 29А и фиг. 29В. Неожиданным образом, наблюдалась экспрессия in vivo зкДНК, содержащей мутантные ITR с левой и с правой стороны конструкции (т.е., конструкции-388), на уровнях, аналогичных уровням, наблюдаемым для конструкции зкДНК, содержащей AAV ITR дикого типа как с левой, так и с правой стороны конструкции (т.е., конструкции-393) (см. фиг. 29А и 29В). Указанные данные предполагают, что интактный ITR может не быть необходим для функциональных локализации и экспрессии зкДНК. Кроме того, синтетическая зкДНК, полученная бесклеточными способами, описанными в настоящем документе, также демонстрировала устойчивые уровни экспрессии, как и ожидалось (см. фиг. 29А).

ИСТОЧНИКИ

Все источники, перечисленные и раскрытые в настоящем описании и в примерах, в том числе патенты, патентные заявки, международные патентные заявки и публикации включены в настоящий документ полностью посредством ссылок.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕРЕЙШЕН БИО КО.

<120> МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), СОДЕРЖАЩАЯ

СИММЕТРИЧНЫЕ

МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ КОНЦЕВЫЕ ПОВТОРЫ

<130> 131698-05320

<140> PCT/US2019/060395

<141> 2019-11-08

<150> 62/757872

<151> 2018-11-09

<150> 62/757,892

<151> 2018-11-09

<160> 574

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 1

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag ctgcctgcag g

141

<210> 2

<211> 130

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 2

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg

130

<210> 3

<211> 1923

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 3

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta

60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc

120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg

180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc

240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat

300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc

360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga

420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg

480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg

540

cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta

600

attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg

660

gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg

720

cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg

780

aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg

840

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc

900

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt

960

ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc

1020

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc

1080

ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg

1140

aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag

1200

gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc

1260

tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg

1320

gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg

1380

ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc

1440

ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg

1500

taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct

1560

gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg

1620

aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc

1680

cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg

1740

ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc

1800

ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg

1860

acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag

1920

cca

1923

<210> 4

<211> 1272

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 4

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc

60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc

120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc

180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc

240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt

300

ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag

360

taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa

420

gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg

480

ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc

540

tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt

600

gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag

660

cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt

720

ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat

780

cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt

840

ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct

900

gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg

960

cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag

1020

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc

1080

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag

1140

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt

1200

tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac

1260

ctttggaact ga

1272

<210> 5

<211> 547

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 5

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactga

547

<210> 6

<211> 1179

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 6

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg

60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt

120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca

180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc

240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt

300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg

360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg

420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct

480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg

540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc

600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga

660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct

720

ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca

780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg

840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg

900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat

960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg

1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa

1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca

1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga

1179

<210> 7

<211> 8

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 7

gtttaaac

8

<210> 8

<211> 581

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 8

gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat

60

ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt

120

actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc

180

tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt

240

aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct

300

attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt

360

ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac

420

gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct

480

ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca

540

ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c

581

<210> 9

<211> 225

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 9

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct

60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc

225

<210> 10

<211> 213

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 10

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta

60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag

120

ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt

180

tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta

213

<210> 11

<211> 1260

<212> DNA/ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус - 2

<400> 11

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag

60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt

1200

taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga

1260

<210> 12

<211> 1932

<212> DNA/ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус - 2

<400> 12

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc

60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat

120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag

180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg

240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg

300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt

360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc

420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa

480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg

540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag

600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact

660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag

720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg

780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc

840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa

900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc

960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag

1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc

1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg

1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc

1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc

1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg

1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag

1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg

1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca

1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg

1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg

1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc

1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt

1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg

1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa

1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga

1920

cactctctct ga

1932

<210> 13

<211> 1876

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 13

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg

60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa

1876

<210> 14

<211> 1194

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 14

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag

60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa

1194

<210> 15

<211> 141

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 15

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt

60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t

141

<210> 16

<211> 556

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 16

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt

180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc

240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt

300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc

360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct

420

tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa

480

aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc

540

caacctttgg aactga

556

<210> 17

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 17

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 18

<211> 241

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 18

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag

60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga

120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat

180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga

240

c

241

<210> 19

<211> 215

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 19

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa

60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc

120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg

180

gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac

215

<210> 20

<211> 150

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 20

ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc

60

gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct

120

gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct

150

<210> 21

<211> 546

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 21

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactg

546

<210> 22

<211> 317

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 22

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt

60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca

120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa

180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag

240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag

300

gcctaggctt ttgcaaa

317

<210> 23

<211> 576

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 23

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa

60

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata

120

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag

180

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc

240

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta

300

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg

360

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt

420

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca

480

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag

540

gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag

576

<210> 24

<211> 1313

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 24

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga

60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc

120

atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg

180

gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg

240

tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt

300

agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg

360

gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc

420

gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg

480

ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc

540

tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct

600

gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta

660

aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc

720

gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg

780

aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc

840

tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca

900

ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg

960

gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct

1020

tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc

1080

gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt

1140

tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg

1200

aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt

1260

attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa

1313

<210> 25

<211> 19

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 25

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 26

<211> 19

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 26

Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly

<210> 27

<211> 7

<212> PRT/Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 27

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 28

<400> 28

000

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<400> 30

000

<210> 31

<400> 31

000

<210> 32

<400> 32

000

<210> 33

<400> 33

000

<210> 34

<400> 34

000

<210> 35

<400> 35

000

<210> 36

<400> 36

000

<210> 37

<400> 37

000

<210> 38

<400> 38

000

<210> 39

<400> 39

000

<210> 40

<400> 40

000

<210> 41

<400> 41

000

<210> 42

<400> 42

000

<210> 43

<400> 43

000

<210> 44

<400> 44

000

<210> 45

<211> 6

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 45

ggttga

6

<210> 46

<211> 4

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 46

agtt

4

<210> 47

<211> 6

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 47

ggttgg

6

<210> 48

<211> 6

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 48

agttgg

6

<210> 49

<211> 6

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 49

agttga

6

<210> 50

<211> 6

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 50

rrttrr

6

<210> 51

<211> 141

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 51

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t

141

<210> 52

<211> 130

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 52

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt

60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact

120

aggggttcct

130

<210> 53

<211> 3123

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 53

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc

60

cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg

120

gttcctgaac agagaaacag gagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc

180

ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc

240

tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc

300

ccgccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa

360

atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc

420

ttctgctccc cgagctctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga

480

gacgccatcc acgctgtttt gacttccata gaaggccgcc accatggaag acgccaaaaa

540

cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact

600

gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca

660

tatcgaggtg gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc

720

tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct

780

tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa

840

cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt

900

gttcgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat

960

ccaaaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac

1020

gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt

1080

cgatagggac aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa

1140

aggtgtcgct ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat

1200

ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg

1260

ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta

1320

tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct

1380

gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt

1440

atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc

1500

ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac

1560

atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt

1620

tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca

1680

aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga

1740

agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg

1800

ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg

1860

ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga

1920

cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt

1980

tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg ccagtcaagt

2040

aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac cgaaaggtct

2100

taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca agaagggcgg

2160

aaagatcgcc gtgtaagagc atcttaccgc catttattcc catatttgtt ctgtttttct

2220

tgatttgggt atacatttaa atgttaataa aacaaaatgg tggggcaatc atttacattt

2280

ttagggatat gtaattacta gttcaggtgt attgccacaa gacaaacatg ttaagaaact

2340

ttcccgttat ttacgctctg ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag

2400

attgactgat attcttaact atgttgctcc ttttacgctg tgtggatatg ctgctttata

2460

gcctctgtat ctagctattg cttcccgtac ggctttcgtt ttctcctcct tgtataaatc

2520

ctggttgctg tctcttttag aggagttgtg gcccgttgtc cgtcaacgtg gcgtggtgtg

2580

ctctgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcatt gccaccacct gtcaactcct

2640

ttctgggact ttcgctttcc ccctcccgat cgccacggca gaactcatcg ccgcctgcct

2700

tgcccgctgc tggacagggg ctaggttgct gggcactgat aattccgtgg tgttgtctgt

2760

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga

2820

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag

2880

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga

2940

agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcaggaaccc ctagtgatgg

3000

agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg

3060

cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc

3120

agg

3123

<210> 54

<211> 3117

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 54

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc

180

tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg

240

gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg

300

tccccagatg cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg

360

ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg

420

cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc

480

gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgactt ccatagaagg ccgccaccat

540

ggaagacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatccgctgg aagatggaac

600

cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg gaacaattgc

660

ttttacagat gcacatatcg aggtggacat cacttacgct gagtacttcg aaatgtccgt

720

tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa tcgtcgtatg

780

cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta tcggagttgc

840

agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta tgggcatttc

900

gcagcctacc gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga acgtgcaaaa

960

aaagctccca atcatccaaa aaattattat catggattct aaaacggatt accagggatt

1020

tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg aatacgattt

1080

tgtgccagag tccttcgata gggacaagac aattgcactg atcatgaact cctctggatc

1140

tactggtctg cctaaaggtg tcgctctgcc tcatagaact gcctgcgtga gattctcgca

1200

tgccagagat cctatttttg gcaatcaaat cattccggat actgcgattt taagtgttgt

1260

tccattccat cacggttttg gaatgtttac tacactcgga tatttgatat gtggatttcg

1320

agtcgtctta atgtatagat ttgaagaaga gctgtttctg aggagccttc aggattacaa

1380

gattcaaagt gcgctgctgg tgccaaccct attctccttc ttcgccaaaa gcactctgat

1440

tgacaaatac gatttatcta atttacacga aattgcttct ggtggcgctc ccctctctaa

1500

ggaagtcggg gaagcggttg ccaagaggtt ccatctgcca ggtatcaggc aaggatatgg

1560

gctcactgag actacatcag ctattctgat tacacccgag ggggatgata aaccgggcgc

1620

ggtcggtaaa gttgttccat tttttgaagc gaaggttgtg gatctggata ccgggaaaac

1680

gctgggcgtt aatcaaagag gcgaactgtg tgtgagaggt cctatgatta tgtccggtta

1740

tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc tacattctgg

1800

agacatagct tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc gttgaccgcc tgaagtctct

1860

gattaagtac aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg gaatccatct tgctccaaca

1920

ccccaacatc ttcgacgcag gtgtcgcagg tcttcccgac gatgacgccg gtgaacttcc

1980

cgccgccgtt gttgttttgg agcacggaaa gacgatgacg gaaaaagaga tcgtggatta

2040

cgtcgccagt caagtaacaa ccgcgaaaaa gttgcgcgga ggagttgtgt ttgtggacga

2100

agtaccgaaa ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa atcagagaga tcctcataaa

2160

ggccaagaag ggcggaaaga tcgccgtgta agagcatctt accgccattt attcccatat

2220

ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg

2280

caatcattta catttttagg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa

2340

acatgttaag aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta

2400

caaaatttgt gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg

2460

atatgctgct ttatagcctc tgtatctagc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc

2520

ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct tttagaggag ttgtggcccg ttgtccgtca

2580

acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac

2640

cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact

2700

catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc

2760

cgtggtgttg tctgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc

2820

ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc

2880

atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa

2940

gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcagg

3000

aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg

3060

cccgggaaac ccgggcgtgc gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg

3117

<210> 55

<400> 55

000

<210> 56

<400> 56

000

<210> 57

<211> 3912

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 57

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc

60

cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg

120

gttcctggct cagaggctca gaggcacaca ggagtttctg ggctcaccct gcccccttcc

180

aacccctcag ttcccatcct ccagcagctg tttgtgtgct gcctctgaag tccacactga

240

acaaacttca gcctactcat gtccctaaaa tgggcaaaca ttgcaagcag caaacagcaa

300

acacacagcc ctccctgcct gctgaccttg gagctggggc agaggtcaga gacctctctg

360

ggcccatgcc acctccaaca tccactcgac cccttggaat ttcggtggag aggagcagag

420

gttgtcctgg cgtggtttag gtagtgtgag agggtccggg ttcaaaacca cttgctgggt

480

ggggagtcgt cagtaagtgg ctatgccccg accccgaagc ctgtttcccc atctgtacaa

540

tggaaatgat aaagacgccc atctgatagg gtttttgtgg caaataaaca tttggttttt

600

ttgttttgtt ttgttttgtt ttttgagatg gaggtttgct ctgtcgccca ggctggagtg

660

cagtgacaca atctcatctc accacaacct tcccctgcct cagcctccca agtagctggg

720

attacaagca tgtgccacca cacctggcta attttctatt tttagtagag acgggtttct

780

ccatgttggt cagcctcagc ctcccaagta actgggatta caggcctgtg ccaccacacc

840

cggctaattt tttctatttt tgacagggac ggggtttcac catgttggtc aggctggtct

900

agaggtaccg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga

960

gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg

1020

gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg

1080

aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag

1140

ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca

1200

ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc

1260

cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgccgcca ccatggaaga

1320

cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg gaaccgctgg

1380

agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac

1440

agatgcacat atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt ccgttcggtt

1500

ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga

1560

aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc

1620

gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca tttcgcagcc

1680

taccgtggtg ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaagct

1740

cccaatcatc caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc

1800

gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg attttgtgcc

1860

agagtccttc gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg gatctactgg

1920

tctgcctaaa ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct cgcatgccag

1980

agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt

2040

ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt

2100

cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt acaagattca

2160

aagtgcgctg ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa

2220

atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct ctaaggaagt

2280

cggggaagcg gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat atgggctcac

2340

tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg

2400

taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga aaacgctggg

2460

cgttaatcaa agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg gttatgtaaa

2520

caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt ctggagacat

2580

agcttactgg gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt ctctgattaa

2640

gtacaaaggc tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc aacaccccaa

2700

catcttcgac gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc

2760

cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc

2820

cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc

2880

gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa

2940

gaagggcgga aagatcgccg tgtaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc

3000

tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca

3060

tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt

3120

taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat

3180

ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc

3240

tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt

3300

gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg

3360

cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg

3420

tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc

3480

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt

3540

gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt

3600

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca

3660

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga

3720

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg caggaacccc

3780

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac

3840

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca

3900

gctgcctgca gg

3912

<210> 58

<211> 3906

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 58

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc tggctcagag gctcagaggc acacaggagt ttctgggctc

180

accctgcccc cttccaaccc ctcagttccc atcctccagc agctgtttgt gtgctgcctc

240

tgaagtccac actgaacaaa cttcagccta ctcatgtccc taaaatgggc aaacattgca

300

agcagcaaac agcaaacaca cagccctccc tgcctgctga ccttggagct ggggcagagg

360

tcagagacct ctctgggccc atgccacctc caacatccac tcgacccctt ggaatttcgg

420

tggagaggag cagaggttgt cctggcgtgg tttaggtagt gtgagagggt ccgggttcaa

480

aaccacttgc tgggtgggga gtcgtcagta agtggctatg ccccgacccc gaagcctgtt

540

tccccatctg tacaatggaa atgataaaga cgcccatctg atagggtttt tgtggcaaat

600

aaacatttgg tttttttgtt ttgttttgtt ttgttttttg agatggaggt ttgctctgtc

660

gcccaggctg gagtgcagtg acacaatctc atctcaccac aaccttcccc tgcctcagcc

720

tcccaagtag ctgggattac aagcatgtgc caccacacct ggctaatttt ctatttttag

780

tagagacggg tttctccatg ttggtcagcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc

840

ctgtgccacc acacccggct aattttttct atttttgaca gggacggggt ttcaccatgt

900

tggtcaggct ggtctagagg taccggatct tgctaccagt ggaacagcca ctaaggattc

960

tgcagtgaga gcagagggcc agctaagtgg tactctccca gagactgtct gactcacgcc

1020

accccctcca ccttggacac aggacgctgt ggtttctgag ccaggtacaa tgactccttt

1080

cggtaagtgc agtggaagct gtacactgcc caggcaaagc gtccgggcag cgtaggcggg

1140

cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac

1200

cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac

1260

ggacgaggac agggccctgt ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtgc

1320

cgccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atccgctgga

1380

agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg

1440

aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc acttacgctg agtacttcga

1500

aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat

1560

cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat

1620

cggagttgca gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat

1680

gggcatttcg cagcctaccg tggtgttcgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa

1740

cgtgcaaaaa aagctcccaa tcatccaaaa aattattatc atggattcta aaacggatta

1800

ccagggattt cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga

1860

atacgatttt gtgccagagt ccttcgatag ggacaagaca attgcactga tcatgaactc

1920

ctctggatct actggtctgc ctaaaggtgt cgctctgcct catagaactg cctgcgtgag

1980

attctcgcat gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt

2040

aagtgttgtt ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg

2100

tggatttcga gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttctga ggagccttca

2160

ggattacaag attcaaagtg cgctgctggt gccaacccta ttctccttct tcgccaaaag

2220

cactctgatt gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg gtggcgctcc

2280

cctctctaag gaagtcgggg aagcggttgc caagaggttc catctgccag gtatcaggca

2340

aggatatggg ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa

2400

accgggcgcg gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac

2460

cgggaaaacg ctgggcgtta atcaaagagg cgaactgtgt gtgagaggtc ctatgattat

2520

gtccggttat gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct

2580

acattctgga gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatcg ttgaccgcct

2640

gaagtctctg attaagtaca aaggctatca ggtggctccc gctgaattgg aatccatctt

2700

gctccaacac cccaacatct tcgacgcagg tgtcgcaggt cttcccgacg atgacgccgg

2760

tgaacttccc gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat

2820

cgtggattac gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt

2880

tgtggacgaa gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat

2940

cctcataaag gccaagaagg gcggaaagat cgccgtgtaa gagcatctta ccgccattta

3000

ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat ttaaatgtta ataaaacaaa

3060

atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt actagttcag gtgtattgcc

3120

acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc tctgttcctg ttaatcaacc

3180

tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt aactatgttg ctccttttac

3240

gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct attgcttccc gtacggcttt

3300

cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt

3360

tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg

3420

cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac

3480

ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac

3540

tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc

3600

ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga

3660

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca

3720

ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc

3780

tatggcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca

3840

ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc

3900

tgcagg

3906

<210> 59

<400> 59

000

<210> 60

<400> 60

000

<210> 61

<400> 61

000

<210> 62

<400> 62

000

<210> 63

<211> 126

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 63

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc

60

cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg

120

gttcct

126

<210> 64

<211> 120

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 64

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgcccggga aacccgggcg tgcgcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg

120

<210> 65

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 65

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 66

<211> 141

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 66

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt

60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t

141

<210> 67

<211> 1876

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 67

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga

60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa

1876

<210> 68

<211> 129

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 68

atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc

60

gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca

120

tcgggcgcg

129

<210> 69

<211> 1203

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 69

gccgccacca tggagttggt gggctggctc gtggacaaag gcattacttc ggaaaagcag

60

tggattcagg aggatcaggc atcttacatc tcattcaacg ctgccagtaa ctcgaggtcc

120

cagatcaagg cagcgctgga caacgcggga aagattatga gtctgaccaa aactgctcca

180

gactacctcg ttggtcagca accggtggaa gatatctcca gcaacaggat ctacaagatt

240

ctggagctca acggctacga ccctcaatac gctgcctcag tgttcttggg ttgggccacc

300

aagaaattcg gcaagagaaa cactatctgg ctgttcggcc ccgctaccac tggaaagaca

360

aacatcgcag aagcgattgc tcacacggtg ccattctacg gctgcgtcaa ctggacaaac

420

gagaacttcc cgttcaacga ctgtgtcgat aagatggtta tctggtggga ggaaggaaag

480

atgacggcca aagtggtcga aagcgccaag gcaattctgg gtggctctaa agtgcgcgtc

540

gaccagaagt gcaaatcttc agctcaaatc gatcctaccc ccgttattgt gacatcaaac

600

acgaacatgt gtgccgtgat cgacggaaac agtacaacgt tcgaacacca gcaacctctc

660

caggatcgta tgttcaagtt cgagctcacc cgccgtttgg accatgattt cggcaaggtc

720

actaaacaag aggttaagga cttcttccgc tgggctaaag atcacgttgt ggaggttgaa

780

catgagttct acgtcaagaa aggaggtgct aagaaacgtc cagccccgtc ggacgcagat

840

atctccgaac ctaagagggt gagagagtcg gtcgcacagc caagcacttc tgacgcagaa

900

gcttccatta actacgcaga taggtaccaa aacaagtgca gcagacacgt gggtatgaac

960

ttgatgctgt tcccatgccg ccagtgtgag cgtatgaacc aaaactctaa catctgtttc

1020

acacatggcc agaaggactg cctcgaatgt ttccctgtgt cagagagtca gcccgtctca

1080

gtcgttaaga aagcttacca aaagttgtgc tacatccacc atattatggg taaagtccct

1140

gatgcctgta ccgcttgtga tctggtcaac gtggatttgg acgactgtat tttcgagcaa

1200

taa

1203

<210> 70

<211> 388

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 70

gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc

60

cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt

120

aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc

180

tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc

240

ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc

300

tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc

360

atccacgctg ttttgacttc catagaag

388

<210> 71

<211> 1662

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 71

gccgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg

60

gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct

120

ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc

180

gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga

240

atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt

300

atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt

360

atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg

420

aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat

480

taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat

540

gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac

600

tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg

660

agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt

720

ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata

780

tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt

840

caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa

900

agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct

960

cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg

1020

caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat

1080

aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat

1140

accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt

1200

atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg

1260

ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc

1320

ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc

1380

ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc

1440

ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag

1500

atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg

1560

tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag

1620

atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aa

1662

<210> 72

<211> 581

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 72

gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat

60

ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt

120

actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc

180

tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt

240

aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct

300

attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt

360

ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac

420

gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct

480

ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca

540

ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c

581

<210> 73

<211> 225

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 73

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct

60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc

225

<210> 74

<211> 1177

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 74

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc

60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac

120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac

180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca

240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc

300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag

360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa

420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt

480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga

540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca

600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt

660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta

720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt

780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca

840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca

900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg

960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg

1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca

1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc

1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt

1177

<210> 75

<400> 75

000

<210> 76

<400> 76

000

<210> 77

<400> 77

000

<210> 78

<400> 78

000

<210> 79

<400> 79

000

<210> 80

<400> 80

000

<210> 81

<400> 81

000

<210> 82

<400> 82

000

<210> 83

<400> 83

000

<210> 84

<400> 84

000

<210> 85

<400> 85

000

<210> 86

<400> 86

000

<210> 87

<400> 87

000

<210> 88

<400> 88

000

<210> 89

<400> 89

000

<210> 90

<400> 90

000

<210> 91

<400> 91

000

<210> 92

<400> 92

000

<210> 93

<400> 93

000

<210> 94

<400> 94

000

<210> 95

<211> 122

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 95

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 96

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 96

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

aagcgagcgc gc

72

<210> 97

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 97

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 98

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 98

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 99

<211> 122

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 99

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 100

<211> 130

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 100

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg

130

<210> 101

<211> 70

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 101

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga

60

gcgagcgcgc

70

<210> 102

<211> 70

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 102

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga

60

gcgagcgcgc

70

<210> 103

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 103

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 104

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 104

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 105

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 105

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 106

<211> 72

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 106

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 107

<211> 83

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 107

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 108

<211> 83

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 108

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 109

<211> 77

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 109

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag

60

tgagcgagcg agcgcgc

77

<210> 110

<211> 77

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 110

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag

60

tgagcgagcg agcgcgc

77

<210> 111

<211> 51

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 111

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

51

<210> 112

<211> 51

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 112

gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

51

<210> 113

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 113

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 114

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 114

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 115

<211> 77

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 115

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgc

77

<210> 116

<211> 79

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 116

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 117

<211> 89

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 117

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc

60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 118

<211> 89

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 118

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc

60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 119

<211> 87

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 119

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc

60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 120

<211> 87

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 120

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg

60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 121

<211> 85

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 121

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 122

<211> 85

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 122

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 123

<211> 89

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 123

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc

60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 124

<211> 89

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 124

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc

60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 125

<211> 87

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 125

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc

60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 126

<211> 87

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 126

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg

60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 127

<211> 85

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 127

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 128

<211> 85

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 128

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 129

<211> 83

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 129

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 130

<211> 83

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 130

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 131

<211> 81

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 131

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc

60

tcagtgagcg agcgagcgcg c

81

<210> 132

<211> 81

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 132

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc

60

tcagtgagcg agcgagcgcg c

81

<210> 133

<211> 79

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 133

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 134

<211> 79

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 134

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 135

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 135

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagcc cgggctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 136

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 136

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 137

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 137

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac cggtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 138

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 138

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgca cgtgcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 139

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 139

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 140

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 140

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac cggtctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 141

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 141

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca cgtgtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 142

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 142

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 143

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 143

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca cgtgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 144

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 144

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc cgggttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 145

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 145

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagcc atggctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 146

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 146

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaac cggttggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 147

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 147

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc atggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 148

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 148

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 149

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 149

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgca attgcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 150

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 150

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac cggtttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 151

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 151

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa cgttctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 152

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 152

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 153

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 153

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa cgtttggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 154

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 154

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa atttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 155

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 155

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 156

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 156

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc atggttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 157

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 157

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaac atgttggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 158

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 158

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac atgtctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 159

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 159

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca attgtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 160

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 160

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa cgttttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 161

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 161

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac atgtttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 162

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 162

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaca attgttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 163

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 163

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa atttctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 164

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 164

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa attttggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 165

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 165

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa atttttgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 166

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 166

gcgcgctcgc tcgctcgctg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 167

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 167

gcgcgctcgc tcgctcaatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 168

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 168

gcgcgctcgc tcgctcaccg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cggtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 169

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 169

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 170

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 170

gcgcgctcgc tcgctcactg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 171

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 171

gcgcgctcgc tcgctcactg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 172

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 172

gcgcgctcgc tcgctcactg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 173

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 173

gcgcgctcgc tcgctcgatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 174

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 174

gcgcgctcgc tcgctcgcgg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 175

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 175

gcgcgctcgc tcgctcgcta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 176

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 176

gcgcgctcgc tcgctcgctg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

cagcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 177

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 177

gcgcgctcgc tcgctcgctg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

cagcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 178

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 178

gcgcgctcgc tcgctcgctg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct

60

cagcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 179

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 179

gcgcgctcgc tcgctcgagg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 180

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 180

gcgcgctcgc tcgctcgata aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tatcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 181

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 181

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 182

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 182

gcgcgctcgc tcgctcgatg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 183

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 183

gcgcgctcgc tcgctcgatg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 184

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 184

gcgcgctcgc tcgctcgaga aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 185

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 185

gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 186

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 186

gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 187

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 187

gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 188

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 188

gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 189

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 189

gcgcgctcgc tcgctcgagg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct

60

cctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 190

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 190

gcgcgctcgc tcgctcgaga gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 191

<400> 191

000

<210> 192

<400> 192

000

<210> 193

<400> 193

000

<210> 194

<400> 194

000

<210> 195

<400> 195

000

<210> 196

<400> 196

000

<210> 197

<400> 197

000

<210> 198

<400> 198

000

<210> 199

<400> 199

000

<210> 200

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 200

gcgcgctcgc tcgctcgaga aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 201

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 201

gcgcgctcgc tcgctcgaga agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 202

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 202

gcgcgctcgc tcgctcgaga gagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 203

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 203

gcgcgctcgc tcgctcgaga ggaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtcc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 204

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 204

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 205

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 205

gcgcgctcgc tcgctcaaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tcttgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 206

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 206

gcgcgctcgc tcgctcacga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tcgtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 207

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 207

gcgcgctcgc tcgctcacta gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 208

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 208

gcgcgctcgc tcgctcactg gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 209

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 209

gcgcgctcgc tcgctcactg aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 210

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 210

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 211

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 211

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 212

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 212

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 213

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 213

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgagcg accaaaggtc gctcgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 214

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 214

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggacg accaaaggtc gtccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 215

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 215

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggag accaaaggtc tcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 216

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 216

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca accaaaggtt gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 217

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 217

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 218

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 218

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aacaaagttc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 219

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 219

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 220

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 220

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaagcg accaaaggtc gcttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 221

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 221

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaacg accaaaggtc gtttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 222

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 222

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 223

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 223

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa accaaaggtt ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 224

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 224

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gccaaaggct ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 225

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 225

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gacaaagtct ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 226

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 226

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gaaaaattct ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 227

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 227

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 228

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 228

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaaa aaaaaatttt tttcgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 229

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 229

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggaaa gaaaaattct ttccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 230

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 230

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggaa gaaaaattct tcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 231

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 231

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 232

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 232

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gaaaaattcc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 233

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 233

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaaaatttc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 234

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 234

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 235

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 235

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 236

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 236

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 237

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 237

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 238

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 238

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 239

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 239

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 240

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 240

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 241

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 241

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 242

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 242

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 243

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 243

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 244

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 244

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 245

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 245

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 246

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 246

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 247

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 247

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 248

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 248

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 249

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 249

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 250

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 250

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 251

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 251

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 252

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 252

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 253

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 253

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 254

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 254

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 255

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 255

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 256

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 256

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 257

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 257

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 258

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 258

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 259

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 259

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 260

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 260

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 261

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 261

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 262

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 262

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 263

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 263

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 264

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 264

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 265

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 265

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 266

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 266

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 267

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 267

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 268

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 268

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 269

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 269

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 270

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 270

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 271

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 271

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 272

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 272

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 273

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 273

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 274

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 274

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 275

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 275

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 276

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 276

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 277

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 277

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 278

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 278

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 279

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 279

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 280

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 280

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 281

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 281

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 282

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 282

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 283

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 283

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 284

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 284

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 285

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 285

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 286

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 286

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 287

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 287

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 288

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 288

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 289

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 289

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 290

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 290

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 291

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 291

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 292

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 292

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 293

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 293

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 294

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 294

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 295

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 295

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 296

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 296

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 297

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 297

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 298

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 298

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 299

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 299

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 300

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 300

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 301

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 301

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 302

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 302

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 303

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 303

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 304

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 304

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 305

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 305

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 306

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 306

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 307

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 307

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 308

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 308

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 309

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 309

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 310

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 310

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 311

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 311

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 312

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 312

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 313

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 313

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 314

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 314

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 315

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 315

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 316

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 316

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 317

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 317

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 318

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 318

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 319

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 319

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 320

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 320

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 321

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 321

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 322

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 322

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 323

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 323

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 324

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 324

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 325

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 325

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 326

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 326

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 327

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 327

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 328

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 328

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 329

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 329

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 330

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 330

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 331

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 331

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 332

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 332

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 333

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 333

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 334

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 334

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 335

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 335

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 336

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 336

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 337

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 337

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 338

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 338

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 339

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 339

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 340

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 340

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 341

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 341

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 342

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 342

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 343

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 343

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 344

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 344

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 345

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 345

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 346

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 346

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 347

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 347

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 348

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 348

gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct

60

tagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 349

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 349

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 350

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 350

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 351

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 351

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 352

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 352

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 353

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 353

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 354

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 354

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 355

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 355

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 356

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 356

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 357

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 357

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 358

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 358

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 359

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 359

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 360

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 360

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 361

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 361

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 362

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 362

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 363

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 363

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 364

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 364

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 365

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 365

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 366

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 366

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 367

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 367

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 368

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 368

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 369

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 369

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 370

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 370

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 371

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 371

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 372

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 372

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 373

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 373

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 374

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 374

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 375

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 375

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 376

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 376

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 377

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 377

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 378

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 378

gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct

60

catcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 379

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 379

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 380

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 380

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 381

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 381

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 382

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 382

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 383

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 383

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 384

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 384

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 385

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 385

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 386

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 386

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 387

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 387

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 388

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 388

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 389

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 389

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 390

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 390

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 391

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 391

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 392

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 392

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 393

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 393

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 394

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 394

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 395

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 395

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 396

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 396

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 397

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 397

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 398

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 398

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 399

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 399

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 400

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 400

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 401

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 401

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 402

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 402

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 403

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 403

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 404

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 404

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 405

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 405

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 406

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 406

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 407

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 407

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 408

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 408

gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgttc

60

tctcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 409

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 409

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 410

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 410

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 411

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 411

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 412

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 412

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 413

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 413

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 414

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 414

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 415

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 415

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 416

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 416

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 417

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 417

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 418

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 418

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 419

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 419

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 420

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 420

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 421

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 421

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 422

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 422

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 423

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 423

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 424

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 424

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 425

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 425

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 426

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 426

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 427

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 427

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 428

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 428

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 429

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 429

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 430

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 430

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 431

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 431

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 432

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 432

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 433

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 433

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 434

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 434

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 435

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 435

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 436

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 436

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 437

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 437

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 438

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 438

gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgccc

60

ccgcgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 439

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 439

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 440

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 440

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 441

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 441

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 442

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 442

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 443

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 443

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 444

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 444

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 445

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 445

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 446

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 446

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 447

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 447

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 448

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 448

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 449

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 449

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 450

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 450

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 451

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 451

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 452

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 452

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 453

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 453

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 454

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 454

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 455

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 455

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 456

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 456

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 457

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 457

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 458

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 458

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 459

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 459

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 460

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 460

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 461

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 461

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 462

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 462

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 463

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 463

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 464

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 464

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 465

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 465

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 466

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 466

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 467

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 467

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 468

<211> 80

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 468

gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgttt

60

tattgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 469

<211> 120

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 469

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg

120

<210> 470

<211> 122

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 470

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 471

<211> 129

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 471

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg

129

<210> 472

<211> 101

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 472

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g

101

<210> 473

<211> 139

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 473

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg

139

<210> 474

<211> 137

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 474

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg

137

<210> 475

<211> 135

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 475

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg

135

<210> 476

<211> 133

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 476

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg

133

<210> 477

<211> 139

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 477

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg

139

<210> 478

<211> 137

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 478

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg

137

<210> 479

<211> 135

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 479

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg

135

<210> 480

<211> 133

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 480

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg

133

<210> 481

<211> 131

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 481

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag

120

ctgcctgcag g

131

<210> 482

<211> 129

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 482

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg

129

<210> 483

<211> 127

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 483

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc

120

ctgcagg

127

<210> 484

<211> 120

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 484

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct

120

<210> 485

<211> 122

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 485

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct

122

<210> 486

<211> 122

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 486

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct

122

<210> 487

<211> 129

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 487

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg

60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct

129

<210> 488

<211> 101

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 488

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc

60

gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t

101

<210> 489

<211> 139

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 489

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct

139

<210> 490

<211> 137

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 490

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct

137

<210> 491

<211> 135

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 491

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct

135

<210> 492

<211> 133

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 492

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct

133

<210> 493

<211> 139

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 493

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg

60

gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct

139

<210> 494

<211> 137

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 494

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc

60

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct

137

<210> 495

<211> 135

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 495

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga

60

cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct

135

<210> 496

<211> 133

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 496

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc

60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct

133

<210> 497

<211> 131

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 497

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt

60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac

120

taggggttcc t

131

<210> 498

<211> 129

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 498

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg

60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct

129

<210> 499

<211> 127

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 499

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt

60

cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg

120

ggttcct

127

<210> 500

<211> 43

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 500

gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc

43

<210> 501

<211> 28

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 501

cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc

28

<210> 502

<211> 28

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 502

gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg

28

<210> 503

<211> 22

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 503

cgtgcgggcc caaagggccc gc

22

<210> 504

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 504

cgggcgacca aaggtcgccc g

21

<210> 505

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 505

cgcccgggct ttgcccgggc

20

<210> 506

<211> 42

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 506

cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc

42

<210> 507

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 507

cgggcgacca aaggtcgccc g

21

<210> 508

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 508

cgcccgggct ttgcccgggc

20

<210> 509

<211> 34

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 509

cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggc

34

<210> 510

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 510

cgggcgacca aaggtcgccc g

21

<210> 511

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 511

cgcccgggct ttgcccgggc

20

<210> 512

<211> 30

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 512

cggggcccga cgcccgggct ttgcccgggc

30

<210> 513

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 513

cgggcgacca aaggtcgccc g

21

<210> 514

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 514

cgcccgggct ttgcccgggc

20

<210> 515

<211> 29

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 515

cgggcccgac gcccgggctt tgcccgggc

29

<210> 516

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 516

cgggcgacca aaggtcgccc g

21

<210> 517

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 517

cgcccgggct ttgcccgggc

20

<210> 518

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 518

gcccgggcaa agcccgggcg

20

<210> 519

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 519

cgggcgacct ttggtcgccc g

21

<210> 520

<211> 42

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 520

gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg

42

<210> 521

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 521

gcccgggcaa agcccgggcg

20

<210> 522

<211> 31

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 522

gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g

31

<210> 523

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 523

gcccgggcaa agcccgggcg

20

<210> 524

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 524

cgggcgacct ttggtcgccc g

21

<210> 525

<211> 34

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 525

gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg

34

<210> 526

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 526

gcccgggcaa agcccgggcg

20

<210> 527

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 527

cgggcgacct ttggtcgccc g

21

<210> 528

<211> 31

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 528

gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g

31

<210> 529

<211> 21

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 529

cgggcgacct ttggtcgccc g

21

<210> 530

<211> 1653

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 530

atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc

60

tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt

120

ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg

180

tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag

240

caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc

300

cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc

360

cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg

420

atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct

480

tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc

540

aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag

600

agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc

660

ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag

720

ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc

780

cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac

840

atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac

900

tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat

960

cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt

1020

gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata

1080

ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac

1140

ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt

1200

gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct

1260

cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag

1320

cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg

1380

attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg

1440

agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact

1500

gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg

1560

gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa

1620

ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga

1653

<210> 531

<211> 16

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 531

gcgcgctcgc tcgctc

16

<210> 532

<211> 8

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 532

actgaggc

8

<210> 533

<211> 22

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 533

cgggcgacca aaggtcgccc ga

22

<210> 534

<211> 10

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 534

cgcccgggcg

10

<210> 535

<211> 8

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 535

gcctcagt

8

<210> 536

<211> 16

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 536

gagcgagcga gcgcgc

16

<210> 537

<211> 20

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

олигонуклеотид

<400> 537

gcccgggcaa agcccgggcg

20

<210> 538

<211> 165

<212> DNA/ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 538

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct

165

<210> 539