НЕВИРУСНЫЕ ДНК-ВЕКТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ И СЛИТЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2023 года по МПК A61K39/395 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно §119(e) Раздела 35 Свода законов США на основании предварительной заявки США № 62/630670, поданной 14 февраля 2018 г., предварительной заявки США № 62/680087, поданной 4 июня 2018 г., предварительной заявки США № 62/630676, поданной 14 февраля 2018 г., и предварительной заявки США № 62/680092, поданной 4 июня 2018 г., содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Данная заявка включает перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная ASCII-копия, созданная 13 февраля 2019 г., имеет название 080170-091100-WOPT_SL.txt и размер 128788 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Данное изобретение относится к области генной терапии, включая невирусные векторы для экспрессии трансгена или выделенных полинуклеотидов у субъекта или в клетке. Данное изобретение также относится к конструктам нуклеиновых кислот, промоторам, векторам и клеткам-хозяевам, которые содержат полинуклеотиды, а также к способам доставки экзогенных последовательностей ДНК в целевую клетку, ткань, орган или организм. Например, данное изобретение предусматривает способы использования невирусных ДНК-векторов для экспрессии антител, таких как терапевтические антитела, из клетки. Данное изобретение также обеспечивает способы использования невирусных ДНК-векторов для экспрессии слитых белков, таких как терапевтические слитые белки, из клетки. Способы и композиции можно применять, например, для коммерческого продуцирования антител или слитых белков, или с целью лечения заболевания путем экспрессии терапевтического антитела или слитого белка в клетке или ткани субъекта, нуждающегося в этом.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Целью генной терапии является улучшение клинических исходов для пациентов, страдающих генетическими мутациями или приобретенными заболеваниями, вызываемыми аберрациями в профиле генной экспрессии. Генная терапия включает лечение или предотвращение медицинских состояний, вызываемых дефектными генами или аномальной регуляцией или экспрессией, например, недостаточной экспрессией или избыточной экспрессией, которые могут привести к расстройству, заболеванию, злокачественному новообразованию и т.д. Например, заболевание или расстройство, вызываемое дефектным геном. можно лечить, предотвращать или облегчать путем доставки пациенту корректирующего генетического материала, или можно лечить, предотвращать или облегчать путем изменения или подавления у пациента дефектного гена, например, с помощью корректирующего генетического материала, приводящего к терапевтической экспрессии генетического материала в организме пациента.

[0005] Основой генной терапии является введение транскрипционной кассеты с активным генным продуктом (иногда называемым трансгеном), который, например, может приводить к положительному эффекту усиления функции, отрицательному эффекту потери функции, или другому исходу. Такие результаты можно объяснить экспрессией активирующего антитела или слитого белка или ингибирующего (нейтрализующего) антитела или слитого белка. Генная терапия может также использоваться для лечения заболевания или злокачественного новообразования, вызванных другими факторами. Моногенные расстройства человека можно лечить путем доставки и экспрессии нормального гена в клетки-мишени. Доставка и экспрессия корректирующего гена в клетках-мишенях пациента могут осуществляться многочисленными методами, включая использование вирусов, полученных методами генной инженерии, и вирусных векторов доставки генов. Среди множества доступных векторов вирусного происхождения (например, рекомбинантного ретровируса, рекомбинантного лентивируса, рекомбинантного аденовируса и т.п.), рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рААВ) набирает популярность в качестве универсального вектора для генной терапии.

[0006] Аденоассоциированные вирусы (ААВ) принадлежат к семейству Parvoviridae и, более конкретно, составляют род депендопарвовирусов. Векторы, полученные из ААВ (т.е. рекомбинантные ААВ (рААВ) или ААВ-векторы), являются привлекательным способом доставки генетического материала, потому что (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр неделящихся и делящихся клеточных типов, включая миоциты и нейроны; (ii) они лишены вирусных структурных генов, тем самым уменьшая ответы клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например, опосредованные интерфероном ответы; (iii) вирусы дикого типа считаются непатологичными для человека; (iv) в отличие от ААВ дикого типа, который способен интегрироваться в геном клетки-хозяина, дефектные по репликации ААВ-векторы лишены гена rep и обычно персистируют в виде эписом, что ограничивает риск инсерционного мутагенеза или генотоксичности; и (v) по сравнению с другими векторными системами, ААВ-векторы, как правило, считаются относительно слабыми иммуногенами и, следовательно, не вызывают значимого иммунного ответа (см. ii), обеспечивая, таким образом, персистенцию векторной ДНК и, потенциально, долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов.

[0007] Однако применение частиц AAV в качестве вектора для доставки генов имеет ряд серьезных недостатков. Одним из основных недостатков, связанных с рААВ, является ограниченная емкость вирусной упаковки, составляющая примерно 4,5 т.п.о. гетерологичной ДНК (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010), вследствие чего использование ААВ-векторов ограничено способностью кодирования белков менее 150000 Да. Вторым недостатком является то, что в результате распространенности инфекции ААВ дикого типа среди населения, кандидаты на генную терапию рААВ должны проходить скрининг на наличие нейтрализующих антител, элиминирующих вектор из организма пациента. Третий недостаток связан с иммуногенностью капсида, которая предотвращает повторное введение пациентам, не исключенным из первичного лечения. Иммунная система пациента может реагировать на вектор, который эффективно действует в качестве «бустерного» агента, стимулируя иммунную систему, генерирующую высокие титры антител против ААВ, что исключает лечение в будущем. Некоторые недавние сообщения указывают на проблемы с иммуногенностью в ситуациях с использованием высоких доз. Другой заметный недостаток заключается в относительно медленном начале ААВ-опосредованной генной экспрессии, учитывая, что одноцепочечная ДНК ААВ должна быть преобразована в двухцепочечную ДНК до экспрессии гетерологичного гена.

[0008] Кроме того, обычные вирионы ААВ с капсидами получают путем введения плазмиды или плазмид, содержащих геном ААВ, гены rep и гены cap (Grimm et al., 1998). Однако было обнаружено, что такие заключенные в капсиды вирусные ААВ-векторы неэффективно трансдуцируют определенные типы клеток и тканей, и указанные капсиды также индуцируют иммунный ответ.

[0009] Соответственно, применение векторов на основе аденоассоциированного вируса (ААВ-векторов) для генной терапии ограничено из-за однократного введения пациентам (вследствие иммунного ответа пациента), ограниченного диапазона трансгенного генетического материала, подходящего для доставки в ААВ-векторах ввиду минимальной емкости вирусной упаковки (около 4,5 т.п.о.), и медленной ААВ-опосредованной генной экспрессии.

[0010] В данной области существует потребность в технологии, которая позволяет осуществлять экспрессию терапевтического антитела (например, секретируемого антитела или интратела) или слитого белка (например, слитого внеклеточного домена рецептора-Fc) в клетке, ткани или у субъекта или, альтернативно, с целью получения антител или слитых белков in vitro или in vivo для очистки и/или коммерческого производства. Кроме того, сохраняется важная неудовлетворенная потребность в контролируемых рекомбинантных ДНК-векторах с улучшенными характеристиками продуцирования и/или экспрессии для улучшения продуцирования антител (например, терапевтических антител) и слитых белков (например, терапевтических слитых белков) по сравнению с существующими или традиционными способами, или векторами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Описанная в данном документе технология относится к способам и композициям для экспрессии антител и слитых белков (таких как терапевтические антитела и слитые белки) с использованием бескапсидного (например, невирусного) ДНК-вектора с ковалентно замкнутыми концами (называемого в данном документе «ДНК-вектор с замкнутыми концами» или «зкДНК-вектор»). Такие зкДНК-векторы могут быть использованы для продуцирования антител и слитых белков для лечения заболеваний, лечения злокачественных новообразований, мониторинга и диагностики, а также для коммерческого производства антител или слитых белков. Один типичный пример антитела представляет собой антитело против фактора некроза опухоли или его антигенсвязывающий фрагмент, включая, без ограничений, моноклональное антитело адалимумаб (хумира (Humira™)), которое можно экспрессировать в клетке или ткани субъекта с использованием зкДНК-векторов, описанных в данном документе. Такое терапевтическое антитело может быть использовано с целью лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и болезни Крона.

[0012] Соответственно, изобретение, описанное в данном документе, относится к бескапсидному (например, невирусному) ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (называемому в данном документе «ДНК-вектором с замкнутыми концами» или «зкДНК-вектором»), содержащему гетерогенный ген, кодирующий антитело (например, легкие цепи, тяжелые цепи, каркасы, Fabs', одноцепочечные антитела), или его антигенсвязывающий фрагмент для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетке, например, секретируемого антитела или интратела. Изобретение также относится к зкДНК-вектору, содержащему гетерогенный ген, кодирующий слитый белок, для обеспечения возможности экспрессии слитого белка в клетке. Такие антитела или слитые белки, которые должны быть экспрессированы, могут быть терапевтическими антителами или слитыми белками, и/или применяемые методы могут быть использованы при получении антител или слитых белков для коммерческих целей. В частности, технология, описанная в данном документе, относится к усовершенствованному продуцированию антител и слитых белков с использованием зкДНК-векторов.

[0013] зкДНК-векторы для продуцирования антител и слитых белков, как описано в данном документе, представляют собой бескапсидные линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные непрерывной цепью комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и неинкапсидированная структура), которые содержат последовательность 5' инвертированного концевого повтора (ITR) и последовательность 3'-ITR, причем 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь одинаковую симметричную трехмерную организацию относительно друг друга (т.е. симметричную или по существу симметричную) или, альтернативно, 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь различную трехмерную организацию по отношению друг к другу (т.е. асимметричные ITR). Кроме того, ITR могут принадлежать к одному или разным серотипам. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве (т.е. они одинаковы или являются зеркальным отражением друг друга). В некоторых вариантах реализации один ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ.

[0014] Соответственно, некоторые аспекты технологии, описанной в данном документе, относятся к зкДНК-вектору для улучшенной экспрессии и/или продукции антитела или слитого белка, которые содержат последовательности ITR, выбранные из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (ITR) ААВ (например, асимметричные модифицированные ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричные модифицированные ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ITR WT-WT, причем каждый WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной пары модифицированных ITR, причем каждый mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы могут продуцироваться в эукариотических клетках и, таким образом, не иметь прокариотических модификаций ДНК и загрязнений бактериальными эндотоксинами в клетках насекомых.

[0015] Способы и композиции, описанные в данном документе, относятся, в частности, к открытию невирусного бескапсидного ДНК-вектора с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-векторов), который можно использовать для экспрессии по меньшей мере одного антитела и/или слитого белка, или более чем одного антитела и/или слитого белка, из клетки. Способы и композиции могут применяться, например, для коммерческого производства антитела или слитого белка, или с целью лечения заболевания терапевтическим антителом или слитым белком.

[0016] Соответственно, в данном документе в одном аспекте представлены ДНК-векторы (например, зкДНК-векторы), содержащие по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один трансген, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или его слитые белки, функционально связанные с промотором, расположенным между двумя различными последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ, один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и Rep-связывающий сайт, и один из ITR содержит делецию, вставку или замену относительно другого ITR; причем трансген представляет собой антитело или его фрагмент (например, его антигенсвязывающий фрагмент) или слитый белок; и при этом ДНК при расщеплении рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, отличается наличием характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с контролями линейных и прерывистых ДНК при анализе на неденатурирующем геле. Другие аспекты включают доставку терапевтического антитела или слитого белка путем их экспрессии in vivo из зкДНК-вектора, как описано в данном документе и, дополнительно, лечение различных заболеваний с использованием таких антител или слитых белков. В данном документе также предусматриваются клетки, содержащие зкДНК-вектор, описанный в данном документе.

[0017] Аспекты данного изобретения относятся к способам получения зкДНК-векторов, пригодных для продуцирования антитела или слитого белка, или экспрессии антитела или слитого белка в клетке, как описано в данном документе. Другие варианты реализации относятся к зкДНК-вектору, продуцируемому способом, представленным в данном документе. В одном варианте реализации бескапсидный (например, невирусный) ДНК-вектор (зкДНК-вектор) для продуцирования антитела или слитого белка получают из плазмиды (называемой в данном документе «зкДНК-плазмида»), содержащей матрицу полинуклеотидного экспрессионного конструкта, содержащую, в указанном порядке: первый 5' инвертированный концевой повтор (например, ITR ААВ); гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты; и 3'-ITR (например, ITR ААВ), причем 5'-ITR и 3'-ITR могут быть асимметричными относительно друг друга или симметричными (например, WT-ITR или модифицированными симметричными ITR), как определено в данном документе.

[0018] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как раскрыто в данном документе, можно получить несколькими способами, которые будут известны рядовому специалисту в данной области техники после прочтения данного раскрытия. Например, матрица полинуклеотидного экспрессионного конструкта, используемая для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. В одном варианте реализации зкДНК-плазмида содержит сайт рестрикционного клонирования (например, SEQ ID NO: 123 и/или 124), функционально расположенный между ITR, в который может быть вставлена экспрессионная кассета, содержащая, например, промотор, функционально связанный с трансгеном, например, нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или слитый белок и/или репортерный ген). В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков получают из полинуклеотидной матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса), содержащей симметричные или асимметричные ITR (модифицированные или WT-ITR).

[0019] В пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, полинуклеотидная матрица, имеющая по меньшей мере две ITR, реплицируется, чтобы продуцировать зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезания («спасения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) с помощью белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора. Белки Rep и сайты связывания Rep различных серотипов ААВ хорошо известны специалистам в данной области. Специалисту в данной области понятно, что следует выбирать белок Rep из серотипа, который связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты и реплицирует ее, на основе, по меньшей мере, одного функционального ITR. Например, если компетентный по репликации ITR относится к ААВ серотипа 2, соответствующий Rep будет принадлежать серотипу ААВ, который взаимодействует с этим серотипом, например, ITR ААВ2 с Rep ААВ2 или ААВ4, но не с Rep ААВ5, который не обладает такой способностью. После репликации зкДНК-вектор с ковалентно замкнутыми концами продолжает накапливаться в пермиссивных клетках, и зкДНК-вектор предпочтительно является достаточно стабильным во времени в присутствии белка Rep в стандартных условиях репликации, например, для накопления в количестве, составляющем по меньшей мере 1 пг/клетку, предпочтительно, по меньшей мере 2 пг/клетку, предпочтительно, по меньшей мере 3 пг/клетку, более предпочтительно, по меньшей мере 4 пг/клетку, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5 пг/клетку.

[0020] Соответственно, один аспект данного изобретения относится к способу получения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, включающему стадии: а) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих матрицу полинуклеотидного экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая лишена последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, обеспечивающих эффективность, и в течение времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, причем клетки-хозяева не содержат кодирующие последовательности вирусного капсида; и б) сбора и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для получения зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка в клетке-хозяине. Однако, вирусные частицы (например, вирионы ААВ) не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, налагаемые вирионом.

[0021] Присутствие зкДНК-вектора, полезного для продуцирования антител или слитого белка, выделенного из клеток-хозяев, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа материала расщепленной ДНК на денатурирующих и неденатурирующих гелях для подтверждения наличия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

[0022] Для целей данного изобретения трансген, экспрессируемый зкДНК, кодирует антитело или связывающий фрагмент антитела, или слитый белок. Антитела и слитые белки хорошо известны в данной области и могут связываться с любым представляющим интерес белком, включая, без ограничений, лиганд, рецептор, токсин, гормон, фермент, или белок клеточной поверхности, или патоген, или вирусный белок, или антиген, а также пре- и посттрансляционно модифицированные белки, такие как гликопротеины или сумоилированные белки (например, антитело против SUMO2/3) и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты также включают антитела, которые связываются с любым антигеном, включая, без ограничений, нуклеиновые кислоты, например, ДНК (например, анти-дцДНК антитела), РНК (например, анти-РНК связывающие антитела). В некоторых вариантах реализации антитела, продуцируемые зкДНК-векторами, раскрытыми в данном документе, являются нейтрализующими антителами или их антигенсвязывающими фрагментами. Типичные примеры генов, выступающих в роли мишеней, и белков, представляющих интерес, подробно описаны в разделах методов применения и способов лечения данного документа.

[0023] В данном документе также предлагаются способы экспрессии антитела или слитого белка, которые находят терапевтическое применение, с использованием зкДНК-вектора в клетке или у субъекта. Такие антитела или слитые белки могут быть использованы для лечения заболевания. Соответственно, в данном документе предлагаются способы лечения заболевания, включающие введение зкДНК-вектора, кодирующего терапевтическое антитело или слитый белок, нуждающемуся в этом субъекту. В других вариантах реализации терапевтическое антитело или слитый белок можно использовать для нацеливания на злокачественные клетки, мониторинга конкретных белков или в диагностических целях.

[0024] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих параграфов:

1. Бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), содержащий:

по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одно антитело и/или слитый белок.

1. зкДНК-вектор по п. 1, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует антитело.

2. зкДНК-вектор по п. 2, в котором антитело представляет собой полноразмерное антитело, Fab, Fab', однодоменное антитело или одноцепочечное антитело (scFv).

3. зкДНК-вектор по п. 3, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует однодоменное антитело или одноцепочечное антитело.

4. зкДНК-вектор по п. 4, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует секреторную лидерную последовательность, предшествующую однодоменному антителу или одноцепочечному антителу.

5. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-3, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует вариабельную область тяжелой цепи, и вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует вариабельную область легкой цепи.

6. зкДНК-вектор по п. 4, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует вариабельную область тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи или ее часть, и вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи или ее часть.

7. зкДНК-вектор по п. 6 или п. 7, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность и/или вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность дополнительно кодируют секреторную лидерную последовательность, предшествующую вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи.

8. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-8, в котором антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.

9. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-9, в котором антитело представляет собой антитело IgG, IgA, IgD, IgM или IgE.

10. зкДНК-вектор по п. 10, в котором антитело представляет собой антитело IgG.

11. зкДНК-вектор по п. 11, в котором антитело IgG представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

12. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-12, в котором антитело связывается с по меньшей мере одной мишенью, выбранной из мишеней, перечисленных в Таблицах 1, 2, 3А, 3В, 4 и 5.

13. зкДНК-вектор по п. 1, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок.

14. зкДНК-вектор по п. 14, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность дополнительно кодирует секреторную лидерную последовательность, предшествующую слитому белку.

15. зкДНК-вектор по п. 14 или п. 15, в котором слитый белок содержит по меньшей мере один внеклеточный домен рецептора, слитый с областью Fc.

16. зкДНК-вектор по п. 16, в котором внеклеточный домен рецептора представляет собой внеклеточный домен рецептора, выбранного из CTLA-4, VEGFR1, VEGFR2, LFA-3, TNFR, IL-1R1, IL-1R1, IL-1RAcP и ACVR2A.

17. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-17, в котором антитело или слитый белок выбирают из антител и слитых белков из Таблиц 1, 2, 3А, 3В, 4 или 5.

18. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-18, в котором зкДНК-вектор содержит один или несколько сайтов поли(А).

19. зкДНК-вектор любому из пп. 1-19, в котором зкДНК-вектор содержит по меньшей мере один промотор, функционально связанный с по меньшей мере одной гетерологичной нуклеотидной последовательностью.

20. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-20, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.

21. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-21, в котором по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.

22. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-22, в котором один или оба ITR взяты из вируса, выбранного из парвовируса, депендовируса и аденоассоциированного вируса (ААВ).

23. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-23, в котором фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными.

24. зкДНК-вектор по п. 24, в котором фланкирующие ITR являются симметричными или по существу симметричными.

25. зкДНК-вектор по п. 24, в котором фланкирующие ITR являются асимметричными.

26. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-26, в котором один или оба ITR относятся к дикому типу, или в котором оба ITR относятся к дикому типу.

27. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-27, в котором фланкирующие ITR принадлежат к различным вирусным серотипам.

28. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-28, в котором фланкирующие ITR принадлежат к паре вирусных серотипов, указанных в Таблице 6.

29. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29, в котором один или оба из ITR содержат последовательность, выбранную из последовательностей в Таблице 7.

30. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-30, в котором по меньшей мере один из ITR изменен относительно последовательности ITR ААВ дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию ITR.

31. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-31, в котором один или оба ITR получены из серотипа ААВ, выбранного из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11 и ААВ12.

32. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-32, в котором один или оба ITR являются синтетическими.

33. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-33, в котором один или оба ITR не являются ITR дикого типа, или в котором оба ITR не относятся к дикому типу.

34. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-34, в котором один или оба ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.

35. зкДНК-вектор по п. 35, в котором делеция, вставка и/или замена приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями A, A', B, B', C или C'.

36. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-36, в котором один или оба ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B'.

37. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-37, в котором один или оба ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'.

38. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-38, в котором один или оба ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены, которые приводят к удалению части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями B и B', и/или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями C и C'.

39. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39, в котором один или оба ITR содержат единственную структуру стебель-петля в области, обычно содержащей первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'.

40. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-40, в котором один или оба ITR содержат один стебель и две петли в области, обычно содержащей первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'.

41. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-41, в котором один или оба ITR содержат один стебель и одну петлю в области, обычно содержащей первую структуру стебель-петля, образуемую областями B и B', и вторую структуру стебель-петля, образуемую областями C и C'.

42. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-42, в котором оба ITR изменяются таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда ITR инвертированы относительно друг друга.

43. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-43, в котором один или оба ITR содержат последовательность, выбранную из последовательностей в Таблицах 7, 9А, 9В и 10.

44. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-44, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного переключателя.

45. зкДНК-вектор по п. 45, в котором по меньшей мере один регуляторный переключатель выбирают из бинарного регуляторного переключателя, низкомолекулярного регуляторного переключателя, регуляторного переключателя "с паролем", регуляторного переключателя на основе нуклеиновой кислоты, посттранскрипционного регуляторного переключателя, контролируемого излучением или контролируемого ультразвуком регуляторного переключателя, опосредованного гипоксией регуляторного переключателя, регуляторного переключателя воспалительного ответа, активируемого сдвигом регуляторного переключателя и "аварийного выключателя".

46. Способ экспрессии антитела или слитого белка в клетке, включающий введение клетки в контакт с зкДНК-вектором по любому из пп. 1-46.

47. Способ по п. 47, в котором контактирующая клетка представляет собой эукариотическую клетку.

48. Способ по п. 47 или 48, в котором клетка находится в условиях in vitro или in vivo.

49. Способ по любому из пп. 47-49, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной для экспрессии в эукариотической клетке.

50. Способ по любому из пп. 47-50, в котором антитело или слитый белок секретируются из клетки.

51. Способ по любому из пп. 47-50, в котором антитело или слитый белок удерживаются в клетке.

52. Способ лечения субъекта терапевтическим антителом или терапевтическим слитым белком, включающий введение субъекту зкДНК-вектора по любому из пп. 1-46, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует терапевтическое антитело или терапевтический слитый белок.

53. Способ по п. 53, в котором субъект имеет заболевание или расстройство, выбранное из рака, аутоиммунного заболевания, нейродегенеративного расстройства, гиперхолестеринемии, острого отторжения органа, рассеянного склероза, постменопаузального остеопороза, кожных заболеваний, астмы или гемофилии.

54. Способ по п. 53, в котором рак выбирают из солидной опухоли, саркомы мягких тканей, лимфомы и лейкоза.

55. Способ по п. 53, в котором аутоиммунное заболевание выбирают из ревматоидного артрита и болезни Крона.

56. Способ по п. 53, в котором кожное заболевание выбирают из псориаза и атопического дерматита.

57. Способ по п. 53, в котором нейродегенеративное расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера.

58. Фармацевтическая композиция, содержащая зкДНК-вектор по любому из пп. 1-46.

59. Клетка, содержащая зкДНК-вектор по любому из пп. 1-46.

60. Композиция, содержащая зкДНК-вектор по любому из пп. 1-46 и липид.

61. Композиция по п. 61, в которой липид представляет собой липидную наночастицу (ЛНЧ).

62. Набор, содержащий зкДНК-вектор по любому из пп. 1-46 или композицию по п. 61 или 62, или клетку по п. 65.

63. Способ получения антитела или слитого белка, включающий культивирование клетки по п. 60 в условиях, подходящих для продуцирования антитела или слитого белка.

64. Способ по п. 64, дополнительно включающий выделение антитела или слитого белка.

[0025] В некоторых вариантах реализации один из аспектов технологии, описанной в данном документе, относится к невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), причем зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов, при этом последовательности ITR могут быть асимметричными, или симметричными, или по существу симметричными, как эти термины определены в данном документе, причем по меньшей мере один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт и, необязательно, последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты кодирует трансген (например, антитело или слитый белок), и вектор не помещен в вирусный капсид.

[0026] Эти и другие аспекты данного изобретения описаны более подробно ниже.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0027] Варианты реализации данного изобретения, кратко изложенные выше и описанные более подробно ниже, будут понятными со ссылкой на иллюстративные варианты реализации изобретения, представленные на прилагаемых чертежах. Однако прилагаемые чертежи иллюстрируют только типичные варианты реализации изобретения и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие его объем, поскольку раскрытие может допускать другие в равной степени эффективные варианты реализации.

[0028] Варианты реализации данного изобретения, кратко изложенные выше и описанные более подробно ниже, будут понятными со ссылкой на иллюстративные варианты реализации изобретения, представленные на прилагаемых чертежах. Однако прилагаемые чертежи иллюстрируют только типичные варианты реализации изобретения и, следовательно, не должны рассматриваться как ограничивающие его объем, поскольку раскрытие может допускать другие в равной степени эффективные варианты реализации.

[0029] Фиг. 1А демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего асимметричные ITR. В этом варианте реализации типичный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка) и BGHpA (сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста). Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, может быть вставлена в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - ITR ААВ2 дикого типа слева от (на 5'-конце) и модифицированный ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, таким образом, два ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, являются асимметричными относительно друг друга.

[0030] Фиг. 1B демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего асимметричные ITR с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, может быть вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - модифицированным ITR слева от (на 5'-конце) и ITR дикого типа справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты.

[0031] Фиг. 1C демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего асимметричные ITR, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(A). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR), которые являются асимметричными относительно друг друга - модифицированным ITR слева от (на 5'-конце) и модифицированным ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты, причем 5'-ITR и 3'-ITR оба являются модифицированными ITR, но имеют разные модификации (т.е. они имеют неодинаковые модификации).

[0032] Фиг. 1D демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR являются симметричными или по существу симметричными.

[0033] Фиг. 1E демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(А). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем модифицированный 5'-ITR и модифицированный 3'-ITR являются симметричными или по существу симметричными.

[0034] Фиг. 1F демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего симметричные WT-ITR или по существу симметричные WT-ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, вставлена в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5' WT-ITR и 3' WT-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0035] Фиг. 1G демонстрирует типичный пример структуры зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, трансген, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал поли(А). Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Экспрессионная кассета фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5' WT-ITR и 3' WT-ITR симметричны или по существу симметричны.

[0036] На Фиг. 2А представлена Т-образная структура стебель-петля левого ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 52) с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя Rep-связывающими сайтами (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs). RBE содержит серию из 4 дуплексных тетрамеров, которые, как полагают, взаимодействуют либо с Rep 78, либо с Rep 68. Кроме того, считается также, что RBE' взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ITR дикого типа или мутированном ITR в конструкте. Области D и D' содержат сайты связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры. Фиг. 2B демонстрирует предполагаемую катализируемую Rep никующую и лигирующую активности левого ITR дикого типа (SEQ ID NO: 53), включая Т-образную структуру стебель-петля левого ITR ААВ2 дикого типа с обозначенными плечом A-A', плечом B-B', плечом C-C', двумя Rep-связывающими сайтами (RBE и RBE'), а также с указанными сайтом концевого разрешения (trs) и областью D и D', содержащей несколько сайтов связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры.

[0037] На Фиг. 3А представлена первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащих частей плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' левого ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 54). Фиг. 3B демонстрирует типичный пример последовательности мутированного ITR (также называемого модифицированным ITR) для левого ITR. Представлены первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части плеча A-A', плеча C и плеча B-B’ типичного примера мутированного левого ITR (ITR-1, левый) (SEQ ID NO: 113). Фиг. 3C демонстрирует первичную структуру (слева) и вторичную структуру (справа) RBE-содержащей части петли A-A' и плеч B-B' и C-C' правого ITR ААВ2 дикого типа (SEQ ID NO: 55). Фиг. 3D демонстрирует типичный пример правого модифицированного ITR. Представлены первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части A-A'-плеча, плеч B-B' и C типичного примера мутантного правого ITR (ITR-1, правый) (SEQ ID NO: 114). Может быть использована любая комбинация левого и правого ITR (например, ITR ААВ2 или другого вирусного серотипа, или синтетических ITR), как описано в данном документе. Каждая из полинуклеотидных последовательностей на Фиг. 3А-3D относится к последовательностям, используемым в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса, используемых для продуцирования зкДНК, как описано в данном документе. Также каждая из Фиг. 3A-3D включает соответствующие вторичные структуры зкДНК, полученные из конфигураций зкДНК-вектора в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса и предсказанных значений свободной энергии Гиббса.

[0038] Фиг. 4А представляет собой схематическое изображение апстрим (предшествующего) процесса получения инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (BIIC), которые пригодны для получения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка способом, схематически представленным на Фиг. 4В. На Фиг. 4B схематически представлен пример способа получения зкДНК, а Фиг. 4C демонстрирует биохимический способ и процесс для подтверждения продуцирования зкДНК-вектора. На Фиг. 4D и Фиг. 4Е представлены схематические изображения, описывающие процесс идентификации присутствия зкДНК в ДНК, собранной из клеточных осадков, полученных в процессе продуцирования зкДНК на Фиг. 4В. На Фиг. 4D представлены схематически ожидаемые полосы для типичного примера зкДНК, нерасщепленной или расщепленной рестрикционной эндонуклеазой, а затем подвергнутой электрофорезу на нативном или денатурирующем геле. Самая левая схема демонстрирует нативный гель с несколькими полосами, что свидетельствует о том, что в дуплексной и неразрезанной форме зкДНК существует, по меньшей мере, в мономерном и димерном состояниях, которые проявляются в виде более быстро мигрирующего мономера меньшего размера и медленнее мигрирующего димера с размером в 2 раза больше, чем у мономера. Второе слева схематическое изображение демонстрирует, что при разрезании зкДНК эндонуклеазой рестрикции исходные полосы исчезают, и появляются более быстро мигрирующие полосы (например, меньшего размера), которые соответствуют ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует как соединение вдвое большего размера по сравнению с наблюдаемым на нативном геле, потому что комплементарные цепи ковалентно связаны. Соответственно, на второй справа схеме, расщепленная зкДНК демонстрирует распределение полос, аналогичное наблюдаемому на нативном геле, но полосы мигрируют в виде фрагментов в два раза большего размера, чем у их аналогов в нативном геле. На самой правой схеме, неразрезанная зкДНК в денатурирующих условиях мигрирует как одноцепочечное раскрытое кольцо и, поэтому, наблюдаемые полосы имеют в два раза больший размер, чем в нативных условиях, когда кольцо не раскрыто. На данной фигуре «т.п.о.» используется для указания относительного размера нуклеотидных молекул, основанного, в зависимости от контекста, либо на длине нуклеотидной цепи (например, для одноцепочечных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях), либо на числе пар оснований (например, для двуцепочечных молекул, наблюдаемых в нативных условиях). Фиг. 4E демонстрирует ДНК, имеющую прерывистую структуру. зкДНК может быть разрезана эндонуклеазой рестрикции, имеющей один сайт распознавания на зкДНК-векторе, с образованием двух фрагментов ДНК разного размера (1 т.п.о. и 2 т.п.о.) как в нейтральных, так и в денатурирующих условиях. Фиг. 4E также демонстрирует зкДНК, имеющую линейную и непрерывную структуру. зкДНК-вектор может быть разрезан эндонуклеазой рестрикции и генерировать два фрагмента ДНК, которые мигрируют как 1 т.п.о. и 2 т.п.о. в нейтральных условиях, но в денатурирующих условиях цепи остаются связанными и образуют одиночные цепи, которые мигрируют как 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[0039] Фиг. 5 демонстрирует иллюстративное изображение прогона на денатурирующем геле типичных примеров зкДНК-векторов с (+) или без (-) расщепления эндонуклеазами (EcoRI для зкДНК-конструктов 1 и 2; BamH1 для зкДНК-конструктов 3 и 4; SpeI для зкДНК-конструктов 5 и 6 и XhoI для зкДНК-конструктов 7 и 8). Конструкты 1-8 описаны в Примере 1 международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Размеры для полос, выделенных звездочкой, были определены и приведены внизу чертежа.

[0040] Фиг. 6А-6С демонстрируют типичные примеры конструктов и плазмид для создания зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, и в иллюстративных целях представлен зкДНК-вектор, кодирующий адуканумаб. Рядовой специалист в данной области может легко заменить нуклеиновую кислоту, кодирующую адуканумаб, на любую другую нуклеиновую кислоту, кодирующую другое антитело или слитый белок. Фиг. 6A демонстрирует типичный пример зкДНК-плазмиды (pFBdual-зкДНК-адуканумаб; SEQ ID NO: 56) для получения зкДНК-вектора, экспрессирующего адуканумаб (полный IgG1). Эта зкДНК-плазмида содержит последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии адуканумаба, которая была кодон-оптимизирована, фланкированную между парой асимметричных ITR (т.е. WT 5'-ITR (ITR дикого типа) и 3' mod-ITR (правый асимметричный ITR). Эту пару ITR можно легко заменить другой парой асимметричных ITR или парой симметричных ITR, как описано в данном документе. Кроме того, эта плазмида содержит, фланкированные между парой ITR, в направлении от 5' к 3': энхансер SV40 (SEQ ID NO: 126), альфа-промотор EF1 человека (SEQ ID NO: 77) или его фрагмент (SEQ ID NO: 78) и секреторную лидерную последовательность VH1-02 (SEQ ID NO: 88), оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи (HC) адуканумаба (SEQ ID NO: 57), последовательность поли(A) SV40 (SEQ ID NO: 86) и, расположенные перед последовательностью легкой цепи (LC) адуканумаба, следующие: энхансер CMV (SEQ ID NO: 83), промотор rEF1 (SEQ ID NO: 85 или SEQ ID NO: 150), лидерную последовательность VK A26 (SEQ ID NO: 89), оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи(LC) адуканумаба (SEQ ID NO: 58) и последовательность полиаденилирования BGH (SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 148). Оптимизированную последовательность тяжелой цепи (HC) адуканумаба и оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи (LC) адуканумаба можно легко заменить на любые другие последовательности тяжелой цепи или легкой цепи антител, описанных в данном документе, например, см. Таблицы 1-5 в данном документе. Фиг. 6B демонстрирует типичный пример вставки, которая может быть использована в качестве модульного компонента для вставки в желаемый зкДНК-вектор для получения плазмиды, представленной на Фиг. 6А. Фиг. 6С демонстрирует линеаризованный вид области плазмиды ceDNA-Adu-full-IgG1 (зкДНК-Adu-полный-IgG1), содержащей последовательности для получения адуканумаба.

[0041] Фиг. 7А-7G демонстрируют типичные зкДНК-векторы, которые могут экспрессировать множество различных антител или антигенсвязывающих фрагментов, или слитых белков, как раскрыто в данном документе. Представленные в качестве примеров зкДНК-векторы также иллюстрируют множество конфигураций в отношении использования последовательностей IRES, промоторных последовательностей, энхансерных последовательностей, линкерных последовательностей, последовательностей полиаденилирования. Фиг. 7А демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования антител с последовательностью поли(А), расположенной после последовательности тяжелой цепи и, необязательно, энхансером перед последовательностью нуклеиновой кислоты легкой цепи. Фиг. 7В демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования антител с последовательностью поли(А) после последовательности тяжелой цепи, и IRES перед последовательностью нуклеиновой кислоты легкой цепи. Фиг. 7C демонстрирует вариант конструкта зкДНК-вектора для получения фрагментов антител (например, антигенсвязывающих фрагментов), аналогичных Фиг. 7А, включая содержащие последовательность поли(А) после последовательности фрагмента Fab тяжелой цепи и, необязательно, энхансер перед последовательностью нуклеиновой кислоты фрагмента легкой цепи. Фиг. 7D демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования антитела, как раскрыто в данном документе, в том числе с последовательностью поли(А), расположенной после последовательности легкой цепи. Фиг. 7Е демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования антитела, как описано в данном документе, в том числе с последовательностью поли(А), расположенной после последовательности тяжелой цепи. Фиг. 7F демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования однодоменного антитела (dAb), как описано в данном документе, в том числе с последовательностью поли(А), расположенной после последовательности dAb. Фиг. 7G демонстрирует вариант реализации конструкта зкДНК-вектора для продуцирования фрагмента антитела, такого как слитый белок одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или одноцепочечное антитело, как раскрыто в данном документе, в том числе с последовательностью поли(А), расположенной после последовательности scFv последовательности одноцепочечного антитела. Специалисту в данной области понятно, что зкДНК-векторы для продуцирования антител, как описано в данном документе, можно использовать модульно, так что желаемые регуляторные последовательности или гетерологичные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или его фрагмент, могут быть заменены другими желаемыми последовательностями. Таким образом, зкДНК-векторы можно адаптировать для желаемого применения. Фиг. 7A-7G также демонстрируют варианты реализации, в которых последовательности нуклеиновых кислот вариабельных цепей (V_H и V_L) и константных цепей (C_H и C_L), и последовательности Fc расположены проксимально друг к другу, или, альтернативно, Fc может быть присоединен к последовательности, кодирующей V_H и V_L, через линкерную последовательность, как раскрыто в данном документе.

[0042] Фиг. 8A-8B демонстрируют типичный пример анализа методами ДСН-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) (Фиг. 8A) и вестерн-блоттинга (Фиг. 8B) экспрессии антитела адуканумаба (полный IgG1), экспрессированного из конструкта зкДНК-IgG1-Adu, как описано в Примере 9, после одностадийной очистки экспрессируемого белка. Фиг. 8А демонстрирует изображение геля ДСН-ПААГ экспрессированного антитела. На дорожках: белковый маркер M1 (Takara, кат. № 3452), а очищенный адуканумаб показан в восстанавливающих условиях (дорожка 1) и невосстанавливающих условиях (дорожка 2). Наличие двух полос в восстанавливающих условиях, и только одной полосы - в невосстанавливающих, согласуется с предположением о том, что белок представляет собой антитело с тяжелой и легкой цепями, которое мигрирует как одна полоса в невосстанавливающих условиях, и как составляющие тяжелая и легкая цепи - в восстанавливающих условиях. Фиг. 8В демонстрирует изображение вестерн-блоттинга, иммуноокрашенного антителом против человеческого IgG. На дорожках: белковый маркер M2 (GenScript, кат. № M00521), и P обозначает человеческое антитело IgG1 положительного контроля (Sigma).

[0043] Фиг. 9А-9В демонстрируют экспрессию зкДНК, экспрессирующей антитело GFP или адуканумаб (полный IgG1), экспрессируемого зкДНК-вектором-IgG1-Adu. Фиг. 9А демонстрирует флуоресцентные микроскопические изображения клеток HEK293T, трансфицированных плазмидой зкДНК-GFP (верхняя панель) и зкДНК-вектором-GFP (нижняя панель), как описано в Примере 8. Наличие обильной флуоресценции на обоих изображениях показывает, что значительная трансфекция и экспрессия трансгенного GFP происходили в клетках, обработанных любой зкДНК. Фиг. 9В демонстрирует два разных изображения одного и того же мембранного переноса клеточных образцов, разделенных электрофоретически методом ДСН-ПААГ, как описано в Примере 8. Нижняя панель - мембрана, окрашенная понсо, демонстрирующая полное содержание белка; верхняя панель представляет собой вестерн-блот, на котором видимые полосы отображают присутствие человеческого антитела. На дорожках 7-10 тяжелая цепь антитела мигрирует при приблизительно 50 кДа, а легкая цепь антитела мигрирует при приблизительно 25 кДа; обе цепи видны на всех четырех дорожках.

[0044] Фиг. 10А-10В демонстрируют характеризацию продуцируемого зкДНК антитела к адуканумабу. Фиг. 10А демонстрирует результаты анализа методом ВЭЖХ, описанного в Примере 9, показывающие единственный пик, соответствующий продуцируемому зкДНК адуканумабу. Фиг. 10B демонстрирует результаты анализа методом ИФА (ELISA), оценивающего способность очищенного антитела к адуканумабу распознавать иммобилизованный бета-амилоидный (1-42) лиганд, как описано в Примере 9.

[0045] Фиг. 11 изображает графически результаты экспериментов, описанных в Примере 10. Образцы отрицательного контроля от мышей, обработанных конструктами зкДНК, в которых отсутствуют трансгены адуканумаба (помеченные как зкДНК отрицательного контроля), находились на уровне или ниже нижнего предела количественного определения в анализе. Напротив, сыворотка мышей, обработанных конструктом зкДНК-IgG, имела высокие уровни человеческого иммуноглобулина, присутствующего как на 3-й, так и 7-й день.

[0046] Фиг. 12 демонстрирует результаты для двух разных продолжительностей экспозиции одного и того же мембранного переноса клеточных образцов, разделенных электрофоретически методом ДСН-ПААГ, как описано в Примере 12. Верхняя панель соответствует 6-секундной экспозиции, а нижняя - 20-секундной экспозиции. Полосы, соответствующие интактному антителу, видны в верхней части геля (и ограниченное количество восстановленных тяжелой и легкой цепей, мигрирующих при ок. 50 кДа и ок. 25 кДа, соответственно) видны на дорожках 5, 7 (оба - адуканумаб) и 11 (бевацизумаб) (указаны стрелками). На дорожке 9 присутствие слитого белка Fc наблюдается в верхней части дорожки и, как и ожидалось, продукты с меньшей молекулярной массой не наблюдаются.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0047] В данном документе предусматриваются зкДНК-векторы для продуцирования антител, как описано в данном документе, содержащие одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело (например, тяжелые цепи, легкие цепи, каркас, Fab', scAb (одноцепочечное антитело)). В данном документе также предусматриваются зкДНК-векторы для продуцирования слитого белка, как описано в данном документе, содержащие одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих слитый белок. Такие векторы можно использовать в производстве коммерческих антител или слитых белков, или при доставке терапевтического антитела или слитого белка, как описано в данном документе, путем внутриклеточной экспрессии из зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации экспрессия антитела или слитого белка может включать секрецию антитела или слитого белка из клетки, в которой они экспрессируются, или, альтернативно, в некоторых вариантах экспрессированное антитело или слитый белок могут быть нацелены на белок внутри клетки, в которой они экспрессируются (например, антитело представляет собой интратело (intrabody)). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор экспрессирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или слитый белок в мышце (например, скелетной мышце) субъекта, которая может выступать в роли депо для продуцирования и секретирования антитела или слитого белка во многие системные компартменты.

I. Определения

[0048] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые применительно к данной заявке, будут иметь значения, общепринятые для специалистов в области техники, к которой относится данное изобретение. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, реагентами и т.д., описанными в данном документе, которые фактически могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения. Определения распространенных терминов иммунологии и молекулярной биологии можно найти в следующих источниках: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, опубликовано Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, опубликовано Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology, Werner Luttmann, опубликовано Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, опубликовано Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strobe (eds.), John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), содержание которых включено в данный документ посредством ссылок в полном объеме.

[0049] Используемые в данном документе термины «гетерологичная нуклеотидная последовательность» и «трансген» используются взаимозаменяемо и относятся к представляющей интерес нуклеиновой кислоте (отличной от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид капсида), которая включена в состав и может быть доставлена и экспрессирована с помощью зкДНК-вектора, как описано в данном документе.

[0050] Используемые в данном документе термины «экспрессионная кассета» и «транскрипционная кассета» используются взаимозаменяемо и относятся к линейному фрагменту нуклеиновых кислот, который включает трансген, функционально связанный с одним или несколькими промоторами или другими регуляторными последовательностями, достаточными для прямой транскрипции трансгена, но не содержит кодирующие капсид последовательности, другие векторные последовательности или области инвертированных концевых повторов. Экспрессионная кассета может дополнительно содержать одну или несколько цис-действующих последовательностей (например, промоторов, энхансеров или репрессоров), один или несколько интронов и один или несколько посттранскрипционных регуляторных элементов.

[0051] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды либо дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечные ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. «Олигонуклеотид» обычно относится к полинуклеотидам от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов одно- или двухцепочечной ДНК. Однако, для целей данного изобретения, верхний предел длины олигонуклеотида не установлен. Олигонуклеотиды также известны как «олигомеры» или «олиго» (oligo) и могут быть выделены из генов или химически синтезированы способами, известными в данной области. Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» следует понимать как включающие, применительно к описываемым вариантам реализации, одноцепочечные (такие как смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные полинуклеотиды.

[0052] Используемый в данном документе термин «конструкт нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одноцепочечной или двухцепочечной, которая выделена из встречающегося в природе гена или модифицирована так, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот, способом, не существующим в природе, или является синтетической. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «экспрессионная кассета», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по данному изобретению. «Экспрессионная кассета» включает кодирующую последовательность ДНК, функционально связанную с промотором.

[0053] Под «гибридизуемым» или «комплементарным» или «по существу комплементарным» подразумевается, что нуклеиновая кислота (например, РНК) включает последовательность нуклеотидов, которая позволяет ей нековалентно связываться, т.е. формировать пары оснований по Уотсону-Крику и/или пары оснований G/U, подвергаться «отжигу» или «гибридизироваться» с другой нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности, антипараллельным образом (т.е. нуклеиновая кислота специфически связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой) в соответствующих in vitro и/или in vivo условиях температуры и ионной силы раствора. Как известно в данной области техники, стандартное спаривание оснований по Уотсону-Крику включает спаривание аденина (A) с тимидином (T), спаривание аденина (A) с урацилом (U), и спаривание гуанина (G) с цитозином (C). Кроме того, в данной области техники также известно, что при гибридизации двух молекул РНК (например, дцРНК) гуаниновое (G) основание спаривается с урацилом (U). Например, спаривание оснований G/U частично отвечает за вырожденность (т.е. избыточность) генетического кода в контексте спаривания оснований анти-кодонов тРНК с кодонами в мРНК. В контексте данного изобретения, гуанин (G) связывающего белок сегмента (дуплекса дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению считается комплементарным урацилу (U), и наоборот. Таким образом, когда пара оснований G/U может быть получена в данном нуклеотидном положении со связывающим белок сегментом (дуплекс дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению, это положение не рассматривается как некомплементарное, а считается комплементарным.

[0054] Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме аминокислот любой длины, которая может включать кодируемые и некодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты. и полипептиды, имеющие модифицированные пептидные остовы.

[0055] Используемый в данном документе термин «антитело» охватывает любое антитело или фрагмент антитела (т.е. функциональный фрагмент антитела) или антигенсвязывающий фрагмент, который сохраняет антигенсвязывающую активность по отношению к желаемому антигену или эпитопу. В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит цепь иммуноглобулина или его фрагмент и, по меньшей мере, одну последовательность вариабельного домена иммуноглобулина. Примеры антител включают, без ограничений, scFv, фрагмент Fab, Fab', F(ab')₂, однодоменное антитело (dAb), тяжелую цепь, легкую цепь, тяжелую и легкую цепь, полное антитело (например, включающее каждый из Fc, Fab, тяжелых цепей, легких цепей, вариабельных областей и т.д.), биспецифическое антитело, диатело, линейное антитело, одноцепочечное антитело, интратело, моноклональное антитело, химерное антитело или мультимерное антитело. Кроме того, антитело может быть получено от любого млекопитающего, например, приматов, людей, крыс, мышей, лошадей, коз и т.д. В одном варианте реализации антитело является человеческим или гуманизированным. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой модифицированное антитело. В некоторых вариантах реализации компоненты антитела могут экспрессироваться отдельно, так чтобы после экспрессии белковых компонентов происходила самосборка антитела. В некоторых вариантах реализации антитело обладает желаемой функцией, например, взаимодействия и ингибирования желаемого белка, с целью лечения заболевания или симптома заболевания. В одном варианте реализации антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область или область F_c. Фрагмент антитела может сохранять 10-99% активности полного антитела (например, 10-90%, 10-80%, 10-70%, 10-60%, 10-50%, 10-40%, 10-30%, 10-20%, 50-99%, 50-90%, 50-80%, 50-70%, 50-60%, 20-99%, 30-99%, 40-99%, 60-99%, 70-99%, 80-99%, 90-99% или любое значение активности между указанными величинами). В данном документе также предусматривается, что функциональный фрагмент антитела содержит активность, которая больше активности интактного антитела (например, по меньшей мере в 2 раза или выше). В другом варианте реализации фрагмент антитела содержит сродство к своей мишени, которое по существу аналогично сродству интактного антитела к этой же мишени (например, эпитопу). Антитело может быть «активирующим», так чтобы оно увеличивало активность белка-мишени, или «ингибирующим» (например, нейтрализующее или блокирующее антитело), так чтобы оно снижало активность белка-мишени.

[0056] Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий домен» молекулы антитела относится к части молекулы антитела, например, молекулы иммуноглобулина (Ig), которая участвует в связывании антигена. В вариантах реализации антигенсвязывающий сайт образован аминокислотными остатками вариабельных (V) областей тяжелой (H) и легкой (L) цепей. Три сильно дивергентные участка в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей, называемые гипервариабельными областями, расположены между более консервативными фланкирующими участками, называемыми «каркасными областями» (FR). FR представляют собой аминокислотные последовательности, которые присутствуют в природных условиях между гипервариабельными областями в иммуноглобулинах и прилегают к ним. В вариантах реализации в молекуле антитела три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены друг относительно друга в трехмерном пространстве таким образом, чтобы они образовывали антигенсвязывающую поверхность, комплементарную трехмерной поверхности связанного антигена. Три гипервариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей называются «областями, определяющими комплементарность» или «CDR». Каркасная область и CDR были определены и описаны, например, в Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, и Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917. Каждая вариабельная цепь (например, вариабельная тяжелая цепь и вариабельная легкая цепь) обычно состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, в направлении от аминоконца к карбоксиконцу, в таком порядке аминокислотных последовательностей: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Используемые в данном документе термины «область, определяющая комплементарность», и «CDR» относятся к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают ему антигенную специфичность и аффинность связывания. Как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи имеется три CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3), и в каждой вариабельной области легкой цепи - три CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3). Точные границы аминокислотной последовательности данного CDR могут быть определены с использованием любой из ряда известных схем, в том числе описанных Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (схема нумерации Кабата («Kabat»)), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации Чотиа («Chothia»)). В используемом в данном документе значении, CDR, определенные в соответствии со схемой нумерации Чотиа, также иногда называют «гипервариабельными петлями». Например, согласно схеме Кабата, аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) пронумерованы как 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) пронумерованы как 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). По схеме Чотиа аминокислоты CDR в VH пронумерованы как 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки в VL пронумерованы как 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). Каждый VH и VL обычно включает три CDR и четыре FR, расположенные, в направлении от аминоконца к карбоксиконцу, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0057] Используемый в данном документе термин «полноразмерное антитело» относится, например, к молекуле иммуноглобулина (Ig) (например, антитело IgG, IgE, IgM), которая встречается в природе и образуется в результате процессов рекомбинации фрагмента нормального гена иммуноглобулина.

[0058] Используемые в данном документе термины «функциональный фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» используются взаимозаменяемо и относятся к фрагменту антитела, который связывается с тем же антигеном или эпитопом, который распознается интактным (например, полноразмерным) антителом. Термины «фрагмент антитела» или «функциональный фрагмент» также включают выделенные фрагменты, состоящие из вариабельных областей, такие как фрагменты «Fv», состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, или рекомбинантных одноцепочечных полипептидных молекул, в которых легкие и тяжелые вариабельные области связаны пептидным линкером («белки scFv»). В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела не включает части антител без антигенсвязывающей активности, такие как фрагменты Fc или отдельные аминокислотные остатки. В некоторых вариантах реализации функциональный фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 20% активности интактного или полноразмерного антитела, например, при оценке путем измерения степени активации или ингибирования белка-мишени. В других вариантах реализации функциональный фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, при по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или даже 100% (т.е. по существу схожую величину) активности по сравнению с интактным антителом. В данном документе также предусматривается, что функциональный фрагмент антитела будет обладать повышенной активностью по сравнению с интактным антителом (например, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 100 раз, или больше).

[0059] Используемый в данном документе термин «последовательность вариабельного домена иммуноглобулина» относится к аминокислотной последовательности, которая может образовывать структуру вариабельного домена иммуноглобулина. Например, последовательность может включать всю или часть аминокислотной последовательности встречающегося в природе вариабельного домена. Например, последовательность может включать или не включать одну, две или более N- или C-концевых аминокислот, или может включать другие изменения, которые совместимы с образованием структуры белка.

[0060] Используемый в данном документе термин "каркас" или «каркасная последовательность" относится к остальным последовательностям вариабельной области за исключением CDR. Поскольку точное определение последовательности CDR может быть обусловлено различными системами, значение каркасной последовательности будет устанавливаться в соответствии с различными интерпретациями. Шесть CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи) также делят каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, причем CDR1 расположен между FR1 и FR2, CDR2 - между FR2 и FR3, и CDR3 - между FR3 и FR4. Без указания конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, в соответствии с другими представлениями, обозначает объединенные FR в пределах вариабельной области одной встречающейся в природе цепи иммуноглобулина. В используемом в данном документе значении, отдельно взятая FR (a FR) представляет собой одну из четырех подобластей, а несколько FR (FRs) представляют две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.

[0061] Последовательность ДНК, которая «кодирует» конкретное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты ДНК, которая транскрибируется в конкретную РНК и/или белок. Полинуклеотид ДНК может кодировать РНК (мРНК), которая транслируется в белок, или полинуклеотид ДНК может кодировать РНК, которая не транслируется в белок (например, тРНК, рРНК, или нацеливающая на ДНК РНК; также называемая «некодирующей РНК» или «нкРНК»).

[0001] Используемый в данном документе термин «слитый белок», в используемом в данном документе значении, относится к полипептиду, содержащему белковые домены из по меньшей мере двух разных белков. Например, слитый белок может содержать (i) антитело или его фрагмент (например, антигенсвязывающую часть или антигенсвязывающий фрагмент антитела) или лигандсвязывающий домен, и (ii) по меньшей мере один белок, не являющийся антителом. Слитые белки, охватываемые данным документом, включают, без ограничений, антитело или Fc или антигенсвязывающий фрагмент антитела, слитого с белком, представляющим интерес, например, внеклеточным доменом рецептора, лигандом, ферментом или пептидом. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые являются частью слитого белка, могут представлять собой моноспецифическое антитело или биспецифическое или мультиспецифическое антитело.

[0062] Используемый в данном документе термин «ген безопасной гавани генома» или «ген безопасной гавани» относится к гену или локусам, в которые последовательность нуклеиновой кислоты может быть вставлена так, чтобы последовательность могла интегрироваться и функционировать предсказуемым образом (например, экспрессировать белок, представляющий интерес), без существенных негативных последствий для активности эндогенного гена или способствования развитию рака. В некоторых вариантах реализации ген безопасной гавани также представляет собой локус или ген, в которых вставленная последовательность нуклеиновой кислоты может экспрессироваться эффективно и на более высоких уровнях, чем в сайте, не являющемся «безопасной гаванью».

[0063] Используемый в данном документе термин «доставка гена» означает процесс, посредством которого чужеродная ДНК переносится в клетки-хозяева для генно-терапевтического применения.

[0064] Используемый в данном документе термин «концевой повтор» или «TR» включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимально необходимую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Rep-связывающая последовательность («RBS») (также называемая RBE (Rep-связывающий элемент)) и сайт концевого разрешения («TRS») вместе составляют «минимально необходимую точку начала репликации» и, соответственно, TR содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. TR, являющиеся обратно комплементарными друг другу на данном отрезке полинуклеотидной последовательности, обычно называют «инвертированными концевыми повторами» или «ITR». В контексте вируса, ITR обеспечивают репликацию, упаковку вируса, интеграцию и спасение провируса. Как было неожиданно обнаружено авторами данного изобретения, TR, не являющиеся обратно комплементарными по всей своей длине, могут, тем не менее, выполнять традиционные функции ITR и, соответственно, термин ITR в данном документе используется по отношению к TR в геноме зкДНК или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области будет понятно, что в зкДНК-векторах сложной конфигурации могут присутствовать более двух ITR или пары асимметричных ITR. ITR может представлять собой ITR ААВ или ITR, не принадлежащий ААВ, или может быть получен из ITR ААВ или ITR, не принадлежащего ААВ. Например, ITR может происходить из вируса семейства Parvoviridae, которое охватывает парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собак, парвовирус крупного рогатого скота, парвовирус мышей, парвовирус свиней, парвовирус человека B-19), или шпилька SV40, которая служит точкой начала репликации SV40, может применяться в качестве ITR, который может быть дополнительно модифицирован путем усечения, замены, делеции, вставки и/или добавления. Вирусы семейства Parvoviridae состоят из двух подсемейств: Parvovirinae, инфицирующих позвоночных животных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (ААВ), которые способны к репликации у позвоночных хозяев, включая, без ограничений, виды человека, приматов, крупного рогатого скота, собак, лошадей и овец. Для удобства в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' (выше) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется «5'-ITR» или «левым ITR», а ITR, расположенный со стороны 3’ (ниже) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3’-ITR» или «правый ITR».

[0065] «ITR дикого типа» или «WT-ITR» относится к последовательности встречающейся в природе последовательности ITR в ААВ или другом депендовирусе, который сохраняет, например, активность связывания Rep и никующую способность Rep. Нуклеотидная последовательность WT-ITR из любого серотипа ААВ может незначительно отличаться от канонической встречающейся в природе последовательности из-за вырожденности или дрейфа генетического кода и, таким образом, последовательности WT-ITR, пригодные для использования по данному изобретению, включают последовательности WT-ITR, образующиеся в результате естественных изменений, происходящих в процессе продуцирования (например, ошибки репликации).

[0066] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные WT-ITR» или «по существу симметричная пара WT-ITR» относится к паре WT-ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба представляют собой ITR дикого типа, имеющие обратно комплементарные последовательности по всей их длине. Например, ITR можно рассматривать как последовательность дикого типа, даже если она имеет один или несколько нуклеотидов, которые отклоняются от канонической последовательности, встречающейся в природе, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую трехмерную структуру последовательности. В некоторых аспектах отклоняющиеся нуклеотиды представляют собой консервативные изменения последовательности. В качестве одного неограничивающего примера последовательность, имеющая идентичность последовательностей по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную, например, с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию с другой WT-ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричные WT-ITR имеют одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве. По существу симметричный WT-ITR можно функционально подтвердить как относящийся к дикому типу (WT), определив, что он имеет функциональный Rep-связывающий сайт (RBE или RBE') и сайт концевого разрешения (trs), который связывается с соответствующим белком Rep. Дополнительно можно проверить другие функции, в том числе экспрессию трансгена в пермиссивных условиях.

[0067] Используемые в данном документе фразы «модифицированный ITR» или «mod-ITR» или «мутантный ITR» являются взаимозаменяемыми и относятся к ITR, который имеет мутацию по меньшей мере в одном или нескольких нуклеотидах по сравнению с WT-ITR из того же серотипа. Мутация может приводить к изменению одной или нескольких из областей A, C, C', B, B' в ITR, и может приводить к изменению трехмерной пространственной организации (т.е. ее трехмерной структуры в геометрическом пространстве) по сравнению с трехмерной пространственной организацией WT-ITR того же серотипа.

[0068] Используемый в данном документе термин «асимметричные ITR», также называемый «асимметричными парами ITR», относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые не являются обратными комплементами по их полной длине. В качестве одного неограничивающего примера, ITR в асимметричной паре не имеет симметричной трехмерной пространственной организации со своим ITR-партнером, так что их трехмерные структуры имеют разную форму в геометрическом пространстве. Иными словами, ITR в асимметричной паре имеют разную общую геометрическую структуру, т.е. они имеют разную организацию своих A, C-C'- и B-B'-петель в трехмерном пространстве (например, один ITR может иметь короткое плечо C-C’ и/или короткое плечо B-B' по сравнению с ITR-партнером). Различие в последовательностях между двумя ITR может быть связано с добавлением, делецией, усечением или точечной мутацией одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте реализации один ITR асимметричной пары ITR может быть последовательностью ITR ААВ дикого типа, а другой ITR - модифицированным ITR, как определено в данном документе (например, последовательностью ITR не-дикого типа или синтетической). В другом варианте реализации ни один из ITR асимметричной пары ITR не является последовательностью ААВ дикого типа, и указанные два ITR представляют собой модифицированные ITR, которые имеют разную форму в геометрическом пространстве (т.е. разную общую геометрическую структуру). В некоторых вариантах реализации один mod-ITR асимметричной пары ITR может иметь короткое C-C'-плечо, а другой ITR может иметь другую модификацию (например, одно плечо или короткое B-B'-плечо и т.д.), так что они имеют различную трехмерную пространственную организацию по сравнению с парным ему асимметричным mod-ITR.

[0069] Используемый в данном документе термин «симметричные ITR» относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые мутированы или модифицированы относительно последовательностей депендовирусных ITR дикого типа и являются обратными комплементами по всей своей длине. Ни один из ITR не является последовательностью ITR ААВ2 дикого типа (т.е. они представляют собой модифицированные ITR, также называемые мутантными ITR), и может отличаться от последовательности ITR дикого типа вследствие добавления, делеции, замены, усечения или точечной мутации нуклеотидов. Для удобства в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' (выше) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется «5'-ITR» или «левым ITR», а ITR, расположенный со стороны 3’ (ниже) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3’-ITR» или «правый ITR».

[0070] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные модифицированные ITR» или «по существу симметричная пара mod-ITR» относится к паре модифицированных ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба имеют обратно комплементарные последовательности по всей своей длине. Например, модифицированный ITR может считаться по существу симметричным, даже имея некоторые нуклеотидные последовательности, отклоняющиеся от обратно комплементарной последовательности, если указанные изменения не влияют на свойства и общую форму. В качестве одного неограничивающего примера, последовательность, которая имеет идентичность последовательностей по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию с парным к ней модифицированным ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. Иными словами, по существу симметричная пара модифицированных ITR имеет одинаковую организацию A, C-C' и B-B’-петель в трехмерном пространстве. В некоторых вариантах реализации ITR из пары mod-ITR могут иметь разные обратно комплементарные нуклеотидные последовательности, но все же имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию, т.е. оба ITR имеют мутации, которые приводят к одинаковой общей трехмерной форме. Например, один ITR (например, 5'-ITR) в паре mod-ITR может принадлежать к одному серотипу, а другой ITR (например, 3'-ITR) может принадлежать к другому серотипу, однако оба могут иметь одинаковые соответствующие мутации (например, если 5'ITR имеет делецию в области C, то родственный ему модифицированный 3'ITR другого серотипа имеет делецию в соответствующей позиции в области C'), так что пара модифицированных ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. В таких вариантах реализации каждый ITR в модифицированной паре ITR может принадлежать к разным серотипам (например, ААВ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), такой как комбинация ААВ2 и ААВ6, с модификацией в одном ITR, отображаемой в соответствующей позиции в ITR-партнере из другого серотипа. В одном варианте реализации пара по существу симметричных модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR), при условии, что разница в нуклеотидных последовательностях между ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. В качестве неограничивающего примера, mod-ITR имеет идентичность последовательностей по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с каноническим mod-ITR, определенную стандартными средствами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)) или BLASTN с настройками по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то парный ему mod-ITR имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных петель A и B-B' одинаковой формы в геометрическом пространстве с парным ему mod-ITR.

[0071] Термин «фланкирование» относится к относительному положению одной последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к другой последовательности нуклеиновой кислоты. В общем, в последовательности ABC A и C фланкируют B. То же самое относится к схеме расположения AxBxC. Таким образом, фланкирующая последовательность предшествует или следует за фланкируемой последовательностью, но не обязательно должна быть смежной с фланкируемой последовательностью или непосредственно прилегать к ней. В одном варианте реализации термин фланкирование относится к концевым повторам на каждом конце линейного дуплексного зкДНК-вектора.

[0072] Используемый в данном документе термин «геном зкДНК» относится к экспрессионной кассеты, которая дополнительно включает, по меньшей мере, одну область инвертированного концевого повтора. Геном зкДНК может дополнительно содержать одну или несколько спейсерных областей. В некоторых вариантах реализации геном зкДНК включен в виде межмолекулярного дуплексного полинуклеотида ДНК в плазмиду или вирусный геном.

[0073] Используемый в данном документе термин «спейсерная область зкДНК» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в зкДНК-векторе или геноме зкДНК. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК удерживают два функциональных элемента на желаемом расстоянии для оптимальной функциональности. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК обеспечивают или увеличивают генетическую стабильность генома зкДНК в составе, например, плазмиды или бакуловируса. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК облегчают генетическое манипулирование геномом зкДНК, обеспечивая удобное расположение сайтов клонирования и т.п. Например, в определенных аспектах олигонуклеотидный «полилинкер», содержащий несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами, или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированная таким образом, чтобы она не содержал известных сайтов связывания белка (например, транскрипционного фактора), могут быть размещены в зкДНК-геноме для разделения цис-действующих факторов, например, посредством вставок 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.д., между сайтом концевого разрешения и вышележащим регуляторным элементом транскрипции. Аналогично, спейсер может быть включен между сигнальной последовательностью полиаденилирования и 3'-сайтом концевого разрешения.

[0074] Используемые в данном документе термины «Rep-связывающий сайт», «элемент связывания Rep», «RBE» и «RBS» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту связывания белка Rep (например, Rep 78 ААВ или Rep 68 ААВ), который после связывания белком Rep позволяет белку Rep проявлять свою сайт-специфическую эндонуклеазную активность в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и ее обратный комплемент вместе образуют один RBS. Последовательности RBS известны в данной области и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), представляющую собой последовательность RBS, идентифицированную в ААВ2. Любая известная последовательность RBS может быть использована в вариантах реализации изобретения, включая другие известные последовательности RBS ААВ и другие известные природные или синтетические последовательности RBS. Без связи с какой-либо теорией, считается, что нуклеазный домен белка Rep связывается с дуплексной последовательностью нуклеотидов GCTC и, соответственно, происходит прямое связывание и стабильная сборка двух известных белков Rep ААВ на дуплексном олигонуклеотиде 5’-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3’ (SEQ ID NO: 60). Кроме того, растворимые агрегированные конформеры (т.е. неопределенное число взаимосвязанных белков Rep) диссоциируют и связываются с олигонуклеотидами, которые содержат сайты связывания Rep. Каждый белок Rep взаимодействует как с азотистыми основаниями, так и с фосфодиэфирным остовом каждой цепи. Взаимодействия с азотистыми основаниями обеспечивают специфичность в отношении последовательности, в то время как взаимодействия с фосфодиэфирным остовом являются неспецифическими или менее специфическими по отношению к последовательности и стабилизируют комплекс белок-ДНК.

[0075] Используемые в данном документе термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином, с образованием 3'-ОН, который служит субстратом для удлинения ДНК с помощью клеточной ДНК-полимеразы, например, ДНК-полимеразы дельта или ДНК-полимеразы эпсилон. Альтернативно, комплекс Rep-тимидин может участвовать в скоординированной реакции лигирования. В некоторых вариантах реализации TRS охватывает, как минимум, неспаренный с основанием тимидин. В некоторых вариантах реализации никующую эффективность TRS можно контролировать, по меньшей мере частично, посредством его расстояния от RBS в одной и той же молекуле. Когда акцепторный субстрат является комплементарным ITR, то получаемый продукт представляет собой внутримолекулярный дуплекс. Последовательности TRS известны в данной области и включают, например, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 61), представляющую собой гексануклеотидную последовательность, идентифицированную в ААВ2. Любая известная последовательность TRS может быть использована в вариантах реализации данного изобретения, включая другие известные последовательности TRS ААВ и другие известные природные или синтетические последовательности TRS, такие как AGTT (SEQ ID NO: 62), GGTTGG (SEQ ID NO: 63), AGTTGG (SEQ ID NO: 64), AGTTGA (SEQ ID NO: 65) и другие мотивы, такие как RRTTRR (SEQ ID NO: 66).

[0076] Используемый в данном документе термин «зкДНК-плазмида» относится к плазмиде, которая содержит геном зкДНК в качестве межмолекулярного дуплекса.

[0077] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, содержащему геном зкДНК в качестве межмолекулярного дуплекса, который способен размножаться в E.coli в виде плазмиды и, таким образом, может выступать в роли челночного вектора для бакуловируса.

[0078] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит геном зкДНК в виде межмолекулярного дуплекса в геноме бакуловируса.

[0079] Используемые в данном документе термины «клетка насекомого, инфицированного зкДНК-бакуловирусом» и «зкДНК-BIIC» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке-хозяину из беспозвоночного животного (включая, без ограничений, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированной зкДНК-бакуловирусом.

[0080] Используемый в данном документе термин «ДНК-вектор с замкнутыми концами» относится к бескапсидному ДНК-вектору с по меньшей мере одним ковалентно замкнутым концом, причем по меньшей мере часть вектора имеет внутримолекулярную дуплексную структуру.

[0081] Используемые в данном документе термины «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо и относятся к ДНК-вектору с замкнутыми концами, содержащему по меньшей мере один концевой палиндром. В некоторых вариантах реализации зкДНК содержит два ковалентно замкнутых конца.

[0082] Как определено в данном документе, «репортеры» относятся к белкам, которые могут использоваться для обеспечения детектируемых показаний. Репортеры обычно генерируют измеримый сигнал, такой как флуоресцентный, цветовой или люминесцентный. Кодирующие последовательности репортерных белков кодируют белки, присутствие которых в клетке или организме легко поддается наблюдению. Например, флуоресцентные белки вызывают флуоресценцию клетки при возбуждении светом определенной длины волны, люциферазы вызывают катализ клеткой реакции, генерирующей свет, а ферменты, такие как β-галактозидаза, превращают субстрат в окрашенный продукт. Типичные примеры репортерных полипептидов, пригодных для экспериментальных или диагностических целей, включают, без ограничения перечисленными, β-лактамазу, β-галактозидазу (LacZ), щелочную фосфатазу (AP), тимидинкиназу (TK), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие флуоресцентные белки, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), люциферазу и другие, хорошо известные в данной области.

[0083] Используемый в данном документе термин «эффекторный белок» относится к полипептиду, который обеспечивает детектируемые показания, либо, например, как репортерный полипептид, либо, более предпочтительно, как полипептид, убивающий клетку, например, токсин, или агент, придающий клетке чувствительность к киллингу определенным агентом или при отсутствии определенного агента. Эффекторные белки включают любой белок или пептид, которые непосредственно нацелены на ДНК и/или РНК клетки-хозяина или повреждают их. Например, эффекторные белки могут включать, без ограничений, эндонуклеазу рестрикции, которая нацелена на последовательность ДНК клетки-хозяина (будь то геномный или внехромосомный элемент), протеазу, вызывающую деградацию полипептида-мишени, необходимого для выживания клетки, ингибитор ДНК-гиразы и токсин рибонуклеазного типа. В некоторых вариантах реализации экспрессия эффекторного белка, контролируемого синтетическим биологическим контуром, как описано в данном документе, может выступать в роли фактора в другом синтетическом биологическом контуре, расширяя таким образом диапазон и сложность отклика системы биологического контура.

[0084] Регуляторы транскрипции относятся к активаторам и репрессорам транскрипции, которые либо активируют, либо подавляют транскрипцию гена, представляющего интерес. Промоторы представляют собой области нуклеиновой кислоты, которые инициируют транскрипцию конкретного гена. Активаторы транскрипции обычно связываются поблизости от промоторов транскрипции и рекрутируют РНК-полимеразу, чтобы непосредственно инициировать транскрипцию. Репрессоры связываются с промоторами транскрипции и стерически затрудняют инициацию транскрипции с помощью РНК-полимеразы. Другие регуляторы транскрипции могут служить либо активатором, либо репрессором, в зависимости от места их связывания и условий в клетке и окружающей среде. Неограничивающие примеры классов регуляторов транскрипции включают, без ограничений, гомеодоменные белки, белки цинкового пальца, белки с мотивом «крылатая спираль» (белки forkhead) и белки лейциновой молнии.

[0085] Используемый в данном документе термин «белок-репрессор» или «белок-индуктор» представляет собой белок, который связывается с элементом регуляторной последовательности и подавляет или активирует, соответственно, транскрипцию последовательностей, функционально связанных с указанным элементом регуляторной последовательности. Предпочтительные белки-репрессоры и индукторы, как описано в данном документе, чувствительны к присутствию или отсутствию по меньшей мере одного вводимого агента или входного воздействия окружающей среды. Предпочтительные белки, как описано в данном документе, являются модульными по форме и содержат, например, отделяемые ДНК-связывающие, и связывающиеся с входными агентами, или откликающиеся на них, элементы или домены.

[0086] Используемый в данном документе термин «носитель» включает любые растворители, дисперсионные среды, несущие среды, покрытия, разбавители, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Вспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в указанные композиции. Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным субстанциям и композициям, которые не вызывают токсическую, аллергическую или подобную неблагоприятную реакцию при введении хозяину.

[0087] Используемый в данном документе термин «домен, реагирующий на вводимый агент», представляет собой домен транскрипционного фактора, который связывается с, или иначе отвечает на условие или вводимый агент, обеспечивая отклик слитого с ним ДНК-связывающего домена на наличие указанного условия или входного воздействия. В одном варианте реализации наличие условия или входного воздействия приводит к конформационному изменению в домене, чувствительном к вводимому агенту, или в слитом с ним белке, которое модифицирует транскрипционно-модулирующую активность фактора транскрипции.

[0088] Термин «in vivo» относится к анализам или процессам, которые происходят в организме или в пределах организма, такого как многоклеточное животное. В некоторых аспектах, описанных в данном документе, можно сказать, что способ или применение происходит «in vivo», когда используется одноклеточный организм, такой как бактерия. Термин «ex vivo» относится к способам и применениям, которые осуществляют с использованием живой клетки с интактной мембраной, находящейся вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантатов, культивируемых клеток, в том числе первичных клеток и клеточных линий, трансформированных клеточных линий и экстрагированных тканей или клеток, в том числе клеток крови, среди прочего. Термин «in vitro» относится к анализам и способам, которые не требуют присутствия клетки с интактной мембраной, например, проводимым на клеточных экстрактах, и может относиться к введению программируемого синтетического биологического контура в не-клеточную систему, такую как среда, не содержащая клеток или клеточных систем, такая как клеточные экстракты.

[0089] Используемый в данном документе термин «промотор» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты путем управления транскрипцией указанной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой гетерологичный ген-мишень, кодирующий белок или РНК. Промоторы могут быть конститутивными, индуцибельными, репрессируемыми, тканеспецифичными или любой их комбинацией. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, которая контролирует инициацию и уровень транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор также может содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, промотор может управлять экспрессией транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию самого промотора. В последовательности промотора будет присутствовать сайт инициации транскрипции, а также связывающие белки домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, но не всегда, содержат «TATA»-боксы и «CAT»-боксы. Для управления экспрессией трансгенов в зкДНК-векторах, описанных в данном документе, могут применяться различные промоторы, в том числе индуцибельные промоторы. Промоторная последовательность может быть ограничена на своем 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается в восходящем направлении (в направлении к 5'-концу), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициирования транскрипции на уровнях, детектируемых выше фона.

[0090] Используемый в данном документе термин «энхансер» относится к цис-действующей регуляторной последовательности (например, 50-1500 пар оснований), которая связывает один или несколько белков (например, белки-активаторы или фактор транскрипции) для повышения транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии до 1000000 пар оснований выше сайта начала гена или ниже сайта начала гена, который они регулируют. Энхансер может быть расположен в интронной области или в экзонной области не связанного с ним гена.

[0091] Можно сказать, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Выражения «функционально связаны», «функционально расположены», «оперативно связаны», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» указывают, что промотор находится в корректном функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности. «Инвертированный промотор» в данном документе относится к промотору, последовательность нуклеиновой кислоты которого имеет обратную ориентацию, так чтобы кодирующая цепь становилась некодирующей, и наоборот. Инвертированные промоторные последовательности могут использоваться в различных вариантах реализации для регулирования состояния переключателя. Кроме того, в различных вариантах реализации промотор можно использовать совместно с энхансером.

[0092] Промотор может быть естественным образом ассоциирован с геном или последовательностью, что может быть достигнуто путем выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном данного гена или последовательности. Такой промотор можно назвать «эндогенным». Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации энхансер может быть естественным образом ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной либо после, либо перед указанной последовательностью.

[0093] В некоторых вариантах реализации кодирующий сегмент нуклеиновой кислоты помещен под контроль «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора», причем оба термина относятся к промотору, ассоциированному с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, отличной от той, с которой он функционально связан в условиях его естественной среды. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится к энхансеру, обычно не связанному с данной последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «встречающимися в природе», т.е. содержат различные элементы разных транскрипционных регуляторных областей и/или изменяющие экспрессию мутации, введенные с применением способов генетического конструирования, известных в данной области техники. Наряду с получением последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансером синтетическим путем, последовательности промоторов могут быть получены с использованием рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР, применительно к синтетическим биологическим контурам и модулям, раскрытым в данном документе (см., например, патент США № 4683202, патент США № 5928906, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрена также возможность применения контрольных последовательностей, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.

[0094] Как описано в данном документе, «индуцибельный промотор» представляет собой промотор, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии, под влиянием, или при контакте с, индуктором или индуцирующим агентом. «Индуктор» или «индуцирующий агент», как определено в данном документе, может быть эндогенным или в норме экзогенным соединением или белком, которые вводят таким образом, чтобы обеспечить их активность по индуцированию транскрипционной активности индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуктор или индуцирующий агент, т.е. химическое вещество, соединение или белок, сам может быть получен в результате транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. индуктор может представлять собой индукторный белок, экспрессируемый другим компонентом или модулем), который сам может находиться под контролем индуцибельного промотора. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцибельных промоторов включают, без ограничений, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса и длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие чувствительные к стероидам промоторы, реагирующие на рапамицин промоторы и т.п.

[0095] Термины «регуляторные последовательности ДНК», «контрольные элементы» и «регуляторные элементы», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к контрольным последовательностям транскрипции и трансляции, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют транскрипцию некодирующей последовательности (например, нацеливающей на ДНК РНК) или кодирующей последовательности (например, сайт-направленного модифицирующего полипептида или полипептида Cas9/Csn1) и/или регулируют трансляцию кодируемого полипептида.

[0096] «Функционально связанный» относится к размещению в непосредственной близости, при котором описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать по назначению. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. «Экспрессионная кассета» включает в себя гетерологичную последовательность ДНК, которая функционально связана с промотором или другой регуляторной последовательностью, достаточной для направления транскрипции трансгена в зкДНК-векторе. Подходящие промоторы включают, например, тканеспецифичные промоторы. Промоторы также могут иметь происхождение от ААВ.

[0097] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или животному, лечение которых, включая профилактическое лечение, проводится с помощью зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением. Обычно животное представляет собой позвоночное животное, такое как, без ограничения, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. К приматам относятся, без ограничений, шимпанзе, яванские макаки, коаты и макаки, например, макаки-резусы. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, без ограничений, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, виды кошачьих, например, домашнюю кошку, виды собачьих, например, собак, лис, волков, виды птиц, например, кур, эму, страуса, и рыб, например, форель, сома и лосося. В определенных вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, указанным субъектом является млекопитающее, например, примат или человек. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъект может быть младенцем или ребенком. В некоторых вариантах реализации указанный субъект может представлять собой новорожденного или нерожденного субъекта, например, субъекта in utero. Предпочтительно, субъект является млекопитающим. Млекопитающее может быть человеком, не являющимся человеком приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, без ограничения этими примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут быть выгодно использованы в качестве субъектов, являющихся животными моделями заболеваний и расстройств. Кроме того, способы и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы для одомашненных животных и/или домашних животных. Человек может быть любого возраста, пола, принадлежать к любой расе или этнической группе, например, может быть европеоидом (белым), азиатом, африканцем, черным, афроамериканцем, афроевропейцем, испаноамериканцем, представителем ближневосточного этноса и т.д. В некоторых вариантах субъект может представлять собой пациента или другого субъекта в клинических условиях. В некоторых вариантах реализации, указанный субъект уже проходит курс лечения. В некоторых вариантах реализации субъект является эмбрионом, плодом, новорожденным, младенцем, ребенком, подростком или взрослым. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой плод человека, человеческого новорожденного, младенца человека, ребенка человека, подростка или взрослого человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион животного или эмбрион, не принадлежащий человеку, или эмбрион примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человеческий эмбрион.

[0098] Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» включает любой тип клеток, которые являются восприимчивыми к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с использованием конструкта нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии зкДНК по данному изобретению. В качестве неограничивающих примеров клетка-хозяин может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, клетки CD34⁺), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из ряда иммортализованных клеточных линий (например, клетки HepG2). Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой клетку in situ или in vivo в ткани, органе или организме.

[0099] Термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, отличной от ее природного источника. Термин «экзогенный» при использовании в данном документе может относиться к нуклеиновой кислоте (например, нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они обычно не присутствуют, причем введение нуклеиновой кислоты или полипептида в такую клетку или организм является желательным. Альтернативно, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они присутствуют в относительно небольших количествах, когда желательно увеличение количества нуклеиновой кислоты или полипептида в указанных клетке или организме, например, для создания эктопической экспрессии или уровней. Напротив, термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для биологической системы или клетки.

[00100] Термин «идентичность последовательности» относится к сродству между двумя нуклеотидными последовательностями. Для целей данного изобретения степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры: штраф за открытие пробела 10, штраф за расширение пробела 0,5 и матрица замещения EDNAFULL (версия EMBOSS NCBI NUC4.4). Выходной параметр Нидла, обозначенный как «самая длинная идентичность» (полученный с использованием параметра -nobrief), используется в качестве процентной идентичности и рассчитываются следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды х 100) / (Длина выравнивания - Общее число пробелов в выравнивании). Длина выравнивания предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 50 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100 нуклеотидов.

[00101] Термин «гомология» или «гомологичный», используемый в данном документе, определяется как процент нуклеотидных остатков в гомологичном плече, которые идентичны нуклеотидным остаткам в соответствующей последовательности на хромосоме-мишени после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента гомологии нуклеотидных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как прикладные программы BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность ДНК), например, гомологичное плечо, считается «гомологичной», когда последовательность является идентичной, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, соответствующей нативной или неотредактированной последовательности нуклеиновой кислоты (например, геномной последовательности) клетки-хозяина.

[00102] Термин «гетерологичный», используемый в данном документе, означает нуклеотидную или полипептидную последовательность, которая не обнаружена в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с природной последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, с помощью генной инженерии) для получения химерной нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный полипептид. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с вариантом полипептида (например, с помощью генной инженерии) для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант слитого полипептида.

[00103] «Вектор» или «экспрессионный вектор» представляет собой репликон, такой как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, т.е. «вставка», чтобы вызвать репликацию прикрепленного сегмента в клетке. Вектор может представлять собой конструкт нуклеиновой кислоты, предназначенный для доставки в клетку-хозяина или для переноса между различными клетками-хозяевами. В используемом в данном документе значении, вектор может быть вирусным или невирусным по происхождению и/или в конечной форме, однако для целей данного изобретения «вектор» обычно относится к зкДНК-вектору, как этот термин используется в данном документе. Термин «вектор» охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации, когда он связан с надлежащими контрольными элементами, и который может переносить генные последовательности в клетки. В некоторых вариантах реализации вектор может представлять собой экспрессионный вектор или рекомбинантный вектор.

[00104] Используемый в данном документе термин «экспрессионный вектор» относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в векторе. Экспрессируемые последовательности часто, но не обязательно, будут гетерологичными по отношению к клетке. Экспрессионный вектор может содержать дополнительные элементы, например, экспрессионный вектор может иметь две системы репликации, что позволяет поддерживать его в двух организмах, например, в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Термин «экспрессия» относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков и, при необходимости, в секретировании белков, включая, когда это применимо, без ограничений, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и укладку белка, модификацию и процессинг. «Продукты экспрессии» включают РНК, транскрибируемую с гена, и полипептиды, полученные путем трансляции мРНК, транскрибированной с гена. Термин «ген» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (ДНК) в РНК in vitro или in vivo, когда она функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями. Ген может включать или не включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, например, 5'-нетранслируемые (5'UTR) или «лидерные» последовательности и 3'-UTR или «трейлерные» последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами).

[00105] Под «рекомбинантным вектором» подразумевается вектор, который включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, или «трансген», способный к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в данном документе, в некоторых вариантах реализации можно комбинировать с другими подходящими композициями и терапиями. В некоторых вариантах реализации вектор является эписомальным. Использование подходящего эписомального вектора обеспечивает средства поддержания представляющего интерес нуклеотида у субъекта в многокопийной экстрахромосомной ДНК, тем самым устраняя потенциальные эффекты интеграции хромосом.

[00106] Используемое в данном документе выражение «генетическое заболевание» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или косвенно, вызванному одной или несколькими аномалиями в геноме, особенно, к состоянию, присутствующему с момента рождения. Аномалия может быть мутацией, вставкой или делецией. Аномалия может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Генетическим заболеванием могут быть, без ограничений, МДД (мышечная дистрофия Дюшенна), гемофилия, муковисцидоз, хорея Гентингтона, семейная гиперхолестеринемия (дефект рецептора ЛПНП), гепатобластома, болезнь Вильсона, врожденная печеночная порфирия, наследственные нарушения метаболизма печени, синдром Леша-Нихана, серповидноклеточная анемия, талассемии, пигментная ксеродерма, анемия Фанкони, пигментный ретинит, атаксия-телеангиэктазия, синдром Блума, ретинобластома и болезнь Тея-Сакса.

[00107] Используемый в данном документе термин «содержащий» или «содержит» используется в отношении композиций, способов и их соответствующих компонентов, которые важны для способа или композиции, но допускают включение неуказанных элементов, будь то существенных или нет.

[00108] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к тем элементам, которые необходимы для данного варианта реализации. Этот термин допускает присутствие элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики этого варианта реализации. Использование слова «содержащий» указывает на включение, а не на ограничение.

[00109] Термин «состоящий из» относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, как описано в данном документе, которые исключают любой элемент, не указанный в этом описании варианта реализации.

[00110] Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, в том числе сопровождаемые определением «указанный» (в английском тексте - с артиклями "a", "an" и "the») включают ссылки на формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или несколько способов и/или этапов описанного в данном документе типа, и/или таких, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного изобретения, и т.д. Аналогично, предусматривается, что термин «или» включает «и», если из контекста явным образом не следует иное. Хотя при практической реализации или тестировании данного изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Сокращение «напр.» используется в данном документе для описания неограничивающего примера. Таким образом, сокращение «напр.» является синонимом термина «например».

[00111] За исключением рабочих примеров или иных указанных случаев, все числа, отражающие количества ингредиентов или условия реакции согласно данному изобретению, во всех случаях должны пониматься как модифицированные термином «приблизительно». Термин «приблизительно» применительно к процентам может означать ±1%. Данное изобретение дополнительно более подробно поясняется в приведенных ниже примерах, однако объем данного изобретения не ограничен ими.

[00112] Группы альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, раскрытых в данном документе, не должны рассматриваться как ограничения. На каждый член группы можно ссылаться и заявлять его индивидуально или в любой комбинации с другими членами указанной группы или другими элементами, упоминаемыми в данном документе. Один или несколько членов группы могут быть включены в группу или исключены из нее из соображений удобства и/или патентоспособности. При любом таком включении или удалении в данном документе считается, что описание изобретения содержит измененную группу, тем самым удовлетворяя условию письменного описания всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.

[00113] В некоторых вариантах реализации любого из аспектов, изобретение, описанное в данном документе, не касается процесса клонирования людей, процессов модификации генетической идентичности зародышевой линии людей, использования человеческих эмбрионов в промышленных или коммерческих целях, или процессов модификации генетической идентичности животных, которые вероятно могут причинить им страдания без какой-либо существенной медицинской выгоды для человека или животного, а также животных, возникающих в результате таких процессов.

[00114] Определения других терминов приведены в данном документе в описании различных аспектов изобретения.

[00115] Все патенты и другие публикации; включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки; упомянутые в данной заявке, явным образом включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с технологией, описанной в данном документе. Эти публикации представлены исключительно по причине их раскрытия до даты подачи данной заявки. Ничто в этом отношении не должно быть истолковано как признание того, что авторы изобретения не обладают правами на более раннее изобретение по отношению к такому раскрытию в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не означают допущения каким-либо образом признания правильности дат или содержания этих документов.

[00116] Описание вариантов реализации изобретения не должно рассматриваться как исчерпывающее или ограничивающее изобретение точной раскрытой формой. Хотя в данном документе описаны в иллюстративных целях конкретные варианты реализации и примеры раскрытия, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема раскрытия, как будет понятно специалистам в соответствующей области техники. Например, хотя стадии или функции способа представлены в указанном порядке, в альтернативных вариантах реализации функции могут выполняться в другом порядке, или функции могут выполняться по существу одновременно. Принципиальные положения изобретения, представленные в данном документе, могут быть применены к другим процедурам или методам в зависимости от ситуации. Различные варианты реализации, описанные в данном документе, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов реализации. Аспекты раскрытия могут быть модифицированы, при необходимости, для использования составов, функций и концепций вышеупомянутых ссылок и применения для обеспечения дополнительных вариантов реализации изобретения. Кроме того, из соображений биологической функциональной эквивалентности могут быть выполнены некоторые изменения в структуре белка, не влияющие на биологическое или химическое действие в натуральном или количественном отношении. Эти и другие изменения могут быть внесены в раскрытие в свете подробного описания. Все такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.

[00117] Конкретные элементы любого из вышеупомянутых вариантов реализации могут быть объединены или заменены элементами других вариантов реализации. Кроме того, хотя преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации изобретения, были описаны в контексте этих вариантов реализации, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и не все варианты реализации обязательно должны демонстрировать такие преимущества, чтобы попадать в объем раскрытия.

[00118] Описанная в данном документе технология дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не должны рассматриваться как дополнительные ограничения. Следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, реагентами и т.д., описанными в данном документе, которые фактически могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

II. Экспрессия антитела или слитого белка из зкДНК-вектора

[00119] Описанная в данном документе технология направлена в общем на экспрессию и/или продуцирование антитела или слитого белка в клетке из невирусного ДНК-вектора, например, зкДНК-вектора, как описано в данном документе. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «зкДНК-векторы в целом». В частности, зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков содержат пару ITR (например, симметричных или ассиметричных, как описано в данном документе) и между парой ITR - нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или слитый белок, как описано в данном документе, функционально связанную с промотором или регуляторной последовательностью. Очевидное преимущество зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков по сравнению с традиционными векторами ААВ и даже лентивирусными векторами заключается в отсутствии ограничений по размеру для последовательностей гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих желаемый белок. Таким образом, даже полноразмерное антитело, содержащее, например, две области Fc тяжелой цепи, линкер и фрагмент Fab, может экспрессироваться из одного зкДНК-вектора. В частности, для экспрессии и/или продуцирования антител, учитывая их размер, зкДНК-вектор может быть предпочтительным по сравнению с традиционными векторами из-за простоты использования и отсутствия ограничений по размеру, что позволяет легко экспрессировать антитела (включая мультимерные антитела) с различными доменными структурами контролируемым образом. Кроме того, может проводиться многократное введение, позволяющее вводить коктейли из разных зкДНК-векторов, экспрессирующих разные антитела или слитые белки. Таким образом, зкДНК-векторы, описанные в данном документе, можно использовать для экспрессии терапевтического антитела или слитого белка у нуждающегося в этом субъекта. Альтернативно, зкДНК-векторы могут быть использованы в производстве антител или слитых белков в коммерческих условиях, например, с использованием биореактора, или для продуцирования в желаемом хозяине.

[00120] Должно быть понятно, что описанные в данном документе технологии зкДНК-векторов могут быть адаптированы к любому уровню сложности или могут использоваться модульно, причем экспрессия различных компонентов антитела или слитого белка может контролироваться независимо. Например, конкретно предусматривается, что разработанные в данном документе технологии зкДНК-векторов могут быть такими же простыми, как использование одного зкДНК-вектора для экспрессии одной гетерологичной генной последовательности (например, тяжелой цепи или легкой цепи желаемого антитела), или могут быть настолько же сложными, как использование множества зкДНК-векторов, где каждый вектор экспрессирует множество антител или компонентов антител, каждое из которых независимо контролируется разными промоторами. Описанные далее варианты реализации конкретно предусматриваются в данном документе и могут быть адаптированы специалистом в данной области техники желательным образом.

[00121] В одном варианте реализации один зкДНК-вектор может использоваться для экспрессии одного компонента антитела или слитого белка, например, тяжелой цепи или легкой цепи. Альтернативно, один зкДНК-вектор может быть использован для экспрессии нескольких компонентов (например, по меньшей мере 2) антитела или слитого белка под контролем одного промотора (например, сильного промотора), необязательно, с использованием последовательности (последовательностей) IRES для обеспечения надлежащей экспрессии каждого из компонентов.

[00122] В данном документе также предусматривается, в другом варианте реализации, один зкДНК-вектор, содержащий по меньшей мере две вставки (например, экспрессирующие тяжелую цепь или легкую цепь), причем экспрессия каждой вставки находится под контролем ее собственного промотора. Промоторы могут включать несколько копий одного и того же промотора, несколько разных промоторов или любую их комбинацию. Специалисту в данной области понятно, что часто бывает желательно экспрессировать компоненты антитела с разными уровнями экспрессии, тем самым контролируя стехиометрию отдельных экспрессируемых компонентов для обеспечения эффективной укладки и комбинирования антител в клетке.

[00123] Специалист в данной области может предусмотреть дополнительные варианты технологий зкДНК-векторов или адаптировать их к методам получения антител с использованием традиционных векторов.

А. Гетерогенные последовательности для экспрессии антитела или слитого белка

[00124] По существу любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, функциональный фрагмент) или слитый белок могут экспрессироваться из зкДНК-вектора, как описано в данном документе. Специалисту в данной области понятно, что фрагмент антитела содержит, как минимум, аминокислоты, необходимые для связывания антигена или эпитопа (например, scAb, Fab, F(ab')₂, dAb и Fv). Например, молекула антитела может включать последовательность вариабельного домена тяжелой (H) цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как VH) и последовательность вариабельного домена легкой (L) цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как VL). В одном варианте реализации молекула антитела содержит, или состоит из, тяжелой цепи и легкой цепи (называемых в данном документе полуантителом). В другом примере молекула антитела включает две последовательности вариабельного домена тяжелой (H) цепи и две последовательности вариабельного домена легкой (L) цепи, образуя тем самым два антигенсвязывающих сайта, таких как Fab, Fab', F(ab')₂, Fc , Fd, Fd', Fv, одноцепочечные антитела (например, scFv), антитела с одним вариабельным доменом, диатела (Dab) (двухвалентные и биспецифичные) и химерные (например, гуманизированные) антитела, которые могут быть получены путем модификации целых антител, или синтезированы de novo с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Такие функциональные фрагменты антител сохраняют способность избирательно связываться с их соответствующим антигеном или эпитопом и активировать или ингибировать белок-мишень.

[00125] Данный документ также охватывает зкДНК-векторы, экспрессирующие слитые белки. В некоторых вариантах реализации слитый белок представляет собой биофункциональный слитый белок. В некоторых вариантах реализации слитый белок пригоден для технологии ловушек, например, ловушек антитело-лиганд, в которых слитый белок содержит антитело (например, моноспецифическое или биспецифическое антитело) или фрагмент антитела (например, антигенсвязывающий фрагмент), слитый с пептидом, или лиганд-связывающий домен или рецепторный домен, который захватывает лиганд, тем самым ингибируя активность лиганда. Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может кодировать и экспрессировать слитый белок, который в данной области называется ловушкой или Y-ловушкой. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, используется для экспрессии слитого белка, например, слитого белка VEGF-Trap, слитого белка IGF-trap (см. Vaniotis et al., Sci Rep, 2018, 8(1), 17361) или слитого белка TGFβ-Trap. Типичным примером TGFβ-ловушки является Y-ловушка, например, бифункциональная ловушка антитело-лиганд (Y-ловушка), содержащая антитело, нацеленное на CTLA-4 и/или PD-L1, слитое с последовательностью эктодомена рецептора TGFβ II, которая одновременно блокирует аутокринный/паракринный TGFβ в микросреде клетки-мишени (a-CTLA4-TGFβRIIecd и a-PDL1-TGFβRIIecd) (см., например, Ravi et al., Nat Comm 2018, 9(1); 741). В некоторых вариантах реализации слитый белок, включенный для использования по данному документу и экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой ловушку антитело-лиганд, причем слитый белок содержит антитело или фрагмент антитела (например, антигенсвязывающий фрагмент), слитый с лиганд-связывающим доменом или рецепторным доменом (например, внеклеточным рецепторным доменом), который захватывает лиганд, при этом лиганд выбирают из любых общеизвестных факторов роста или лигандов, включая, без ограничений, IGF, VEGF, TGFβ, ФНОα, EGF, NGF, PDGF, LFA-3, CTLA-4, IL-1, TPO.

[00126] Типичные примеры слитых белков включают, без ограничений, этанерцепт (ENBREL®), который содержит 75 кДа растворимый внеклеточный домен (ECD) рецептора II фактора некроза опухоли (ФНО), слитый с человеческим Fc IgG1; алефацепт (AMEVIVE®), который содержит первый ECD антигена 3, связанного с функцией лимфоцитов (LFA-3), слитый с Fc человеческого IgG1; абатацепт (ORENCIA®), который содержит ECD молекулы цитотоксического Т-лимфоцита человека-4 (CTLA-4), слитый с человеческим Fc IgG1; рилонацепт (ARCALYST®), который содержит две цепи, каждая из которых содержит С-конец лигандсвязывающей области вспомогательного белка-IL-1R, слитый с N-концом ECD IL-1RI, слитым с Fc человеческого IgG1; ромиплостим (NPLATE®), который содержит пептидный миметик тромбопоэтина (ТПО), слитый с С-концом агликозилированного человеческого Fc IgG1; белатацепт (NULOJIX®), который содержит ECD CTLA-4, слитый с человеческим Fc IgG1, и отличается от абатацепта двумя аминокислотными заменами (L104E, A29Y) в области CTLA-4.

[00127] Антитела и фрагменты антител могут принадлежать к любому классу антител, включая, без ограничений, IgG, IgA, IgM, IgD и IgE, и любому подклассу антител (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Антитело может быть моноклональным. Антитело, полученное с использованием способов, описанных в данном документе, может представлять собой человеческое, гуманизированное, CDR-привитое или созданное in vitro антитело. Антитело может иметь константную область тяжелой цепи, выбранную, например, из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитело также может иметь легкую цепь, выбранную, например, из цепей каппа или лямбда. Термин «иммуноглобулин» (Ig) используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «антитело». Вставляя кодирующие последовательности таких антител в зкДНК-вектор, можно получить практически любое антитело. В одном варианте реализации гены легкой цепи и тяжелой цепи находятся под контролем регуляторного переключателя. В тех же или альтернативных вариантах реализации, гены легкой и тяжелой цепей связаны с последовательностью IRES (например, SEQ ID NO: 190).

[00128] Как правило, ген антитела или слитого белка также кодирует секреторную последовательность, так чтобы антитело направлялось в аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум (ЭР), где происходит укладка антитела в правильную конформацию молекулами-шаперонами при его прохождении через ЭР и выходе из клетки. Типичные примеры секреторных последовательностей включают, без ограничений, VH-02 (SEQ ID NO: 88) и (abd) VK-A26 (SEQ ID NO: 89) и сигнальную последовательность Igĸ (SEQ ID NO: 126), а также секреторный сигнал Gluc, позволяющий меченому белку секретироваться из цитозоля (SEQ ID NO: 188), секреторная последовательность TMD-ST, направляющая меченый белок в аппарат Гольджи (SEQ ID NO: 189).

[00129] Когда желательно получить интратело, нуклеиновая кислота или ген, кодирующие антитело, обычно не кодируют секреторную последовательность. В некоторых случаях они могут кодировать секреторную последовательность, но также имеют предполагаемую нацеливающую последовательность, такую как, без ограничений, последовательность KDEL, для его удерживания в клетке. В других вариантах реализации гены интратела кодируют другую последовательность внутриклеточного нацеливания, например, последовательность ядерной локализации.

[00130] Регуляторные переключатели могут быть использованы для точной настройки экспрессии антител (включая интратела) или слитых белков, так что антитело экспрессировалось желательным образом, включая, без ограничений, экспрессию антитела или слитого белка с желаемым уровнем экспрессии или количеством или, альтернативно, в случае наличия или отсутствия определенного сигнала, включая событие клеточной сигнализации. Например, как описано в данном документе, экспрессия антитела или слитого белка из зкДНК-вектора может быть включена или выключена при возникновении определенного состояния, как описано в разделе данного документа, озаглавленном «Регуляторные переключатели».

[00131] Например, и только в целях иллюстрации, антитела или слитые белки могут быть использованы для выключения нежелательной реакции, как в случае антител против ФНОα, таких как адалимумаб. В других случаях антитело или слитый белок могут помогать усиливать иммунную реакцию. Например, по отношению к злокачественной клетке, например, опухолевой. Ген антитела может содержать опухолеассоциированный маркер для переноса антитела к желаемой клетке. Однако в любой ситуации может быть желательным регулировать экспрессию антитела или слитого белка. зкДНК-векторы позволяют легко приспособить регуляторные переключатели для использования вместе с антителами. зкДНК-векторы также позволяют контролировать стехиометрию тяжелой и легкой цепей. Примеры слитых белков включают, без ограничений, технологии VEGF-ловушка (VEGF-trap) и TGFβ-ловушка (TGFβ-trap).

[00132] Молекулы антител включают интактные молекулы, а также их антигенсвязывающие фрагменты и их функциональные фрагменты. Константные области молекул антитела могут быть изменены, например, мутированы, для модификации свойств антитела (например, для увеличения или уменьшения одного или нескольких из: связывания с Fc-рецептором, количества остатков цистеина и т.д.). Примеры антигенсвязывающих фрагментов молекулы антитела включают, без ограничений: (i) фрагмент Fab, представляющий собой одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, представляющий собой бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент диатела (dAb), который состоит из домена VH; (vi) вариабельный домен верблюжьего или камелизированного антитела; (vii) одноцепочечный Fv (scFv), см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); (viii) однодоменное антитело. Эти фрагменты антител получают с использованием зкДНК-векторов, и они могут быть подвернуты скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела.

[00133] Несомненным преимуществом зкДНК-векторов по сравнению с традиционными ААВ-векторами и даже лентивирусными векторами является отсутствие ограничений по размеру последовательностей гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих желаемый белок. Таким образом, даже полноразмерное антитело, содержащее две области Fc тяжелой цепи, линкер и фрагмент Fab, может экспрессироваться из одного зкДНК-вектора. Кроме того, в зависимости от необходимой стехиометрии, можно экспрессировать несколько сегментов одного и того же антитела или слитого белка, например, легкую цепь и тяжелую цепь, и можно использовать одинаковые или разные промоторы, а также можно использовать регуляторные переключатели для точной настройки экспрессии каждой области. Например, как показано в примерах, можно использовать зкДНК-вектор, содержащий двойную промоторную систему, так чтобы для каждой из тяжелой цепи и легкой цепи антитела адуканумаба использовался отдельный промотор. Использование зкДНК-плазмиды для продуцирования антитела или слитого белка может включать уникальную комбинацию промоторов для экспрессии тяжелой и легкой цепей, которая приводит к надлежащим соотношениям тяжелой и легкой цепей для образования функционального антитела или слитого белка. Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может использоваться для экспрессии различных областей антитела или слитого белка по отдельности (например, под контролем другого промотора). В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь, может быть функционально связана с первым промотором или первым регуляторным переключателем, а нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь, может быть функционально связана со вторым промотором или вторым регуляторным переключателем, обеспечивая таким образом контролируемую или регулируемую экспрессию тяжелой цепи и легкой цепи независимо друг от друга, позволяющую контролировать соотношения тяжелой цепи и легкой цепи для продуцирования функционального антитела или слитого белка.

[00134] Экспрессия антитела или слитого белка из зкДНК-вектора может быть достигнута как в пространстве, так и во времени, с использованием одного или нескольких индуцируемых или репрессируемых промоторов.

[00135] Молекулы антител также могут быть однодоменными антителами. Однодоменные антитела могут включать антитела, определяющие комплементарность области которого являются частью однодоменного полипептида. Примеры включают, без ограничений, антитела с тяжелой цепью, антитела, естественным образом лишенные легких цепей, однодоменные антитела, полученные из обычных 4-цепочечных антител, сконструированные антитела и однодоменные скаффолды, отличные от полученных из антител. Однодоменные антитела могут быть любыми известными из уровня техники или любыми однодоменными антителами, которые будут разработаны в будущем. Однодоменные антитела могут быть получены от любых видов, включая, без ограничений, мышь, человека, верблюда, ламу, рыб, акул, козу, кролика и жвачных животных.

[00136] В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, которое содержит две или больше вариабельных областей для связывания с по меньшей мере двумя разными эпитопами, например, на одном и том же белке-мишени, или для одновременного нацеливания на по меньшей мере два разных белка. Таким образом, эпитопы, распознаваемые мультиспецифическим антителом, могут находиться на одной и той же или на разных мишенях.

[00137] В других вариантах реализации антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое может распознавать и связываться с по меньшей мере двумя различными эпитопами или мишенями (см., например, Riethmuller, G Cancer Immunity (2012) 12: 12-18; Schaefer W et al. PNAS (2011) 108(27): 11187-92 для типичных структур биспецифических антител). Биспецифические антитела второго поколения, например, «трифункциональные биспецифические» антитела, также предусматриваются со способами и композициями, описанными в данном документе.

[00138] В определенных вариантах реализации предусматриваемое антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, включая биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания с по меньшей мере двумя разными сайтами. Типичным примером биспецифического антитела является антитело, в котором одна из специфичностей связывания относится к бета-амилоидному пептиду, а другая - к любому другому антигену. В определенных вариантах реализации биспецифические антитела могут связываться с двумя различными бета-амилоидными эпитопами. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов в клетках. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

[00139] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования мультиспецифического антитела включает коэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, имеющих разные специфичности (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и технология «выступ-во-впадину» (см., например, патент США № 5731168). Мультиспецифические антитела также могут быть получены путем конструирования электростатических направляющих эффектов для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009 / 089004A1); сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); использования лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); использования технологии «диател» для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и использования одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).

[00140] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует сконструированное антитело с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая антитела-«осьминоги», которые также включены в данный документ (см., например, US 2006/0025576A1). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует антитело или слитый белок, которые представляют собой «FAb двойного действия» или «DAF», содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с бета-амилоидным пептидом, а также с другим, отличным от него антигеном (см., например, US 2008/0069820).

[00141] В одном варианте реализации антитело представляет собой «вариант антитела», которое относится к антителу, имеющему измененную аминокислотную последовательность, состав или структуру по сравнению с его соответствующим нативным антителом. Например, вариант антитела может содержать не-нативный сигнал секреции, чтобы позволить антителу секретироваться из клетки-хозяина.

[00142] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует вариант антитела, модифицированный цистеином, например, «thioMAb», в котором один или несколько остатков антитела замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах реализации замененные остатки находятся в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков на цистеин реакционноспособные тиольные группы, таким образом, располагаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственных средств или фрагменты лекарственное средство-линкер, для создания иммуноконъюгата, как описано в данном документе ниже. В некоторых вариантах реализации любой один или несколько из следующих остатков могут быть замещены цистеином: V205 (нумерация по Кабату) легкой цепи; A118 (нумерация EU) тяжелой цепи; и S400 (нумерация EU) Fc-области тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте США № 7521541.

[00143] В другом варианте реализации антитело может представлять собой миниатюризированное антитело, которое представляет собой одновалентное или двухвалентное антитело, содержащее вариабельную легкую цепь, вариабельный антигенсвязывающий домен тяжелой (цепи) и, необязательно, один или несколько эффекторных доменов (например, тканеспецифическое нацеливание). Хотя использование миниатюризированных антител конкретно предусматривается в данном документе, зкДНК-векторы не ограничены по размеру в отношении гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот и поэтому имеют преимущество, заключающееся в возможности экспрессии даже полноразмерного антитела.

[00144] В другом варианте реализации антитело или слитый белок, экспрессируемые из зкДНК-векторов, дополнительно содержат дополнительную функциональность, такую как флуоресценция, ферментативная активность, сигнал секреции или активатор иммунных клеток.

[00145] В некоторых вариантах реализации антитело, кодируемое зкДНК-вектором, содержит диатело (биспецифические одноцепочечные антитела) или унитела (молекула IgG4 с отсутствующей шарнирной областью для снижения риска иммунной активации).

[00146] зкДНК-векторы для продуцирования антител, как описано в данном документе, также полезны для экспрессии слитых белков или интрател (т.е. внутриклеточных антител), которые могут нацеливаться на внутриклеточные белки, влияющие на клеточную функцию (например, метаболизм, деление клеток, транскрипция, трансляция и т.д.). Интратело может представлять собой scFv. Интратела могут быть направлены в конкретный клеточный компартмент путем включения сигнальных мотивов, таких как С-концевой сигнал удерживания в ЭР (например, KDEL), последовательность нацеливания на митохондрии, последовательность ядерной локализации и т.д.

[00147] Интратела особенно пригодны для лечения заболеваний, связанных с белками с неправильной укладкой, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, прионной болезни, болезни Гентингтона и т.д.

[00148] В некоторых вариантах реализации антитело или слитый белок могут дополнительно содержать, например, линкерный домен. Используемый в данном документе термин «линкерный домен» относится к олиго- или полипептидной области длиной от примерно 2 до 100 аминокислот, которая связывает любые домены/области антитела, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации линкеры могут включать или состоять из гибких остатков, таких как глицин и серин, так чтобы смежные белковые домены могли свободно перемещаться относительно друг друга. Более длинные линкеры могут использоваться, когда желательно гарантировать, что два соседних домена не будут стерически мешать друг другу. Линкеры могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми. Примеры расщепляемых линкеров включают линкеры 2А (например, Т2А), 2А-подобные линкеры, или их функциональные эквиваленты и их комбинации. Линкер может представлять собой линкерную область T2A, полученную из вируса Thosea asigna.

[00149] Специалист в данной области может взять известные и/или общедоступные белковые последовательности, например, слитого белка, тяжелой цепи, легкой цепи, вариабельной области и т.д., и провести обратный инжиниринг последовательности кДНК для кодирования такого белка (например, слитого белка) или антитела. Затем кДНК может быть кодон-оптимизирована для соответствия предполагаемой клетке-хозяину и вставлена в зкДНК-вектор, как описано в данном документе.

[00150] В одном варианте реализации кодирующая антитело последовательность может быть получена из существующей линии клеток гибридомы, например, путем обратной транскрипции мРНК, полученной из линии клеток гибридомы, и амплификации последовательности с использованием ПЦР.

B. зкДНК-векторы, экспрессирующие антитело или слитый белок

[00151] зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, имеющий одну или несколько последовательностей, кодирующих желаемое антитело, может содержать регуляторные последовательности, такие как промоторы, сигналы секреции, области поли(А) и энхансеры. Как минимум, зкДНК-вектор содержит одну или несколько гетерологичных последовательностей, кодирующих антитело или слитый белок. Типичные зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков представлены на Фиг. 7A-7G.

[00152] Для достижения высокоэффективной и точной сборки антитела или слитого белка, в некоторых вариантах реализации конкретно предусматривается, что антитело, слитый белок или отдельные домены антитела содержат лидерную последовательность ER эндоплазматического ретикулума (ЭР), чтобы направлять ее в ЭР, где происходит укладка белка. Например, последовательность, которая направляет экспрессированный белок (белки) в ЭР для укладки.

[00153] В некоторых вариантах реализации сигнал клеточной или внеклеточной локализации (например, секреторный сигнал, сигнал ядерной локализации, сигнал митохондриальной локализации и т.д.) содержится в зкДНК-векторе (см., например, Фиг. 10G) для направления секреции или желаемой субклеточной локализации антитела или слитого белка, так чтобы антитело или слитый белок могли связываться с внутриклеточной мишенью (мишенями) (например, в случае интратела) или внеклеточной мишенью (мишенями).

[00154] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител может кодировать интратело, а в некоторых вариантах реализации интратело может быть полноразмерным антителом, а также одной цепью. Интратела могут использоваться в широком диапазоне областей, включая лечение вирусных расстройств и клеточных расстройств, таких как рак, см., например, патент США № 6004940.

[00155] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе (например, см. типичный пример зкДНК-вектора, представленный на Фиг. 6А), позволяет собирать и экспрессировать любое желаемое антитело или слитый белок модульным образом. Используемый в данном документе термин «модульный» относится к элементам в плазмиде, экспрессирующей зкДНК, которые могут быть легко удалены из конструкта. Например, модульные элементы в плазмиде, генерирующей зкДНК, содержат уникальные пары сайтов рестрикции, фланкирующие каждый элемент конструкта, что обеспечивает исключительные возможности манипулирования отдельными элементами (см., например, Фиг. 7A-7G). Таким образом, платформа зкДНК-вектора может обеспечивать возможность экспрессии и сборки любой желаемой конфигурации антитела или слитого белка. В данном описании в различных вариантах реализации представлены плазмидные зкДНК-векторы, которые могут уменьшать и/или минимизировать количество манипуляций, необходимых для сборки желаемого вектора зкДНК, кодирующего антитело или слитый белок.

C. Типичные примеры антител и слитых белков, экспрессируемых зкДНК-векторами

[00156] В частности, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может кодировать, например, без ограничений, антитела, антигенсвязывающие фрагменты, слитые белки, а также их варианты и/или активные фрагменты, для использования при лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, травмы и/или расстройства. В одном аспекте заболевание, дисфункция, травма, поражение и/или расстройство представляют собой заболевание, дисфункцию, травму, поражение и/или расстройство человека.

[00157] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, также может кодировать кофакторы или другие полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК (siRNA), малые шпилечные РНК (shRNA), микро-РНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR)), которые могут использоваться в сочетании с антителом или слитым белком, экспрессируемым из зкДНК. Кроме того, экспрессионные кассеты, содержащие последовательность, кодирующую антитело или слитый белок, также могут включать экзогенную последовательность, которая кодирует репортерный белок, предназначенный для использования в экспериментальных или диагностических целях, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области.

[00158] В определенных вариантах реализации множество различных антител и/или слитых белков могут быть введены с использованием одного или нескольких зкДНК-векторов. Таким образом, конкретно предусматривается, что можно экспрессировать желаемое количество антител и/или слитых белков в «коктейле» в клетке, ткани или у субъекта.

[00159] Описанные в данном документе зкДНК-векторы могут быть использованы для доставки антител и слитых белков для лечения, например, рака, аутоиммунного заболевания (например, ревматоидного артрита, болезни Крона), болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемии, острого отторжения органа, рассеянного склероза, постменопаузального остеопороза, кожных заболеваний (например, псориаза, атопического дерматита), астмы или гемофилии.

[00160] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть использованы для экспрессии любого желаемого терапевтического антитела или слитого белка. Типичные примеры терапевтических антител и слитых белков включают, без ограничений, абциксимаб, абалопаратид, адалимумаб, адалимумаб-atto, адо-трастузумаб, эмтанзин, адуканумаб, алемтузумаб, алирокумаб, атезолизумаб, авелумаб, бапинеузумаб, басиликсимаб, белимумаб, бевацизумаб, безлотоксумаб, блинатумомаб, блосозумаб, бокоцизумаб, брентуксимаб ведотин, бродалумаб, канакинумаб, капромаб пендетид, цертолизумаб пегол, цетуксимаб, концизумаб, даклизумаб, даратумумаб, деносумаб, динутуксимаб, дупилумаб, дурвалумаб, экаллантид, экулизумаб, элотузумаб, эмтансин, эмицизумаб, эволокумаб, эвинакумаб, фактор IX -Fc-антитело, фактор VIII-Fc-антитело, голимумаб, ибритумомаб тиуксетан, идаруцизумаб, инклакумаб, инфликсимаб, инфликсимаб-abda, инфликсимаб-dyyb, ипилимумаб, иксекизумаб, ланаделумаб, лоделцизумаб, меполизумаб, натализумаб, нецитумумаб, ниволумаб, обилтоксаксимаб, обинутузумаб, окрелизумаб, офатумумаб, оларатумаб, омализумаб, ортикумаб, паливизумаб, панитумумаб, пембролизумаб, пертузумаб, пекселизумаб, ралпанцизумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, реслизумаб, ритуксимаб, роледумаб, ромосозумаб, секукинумаб, силтуксимаб, соланезумаб, сотатерцепт, тадоцизумаб, тоцилизумаб, трастузумаб, устекинумаб, ведолизумаб, сарилумаб, ритуксимаб, гуселкумаб, инотузумаб озогамицин, адалимумаб-adbm, гемтузумаб озогамицин, бевацизумаб-awwb, бенрализумаб, эмицизумаб-kxwh, трастузумаб-dkst.

[00161] В одном варианте реализации зкДНК-вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии терапевтического антитела или слитого белка, которые являются функциональными для лечения заболевания. В предпочтительном варианте реализации терапевтическое антитело или слитый белок не вызывают реакцию иммунной системы, если это не является желательным.

[00162] В одном варианте реализации антитело представляет собой терапевтическое антитело или слитый белок, экспрессируемый зкДНК-вектором, который нацелен на ингибитор иммунной контрольной точки (например, PDL1) и может быть использован для лечения, например, рака (например, солидных опухолей, рака молочной железы, лимфом, рака печени, рака яичников, рака легкого, колоректального рака, лейкозов, гематологических раковых заболеваний, рака кожи, множественной миеломы и т.д.). В одном варианте реализации терапевтическое антитело или слитый белок нацелены на ингибитор контрольной точки, такой как PDL1, CD47, мезотелин, ганглиозид (gangloside) 2 (GD2), антиген стволовых клеток простаты (PSCA), простатический специфический мембранный антиген (PMSA), простат-специфический антиген (PSA), раково-эмбриональный антиген (CEA), киназа Ron, c-Met, незрелый рецептор ламинина, TAG-72, BING-4, кальций-активированный хлоридный канал 2, циклин-B1, 9D7, Ep-CAM, EphA3, Her2/neu, теломераза, SAP-1, сурвивин, NY-ESO-1/LAGE-1, PRAME, SSX-2, Melan-A/MART-1, Gp100/pmel17, тирозиназа, TRP-1/-2, MC1R, β-катенин, BRCA1/2, CDK4, CML66, фибронектин, p53, Ras, рецептор TGF-B, AFP, ETA, MAGE, MUC-1, CA-125, BAGE, GAGE, NY-ESO-1, β-катенин, CDK4, CDC27, CD47, α-актинин-4, TRP1/gp75, TRP2, gp100, Melan-A/MART1, ганглиозиды, WT1, EphA3, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), CD20, MART-2, MART-1, MUC1, MUC2 , MUC16, MUM1, MUM2, MUMS, NA88-1, NPM, OA1, OGT, RCC, RUI1, RUI2, SAGE, TRG, TRP1, TSTA, альфа-рецептор фолата, L1-CAM, CAIX, EGFRvIII, gpA33, GD3, GM2, VEGFR, интегрины (интегрин альфаVбета3, интегрин альфа5бета1), углеводы (Le), IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, активирующая фибробласты протеаза (FAP), TGF-бета, гиалуроновая кислота, коллаген (например, коллаген IV, тенасцин С или тенасцин W), CD19, CD33, CD47, CD123, CD20, CD99, CD30, BCMA, CD38, CD22, SLAMF7 или NY-ESO1.

[00163] В одном варианте реализации зкДНК-вектор экспрессирует моноклональное антитело к эволокумабу и используется для лечения гиперлипидемии. Эволокумаб ингибирует пропротеинконвертазу субтилизин/кексинового типа 9 (PCSK9). PCSK9 представляет собой белок, который нацелен на рецепторы ЛПНП для их деградации, и тем самым снижает способность печени выводить из крови комплекс ЛПНП-холестерин (LDL-C) или «плохой» холестерин. Эволокумаб дополнительно описан в US 8999341, который в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки.

[00164] Типичными примерами антител и слитых белков, экспрессируемых из зкДНК-вектора, для использования в способах и композициях, описанных в данном документе, могут быть любые антитела или слитые белки, перечисленные в Таблице 1, Таблице 2, Таблице 3А, Таблице 3В, Таблице 4 или Таблице 5 в данном документе.

[00165]

Таблица 1: Утвержденные FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США) антитела и слитые белки как типичные примеры антител и слитых белков. BLASTN ХИМИЧЕСКОЕ (РОДОВОЕ) НАЗВАНИЕ ПАТЕНТОВАННОЕ НАЗВАНИЕ ССЫЛКА (ССЫЛКИ), SEQ ID NO В ССЫЛКЕ 125118 абатацепт оренциа (ORENCIA®) US20130330338A1, SEQ ID NO: 6
WO2017125402A1, SEQ ID NO: 2 103575 абциксимаб Реопро (REOPRO®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 1,2 125057 адалимумаб хумира (HUMIRA®) US 8921526
US20180126000A1, SEQ ID NO: 66,73
WO2017112536A1, SEQ ID NO: 23,24 125387 афлиберцепт эйлеа (EYLEA®) WO2014006113A1, SEQ ID NO: 1
WO2016073894A1, SEQ ID NO: 54 103948 алемтузумаб кампат (CAMPATH), лемтрада (LEMTRADA®) US8592149B2, SEQ ID NO: 14
US20150112045A1, SEQ ID NO: 15,16 125559 алирокумаб пралуент (PRALUENT®) US 8062640
US20180363000A1, SEQ ID NO: 11
US20170002060A1, SEQ ID NO: 160,161 761034 атезолизумаб тецентрик (TECENTRIQ®) US20170239351A1, SEQ ID NO: 66,67
US8217149B2, SEQ ID NO: 20,21 761049 авелумаб бавенцио (BAVENCIO®) US20170239351A1, SEQ ID NO: 76,77
US20140341917A1, SEQ ID NO: 24,25 103764 базиликсимаб симулект (SIMULECT®) US20150314007A1, SEQ ID NO: 20,21
US20170002060A1, SEQ ID NO: 15,16 125370 белимумаб бенлиста (BENLYSTA®) US20160281106A1, SEQ ID NO: 25,26
US20170002060A1, SEQ ID NO: 17 761070 бенрализумаб фазенра (FASENRA®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 183,184,185,186
WO2008143878A1, SEQ ID NO: 1,2,3,4 125085 бевацизумаб авастин (AVASTIN®) WO2018129533A1, SEQ ID NO: 65,66
US20190016817A1, SEQ ID NO: 1,2
WO2016073894A1, SEQ ID NO: 55,56 761046 безлотоксумаб зинплава (ZINPLAVA®) WO2018111662A1, SEQ ID NO: 1,5
US9181632B1, SEQ ID NO: 11,12 125557 блинатумомаб блинцито (BLINCYTO®) US20190038730A1, SEQ ID NO: 19
US20170362325A1, SEQ ID NO: 5
WO2016036678A1, SEQ ID NO: 25 125388 брентуксимаб ведотин адцетрис (ADCETRIS®) US20180086734A1, SEQ ID NO: 10,11
US20180036425A1, SEQ ID NO: 3,4 761032 бродалумаб силик (SILIQ®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 238,239
WO2006013107A1, SEQ ID NO: 427,429 761068 буросумаб-twza крисвита (CRYSVITA®) WO2015191312A1, SEQ ID NO: 7,8, как KRN23 125319 канакинумаб иларис (ILARIS®) WO2018235056A1, SEQ ID NO: 17,18
US20180186882A1, SEQ ID NO: 349,350
US20130122008A1, SEQ ID NO: 1,2 125160 цертолизумаба пегол симзия (CIMZIA®) WO2017112536A1, SEQ ID NO: 25.26
US20170002060A1, SEQ ID NO: 39,40 125084 цетуксимаб эрбитукс (ERBITUX®) WO2018204717A1, SEQ ID NO: 124,125
WO2017205465A2, SEQ ID NO: 1,2
WO2017120536A1, SEQ ID NO: 7,8 103749 даклизумаб зенапакс (ZENAPAX®) US20170226223A1, SEQ ID NO: 45,46
US20170002060A1, SEQ ID NO: 41,42
US20180256732A1, SEQ ID NO: 29,30 761036 даратумумаб дарзалекс (DARZALEX®) US20170044265A1, SEQ ID NO: 4,5
WO2018002181A1, SEQ ID NO: 4,5
WO2017162890A1, SEQ ID NO: 22,29 125320 деносумаб пролиа (PROLIA®), эксджива (XGEVA®) US 8962807, US 7528236, US 7364736, US 8058418, US 8409578
US20170002060A1, SEQ ID NO: 49,50 125516 динутуксимаб унитуксин (UNITUXIN®) US20140170155A1, SEQ ID NO: 3,4 761055 дупилумаб дупиксент (DUPIXENT®) WO2018190990A1, SEQ ID NO: 345,346
US20190040147A1, SEQ ID NO: 9,10
US20170002060A1, SEQ ID NO: 359,364 761069 дурвалумаб имфинзи (IMFINZI®) US20190031766A1, SEQ ID NO: 643,644
WO2018172286A1, SEQ ID NO: 13,14
WO2018129533A1, SEQ ID NO: 25,26 125166 экулизумаб солирис (SOLIRIS®) WO2018195034A1, SEQ ID NO: 10,11
WO2018075758A1, SEQ ID NO: 5,6
US20180311345A1, SEQ ID NO: 7,8 761035 элотузумаб эмплисити (EMPLICITI®) US20180222979A1, SEQ ID NO: 36,37
US20170002060A1, SEQ ID NO: 289,290
US20180185348A1, SEQ ID NO: 1,2 761083 эмицизумаб-kxwh гемлибра (HEMLIBRA®) US20180011114A1, SEQ ID NO: 9,10,11,12, как ACE910 761077 эренумаб-aooe аймовиг (AIMOVIG®) US9102731B2 103795 этанерцепт энбрел (ENBREL®) US20180291084A1, SEQ ID NO: 10
WO2016009049A1, SEQ ID NO: 4
US20160160279A1, SEQ ID NO: 1 125522 эволокумаб репата (REPATHA®) US 8030457
US20170002060A1, SEQ ID NO: 158,159 761060 гемтузумаб озогамицин милотарг (Mylotarg®) WO2018129533A1, SEQ ID NO: 67,68
US20190002560A1, SEQ ID NO: 248,249
US20180148514A1, SEQ ID NO: 243,244 125289 голимумаб симпони (SIMPONI®) WO2018147915A1, SEQ ID NO: 36,37
US7250165B2, цитируемый в US20170002060A1 125433 голимумаб симпони ариа (SIMPONI ARIA®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 63,64
US7250165B2, SEQ ID NO: 7,8
WO2013087912A1, SEQ ID NO: 6,7
Все - VH/VL 761061 гуселькумаб тремфиа (TREMFYA®) WO2018093841A1, SEQ ID NO: 106,116
US9803010B2, SEQ ID NO: 44,45 761065 ибализумаб-uiyk трогарцо (TROGARZO®) US8637024B2, SEQ ID NO: 15,19, VH/VL 125019 ибритумомаб тиуксетан зевалин (ZEVALIN®) WO2018129533A1, SEQ ID NO: 59,60
US20170002060A1, SEQ ID NO: 71,72
US9683985B2, SEQ ID NO: 41,42 761025 идаруцизумаб праксбайнд (PRAXBIND®) US 8486398 103772 инфликсимаб ремикейд (REMICADE®) US20160153020A1, SEQ ID NO: 41,42
US20180256732A1, SEQ ID NO: 22,23 761040 инотузумаб озогамицин беспонса (BESPONSA®) WO2018193231A1, SEQ ID NO: 25,26
US20170002060A1, SEQ ID NO: 299,304
US8153768B2, SEQ ID NO: 28,30 125377 ипилимумаб ервой (YERVOY®) US20150283234A1
WO2018204343A1, SEQ ID NO: 84,85
WO2018049042A1, SEQ ID NO: 1,2 125521 иксекизумаб талтц (TALTZ®) WO2019027828A1, SEQ ID NO: 4,5
US 7838638
US 8110191 125526 меполизумаб нукала (NUCALA®) WO2009068649A2, SEQ ID NO: 65,66
WO2009120927A2, SEQ ID NO: 19,21
ссылка в US20170002060A1 125104 натализумаб тисабри (TYSABRI®) US5840299A, SEQ ID NO: 2,4 VL/VH, ссылка в US20170002060A1
WO2010121141A1, SEQ ID NO: 1,2 125547 нецитумумаб портрацца (PORTRAZZA®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 320,324 125554 ниволумаб опдиво (OPDIVO®) US20190031766A1, SEQ ID NO: 535,536
WO2018183408A1, SEQ ID NO: 23,24
WO2018150326A1, SEQ ID NO: 98,99 125509 обилтоксаксимаб антим (ANTHIM®) WO2017186928A1, SEQ ID NO: 616,617 125486 обинутузумаб газива (GAZYVA®) US20190008869A1, SEQ ID NO: 3,4
US20190022092A1, SEQ ID NO: 367,368 761053 окрелизумаб окревус (OCREVUS®) US8679767B2, SEQ ID NO: 11,19
US20180327505A1, SEQ ID NO: 13,14 125326 офатумумаб арзерра (ARZERRA®) US20180169189A1, SEQ ID NO: 23,24 VH/VL
WO2009086072A2, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL 761038 оларатумаб лартруво (LARTRUVO®) WO2018022407A1, SEQ ID NO: 26,28
US20170137523A1, SEQ ID NO: 11,12 103976 омализумаб ксолар (XOLAIR®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 110,111 VH/VL
US20150314007A1, SEQ ID NO: 22,23
US20150140608A1, SEQ ID NO: 1,2 103770 паливизумаб Синагис (SYNAGIS®) WO2018013483A1, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL
US7786273B2, SEQ ID NO: NO: 1,2 VH/VL 125147 панитумумаб вектибикс (VECTIBIX®) WO2018156802A1, SEQ ID NO: 1,4
WO2017060322A2, SEQ ID NO: 237,238 125514 пембролизумаб кейтруда (KEYTRUDA®) WO2018183408A1, SEQ ID NO: 21,22
WO2018150326A1, SEQ ID NO: 50,51
WO2018106588A1, SEQ ID NO: 32,33 125409 пертузумаб перьета (PERJETA®) WO2018160654A2, SEQ ID NO: 11,12
WO2018140831A2, SEQ ID NO: 11,16 US20120107391A1, SEQ ID NO: 16,17 125477 рамуцирумаб цирамза (CYRAMZA®) WO2018093668A1, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL
WO2018081512A1, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL 125156 ранибизумаб луцентис (LUCENTIS®) WO2018211529A1, SEQ ID NO: 2,4
WO2017117464A1, SEQ ID NO: 5,6 761033 реслизумаб синкеа (CINQAIR®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 181,182
WO1995035375A1, ссылка в US20170002060A1 103705 ритуксимаб ритуксан (RITUXAN®) WO2018129533A1, SEQ ID NO: 55,56
WO2018033482A1, SEQ ID NO: 4,5
US20190008869A1, SEQ ID NO: 1,2 761037 сарилумаб кевзара (KEVZARA®) US20170166646A1, SEQ ID NO: 2,3
US20170252434A1, SEQ ID NO: 1,2
US20170002060A1, SEQ ID NO: 207,208 125504 секукинумаб косентикс (COSENTYX®) WO2006013107A1
US20170002060A1, SEQ ID NO: 225,226
US20170304439A1, SEQ ID NO: 8,10, VH/VL 125496 силтуксимаб силвант (SYLVANT®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 197,198
US20180236032A1, SEQ ID NO: 4,5 761067 тилдракизумаб-asmn илюмиа (ILUMYA®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 245,246
US8263748B2, SEQ ID NO: 7,17 125276 тоцилизумаб актемра (ACTEMRA®) WO2017202387A1, SEQ ID NO: 1,2
US20170074890A1, SEQ ID NO: 1,2
US20170152319A1, SEQ ID NO: 1,2 103792 трастузумаб герцептин (HERCEPTIN®) WO2018160654A2, SEQ ID NO: 13,14
WO2018129533A1, SEQ ID NO: 57,58 761044 устекинумаб стелара (STELARA®) WO2018024770A1, SEQ ID NO: 1,2
US20190025325A1, SEQ ID NO: 1,2
WO2017112536A1, SEQ ID NO: 19,20 125476 ведолизумаб энтивио (ENTYVIO®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 154,155
US20120282249A1, SEQ ID NO: 2,4
WO2008115504A2, SEQ ID NO: 11,12

[00166]

Таблица 2: Типичные примеры антител и слитых белков для экспрессии зкДНК-векторами, пригодных для использования в способах и композициях, описанных в данном документе. Мишень Примеры антител Информация о ссылках Рецептор трансферрина 2015/0110791 A1 Интегрин альфа-4 Натализумаб, тисабри (TYSABRI®) 5840299; 6033665; 6602503; 5168062; 5385839; 5730978 EGFR Цетуксимаб, эрбитукс (ERBITUX®), панитумумаб, нецитумумаб, портрацца (PORTRAZZA®) US6217866B1 CD25 (альфа-цепь рецептора IL-2) Базиликсимаб, симулект (SIMULECT®), даклизумаб, зинбрита (ZINBRYTA®) US6521230B1 ФНО-альфа Ремикейд (REMICADE®), симпони (SIMPONI®), адалимумаб, хумира (HUMIRA®), цертолизумаба пегол, симзия (CIMZIA®), голимумаб, инфликсимаб US20080033149A1, US20120258114A1, US20030157061 CTLA4 Оренсия, ипилимумаб, ервой (YERVOY®) WO1993000431A1, US8784815B2 IgE Ксолар (XOLAIR®), омализумаб, лигелизумаб WO1993004173A1 C5 Экулизумаб, солирис (SOLIRIS®), REGN3918, пекселизумаб WO1995029697A1 IL-6R Сарилумаб, сатрализумаб, актемра (ACTEMRA®), тоцилизумаб, атлизумаб US8017121B2 BAFF (BLyS) Белимумаб, бенлиста (BENLYSTA®) WO1998018921A1, WO2003055979A2 VEGF-A Ранибизумаб, луцентис (LUCENTIS®), авастин (AVASTIN®), бролуцизумаб, бевацизумаб, рамуцирумаб, цирамза (CYRAMZA®) WO1998045331A2, WO1994010202A1, US20140086829, US2013067098, Lien and Lowman, в: Chemajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg 131-150 Р-селектин Инклакумаб, LC1004-002, R04905417 US 7563441; US 8039596; US 7432359 HER2 Трастузумаб, герцептин (HERCEPTIN®), пертузумаб, перьета (PERJETA®), кадсила (KADCYLA®) US 7879325 PCSK9 Алирокумаб, бокоцизумаб, эволокумаб, репата (REPATHA®), лоделцизумаб, ралпанцизумаб US 8030457, US 8710192 PD-L1 Атезолизумаб, тецентрик (TENCENTRIQ®), авелумаб, бавенсио (BAVENCIO®), дурвалумаб, имфинзи (IMFINZI®) US 8217149 oxLDL Ортикумаб, BI-204, MLDL-1278A, R7418 US 8318161 Дабигатран Идаруцизумаб, праксбайнд (PRAXBIND®) US 8486398 Паратгормон-родственный протеин (PTHrP) Абалопаратид, тимлос (TYMLOS®) US 8747382, US 7803770; US 8148333 RANKL Деносумаб, пролиа (PROLIA®), эксджива (XGEVA®) US 8962807; US 7528236; US 7364736; US 8058418; US 8409578 NGF Ранезумаб, фасинумаб US20040237124 Рецептор PD1 Пембролизумаб, ламбролизумаб, кейтруда (KEYTRUDA®) US2012135408 Альфа4бета7 интегрин Ведолизумаб, энтивио (ENTYVIO®) US2012151248 Интегрин альфа4бета7 Ведолизумаб, энтивио (ENTYVIO®) US2012151248 IL17a Талтц (TALTZ®), иксекизумаб, секукинумаб, косентикс (COSENTYX®) US20130202610 CSa BNJ378, BNJ383 US20130224187 PD1 Цемиплимаб, ниволумаб, опдиво (OPDIVO®) US2013173223 PDGFR-бета 3299N, оларатумаб, лартруво (LARTRUVO®) US20140193402 TiKA BXhVH5VLl US20150183885 TrkA GBR, VH5(P60A, T62S), VL1 US20150183885 Бета-амилоид кренезумаб, MEDI1814, гантенерумаб, адуканумаб, BAN2401, соленезумаб, LY3002813, бапинезумаб US20150246963 Активин REGN 2477, бимагрумаб (BIMAGRUMAB®), гаретосмаб US20170260275, WO2015162590 CD33 Гемтузумаб, милотарг (MYLOTARG®) US5585089 CD19 Блинатумомаб, блинцито (BLINCYTO®), инбилизумаб US7235641; US7575923; US7635472; US8247194 IL-6 Силтуксумаб, силвант (SYLVANT®) US7612182 NGF Фулраинтин (Fulraintin), 4D4, AMG-403, lN.142160443 US7601818 Фулранумаб; 4D4, AMG-403, JNJ- US7988967 US8552157 US8048421 CD20 Окрелизумаб, окревус (OCREVUS®), офатумумаб, арзерра (ARZERRA®), ритуксимаб, ритуксан (RITUXAN®), обинутузумаб, ибритумомаб, US8337847, WO1994011026A3 GFRa3 H4H2364S US8968736 CORP 01, кластерная головная боль US9115194 CGRP галканезумаб, эренумаб US9115194, US20120294802, US9102731 TrkA BXhVHl® W02009098238 TrkA HUVHWOV® W02009098238 Аннексин IV или фосфолипид; и (b) ингибитор комплемента W02014116880 Nav 1.7 H1Hl015B W02014159595 Фактор D Fab238, лампализумаб WO2009134711, US8273352 Антиген резус-фактора Роледумаб, дматриа (DMATRIA®) WO2010100383 TGF-бета DOM23h-271-12 WO2011012609 Альфа-синуклеин BIIB054 WO2018178950A1, SEQ ID NO: 8,9 VH/VL RG7935 US20160324852A1 Защитный антиген Bacillus anthracis Раксибакумаб US20130028920A1 Обилтоксаксимаб, антим (ANTHIM®) WO2017186928A1, SEQ ID NO: 616,617 ANGPTL-3 Эвинакумаб US20170312359A1, SEQ ID NO: 1,5 VH/VL WO2017151783A1, SEQ ID NO: 10,11 B7RP1 Презалумаб WO2017186928A1 BAFF VAY736 US8106163B2, SEQ ID NO: 71,75 BDCA2 BIIB059 WO2017189827A1, SEQ ID NO: 9,10 US20180362652A1, SEQ ID NO: 3,4 C1 BIVV009 WO2018170145A1, SEQ ID NO: 22,23 CD22 Инотузумаб WO2018193231A1, SEQ ID NO: 25,26; WO2018193231A1, SEQ ID NO: 25,26; US8153768B2, SEQ ID NO: 28,30 CD30 Брентуксимаб ведотин, адцетрис (ADCETRIS®) US20180086734A1, SEQ ID NO: 10,11; US20180036425A1, SEQ ID NO: 3,4 CD38 Даратумумаб, дарзалекс (DARZALEX®) US20170044265A1, SEQ ID NO: 4,5; WO2018002181A1, SEQ ID NO: 4,5; WO2017162890A1, SEQ ID NO: 22,29 CD52 Алемтузумаб, лемтрада (LEMTRADA®) US8592149B2, SEQ ID NO: 14; US20150112045A1, SEQ ID NO: 15,16 CD319 (SLAMF7) Элотузумаб, эмплицити (EMPLICITI®) US20180222979A1, SEQ ID NO: 36,37; US20170002060A1, SEQ ID NO: 289,290; US20180185348A1, SEQ ID NO: 1,2 Токсины клостридий А и В Безлотоксумаб, зинплава (ZINPLAVA®) WO2018111662A1, SEQ ID NO: 1,5; US9181632B1, SEQ ID NO: 11,12 Fel d1 REGN1908 WO2018118713A1, SEQ ID NO: 18,26 VH/VL REGN1909 WO2018118713A1, SEQ ID NO: 306,314 VH/VL GDF8 Тревогрумаб US8840894B2 WO2016168613A1, SEQ ID NO: 360,368 VH/VL Гликолипид GD2 Динутуксимаб, унитуксин (UNITUXIN®), динутуксимаб бета, искет (ISQUETTE®) US20140170155A1, SEQ ID NO: 3,4 Рецептор гликопротеина IIb/IIa Абциксимаб, реопро (REOPRO®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 1,2 GM-CSF Намилумаб WO2017076804A1, SEQ ID NO: 11,12 Маврилимумаб US8263075B2 US8506960B2 WO2017202879A1, SEQ ID NO: 2,3 Рецептор IFN-альфа Анифролумаб US20110059078A1 US20160251441A1, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL как MEDI-546 IG2-каппа SHP647 IL-1-бета Канакинумаб, иларис (ILARIS®) WO2018235056A1, SEQ ID NO: 17,18; US20180186882A1, SEQ ID NO: 349,350; US20130122008A1, SEQ ID NO: 1,2 IL-3R Дупилумаб WO2018190990A1, SEQ ID NO: 345,346; US20190040147A1, SEQ ID NO: 9,10; US20170002060A1, SEQ ID NO: 359,364 IL-5 Фенсенра (FENSENRA®), меполизумаб, GS3511294, реслизумаб, синкир (CINQUIR®) WO2009068649A2, SEQ ID NO: 65,66; WO2009120927A2, SEQ ID NO: 19,21; ссылка в US20170002060A1 IL-5R (CD125) Бенрализумаб, фасренра (FASRENRA®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 183,184,185,186 WO2008143878A1, SEQ ID NO: 1,2,3,4 Рецептор IL-17 Бродалумаб, силик (SILIQ®) US20170002060A1, SEQ ID NO: 238,239 WO2006013107A1, SEQ ID NO: 427,429 IL-23 Тремфиа (TREMFYA®), гуселкумаб WO2018093841A1, SEQ ID NO: 106,116 US9803010B2, SEQ ID NO: 44,45 Мирикизумаб WO2019012531A1 IL-31 Немолизумаб US20180346543A1 IL-33 REGN3500 WO2018102597A1, SEQ ID NO: 274,282 VH/VL MEDI3506 GSK3772847 (формально CNTO 716) Грипп А MEDI8852 Интегрин альфаIIbбета3 Тадоцизумаб WO2016011264A1 Калликреин SHP643 EP3390439A1 Экаллантид, калбитор (KALBITOR®) US20160252527A1, SEQ ID NO: 3 US20070213275A1, SEQ ID NO: 1 Ланаделумаб US20180306807A1, SEQ ID NO: 81,82 VH/VL DX-2930 US20180118851A1, SEQ ID NO: 9,10 US20150362492A1, SEQ ID NO: 9,10 VH/VL LAG-3 REGN3767 WO2018222722A2 LEPR LINGO-1 Опининумаб Ближневосточный репираторный коронавирус REGN3048, REGN3049, REGN3050, REGN3051 US20190030187A1 Миостатин Домагрозумаб, RG6206 NGF 42160443 PSMA Капромаб пенетид, простасцинт (PROSTASCINT®) WO2006076525A2 Белок RSV F Паливизумаб, синагис (SYNAGIS®) WO2018013483A1, SEQ ID NO: 1,2 VH/VL US7786273B2, SEQ ID NO: NO: 1,2 VH/VL MEDI8897 WO2018160722A1, SEQ ID NO: 1,2 SP0232 Склеростин Ромосозумаб WO2017153541A1, SEQ ID NO: 11,12 SOST Блосозумаб WO2018115880A1, SEQ ID NO: 70,81, возможно VH/VL Токсин золотистого стафилококка (Staph. aureus) Сувратоксумаб WO2017075188A2, SEQ ID NO: 9,10, как MEDI4893 Тау-белок BIIB092 WO2018231254A1, SEQ ID NO: 14,15 RG6100 WO2019025595A1 TFPI Концизумаб WO2017186928A1, SEQ ID NO: 176,177 NN7415 Тимусный стромальный лимфопротеин Тезепелумаб WO2018191479A1, SEQ ID NO: 105,106 Мишени биспецифических антител Alpha3beta7/альфаEбета7 Этролизумаб US20180086833A1 WO2017019673A2, SEQ ID NO: 31,32 VH/VL CD20/CD3 REGN1979 Фактор IX/фактор X Эмицизумаб, гемлибра (HEMLIBRA®) US20180011114A1, SEQ ID NO: 9,10,11,12, как ACE910 IL-4/IL-13 SAR156597 US20170145089A1, SEQ ID NO: 1,2,3,4 VH/VL IL-12/IL-23 Устекинумаб, стелара (STELARA®) WO2018024770A1, SEQ ID NO: 1,2 US20190025325A1, SEQ ID NO: 1,2 WO2017112536A1, SEQ ID NO: 19,20 IL-33/STR2 AMG 282, RG6149 Psl/PcrV MEDI3902 VEGF-A/Ang2 RG7716 WO2017218977A2, SEQ ID NO: 13,14,15,16 Антителоподобные белки Слитый белок рецептора активина типа 2A-IgG-Fc (функционирует как ловушка лиганда TGF-β) ACE-011, сотатерцепт (SOTATERCEPT®) US20180161426A1, SEQ ID NO: 7 US20170304397A1, SEQ ID NO: 7

[00167]

Таблица 3А. Типичные примеры антител для экспрессии зкДНК-векторами, включая, без ограничений, терапевтические средства на основе антител, одобренные в Европейском Союзе или США. Международное непатентованное наименование ФИРМЕННОЕ НАИМЕНОВАНИЕ Мишень; Формат Впервые одобренное показание Бродалумаб силик (SILIQ®), лумисеф (LUMICEF®), кинтеум (KYNTHEUM®) IL-17RA; человеческий IgG2 Бляшечный псориаз Авелумаб бавенцио (BAVENCIO®) PD-L1; человеческий IgG1 Карцинома клеток Меркеля Дупилумаб дупиксент (DUPIXENT®) IL-4Rα; человеческий IgG4 Атопический дерматит Окрелизумаб окревус (OCREVUS®) CD20; гуманизированный IgG1 Рассеянный склероз Дурвалумаб имфинзи (IMFINZI®) PD-L1; человеческий IgG1 Рак мочевого пузыря Сарилумаб кевзара (KEVZARA®) IL-6R; человеческий IgG1 Ревматоидный артрит Гуселькумаб тремфиа (TREMFYA®) IL-23 р19; человеческий IgG1 Бляшечный псориаз Инотузумаб озогамицин беспонса (BESPONSA®) CD22; гуманизированный IgG4; ADC (конъюгат антитело-лекарственное средство) Острый лимфобластный лейкоз Бенрализумаб фазенра (FASENRA®) IL-5Rα; гуманизированный IgG1 Астма Эмицизумаб гемлибра (HEMLIBRA®) Фактор IXa, X; гуманизированный IgG4, биспецифичный Гемофилия А

[00168]

Таблица 3B. Типичные примеры антител для экспрессии зкДНК-векторами, включая, без ограничений, лекарственные средства на основе антител, проходящие регуляционное тестирование в Европейском Союзе или США. Международное непатентованное наименование Предложенное фирменное наименование Мишень; Формат Рассматриваемое показание Ибализумаб (не завершено) CD4; гуманизированный IgG4 ВИЧ-инфекция Буросумаб (не завершено) FGF23; человеческий IgG1 Х-сцепленная гипофосфатемия Тилдракизумаб (не завершено) IL-23 р19; гуманизированный IgG1 Бляшечный псориаз Каплацизумаб (не завершено) фактор фон Виллебранда; гуманизированное нанотело Приобретенная тромботическая тромбоцитопеническая пурпура Эренумаб аймовиг (AIMOVIG®) Рецептор CGRP; человеческий IgG2 Профилактика мигрени Фреманезумаб (не завершено) CGRP; гуманизированный IgG2 Профилактика мигрени Галканезумаб (не завершено) CGRP; гуманизированный IgG4 Профилактика мигрени Ромосозумаб эвенити (EVENITY®) Склеростин; гуманизированный IgG2 Остеопороз у женщин в постменопаузе с повышенным риском переломов Могамулизумаб потилигио (POTELIGEO®) CCR4; гуманизированный IgG1 Кожная Т-клеточная лимфома

[00169] Таблица 4: Типичные примеры антител для экспрессирования зкДНК-векторами, включая, без ограничений, лекарственные средства на основе антител при нераковых показаниях, на поздних стадиях клинических исследований. Компании, проводящие коммерческую разработку или клиническое тестирование антител: 1. Novartis, 2. LFB Group, 3. Shire, 4. Prothena Therapeutics Ltd., 5. Omeros Corporation, 6. Alexion Pharmaceuticals Inc., 7. AstraZeneca/MedImmune LLC, 8. Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, AbbVie, 9. Genentech, 10. Shire, 11. R-Pharm, 12. Chugai Pharmaceuticals/Roche, 13. NovImmune SA, 14. CytoDyn, 15. Biogen, 16. Hoffmann-La Roche, 17. Alder Biopharmaceuticals, 18. Regeneron Pharmaceuticals, 19. Pfizer; Eli Lilly & Company, 20. Horizon Pharma USA

Таблица 4 Международное непатентованное название (INN) или кодовое имя Молекулярный формат Мишень Показание (показания) на поздней стадии исследований Кризанлизумаб¹ Гуманизированный IgG2 CD62 (он же P-селектин) Серповидноклеточная анемия Роледумаб² Человеческий IgG1 Rh D Гемолитическая болезнь Ланаделумаб³ Человеческий IgG1 Калликреин плазмы Приступы наследственного ангионевротического отека NEOD001⁴ Гуманизированный IgG1 Амилоид Первичный системный амилоидоз OMS721⁵ Человеческое моноклональное антитело MASP-2 Атипичный гемолитический уремический синдром Равулизумаб (ALXN1210)⁶ Гуманизированное моноклональное антитело C5 Пароксизмальная ночная гемоглобинурия, атипичный гемолитический уремический синдром Тезепелумаб⁷ Человеческий IgG2 Тимусный стромальный лимфопоэтин Тяжелая неконтролируемая астма Тралокинумаб⁷ Человеческий IgG4 IL-13 Атопический дерматит Рисанкизумаб⁸ Гуманизированный IgG1 Il-23 p19 Псориаз; болезнь Крона Анифролумаб⁷ Человеческий IgG1 Рецептор интерферона (IFN) α, β, ω 1-го типа Системная красная волчанка Этролизумаб⁹ Гуманизированный IgG1 Рецептор интегрина α4-β7/αE-β7 Неспецифический язвенный колит (UC); болезнь Крона SHP-647¹⁰ Человеческий IgG2 Молекула клеточной адгезии слизистой оболочки адрессин-1 Неспецифический язвенный колит (UC); болезнь Крона Олокизумаб¹¹ Гуманизированный IgG4 IL-6 Ревматоидный артрит Инебилизумаб⁷ Гуманизированный IgG1 CD19 Нейромиелит зрительного нерва и расстройства спектра нейромиелита зрительного нерва Сатрализумаб¹² Гуманизированный IgG2 IL-6R Нейромиелит зрительного нерва и расстройства спектра нейромиелита зрительного нерва Эмапалумаб¹³ Человеческий IgG1 IFN γ Первичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз PRO-140, PA14¹⁴ Гуманизированный IgG4 CCR5 ВИЧ-инфекция Адуканумаб¹⁵ Человеческий IgG1 Амилоид β Болезнь Альцгеймера Кренезумаб⁹ Гуманизированный IgG4 Амилоид β Болезнь Альцгеймера Гантенерумаб¹⁶ Человеческий IgG1 Амилоид β Болезнь Альцгеймера Эптинезумаб¹⁷ Гуманизированный IgG1 CGRP Профилактика мигрени, хроническая мигрень Фасинумаб¹⁸ Человеческий IgG4 NGF (фактор роста нервов) Боль в колене или бедре из-за остеоартрита, хроническая боль в пояснице Танезумаб¹⁹ Гуманизированный IgG2 NGF (фактор роста нервов) Боль в колене или бедре из-за остеоартрита, хроническая боль в пояснице, раковая боль из-за метастаз в кости Тепротумумаб²⁰ Человеческий IgG1 IGF-1R Эндокринная офтальмопатия Лампализумаб⁹ Гуманизированный Fab IgG1 Фактор D комплемента Географическая атрофия, связанная с сухой возрастной дегенерацией желтого пятна Бролуцизумаб¹ Гуманизированные scFv VEGF-A Неоваскулярная возрастная макулярная дегенерация

[00170] Таблица 5: Типичные примеры антител для экспрессирования зкДНК-векторами, включая, без ограничений, терапевтические средства на основе антител при показаниях, связанных с раковыми заболеваниями, в клинических исследованиях на поздней стадии. Компании, проводящие коммерческую разработку или клиническое тестирование антител в Таблице 4: 1. Actinium Pharmaceuticals, 2. Sanofi, 3. TG Therapeutics, 5. MorphoSys, 6. Pfizer, 8. Viventia Bio, 10. Jiangsu HengRui Medicine Co., Ltd, 11. MacroGenics, 16. Gilead Sciences, 18. AstraZeneca/MedImmune LLC, 19. Recombio SL, 20. Regeneron Pharmaceuticals, 21. Innovent Biologics (Suzhou) Co. Ltd., 22. BeiGene, 24. Biocad, 25. Novartis, 26. Philogen SpA, 27. Tracon.

ТАБЛИЦА 5 Международное непатентованное название (INN) или кодовое имя Молекулярный формат Мишень Показание (показания) на поздней стадии исследований I-131-BC8, иомаб-B (Iomab-B)¹ Мышиные IgG1, меченые радиоактивным изотопом CD45 Абляция костного мозга перед трансплантацией гемопоэтических клеток у пациентов с острым миелогенным лейкозом (AML) Исатуксимаб² Гуманизированный* IgG1 CD38 Множественная миелома Ублитуксимаб³ Химерный IgG1 CD20 Хронический лимфоцитарный лейкоз, неходжкинская лимфома, рассеянный склероз XMAB-5574, MOR208⁵ Гуманизированный IgG1 CD19 Диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома Утомилумаб⁶ Человеческий IgG2 4–1BB (CD137) Диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома Опортузумаб монатокс⁸ Иммунотоксин гуманизированного scFv EpCAM Рак мочевого пузыря Камрелизумаб¹⁰ Гуманизированный IgG4 PD-1 Гепатоцеллюлярная карцинома, рак пищевода Маргетуксимаб¹¹ Химерный IgG1 HER2 Рак молочной железы Андекаликсимаб¹⁶ Гуманизированный* IgG4 MMP-9 Рак желудка или аденокарцинома пищеводно-желудочного перехода Тремелимумаб¹⁸ Человеческий IgG2 CTLA-4 Немелкоклеточный рак легкого, рак головы и шеи, уротелиальный рак, гепатоцеллюлярная карцинома Ракотумомаб¹⁹ Мышиный IgG1 NGcGM3 Немелкоклеточный рак легкого Цемиплимаб²⁰ Человеческое моноклональное антитело PD-1 Кожно-плоскоклеточный рак; немелкоклеточный рак легкого, рак шейки матки IBI308²¹ Человеческое моноклональное антитело PD-1 Плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого BGB-A317²² Гуманизированное моноклональное антитело PD-1 Немелкоклеточный рак легкого BCD-100²⁴ Человеческое моноклональное антитело PD-1 Меланома PDR001²⁵ Гуманизированный IgG4 PD-1 Меланома L19IL2/L19TNF²⁶ Иммуноконъюгаты scFv Экстрадомен B фибронектина Меланома Каротуксимаб²⁷ Химерный IgG1 Эндоглин Саркома мягких тканей, ангиосаркома, почечно-клеточный рак, влажная возрастная макулярная дегенерация

[00171] Дополнительные типичные примеры антител и слитых белков для экспрессии зкДНК-векторами включают, без ограничений, описанные ниже:

[00172] Бродалумаб (силик (SILIQ®), лумисеф (LUMICEF®), кинтеум (KYNTHEUM®), AMG-827) представляет собой человеческое антитело IgG2, которое нацелено на рецептор A IL-17 (IL-17RA) и предотвращает воспалительную передачу сигналов провоспалительных цитокинов IL-17A, IL-17F и IL-17C через IL-17RA. Бродалумаб одобрен в США (силик (SILIQ®)), ЕС (кинтеум (KYNTHEUM®)) и Японии (лумисеф (LUMICEF®)). Бродалумаб показан для лечения взрослых пациентов с псориазом от умеренного до тяжелого бляшечного, которые являются кандидатами на системную терапию или фототерапию, и которые не ответили или перестали отвечать на другие системные методы лечения.

[00173] Дупилумаб (дупиксент (DUPIXENT®), REGN668/SAR231893) представляет собой человеческое моноклональное антитело (mAb) IgG4, нацеленное на рецептор IL-4 (IL4R), блокирующее таким образом воспалительные реакции, опосредованные IL-4 и IL-13. Это MAb было одобрено в США и ЕС для пациентов с атопическим дерматитом.

[00174] Окрелизумаб (окревум (OCREVUS®)) представляет собой гуманизированное антитело IgG1, нацеленное на CD20-позитивные В-клетки. Такие В-клетки играют определенную роль в повреждении миелина и патогенезе рассеянного склероза.

[00175] Окрелизумаб получил одобрение для лечения рецидивирующего рассеянного склероза (RMS) и первичного прогрессирующего рассеянного склероза (PPMS) в США.

[00176] Сарилумаб (кевзара (KEVZARA®), SAR153191, REGN88) представляет собой человеческое антитело IgG1, нацеленное на рецептор IL-6 (IL-6R), и был одобрен в Канаде, США и ЕС для пациентов с ревматоидным артритом (РА) от умеренного до тяжелого, демонстрирующих недостаточный ответ или непереносимость одного или нескольких модифицирующих заболевание противоревматических препаратов (DMARD), таких как метотрексат (MTX).

[00177] Бенрализумаб (фазенра (FASENRA®), MEDI-563) представляет собой афукозилированное mAb IgG1, нацеленное на α-субъединицу IL-5R, присутствующую на эозинофилах, получивший одобрение FDA для дополнительного поддерживающего лечения пациентов с тяжелой астмой в возрасте 12 лет и старше.

[00178] Эмицизумаб (гемлибра (HEMLIBRA®), эмицизумаб-kxwh, ACE910, RO5534262) представляет собой биспецифичное mAb IgG4, нацеленное на факторы IXa и X, получило одобрение FDA. Этот препарат был одобрен для предотвращения или уменьшения частоты эпизодов кровотечения у взрослых и педиатрических пациентов с гемофилией А, у которых вырабатываются ингибиторы фактора VIII. По состоянию на 1 декабря 2017 г. в США или ЕС проходили проверку в общей сложности 9 терапевтических средств на основе антител. Из них 8 (ибализумаб, буросумаб, тилдракизумаб, каплацизумаб, эренумаб, фреманезумаб, галканезумаб, ромосозумаб) еще не получили разрешения на продажу. Могамулизумаб получил первое глобальное одобрение в Японии 20 марта 2012 г.

[00179] Ибализумаб представляет собой mAb IgG4, нацеленное на CD4, в настоящее время FDA проводит его оценку как средства для лечения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с множественной лекарственной устойчивостью.

[00180] Буросумаб (KRN23) представляет собой человеческое mAb IgG1, нацеленное на фактор роста 23 фибробластов (FGF23), который является гормоном, регулирующим экскрецию фосфатов и активную выработку витамина D почками.

[00181] Тилдракизумаб (SCH 900222/MK-3222) представляет собой гуманизированное mAb IgG1, нацеленное на IL-23p19. Заявки на получение разрешения на продажу тилдракизумаба в качестве средства для лечения бляшечного псориаза от умеренного до тяжелого были поданы в ЕС и США.

[00182] Каплацизумаб (ALX-0081) представляет собой бивалентное однодоменное антитело (Nanobody®), нацеленное на фактор фон Виллебранда, и в данное время находится на стадии регуляционного тестирования в качестве средства для лечения приобретенной тромботической тромбоцитопенической пурпуры (пТТП), являющейся редким жизнеопасным нарушением свертываемости крови, связанным с образованием микросгустков, приводящим к низкому содержанию тромбоцитов, ишемии тканей и дисфункции органов у пациентов с пТТП.

[00183] Эренумаб (аймовиг (AIMOVIG™), AMG 334) представляет собой mAb IgG2, нацеленное на рецептор пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP), который участвует в развитии сенсибилизированных ноцицептивных нейронов. Заявки на получение разрешения на продажу эренумаба для профилактики мигрени у пациентов, испытывающих четыре или более дней мигрени в месяц, были поданы в ЕС и США.

[00184] Фреманезумаб (TEV-48125) представляет собой mAb IgG2, нацеленное на CGRP, которое в настоящее время находится на стадии регуляционного тестирования для профилактического лечения мигрени.

[00185] Галканезумаб (LY2951742) представляет собой mAb IgG4, нацеленное на CGRP, которое в настоящее время находится на стадии регуляционного тестирования для профилактики эпизодической и хронической мигрени у взрослых.

[00186] Ромосозумаб (эвенити (EVENITY™), AMG785) представляет собой гуманизированное mAb IgG2, нацеленное на склеростин, которое в настоящее время проходит оценку в качестве средства для лечения остеопороза у женщин и мужчин.

[00187] Могамулизумаб (KW-0761, потилигио (POTELIGEO®)) представляет собой афукозилированное гуманизированное mAb IgG1, нацеленное на рецептор 4 CC-хемокинов (CCR4), экспрессируемый на опухолевых клетках пациентов с кожной Т-клеточной лейкемией/лимфомой (CTCL), включая грибковые микозы и синдром Сезари.

[00188] Ланаделумаб (SHP643, DX-2930) представляет собой mAb IgG1 человека, которое нацелено на калликреин плазмы и тем самым предотвращает выработку брадикинина.

[00189] Кризанлизумаб (SEG101) представляет собой гуманизированное mAb, нацеленное на P-селектин, также известное как CD62, и в данное время проходит оценку в качестве средства для лечения связанных с серповидноклеточной болезнью болевых кризов (SCPC), вызываемых вазоокклюзией у пациентов с серповидноклеточной анемией.

[00190] Равулизумаб (ALXN1210) представляет собой нацеливающий компонент 5 (C5) комплемента гуманизированного mAb, который проходит оценку в двух исследованиях фазы 3 у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией (ПНГ).

[00191] Эптинезумаб (ALD403) представляет собой mAb IgG1, нацеленное на пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), и в данное время оценивается для использования при профилактике мигрени.

[00192] Рисанкизумаб (ABBV066, BI655066) представляет собой mAb IgG1, нацеленное на субъединицу р19 IL-23, которая участвует в патогенезе псориаза.

[00193] Сатрализумаб (SA237) представляет собой гуманизированный IgG2, нацеленный на IL-6R, который проходит оценку в двух исследованиях фазы 3 у пациентов с нейромиелитом зрительного нерва (NMO) или расстройством спектра NMO.

[00194] Бролуцизумаб (RTH258) представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), нацеленный на фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF)-A.

[00195] PRO140 является гуманизированным mAb IgG4, блокирует корецептор CCR5 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на Т-клетках, тем самым предотвращая проникновение вируса.

[00196] Лампализумаб (RG7417, FCFD4514S) представляет собой гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент (Fab), ингибирует активацию и амплификацию альтернативного пути комплемента путем связывания фактора D комплемента.

[00197] Роледумаб (LFB-R593) представляет собой mAb против резус-фактора (Rh)D человеческого IgG1, полученное с помощью технологии платформы EMABLING® фирмы LFB S.A., которая изменяет фукозилирование, что приводит к более эффективному связыванию антител с эффекторными клетками. Антитело предназначено для предотвращения некоторых связанных с беременностью состояний аллоиммунизации, а именно, у RhD-отрицательных беременных женщин с RhD-положительным плодом.

[00198] Фазинумаб (REGN475) представляет собой mAb IgG4 человека, нацеленное фактор роста нервов, которое в настоящее время проходит оценку в многочисленных исследованиях на поздних стадиях в качестве средства для лечения остеоартритной боли от умеренной до тяжелой тазобедренного или коленного сустава и хронической боли в пояснице.

[00199] Этролизумаб (RH7413) представляет собой гуманизированное mAb, которое связывает субъединицу β7 гетеродимеров интегрина α4β7 и αEβ7, ингибируя тем самым взаимодействия с их лигандами MAdCAM-1 и E-кадгерином, соответственно.

[00200] NEOD001 является гуманизированным mAb IgG1, нацеленным на растворимые и нерастворимые агрегаты легких цепей, которые вызывают амилоидоз амилоидной легкой цепи (AL), представляющий собой расстройство, характеризующееся чрезмерным накоплением белковых агрегатов в тканях и органах, включая сердце, почки и печень.

[00201] Гантенерумаб (RO4909832) представляет собой человеческое mAb, нацеленное на фибриллярный амилоид-β, которое проходит исследования в качестве средства для лечения болезни Альцгеймера.

[00202] Анифролумаб (MEDI-546) представляет собой человеческое mAb IgG1, нацеленное на субъединицу 1 рецептора интерферона (IFN) I типа, которое проходит оценку как средство для лечения системной красной волчанки (SLE).

[00203] Моксетумомаб пасудотокс (HA22, CAT-8015) представляет собой рекомбинантный иммунотоксин, содержащий 38-кДа цитотоксическую часть экзотоксина A Pseudomonas, слитую с вариабельным фрагментом антитела, нацеленным на CD22.

[00204] Цемиплимаб (REGN2810, SAR439684) - человеческое антитело, которое нацелено на белок запрограммированной смерти-1 (PD1), проходит оценку в качестве средства для лечения метастатического или неоперабельного кожного плоскоклеточного рака (CSCC).

[00205] Ублитуксимаб (LFB-R603, TGT-1101, TGTX-1101) представляет собой гликоинженерное химерное mAb, нацеленное на CD20.

[00206] Тремелимумаб (CP-675,206) представляет собой человеческое антитело IgG2, нацеленное на цитотоксический антиген-4, ассоциированный с Т-лимфоцитом (CTLA-4). В физиологических условиях CD28 взаимодействует с лигандами В7 (CD80, CD86), что приводит к активации Т-клеток, пролиферации и повышающей регуляции CTLA-4. CTLA-4 связывает лиганды B7 с более высокой аффинностью, чем CD28, и прекращает ответы Т-клеток.

[00207] Изатуксимаб (SAR650984) представляет собой химерное антитело против CD38 IgG1, которое проходит оценку для лечения пациентов с рецидивирующей и рефрактерной множественной миеломой (ММ).

[00208] BCD-100 представляет собой человеческое антитело, нацеленное на белок запрограммированной гибели клеток-1 (PD-1)

[00209] Каротуксимаб (TRC105) является химерным антителом IgG1, нацеленным на эндоглин (CD105), представляющий собой белок, высокоэкспрессируемый в ангиогенных и пролиферативных эндотелиальных клетках. Указанное MAb связывает человеческий CD105 на пролиферирующем эндотелии с константой диссоциации (KD) 1-2 нг/мл и индуцирует опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) эндотелиальных клеток пупочной вены человека.

[00210] Камрелизумаб (INCSHR-1210, SHR-1210) представляет собой гуманизированное антитело IgG4κ, нацеленное на PD-1.

[00211] Глембатумумаб ведотин (CDX-011, CR011-vcMMAE) представляет собой человеческое антитело IgG2, нацеленное на неметастатический ген B трансмембранного гликопротеина (gpNMB), конъюгированное с монометилауристатином E - цитотоксическим лекарственным средством, которое при высвобождении в раковых клетках может привести к гибели опухолевых клеток.

[00212] Мирветуксимаб соравтанзин (IMGN853) представляет собой антитело, нацеленное на альфа-рецептор фолата (FRα), которое конъюгировано с 3-4 молекулами мейтанзиноидного препарата DM4, антимитотического агента.

[00213] Опортузумаб монатокс (вициниум (VICINIUM™), VB4-845) представляет собой фрагмент scFv рекомбинантного гуманизированного антитела против молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), конъюгированный с экзотоксином A Pseudomonas aeruginosa.

[00214] L19IL2/L19TNF (даромун (DAROMUN)) представляет собой гибридный белок, состоящий из scFv антитела L19, нацеленного на экстрадомен B фибронектина, слитый либо с человеческим IL2, либо с человеческим ФНО.

[00215] Кроме того, дополнительные типичные антитела и слитые белки могут быть выбраны из любых из следующего: бенилизумаб, MEDI-8968, анифролумаб, MEDI7183, сифалимумаб, MEDI-575, тралокинумаб производства фирм AstraZeneca и MedImmune; BAN2401 производства фирмы Biogen Idec/Eisai Co. LTD («Eisai»)/BioArctic Neuroscience AB; CDP7657 фрагмент Fab моновалентного пегилированного антитела против CD40L, STX-100, mAb против avB6, BIIB059, анти-TWEAK (BIIB023) и BIIB022 производства фирмы Biogen; фулранумаб производства фирм Janssen и Amgen; BI-204/RG7418 производства фирм BioInvent International/Genentech; BT-062 (индатуксимаб равтанзин) производства фирмы Biotest Pharmaceuticals Corporation; XmAb производства фирм Boehringer Ingelheim/Xencor; анти-IP10 производства фирмы Bristol-Myers Squibb; J 591 Lu-177 производства фирмы BZL Biologics LLC; CDX-011 (глембатумумаб ведотин), CDX-0401 производства фирмы Celldex Therapeutics; форовирумаб производства фирмы Crucell; тигатузумаб производства фирмы Daiichi Sankyo Company Limited; MORAb-004, MORAb-009 (аматуксимаб) производства фирмы Eisai; LY2382770 производства фирмы Eli Lilly; DI17E6 производства фирмы EMD Serono Inc; занолимумаб производства фирмы Emergent BioSolutions, Inc.; FG-3019 производства фирмы FibroGen, Inc.; катумаксомаб производства фирмы Fresenius SE & Co. KGaA; патеклизумаб, ронтализумаб производства фирмы Genentech; фрезолимумаб производства фирмы Genzyme & Sanofi; GS-6624 (симтузумаб) производства фирмы Gilead; CNTO-328, бапинеузумаб (AAB-001), карлумаб, CNTO-136 производства фирмы Janssen; KB003 производства фирмы KaloBios Pharmaceuticals, Inc.; ASKP1240 производства фирмы Kyowa; RN-307 производства фирмы Labrys Biologics Inc.; экромексимаб производства фирмы Life Science Pharmaceuticals; LY2495655, LY2928057, LY3015014, LY2951742 производства фирмы Eli Lilly; MBL-HCV1 производства фирмы MassBiologics; AME-133v производства фирмы MENTRIK Biotech, LLC; абитузумаб производства фирмы Merck KGaA; MM-121 производства фирмы Merrimack Pharmaceuticals, Inc.; MCS 110, QAX576, QBX258, QGE031 производства фирмы Novartis AG; HCD122 производства фирм Novartis AG и XOMA Corporation (“XOMA”); NN8555 производства фирмы Novo Nordisk; бавитуксимаб, котара производства фирмы Peregrine Pharmaceuticals, Inc.; PSMA-ADC производства фирмы Progenies Pharmaceuticals, Inc.; ореговомаб производства фирмы Quest Pharmatech, Inc.; фасинумаб (REGN475), REGN1033, SAR231893, REGN846 производства фирмы Regeneron; RG7160, CIM331, RG7745 производства фирмы Roche; ибализумаб (TMB-355) производства фирмы TaiMed Biologics Inc.; TCN-032 производства фирмы Theraclone Sciences; TRC105 производства фирмы TRACON Pharmaceuticals, Inc.; UB-421 производства фирмы United Biomedical Inc.; VB4-845 производства фирмы Viventia Bio, Inc.; ABT-110 производства фирмы AbbVie; каплацизумаб, озорализумаб производства фирмы Ablynx; PRO 140 производства фирмы CytoDyn, Inc.; GS-CDA1, MDX-1388 производства фирмы Medarex, Inc.; AMG 827, AMG 888 производства фирмы Amgen; ублитуксимаб производства фирмы TG Therapeutics Inc.; TOL101 производства фирмы Tolera Therapeutics, Inc.; huN901-DM1 (лорвотузумаб мертанзин) производства фирмы ImmunoGen Inc.; комбинация эпратузумаб Y-90/вельтузумаб (IMMU-102) производства фирмы Immunomedics, Inc.; анти-фибриновое mAb/3B6/22 Tc-99m производства фирмы Agenix, Limited; ALD403 производства фирмы Alder Biopharmaceuticals, Inc.; RN6G/PF-04382923 производства фирмы Pfizer; CG201 производства фирмы CG Therapeutics, Inc.; KB001-A производства фирм KaloBios Pharmaceuticals/Sanofi; KRN-23 производства фирмы Kyowa; Y-90 hPAM 4 производства фирмы Immunomedics, Inc.; тарекстумаб производства фирм Morphosys AG & OncoMed Pharmaceuticals, Inc.; LFG316 производства фирм Morphosys AG & Novartis AG; CNTO3157, CNTO6785 производства фирм Morphosys AG & Jannsen; RG6013 производства фирм Roche & Chugai; MM-111 производства фирмы Merrimack Pharmaceuticals, Inc. («Merrimack»); GSK2862277 производства фирмы GlaxoSmithKline; AMG 282, AMG 172, AMG 595, AMG 745, AMG 761 производства фирмы Amgen; BVX-20 производства фирмы Biocon; CT-P19, CT-P24, CT-P25, CT-P26, CT-P27, CT-P4 производства фирмы Celltrion; GSK284933, GSK2398852, GSK2618960, GSK1223249, GSK933776A производства фирмы GlaxoSmithKline; анетумаб равтанзин производства фирм Morphosys AG & Bayer AG; BI-836845 производства фирм Morphosys AG & Boehringer Ingelheim; NOV-7, NOV-8 производства фирм Morphosys AG и Novartis AG; MM-302, MM-310, MM-141, MM-131, MM-151 производства фирмы Merrimack, RG7882 производства фирм Roche & Seattle Genetics; RG7841 производства фирм Roche/Genentech; PF-06410293, PF-06438179, PF-06439535, PF-04605412, PF-05280586 производства фирмы Pfizer; RG7716, RG7936, гентенерумаб, RG7444 производства фирмы Roche; MEDI-547, MEDI-565, MEDI1814, MEDI4920, MEDI8897, MEDI-4212, MEDI-5117, MEDI-7814 производства фирмы Astrazeneca; улокуплумаб, адсептин PCSK9 производства фирмы Bristol-Myers Squibb; FPA009, FPA145 производства фирмы FivePrime Therapeutics, Inc.; GS-5745 производства фирмы Gilead; BIW-8962, KHK4083, KHK6640 производства фирмы Kyowa Hakko Kirin; MM-141 производства фирмы Merck KGaA; REGN1154, REGN1193, REGN1400, REGN1500, REGN1908-1909, REGN2009, REGN2176-3, REGN728 производства фирмы Regeneron; SAR307746 производства фирмы Sanofi; SGN-CD70A производства фирмы Seattle Genetics; ALX-0141, ALX-0171 производства фирмы Ablynx; милатузумаб-DOX, милатузумаб, TF2, производства фирмы Immunomedics, Inc.; MLNO264 производства фирмы Millennium; ABT-981 производства фирмы AbbVie; AbGn-168H производства фирмы AbGenomics International Inc.; фиклатузумаб производства фирмы AVEO; BI-505 производства фирмы BioInvent International; CDX-1127, CDX-301 производства фирмы Celldex Therapeutics; CLT-008 производства фирмы Cellerant Therapeutics Inc.; VGX-100 производства фирмы Circadian; U3-1565 производства фирмы Daiichi Sankyo Company Limited; DKN-01 производства фирмы Dekkun Corp.; фланвотумаб (белок TYRP1), антитело IL-1 β, IMC-CS4 производства фирмы Eli Lilly; mAb VEGFR3, IMC-TR1 (LY3022859) производства фирм Eli Lilly и ImClone, LLC; Anthim производства фирмы Elusys Therapeutics Inc.; HuL2G7 производства фирмы Galaxy Biotech LLC; IMGB853, IMGN529 производства фирмы ImmunoGen Inc.; CNTO-5, CNTO-5825 производства фирмы Janssen; KD-247 производства фирмы Kaketsuken; KB004 производства фирмы KaloBios Pharmaceuticals; MGA271, MGAH22 производства фирмы MacroGenics, Inc.; XmAb5574 производства фирм MorphoSys AG/Xencor; энситуксимаб (NPC-1C) производства фирмы Neogenix Oncology, Inc.; LFA102 производства фирм Novartis AG и XOMA; ATI355 производства фирмы Novartis AG; SAN-300 производства фирмы Santarus Inc.; SelG1 производства фирмы Selexys; HuM195/rGel производства фирмы Targa Therapeutics, Corp.; VX15 производства фирм Teva Pharmaceuticals, Industries Ltd. («Teva») и Vaccinex Inc.; TCN-202 производства фирмы Theraclone Sciences; XmAb2513, XmAb5872 производства фирмы Xencor; XOMA 3AB производства фирмы XOMA и Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (National Institute for Allergy and Infectious Diseases); вакцина нейробластомных антител производства фирмы MabVax Therapeutics; цитолин производства фирмы CytoDyn, Inc.; травикса производства фирмы Emergent BioSolutions Inc.; и FB 301 производства фирмы Cytovance Biologics; mAb против бешенства производства фирм Janssen и Sanofi; mAb против гриппа производства фирмы Janssen, с частичным финансированием Национальными институтами здравоохранения (National Institutes of Health); MB-003 и ZMapp производства фирмы Mapp Biopharmaceutical, Inc.; и ZMAb производства фирмы Defyrus IncG.

III. зкДНК-вектор в целом для использования в производстве антител и слитых белков

[00216] Варианты реализации изобретения основаны на способах и композициях, содержащих линейные дуплексные векторы с замкнутыми концами (зкДНК), которые могут экспрессировать трансген (например, антитело или слитый белок). В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой последовательность, кодирующую антитело или слитый белок. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, не ограничены по размеру, что позволяет, например, экспрессировать все компоненты, необходимые для экспрессии трансгена из одного вектора. зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков предпочтительно является дуплексным, например, самокомплементарным, по меньшей мере, на части молекулы, такой как экспрессионная кассета. (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой). зкДНК-вектор имеет ковалентно замкнутые концы и, таким образом, устойчив к расщеплению экзонуклеазой (например, экзонуклеазой I или экзонуклеазой III), например, в течение часа при 37 °С.

[00217] Как правило, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе) и второй ITR ААВ. Последовательности ITR выбирают из любого из: (i) по меньшей мере, одного ITR WT и, по меньшей мере, одного модифицированного инвертированного концевого повтора ААВ (mod-ITR) (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию относительно друг друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) пары симметричных или по существу симметричных ITR WT-WT, причем каждый WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) пары симметричных или по существу симметричных модифицированных ITR, причем каждый mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию.

[00218] Данный документ охватывает способы и композиции, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, которые могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, систему доставки на основе липосомных наночастиц. Неограничивающие примеры системы липосомных наночастиц, предусматриваемых для использования, раскрыты в данном документе. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, содержащей зкДНК и ионизируемый липид. Например, состав липидных наночастиц, который изготовлен и нагружен зкДНК-вектором, полученным указанным способом, раскрыт в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ.

[00219] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, не имеют ограничений по упаковке, накладываемых ограниченным пространством внутри вирусного капсида. зкДНК-векторы представляют собой жизнеспособную эукариотически продуцируемую альтернативу продуцируемым прокариотами плазмидным ДНК-векторам, в отличие от инкапсулированных ААВ-геномов. Это позволяет вставлять контрольные элементы, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, большие трансгены, множественные трансгены и т.д.

[00220] Фиг. 1А-1Е демонстрируют схемы неограничивающих примеров зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, или соответствующей последовательности зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков являются беескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессионная кассета, содержащая трансген, и второй ITR. Экспрессионная кассета может включать одну или несколько регуляторных последовательностей, которые обеспечивают возможность и/или контролируют экспрессию трансгена, например, в тех случаях, когда экспрессионная кассета может содержать что-то одно или несколько из следующего, в указанном порядке: энхансер/промотор, репортер ORF (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(A) BGH).

[00221] Экспрессионная кассета также может содержать внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и/или элемент 2А. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может действовать в качестве промотора для трансгена, например, антитела или слитого белка. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторный переключатель, который описан в данном документе в разделе, озаглавленном «Регуляторные переключатели», для контроля и регуляции экспрессии антитела или слитого белка, и может включать, при необходимости, регуляторный переключатель, являющийся «аварийным выключателем», обеспечивающим контролируемую гибель клетки, содержащей зкДНК-вектор.

[00222] Экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотидов, или 50000 нуклеотидов, или любой диапазон значений от примерно 4000 до 10000 нуклеотидов или от 100000000 нуклеотидов до более 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 75000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 1000 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать трансген, имеющий длину в диапазоне от 500 до 5000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру инкапсидированных векторов ААВ, что позволяет доставлять экспрессионную кассету большого размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор лишен специфического для прокариот метилирования.

[00223] Экспрессионная кассета зкДНК может включать, например, экспрессируемую экзогенную последовательность (например, открытую рамку считывания) или трансген, кодирующие белок, который либо отсутствует, либо неактивен, либо обладает недостаточной активностью у субъекта-реципиента, или ген, который кодирует белок, имеющий желаемый биологический или терапевтический эффект. Трансген может кодировать продукт гена, который может выполнять функцию коррекции экспрессии дефектного гена или транскрипта. В принципе, экспрессионная кассета может включать любой ген, кодирующий белок, полипептид или РНК, который либо редуцирован, либо отсутствует из-за мутации, или который приносит терапевтическую пользу, когда сверхэкспрессия считается входящей в объем изобретения.

[00224] Экспрессионная кассета может содержать любой трансген (например, кодирующий антитело или слитый белок), например, антитело или слитый белок, пригодные для лечения заболевания или расстройства у субъекта, т.е. терапевтические антитело или слитый белок. зкДНК-вектор может быть использован для доставки и экспрессии любого представляющего интерес антитела или слитого белка у субъекта, отдельно или в комбинации с нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептиды, или некодирующими нуклеиновыми кислотами (например, РНКи (RNAi), зрелые микроРНК (miR) и т.д.), а также экзогенные гены и нуклеотидные последовательности, включая вирусные последовательности в геноме субъекта, например, последовательности вируса ВИЧ и т.п. Предпочтительно зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, используется в терапевтических целях (например, для медицинских, диагностических или ветеринарных применений), или иммуногенные полипептиды. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор пригоден для экспрессии у субъекта любого представляющего интерес гена, который включает один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК (siRNA), РНКи, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов или РНК (кодирующих или некодирующих, например, миРНК, короткие шпилечные РНК (shRNA), микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR))), антител, антигенсвязывающих фрагментов или любую их комбинацию.

[00225] Экспрессионная кассета также может кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, короткие шпилечные РНК, микроРНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир)). Экспрессионные кассеты могут включать экзогенную последовательность, которая кодирует репортерный белок для использования в экспериментальных или диагностических целях, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области.

[00226] Последовательности, представленные в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, описанного в данном документе, могут быть кодон-оптимизированы для целевой клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных животных, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ Gene Forge® фирмы Aptagen (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или слитый белок, оптимизирована для экспрессии у человека и/или представляет собой человеческое антитело или гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как известно в данной области.

[00227] В некоторых вариантах реализации антитело или слитый белок, экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой терапевтическое антитело или слитый белок, включая терапевтические активирующие антитела или слитые белки или терапевтические нейтрализующие (например, блокирующие или ингибирующие) антитела или слитые белки.

[00228] Трансген, экспрессируемый зкДНК-вектором для продуцирования антитела или слитого белка, как раскрыто в данном документе, кодирует антитело или слитый белок. Антитела и слитые белки хорошо известны в данной области и могут связываться с любым представляющим интерес белком, включая, без ограничений, лиганд, рецептор, токсин, гормон, фермент, или белок клеточной поверхности, или патоген, или вирусный белок, или антиген, а также пре- и посттрансляционно модифицированные белки, такие как гликопротеины или сумоилированные белки (например, антитело против SUMO2/3) и т.д. Антитела также включают антитела, которые связываются с любым антигеном, включая, без ограничений, нуклеиновые кислоты, например, ДНК (например, антитела против дцДНК), РНК (например, антитела, связывающиеся с РНК). В некоторых вариантах реализации антитела или слитые белки, продуцируемые зкДНК-векторами, раскрытыми в данном документе, являются нейтрализующими антителами или слитыми белками. Типичные примеры генов, выступающих в роли мишеней, и белков, представляющих интерес, подробно описаны в разделах методов применения и способов лечения данного документа. Антитела, слитые белки, а также их варианты и/или активные фрагменты для применения в лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства, предусматриваются для использования в зкДНК-векторах с целью продуцирования антител или слитых белков, раскрытых в данном документе. Типичные примеры терапевтических генов описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Способ лечения».

[00229] Существует много структурных особенностей зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, которые отличаются от векторов экспрессии на основе плазмид. зкДНК-векторы могут обладать одной или несколькими из следующих особенностей: отсутствие исходной (т.е. не вставленной) бактериальной ДНК, отсутствие прокариотической точки начала репликации, самодостаточность, т.е. они не требуют каких-либо последовательностей, кроме двух ITR, включая сайты связывания Rep и концевого разрешения (RBS и TRS), и экзогенной последовательности между ITR, наличие последовательностей ITR, образующих шпильки, и отсутствие метилирования ДНК бактериального типа или какого-либо другого метилирования, считающегося аномальным у млекопитающего-хозяина. В целом, предпочтительно, чтобы векторы по данному изобретению не содержали какой-либо прокариотической ДНК, но предусматривается, что некоторое количество прокариотической ДНК может быть вставлено в виде экзогенной последовательности, в качестве неограничивающего примера, в области промотора или энхансера. Другой важной особенностью, отличающей зкДНК-векторы от плазмидных экспрессионных векторов, является то, что зкДНК-векторы представляют собой одноцепочечную линейную ДНК с замкнутыми концами, тогда как плазмиды всегда представляют собой двухцепочечную ДНК.

[00230] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, полученные способами, представленными в данном документе, предпочтительно, имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, при определении анализом расщепления рестриктазой (Фиг. 4D). Полагают, что линейная и непрерывная структура является более устойчивой к воздействию клеточных эндонуклеаз, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Таким образом, зкДНК-вектор линейной и непрерывной структуры является предпочтительным вариантом реализации. Непрерывный линейный одноцепочечный зкДНК-вектор с внутримолекулярным дуплексом может иметь ковалентно связанные терминальные концы, без последовательностей, кодирующих капсидные белки ААВ. Эти зкДНК-векторы структурно отличаются от плазмид (включая зкДНК-плазмиды, описанные в данном документе), которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновой кислоты бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с образованием двух молекул нуклеиновой кислоты, в то время как зкДНК-векторы, напротив, хотя и имеют комплементарные цепи, представляют собой одну молекулу ДНК и потому остаются единой молекулой даже в денатурированном состоянии. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть получены без метилирования ДНК-оснований по прокариотическому типу, в отличие от плазмид. Таким образом, зкДНК-векторы и зкДНК-плазмиды различаются как по структуре (в частности, линейной или кольцевой), так и по способам, применяемым для получения и очистки этих различных объектов (см. ниже), а также по их характеру метилирования ДНК, которое происходит по прокариотическому типу в зкДНК-плазмидах и по эукариотическому типу в зкДНК-векторе.

[00231] Существует несколько преимуществ использования зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, по сравнению с экспрессионными векторами на основе плазмид, такие преимущества включают, без ограничений, следующие: 1) плазмиды содержат последовательности бактериальной ДНК и подвергаются специфичному для прокариот метилированию, например, метилированию 6-метиладенозина и 5-метилцитозина, тогда как бескапсидные последовательности ААВ-вектора имеют эукариотическое происхождение и не подвергаются специфическому для прокариот метилированию; в результате бескапсидные ААВ-векторы с меньшей вероятностью будут индуцировать воспалительные и иммунные реакции по сравнению с плазмидами; 2) если плазмиды требуют наличия гена устойчивости в процессе получения, то зкДНК-векторы его не требуют; 3) если кольцевая плазмида не доставляется в ядро при введении в клетку и требует перегрузки для того, чтобы избежать деградации клеточными нуклеазами, то зкДНК-векторы содержат вирусные цис-элементы, т.е. ITR, которые придают устойчивость к нуклеазам и могут быть сконструированы для обеспечения нацеливания и доставки в ядро. Было выдвинуто предположение, что минимальными определяющими элементами, обязательными для функции ITR, являются Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 64) для ААВ2) плюс вариабельная палиндромная последовательность, обеспечивающая возможность образования шпильки; и 4) зкДНК-векторы не имеют часто наблюдаемой в плазмидах прокариотического происхождения чрезмерной представленности динуклеотидов CpG (цитозин-фосфат-гуанин), которые, по имеющимся данным, связываются с представителем Toll-подобного семейства рецепторов, вызывая опосредованный T-клетками иммунный ответ. Напротив, трансдукция бескапсидными ААВ-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами ААВ, с применением различных реагентов для доставки.

IV. ITR

[00232] Как раскрыто в данном документе, зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков содержат трансген или последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), причем последовательности ITR могут быть асимметричной парой ITR или симметричной или по существу симметричной парой ITR, как эти термины определены в данном документе. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может содержать последовательности ITR, которые выбраны из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (mod-ITR) ААВ (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) пары симметричных или по существу симметричных ITR WT-WT, в которой каждый WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) пары симметричных или по существу симметричных модифицированных ITR, в которой каждый mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, при этом способы по данному изобретению могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, система доставки на основе липосомных наночастиц.

[00233] В некоторых вариантах реализации последовательность ITR может принадлежать вирусам семейства Parvoviridae, включающего два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют насекомых. Подсемейство Parvovirinae (называемое парвовирусами) включает в себя род Dependovirus, представители которого для продуктивной инфекции, в большинстве случаев, нуждаются в коинфекции хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса. Род Dependovirus включает аденоассоциированный вирус (ААВ), который обычно инфицирует человека (например, серотипы 2, 3A, 3B, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы крупного рогатого скота, собачьих, лошадей и овец). Парвовирусы и другие члены семейства Parvoviridae в общем описаны в Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).

[00234] Хотя ITR, приведенные для иллюстрации в данном документе в описании и Примерах, представляют собой WT-ITR ААВ2, специалисту в данной области техники понятно, что, как было указано выше, можно использовать ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как ААВ (например, из генома ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), химерные ITR или ITR из любого синтетического ААВ. В некоторых вариантах реализации ААВ может инфицировать теплокровных животных, например, аденоассоциированные вирусы птиц (AAAV), крупного рогатого скота (BAAV), собак, лошадей и овец. В некоторых вариантах реализации указанный ITR происходит от парвовируса B19 (GenBank, № доступа NC 000883), минутного вируса мышей (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); парвовируса гусей (GenBank, № доступа NC 001701); парвовируса змей 1 (GenBank, № доступа NC 006148). В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR может принадлежать к одному серотипу, а 3' WT-ITR - к другому серотипу, как описано в данном документе.

[00235] Рядовому специалисту в данной области техники известно, что последовательности ITR содержат, в качестве общего структурного элемента, двуцепочечную структуру Холлидея, которая, как правило, представляет собой T-образную или Y-образную шпильку (см., например, Фиг. 2A и Фиг. 3A), при этом каждый WT-ITR образован двумя палиндромными плечами или петлями (B-B' и C-C'), встроенными в палиндромное плечо большего размера (A-A'), и одноцепочечной последовательностью D (где порядок указанных палиндромных последовательностей определяет направление ориентации ITR в одну или другую сторону (flip or flop)). См., например, описание структурного анализа и сравнения последовательностей ITR из разных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6) в Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. Специалист в данной области техники может легко определить последовательности WT-ITR из любого серотипа ААВ для использования в зкДНК-векторе или в зкДНК-плазмиде, на основании приведенных в данном документе примеров последовательностей ITR ААВ2. См., например, сравнение последовательностей ITR из различных серотипов ААВ (ААВ1-ААВ6 и ААВ птиц (AAAV) и ААВ крупного рогатого скота (BAAV)), описанное в Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; где приведен % идентичности левого ITR ААВ2 с левым ITR из других серотипов: ААВ-1 (84%), ААВ-3 (86%), ААВ-4 (79%), ААВ-5 (58%) ААВ-6 (левый ITR) (100%) и ААВ-6 (правый ITR) (82%).

А. Симметричные пары ITR

[00236] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса (ААВ) (ITR), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ITR ААВ, причем первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) являются симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, т.е. зкДНК-вектор может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имела одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве. В таком варианте реализации симметричная пара ITR или по существу симметричная пара ITR могут быть модифицированными ITR (например, mod-ITR), которые не являются ITR дикого типа. Пара mod-ITR может иметь одинаковые последовательности, которые содержат одну или несколько модификаций по сравнению с ITR дикого типа и являются обратно комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации, пара модифицированных ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR может иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму.

[00237] (i) ITR дикого типа

[00238] В некоторых вариантах реализации симметричные ITR или по существу симметричные ITR относятся к дикому типу (WT-ITR), как описано в данном документе. То есть, оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не должны обязательно быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.

[00239] Соответственно, как описано в данном документе, зкДНК-векторы содержат трансген или гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, расположенные между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), которые являются либо обратно комплементарными (инвертированными) относительно друг друга, либо, альтернативно, являются по существу симметричными друг относительно друга - т.е. пара WT-ITR имеет симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации последовательность ITR дикого типа (например, ААВ WT-ITR) содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62).

[00240] В одном аспекте зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков можно получить из векторного полинуклеотида, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR) (например, WT-ITR ААВ). То есть, оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не должны обязательно быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу ААВ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу ААВ. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR относится к одному серотипу ААВ, а 3' WT-ITR относится к тому же или другому серотипу ААВ. В некоторых вариантах реализации 5'-WT-ITR и 3'WT-ITR являются зеркальными изображениями друг друга, т.е. они симметричны. В некоторых вариантах реализации 5' WT-ITR и 3' WT-ITR относятся к одному и тому же серотипу ААВ.

[00241] WT ITR хорошо известны. В одном варианте реализации два ITR относятся к одному и тому же серотипу ААВ2. В некоторых вариантах реализации можно использовать последовательности дикого типа (WT) из других серотипов. Существует ряд серотипов, которые являются гомологичными, например, ААВ2, ААВ4, ААВ6, ААВ8. В одном варианте реализации могут использоваться близко гомологичные ITR (например, ITR с аналогичной структурой петли). В другом варианте реализации можно использовать ITR WT ААВ с большей степенью различий, например, ААВ2 и ААВ5, и еще в одном варианте реализации можно использовать ITR, который по существу относится к WT, т.е. имеет базовую структуру петли, характерную для WT, но содержит некоторые консервативные изменения нуклеотидов, которые не изменяют или не влияют на свойства. При использовании WT-ITR из одного и того же вирусного серотипа может быть дополнительно использована одна или несколько регуляторных последовательностей. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность представляет собой регуляторный переключатель, который позволяет модулировать активность зкДНК, например, экспрессию кодируемого антитела или слитого белка.

[00242] В некоторых вариантах реализации один из аспектов технологии, описанной в данном документе, относится к зкДНК-вектору для продуцирования антител или слитых белков, при этом зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), причем WT-ITR могут принадлежать к одному и тому же серотипу, разным серотипам, или быть по существу симметричными друг относительно друга (т.е. иметь симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или иметь одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве). В некоторых вариантах реализации симметричные WT-ITR содержат функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт. В некоторых вариантах реализации гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген и при этом вектор не заключен в вирусный капсид.

[00243] В некоторых вариантах реализации WT-ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг относительно друга. Например, последовательности AACG в 5'-ITR может соответствовать CGTT (т.е. обратный комплемент) в соответствующем сайте 3'-ITR. 5'-WT-ITR содержит последовательность ATCGATCG, а соответствующая смысловая цепь 3'-WT-ITR содержит CGATCGAT (т.е. обратный комплемент ATCGATCG). В некоторых вариантах реализации зкДНК, WT-ITR дополнительно содержит сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, Rep-связывающий сайт.

[00244] Типичные последовательности WT-ITR для использования в зкДНК-векторах для продуцирования антител или слитых белков, содержащих WT-ITR, приведены в Таблице 7, где представлены пары WT-ITR (5' WT-ITR и 3' WT-ITR).

[00245] В качестве типичного примера, данное изобретение предусматривает зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, содержащий промотор, функционально связанный с трансгеном (например, гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты), с регуляторным переключателем или без него, при этом зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. Фиг. 1F-1G), которая кодирует WT-ITR, причем каждый WT-ITR имеет одинаковое количество пар оснований внутримолекулярных дуплексов во вторичной конфигурации своей шпильки (предпочтительно, исключая делецию любой концевой петли AAA или TTT в этой конфигурации по сравнению с такими референсными последовательностями), и (b) идентифицируется как зкДНК с использованием анализа идентификации зкДНК с помощью электрофореза на агарозном геле с нативным гелем и в денатурирующих условиях в Примере 1.

[00246] В некоторых вариантах реализации, фланкирующие WT-ITR по существу симметричны друг другу. В этом варианте реализации 5' WT-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а 3' WT-ITR ITR - к другому серотипу ААВ, так что WT-ITR не являются идентичными обратными комплементами. Например, 5' WT-ITR может принадлежать к ААВ2, а 3' WT-ITR - к другому серотипу (например, ААВ1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12). В некоторых вариантах реализации WT-ITR могут быть выбраны из двух разных парвовирусов, выбранных из любого из: ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змеи (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собак, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, парвовируса свиней или ААВ насекомых. В некоторых вариантах реализации такая комбинация ITR WT является комбинацией ITR WT из ААВ2 и ААВ6. В одном варианте реализации, WT-ITR являются по существу симметричными, когда один из них является инвертированным относительно другого ITR, идентичного на по меньшей мере 90%, идентичного на по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96% ... 97% ... 98%... 99% ... 99,5%, включая все промежуточные значения, и имеет такую же симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, поскольку они имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, например, имеют одинаковую трехмерную организацию A, C-C', B-B' и D-плеч. В одном варианте реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертирована друг относительно друга и идентична на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96% ... 97% ... 98%... 99% .... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5´-GCGCGCTCGCTCGCTC-3´ (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs). В некоторых вариантах реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертирована друг относительно друга, и является по меньшей мере на 95% идентичными, по меньшей мере на 96% ... 97% ... 98%... 99% .... 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5´-GCGCGCTCGCTCGCTC-3´ (SEQ ID NO: 60) и сайт концевого разрешения (trs), и в дополнение к вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей сформировать вторичную структуру шпильки. Гомология может быть определена стандартными средствами, хорошо известными в данной области техники, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search ToolTool (простое средство поиска локальных соответствий)), BLASTN, при настройках по умолчанию.

[00247] В некоторых вариантах реализации структурным элементом ITR может быть любой структурный элемент, который участвует в функциональном взаимодействии ITR с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). В некоторых вариантах реализации структурный элемент обеспечивает селективность взаимодействия ITR с большим белком Rep, т.е. определяет, по меньшей мере, частично, какой белок Rep функционально взаимодействует с ITR. В других вариантах реализации структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ITR. Каждый структурный элемент может быть, например, вторичной структурой ITR, нуклеотидной последовательностью ITR, промежуточной последовательностью между двумя или более элементами, или комбинацией любого из вышеперечисленного. В одном варианте реализации конструктивные элементы выбирают из группы, состоящей из плеча A и A’, плеча B и B’, плеча C и C’, плеча D, Rep-связывающего сайта (RBE) и RBE’ (т.е. последовательности, комплементарной RBE), и сайта концевого разрешения (trs).

[00248] Только в качестве примера, в Таблице 6 представлены примеры комбинаций WT-ITR.

[00249] Таблица 6: Иллюстративные примеры комбинаций WT-ITR одного и того же серотипа, или разных серотипов, или разных парвовирусов. Приведенный порядок не указывает на положение ITR, например, «ААВ1, ААВ2» демонстрирует, что зкДНК может содержать WT-ITR ААВ1 в положении 5' и WT-ITR ААВ2 в положении 3' или, наоборот, WT-ITR ААВ2 в положении 5' и WT-ITR ААВ1 в положении 3'. Сокращения: ААВ серотипа 1 (ААВ1), ААВ серотипа 2 (ААВ2), ААВ серотипа 3 (ААВ3), ААВ серотипа 4 (ААВ4), ААВ серотипа 5 (ААВ5), ААВ серотипа 6 (ААВ6), ААВ серотипа 7 (ААВ7), ААВ серотипа 8 (ААВ8), ААВ серотипа 9 (ААВ9), ААВ серотипа 10 (ААВ10), ААВ серотипа 11 (ААВ11) или ААВ серотипа 12 (ААВ12); геном ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8 (например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITR теплокровных животных (птичий ААВ (AAAV), бычий ААВ (ААВ крупного рогатого скота) (BAAV), ААВ собак, лошадей и овец), ITR парвовируса B19 (GenBank, № доступа: NC 000883), минутного вируса мышей (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); гуси: парвовирус гусей (GenBank, № доступа: NC 001701); змеи: змеиный парвовирус 1 (GenBank, № доступа: NC 006148).

[00250]

Таблица 6 ААВ1, ААВ1 ААВ2, ААВ2 ААВ3, ААВ3 ААВ4, ААВ4 ААВ5, ААВ5 ААВ1, ААВ2 ААВ2, ААВ3 ААВ3, ААВ4 ААВ4, ААВ5 ААВ5, ААВ6 ААВ1, ААВ3 ААВ2, ААВ4 ААВ3, ААВ5 ААВ4, ААВ6 ААВ5, ААВ7 ААВ1, ААВ4 ААВ2, ААВ5 ААВ3, ААВ6 ААВ4, ААВ7 ААВ5, ААВ8 ААВ1, ААВ5 ААВ2, ААВ6 ААВ3, ААВ7 ААВ4, ААВ8 ААВ5, ААВ9 ААВ1, ААВ6 ААВ2, ААВ7 ААВ3, ААВ8 ААВ4, ААВ9 ААВ5, ААВ10 ААВ1, ААВ7 ААВ2, ААВ8 ААВ3, ААВ9 ААВ4, ААВ10 ААВ5, ААВ11 ААВ1, ААВ8 ААВ2, ААВ9 ААВ3, ААВ10 ААВ4, ААВ11 ААВ5, ААВ12 ААВ1, ААВ9 ААВ2, ААВ10 ААВ3, ААВ11 ААВ4, ААВ12 ААВ5, ААВRH8 ААВ1, ААВ10 ААВ2, ААВ11 ААВ3, ААВ12 ААВ4, ААВRH8 ААВ5, ААВRH10 ААВ1, ААВ11 ААВ2, ААВ12 ААВ3, ААВRH8 ААВ4, ААВRH10 ААВ5, ААВ13 ААВ1, ААВ12 ААВ2, ААВRH8 ААВ3, ААВRH10 ААВ4, ААВ13 ААВ5, ААВDJ ААВ1, ААВRH8 ААВ2, ААВRH10 ААВ3, ААВ13 ААВ4, ААВDJ ААВ5, ААВDJ8 ААВ1, ААВRH10 ААВ2, ААВ13 ААВ3, ААВDJ ААВ4, ААВDJ8 ААВ5, ПТИЧИЙ ААВ1, ААВ13 ААВ2, ААВDJ ААВ3, ААВDJ8 ААВ4, ПТИЧИЙ ААВ5, БЫЧИЙ ААВ1, ААВDJ ААВ2, ААВDJ8 ААВ3, ПТИЧИЙ ААВ4, БЫЧИЙ ААВ5, СОБАЧИЙ ААВ1, ААВDJ8 ААВ2, ПТИЧИЙ ААВ3, БЫЧИЙ ААВ4, СОБАЧИЙ ААВ5, ЛОШАДЕЙ ААВ1, ПТИЧИЙ ААВ2, БЫЧИЙ ААВ3, СОБАЧИЙ ААВ4, ЛОШАДЕЙ ААВ5, КОЗИЙ ААВ1, БЫЧИЙ ААВ2, СОБАЧИЙ ААВ3, ЛОШАДЕЙ ААВ4, КОЗИЙ ААВ5, КРЕВЕТОК ААВ1, СОБАЧИЙ ААВ2, ЛОШАДЕЙ ААВ3, КОЗИЙ ААВ4, КРЕВЕТОК ААВ5, СВИНЕЙ ААВ1, ЛОШАДЕЙ ААВ2, КОЗИЙ ААВ3, КРЕВЕТОК ААВ4, СВИНЕЙ ААВ5, НАСЕКОМЫХ ААВ1, КОЗИЙ ААВ2, КРЕВЕТОК ААВ3, СВИНЕЙ ААВ4, НАСЕКОМЫХ ААВ5, ОВЕЦ ААВ1, КРЕВЕТОК ААВ2, СВИНЕЙ ААВ3, НАСЕКОМЫХ ААВ4, ОВЕЦ ААВ5, B19 ААВ1, СВИНЕЙ ААВ2, НАСЕКОМЫХ ААВ3, ОВЕЦ ААВ4, B19 ААВ5, MVM ААВ1, НАСЕКОМЫХ ААВ2, ОВЕЦ ААВ3, B19 ААВ4, MVM ААВ5, ГУСЕЙ ААВ1, ОВЕЦ ААВ2, B19 ААВ3, MVM ААВ4, ГУСЕЙ ААВ5, ЗМЕЙ ААВ1, B19 ААВ2, MVM ААВ3, ГУСЕЙ ААВ4, ЗМЕЙ ААВ1, MVM ААВ2, ГУСЕЙ ААВ3, ЗМЕЙ ААВ1, ГУСЕЙ ААВ2, ЗМЕЙ ААВ1, ЗМЕЙ ААВ6, ААВ6 ААВ7, ААВ7 ААВ8, ААВ8 ААВ9, ААВ9 ААВ10, ААВ10 ААВ6, ААВ7 ААВ7, ААВ8 ААВ8, ААВ9 ААВ9, ААВ10 ААВ10, ААВ11 ААВ6, ААВ8 ААВ7, ААВ9 ААВ8, ААВ10 ААВ9, ААВ11 ААВ10, ААВ12 ААВ6, ААВ9 ААВ7, ААВ10 ААВ8, ААВ11 ААВ9, ААВ12 ААВ10, ААВRH8 ААВ6, ААВ10 ААВ7, ААВ11 ААВ8, ААВ12 ААВ9, ААВRH8 ААВ10, ААВRH10 ААВ6, ААВ11 ААВ7, ААВ12 ААВ8, ААВRH8 ААВ9, ААВRH10 ААВ10, ААВ13 ААВ6, ААВ12 ААВ7, ААВRH8 ААВ8, ААВRH10 ААВ9, ААВ13 ААВ10, ААВDJ ААВ6, ААВRH8 ААВ7, ААВRH10 ААВ8, ААВ13 ААВ9, ААВDJ ААВ10, ААВDJ8 ААВ6, ААВRH10 ААВ7, ААВ13 ААВ8, ААВDJ ААВ9, ААВDJ8 ААВ10, ПТИЧИЙ ААВ6, ААВ13 ААВ7, ААВDJ ААВ8, ААВDJ8 ААВ9, ПТИЧИЙ ААВ10, БЫЧИЙ ААВ6, ААВDJ ААВ7, ААВDJ8 ААВ8, ПТИЧИЙ ААВ9, БЫЧИЙ ААВ10, СОБАЧИЙ ААВ6, ААВDJ8 ААВ7, ПТИЧИЙ ААВ8, БЫЧИЙ ААВ9, СОБАЧИЙ ААВ10, ЛОШАДЕЙ ААВ6, ПТИЧИЙ ААВ7, БЫЧИЙ ААВ8, СОБАЧИЙ ААВ9, ЛОШАДЕЙ ААВ10, КОЗИЙ ААВ6, БЫЧИЙ ААВ7, СОБАЧИЙ ААВ8, ЛОШАДЕЙ ААВ9, КОЗИЙ ААВ10, КРЕВЕТОК ААВ6, СОБАЧИЙ ААВ7, ЛОШАДЕЙ ААВ8, КОЗИЙ ААВ9, КРЕВЕТОК ААВ10, СВИНЕЙ ААВ6, ЛОШАДЕЙ ААВ7, КОЗИЙ ААВ8, КРЕВЕТОК ААВ9, СВИНЕЙ ААВ10, НАСЕКОМЫХ ААВ6, КОЗИЙ ААВ7, КРЕВЕТОК ААВ8, СВИНЕЙ ААВ9, НАСЕКОМЫХ ААВ10, ОВЕЦ ААВ6, КРЕВЕТОК ААВ7, СВИНЕЙ ААВ8, НАСЕКОМЫХ ААВ9, ОВЕЦ ААВ10, B19 ААВ6, СВИНЕЙ ААВ7, НАСЕКОМЫХ ААВ8, ОВЕЦ ААВ9, B19 ААВ10, MVM ААВ6, НАСЕКОМЫХ ААВ7, ОВЕЦ ААВ8, B19 ААВ9, MVM ААВ10, ГУСЕЙ ААВ6, ОВЕЦ ААВ7, B19 ААВ8, MVM ААВ9, ГУСЕЙ ААВ10, ЗМЕЙ ААВ6, B19 ААВ7, MVM ААВ8, ГУСЕЙ ААВ9, ЗМЕЙ ААВ6, MVM ААВ7, ГУСЕЙ ААВ8, ЗМЕЙ ААВ6, ГУСЕЙ ААВ7, ЗМЕЙ ААВ6, ЗМЕЙ ААВ11, ААВ11 ААВ12, ААВ12 ААВRH8, ААВRH8 ААВRH10, ААВRH10 ААВ13, ААВ13 ААВ11, ААВ12 ААВ12, ААВRH8 ААВRH8, ААВRH10 ААВRH10, ААВ13 ААВ13, ААВDJ ААВ11, ААВRH8 ААВ12, ААВRH10 ААВRH8, ААВ13 ААВRH10, ААВDJ ААВ13, ААВDJ8 ААВ11, ААВRH10 ААВ12, ААВ13 ААВRH8, ААВDJ ААВRH10, ААВDJ8 ААВ13, ПТИЧИЙ ААВ11, ААВ13 ААВ12, ААВDJ ААВRH8, ААВDJ8 ААВRH10, ПТИЧИЙ ААВ13, БЫЧИЙ ААВ11, ААВDJ ААВ12, ААВDJ8 ААВRH8, ПТИЧИЙ ААВRH10, БЫЧИЙ ААВ13, СОБАЧИЙ ААВ11, ААВDJ8 ААВ12, ПТИЧИЙ ААВRH8, БЫЧИЙ ААВRH10, СОБАЧИЙ ААВ13, ЛОШАДЕЙ ААВ11, ПТИЧИЙ ААВ12, БЫЧИЙ ААВRH8, СОБАЧИЙ ААВRH10, ЛОШАДЕЙ ААВ13, КОЗИЙ ААВ11, БЫЧИЙ ААВ12, СОБАЧИЙ ААВRH8, ЛОШАДЕЙ ААВRH10, КОЗИЙ ААВ13, КРЕВЕТОК ААВ11, СОБАЧИЙ ААВ12, ЛОШАДЕЙ ААВRH8, КОЗИЙ ААВRH10, КРЕВЕТОК ААВ13, СВИНЕЙ ААВ11, ЛОШАДЕЙ ААВ12, КОЗИЙ ААВRH8, КРЕВЕТОК ААВRH10, СВИНЕЙ ААВ13, НАСЕКОМЫХ ААВ11, КОЗИЙ ААВ12, КРЕВЕТОК ААВRH8, СВИНЕЙ ААВRH10, НАСЕКОМЫХ ААВ13, ОВЕЦ ААВ11, КРЕВЕТОК ААВ12, СВИНЕЙ ААВRH8, НАСЕКОМЫХ ААВRH10, ОВЕЦ ААВ13, B19 ААВ11, СВИНЕЙ ААВ12, НАСЕКОМЫХ ААВRH8, ОВЕЦ ААВRH10, B19 ААВ13, MVM ААВ11, НАСЕКОМЫХ ААВ12, ОВЕЦ ААВRH8, B19 ААВRH10, MVM ААВ13, ГУСЕЙ ААВ11, ОВЕЦ ААВ12, B19 ААВRH8, MVM ААВRH10, ГУСЕЙ ААВ13, ЗМЕЙ ААВ11, B19 ААВ12, MVM ААВRH8, ГУСЕЙ ААВRH10, ЗМЕЙ ААВ11, MVM ААВ12, ГУСЕЙ ААВRH8, ЗМЕЙ ААВ11, ГУСЕЙ ААВ12, ЗМЕЙ ААВ11, ЗМЕЙ ААВDJ, ААВDJ ААВDJ8, AVVDJ8 ПТИЧИЙ, ПТИЧИЙ БЫЧИЙ, БЫЧИЙ СОБАЧИЙ, СОБАЧИЙ ААВDJ, ААВDJ8 ААВDJ8, ПТИЧИЙ ПТИЧИЙ, БЫЧИЙ БЫЧИЙ, СОБАЧИЙ СОБАЧИЙ, ЛОШАДЕЙ ААВDJ, ПТИЧИЙ ААВDJ8, БЫЧИЙ ПТИЧИЙ, СОБАЧИЙ БЫЧИЙ, ЛОШАДЕЙ СОБАЧИЙ, КОЗИЙ ААВDJ, БЫЧИЙ ААВDJ8, СОБАЧИЙ ПТИЧИЙ, ЛОШАДЕЙ БЫЧИЙ, КОЗИЙ СОБАЧИЙ, КРЕВЕТОК ААВDJ, СОБАЧИЙ ААВDJ8, ЛОШАДЕЙ ПТИЧИЙ, КОЗИЙ БЫЧИЙ, КРЕВЕТОК СОБАЧИЙ, СВИНЕЙ ААВDJ, ЛОШАДЕЙ ААВDJ8, КОЗИЙ ПТИЧИЙ, КРЕВЕТОК БЫЧИЙ, СВИНЕЙ СОБАЧИЙ, НАСЕКОМЫХ ААВDJ, КОЗИЙ ААВDJ8, КРЕВЕТОК ПТИЧИЙ, СВИНЕЙ БЫЧИЙ, НАСЕКОМЫХ СОБАЧИЙ, ОВЕЦ ААВDJ, КРЕВЕТОК ААВDJ8, СВИНЕЙ ПТИЧИЙ, НАСЕКОМЫХ БЫЧИЙ, ОВЕЦ СОБАЧИЙ, B19 ААВDJ, СВИНЕЙ ААВDJ8, НАСЕКОМЫХ ПТИЧИЙ, ОВЕЦ БЫЧИЙ, B19 СОБАЧИЙ, MVM ААВDJ, НАСЕКОМЫХ ААВDJ8, ОВЕЦ ПТИЧИЙ, B19 БЫЧИЙ, MVM СОБАЧИЙ, ГУСЕЙ ААВDJ, ОВЕЦ ААВDJ8, B19 ПТИЧИЙ, MVM БЫЧИЙ, ГУСЕЙ СОБАЧИЙ, ЗМЕЙ ААВDJ, B19 ААВDJ8, MVM ПТИЧИЙ, ГУСЕЙ БЫЧИЙ, ЗМЕЙ ААВDJ, MVM ААВDJ8, ГУСЕЙ ПТИЧИЙ, ЗМЕЙ ААВDJ, ГУСЕЙ ААВDJ8, ЗМЕЙ ААВDJ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, ЛОШАДЕЙ КОЗИЙ, КОЗИЙ КРЕВЕТОК, КРЕВЕТОК СВИНЕЙ, СВИНЕЙ НАСЕКОМЫХ, НАСЕКОМЫХ ЛОШАДЕЙ, КОЗИЙ КОЗИЙ, КРЕВЕТОК КРЕВЕТОК, СВИНЕЙ СВИНЕЙ, НАСЕКОМЫХ НАСЕКОМЫХ, ОВЕЦ ЛОШАДЕЙ, КРЕВЕТОК КОЗИЙ, СВИНЕЙ КРЕВЕТОК, НАСЕКОМЫХ СВИНЕЙ, ОВЕЦ НАСЕКОМЫХ, B19 ЛОШАДЕЙ, СВИНЕЙ КОЗИЙ, НАСЕКОМЫХ КРЕВЕТОК, ОВЕЦ СВИНЕЙ, B19 НАСЕКОМЫХ, MVM ЛОШАДЕЙ, НАСЕКОМЫХ КОЗИЙ, ОВЕЦ КРЕВЕТОК, B19 СВИНЕЙ, MVM НАСЕКОМЫХ, ГУСЕЙ ЛОШАДЕЙ, ОВЕЦ КОЗИЙ, B19 КРЕВЕТОК, MVM СВИНЕЙ, ГУСЕЙ НАСЕКОМЫХ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, B19 КОЗИЙ, MVM КРЕВЕТОК, ГУСЕЙ СВИНЕЙ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, MVM КОЗИЙ, ГУСЕЙ КРЕВЕТОК, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, ГУСЕЙ КОЗИЙ, ЗМЕЙ ЛОШАДЕЙ, ЗМЕЙ ОВЕЦ, ОВЕЦ B19, B19 MVM, MVM ГУСЕЙ, ГУСЕЙ ЗМЕЙ, ЗМЕЙ ОВЕЦ, B19 B19, MVM MVM, ГУСЕЙ ГУСЕЙ, ЗМЕЙ ОВЕЦ, MVM B19, ГУСЕЙ MVM, ЗМЕЙ ОВЕЦ, ГУСЕЙ B19, ЗМЕЙ ОВЕЦ, ЗМЕЙ

[00251] Только в качестве примера, в Таблице 7 приведены последовательности типичных WT-ITR из некоторых разных серотипов ААВ.

[00252]

[00253] В некоторых вариантах реализации нуклеотидная последовательность WT-ITR может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений в указанных пределах), причем модификация представляет собой замену на комплементарный нуклеотид, например, G на C и наоборот, и T на A и наоборот.

[00254] В определенных вариантах реализации данного изобретения зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка не имеет WT-ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любого из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14. В альтернативных вариантах реализации данного изобретения, если зкДНК-вектор имеет WT-ITR, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из любого из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14, то фланкирующий ITR также относится к дикому типу (WT), и зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, например, как описано в данном документе и в международной заявке PCT/US18/49996 (например, см. Таблицу 11 PCT/US18/49996). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и выбранный WT-ITR имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из любого члена группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1, 2, 5-14.

[00255] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может включать структуры WT-ITR, которые сохраняют функциональные части RBE, trs и RBE´. Фиг. 2А и Фиг. 2B демонстрируют, с использованием для иллюстрации ITR дикого типа, один из возможных механизмов функционирования сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей WT-ITR, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один WT-ITR является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, когда зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит два WT-ITR, которые по существу симметричны друг другу, по меньшей мере один WT-ITR является функциональным, и по меньшей мере один WT-ITR является нефункциональным.

B. Модифицированные ITR (mod-ITR) в целом для зкДНК-векторов, содержащих асимметричные пары ITR или симметричные пары ITR

[00256] Как обсуждалось в данном документе, зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка может содержать симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR. В обоих случаях один или оба из ITR могут быть модифицированными ITR - различие заключается в том, что в первом случае (т.е. симметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют одинаковые конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч), тогда как во втором случае (т.е. асимметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют разную трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют разные конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч).

[00257] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR представляет собого ITR, который модифицируют путем делеции, вставки и/или замещения по сравнению с последовательностью ITR дикого типа (например, ITR ААВ). В некоторых вариантах по меньшей мере один из ITR в зкДНК-векторе содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для ААВ2, SEQ ID NO: 60) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 62). В одном варианте реализации, по меньшей мере один из ITR является нефункциональным ITR. В одном варианте реализации каждый из разных или модифицированных ITR не представляет собой ITR дикого типа из разных серотипов.

[00258] Конкретные изменения и мутации в ITR подробно описаны в данном документе, но, в контексте ITR, «измененный» или «мутированный» или «модифицированный» указывает на то, что нуклеотиды были вставлены, удалены и/или замещены относительно последовательности дикого типа, референсной или исходной последовательности ITR. Измененный или мутированный ITR может быть рекомбинантным ITR. Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к аспекту проведения манипуляций человеком. Например, полипептид считается «рекомбинантным», когда по меньшей мере один аспект полипептида, например, его последовательность, был подвергнут манипуляциям со стороны человека для создания отличий от аспекта, в котором он существует в природе.

[00259] В некоторых вариантах реализации mod-ITR может быть синтетическим. В одном варианте реализации синтетический ITR основан на последовательностях ITR из более чем одного серотипа ААВ. В другом варианте реализации синтетический ITR не включает последовательность на основе ААВ. В еще одном варианте реализации синтетический ITR сохраняет структуру ITR, описанную выше, хотя содержит лишь некоторые последовательности из ААВ или не содержит их. В некоторых аспектах синтетический ITR может взаимодействовать преимущественно с Rep дикого типа или Rep определенного серотипа или, в некоторых случаях, он не будет распознаваться Rep дикого типа и будет распознаваться только мутированным Rep.

[00260] Специалист в данной области может определить соответствующую последовательность в других серотипах известными способами. Например, путем определения того, находится ли изменение в области A, A', B, B', C, C' или D, и определения соответствующей области в другом серотипе. Можно использовать BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) или другие программы выравнивания для определения гомологии с настройками по умолчанию для определения соответствующей последовательности. Изобретение дополнительно предусматривает популяции и множества зкДНК-векторов, содержащих mod-ITR из комбинации различных серотипов ААВ, т.е. один mod-ITR может принадлежать к одному серотипу ААВ, а другой mod-ITR может принадлежать к другому серотипу. Не желая быть связанными какой-либо теорией, укажем, что в одном варианте реализации один ITR может быть взят из последовательности ITR ААВ2 или быть на ней основан, а другой ITR зкДНК-вектора может быть взят из или быть основан на любой одной или нескольких последовательностях ITR серотипа 1 ААВ (ААВ1), ААВ серотипа 4 (ААВ4), ААВ серотипа 5 (ААВ5), ААВ серотипа 6 (ААВ6), ААВ серотипа 7 (ААВ7), ААВ серотипа 8 (ААВ8), ААВ серотипа 9 (ААВ9), ААВ серотипа 10 (ААВ10), ААВ серотипа 11 (ААВ11) или ААВ серотипа 12 (ААВ12).

[00261] Любой парвовирусный ITR может быть использован как ITR или в качестве базового ITR для модификации. Предпочтительно, парвовирус представляет собой депендовирус. Более предпочтительно, он представляет собой ААВ. Выбранный серотип может быть основан на тканевом тропизме серотипа. ААВ2 обладает широким тканевым тропизмом, ААВ1 преимущественно нацелен на нейрональные ткани и скелетные мышцы, а ААВ5 преимущественно нацелен на нейрональные ткани, пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы. ААВ6 преимущественно нацелен на скелетные мышцы и легкие. ААВ8 нацелен преимущественно на ткани печени, скелетных мышц, сердца и поджелудочной железы. ААВ9 преимущественно нацелен на ткани печени, скелетных мышц и легких. В одном варианте реализации модифицированный ITR основан на ITR ААВ2.

[00262] Более конкретно, способность структурного элемента функционально взаимодействовать с конкретным большим белком Rep может быть изменена путем модификации структурного элемента. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована по сравнению с последовательностью ITR дикого типа. В одном варианте реализации структурный элемент (например, плечо A, плечо A, плечо B, плечо B, плечо C, плечо C, плечо D, RBE, RBE' и TRS) ITR может быть удален и заменен структурным элементом дикого типа из другого парвовируса. Например, заменяющая структура может быть взята из ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ6, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ11, ААВ12, ААВ13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса крупного рогатого скота, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собачьих, парвовируса лошадиных, парвовируса креветок, свиного парвовируса или ААВ насекомых. Например, ITR может представлять собой ITR ААВ2, и плечо A или A' или RBE могут быть заменены структурным элементом из ААВ5. В другом примере, ITR может представлять собой ITR ААВ5, а плечи C или C', RBE и TRS могут быть заменены структурным элементом из ААВ2. В другом примере ITR ААВ может быть ITR ААВ5, в котором плечи B и B' заменены плечами B и B' ITR ААВ2.

[00263] Только в качестве примера, в Таблице 8 приведены типичные примеры модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в областях модифицированных ITR, где X указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, инсерцию и/или замену) в указанном отделе относительно соответствующего ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) в любой из областей C и/или C' и/или B и/или B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по крайней мере в одной концевой петле. Например, если модификация приводит к чему-либо из: ITR с одним плечом (например, с единственным плечом C-C’ или единственным плечом B-B’), или с модифицированным плечом C-B’ или плечом C’-B, или ITR с двумя плечами, содержащему по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо C-C’ и/или усеченное плечо B-B’), то по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плеч ITR с двумя плечами (причем одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида T (т.е., TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации усеченное плечо C-C' и/или усеченное плечо B-B' содержит три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) в концевой петле.

[00264]

Таблица 8: Примеры комбинаций модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в разных областях B-B’ и C-C’ или плечах ITR (X указывает на модификацию нуклеотида, например, добавление, делецию или замену по меньшей мере одного нуклеотида в области). Область B Область B' Область С Область C' X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

[00265] В некоторых вариантах реализации mod-ITR для использования в зкДНК-векторе для продуцирования антитела или слитого белка, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, как описано в данном документе, может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8 , а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: между A' и C, между C и C', между C' и B, между B и B', и между B' и A. В некоторых вариантах реализации, при любой модификации по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, вставке и/или замене) в областях C или C' или B или B', все равно сохраняется концевая петля структуры стебель-петля. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В альтернативных вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида A (т.е. AAA) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: A', A и/или D. Например, в некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А и/или A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 8, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области D.

[00266] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений), для получения модифицированного структурного элемента. Примеры конкретных модификаций ITR согласно одному варианту реализации приведены в данном документе (например, SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или представлены на Фиг. 7A-7B PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г. (например, SEQ ID NO: 97-98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54 в PCT/US2018/064242). В некоторых вариантах реализации ITR может быть модифицирован (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений). В других вариантах реализации ITR может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичности последовательностей с одним из модифицированных ITR из SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или RBE-содержащего отдела плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' согласно SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187, или приведенных в Таблицах 2-9 (т.е. SEQ ID NO: 110-112, 115-190, 200-468) международной заявки PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00267] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может, например, содержать удаление или делецию всего конкретного плеча, например, всего или части плеча A-A', или всего или части плеча B-B', или всего или части плеча C-C' или, альтернативно, удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований, образующих стебель петли, при условии сохранения присутствия кэпирующей петли на конце стебля (например, одного плеча) (например, см. ITR-21 на Фиг. 7A заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' (см., например, ITR-1 на Фиг. 3B или ITR-45 на Фиг. 7А заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' и удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. Предусматриваются любые комбинации удаления пар оснований, например, могут быть удалены 6 пар оснований в плече C-C' и 2 пары оснований в плече B-B'. В качестве иллюстративного примера на Фиг. 3B продемонстрирован пример модифицированного ITR с делецией по меньшей мере 7 пар оснований из каждого из участка C и участка C', заменой нуклеотида в петле в области между C и C', и делецией по меньшей мере одной пары оснований из каждой из областей B и B', так чтобы модифицированный ITR содержал два плеча, из которых по меньшей мере одно (например, C-C') является усеченным. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR также содержит делецию по меньшей мере одной пары оснований из каждой из областей B и B', так чтобы плечо B-B' также было усеченным по сравнению с ITR дикого типа.

[00268] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 50 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 30 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR WT. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR имеет от 2 до 20 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа.

[00269] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR не содержит каких-либо нуклеотидных делеций в RBE-содержащей части областей A или A', чтобы не мешать репликации ДНК (например, связыванию белка Rep с RBE или никированию в сайте концевого разрешения). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR, пригодный для использования по данному изобретению, имеет одну или несколько делеций в области B, B', C и/или C, как описано в данном документе.

[00270] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, содержащий симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR, содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и по меньшей мере один модифицированный ITR, выбранный из имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 3, 4, 15-47, 101-116 или 165-187.

[00271] В другом варианте реализации структура структурного элемента может быть модифицирована. Например, структурный элемент (имеет) изменение высоты стебля и/или количества нуклеотидов в петле. Например, высота стебля может составлять примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов или более, или соответствовать любому диапазону значений. В одном варианте реализации стебель может иметь высоту от примерно 5 нуклеотидов до примерно 9 нуклеотидов и функционально взаимодействует с Rep. В другом варианте реализации стебель может иметь высоту около 7 нуклеотидов и функционально взаимодействует с Rep. В другом примере петля может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00272] В другом варианте реализации количество сайтов связывания GAGY или связанных с GAGY сайтов связывания в пределах RBE или расширенного RBE может быть увеличено или уменьшено. В одном примере RBE или расширенный RBE могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более сайтов связывания GAGY или любой диапазон указанных значений. Каждый сайт связывания GAGY может независимо представлять собой точную последовательность GAGY или последовательность, аналогичную GAGY, при условии, что эта последовательность является достаточной для связывания белка Rep.

[00273] В другом варианте реализации интервал между двумя элементами (такими как, без ограничений, RBE и шпилька) может быть изменен (например, увеличен или уменьшен) для изменения функционального взаимодействия с большим белком Rep. Например, интервал может составлять примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.

[00274] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, описанный в данном документе, может включать структуру ITR, которая модифицирована относительно структуры ITR ААВ2 дикого типа, раскрытой в данном документе, но все еще сохраняет функциональную часть RBE, trs и RBE´. На Фиг. 2А и Фиг. 2B продемонстрирован один из возможных механизмов работы сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей ITR, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) для ААВ2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один ITR (дикого типа или модифицированный ITR) является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, в тех случаях, когда зкДНК-вектор содержит два модифицированных ITR, которые отличаются друг от друга или асимметричны друг относительно друга, по меньшей мере один модифицированный ITR является функциональным и по меньшей мере один модифицированный ITR является нефункциональным.

[00275] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR (например, левый или правый ITR) зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, имеет модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере. Примеры последовательностей ITR, имеющих модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере, перечислены в Таблице 2 (т.е. SEQ ID NO: 135-190, 200-233); Таблице 3 (например, SEQ ID NO: 234-263); Таблице 4 (например, SEQ ID NO: 264-293); Таблице 5 (например, SEQ ID NO: 294-318 в данном документе); Таблице 6 (например, SEQ ID NO: 319-468; и Таблицах 7-9 (например, SEQ ID NO: 101-110, 111-112, 115-134) или Таблице 10A или 10B (например, SEQ ID NO: 9, 100, 469-483, 484-499) международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00276] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, выбирают из любых или из комбинации ITR, приведенных в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10A-10B международной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00277] Дополнительные примеры модифицированных ITR для использования в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков, содержащих асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR в каждом из вышеуказанных классов, представлены в Таблицах 9A и 9B. Предсказанные вторичные структуры правых модифицированных ITR, указанных в Таблице 9A, представлены на Фиг. 7А международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., и предсказанные вторичные структуры левых модифицированных ITR, указанных в Таблице 9B, представлены на Фиг. 7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме.

[00278] В Таблице 9A и Таблице 9B представлены примеры правых и левых модифицированных ITR.

[00279] Таблица 9A: Примеры правых модифицированных ITR. Эти примеры правых модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 9А: Примеры правых модифицированных ITR Конструкт ITR Последовательность SEQ ID NO: ITR-18 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 15 ITR-19 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 16 ITR-20 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 17 ITR-21 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 18 ITR-22 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 19 ITR-23 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 20 ITR-24 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 21 ITR-25 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 22 ITR-26 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 23 ITR-27 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 24 ITR-28 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 25 ITR-29 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 26 ITR-30 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 27 ITR-31 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 28 ITR-32 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 29 ITR-49 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 30 ITR-50 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 31

[00280] ТАБЛИЦА 9B: Примеры левых модифицированных ITR. Эти примеры левых модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и комплемент RBE (RBE') GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 9B: Примеры левых модифицированных ITR ITR-33 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 32 ITR-34 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 33 ITR-35 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 34 ITR-36 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 35 ITR-37 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 36 ITR-38 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 37 ITR-39 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 38 ITR-40 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 39 ITR-41 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 40 ITR-42 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 41 ITR-43 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 42 ITR-44 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 43 ITR-45 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 44 ITR-46 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 45 ITR-47 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 46 ITR-48 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 47

[00281] В одном варианте реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе), и второй ITR ААВ, причем первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) являются асимметричными относительно друг друга, т.е. они имеют разную трехмерную пространственную конфигурацию по сравнению друг с другом. В качестве примера варианта реализации, первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может быть мутированным или модифицированным ITR или, наоборот, первый ITR может быть мутированным или модифицированным ITR, а второй ITR - ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации первый ITR и второй ITR оба представляют собой mod-ITR, но имеют разные последовательности, или имеют разные модификации и, таким образом, не являются одинаковыми модифицированными ITR и имеют разные пространственные 3D-конфигурации. Иными словами, зкДНК-вектор с асимметричными ITR содержит ITR, в которых любые изменения в одном ITR относительно WT-ITR не отображаются в другом ITR; или, альтернативно, в которых асимметричные ITR представляют собой (have a the) модифицированную асимметричную пару ITR, которые могут иметь разные последовательности и разную трехмерную форму друг относительно друга. Типичные примеры асимметричных ITR в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков и для использования при получении зкДНК-плазмиды представлены в Таблице 9А и 9В.

[00282] В альтернативном варианте реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит два симметричных mod-ITR, т.е. оба ITR имеют одинаковую последовательность, но являются обратными комплементами (инвертированными формами) друг друга. В некоторых вариантах реализации симметричная пара mod-ITR содержит, по меньшей мере, что-то одно из, или любую комбинацию делеции, вставки или замены относительно последовательности ITR дикого типа из того же серотипа ААВ. Добавления, делеции или замены в симметричных ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг к другу. Например, вставка 3 нуклеотидов в области C 5'-ITR будет отображена во вставке 3 обратно комплементарных нуклеотидов в соответствующем участке C’-области 3'-ITR. Исключительно в целях иллюстрации, если в 5'-ITR добавление представляет собой AACG, то в 3'-ITR добавлением будет CGTT в соответствующем сайте. Например, если смысловая цепь 5'-ITR представляет собой ATCGATCG с добавлением AACG между G и A, то в результате будет получена последовательность ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51). Соответствующая смысловая цепь 3'-ITR представляет собой CGATCGAT (обратный комплемент ATCGATCG) с добавлением CGTT (т.е. обратного комплемента AACG) между T и C, что приводит к последовательности CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (обратный комплемент ATCGAACGATCG) (SEQ ID NO: 51).

[00283] В альтернативных вариантах реализации, пара модифицированных ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но имеют соответствующую или одинаковую симметричную трехмерную форму. Например, один модифицированный ITR может принадлежать к одному серотипу, а другой модифицированный ITR может принадлежать к другому серотипу, но они имеют одинаковую мутацию (например, вставку, делецию или замену нуклеотида) в одной и той же области. Иными словами, только в иллюстративных целях, если 5' mod-ITR принадлежит ААВ2 и имеет делецию в области C, а 3' mod-ITR принадлежит ААВ5 и имеет соответствующую делецию в области C', то при условии, что 5' mod-ITR и 3' mod-ITR имеют одинаковую или симметричную трехмерную пространственную организацию, они будут включены для использования по данному изобретению в качестве пары модифицированных ITR.

[00284] В некоторых вариантах реализации по существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то родственный mod-ITR имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру оставшихся петель A и B-B' одинаковой формы в геометрическом пространстве со своим родственным mod-ITR. Только в качестве примера, по существу симметричные ITR могут иметь симметричную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, например, когда пару G-C модифицируют, например, в пару C-G, или наоборот, или пару A-T модифицируют в пару T-A, или наоборот. Поэтому, используя приведенный выше приведенный выше иллюстративный пример модифицированного 5'-ITR в виде ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51), и модифицированного 3'-ITR в виде CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (т.е. обратный комплемент ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51)), эти модифицированные ITR будут оставаться симметричными, если, например, 5'-ITR имеет последовательность ATCGAACCATCG (SEQ ID NO: 50), где G в добавлении модифицируют до C, и по существу симметричный 3'-ITR имеет последовательность CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49), без соответствующей модификации T в добавлении до A. В некоторых вариантах реализации такая пара модифицированных ITR является по существу симметричной, поскольку пара модифицированных ITR имеет симметричную стереохимию.

[00285] В Таблице 10 приведены примеры симметричных модифицированных пар ITR (т.е. модифицированный левый ITR и симметричный правый модифицированный ITR) для использования в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков. Выделенная жирным шрифтом (красная) часть последовательностей идентифицирует частичные последовательности ITR (т.е. последовательности петель A-A', C-C' и B-B'), также изображенные на Фиг. 31A-46B. Эти примеры модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).

Таблица 10: Типичные примеры симметричных модифицированных пар ITR в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков ЛЕВЫЙ модифицированный ITR
(модифицированный 5'-ITR) Симметричный ПРАВЫЙ модифицированный ITR
(модифицированный 3'-ITR) SEQ ID NO: 32 (ITR-33, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 15 (ITR-18, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 33 (ITR-34, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 48 (ITR-51, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 34 (ITR-35, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 16 (ITR-19, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 35 (ITR-36, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 17 (ITR-20, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 36 (ITR-37, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 18 (ITR-21, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 37 (ITR-38, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 19 (ITR-22 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 38 (ITR-39, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 20 (ITR-23, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 39 (ITR-40, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 21 (ITR-24, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 40 (ITR-41, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 22 (ITR-25 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 41 (ITR-42, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 23 (ITR-26 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 42 (ITR-43, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 24 (ITR-27 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 43 (ITR-44, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 25 (ITR-28 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 44 (ITR-45, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 26 (ITR-29, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 45 (ITR-46, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 27 (ITR-30, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 46 (ITR-47, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 28 (ITR-31, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG SEQ ID NO: 47 (ITR-48, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 29 (ITR-32 справа) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG

[00286] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, содержащий пару асимметричных ITR, может содержать ITR с модификацией, соответствующей любой из модификаций последовательностей ITR или частичных последовательностей ITR, приведенных в любой одной или нескольких из Таблиц 9A-9B в данном документе, или последовательностей, представленных на Фиг. 7A-7B международной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ, или раскрытой в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10A-10B международной заявки PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

V. Типичные примеры зкДНК-векторов

[00287] Как описано выше, данное изобретение относится к рекомбинантным экспрессионным зкДНК-векторам и зкДНК-векторам, которые кодируют антитело или слитый белок, для продуцирования антитела или слитого белка, содержащих любую из: пары асимметричных ITR, пары симметричных ITR или пары по существу симметричных ITR, как описано выше. В некоторых вариантах реализации изобретение относится к рекомбинантным зкДНК-векторам для продуцирования антител или слитых белков, имеющим фланкирующие последовательности ITR и трансген, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе, и зкДНК дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновую кислоту трансгена), расположенную между фланкирующими ITR, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты лишена кодирующих последовательностей белка вирусного капсида.

[00288] Экспрессионный зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка может представлять собой любой зкДНК-вектор, который может быть удобно подвергнут процедурам рекомбинантных ДНК, включая нуклеотидную последовательность (последовательности), как описано в данном документе, при условии, что по меньшей мере один ITR является измененным. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков по данному изобретению совместимы с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен зкДНК-вектор. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы могут быть линейными. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы могут существовать в виде внехромосомного объекта. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать элемент(ы), которые позволяют интегрировать донорную последовательность в геном клетки-хозяина. Используемые в данном документе термины «трансген» и «гетерологичная нуклеотидная последовательность» являются синонимами, и кодируют антитело или слитый белок, как описано в данном документе.

[00289] На Фиг. 1A-1G продемонстрированы схемы функциональных компонентов двух неограничивающих примеров плазмид, полезных для получения зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков. Фиг. 1А, 1В, 1D, 1F изображают конструкты зкДНК-векторов или соответствующих последовательностей зкДНК-плазмид для продуцирования антител или слитых белков. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемая кассета трансгена и второй ITR, причем первая и вторая последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемый трансген (белок или нуклеиновая кислота) и второй ITR, причем первая и вторая последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными относительно друг друга, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессируемая кассета трансгена включает, при необходимости, энхансер/промотор, одно или несколько гомологичных плеч, донорную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE, например, SEQ ID NO: 67) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, поли(А) BGH, например, SEQ ID NO: 68).

[00290] Фиг. 5 изображает гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества плазмидных конструктов с использованием способа, описанного в примерах. Получение зкДНК-вектора подтверждается характерной электрофореграммой в геле, как было описано для Фиг. 4А выше и в примерах.

А. Регуляторные элементы

[00291] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, содержащие асимметричную пару ITR или симметричную пару ITR, как определено в данном документе, могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может выступать в роли промотора для трансгена, например, антитела или слитого белка. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, для регулирования экспрессии трансгена, или "аварийный выключатель", который может убивать клетку, содержащую зкДНК-вектор, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Регуляторные элементы, включая регуляторные переключатели, которые можно использовать в данном изобретении, более подробно описаны в международной заявке PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00292] В вариантах реализации, вторая нуклеотидная последовательность включает регуляторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность гена функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность пригодна для контроля экспрессии нуклеазы в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность включает пригодную промоторную последовательность, способную направлять транскрипцию гена, функционально связанного с промоторной последовательностью, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу (нуклеазы) по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность, связанную с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей нуклеазу. В некоторых вариантах реализации предусматривается энхансерная последовательность перед промотором для повышения эффективности промотора. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность включает энхансер и промотор, причем вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, при этом интрон включает один или несколько сайтов расщепления нуклеазой, и промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.

[00293] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, полученные синтетическим путем или с использованием способа продуцирования на основе клеток, как описано в данном документе в примерах, могут дополнительно содержать конкретную комбинацию цис-регуляторных элементов, таких как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67) и поли(А) BGH (SEQ ID NO: 68). Подходящие экспрессионные кассеты для использования в экспрессионных конструктах не имеют ограничений упаковки, накладываемых вирусным капсидом.

(i). Промоторы:

[00294] Специалисту в данной области будет понятно, что промоторы, используемые в зкДНК-векторах для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, должны быть адаптированы для соответствия конкретным последовательностям, которые они стимулируют.

[00295] Экспрессионные кассеты зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков могут включать промотор, который может влиять на общие уровни экспрессии, а также на клеточную специфичность. Для экспрессии трансгена, например, экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента, они могут включать высокоактивный немедленный ранний промотор вирусного происхождения. Экспрессионные кассеты могут содержать тканеспецифичные эукариотические промоторы для ограничения экспрессии трансгена определенными типами клеток и снижения токсических эффектов и иммунных реакций, возникающих в результате нерегулируемой эктопической экспрессии. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета может содержать синтетический регуляторный элемент, такой как промотор CAG (SEQ ID NO: 72). Промотор CAG включает (i) элемент раннего энхансера цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы, и (iii) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика. Альтернативно, экспрессионная кассета может содержать промотор альфа-1-антитрипсина (AAT) (SEQ ID NO: 73 или SEQ ID NO: 74), печень-специфичный (LP1) промотор (SEQ ID NO: 75 или SEQ ID NO: 76) или промотор человеческого фактора элонгации-1 альфа (EF1a) (например, SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 78). В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета включает один или несколько конститутивных промоторов, например, ретровирусный промотор длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно, с энхансером RSV), или немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно, с энхансером CMV, например, SEQ ID NO: 79). Альтернативно, можно использовать индуцибельный промотор, нативный промотор трансгена, тканеспецифичный промотор или различные промоторы, известные в данной области.

[00296] Подходящие промоторы, в том числе описанные выше, могут быть получены из вирусов и поэтому могут называться вирусными промоторами, или они могут быть получены из любого организма, включая прокариотические или эукариотические организмы. Подходящие промоторы могут быть использованы для управления экспрессией любой РНК-полимеразой (например, pol I, pol II, pol III). Типичные промоторы включают, без ограничений, ранний промотор SV40, промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса опухоли молочной железы мыши; главный поздний промотор аденовируса (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленного раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), малый ядерный промотор U6 человека (U6, например, SEQ ID NO: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усиленный промотор U6 (например, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31 (17)), промотор H1 человека (H1) (например, SEQ ID NO: 81 или SEQ ID NO: 155), промотор CAG, промотор человеческого альфа 1-антитипсина (HAAT) (например, SEQ ID NO: 82) и т.п. В некоторых вариантах реализации эти промоторы изменены на своем нижестоящем интрон-содержащем конце для включения одного или нескольких сайтов расщепления нуклеазой. В некоторых вариантах реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазой, чужеродна промоторной ДНК.

[00297] В одном варианте реализации используемый промотор является нативным промотором гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности для соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и были охарактеризованы. Используемая область промотора может дополнительно включать одну или несколько дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеров (например, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 83), включая энхансер SV40 (SEQ ID NO: 126).

[00298] В некоторых вариантах реализации промотор также может представлять собой промотор из человеческого гена, такого как убиквитин С человека (hUbC), человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотор также может представлять собой тканеспецифичный промотор, такой как специфичный для печени промотор, такой как альфа-1-антитипсин человека (HAAT), природный или синтетический. В одном варианте реализации доставка в печень может быть достигнута с использованием эндогенного ApoE-специфического нацеливания композиции, содержащей зкДНК-вектор, на гепатоциты посредством рецептора липопротеина низкой плотности (LDL), присутствующего на поверхности гепатоцитов.

[00299] Неограничивающие примеры подходящих промоторов для использования в соответствии с данным изобретением включают промотор CAG, например, (SEQ ID NO: 72), промотор HAAT (SEQ ID NO: 82), промотор человеческого EF1-α (SEQ ID NO: 77) или фрагмент промотора EF1a (SEQ ID NO: 78), промотор IE2 (например, SEQ ID NO: 84) и промотор EF1-α крысы (SEQ ID NO: 85), промотор mEF1 (SEQ ID NO: 59) или фрагмент промотора 1E1 (SEQ ID NO: 125).

(ii). Последовательности полиаденилирования:

[00300] Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитого белка, чтобы стабилизировать мРНК, экспрессируемую из зкДНК-вектора, и для содействия в ядерном экспорте и трансляции. В одном варианте реализации зкДНК-вектор не включает последовательность полиаденилирования. В других вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка включает по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. В некоторых вариантах реализации последовательность полиаденилирования содержит примерно 43 нуклеотида, примерно 40-50 нуклеотидов, примерно 40-55 нуклеотидов, примерно 45-50 нуклеотидов, примерно 35-50 нуклеотидов, или величины, находящиеся в любом диапазоне между указанными значениями. Как изображено на Фиг. 10A-10G, последовательность полиаденилирования может быть расположена со стороны 3' от трансгена, кодирующего антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, который кодирует полный IgG или полное антитело, может содержать последовательность IRES (внутренний сайт входа в рибосому) (SEQ ID NO: 190), причем последовательность IRES расположена, например, со стороны 3' от последовательности полиаденилирования, так чтобы второй трансген (например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент), расположенный со стороны 3' от первого трансгена, транслировался и экспрессировался тем же зкДНК-вектором, чтобы указанный зкДНК-вектор мог экспрессировать полное антитело (см., например, Фиг. 10B).

[00301] Кассеты экспрессии могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области, или ее вариант, такую как встречающаяся в природе последовательность, выделенная из бычьей BGHpA (например, SEQ ID NO: 68) или вирусной SV40pA (например, SEQ ID NO: 86), или синтетическая последовательность (например, SEQ ID NO: 87). Некоторые экспрессионной кассеты также могут включать последовательность вышележащего энхансера (USE) позднего поли(А) сигнала SV40. В некоторых вариантах реализации USE можно использовать в комбинации с SV40pA или гетерологичным поли-A-сигналом.

[00302] Кассеты экспрессии могут также включать посттранскрипционный элемент для увеличения экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации для увеличения экспрессии трансгена используется посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE) (например, SEQ ID NO: 67). Можно использовать другие элементы посттранскрипционного процессинга, такие как посттранскрипционный элемент из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита В (HBV). С трансгенами могут быть связаны секреторные последовательности, например, последовательности VH-02 и VK-A26, например, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89.

(iii). Последовательности ядерной локализации

[00303] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах реализации одна или несколько NLS расположены на амино-конце или рядом с ним, на карбокси-конце или рядом с ним, или в их комбинации (например, одна или несколько NLS на амино-конце и/или одна или несколько NLS на карбокси-конце). В случае присутствия более чем одной NLS, каждая из них может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS будет присутствовать в более чем одной копии и/или в сочетании с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. Неограничивающие примеры NLS приведены в Таблице 11.

[00304]

Таблица 11: Сигналы ядерной локализации ИСТОЧНИК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO. большой Т-антиген вируса SV40 PKKKRKV (кодируется последовательностью CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG; SEQ ID NO: 91) 90 нуклеоплазмин KRPAATKKAGQAKKKK 92 c-myc PAAKRVKLD 93 RQRRNELKRSP 94 hRNPA1 M9 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY 95 домен IBB импортина-альфа RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV 96 белок Т миомы VSRKRPRP 97 PPKKARED 98 человеческий р53 PQPKKKPL 99 мышиный c-abl IV SALIKKKKKMAP 100 NS1 вируса гриппа DRLRR 117 PKQKKRK 118 антиген вируса гепатита дельта RKLKKKIKKL 119 белок Mx1 мыши REKKKFLKRR 120 человеческая полимераза поли(АДФ-рибозы) KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 121 глюкокортикоид (человеческих) рецепторов стероидных гормонов RKCLQAGMNLEARKTKK 122

B. Дополнительные компоненты зкДНК-векторов

[00305] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков по данному изобретению могут содержать нуклеотиды, которые кодируют другие компоненты для экспрессии генов. Например, для выбора специфических событий нацеливания на гены, защитная shRNA может быть встроена в микроРНК и вставлена в рекомбинантный зкДНК-вектор, предназначенный для интеграции сайт-специфическим образом в высокоактивный локус, такой как локус альбумина. Такие варианты реализации могут обеспечить систему для селекции in vivo и экспансии генно-модифицированных гепатоцитов на любом генетическом фоне, например, описанную в Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016. зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют отбирать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные или подобные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию к ауксотрофам, NeoR и т.п. В некоторых вариантах реализации в донорные последовательности включены маркеры позитивной селекции, такие как NeoR. Маркеры негативной селекции могут быть включены после донорной последовательности, например, последовательность нуклеиновой кислоты HSV-tk, кодирующая маркер негативной селекции, может быть включена в конструкт нуклеиновой кислоты после донорной последовательности.

C. Регуляторные переключатели

[00306] Молекулярный регуляторный переключатель представляет собой переключатель, который генерирует измеримое изменение состояния в ответ на сигнал. Такие регуляторные переключатели могут быть эффективно скомбинированы с зкДНК-векторами для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, для контроля выхода экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента из зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит регуляторный переключатель, который служит для тонкой настройки экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, он может служить для обеспечения функции биосдерживания зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации переключатель представляет собой двухпозиционный (“ON/OFF”) переключатель, который предназначен для запуска или остановки (т.е. прекращения) экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента в зкДНК-векторе контролируемым и регулируемым образом. В некоторых вариантах реализации переключатель может включать «аварийный выключатель», который может давать указание клетке, содержащей зкДНК-вектор, переходить к запрограммированной клеточной смерти после активации переключателя. Типичные примеры регуляторных переключателей, предусматриваемых для использования в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков, могут быть использованы для регуляции экспрессии трансгена и более подробно описаны в международной заявке PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

(i) Бинарные регуляторные переключатели

[00307] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка содержит регуляторный переключатель, который может служить для контролируемой модуляции экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, экспрессионная кассета, расположенная между ITR зкДНК-вектора, может дополнительно содержать регуляторную область, например, промотор, цис-элемент, репрессор, энхансер и т.д., которая функционально связана с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, причем указанная регуляторная область регулируется одним или несколькими кофакторами или экзогенными агентами. Только в качестве примера, регуляторные области можно модулировать с помощью низкомолекулярных переключателей или индуцибельных или репрессируемых промоторов. Неограничивающими примерами индуцибельных промоторов являются индуцируемые гормонами или индуцируемые металлом промоторы. Другие типичные индуцибельные промоторы/энхансерные элементы включают, без ограничений, промотор, индуцируемый RU486, индуцируемый экдизоном промотор, индуцируемый рапамицином промотор и металлотионеиновый промотор.

(ii) Регуляторные переключатели на основе малых молекул

[00308] Различные регуляторные переключатели на основе малых молекул известны в данной области и могут быть скомбинированы с зкДНК-векторами для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, для получения зкДНК-вектора, контролируемого регуляторным переключателем. В некоторых вариантах регуляторный переключатель может быть выбран из чего-либо одного или комбинации следующего: пара ортогональный лиганд/ядерный рецептор, например, вариант ретиноидного рецептора/LG335 и GRQCIMFI, вместе с искусственным промотором, контролирующим экспрессию функционально связанного трансгена, как раскрыто в Taylor et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; рекомбинантные рецепторы стероидов, например, модифицированный рецептор прогестерона с усеченным С-концом, который не может связывать прогестерон, но связывает RU486 (мифепристон) (патент США № 5364791); рецептор экдизона дрозофилы (Drosophila) и его экдистероидные лиганды (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517); или переключатель, контролируемый антибиотиком триметопримом (TMP), как описано в Sando R 3^rd; Nat Methods, 2013, 10(11):1085-8. В некоторых вариантах регуляторный переключатель, предназначенный для контроля трансгена, или экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой переключатель активации пролекарства, такой как раскрытый в патентах США №№ 8771679 и 6339070.

(iii) Регуляторные переключатели с «паролем»

[00309] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель может представлять собой «переключатель с паролем» (passcode switch) или «контур с паролем». Переключатели с паролем позволяют обеспечить тонкую настройку контроля экспрессии трансгена из зкДНК-вектора при возникновении специфических условий, т.е. комбинации условий, наличие которых необходимо для осуществления экспрессии и/или репрессии трансгена. Например, для осуществления экспрессии трансгена необходимо наличие по меньшей мере условий A и B. Регуляторный переключатель с паролем может контролировать наличие любого числа условий, например, по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 или более условий, необходимых для протекания экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации должны быть выполнены по меньшей мере 2 условия (например, условия A, B), а в некоторых вариантах реализации должны быть выполнены по меньшей мере 3 условия (например, A, B и C, или A, B и D). Только в качестве примера, для осуществления экспрессии гена из зкДНК, содержащей регуляторный переключатель с паролем «ABC», должны присутствовать условия A, B и C. Условия A, B и C могут быть следующими; условие A представляет собой наличие состояния или заболевания, условие B представляет собой гормональный ответ, и условие C представляет собой ответ на экспрессию трансгена. Например, если трансген редактирует дефектный ген EPO, то условие A - это наличие хронической болезни почек (CKD), условие B выполняется при наличии у субъекта гипоксических состояний в почках, условие C заключается в нарушении рекрутинга эритропоэтин-продуцирующих клеток (EPC) в почках; или, альтернативно, в нарушении активации HIF-2. При повышении уровней кислорода или достижении требуемого уровня EPO трансген снова отключается до момента выполнения 3 условий, которые его опять включат.

[00310] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель с паролем или «контур с паролем», предусматриваемый для применения в зкДНК-векторе, содержит гибридные факторы транскрипции (TF) для расширения диапазона и уровня сложности сигналов окружающей среды, используемых для определения условий биосдержания. В отличие от блокирующего выключателя, который инициирует клеточную смерть при наличии заранее определенного условия, «контур с паролем» позволяет обеспечить выживание клеток или экспрессию трансгена при наличии определенного «пароля», и может быть легко перепрограммирован, что позволяет обеспечить экспрессию трансгена и/или выживание клеток только при наличии заранее заданного условия окружающей среды или пароля.

[00311] Любые и все комбинации регуляторных переключателей, раскрытых в данном документе, например, низкомолекулярные переключатели, переключатели на основе нуклеиновых кислот, гибридные переключатели на основе малых молекул и нуклеиновых кислот, посттранскрипционные регуляторные переключатели трансгенов, посттрансляционная регуляция, контролируемые излучением переключатели, опосредуемые гипоксией переключатели и другие регуляторные переключатели, известные специалистам в данной области техники, раскрытые в данном документе, могут применяться в регуляторном переключателе с паролем, как раскрыто в данном документе. Регуляяторные переключатели, предусматриваемые для применения, также описаны в обзорной статье Kis et al., JR Soc Interface, 12: 20141000 (2015) и обобщены в Таблице 1 статьи Kis. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для применения в системе с паролем может быть выбран из любых переключателей, или их комбинаций, приведенных в Таблице 11 международной патентной заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

(iv). Регуляторные переключатели на основе нуклеиновых кислот для контроля экспрессии трансгена

[00312] В некоторых вариантах реализации, регуляторный переключатель для контроля антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемого зкДНК, основан на механизме контроля на основе нуклеиновой кислоты. Типичные примеры механизмов контроля на основе нуклеиновых кислот известны в данной области и предусматриваются для использования. Например, такие механизмы включают рибопереключатели, такие как раскрытые, например, в US 2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, патенте США 9222093 и заявке на европейский патент EP288071, а также в обзоре Villa JK et al. Microbiol Spectr., 2018 May;6(3). Также включены чувствительные к метаболитам транскрипционные биосенсоры, такие как раскрытые в WO2018/075486 и WO2017/147585. Другие известные в данной области механизмы, предусмотренные для применения, включают сайленсинг указанного трансгена с помощью миРНК или молекулы РНК-интерференции (RNAi) (например, зрелой микроРНК (miR), мшРНК (shRNA)). Например, зкДНК-вектор может содержать регуляторный переключатель, кодирующий молекулу РНКи, которая комплементарна части трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором. При экспрессии такой РНКи, даже при экспрессии трансгена зкДНК-вектором, происходит его сайленсинг за счет действия комплементарной молекулы РНК-интерференции, а при отсутствии экспрессии РНКи, если указанный трансген экспрессируется зкДНК-вектором, сайленсинг указанного трансгена за счет РНК-интерференции не происходит.

[00313] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой тканеспецифический самоинактивирующийся регуляторный переключатель, например, как раскрыто в US2002/0022018, при этом регуляторный переключатель целенаправленно выключает экспрессию трансгена в сайте, где экспрессия трансгена может, напротив, быть неблагоприятной. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель представляет собой рекомбиназную обратимую систему генной экспрессии, например, как раскрыто в US2014/0127162 и патенте США 8324436.

(v). Посттранскрипционные и посттрансляционные регуляторные переключатели.

[00314] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для контроля антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой систему посттранскрипционной модификации. Например, таким регуляторным переключателем может быть аптазимовый рибопереключатель, который чувствителен к тетрациклину или теофиллину, как раскрыто в US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, патенте EP 2707487 и Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526–534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858. В некоторых вариантах реализации предусматривается, что специалист в данной области техники может кодировать как трансген, так и ингибирующую миРНК, которая содержит чувствительный к лиганду (выключающий (OFF-switch)) аптамер, с получением в итоге лиганд-чувствительного включающего переключателя (ON-switch).

(vi). Другие примеры регуляторных переключателей

[00315] Любой известный регуляторный переключатель может быть использован в зкДНК-векторе для контроля экспрессии гена антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемого зкДНК-вектором, в том числе инициируемый изменениями окружающей среды. Дополнительные примеры включают, без ограничений; метод BOC согласно Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); расширение генетического кода и нефизиологическую аминокислоту; переключатели, контролируемые излучением или управляемые ультразвуком (см., например, Scott S. et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7 (13): 1121-5; патенты США 5612318; 5571797; 5770581; 5817636; WO1999/025385A1. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель управляется имплантируемой системой, например, как раскрыто в патенте США 7840263; US2007/0190028A1, в которых экспрессия гена контролируется одной или несколькими формами энергии, включая электромагнитную энергию, которая активирует промоторы, функционально связанные с трансгеном в зкДНК-векторе.

[00316] В некоторых вариантах регуляторный переключатель, предназначенный для использования в зкДНК-векторе, представляет собой опосредуемый гипоксией или стресс-активируемый переключатель, например, такой, как описано в WO1999060142A2, патентах США 5834306; 6218179; 6709858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, а также элементы FROG, TOAD и NRSE и условно индуцибельные элементы сайленсинга, в том числе элементы ответа на гипоксию (HRE), элементы воспалительного ответа (IRE) и активируемые сдвиговым напряжением элементы (SSAE), например, как раскрыто в патенте США 9394526. Такой вариант реализации подходит для включения экспрессии указанного трансгена из зкДНК-вектора после ишемии или в ишемических тканях и/или опухолях.

(iv). «Аварийные выключатели»

[00317] Другие варианты реализации, описанные в данном документе, относятся к зкДНК-вектору для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, содержащему «аварийный выключатель». «Аварийный выключатель», как описано в данном документе, позволяет убить клетку, содержащую зкДНК-вектор, или обеспечить ее переход к запрограммированной гибели в качестве способа окончательного удаления введенного зкДНК-вектора из системы субъекта. Специалисту в данной области должно быть понятно, что использование «аварийных выключателей» в зкДНК-векторах для продуцирования антител или слитых белков будет обычно связано с нацеливанием зкДНК-вектора на ограниченное число клеток, потеря которых является приемлемой для субъекта, или на тип клеток, апоптоз которых желателен (например, на раковые клетки). Во всех аспектах, раскрытый в данном документе ««аварийный выключатель» предназначен для обеспечения быстрого и надежного уничтожения клетки, содержащей зкДНК-вектор, в отсутствие входного сигнала выживания или другого определенного состояния. Другими словами, «аварийный выключатель», кодируемый зкДНК-вектором для продуцирования антител или слитых белков, описанным в данном документе, может ограничивать выживаемость клетки, содержащей зкДНК-вектор, окружающей средой, определяемой специфическими входными сигналами. Такие «аварийные выключатели» служат для обеспечения функции биологического биосдерживания при необходимости удаления у субъекта зкДНК-вектора, экспрессирующего антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или для обеспечения отсутствия экспрессии кодируемого антитела или антигенсвязывающего фрагмента.

[00318] Предусматривается использование в зкДНК-векторе для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, других «аварийных выключателей», известных специалисту в данной области, например, как раскрыто в US 2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568, а также «аварийных выключателей», раскрытых в Jusiak et al., Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56; Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9; Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319; and in Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11.

[00319] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка может содержать конструкт нуклеиновой кислоты «аварийного выключателя», который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую эффекторный токсин или репортерный белок, причем экспрессия эффекторного токсина (например, белка смерти) или репортерного белка контролируется предварительно заданным условием. Например, предварительно заданным условием может быть присутствие агента окружающей среды, такого как, например, экзогенный агент, без которого клетка по умолчанию будет экспрессировать эффекторный токсин (например, белок смерти) и погибнет. В альтернативных вариантах реализации предварительно заданным условием является присутствие двух или более агентов окружающей среды, например, клетка будет выживать только при подаче двух или более необходимых экзогенных агентов, и без какого-либо из них клетка, содержащая зкДНК-вектор, погибнет.

[00320] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка модифицируют, чтобы включить «аварийный выключатель» для разрушения клеток, содержащих зкДНК-вектор, для эффективного прекращения in vivo экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором (например, полноразмерным антителом, Fab, одноцепочечным антителом (scAb)). В частности, зкДНК-вектор дополнительно генетически сконструирован для экспрессии белка-переключателя, который не функционирует в клетках млекопитающих в нормальных физиологических условиях. Клетки, экспрессирующие белок-переключатель, будут разрушаться только после введения лекарственного средства или воздействия условия внешней среды, специфически нацеленных на этот белок-переключатель, тем самым прекращая экспрессию терапевтического белка или пептида. Например, сообщалось, что клетки, экспрессирующие HSV-тимидинкиназу, могут погибать при введении лекарственных средств, таких как ганцикловир и цитозиндезаминаза. См., например, Dey and Evans, Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), в: Targets in Gene Therapy, под ред. You (2011); и Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать «аварийный выключатель» миРНК, называемый DISE (смерть, вызываемая элиминацией гена выживания) (Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658. Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo).

VI. Подробное описание способа получения зкДНК-вектора

А. Получение в целом

[00321] Определенные способы получения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, содержащего асимметричную пару ITR или симметричную пару ITR, как определено в данном документе, описаны в разделе IV международной заявки PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть получен с использованием клеток насекомых, как описано в данном документе. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть получен синтетическим путем и, в некоторых вариантах реализации, бесклеточным способом, как описано в международной заявке PCT/US19/14122, поданной 18 января 2019 г., которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

[00322] Как описано в данном документе, в одном варианте реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков может быть получен, например, с помощью процесса, включающего стадии: а) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих полинуклеотидную матрицу экспрессионного конструктаа (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая лишена кодирующих последовательностей вирусного капсида, в присутствии белка Rep в условиях, обеспечивающих эффективность, и в течение времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, причем клетки-хозяева не содержат кодирующие последовательности вирусного капсида; и b) сбор и выделение зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако, вирусные частицы (например, вирионы ААВ) не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, такие как накладываемые естественным образом в ААВ или других вирусных векторах.

[00323] Присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, можно подтвердить путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, рестрикционным ферментом, имеющим единственный сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа материала расщепленной ДНК на неденатурирующем геле для подтверждения наличия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК.

[00324] В еще одном аспекте, данное изобретение предусматривает использование линий клеток-хозяев, имеющих стабильно интегрированную в собственный геном матрицу экспрессионного полинуклеотидного ДНК-вектора (матрицу зкДНК) при получении невирусного ДНК-вектора, например, как описано в Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. Предпочтительно, Rep добавляют к клеткам-хозяевам при множественности заражения (MOI) около 3. Когда клеточная линия хозяина является клеточной линией млекопитающего, например, клетками HEK293, клеточные линии могут иметь стабильно интегрированную матрицу полинуклеотидного вектора, и второй вектор, такой как вирус герпеса, может использоваться для введения в клетки белка Rep, что позволяет вырезать и амплифицировать зкДНК в присутствии Rep и вируса-хелпера.

[00325] В одном варианте реализации клетки-хозяева, используемые для получения зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, представляют собой клетки насекомых, и бакуловирус используется для доставки как полинуклеотида, кодирующего белок Rep, так и матрицы экспрессионного конструкта невирусного полинуклеотидного ДНК-вектора для зкДНК, например, как описано на Фиг. 4А-4С и в Примере 1. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин модифицирована для экспрессии белка Rep.

[00326] зкДНК-вектор затем собирают и выделяют из клеток-хозяев. Время сбора и выделения из клеток зкДНК-векторов, описанных в данном документе, может быть выбрано и оптимизировано для достижения высокопроизводительного продуцирования зкДНК-векторов. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. В одном варианте реализации клетки выращивают в достаточных условиях и собирают через период времени, достаточный для продуцирования зкДНК-векторов после инфицирования бакуловирусом, но до начала гибели большей части клеток из-за бакуловирусной токсичности. ДНК-векторы могут быть выделены с использованием наборов для очистки плазмид, таких как наборы Qiagen Endo-Free Plasmid. Другие методы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для ДНК-векторов. В общем, могут применяться любые способы очистки нуклеиновых кислот.

[00327] ДНК-векторы могут быть очищены любыми способами, известными специалистам в данной области для очистки ДНК. В одном варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде молекул ДНК. В другом варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде экзосом или микрочастиц.

[00328] Присутствие зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков можно подтвердить путем расщепления ДНК-вектора, выделенного из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа материала расщепленной и нерасщепленной ДНК с использованием гель-электрофореза для подтверждения наличия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и прерывистой ДНК. Фиг. 4C и Фиг. 4D демонстрируют один вариант идентификации присутствия зкДНК-векторов с замкнутыми концами, продуцируемых способами по данному изобретению.

B. зкДНК-плазмида

[00329] зкДНК-плазмида представляет собой плазмиду, используемую для последующего получения зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков. В некоторых вариантах реализации зкДНК-плазмида может быть сконструирована с использованием известных методик для обеспечения по меньшей мере следующих функционально связанных компонентов, в направлении транскрипции: (1) модифицированная последовательность 5'-ITR; (2) экспрессионная кассета, содержащая цис-регуляторный элемент, например, промотор, индуцибельный промотор, регуляторный переключатель, энхансеры и т.п.; и (3) модифицированная последовательность 3'-ITR, причем последовательность 3'-ITR является симметричной относительно последовательности 5'-ITR. В некоторых вариантах реализации экспрессионная кассета, фланкируемая ITR, содержит сайт клонирования для введения экзогенной последовательности. Экспрессионная кассета заменяет кодирующие области rep и cap геномов ААВ.

[00330] В одном аспекте зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка получают из плазмиды, называемой в данном документе «зкДНК-плазмида», кодирующей, в указанном порядке: первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (ААВ), экспрессионную кассету, содержащую трансген и мутированный или модифицированный ITR ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный ITR ААВ, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3') модифицированный ITR ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ, и 5'- и 3'-ITR симметричны относительно друг друга. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный ITR ААВ, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3') мутированный или модифицированный ITR ААВ, причем указанная зкДНК-плазмида лишена кодирующих последовательностей капсидного белка ААВ, и модифицированные 5'- и 3'-ITR имеют одинаковые модификации (т.е. они являются обратно комплементарными или симметричными относительно друг друга).

[00331] В дополнительном варианте реализации система зкДНК-плазмиды лишена кодирующих последовательностей вирусного капсидного белка (т.е. она лишена генов капсида ААВ, а также капсидных генов других вирусов). Кроме того, в конкретном варианте реализации, зкДНК-плазмида также лишена кодирующих последовательностей белка Rep ААВ. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации зкДНК-плазмида лишена функциональных генов cap ААВ и rep ААВ (GG-3' для ААВ2) плюс вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей сформировать шпильку.

[00332] зкДНК-плазмида по данному изобретению может быть получена с использованием природных нуклеотидных последовательностей геномов любых серотипов ААВ, хорошо известных в данной области. В одном варианте реализации, основную цепь зкДНК-плазмиды получают из генома ААВ1, ААВ2, ААВ3, ААВ4, ААВ5, ААВ 5, ААВ7, ААВ8, ААВ9, ААВ10, ААВ 11, ААВ12, ААВrh8, ААВrh10, ААВ-DJ и ААВ-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses (Индекс вирусов Springer), доступный по URL-адресу, поддерживаемому Springer (по веб-адресу www: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.) (примечание - ссылки на URL или базу данных относятся к содержанию URL или базы данных на действительную дату подачи данной заявки). В конкретном варианте реализации остов зкДНК-плазмиды получают из генома ААВ2. В другом конкретном варианте реализации, остов зкДНК-плазмиды представляет собой синтетический остов, генетически сконструированный с включением в него 5'- и 3'-ITR, полученных из одного из указанных геномов ААВ.

[00333] зкДНК-плазмида может, необязательно, включать селектируемый или селекционный маркер для использования при создании линии клеток, продуцирующих зкДНК-вектор. В одном варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен после (т.е. со стороны 3') последовательности 3'-ITR. В другом варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен перед (т.е. со стороны 5') последовательности 5'-ITR. Подходящие селекционные маркеры включают, например, маркеры, придающие лекарственную устойчивость. Селекционными маркерами могут быть, например, ген устойчивости к бластицидину S, канамицину, генетицину и т.п. В предпочтительном варианте реализации селекционный маркер лекарственного средства представляет собой ген устойчивости к бластицидину S.

[00334] Типичный зкДНК-вектор (например, rAAV0) для продуцирования антител или слитых белков получают из плазмиды rAAV. Способ получения rAAV-вектора может включать: (a) обеспечение клетки-хозяина плазмидой rAAV, как описано выше, причем и клетка-хозяин, и плазмида лишены генов, кодирующих капсидный белок, (b) культивирование клетки-хозяина в условиях, позволяющих получить геном зкДНК, и (c) сбор клеток и выделение генома ААВ, полученного из указанных клеток.

C. Пример способа получения зкДНК-векторов из зкДНК-плазмид

[00335] В данном документе также предлагаются способы получения безкапсидных зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, в частности, способ с достаточно высоким выходом для получения достаточного количества вектора для экспериментов in vivo.

[00336] В некоторых вариантах реализации способ получения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка включает стадии: (1) введения конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего экспрессионную кассету и две симметричные последовательности ITR, в клетку-хозяина (например, клетки Sf9), (2) необязательно, установления клональной клеточной линии, например, с использованием селекционного маркера, присутствующего на плазмиде, (3) введения гена, кодирующего Rep (путем трансфекции или инфицирования бакуловирусом, несущим указанный ген), в указанные клетки насекомого, и (4) сбора клеток и очистки зкДНК-вектора. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий экспрессионную кассету и две последовательности ITR, описанный выше для получения зкДНК-вектора, может иметь форму зкДНК-плазмиды или бакмиды или бакуловируса, полученных с помощью зкДНК-плазмиды, как описано ниже. Конструкт нуклеиновой кислоты может быть введен в клетку-хозяина путем трансфекции, вирусной трансдукции, стабильной интеграции или другими способами, известными в данной области.

D. Клеточные линии:

[00337] Линии клеток-хозяев, используемые для получения зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, могут включать линии клеток насекомых, полученные от кукурузной лиственной совки (Spodoptera frugiperda), такие как клетки Sf9, Sf21, или металловидки капустной (Trichoplusia ni), или другие линии клеток беспозвоночных, позвоночных, или другие линии эукариотических клеток, включая клетки млекопитающих. Также могут быть использованы другие клеточные линии, известные специалисту в данной области, такие как HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, моноциты, а также зрелые и незрелые дендритные клетки. Линии клеток-хозяев могут быть трансфицированы для стабильной экспрессии зкДНК-плазмиды для продуцирования зкДНК-вектора с высоким выходом.

[00338] зкДНК-плазмиды могут быть введены в клетки Sf9 путем транзиентной трансфекции с использованием реагентов (например, липосомальных, фосфата кальция) или физических средств (например, электропорации), известных в данной области. Альтернативно, могут быть созданы стабильные клеточные линии Sf9 с зкДНК-плазмидой, стабильно интегрированной в геномах. Такие стабильные клеточные линии могут быть созданы путем включения селекционного маркера в зкДНК-плазмиду, как описано выше. Если зкДНК-плазмида, используемая для трансфекции клеточной линии, включает селекционный маркер, такой как антибиотик, то клетки, трансфицированные такой зкДНК-плазмидой и имеющие интегрированную в их геном ДНК зкДНК-плазмиды, могут быть подвергнуты селекции путем добавления антибиотика в среду для роста клеток. Устойчивые клоны клеток затем могут быть выделены методами клонального разведения или переноса колоний и размножены.

E. Выделение и очистка зкДНК-векторов:

[00339] Примеры способа получения и выделения зкДНК-векторов описаны на Фиг. 4А-4Е и в примерах конкретного выполнения, приведенных ниже. зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, описанные в данном документе, могут быть получены из клетки-продуцента, экспрессирующей белок (белки) Rep ААВ, дополнительно трансформированной зкДНК-плазмидой, зкДНК-бакмидой или зкДНК-бакуловирусом. Плазмиды, пригодные для получения зкДНК-векторов, включают плазмиды, кодирующие тяжелую цепь антитела и/или легкую цепь антитела, или плазмиды, кодирующие один или несколько (moe) белков REP. Типичный пример зкДНК-плазмиды продемонстрирован на Фиг. 6A, при этом трансген, кодирующий тяжелую цепь (HC) адуканумаба, и трансген, кодирующий легкую цепь (LC) адуканумаба, можно заменить последовательностями нуклеиновых кислот с тяжелой цепью и/или легкой цепью антитела или слитого белка, представляющего интерес, например, см. Таблицы 1-5.

[00340] В одном аспекте полинуклеотид кодирует белок Rep ААВ (Rep 78 или 68), доставляемый в клетку-продуцент в плазмиде (Rep-плазмиде), бакмиде (Rep-бакмиде) или бакуловирусе (Rep-бакуловирусе). Rep-плазмида, Rep-бакмида и Rep-бакуловирус могут быть получены способами, описанными выше.

[00341] Способы получения зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков описаны в данном документе. Экспрессионные конструкты, используемые для получения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, могут представлять собой плазмиду (например, зкДНК-плазмиды), бакмиду (например, зкДНК-бакмиду) и/или бакуловирус (например, зкДНК-бакуловирус). Только в качестве примера, зкДНК-вектор может быть получен из клеток, коинфицированных зкДНК-бакуловирусом и Rep-бакуловирусом. Белки Rep, продуцируемые из Rep-бакуловируса, могут реплицировать зкДНК-бакуловирус для получения зкДНК-векторов. Альтернативно, зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков могут быть получены из клеток, стабильно трансфицированных конструктом, содержащим последовательность, кодирующую белок Rep ААВ (Rep78/52), доставляемым в Rep-плазмидах, Rep-бакмидах или Rep-бакуловирусе. зкДНК-бакуловирус может быть транзиентно трансфицирован в клетки, реплицироваться белком Rep и продуцировать зкДНК-векторы.

[00342] Бакмида (например, зкДНК-бакмида) может быть трансфицирована в пермиссивные клетки насекомых, такие как клетки Sf9, Sf21, клетки Tni (Trichoplusia ni), клетки High Five, и генерировать зкДНК-бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирус, включающий последовательности, содержащие симметричные ITR и экспрессионную кассету. Клетки насекомых могут быть снова инфицированы зкДНК-бакуловирусом для получения следующего поколения рекомбинантного бакуловируса. Необязательно, указанная стадия может быть повторена один или несколько раз для получения рекомбинантного бакуловируса в большем количестве.

[00343] Время сбора и выделения из клеток зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть выбрано и оптимизировано таким образом, чтобы обеспечить получение зкДНК-векторов с высоким выходом. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. Обычно клетки можно собирать через период времени после инфекции бакуловирусом, достаточный для продуцирования зкДНК-векторов (например, зкДНК-векторов), но до начала гибели большинства клеток из-за вирусной токсичности. зкДНК-векторы могут быть выделены из клеток Sf9 с использованием наборов для очистки плазмид, таких как наборы Qiagen ENDO-FREE PLASMID®. Другие методы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для зкДНК-векторов. Обычно могут быть использованы любые известные в данной области способы очистки нуклеиновых кислот, а также коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.

[00344] Альтернативно, очистка может быть осуществлена путем проведения процесса щелочного лизиса клеточного осадка, центрифугирования полученного лизата и проведения хроматографического разделения. В качестве одного неограничивающего примера, процесс может быть проведен путем загрузки супернатанта на ионообменную колонку (например, SARTOBIND Q®), которая удерживает нуклеиновые кислоты, и затем элюирования (например, 1,2 М раствором NaCl) и проведения дополнительной хроматографической очистки на колонке для гель-фильтрации (например, 6 Fast Flow GE). Затем извлекают бескапсидный вектор ААВ, например, путем осаждения.

[00345] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков также могут быть очищены в виде экзосом или микрочастиц. В данной области техники известно, что многие типы клеток высвобождают не только растворимые белки, но также и грузы сложных белков/нуклеиновых кислот в результате шеддинга мембранных микровезикул (Cocucci et al., 2009; EP 10306226.1). Такие везикулы включают микровезикулы (также называемые микрочастицами) и экзосомы (также называемые нановезикулами), содержащие, в качестве груза, белки и РНК. Микровезикулы образуются при прямом почковании плазматической мембраны, а экзосомы высвобождаются во внеклеточную среду при слиянии мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной. Таким образом, микровезикулы и/или экзосомы, содержащие зкДНК-вектор, могут быть выделены из клеток, трансдуцированных с помощью зкДНК-плазмиды или бакмиды или бакуловируса, сгенерированных с помощью зкДНК-плазмиды.

[00346] Микровезикулы могут быть выделены путем проведения фильтрации или ультрацентрифугирования культуральной среды при 20000 x g, и экзосом - при 100000 x g. Оптимальная продолжительность ультрацентрифугирования может быть определена экспериментально и будет зависеть от конкретного типа клеток, выделяющих везикулы. Предпочтительно, культуральную среду сначала очищают низкоскоростным центрифугированием (например, при 2000 x g в течение 5-20 минут) и подвергают концентрированию на центрифуге с использованием, например, центрифужной колонки AMICON® (Millipore, Уотфорд, Великобритания). Микровезикулы и экзосомы могут быть дополнительно очищены методами FACS (сортировка клеток с активацией флуоресценции) или MACS (система магнитной сортировки клеток) с использованием специфических антител, которые распознают специфические поверхностные антигены, присутствующие на микровезикулах и экзосомах. Другие способы очистки микровезикул и экзосом включают, без ограничений, иммунопреципитацию, аффинную хроматографию, фильтрацию и магнитные шарики, покрытые специфическими антителами или аптамерами. После очистки везикулы промывают, например, забуференным фосфатом солевым раствором. Одним из преимуществ использования микровезикул или экзосом для доставки содержащих зкДНК везикул является то, что такие везикулы могут быть нацелены на клетки различных типов путем включения в их мембраны белков, распознаваемых специфическими рецепторами на соответствующих типах клеток. (См. также EP 10306226).

[00347] Другой аспект изобретения, раскрытого в данном документе, относится к способам очистки зкДНК-векторов от линий клеток-хозяев, имеющих стабильно интегрированный в свой геном зкДНК-конструкт. В одном варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде молекул ДНК. В другом варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде экзосом или микрочастиц.

[00348] Фиг. 5 международной заявки PCT/US18/49996 демонстрирует гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества зкДНК-плазмидных конструктов с использованием способа, описанного в примерах. зкДНК подтверждается характерным рисунком полос в геле, как описано со ссылкой на Фиг. 4D в примерах.

VII. Фармацевтические композиции

[00349] В другом аспекте предусматриваются фармацевтические композиции. Фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

[00350] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Например, зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для желаемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, пригодной для обеспечения высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций, содержащие зкДНК-вектор, могут быть приготовлены путем включения состава зкДНК-вектора в необходимом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием, для доставки трансгена в виде нуклеиновой кислоты в клетки реципиента, приводящей к терапевтической экспрессии трансгена или донорной последовательности в нем. Композиция может также включать фармацевтически приемлемый носитель.

[00351] Фармацевтически активные композиции, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, могут быть составлены для доставки трансгена для различных целей в клетку, например, в клетки субъекта.

[00352] Фармацевтические композиции терапевтического назначения, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, пригодной для обеспечения высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.

[00353] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть включен в фармацевтическую композицию, пригодную для местного, системного, интраамниотического, интратекального, внутричерепного, внутриартериального, внутривенного, внутрилимфатического, внутрибрюшинного, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, внутрисердечного, внутрипеченочного, внутрипочечного, внутримозгового), интратекального, внутрипузырный, конъюнктивального (например, экстраорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хориоидального, субхориоидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального введения (например, перорального, ректального, назального). Также предусматриваются пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточная инъекция, такая как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция.

[00354] В некоторых аспектах способы, предусматриваемые в данном документе, включают доставку одного или нескольких зкДНК-векторов для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в клетку-хозяина. В данном документе также предложены клетки, полученные такими способами, и организмы (такие как животные, растения или грибы), содержащие такие клетки или полученные из них. Способы доставки нуклеиновых кислот могут включать липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, «голую» ДНК и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патентах США №№ 5049386, 4946787; и 4897355), и реагенты для липофекции продаются коммерчески (например, трансфектам (Transfectam™) и липофектин (Lipofectin™)). Доставка может осуществляться в клетки (например, введение in vitro или ex vivo ) или в ткани-мишени (например, введение in vivo).

[00355] В данной области техники известны различные методы и способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Например, нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК для продуцирования антител или слитых белков, могут быть приготовлены в виде композиций липидных наночастиц (ЛНЧ), липидоидов, липосом, липидных наночастиц, липоплексов или наночастиц типа ядро-оболочка. Как правило, ЛНЧ состоят из молекул нуклеиновой кислоты (например, зкДНК), одного или нескольких ионизируемых или катионных липидов (или их солей), одного или нескольких неионных или нейтральных липидов (например, фосфолипида), молекулы, которая предотвращает агрегацию (например, ПЭГ или конъюгат ПЭГ-липид) и, необязательно, стерола (например, холестерина).

[00356] Другим способом доставки в клетку нуклеиновых кислот, таких как зкДНК для продуцирования антител или слитого белка, является конъюгирование нуклеиновой кислоты с лигандом, который интернализуется клеткой. Например, лиганд может связываться с рецептором на поверхности клетки и интернализуется посредством эндоцитоза. Лиганд может быть ковалентно связан с нуклеотидом в нуклеиновой кислоте. Типичные примеры конъюгатов для доставки нуклеиновых кислот в клетку описаны, например, в WO 2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 и WO2017/177326.

[00357] Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, также могут быть доставлены в клетку путем трансфекции. Пригодные способы трансфекции включают, без ограничений, липид-опосредованную трансфекцию, опосредованную катионными полимерами трансфекцию или осаждение фосфатом кальция. Реагенты для трансфекции хорошо известны в данной области и включают, без ограничений, реагент для трансфекции TurboFect (Thermo Fisher Scientific), реагент Pro-Ject (Thermo Fisher Scientific), белковый реагент для трансфекции TRANSPASS™ P (New England Biolabs), белковый реагент для доставки CHARIOT™ (Active Motif), белковый реагент для трансфекции PROTEOJUICE™ (EMD Millipore), 293-фектин, липофектамин 2000 (LIPOFECTAMINE™ 2000), липофектамин 3000 (LIPOFECTAMINE™ 3000, Thermo Fisher Scientific), липофектамин (LIPOFECTAMINE™, Thermo Fisher Scientific), липофектин (LIPOFECTIN™, Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Базель, Швейцария), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (трансфектам, Promega, Мэдисон, Висконсин), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), трансфектин (TRANSFECTIN™, BioRad, Геркулес, Калифорния), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Валенсия, Калифорния), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, Сан-Диего, Калифорния), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Лафайет, Колорадо), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, Сент-Луис, Миссури), и ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку методами микрофлюидики, известными специалистам в данной области.

[00358] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, также можно вводить непосредственно в организм для трансдукции клеток in vivo. Введение осуществляется любым путем, обычно используемым для введения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или ткани, включая, без ограничений, инъекцию, инфузию, местное применение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот являются доступными и хорошо известны специалистам в данной области, и, хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, какой-либо конкретный путь часто может обеспечивать более быструю и более эффективную реакцию, чем другой путь.

[00359] Способы введения вектора нуклеиновой кислоты типа зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, могут включать доставку в гемопоэтические стволовые клетки, например, способами, описанными, например, в патенте США № 5928638.

[00360] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, имеющих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды. Типичные липосомы и липосомные составы, включая, без ограничений, соединения, содержащие функциональные группы полиэтиленгликоля (ПЭГ), раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и в международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., например, см. раздел, озаглавленный «Фармацевтические композиции».

[00361] Различные способы доставки, известные в данной области, или их модификации могут быть использованы для доставки зкДНК-векторов in vitro или in vivo. Например, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков доставляются путем транзиентного проникновения в клеточную мембрану с использованием механической, электрической, ультразвуковой, гидродинамической или лазерной энергии так, чтобы облегчить вхождение ДНК в клетки-мишени. Например, зкДНК-вектор может быть доставлен путем транзиентного нарушения клеточной мембраны в результате сдавливания клетки при прохождении по каналу с ограниченным размером, или другими способами, известными в данной области техники. В некоторых случаях отдельно взятый зкДНК-вектор вводят прямой инъекцией «голой» ДНК в кожу, вилочковую железу, сердечную мышцу, скелетную мышцу или клетки печени. В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляется с помощью генной пушки. Сферические частицы золота или вольфрама (диаметром 1–3 мкм), покрытые бескапсидными векторами ААВ, могут быть разогнаны до высокой скорости с помощью сжатого газа для проникновения в клетки ткани-мишени.

[00362] Композиции, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков и фармацевтически приемлемый носитель, конкретно предусматриваются данным документом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор состоит из липидной системы доставки, например, липосом, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации такие композиции вводят любым путем, желательным для квалифицированного специалиста. Композиции могут быть введены субъекту различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, путем ингаляции, путем буккального введения, интраплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставный, или их комбинации. Для ветеринарного применения композиция может быть введена в виде достаточно приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринарный врач может легко определить режим дозирования и способ введения, которые наиболее подходят для конкретного животного. Композиции можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами», или другими физическими методами, такими как электропорация («ЭП»), гидродинамические методы или применение ультразвука.

[00363] В некоторых случаях зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков доставляется с помощью гидродинамической инъекции, которая является простым и высокоэффективным методом прямой внутриклеточной доставки любых водорастворимых соединений и частиц во внутренние органы и скелетные мышцы во всей конечности.

[00364] В некоторых случаях зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков доставляют с помощью ультразвука путем создания наноскопических пор в мембране для облегчения внутриклеточной доставки частиц ДНК в клетки внутренних органов или опухолей, поэтому размер и концентрация плазмидной ДНК имеют большое значение для эффективности системы. В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляются магнитофекцией с использованием магнитных полей для концентрирования частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, в клетках-мишенях.

[00365] В некоторых случаях могут быть использованы химические системы доставки, например, с использованием наномерных комплексов, которые включают компактизацию отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты поликатионными наномерными частицами, принадлежащими катионным липосомам/мицеллам, или катионными полимерами. Катионные липиды, используемые для способа доставки, включают, без ограничений, моновалентные катионные липиды, поливалентные катионные липиды, гуанидинсодержащие соединения, соединения - производные холестерина, катионные полимеры (например, поли(этиленимин), поли-L-лизин, протамин, другие катионные полимеры) и гибрид липид-полимер.

А. Экзосомы:

[00366] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, доставляется упакованным в экзосому. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы эндоцитарного происхождения, которые высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Их поверхность состоит из липидного бислоя из клеточной мембраны донорской клетки, они содержат цитозоль из клетки, продуцирующей экзосому, и экспонируют на поверхности мембранные белки из родительской клетки. Экзосомы продуцируются различными типами клеток, включая эпителиальные клетки, В- и Т-лимфоциты, тучные клетки (МС), а также дендритные клетки (ДК). Некоторые варианты реализации предусматривают использование экзосом диаметром от 10 нм до 1 мкм, от 20 нм до 500 нм, от 30 нм до 250 нм, от 50 нм до 100 нм. Экзосомы могут быть выделены для доставки в клетки-мишени либо с использованием их донорских клеток, либо путем введения в них специфических нуклеиновых кислот. Различные подходы, известные в данной области, могут быть использованы для получения экзосом, содержащих бескапсидные векторы ААВ по данному изобретению.

B. Микрочастицы/наночастицы:

[00367] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, доставляется с помощью липидной наночастицы. Обычно липидные наночастицы содержат ионизируемый аминолипид (например, гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат, DLin-MC3-DMA, фосфатидилхолин (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, DSPC), холестерин и липид оболочки (полиэтиленгликоль-димиристолглицерин, ПЭГ-DMG), например, как описано Tam et al. (2013), Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.

[00368] В некоторых вариантах реализации изобретения липидная наночастица имеет средний диаметр от примерно 10 до примерно 1000 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 10 до примерно 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 25 до примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации препарат липидных наночастиц (например, композиция, содержащая множество липидных наночастиц) имеет распределение по размерам, при котором средний размер (например, диаметр) составляет от примерно 70 нм до примерно 200 нм, и более типично средний размер составляет примерно 100 нм или меньше.

[00369] Различные липидные наночастицы, известные в данной области, могут быть использованы для доставки зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе. Например, различные способы доставки с использованием липидных наночастиц описаны в патентах США №№ 9404127, 9006417 и 9518272.

[00370] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, доставляется с помощью наночастиц золота. Как правило, нуклеиновая кислота может быть ковалентно связана с наночастицей золота или нековалентно связана с наночастицей золота (например, связана посредством заряд-зарядного взаимодействия), например, как описано Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. В некоторых вариантах реализации конъюгаты наночастиц золота с нуклеиновой кислотой получают с использованием способов, описанных, например, в патенте США № 6812334.

C. Конъюгаты

[00371] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, конъюгирован (например, ковалентно связан) с агентом, который увеличивает клеточное поглощение. «Агент, который увеличивает клеточное поглощение», представляет собой молекулу, облегчающую транспорт нуклеиновой кислоты через липидную мембрану. Например, нуклеиновая кислота может быть конъюгирована с липофильным соединением (например, холестерином, токоферолом и т.д. ), проникающим в клетки пептидом (CPP) (например, пенетратином, TAT, Syn1B и т.д. ) и полиаминами (например, спермином). Дополнительные примеры агентов, которые увеличивают клеточное поглощение, раскрыты, например, в Winkler (2013), Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.

[00372] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, конъюгируют с полимером (например, полимерной молекулой) или молекулой фолата (например, молекулой фолиевой кислоты). В общем, доставка нуклеиновых кислот, конъюгированных с полимерами, известна в данной области, например, как описано в WO2000/34343 и WO2008/022309. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, конъюгируют с поли(амидным) полимером, например, как описано в патенте США № 8987377. В некоторых вариантах реализации нуклеиновую кислоту, описанную в данном изобретении, конъюгируют с молекулой фолиевой кислоты, как описано в патенте США № 8507455.

[00373] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, конъюгируют с углеводом, например, как описано в патенте США № 8450467.

D. Нанокапсула

[00374] Альтернативно, могут быть использованы нанокапсульные композиции зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе. Нанокапсулы могут обычно захватывать вещества стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных избыточной внутриклеточной нагрузкой полимерами, такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) необходимо разрабатывать с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Предусматривается использование биоразлагаемых полиалкил-цианоакрилатных наночастиц, которые удовлетворяют таким требованиям.

Е. Липосомы

[00375] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, имеющих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00376] Образование и использование липосом в целом известно специалистам в данной области. Были разработаны липосомы с улучшенными показателями стабильности в сыворотке и времени полувыведения из кровотока (патент США № 5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США № 5567434; 5552157; 5565213; 5738868 и 5795587).

F. Типичные композиции липосом и наночастиц липидов (ЛНЧ)

[00377] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку, например, в клетку, нуждающуюся в экспрессии трансгена. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы типично используются в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтической разработки. Они действуют путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, имеющих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.

[00378] Липидные наночастицы (ЛНЧ), содержащие зкДНК-векторы, раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и международной заявке PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме и предназначена для использования в способах и композициях, раскрытых в данном документе.

[00379] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает композицию липосом, которая включает одно или несколько соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которые могут снижать иммуногенность/антигенность, обеспечивать гидрофильность и гидрофобность соединения (соединений) и уменьшать частоту дозирования. В других случаях, липосомальная композиция просто содержит полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. В таких аспектах молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.

[00380] В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липосом, которая доставляет АФИ с профилем пролонгированного или контролируемого высвобождения на протяжении периода времени от нескольких часов до недель. В некоторых связанных аспектах композиция липосом может содержать водные камеры, ограниченные липидными бислоями. В других родственных аспектах липосомальная композиция инкапсулирует АФИ с помощью компонентов, которые при повышенной температуре претерпевают физический переход, с высвобождением АФИ на протяжении периода времени от нескольких часов до недель.

[00381] В некоторых аспектах липосомная композиция содержит сфингомиелин и один или несколько липидов, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит оптисомы.

[00382] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которая включает один или несколько липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида, HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеоилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); EPC (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеоилфосфатидилсерина); POPC (пальмитоилолеоилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диэрукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеоил-sn-глицерофосфоэтаноламина), холестерилсульфата (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеоил-sn-глицерофосфатидилхолина) или любой их комбинации.

[00383] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. В некоторых аспектах общее содержание липидов в липосомной композиции составляет от 2 до 16 мг/мл. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид, в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, холестерин и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, и холестерин. В некоторых аспектах пегилированный липид представляет собой ПЭГ-2000-DSPE. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую DPPG, соевый фосфатидилхолин (PC), липидный конъюгат MPEG-DSPE и холестерин.

[00384] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую один или несколько липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, и один или несколько липидов, содержащих функциональную группу этаноламина. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, содержащую один или несколько компонентов из: липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, липидов, содержащих функциональную группу этаноламина, и стеринов, например, холестерина. В некоторых аспектах липосомальная композиция содержит DOPC/DEPC; и DOPE.

[00385] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, дополнительно содержащую один или несколько фармацевтических эксципиентов, например, сахарозу и/или глицин.

[00386] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которая является либо однослойной, либо многослойной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которую включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает композицию липосом, размер которых больше, чем у обычных наночастиц, и составляет примерно от 150 до 250 нм. В некоторых аспектах липосомальная композиция представляет собой лиофилизированный порошок.

[00387] В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, которую готовят и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в данном документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК вне липосомы. Такое добавление повышает рН вне липосом до значения, равного примерно 7,3, и направляет АФИ в липосому. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, имеющую кислый рН внутри липосом. В таких случаях значение рН внутри липосомы может составлять 4-6,9, более предпочтительно, 6,5. В других аспектах данное изобретение предусматривает липосомальную композицию, полученную с использованием технологии внутрилипосомной стабилизации лекарственного средства. В таких случаях используются полимерные или неполимерные сильнозаряженные анионы и внутрилипосомные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.

[00388] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, содержащей зкДНК и ионизируемый липид. Например, композиция липидных наночастиц, которую готовят и нагружают зкДНК, полученной способом, раскрытым в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ. Это может быть достигнуто путем высокоэнергетического смешивания этанольных растворов липидов с водной зкДНК при низких значениях рН, которые протонируют ионизируемый липид и обеспечивают благоприятную энергетику для ассоциации зкДНК/липид и нуклеации частиц. Частицы могут быть дополнительно стабилизированы путем разбавления водой и удаления органического растворителя. Частицы могут быть сконцентрированы до желаемого уровня.

[00389] Как правило, липидные частицы получают при соотношении общего липида к зкДНК (массовом или весовом) от примерно 10:1 до 30:1. В некоторых вариантах реализации отношение липида к зкДНК (массовое соотношение; отношение мас./мас.) может находиться в диапазоне значений от примерно 1:1 до примерно 25:1, от примерно 10:1 до примерно 14:1, от примерно 3:1 до 15:1, от 4:1 до 10:1, от 5:1 до 9:1, или от 6:1 до 9:1. Количество липидов и зкДНК можно регулировать для обеспечения желаемого отношения N/P, например, отношения N/P, равного 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или выше. Обычно общее содержание липидов в составе липидных частиц может составлять от примерно 5 до примерно 30 мг/мл.

[00390] Ионизируемый липид обычно используется для конденсации груза нуклеиновой кислоты, например, зкДНК, при низком pH, и для стимулирования ассоциации мембран и их фузогенности. Как правило, ионизируемые липиды представляют собой липиды, содержащие по меньшей мере одну аминогруппу, которая положительно заряжена или протонируется в кислых условиях, например, при рН 6,5 или ниже. Ионизируемые липиды также называются в данном документе катионными липидами.

[00391] Типичные примеры ионизируемых липидов описаны в международных патентных публикациях РСТ WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 и WO2013/086354, и публикациях патентов США US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 и US2013/0195920, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00392] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (DLin-MC3-DMA или MC3) имеющий следующую структуру:

.

[00393] Липид DLin-MC3-DMA описан в Jayaraman et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

[00394] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой липид ATX-002, как описано в WO 2015/074085, содержание которого в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

[00395] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоса-13,16-диен-1-амин (соединение 32), как описано в WO2012/040184, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00396] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой соединение 6 или соединение 22, как описано в WO 2015/1992, содержание которого в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

[00397] Без ограничений, ионизируемый липид может составлять 20-90% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, молярное содержание ионизируемого липида может составлять 20-70% (мол.), 30-60% (мол.) или 40-50% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид составляет от примерно 50 % мол. до примерно 90 % мол., от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице.

[00398] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать некатионный липид. Некатионные липиды включают амфипатические липиды, нейтральные липиды и анионные липиды. Соответственно, некатионный липид может представлять собой нейтральный незаряженный, цвиттерионный или анионный липид. Некатионные липиды обычно используются для усиления фузогенности.

[00399] Типичные примеры некатионных липидов, предназначенных для использования в способах и композициях, раскрытых в данном документе, описаны в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., и PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г., которые в полном объеме включены в данный документ. Типичные некатионные липиды описаны в публикации международной заявки WO2017/099823 и публикации патента США US2018/0028664, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00400] Некатионный липид может составлять 0-30% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, содержание некатионного липида составляет 5-20% (мол.) или 10-15% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В различных вариантах реализации молярное отношение ионизируемого липида к нейтральному липиду составляет от примерно 2:1 до примерно 8:1.

[00401] В некоторых вариантах реализации липидные наночастицы не содержат каких-либо фосфолипидов. В некоторых аспектах, липидная наночастица может дополнительно содержать компонент, такой как стерол, для обеспечения целостности мембраны.

[00402] Одним примером стерола, который может быть использован в липидной наночастице, является холестерин и его производные. Типичные производные холестерина описаны в международной заявке WO2009/127060 и публикации патента США US2010/0130588, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00403] Компонент, обеспечивающий целостность мембраны, такой как стерол, может составлять 0-50% (мол.) от общего количества липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 20-50% (мол.) и 30-40% (мол.) от общего содержания липидов в липидной наночастице.

[00404] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ) или конъюгированную молекулу липида. Обычно они используются для ингибирования агрегации липидных наночастиц и/или обеспечения стерической стабилизации. Типичные конъюгированные липиды включают, без ограничений, конъюгаты ПЭГ-липид, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (такие как конъюгаты АТТА-липид), конъюгаты катионный полимер-липид (CPL), и их смеси. В некоторых вариантах реализации конъюгированная молекула липида представляет собой конъюгат ПЭГ-липид, например, (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированные липиды. Типичные конъюгаты ПЭГ-липид включают, без ограничений, ПЭГ-диацилглицерин (DAG) (такой как 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG)), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer), пегилированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE), ПЭГ-сукцинатдиацилглицерол (PEGS-DAG) (такой как 4-O-(2',3'-ди(тетрадеканоилокси)пропил-1-O)-(w-метокси(полиэтокси)этил)бутандиоат (PEG-S-DMG)), PEG-диалкоксипропилкарбам, N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина натриевая соль, или их смесь. Дополнительные примеры конъюгатов ПЭГ-липид описаны, например, в US5885613, US6287591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 и US2017/0119904, содержимое которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

[00405] В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид представляет собой соединение, раскрытое в US2018/0028664, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид раскрыт в US20150376115 или в US2016/0376224, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

[00406] Конъюгатом ПЭГ-DAA может быть, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил, ПЭГ-димиристилоксипропил, ПЭГ-дипалмитилоксипропил или ПЭГ-дистеарилоксипропил. ПЭГ-липид может представлять собой что-то одно или несколько из ПЭГ-DMG, ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистерилглицерина, ПЭГ-дилаурилгликамида, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистерилгликамида, ПЭГ-холестерина (1-[8'-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метилполи(этиленгликоль), ПЭГ-DMB (простой эфир 3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликоля)) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоля)-2000]. В некоторых примерах ПЭГ-липид может быть выбран из группы, состоящей из ПЭГ-ДМГ, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (полиэтиленгликоля)-2000].

[00407] Вместо ПЭГ-липида можно также использовать липиды, конъюгированные с молекулой, отличной от ПЭГ. Например, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (такие как конъюгаты АТТА-липид) и конъюгаты катионный полимер-липид (CPL) могут быть использованы вместо ПЭГ-липида или в дополнение к нему. Типичные кпримеры конъюгированных липидов, т.е. ПЭГ-липиды, конъюгаты (POZ)-липид, конъюгаты АТТА-липид и (катионный полимер)-липиды, описаны в публикациях международных патентных заявок WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 и WO2010/006282, публикациях патентных заявок США US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 и US20110123453, и патентов США US5885613, US6287591, US6320017 и US6586559, содержание которых включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

[00408] В некоторых вариантах реализации одно или несколько дополнительных соединений могут представлять собой терапевтические средства. Терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели. Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели. Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано в соответствии с целью лечения и желаемым биологическим действием. Например, если зкДНК в ЛНЧ предназначена для лечения рака, дополнительное соединение может представлять собой противораковое средство (например, химиотерапевтическое средство, таргетную терапию рака (включая, без ограничений, малую молекулу, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство). В другом примере, если ЛНЧ, содержащие зкДНК, предназначены для лечения инфекции, дополнительное соединение может представлять собой антимикробный агент (например, антибиотик или противовирусное соединение). В еще одном примере, если ЛНЧ, содержащие зкДНК, предназначены для лечения иммунного заболевания или расстройства, дополнительное соединение может представлять собой соединение, которое модулирует иммунный ответ (например, иммунодепрессант, иммуностимулирующее соединение или соединение, модулирующее один или несколько специфических иммунных путей). В некоторых вариантах реализации в композициях и способах по изобретению могут быть использованы различные коктейли разных липидных наночастиц, содержащих разные соединения, такие как зкДНК, кодирующая другой белок, или другое соединение, такое как терапевтическое средство.

[00409] В некоторых вариантах дополнительное соединение представляет собой иммуномодулятор. Например, дополнительное соединение представляет собой иммунодепрессант. В некоторых вариантах дополнительным соединением является иммуностимулирующий агент. В данном документе также предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая инкапсулированный в липидную наночастицу продуцируемый клеткой насекомого или синтетически продуцируемый зкДНК-вектор или для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

[00410] В некоторых аспектах данное изобретение относится к составу липидных наночастиц, дополнительно содержащему один или несколько фармацевтических эксципиентов. В некоторых вариантах реализации композиция липидных наночастиц дополнительно содержит сахарозу, трис, трегалозу и/или глицин.

[00411] зкДНК-вектор может может образовывать комплексы с липидной частью (portion) частицы или быть инкапсулирован в липидной части (position) липидной наночастицы. В некоторых вариантах реализации зкДНК может быть полностью инкапсулирована в липидной части липидной наночастицы, что защищает ее от деградации нуклеазой, например, в водном растворе. В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной наночастице существенно не деградирует после воздействия на липидную наночастицу нуклеазой при 37 °С в течение по меньшей мере около 20, 30, 45 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной наночастице существенно не деградирует после инкубации частицы в сыворотке при 37 °С в течение по меньшей мере примерно 30, 45 или 60 минут, или по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов.

[00412] В определенных вариантах реализации липидные наночастицы являются по существу нетоксичными для субъекта, например, для млекопитающего, такого как человек. В некоторых аспектах композиция липидных наночастиц представляет собой лиофилизированный порошок.

[00413] В некоторых вариантах реализации липидные наночастицы представляют собой частицы с твердым ядром, имеющие по меньшей мере один липидный бислой. В других вариантах реализации липидные наночастицы имеют не-двухслойную структуру, т.е. не-ламеллярную (т.е. не-бислойную) морфологию. Без ограничений, не-бислойная морфология может включать, например, трехмерные трубки, стержни, частицы кубической симметрии и т.д. Например, морфологию липидных наночастиц (ламеллярных и не-ламеллярных) можно легко оценить и охарактеризовать с использованием, например, анализа методом «крио-ТЭМ» (криотрансмиссионная электронная микроскопия), как описано в US2010/0130588, содержание которого включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

[00414] В некоторых других вариантах реализации липидные наночастицы, имеющие неламеллярную морфологию, являются электронно-плотными. В некоторых аспектах данное изобретение предусматривает липидную наночастицу, которая является либо однослойной, либо мультиламеллярной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены.

[00415] Контролируя состав и концентрацию липидных компонентов, можно контролировать скорость выделения конъюгата липида из липидной частицы по механизму обмена и, в свою очередь, скорость превращения липидной наночастицы в фузогенную. Кроме того, другие переменные, включая, например, pH, температуру или ионную силу, могут использоваться для изменения и/или контроля скорости превращения липидной наночастицы в фузогенную. Другие способы, которые можно использовать для контроля скорости превращения липидной наночастицы в фузогенную, будут очевидны для специалистов в данной области техники на основании данного изобретения. Также будет очевидно, что, контролируя состав и концентрацию конъюгата липида, можно контролировать размер липидных частиц.

[00416] Значение pKa составленных композиций катионных липидов может коррелировать с эффективностью ЛНЧ для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), которые обе включены посредством ссылки в полном объеме). Предпочтительный диапазон значений рКа составляет от ок.5 до ок.7. Значение pKa катионного липида в липидных наночастицах может быть определено с использованием анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS).

VIII. Способы применения

[00417] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, также может быть использован в способе доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, кодирующей антитело или слитый белок) в клетку-мишень (например, клетку-хозяина). Способ, в частности, может представлять собой способ доставки антитела или антигенсвязывающего фрагмента в клетку нуждающегося в этом субъекта и лечения представляющего интерес заболевания. Изобретение позволяет обеспечить экспрессию in vivo антитела или слитого белка, закодированных в зкДНК-векторе, в клетке у субъекта таким образом, чтобы проявлялся терапевтический эффект экспрессии антитела или слитого белка. Такие результаты наблюдаются как при in vivo, так и при in vitro способах доставки зкДНК-вектора.

[00418] Кроме того, изобретение предусматривает способ доставки антитела или слитого белка в клетку нуждающегося в этом субъекта, включающий многократное введение зкДНК-вектора по изобретению, кодирующего указанное антитело или слитый белок. Поскольку зкДНК-вектор по изобретению не индуцирует иммунный ответ, подобный тому, который обычно наблюдается против инкапсидированных вирусных векторов, такая стратегия многократного введения, вероятно, будет иметь больший успех в системе на основе зкДНК.

[00419] зкДНК-вектор вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса генов и экспрессии антитела или слитого белка без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, внутривенный (например, в составе липосом), прямую доставку в выбранный орган (например, внутрипортальную доставку в печень), внутримышечный и другие парентеральные (parental) пути введения. При необходимости, пути введения могут быть скомбинированы.

[00420] Доставка зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, не ограничивается доставкой экспрессированного антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Например, получаемые традиционными методами (например, с использованием способа продуцирования на основе клеток (например, способов продуцирования в клетках насекомых)) или синтетически продуцированные зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно использовать вместе с другими системами доставки, предназначенными для обеспечения части генной терапии. Один неограничивающий пример системы, которая может быть скомбинирована с зкДНК-векторами в соответствии с данным изобретением, включает системы, которые доставляют по отдельности один или несколько кофакторов или иммуносупрессоров для эффективной экспрессии гена зкДНК-вектора, экспрессирующего антитело или слитый белок.

[00421] Изобретение также относится к способу лечения заболевания у субъекта, включающему введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Выбранный зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или слитый белок, пригодные для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность антитела или слитого белка, функционально связанную с контрольными элементами, способными, при введении субъекту, направлять транскрипцию желаемого антитела или слитого белка, кодируемого экзогенной последовательностью ДНК. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

[00422] Композиции и векторы, представленные в данном документе, можно использовать для доставки антитела или слитого белка с различными целями. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует антитело или слитый белок, которые предназначены для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, несущего трансген, например, для изучения функции продукта антитела или слитого белка. В другом примере трансген кодирует антитело или слитый белок, которые предполагается использовать для создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации кодированное антитело или слитый белок являются полезными для лечения или профилактики болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Антитело или слитый белок могут быть перенесены пациенту (например, экспрессированы) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена.

[00423] В принципе, экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту или любой трансген, кодирующий антитело или слитый белок, которые либо редуцированы, либо отсутствуют вследствие мутации, либо которые приносят терапевтическую пользу при сверхэкспрессии, и считается входящей в объем изобретения. Предпочтительно, не инсертированная бактериальная ДНК не присутствует и, предпочтительно, композиции зкДНК, предусматриваемые в данном документе, не содержат бактериальной ДНК.

[00424] зкДНК-вектор не ограничивается одним видом зкДНК-вектора. По существу, в другом аспекте множественные зкДНК-векторы, экспрессирующие разные антитела или слитые белки или одно и то же антитело или слитый белок, но функционально связанные с различными промоторами или цис-регуляторными элементами, могут доставляться одновременно или последовательно в клетку-мишень, ткань, орган или субъекту. Таким образом, эта стратегия может обеспечивать возможность генной терапии или доставки генов множества антител и/или слитых белков одновременно. Также возможно разместить разные части антитела в отдельных зкДНК-векторах (например, разные домены и/или кофакторы, необходимые для функциональности антитела или антигенсвязывающего фрагмента), которые можно вводить одновременно или в разное время, и которые можно регулировать отдельно, тем самым добавляя дополнительный уровень контроля экспрессии антитела или слитого белка. Доставка может также осуществляться неоднократно и, что важно для генной терапии в клинических условиях, с последовательно увеличивающимися или уменьшающимися дозами, учитывая отсутствие иммунного ответа хозяина против капсида из-за отсутствия вирусного капсида. Ожидается, что никакой реакции против капсида возникать не будет из-за отсутствия капсида.

[00425] Изобретение также предусматривает способ лечения заболевания у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать требуемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными, при введении субъекту, направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

IX. Способы доставки зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков

[00426] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка может быть доставлен в клетку-мишень in vitro или in vivo различными подходящими способами. Может осуществляться применение или введение с помощью инъекции отдельно взятых зкДНК-векторов. зкДНК-векторы могут быть доставлены в клетку без помощи реагента для трансфекции или других физических средств. Альтернативно, зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков можно доставлять с использованием любого известного в данной области реагента для трансфекции или других известных в данной области физических средств, которые облегчают проникновение ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, полилизин-богатых соединений, аргинин-богатых соединений, фосфата кальция, микровезикул, микроинъекции, электропорации и т.п.

[00427] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, могут эффективно нацеливаться на типы клеток и тканей, которые обычно с трудом поддаются трансдукции обычными вирионами ААВ с использованием различных реагентов для доставки.

[00428] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу доставки антитела или антигенсвязывающего фрагмента в клетку. Как правило, для in vivo и in vitro методов, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть введен в клетку с использованием способов, раскрытых в данном документе, а также других способов, известных в данной области. зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если зкДНК-вектор вводят в клетку in vivo (например, субъекту), то биологически эффективным является количество зкДНК-вектора, достаточное для того, чтобы привести к трансдукции и экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента в клетке-мишени.

[00429] Типичные примеры способов введения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, включают пероральное, ректальное, трансмукозальное, интраназальное, ингаляционное (например, в аэрозоле), буккальное (например, сублингвальное), вагинальное, интратекальное, внутриглазное, чрескожное, интраэндотелиальное введение, внутриматочное (in utero) (или in ovo («в яйцо»)), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутричерепное, внутримышечное [в том числе введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу], интраплевральное, интрацеребральное и внутрисуставное), местное (например, на поверхности кожи и слизистых оболочек, в том числе поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатическое введение и т.п., а также прямую инъекцию в ткань или орган (например, без ограничений, в печень, глаз, мышцы, включая скелетные мышцы, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу, или головной мозг).

[00430] Введение зкДНК-вектора может осуществляться в любое место у субъекта, включая, без ограничений, место, выбранное из группы, состоящей из головного мозга, скелетной мышцы, гладкой мышцы, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почки, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаза. Введение зкДНК-вектора также может осуществляться в опухоль (например, внутрь опухоли или лимфатического узла или возле них).

[00431] Наиболее подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, лечение, облегчение и/или предотвращение которого проводится, и от природы конкретного используемого зкДНК-вектора. Кроме того, зкДНК позволяет вводить более одного антитела в одном векторе или нескольких зкДНК-векторах (например, коктейль зкДНК).

А. Внутримышечное введение зкДНК-вектора

[00432] В некоторых вариантах реализации способ лечения заболевания у субъекта включает введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков вводят в мышечную ткань субъекта.

[00433] В некоторых вариантах реализации введение зкДНК-вектора может осуществляться в любое место у субъекта, включая, без ограничения, место, выбранное из группы, состоящей из скелетной мышцы, гладкой мышцы, сердца, диафрагмы или мышц глаза. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор в соответствии с данным изобретением вводят в скелетную мышцу, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или болезни сердца (например, заболевания периферических артерий (PAD) или застойной сердечной недостаточности).

[00434] Введение зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, в скелетную мышцу в соответствии с данным изобретением включает, без ограничений, введение в скелетную мышцу конечностей (например, в плечо, предплечье, бедро и/или голень), спины, шеи, головы (например, в язык), грудной клетки, брюшной полости, таза/промежности и/или пальцев. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в скелетную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечностей (необязательно, перфузии изолированной конечности - ноги и/или руки; см., например, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464) и/или прямой внутримышечной инъекции. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД)) путем перфузии конечности, необязательно, перфузии изолированной конечности (например, путем внутривенного или внутрисуставного введения). В вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно вводить без использования «гидродинамических» методов. Например, доставка в ткань (например, в мышцу) обычных вирусных векторов часто усиливается гидродинамическими методами (например, внутривенное/внутривенное введение в большом объеме), которые увеличивают давление в сосудистой сети и усиливают способность вирусного вектора преодолевать барьер эндотелиальных клеток. В конкретных вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, можно вводить в отсутствие гидродинамических методов, таких как инфузии большого объема и/или повышенное внутрисосудистое давление (например, выше нормального систолического давления, например, повышение внутрисосудистого давления по сравнению с нормальным систолическим давлением менее чем на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, или на величину, равную указанному значению). Такие методы могут уменьшить или избежать побочных эффектов, связанных с гидродинамическими методами, таких как отек, повреждение нервов и/или синдром компартмента.

[00435] Кроме того, композиция, содержащая зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, которая вводится в скелетную мышцу, может быть введена в скелетную мышцу конечностей (например, в плече, предплечье, бедре и/или голени), спины, шеи, головы (например, в язык), грудной клетки, брюшной полости, таза/промежности и/или пальцев. Подходящие скелетные мышцы включают, без ограничений, отводящую мышцу мизинца (в кисти), отводящую мышцу мизинца (в стопе), отводящую мышцу большого пальца, отводящую мышцу пятой плюсневой кости, короткую мышцу, отводящую большой палец кисти, длинную мышцу, отводящую большой палец кисти, короткую приводящую мышцу, мышцу, приводящую большой палец стопы, длинную приводящую мышцу, большую приводящую мышцу, мышцу, приводящую большой палец кисти, локтевую мышцу, переднюю лестничную мышцу, суставную мышцу колена, двуглавую мышцу плеча, двуглавую мышцу бедра, плечевую мышцу, плечелучевую мышцу, щечную мышцу, клювовидно-плечевую мышцу, мышцу, сморщивающую бровь, дельтовидную мышцу, мышцу, опускающую угол рта, мышцу, опускающую нижнюю губу, двубрюшную мышцу, тыльные межкостные мышцы (кисти), тыльные межкостные мышцы (стопы), короткий лучевой разгибатель запястья, длинный лучевой разгибатель запястья, локтевой разгибатель запястья, разгибатель мизинца, разгибатель пальцев кисти, короткий разгибатель пальцев кисти, длинный разгибатель пальцев кисти, короткий разгибатель большого пальца стопы, длинный разгибатель большого пальца стопы, разгибатель указательного пальца, короткий разгибатель большого пальца, длинный разгибатель большого пальца, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, короткий сгибатель мизинца (кисти), короткий сгибатель мизинца (стопы), короткий сгибатель пальцев стопы, длинный сгибатель пальцев стопы, глубокий сгибатель пальцев кисти, поверхностный сгибатель пальцев кисти, короткий сгибатель большого пальца стопы, длинный сгибатель большого пальца стопы, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинный сгибатель большого пальца кисти, лобную мышцу, икроножную мышцу, подбородочно-подъязычную мышцу, большую ягодичную мышцу, среднюю ягодичную мышцу, малую ягодичную мышцу, тонкую мышцу, подвздошно-рёберную мышцу шеи, подвздошно-рёберную мышцу поясницы, подвздошно-рёберную мышцу груди, подвздошную мышцу, нижнюю близнецовую мышцу, нижнюю косую мышцу, нижнюю прямую мышцу, подостную мышцу, межостистые мышцы, межпоперечные мышцы, латеральную крыловидную мышцу, латеральную прямую мышцу, широчайшую мышцу спины, мышцу, поднимающую угол рта, мышцу, поднимающую верхнюю губу, мышцу, поднимающую верхнюю губу и крыло носа, мышцу, поднимающую верхнее веко, мышцу, поднимающую лопатку, длинные мышцы-вращатели, длиннейшую мышцу головы, длиннейшую мышцу шеи, длиннейшую мышцу груди, длинную мышцу головы, длинную мышцу шеи, червеобразные мышцы (кисти), червеобразные мышцы (стопы), жевательную мышцу, медиальную крыловидную мышцу, медиальную прямую мышцу, среднюю лестничную мышцу, многораздельные мышцы, челюстно-подъязычную мышцу, нижнюю косую мышцу головы, верхнюю косую мышцу головы, наружную запирательную мышцу, внутреннюю запирательную мышцу, затылочную мышцу, лопаточно-подъязычную мышцу, мышцу, противопоставляющую мизинец, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, круговую мышцу глаза, круговую мышцу рта, ладонную межкостную мышцу, короткую ладонную мышцу, длинную ладонную мышцу, гребенчатую мышцу, большую грудную мышцу, малую грудную мышцу, короткую малоберцовую мышцу, длинную малоберцовую мышцу, третью малоберцовую мышцу, грушевидную мышцу, подошвенные межкостные мышцы, подошвенную мышцу, подкожную мышцу шеи, подколенную мышцу, заднюю лестничную мышцу, квадратный пронатор, круглый пронатор, большую поясничную мышцу, квадратную мышцу бедра, квадратную мышцу подошвы, переднюю прямую мышцу головы, латеральную прямую мышцу головы, большую заднюю прямую мышцу головы, малую заднюю прямую мышцу головы, прямую мышцу бедра, большую ромбовидную мышцу, малую ромбовидную мышцу, мышцы смеха, портняжную мышцу, наименьшую лестничную мышцу, полуперепончатую мышцу, полуостистую мышцу головы, полуостистую мышцу шеи, полуостистую мышцу груди, полусухожильную мышцу, переднюю зубчатую мышцу, короткие мышцы-вращатели, камбаловидную мышцу, остистую мышцу головы, остистую мышцу шеи, остистую мышцу груди, ремённую мышцу головы, ремённую мышцу шеи, грудино-ключично-сосцевидную мышцу, грудино-подъязычную мышцу, грудино-щитовидную мышцу, шило-подъязычную мышцу, подключичную мышцу, подлопаточную мышцу, верхнюю близнецовую мышцу, верхнюю косую мышцу, верхнюю прямую мышцу, супинатор, надостную мышцу, височную мышцу, мышцу, напрягающую широкую фасцию, большую круглую мышцу, малую круглую мышцу, мышцы груди, щито-подъязычную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, трапециевидную мышцу, трёхглавую мышцу плеча, промежуточную широкую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, большую скуловую мышцу и малую скуловую мышцу, и любые другие подходящие скелетные мышцы, известные в данной области.

[00436] Введение зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в диафрагмальную мышцу может производиться любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах реализации доставка трансгена, экспрессированного из зкДНК-вектора, в ткань-мишень может также осуществляться путем доставки синтетического депо, содержащего зкДНК-вектор, причем депо, содержащее зкДНК-вектор, имплантируется в скелетную, гладкую, сердечную и/или диафрагмальную мышечную ткань, или мышечная ткань может контактировать с пленкой или другой матрицей, содержащей зкДНК-вектор, как описано в данном документе. Такие имплантируемые матрицы или носители описаны в патенте США № 7201898.

[00437] Введение зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, в сердечную мышцу включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или перегородку. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как внутриаортальное введение, прямой инъекции в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или перфузии коронарной артерии.

[00438] Введение зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, в гладкую мышцу может осуществляться любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. В одном варианте реализации введение может осуществляться в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладкой мышце, рядом с ней и/или на ней. Неограничивающие примеры гладких мышц включают радужную оболочку глаза, бронхиолы легких, мышцы гортани (голосовые связки), мышечные слои желудка, пищевод, тонкую и толстую кишку желудочно-кишечного тракта, мочеточник, детрузорную мышцу мочевого пузыря, миометрий матки, половой член или предстательную железу.

[00439] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, вводят в скелетную мышцу, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или болезни сердца (например, заболевания периферических артерий (PAD) или застойной сердечной недостаточности)). В репрезентативных вариантах реализации зкДНК-вектор согласно данному изобретению используется для лечения и/или предотвращения расстройств скелетной, сердечной и/или диафрагмальной мышцы.

[00440] В частности, предусматривается, что композиция, содержащая зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть доставлена в одну или несколько мышц глаза (например, латеральную прямую, медиальную прямую, верхнюю прямую, нижнюю прямую, верхнюю косую, нижнюю косую), лицевые мышцы (например, затылочно-лобную мышцу, височно-теменную мышцу, мышцу гордецов, носовую мышцу, мышцу, опускающую перегородку носа, круговую мышцу глаза, мышцу, сморщивающую бровь, мышцу, опускающую бровь, переднюю ушную мышцу, круговую мышцу рта, мышцу, опускающую угол рта, мушцу смеха, большую скуловую мышцу, малую скуловую мышцу, мышцу, поднимающую верхнюю губу, мышцу, поднимающую верхнюю губу и крыло носа, мышцу, опускающую нижнюю губу, мышцу, поднимающую угол рта, щечную мышцу, подбородочную мышцу) или мышцы языка (например, подбородочно-язычную, подъязычно-язычную, хрящеязычную, шилоязычную, небно-язычную, верхнюю продольную мышцу, нижнюю продольную мышцу, вертикальную мышцу и поперечную мышцу).

[00441] (i) Внутримышечная инъекция: В некоторых вариантах реализации композиция, содержащая зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может быть введена субъекту инъекцией в один или несколько участков данной мышцы, например, скелетной мышцы (например, дельтовидной, латеральной широкой мышцы бедра, средней и малой ягодичных мышц или (of) большой ягодичной мышцы, или переднебоковой части бедра для младенцев) с помощью иглы. Композиция, содержащая зкДНК, может быть введена в мышечные клетки других подтипов. Неограничивающие примеры подтипов мышечных клеток включают клетки скелетных мышц, клетки сердечной мышцы, клетки гладких мышц и/или клетки диафрагмальной мышцы.

[00442] Способы внутримышечной инъекции известны специалистам в данной области и, как таковые, в данном документе подробно не описываются. Однако при выполнении внутримышечной инъекции должен быть определен надлежащий размер иглы на основании возраста и размера пациента, вязкости композиции, а также места инъекции. В Таблице 12 приведены рекомендации для примерных мест инъекции и соответствующих размеров игл:

Таблица 12: Рекомендации по внутримышечному введению для людей Место инъекции Калибр иглы Размер иглы Максимальный объем композиции Вентроглутеальный участок (средняя ягодичная мышца и малая ягодичная мышца) Водные растворы: калибр 20-25
Вязкий или масляный раствор: калибр 18-21 Худые взрослые: от 15 до 25 мм
Взрослые среднего телосложения: 25 мм
Взрослые крупного телосложения (более 68 кг (150 фунтов)): от 25 до 38 мм.
Дети и младенцы: потребуется игла меньшего размера 3 мл Латеральная широкая мышца бедра Водные растворы: калибр 20-25
Вязкий или масляный раствор: калибр 18-21
Дети/младенцы: калибр от 22 до 25 Взрослые: от 25 до 38 мм 3 мл Дельтовидная Калибр от 22 до 25 Мужчины:
59-118 кг (130-260 фунтов): 25 мм
Женщины:
<59 кг (<130 фунтов): 16 мм
59-91 кг (130-200 фунтов): 25 мм
>91 кг (>200 фунтов): 38 мм 1 мл

[00443] В определенных вариантах реализации композиция зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, составлена в небольшом объеме, например, в типичном примере объема, указаном в Таблице 12 для данного субъекта. В некоторых вариантах, при необходимости, субъекту перед инъекцией может быть введен общий или местный анестетик. Это особенно желательно, если требуются многократные инъекции, или если выполняется инъекция в глубже залегающую мышцу, а не в обычные места инъекций, указанные выше.

[00444] В некоторых вариантах реализации внутримышечную инъекцию можно комбинировать с электропорацией, доставкой под давлением или использованием реагентов для трансфекции для усиления поглощения клетками зкДНК-вектора.

[00445] (ii) Реагенты для трансфекции: В некоторых вариантах реализации составляются композиции зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, содержащие один или несколько реагентов для трансфекции для усиления поглощения векторов в мышечных трубочках или мышечной ткани. Таким образом, в одном варианте реализации нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, вводят в мышечную клетку, мышечную трубочку или мышечную ткань путем трансфекции с использованием способов, описанных в других разделах данного документа.

[00446] (iii) Электропорация: В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, вводят в отсутствие носителя для облегчения проникновения зкДНК в клетки или в физиологически инертном фармацевтически приемлемом носителе (т.е. любом носителе, который не улучшает или не увеличивает поглощение бескапсидных невирусных векторов мышечными трубочками). В таких вариантах реализации поглощение бескапсидного невирусного вектора может быть облегчено путем электропорации клетки или ткани.

[00447] Клеточные мембраны естественным образом препятствуют прохождению внеклеточного вещества в цитоплазму клетки. Одним из способов временного снижения этого сопротивления является «электропорация», при которой электрические поля используются для создания пор в клетках, не вызывая постоянного повреждения клеток. Эти поры достаточно велики, чтобы позволить ДНК-векторам, фармацевтическим препаратам, ДНК и другим полярным соединениям получить доступ внутрь клетки. Со временем поры в клеточной мембране смыкаются и клетка снова становится непроницаемой.

[00448] Электропорация может быть использована для применения как in vitro, так и in vivo при введении, например, экзогенной ДНК в живые клетки. В применениях in vitro обычно смешивают образец живых клеток с композицией, содержащей, например, ДНК. Затем клетки помещают между электродами, такими как параллельные пластины, и к смеси клеток/композиции прикладывают электрическое поле.

[00449] Существует ряд методов электропорации in vivo; электроды могут быть выполнены в различных конфигурациях, таких как, например, в форме штангенциркуля, которым зажимают эпидермис, покрывающий область клеток, подлежащих лечению. Альтернативно, электроды игольчатой формы могут быть введены в ткань, чтобы получить доступ к глубже расположенным клеткам. В любом случае, после того, как композиция, содержащая, например, нуклеиновые кислоты, будет введена инъекцией в область проведения лечения, электроды создают электрическое поле в указанной области. В некоторых приложениях электропорации, такое электрическое поле содержит одиночный прямоугольный импульс порядка 100-500 В/см. длительностью примерно от 10 до 60 мс. Такой импульс может генерироваться, например, в известных применениях, с помощью устройства Electro Square Porator T820, производства подразделения BTX Division корпорации Genetronics, Inc.

[00450] Как правило, успешное поглощение, например, нуклеиновых кислот происходит только в том случае, если мышца электрически стимулируется сразу или вскоре после введения композиции, например, путем инъекции в мышцу.

[00451] В некоторых вариантах реализации электропорация обеспечивается с использованием импульсов электрических полей или с использованием режимов обработки низкого напряжения/длительными импульсами (например, с использованием системы электропорации с импульсами прямоугольной формы). Примеры генераторов импульсов, способных генерировать импульсное электрическое поле, включают, например, ECM600, который может генерировать сигнал экспоненциальной формы, и ElectroSquarePorator (T820), который может генерировать импульсы прямоугольной формы, которые оба поставляются подразделением BTX корпорации Genetronics, Inc. (Сан-Диего, Калифорния). Системы электропорации с прямоугольными сигналами выдают контролируемые электрические импульсы, которые быстро возрастают до заданного значения напряжения, остаются на этом уровне в течение заданного промежутка времени (длительности импульса), а затем быстро падают до нуля.

[00452] В некоторых вариантах реализации вводят местный анестетик, например, инъекцией в месте лечения, чтобы уменьшить боль, которая может быть связана с электропорацией ткани в присутствии композиции, содержащей бескапсидный невирусный вектор, как описано в данном документе. Кроме того, специалисту в данной области понятно, что дозу композиции следует выбирать таким образом, чтобы минимизировать и/или предотвратить чрезмерное повреждение ткани, приводящее к фиброзу, некрозу или воспалению мышцы.

[00453] (iv) Доставка под давлением: В некоторых вариантах реализации доставке зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в мышечную ткань способствует доставка под давлением, которая использует комбинацию больших объемов и быстрого введения в артерию, снабжающую конечность (например, подвздошную артерию). Этот способ введения может быть осуществлен с помощью различных способов, которые включают инфузию в сосуды конечностей композиции, содержащей зкДНК-вектор, обычно при изоляции мышцы от системного кровообращения с помощью турникета из вазофиксаторов. В одном способе композиция циркулирует в сосудистой сети конечности, чтобы обеспечить экстравазацию в клетки. В другом способе внутрисосудистое гидродинамическое давление повышается для расширения сосудистого русла и увеличения поглощения зкДНК-вектора мышечными клетками или тканями. В одном варианте реализации композицию зкДНК вводят в артерию.

[00454] (v) Композиции липидных наночастиц: В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, для внутримышечной доставки готовят в виде композиции, содержащей липосому, как описано в других разделах данного документа.

[00455] (vi) Системное введение зкДНК-вектора, нацеленного на мышечную ткань. В некоторых вариантах реализации композицию зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, составляют так, чтобы он был нацелен на мышцу посредством непрямой доставки, при которой зкДНК транспортируется в мышцу, а не в печень. Соответственно, технология, описанная в данном документе, охватывает непрямое введение композиций, содержащих зкДНК-вектор, для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в мышечную ткань, например, путем системного введения. Такие композиции можно вводить местно, внутривенно (с помощью болюса или непрерывного вливания), внутриклеточной инъекцией, внутритканевой инъекцией, перорально, путем ингаляции, внутрибрюшинно, подкожно, внутриполостно и, при желании, можно доставлять с помощью перистальтических устройств или другими средствами, известными специалистам в данной области. Агент может вводиться системно, например, внутривенной инфузией, если это желательно.

[00456] В некоторых вариантах реализации поглощение зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, мышечными клетками/тканями увеличивается путем использования нацеливающего агента или фрагмента, которые преимущественно направляют вектор в мышечную ткань. Таким образом, в некоторых вариантах реализации бескапсидный зкДНК-вектор может быть сконцентрирован в мышечной ткани по сравнению с количеством бескапсидных зкДНК-векторов, присутствующих в других клетках или тканях организма.

[00457] В некоторых вариантах реализации композиция, содержащая зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, дополнительно содержит фрагмент, нацеливающий на мышечные клетки. В других вариантах реализации экспрессированный генный продукт содержит нацеливающий фрагмент, специфичный по отношению к ткани, в которой его действие является желательным. Нацеливающий фрагмент может включать любую молекулу или комплекс молекул, которые способны нацеливаться, взаимодействовать, соединяться с и/или связываться с внутриклеточным, клеточно-поверхностным или внеклеточным биомаркером клетки или ткани. Биомаркер может включать, например, клеточную протеазу, киназу, белок, рецептор клеточной поверхности, липид и/или жирную кислоту. Другие примеры биомаркеров, на которые нацеливающие фрагменты могут нацеливаться, взаимодействовать, соединяться и/или связываться, включают молекулы, ассоциированные с конкретным заболеванием. Например, биомаркеры могут включать рецепторы клеточной поверхности, участвующие в развитии рака, такие как рецептор эпидермального фактора роста и рецептор трансферрина. Нацеливающие фрагменты могут включать, без ограничений, синтетические соединения, природные соединения или продукты, макромолекулярные фрагменты, биоинженерные молекулы (например, полипептиды, липиды, полинуклеотиды, антитела, фрагменты антител) и малые объекты (например, малые молекулы, нейротрансмиттеры, субстраты, лиганды, гормоны и элементные соединения), которые связываются с молекулами, экспрессируемыми в мышечной ткани-мишени.

[00458] В некоторых вариантах реализации нацеливающий фрагмент может дополнительно содержать рецепторную молекулу, включая, например, рецепторы, которые естественным образом распознают конкретную желаемую молекулу клетки-мишени. Такие рецепторные молекулы включают рецепторы, которые были модифицированы для увеличения специфичности их взаимодействия с молекулой-мишенью, рецепторы, которые были модифицированы для взаимодействия с желаемой молекулой-мишенью, не распознаваемой рецептором естественным образом, и фрагменты таких рецепторов (см., например, Skerra, 2000, J. Molecular Recognition, 13:167-187). Предпочтительным рецептором является хемокиновый рецептор. Типичные хемокиновые рецепторы были описаны, например, в Lapidot et al., 2002, Exp Hematol, 30:973-81 и Onuffer et al., 2002, Trends Pharmacol Sci, 23:459-67.

[00459] В других вариантах реализации дополнительный нацеливающий фрагмент может содержать молекулу лиганда, включая, например, лиганды, которые естественным образом распознают специфический желаемый рецептор клетки-мишени, такой как лиганд трансферрина (Tf). Такие молекулы лигандов включают лиганды, которые были модифицированы для увеличения специфичности их взаимодействия с рецептором-мишенью, лиганды, которые были модифицированы для взаимодействия с желаемым рецептором, не распознаваемым лигандом естественным образом, и фрагменты таких лигандов.

[00460] В других вариантах реализации, нацеливающий фрагмент может содержать аптамер. Аптамеры представляют собой олигонуклеотиды, которые выбирают для специфического связывания с желаемой молекулярной структурой клетки-мишени. Аптамеры обычно являются продуктами процесса аффинного отбора, сходного с аффинным отбором фагового дисплея (также известного как молекулярная эволюция in vitro). Процесс включает выполнение нескольких тандемных итераций аффинного разделения, например, с использованием твердой подложки, к которой присоединен связанный с заболеванием иммуноген (diseased immunogen), с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нуклеиновых кислот, которые связываются с иммуногенами. Таким образом, каждый раунд аффинного разделения обогащает популяцию нуклеиновых кислот молекулами, которые успешно связываются с желаемым иммуногеном. Таким образом, случайный пул нуклеиновых кислот может быть «обучен» для получения аптамеров, которые специфически связывают молекулы-мишени. Аптамеры обычно представляют собой РНК, но могут быть ДНК, или их аналогами или производными, такими как, без ограничения, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и фосфоротиоатные нуклеиновые кислоты.

[00461] В некоторых вариантах реализации нацеливающий фрагмент может содержать фоторазлагаемый лиганд (т.е. «каркасный» (caged) лиганд), который высвобождается, например, под действием сфокусированного пучка света для нацеливания бескапсидных невирусных векторов или генного продукта на конкретную ткань.

[00462] В данном документе также предусматривается, что композиции будут доставляться в несколько мест в одной или нескольких мышцах субъекта. Таким образом, инъекции могут выполняться в по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100 местах. Такие места могут быть распределены по площади одной мышцы или могут быть распределены между несколькими мышцами.

B. Введение зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитого белка в немышечные области

[00463] В другом варианте реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков вводят в ЦНС (например, в головной мозг или в глаз). зкДНК-вектор может быть введен в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черная субстанция, шишковидная железа), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, в том числе затылочные, височные, теменные и лобные доли, кору, базальные ганглии, гиппокамп и воротное миндалевидное тело (portaamygdala)), лимбическую систему, неокортекс, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик. зкДНК-вектор также можно вводить в различные области глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. зкДНК-вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, посредством люмбальной пункции). зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков может быть дополнительно введен в ЦНС внутрисосудисто в ситуациях, когда гематоэнцефалический барьер нарушен (например, опухоль головного мозга или инфаркт головного мозга).

[00464] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков может быть введен в желаемую область (области) ЦНС любым путем, известным в данной области, включая, без ограничений, интратекальную, внутриглазную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит), интраназальную, внутриушную, внутриглазную (например, внутристекловидную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтенонову область) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой к двигательным нейронам.

[00465] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков вводят в жидкой композиции путем прямой инъекции (например, стереотаксической инъекции) в желаемую область или компартмент ЦНС. В других вариантах реализации зкДНК-вектор может быть введен путем местного нанесения на желаемую область или путем интраназального введения аэрозольной композиции. Введение в глаз может осуществляться путем местного нанесения капель жидкости. В качестве дополнительной альтернативы зкДНК-вектор может быть введен в виде твердой композиции с замедленным высвобождением (см., например, патент США № 7201898). В дополнительных вариантах реализации зкДНК-вектор может использоваться для ретроградного транспорта с целью лечения, облегчения и/или предотвращения заболеваний и расстройств, связанных с двигательными нейронами (например, бокового амиотрофического склероза (ALS); спинальной мышечной атрофии (SMA) и т.д.). Например, зкДНК-вектор может быть доставлен в мышечную ткань, из которой он может мигрировать в нейроны.

C. Лечение ex vivo

[00466] В некоторых вариантах реализации клетки извлекают из субъекта, вводят в них зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, и затем клетки возвращают в организм субъекта. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo с последующим введением обратно субъекту известны в данной области (см., например, патент США № 5399346, описание которого включено в данный документ в полном объеме). Альтернативно, зкДНК-вектор вводят в клетки от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и клетки вводят субъекту, нуждающемуся в этом.

[00467] Клетки, трансдуцированные зкДНК-вектором для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, предпочтительно, вводят субъекту в «терапевтически эффективном количестве» в сочетании с фармацевтическим носителем. Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или обеспечивать исцеление, при условии, что субъект получает некоторую пользу.

[00468] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, может кодировать антитело или слитый белок, как описано в данном документе (иногда называемый трансгеном или гетерологичной нуклеотидной последовательностью), которые должен продуцироваться в клетке in vitro, ex vivo или in vivo. Например, в отличие от использования зкДНК-векторов, описанных в данном документе в способе лечения, который обсуждается в данном документе, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка может быть введен в культивируемые клетки, и экспрессированное антитело или слитый белок могут быть выделены из клеток, например, для получения антител и слитых белков. В некоторых вариантах реализации культивируемые клетки, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно использовать для коммерческого производства антител или слитых белков, например, в качестве источника клеток для малого или крупномасштабного биопроизводства антител или слитых белков. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, вводят в клетки субъекта-хозяина, не являющегося человеком, для продуцирования антител или слитых белков in vivo , включая продуцирование в небольших масштабах, а также для коммерческого крупномасштабного производства антитела или слитого белка.

[00469] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, могут использоваться как в ветеринарии, так и в медицине. Подходящие субъекты для способов доставки генов ex vivo, как описано выше, включают как птиц (например, кур, уток, гусей, перепелов, индеек и фазанов), так и млекопитающих (например, людей, крупный рогатый скот, овец, козьих, лошадиных, кошачьих, собачьих и зайцеобразных), причем млекопитающие являются предпочтительными. Люди являются наиболее предпочтительными субъектами. Люди включают новорожденных, детей, подростков и взрослых.

D. Диапазоны доз

[00470] В данном документе предлагаются способы лечения, включающие введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей зкДНК-вектор, кодирующий антитело или слитый белок, как описано в данном документе. Как будет понятно специалисту в данной области, термин «эффективное количество» относится к такому количеству вводимой композиции зкДНК, которое приводит к экспрессии антитела или слитого белка в «терапевтически эффективном количестве» для лечения заболевания.

[00471] Анализы in vivo и/или in vitro можно, необязательно, использовать для определения оптимальных диапазонов дозировки для применения. Точная доза для использования в композиции будет также зависеть от пути введения и серьезности состояния и должна определяться по решению специалиста в данной области техники и с учетом обстоятельств каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на животных моделях.

[00472] зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, вводят в количествах, достаточных для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, описанные выше в разделе «Введение», такие как прямая доставка в выбранный орган (например, интрапортальная доставка в печень), пероральный, ингаляционный (включая интраназальную и интратрахеальную доставку), внутриглазный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный, внутриопухолевый и другие пути парентерального (parental) введения. Пути введения могут быть объединены, при желании.

[00473] Доза количества зкДНК-векторов для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, необходимого для достижения конкретного «терапевтического эффекта», будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничений: путь введения нуклеиновой кислоты, уровень экспрессии гена или РНК, необходимый для достижения терапевтического эффекта, конкретного заболевания или расстройства, лечение которого проводится, и стабильности гена (генов), продукта (продуктов) РНК или итогового экспрессируемого белка (белков). Специалист в данной области может легко определить диапазон доз зкДНК-вектора для лечения пациента с конкретным заболеванием или расстройством на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов, которые хорошо известны в данной области.

[00474] Режим дозирования может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, олигонуклеотид можно вводить неоднократно, например, ежедневно может вводиться несколько доз, или доза может быть пропорционально снижена с учетом диктуемой терапевтической ситуацией необходимости. Специалист в данной области техники легко сможет определить подходящие дозы и схемы введения олигонуклеотидов по данному изобретению, как для введения в клетки, так и для введения субъектам.

[00475] «Терапевтически эффективная доза» будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен с помощью клинических испытаний, и будет зависеть от конкретного применения (нервные клетки потребуют очень небольших количеств, в то время как системные инъекции потребуют больших количеств). Например, для прямой инъекции in vivo в скелетную или сердечную мышцу человека величина терапевтически эффективной дозы будет составлять от примерно 1 мкг до 100 г зкДНК-вектора. Если для доставки зкДНК-вектора используются экзосомы или микрочастицы, то терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально, но ожидается, что она должна доставить от 1 мкг до примерно 100 г вектора. Кроме того, терапевтически эффективная доза представляет собой такое количество зкДНК-вектора, которое экспрессирует достаточное количество трансгена для воздействия на субъекта, приводящего к уменьшению одного или нескольких симптомов заболевания, но не затрагивающего в значительной степени нецелевые области или вызывающего значительные нежелательные побочные эффекты. В одном варианте реализации «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество экспрессируемого антитела или слитого белка, достаточное для получения статистически значимого измеримого изменения экспрессии биомаркера заболевания или уменьшения данного симптома заболевания. Такие эффективные количества для композиции данного зкДНК-вектора могут быть определены в клинических испытаниях, а также в исследованиях на животных.

[00476] Составление композиций фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителей хорошо известно специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения, при использовании конкретных композиций, описанных в данном документе, в различных схемах лечения.

[00477] Для трансфекции in vitro эффективное количество зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, которое должно быть доставлено в клетки (1×10⁶ клеток) будет составлять порядка 0,1-100 мкг зкДНК-вектора, предпочтительно, от 1 до 20 мкг, и более предпочтительно - от 1 до 15 мкг или от 8 до 10 мкг. Большие по размеру зкДНК-векторы будут требовать более высоких доз. Если используются экзосомы или микрочастицы, эффективная доза in vitro может быть определена экспериментально, однако она должна обеспечивать доставку, в общем, такого же количества зкДНК-вектора.

[00478] Подходящая для лечения заболевания дозировка зкДНК-вектора, который экспрессирует антитело или слитый белок, как описано в данном документе, будет зависеть от конкретного типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на антитело, и определяется на усмотрение лечащего врача. Антитело может быть введено пациенту за один раз или на протяжении серии процедур. В данном документе предусматриваются различные схемы дозирования, включая, без ограничений, разовое или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

[00479] В зависимости от типа и тяжести заболевания зкДНК-вектор вводят в таком количестве, чтобы кодируемое антитело или слитый белок экспрессировались в количестве от примерно 0,3 мг/кг до 100 мг/кг (например, 15-100 мг/кг, или с любой дозировкой в указанном диапазоне), посредством одного или нескольких отдельных сеансов введения, или непрерывной инфузией. Одной типичной суточной дозы зкДНК-вектора достаточно, чтобы вызвать экспрессию кодируемого антитела или слитого белка в диапазоне значений от примерно 15 мг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. Одна примерная доза зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для того, чтобы привести к экспрессии кодируемого антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в диапазоне от примерно 10 мг/кг до примерно 50 мг/кг. Таким образом, пациенту может быть введена одна или несколько доз зкДНК-вектора в количестве, достаточном для того, чтобы привести к экспрессии кодируемого антитела или слитого белка, составляющей примерно 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 35 мг/кг, 40 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг, 70 мг/кг, 80 мг/кг, 90 мг/кг или 100 мг/кг (или любую их комбинацию). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят в количестве, достаточном для экспрессии кодируемого антитела или слитого белка с общей дозой в диапазоне от 50 мг до 2500 мг. Примерная доза зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для того, чтобы привести к общей экспрессии кодируемого антитела или слитого белка, составляющей примерно 50 мг, примерно 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, примерно 500 мг, примерно 600 мг. примерно 700 мг, примерно 720 мг, примерно 1000 мг, примерно 1050 мг, примерно 1100 мг, примерно 1200 мг, примерно 1300 мг, примерно 1400 мг, примерно 1500 мг, примерно 1600 мг, примерно 1700 мг, примерно 1800 мг, примерно 1900 мг, примерно 2000 мг, примерно 2050 мг, примерно 2100 мг, примерно 2200 мг, примерно 2300 мг, примерно 2400 мг или примерно 2500 мг (или любую их комбинацию). Поскольку экспрессию антитела или слитого белка из зкДНК-вектора можно точно контролировать с помощью регуляторных переключателей, как описано в данном документе или, альтернативно, путем многократного введения субъекту доз зкДНК-вектора, экспрессию антитела или слитого белка из зкДНК-вектора можно контролировать таким образом, чтобы дозы антитела или слитого белка, экспрессируемого из зкДНК-вектора, можно было вводить периодически, например, раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца или раз в шесть месяцев. Результативность такой терапии можно контролировать с помощью традиционных методов и анализов.

[00480] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят в количестве, достаточном для того, чтобы привести к экспрессии кодируемого антитела или слитого белка в дозе 15 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг, 45 мг/кг, 50 мг/кг, 60 мг/кг или фиксированная доза, например, 300 мг, 500 мг, 700 мг, 800 мг или выше. В некоторых вариантах реализации экспрессию антитела или слитого белка из зкДНК-вектора контролируют таким образом, чтобы антитело или слитый белок экспрессировались каждый день, через день, каждую неделю, каждые 2 недели или каждые 4 недели, на протяжении некоторого периода времени. В некоторых вариантах реализации экспрессию антитела или слитого белка из зкДНК-вектора контролируют таким образом, что антитело или слитый белок экспрессировались каждые 2 недели или каждые 4 недели, на протяжении некоторого периода времени. В некоторых вариантах реализации период времени составляет 6 месяцев, один год, восемнадцать месяцев, два года, пять лет, десять лет, 15 лет, 20 лет или продолжительность жизни пациента.

[00481] Лечение может включать введение одной дозы или многократных доз. В некоторых вариантах реализации субъекту можно вводить более одной дозы; фактически, при необходимости можно вводить многократные дозы, потому что зкДНК-вектор не вызывает иммунного ответа хозяина против капсида из-за отсутствия вирусного капсида. Таким образом, специалист в данной области может легко определить подходящее количество доз. Количество вводимых доз может составлять, например, порядка 1-100, предпочтительно, 2-20 доз.

[00482] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, укажем, что отсутствие типичного противовирусного иммунного ответа, вызванного введением зкДНК-вектора, как описано в данном изобретении (т.е. отсутствие капсидных компонентов), позволяет неоднократно вводить хозяину зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков. В некоторых вариантах реализации число введений гетерологичной нуклеиновой кислоты субъекту находится в диапазоне от 2 до 10 раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор доставляется субъекту более 10 раз.

[00483] В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, вводят субъекту не более одного раза в течение календарного дня (например, за 24-часовой период). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за 2, 3, 4, 5, 6 или 7 календарных дней. В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, вводят субъекту не чаще одного раза за календарную неделю (например, 7 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за две недели (например, один раз в течение двух календарных недель). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за календарный месяц (например, один раз за 30 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за шесть календарных месяцев. В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в течение календарного года (например, за 365 дней, или 366 дней в високосном году).

[00484] В конкретных вариантах реализации более одного введения (например, два, три, четыре или более введений) зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для достижения желаемого уровня экспрессии гена на протяжении различных периодов времени, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.д.

[00485] В некоторых вариантах реализации терапевтическое антитело, кодируемое зкДНК-вектором, как описано в данном документе, может регулироваться с помощью регуляторного переключателя, индуцибельного или репрессируемого промотора, таким образом, чтобы оно экспрессировалось у субъекта в течение по меньшей мере 1 часа, по меньшей мере 2 часов, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 72 часов, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев/одного года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 15 лет, по меньшей мере 20 лет, по меньшей мере 30 лет, по меньшей мере 40 лет, по меньшей мере 50 лет или более. В одном варианте реализации экспрессия может быть достигнута путем повторного введения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, через заранее определенные или желательные интервалы времени. Альтернативно, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может дополнительно содержать компоненты системы редактирования генов (например, CRISPR/Cas, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции), эндонуклеазы цинкового пальца и т.д.), чтобы обеспечить возможность вставки одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, для практически постоянного лечения или «исцеления» заболевания. Такие зкДНК-векторы, содержащие компоненты редактирования генов, раскрыты в международной заявке PCT/US18/64242 и могут включать 5'- и 3'-гомологичные плечи (например, SEQ ID NO: 151-154, или последовательности с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70% или 80% гомологии с ними) для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, в области безопасной гавани, такие как ген альбумина или ген CCR5, но не включая их.

[00486] Продолжительность лечения зависит от клинического прогресса субъекта и от восприимчивости к терапии. Предусматривается постоянное введение относительно низких поддерживающих доз после начальной более высокой терапевтической дозы.

E. Единичные лекарственные формы

[00487] В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, могут быть удобно представлены в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма, как правило, будет адаптирована к одному или нескольким конкретным путям введения фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения путем ингаляции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью генератора аэрозоля. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения, для буккального введения или для сублингвального введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, обычно представлено таким количеством указанного соединения, которое создает терапевтический эффект.

X. Способы лечения

[00488] Описанная в данном документе технология также демонстрирует способы получения, а также способы применения раскрытых зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков различными способами, включая, например, ex vivo, ex situ, in vitro и in vivo применения, методологии, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии.

[00489] В одном варианте реализации терапевтическое антитело, экспрессируемое из зкДНК-вектора, как описано в данном документе, является функциональным для лечения заболевания. В предпочтительном варианте реализации терапевтическое антитело не вызывает реакции иммунной системы, если это не является желательным.

[00490] В данном документе предложен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (например, мышечную клетку или ткань, или другой тип пораженных клеток) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен в присутствии носителя, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в данном документе, полезные для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, может содержать желаемую последовательность ДНК антитела или антигенсвязывающего фрагмента, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого антитела или антигенсвязывающего фрагмента, кодируемого экзогенной последовательностью ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно вводить любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах данного документа.

[00491] В данном документе раскрыты композиции и составы зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, которые включают один или несколько зкДНК-векторов по данному изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми буферами, разбавителями или эксципиентами. Такие композиции могут быть включены в один или несколько диагностических или терапевтических наборов для диагностики, профилактики, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, поражения, расстройства, травмы или нарушения функции. В одном аспекте заболевание, поражение, расстройство, травма или нарушение функции представляют собой заболевание, поражение, расстройство, травму или нарушение функции у человека.

[00492] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ введения нуждающемуся в этом субъекту диагностически или терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, причем способ включает обеспечение для клетки, ткани или органа нуждающегося в этом субъекта некоторого количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе; и в течение времени, обеспечивающего возможность эффективной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, обеспечивая тем самым для субъекта диагностически или терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемых зкДНК-вектором. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00493] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ диагностики, предотвращения, лечения или облегчения по меньшей мере одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В общем, способ включает, по меньшей мере, стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких раскрытых зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, в количестве и в течение времени, достаточных для диагностики, предотвращения, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В таком варианте реализации может проводиться оценка субъекта на эффективность антитела/антигенсвязывающего фрагмента или, альтернативно, на обнаружение антигена или антигенсвязывающего фрагмента в конкретном белке (protien) или участке ткани (включая клеточное и субклеточное местоположение) у субъекта. По существу, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может использоваться в качестве in vivo диагностического инструмента, например, для обнаружения рака или других показаний. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.

[00494] Другим аспектом является использование зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, в качестве инструмента для лечения или ослабления одного или нескольких симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует ряд наследственных заболеваний с известными дефектными генами, которые, как правило, делятся на два класса: состояния дефицита, обычно ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и несбалансированные состояния, в которых могут быть задействованы регуляторные или структурные белки, и которые обычно, но не всегда, наследуются доминантно. При заболеваниях с дефицитным состоянием зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может использоваться для доставки антител или слитых белков, которые нейтрализуют белок метаболического пути, приводя к увеличению экспрессии нормального гена для заместительной терапии, а также, в некоторых вариантах, для создания животных моделей заболеваний с использованием зкДНК-векторов, экспрессирующих нейтрализующие антитела или слитые белки. При несбалансированных болезненных состояниях зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, может использоваться для создания болезненного состояния в модельной системе, которая затем может быть использована для противодействия болезненному состоянию. Таким образом, зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, позволяет лечить генетические заболевания. В используемом в данном документе значении, болезненное состояние лечат путем частичного или полного устранения дефицита или дисбаланса, которые вызывают заболевание или делают его более тяжелым.

[00495] В одном варианте реализации данного изобретения предусматривается, что внутримышечная доставка трансгена для экспрессии антитела в мышце может использоваться для лечения специфических для мышц заболеваний или, альтернативно, в качестве депо для продуцирования белка для воздействия терапевтического продукта трансгена на удаленном участке. Описанные в данном документе зкДНК-векторы могут быть использованы для экспрессии антитела или слитого белка в мышце. В некоторых вариантах реализации продукт гена увеличивает экспрессию и/или активность целевого гена. В других вариантах реализации продукт гена уменьшает экспрессию и/или активность целевого гена.

А. Клетки-хозяева:

[00496] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, доставляет трансген антитела или антигенсвязывающего фрагмента в клетку-хозяина по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека, включая, например, клетки крови, стволовые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD34⁺, клетки печени, раковые клетки, сосудистые клетки, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, глазные клетки или клетки сетчатки, эпителиальные или эндотелиальные клетки, дендритные клетки, фибробласты или любые другие клетки, полученные от млекопитающих, включая, без ограничений, гепатоциты (т.е. клетки печени), клетки легкого, клетки сердца, клетки поджелудочной железы, клетки кишечника, диафрагмальные клетки, почечные клетки (т.е. клетки почек), нервные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, или любой одной или нескольких выбранных тканей субъекта, для которого предусматривается проведение генной терапии. В одном аспекте клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека.

[00497] Данное изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как указано выше, включающим зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе. Таким образом, можно использовать несколько клеток-хозяев в зависимости от цели, как будет понятно специалисту в данной области. Конструкт или зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, включающий донорную последовательность, вводят в клетку-хозяина так, чтобы донорная последовательность поддерживалась как хромосомный интегрант, как описано ранее. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, возникающих во время репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от донорной последовательности и ее источника.

[00498] Клетка-хозяин также может быть эукариотической, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растения или грибка.В одном варианте реализации клетка-хозяин представляет собой клетку человека (например, первичную клетку, стволовую клетку или иммортализованную клеточную линию). В некоторых вариантах клетке-хозяина может быть введен ex vivo зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, с последующей доставкой субъекту после события генной терапии. Клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, например, соматической клеткой или стволовой клеткой, индуцированной плюрипотентной стволовой клеткой или клеткой крови, например, Т-клеткой или В-клеткой, или клеткой костного мозга. В определенных вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой аллогенную клетку. Например, Т-клеточная геномная инженерия полезна для иммунотерапий рака, модуляции заболевания, такой как терапия ВИЧ (например, нокаут рецептора, такого как CXCR4 и CCR5), и терапий иммунодефицита. Мишенями иммунотерапии могут быть рецепторы ГКГ (главный комплекс гистосовместимости) на В-клетках. В некоторых вариантах реализации генно-модифицированные клетки-хозяева, например, стволовые клетки костного мозга, например, клетки CD34⁺, или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, могут быть трансплантированы пациенту обратно для экспрессии терапевтического белка.

C. Дополнительные заболевания для проведения генной терапии:

[00499] Как правило, зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для доставки любого антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с приведенным выше описанием для лечения, предотвращения или ослабления симптомов, связанных с любым расстройством, связанным с аберрантной (aborant) экспрессией белка или экспрессией гена у субъекта. Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, без ограничений: муковисцидоз (и другие заболевания легкого), гемофилию A, гемофилию B, талассемию, анемию и другие расстройства крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболические дефекты, дегенеративные заболевания сетчатки (и другие заболевания глаз), митохондриопатии (например, наследственную оптическую нейропатию Лебера (LHON), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, плече-лопаточно-лицевую миопатию (FSHD) и кардиомиопатии), заболевания солидных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца); и т.п. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть выгодно использованы при лечении индивидуумов с метаболическими нарушениями (например, дефицитом орнитинтранскарбамилазы).

[00500] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для лечения, ослабления и/или предотвращения заболевания или расстройства, вызванного мутацией в гене или продукте гена. Типичные примеры заболеваний или расстройств, лечение которых может проводиться с помощью зкДНК-векторов, включают, без ограничений, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (ФКУ), болезнь накопления гликогена); болезни или расстройства цикла мочевины (например, недостаточность орнитинтранскарбамилазы (ОТК)); болезни или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Хантера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (ПСВХ); заболевания или расстройства крови (например, гемофилию (A и B), талассемию и анемию); раковые заболевания и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, муковисцидоз).

[00501] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для доставки антитела или слитого белка к скелетной, сердечной или диафрагмальной мышце, для продуцирования антитела или слитого белка для секреции и циркуляции в крови или для системной доставки в другие ткани для лечения, облегчения и/или предотвращения расстройства (например, метаболического расстройства, такого как диабет (например, инсулина), гемофилии (например, фактора VIII), мукополисахаридозного расстройства (например, синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Хантера, синдрома Санфилиппо A, B, C, D, синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами и т.п.) или расстройства лизосомального накопления (такого как болезнь Гоше [глюкоцереброзидаза], болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза] или болезнь Фабри [альфа-галактозидаза A]) или расстройства накопления гликогена (такого как болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза]). Другие подходящие белки для лечения, облегчения и/или предотвращения метаболических нарушений описаны выше.

[00502] В других вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для доставки антитела или антигенсвязывающего фрагмента в способе лечения, облегчения и/или предотвращения метаболического нарушения у нуждающегося в этом субъекта. Иллюстративные примеры метаболических нарушений и антитела или антигенсвязывающего фрагмента описаны в данном документе. Необязательно, полипептид секретируется (например, полипептид, который является секретируемым полипептидом в его нативном состоянии, или который был сконструирован так, чтобы секретироваться, например, посредством функциональной ассоциации с секреторной сигнальной последовательностью, как известно в данной области).

[00503] зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно вводить в легкие субъекта любым подходящим способом, необязательно, путем введения аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, содержащих зкДНК-векторы, которую субъект вдыхает. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли с жидкими частицами, содержащими зкДНК-векторы, могут быть получены любыми подходящими способами, например, с помощью пневматического аэрозольного небулайзера или ультразвукового небулайзера, как известно специалистам в данной области. См., например, патент США № 4501729. Аэрозоли с твердыми частицами, содержащими зкДНК-векторы, также могут быть получены с помощью любого генератора медикаментозных аэрозолей с твердыми частицами способами, известными в фармацевтике.

[00504] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно вводить в ткани ЦНС (например, в головной мозг, глаз). В конкретных вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно вводить для лечения, ослабления или предотвращения заболеваний ЦНС, включая генетические нарушения, нейродегенеративные нарушения, психические расстройства и опухоли. Иллюстративные примеры заболеваний ЦНС включают, без ограничений, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, болезнь Лея, болезнь Рефсума, синдром Туретта, первичный боковой склероз, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь Пика, мышечную дистрофию, рассеянный склероз, тяжёлую псевдопаралитическую миастению, болезнь Бинсвангера, травму вследствие повреждения спинного мозга или головы, болезнь Тея-Сакса, болезнь Леша-Нихана, эпилепсию, церебральные инфаркты, нарушения психики, в том числе расстройства настроения (например, депрессию, биполярное аффективное расстройство, устойчивое аффективное расстройство, вторичное расстройство настроения), шизофрению, лекарственную зависимость (например, алкоголизм и зависимость от других веществ), неврозы (например, тревожность, обсессивное расстройство, соматоформное расстройство, диссоциативное расстройство, состояние горя, послеродовую депрессию), психоз (например, галлюцинации и бред), деменцию, паранойю, синдром дефицита внимания, психосексуальные расстройства, нарушения сна, связанные с болью нарушения, нарушения, связанные с питанием или массой тела (например, ожирение, кахексию, нервную анорексию и булимию), и раковые заболевания и опухоли ЦНС (например, опухоли гипофиза).

[00505] Офтальмологические расстройства, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, включают офтальмологические расстройства, затрагивающие сетчатку, задний путь и зрительный нерв (например, пигментный ретинит, диабетическую ретинопатию и другие дегенеративные заболевания сетчатки, увеит, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому). Многие офтальмологические заболевания и расстройства связаны с одним или несколькими из трех типов показаний: (1) ангиогенез, (2) воспаление и (3) дегенерация. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно использовать для доставки антиангиогенных факторов; противовоспалительных факторов; факторов, которые замедляют дегенерацию клеток, способствуют сохранению клеток или способствуют росту клеток, и комбинаций вышеперечисленного. Например, диабетическая ретинопатия характеризуется ангиогенезом. Диабетическую ретинопатию можно лечить путем доставки одного или нескольких антиангиогенных антител или слитых белков либо внутриглазно (например, в стекловидное тело), либо периокулярно (например, в субтеноново пространство). Дополнительные заболевания глаз, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по изобретению, включают географическую атрофию, сосудистую или «влажную» макулярную дегенерацию, болезнь Штаргардта, врожденный амавроз Лебера (LCA), синдром Ушера, эластическую псевдоксантому (PXE), Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP), Х-сцепленный ретиношизис (XLRS), хороидеремию, врожденную нейропатию зрительного нерва Лебера (LHON), ахроматопсию, палочко-колбочковую дистрофию, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, диабетический макулярный отек, и раковые заболевания и опухоли глаз.

[00506] В некоторых вариантах реализации воспалительные глазные заболевания или расстройства (например, увеит) можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе. Одно или несколько противовоспалительных антител или слитых белков могут быть экспрессированы посредством внутриглазного (например, в стекловидное тело или переднюю камеру) введения зкДНК-вектора, как описано в данном документе.

[00507] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, может кодировать антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связаны с трансгеном, кодирующим репортерный полипептид (например, фермент, такой как зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза). В некоторых вариантах реализации трансген, который кодирует репортерный белок, полезный для экспериментальных или диагностических целей, выбирают из любого из: β-лактамазы, β-галактозидазы (LacZ), щелочной фосфатазы, тимидинкиназы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), люциферазы и других, хорошо известных в данной области. В некоторых аспектах зкДНК-векторы, экспрессирующие антитело или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с репортерным полипептидом, могут использоваться в диагностических целях или в качестве маркеров активности зкДНК-вектора у субъекта, которому они вводятся.

[00508] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, может экспрессировать антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с иммуногенным полипептидом или иммуногеном у субъекта. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с любым представляющим интерес иммуногеном, известным в данной области, включая, без ограничений, иммуногены из вируса иммунодефицита человека, вируса гриппа, белков gag, опухолевых антигенов, раковых антигенов, бактериальных антигенов, вирусных антигенов и т.п.

D. Тестирование на успешную экспрессию генов с использованием зкДНК-вектора

[00509] Анализы, хорошо известные в данной области, могут быть использованы для проверки эффективности доставки генов антитела или антигенсвязывающего фрагмента зкДНК-вектором и могут проводиться на моделях как in vitro, так и in vivo. Специалист в данной области может оценить уровни экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента с помощью зкДНК путем измерения уровней мРНК и белка антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, методами ПЦР с обратной транскрипцией, вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА)). В одном варианте реализации зкДНК содержит репортерный белок, который можно использовать для оценки экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента, например, путем изучения экспрессии репортерного белка методом флуоресцентной микроскопии или с помощью устройства для считывания люминесцентных планшетов. Для применений in vivo, анализы функции белка можно использовать для проверки функциональности данного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, чтобы определить, успешно ли прошла экспрессия гена. Специалист сможет определить лучший тест для измерения функциональности антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемого зкДНК-вектором, in vitro или in vivo.

[00510] В данном документе предусматривается, что эффекты генной экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента из зкДНК-вектора в клетке или субъекте могут продолжаться на протяжении по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере четырех месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 20 лет, или могут быть постоянными.

[00511] В некоторых вариантах реализации антитело или антигенсвязывающий фрагмент в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или зкДНК-векторе, описанном в данном документе, могут быть оптимизированы по кодонам для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «кодон-оптимизированный» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных, например, мыши или человека (например, гуманизированной), путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значительного числа кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах данного позвоночного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и пользовательского синтеза генов Gene Forge® фирмы Aptagen (Aptagen, Inc.) или другой общедоступной базы данных.

E. Определение эффективности путем оценки экспрессии антител из зкДНК-вектора

[00512] По существу любой метод определения экспрессии белка, известный в данной области, можно использовать для анализа экспрессии желаемого антитела из зкДНК-вектора. Неограничивающие примеры таких способов/анализов включают иммуноферментный анализ (ИФА), аффинный ИФА, метод иммуноферментных пятен (ELISPOT), серийное разбавление, проточную цитометрию, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализ кинетического исключения, масс-спектрометрию, вестерн-блоттиннг, иммунопреципитацию и ПЦР.

[00513] Для оценки экспрессии антител in vivo, у субъекта может быть получен биологический образец для анализа. Типичные биологические образцы включают образец биологической жидкости, образец жидкости организма, кровь (включая цельную кровь), сыворотку, плазму, мочу, слюну, образец биопсии и/или ткани и т.д. Биологический образец или образец ткани может также относиться к образцу ткани или жидкости, полученному от индивидуума, включая, без ограничений, биопсию опухоли, стул, спинномозговую жидкость, плевральную жидкость, аспираты сосков, лимфатическую жидкость, внешние участки кожи, дыхательные пути, кишечный тракт и мочеполовые пути, слезы, слюну, грудное молоко, клетки (включая, без ограничений, клетки крови), опухоли, органы, а также образцы компонентов in vitro клеточных культур. Этот термин также включает смесь вышеуказанных образцов. Термин «образец» также включает необработанные или предварительно обработанные (или предварительно процессированные) биологические образцы. В некоторых вариантах реализации образец, используемый для анализов и способов, описанных в данном документе, содержит образец сыворотки, взятый у субъекта, подлежащего тестированию.

F. Определение эффективности экспрессированного антитела по клиническим параметрам.

[00514] Эффективность данного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемого зкДНК-вектором, для данного заболевания (т.е. функциональная экспрессия), такого как ревматоидный артрит или рак (включая, без ограничений, рак молочной железы, меланому и т.д.), может быть определена опытным врачом. Тем не менее, лечение считается «эффективным лечением», как этот термин используется в данном документе, если какой-либо один или все признаки или симптомы рака изменяются в лучшую сторону, или если другие клинически принятые симптомы или маркеры заболевания являются улучшаются или ослабевают, например, по меньшей мере на 10% после лечения зкДНК-вектором, кодирующим терапевтическое антитело, как описано в данном документе. Эффективность также может быть измерена по отсутствию у индивидуума ухудшения, которое оценивается по стабилизации заболевания или по потребности в медицинском вмешательстве (т.е. прогрессирование заболевания прекращается или, по крайней мере, замедляется). Способы измерения этих показателей известны специалистам в данной области техники и/или описаны в данном документе. Лечение включает любое лечение заболевания у индивидуума или животного (некоторые неограничивающие примеры включают человека или млекопитающее) и включает: (1) ингибирование заболевания, например, прекращение или замедление прогрессирования заболевания (например, артрита, рака); или (2) облегчение заболевания, например, вызываемое регрессом симптомов; и (3) предотвращение или снижение вероятности развития заболевания, или предотвращение вторичных заболеваний/расстройств, связанных с указанным заболеванием (например, деформации кисти вследствие ревматоидного артрита или метастазирование рака).

[00515] Эффективное количество для лечения заболевания означает такое количество, которое, при введении нуждающемуся в этом млекопитающему, является достаточным для обеспечения эффективного лечения, как этот термин определен в данном документе, этого заболевания. Эффективность агента может быть определена путем оценки физических показателей, которые являются специфическими для данного заболевания. Например, физические показатели для рака включают, без ограничений, боль, размер опухоли, скорость роста опухоли, количество кровяных клеток и т.д.

XI. Различные применения зкДНК-векторов, экспрессирующих антитела или слитые белки

[00516] Как раскрыто в данном документе, композиции и зкДНК-векторы для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, можно использовать для экспрессии антитела или слитого белка для ряда целей. В одном варианте реализации зкДНК-вектор, экспрессирующий антитело или слитый белок, можно использовать для создания соматической модели трансгенного животного, несущей трансген, например, для изучения функции мишени антитела или слитого белка. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, экспрессирующий антитело или слитый белок, полезен для лечения, профилактики или облегчения болезненных состояний или расстройств у субъекта-млекопитающего.

[00517] В некоторых вариантах реализации антитело или слитый белок можно экспрессировать из зкДНК-вектора у субъекта в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией, повышенной активностью продукта гена или неадекватной активацией гена. В таком варианте реализации экспрессированное антитело или слитый белок может представлять собой блокирующее или нейтрализующее антитело или слитый белок, которые вызывают ингибирование или подавление или иное снижение активности белка или генного продукта, который является мишенью, или с которым антитело или слитый белок специфически связывается.

[00518] В некоторых вариантах реализации антитело или слитый белок можно экспрессировать из зкДНК-вектора у субъекта в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или нарушением функции белка. Например, экспрессированное антитело или слитый белок представляет собой активирующее антитело или слитый белок и может увеличивать активность или функцию белка с пониженной экспрессией и/или активностью у субъекта, например, путем агонизации белка или ингибирования репрессора белка.

[00519] Специалисту в данной области должно быть понятно, что трансген может не быть открытой рамкой считывания гена, который сам должен транскрибироваться; вместо этого, он может быть областью промотора или областью репрессора гена-мишени, и зкДНК-вектор может модифицировать такую область, приводя в результате к модуляции экспрессии представляющего интерес гена.

[00520] Композиции и зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно использовать для доставки антитела или антигенсвязывающего фрагмента для различных целей, как описано выше.

[00521] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует одно или несколько антител или слитых белков, которые полезны для лечения, облегчения или предотвращения болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Антитело или слитый белок, экспрессируемый зкДНК-вектором, вводят пациенту в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с аномальной последовательностью генов, что может приводить к любому одному или нескольким из следующего: повышенной экспрессии белка, чрезмерной активности белка, сниженной экспрессии, отсутствию экспрессии или дисфункции целевого гена или белка.

[00522] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, предназначены для использования в способах диагностики и скрининга, причем антитело или антигенсвязывающий фрагмент транзиентно или стабильно экспрессируются в системе клеточной культуры или, альтернативно, трансгенной животной модели.

[00523] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ трансдукции популяции клеток млекопитающих с помощью зкДНК-вектора для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе. В общем, способ включает по меньшей мере стадию введения, в одну или несколько клеток популяции, композиции, содержащей эффективное количество одного или нескольких зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе.

[00524] Кроме того, данное изобретение относится к композициям, а также к терапевтическим и/или диагностическим наборам, которые включают один или несколько раскрытых зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, или композиции зкДНК, составленные с одним или несколькими дополнительными ингредиентами, или приготовленные в соответствии с одной или несколькими инструкциями по их применению.

[00525] Клетка для введения зкДНК-вектора для продуцирования антитела или слитого белка, как описано в данном документе, может быть любого типа, включая, без ограничений, нервные клетки (включая клетки периферической и центральной нервной системы, в частности, клетки головного мозга), клетки легких, клетки сетчатки, эпителиальные клетки (например, кишечные и респираторные эпителиальные клетки), мышечные клетки, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая островковые клетки), клетки печени, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, зародышевые клетки и т.п. Альтернативно, клетка может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы, клетка может быть стволовой клеткой (например, нервной стволовой клеткой, стволовой клеткой печени). В качестве еще одной альтернативы, клетка может быть раковой или опухолевой клеткой. Кроме того, клетки могут иметь происхождение от любого вида, как указано выше.

A. зкДНК-векторы для коммерческого производства антител или слитых белков

[00526] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, можно использовать для продуцирования антител или слитых белков в коммерческих условиях, например, с использованием биореактора или для продуцирования в желаемом хозяине.

[00527] Например, клетки, содержащие зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, можно использовать для коммерческого производства антител или слитых белков, например, в качестве источника клеток для мелкого или крупномасштабного биопроизводства антител или слитых белков. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-вектор для продуцирования антител или слитых белков, как описано в данном документе, вводят в клетки субъекта-хозяина, не являющегося человеком, для продуцирования антител или слитых белков in vivo , включая продуцирование в небольших масштабах, а также для коммерческого крупномасштабного производства антитела или слитого белка. Например, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, можно использовать для продуцирования антител или слитых белков in vivo , например, у крыс, мышей, лошадей, коз и т.д.,с использованием асцитных опухолей.

[00528] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, кодирующие антитело или слитый белок, можно использовать, например, для получения химерного рецептора антигена (CAR), который затем можно использовать для генерирования T-клеток с CAR. CAR представляют собой слитые белки выбранного одноцепочечного вариабельного фрагмента из специфического моноклонального антитела и одного или нескольких внутриклеточных сигнальных доменов рецептора Т-клеток. Такая генетическая модификация Т-клеток может проводиться с использованием зкДНК-векторов, как описано в данном документе. Таким образом, в данном документе конкретно предусматривается, что зкДНК-вектор, экспрессирующий химерный рецептор антигена, можно вводить, например, в Т-клетку ex vivo для создания Т-клетки с CAR для лечения раковых заболеваний, таких как, без ограничений, лейкоз, рак молочной железы. рак легкого , рак яичников и т.п.

B. Производство и очистка антитела или слитого белка

[00529] Описанные в данном документе зкДНК-векторы предназначены для использования для продуцирования антител или слитых белков in vitro либо in vivo. Антитела или слитые белки, полученные таким образом, могут быть выделены, протестированы на желаемую функцию и очищены для дальнейшего использования в исследованиях или в качестве терапевтического лечения. Каждая система производства антител или слитых белков имеет свои преимущества/недостатки. Хотя антитела или слитые белки, продуцируемые in vitro, могут быть легко очищены и могут продуцировать антитела или слитые белки за короткое время, антитела или слитые белки, продуцируемые in vivo, могут иметь посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование.

[00530] Обычные методы получения антител, такие как иммунизация и дисплейная библиотека (например, фаговый дисплей), могут быть адаптированы для кодирования антитела или компонента антитела путем использования зкДНК вместо традиционного вектора (например, плазмидного, вирусного и т.д.). Кроме того, зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут заменять (can be replace) традиционные векторы в биореакторах, биореакторных методах получения, или при продуцировании антител в желаемом хозяине, клетке, ткани или органе. Такие методики известны специалистам в данной области техники и не описываются подробно в данном документе.

[00531] Описанные в данном документе зкДНК-векторы могут быть использованы для экспрессии желаемого антитела в гибридомной клеточной линии. Способы получения линий гибридомных клеток известны в данной области. Для крупномасштабного производства антител клетки гибридомы можно выращивать либо в статической или перемешиваемой суспензионной культуре клеток, в культуре с роллерными флаконами, либо в биореакторе (например, биореакторе с полыми волокнами). Для in vitro получения антител можно также использовать мембранные системы культивирования, в которых клеточная культура отделена от питательных веществ посредством специальной газовой мембраны, которая усиливает перенос кислорода и газа. Альтернативно, предусматривается матричная культуральная система, в которой клетки гибридомы иммобилизованы на матрице и постоянно снабжаются свежей культуральной средой.

[00532] Антитела, продуцируемые с использованием зкДНК-векторов, могут быть очищены любым методом, известным специалистам в данной области, например, ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией, осаждением или электрофорезом.

[00533] Антитело, продуцируемое описанными в данном документе способами, и его композиции могут быть протестированы на связывание с желаемым белком-мишенью.

XIII. Различные другие варианты реализации

[00534] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих пунктов:

[00535] 1. ДНК-вектор, содержащий по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один его трансген, функционально связанный с промотором, расположенным между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ, причем ITR могут необязательно быть одинаковыми или разными ITR, и при этом они являются разными ITR, один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения ААВ и сайт связывания Rep, и один из ITR, содержит делецию, вставку или замену относительно другого ITR; причем трансген представляет собой антитело или его фрагмент или слитый белок; и при этом ДНК при расщеплении рестриктазой, имеющей единственный сайт распознавания на ДНК-векторе, имеет характерные полосы линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейными и прерывистыми ДНК-контролями при анализе на неденатурирующем геле.

[00536] 2. Вектор по п. 1, в котором антитело представляет собой полноразмерное антитело или его фрагмент.

[00537] 3. Вектор по п. 2, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело, одноцепочечное антитело, фрагмент Fab' или однодоменное антитело (dAb).

[00538] 4. Вектор по любому из пп. 1-3, в котором ДНК-вектор содержит промотор, функционально связанный с первым трансгеном, кодирующим секреторную последовательность и белок тяжелой цепи, и второй промотор, функционально связанный со вторым трансгеном, кодирующим белок легкой цепи.

[00539] 5. Вектор по любому из пп. 1-4, в котором трансген кодирует слитый белок, представляющий собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

[00540] 6. Вектор по любому из пп. 1-5, в котором антитело представляет собой антитело, выбранное из Таблиц 1-5.

[00541]. Вектор по любому из пп. 1-6, в котором ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения, а Rep-связывающий сайт представляет собого ITR ААВ дикого типа, или в котором два ITR являются симметричными или по существу симметричными, или в которых два ITR являются асимметричными, или в котором два ITR выбирают из любых, перечисленных в Таблицах 7, 9A, 9B и 10.

[00542] 8. Вектор по п. 1, в котором антитело представляет собой адуканумаб.

[00543] 9. Вектор по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело.

[00544] 10. Вектор по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело представляет собой антитело IgG, IgA, IgD, IgM или IgE.

[00545] 11. Способ экспрессии антитела в клетке или ее популяции, включающий введение в клетку или ее популяцию эффективного количества ДНК-вектора по пп. 1-10 и культивирование клетки или ее популяции в условиях, необходимых для экспрессии антитела в клетке.

[00546] 12. Способ по п. 11, в котором ДНК-вектор или зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[00547] 13. Способ по п. 11 или п. 12, в котором антитело или его фрагмент секретируется из клетки.

[00548] 14. Способ по любому из пп. 11-13, в котором антитело или его фрагмент удерживаются внутриклеточно в виде интратела.

[00549] 15. Способ по любому из пп. 11-14, в котором клетка представляет собой клетку млекопитающего.

[00550] 16. Способ по п. 15, в котором клетка представляет собой клетку человека.

[00551] 17. Способ по п. 15, в котором антитело выделяют из клетки и очищают.

[00552] 18. Способ доставки терапевтического антитела субъекту, включающий: введение субъекту композиции, содержащей ДНК-вектор по пп. 1-10.

[00553] 19. Способ лечения заболевания у субъекта, включающий: введение субъекту композиции, содержащей зкДНК-вектор, по пп. 1-10, приводящее тем самым к экспрессии терапевтического антитела у субъекта и лечению заболевания.

[00554] 20. Способ по п. 18 или п. 19, в котором зкДНК-вектор вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[00555] 21. Способ по любому из пп. 18-20, в котором терапевтическое антитело секретируется из клетки, в которой оно экспрессировалось.

[00556] 22. Способ по любому из пп. 18-22, в котором терапевтическое антитело удерживается в клетке, в которой оно экспрессировалось.

[00557] 23. Способ по любому из пп. 11-17, в котором клетку или ее популяцию культивируют в биореакторе.

[00558] 24. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 1-10 для применения при лечении заболевания у субъекта.

[00559] 25. Применение композиции, содержащей вектор по любому из пп. 1-10, для лечения заболевания у субъекта.

[00560] 26. Применение композиции, содержащей вектор по любому из пп. 1-10, для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания у субъекта.

ПРИМЕРЫ

[00561] Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисту в данной области должно быть понятно, что зкДНК-векторы могут быть сконструированы из любых из ITR дикого типа или модифицированных ITR, описанных в данном документе, и что следующие примеры способов могут быть использованы для конструирования и оценки активности таких зкДНК-векторов. Хотя способы проиллюстрированы конкретными зкДНК-векторами, они применимы к любому зкДНК-вектору в соответствии с описанием.

Пример 1. Конструирование зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых.

[00562] Продуцирование зкДНК-векторов с использованием матрицы полинуклеотидного конструкта описано в Примере 1 заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для получения зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. Не ограничиваясь теорией, в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ITR и экспрессионнуый конструкт, причем по меньшей мере один из ITR модифицирован относительно последовательности ITR дикого типа, реплицируется для получения зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезания («спасения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) посредством белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора.

[00563] Типичным примером способа получения зкДНК-векторов является использование зкДНК-плазмиды, как описано в данном документе. На Фиг. 1А и 1В матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ITR, так и правый модифицированный ITR, со следующими последовательностями между ITR: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) элемент посттранскрипционного ответа (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA)). Уникальные сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции (R1-R6) (показанные на Фиг. 1A и Фиг. 1B ) также были введены между всеми компонентами, чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) встраивают в сайт клонирования для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду pFastBac HT B, полученную от ThermoFisher Scientific.

[00564] Продуцирование зкДНК-бактмид:

[00565] Компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) трансформировали тестируемыми, либо контрольными плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бактерии отбирали путем скрининга с положительной селекцией на основе сине-белого скрининга в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG с антибиотиками для селекции трансформантов и поддержания бакмид и транспозазных плазмид. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, собирали и культивировали в 10 мл среды.

[00566] Рекомбинантные зкДНК-бактерии были выделены из E.coli и трансфицированы в клетки насекомых Sf9 или Sf21 с использованием FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Прилипшие клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах Т25 при 25 °С. Через четыре дня культуральную среду (содержащую вирус Р0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр 0,45 мкм, разделяя частицы инфекционного бакуловируса и клетки или клеточный дебрис.

[00567] Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21, и культивировали в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в орбитальном шейкере-инкубаторе при 130 об/мин при 25 °С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до достижения клетками диаметра 18-19 нм (от наивного диаметра 14-15 нм) и плотности ок. 4.0E+6 клеток/мл. Между 3 и 8 днями после инфицирования частицы бакуловируса P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, а затем фильтровали через фильтр 0,45 мкм.

[00568] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. Конкретнее, четыре клеточные культуры Sf9 по 20 мл при 2,5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27 °С. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также по изменению жизнеспособности клеток, каждый день в течение 4-5 дней.

[00569] «Rep-плазмида», как раскрыто на Фиг. 8А заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки, была приготовлена в экспрессионном векторе pFASTBAC^TM-Dual (ThermoFisher), содержащем либо Rep78 (SEQ ID NO: 131 или 133) и Rep52 (SEQ ID NO: 132), либо Rep68 (SEQ ID NO: 130) и Rep40 (SEQ ID NO: 129). Rep-плазмиду трансформировали в компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher)) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для образования рекомбинантных бактмид («Rep-бакмид»). Рекомбинантные бакмиды отобраны путем положительной селекции, которая включала сине-белый скрининг в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селекционной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне Луриа-Бертани (LB)). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E. coli, и Rep-бакмиды трансфицировали в клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.

[00570] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дней и из культуры выделяли инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток Sf9 или Sf21 насекомых и культивировали в 50-500 мл среды. Между 3 и 8 днями после заражения частицы бакуловируса P1 в среде собирали путем выделения клеток либо центрифугированием, либо фильтрацией, либо с помощью другого процесса фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, четыре клеточные культуры Sf9 по 20 мл при 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также по изменению жизнеспособности клеток, каждый день в течение 4-5 дней.

[00571] Получение и характеризация зкДНК-вектора

[00572] Как указано на Фиг. 4B, питательную среду для культивирования клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, либо (2) Rep-бакуловирус, описанный выше, добавляли затем в свежую культуру клеток Sf9 (2.5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25 °С. Через 4-5 дней после коинфекции определяли диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности ок. 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и клеточные осадки собирали. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - либо воды, либо буфера. зкДНК-вектор выделяли и очищали от клеток с использованием протокола очистки Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, обработка 0,2 мг осадка клеточной массы на колонку).

[00573] Значения выхода зкДНК-векторов, полученных из клеток насекомых Sf9 и очищенных, первоначально определяли на основе УФ-поглощения при 260 нм.

[00574] Оценку зкДНК-векторов можно проводить путем идентификации методом электрофореза в агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как показано на Фиг. 4D, причем (a) наличие на денатурирующих гелях характеристических полос, мигрирующих с вдвое большим размером, по сравнению с нативными гелями, после расщепления эндонуклеазой рестрикции и проведения гель-электрофоретического анализа, и (b) присутствие мономерных и димерных (2x) полос на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала является характерным признаком присутствия зкДНК-вектора.

[00575] Структуры выделенных зкДНК-векторов были дополнительно проанализированы путем расщепления ДНК, полученной из коинфицированных клеток Sf9 (как описано в данном документе), с помощью рестрикционных эндонуклеаз, отобранных по признакам а) наличия только одного сайта расщепления в зкДНК-векторах, и b) образования фрагментов достаточно большого размера, чтобы их было четко видно при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как продемонстрировано на Фиг. 4D и 4E, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой могут различаться по размеру их продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как для зкДНК-вектора с непрерывной структурой ожидается образование фрагментов размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00576] Таким образом, для того, чтобы качественно продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ковалентно замкнутые концы, как это требуется по определению, образцы расщепляли эндонуклеазой рестрикции, идентифицированной, в контексте последовательности конкретного ДНК-вектора, как имеющей один сайт рестрикции, предпочтительно, приводящей к образованию двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза в денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК), линейная ДНК, не имеющая ковалентно замкнутых концов, будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., в то время как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), так как две цепи ДНК связаны и при разворачивании будут иметь вдвое большую длину (хотя и являются одноцепочечными). Кроме того, расщепление мономерной, димерной и n-мерной форм ДНК-векторов будет во всех случаях давать фрагменты одинакового размера из-за связывания мультимерных ДНК-векторов «конец-к-концу» (см. Фиг. 4D).

[00577] Используемая в данном документе фраза «анализ для идентификации ДНК-векторов методом электрофореза на агарозном геле в нативном геле и денатурирующих условиях» относится к анализу для оценки степени замкнутости зкДНК путем проведения расщепления эндонуклеазой рестрикции с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Далее приведен один такой пример анализа, хотя рядовому специалисту в данной области будет понятно, что возможны многие варианты этого примера, известные в данной области техники. Эндонуклеазу рестрикции выбирают так, чтобы она представляла собой фермент, создающий один разрез зкДНК-вектора, представляющего интерес, который будет генерировать продукты, имеющие длину приблизительно 1/3 и 2/3 от длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем геле. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки GE Healthcare ILUSTRA™ MicroSpin™ G-25, представляют собой некоторые из известных в данной области техники вариантов средств, используемых при расщеплении эндонуклеазами. Анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции, 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen, элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10-кратного денатурирующего раствора (10× = 0,5 М NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10-кратного раствора красителя, не забуференного, и проведение анализа вместе с маркерами молекулярного веса ДНК, полученными путем добавления 10-кратного денатурирующего раствора в эксперименте с 4 репликами, на 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и прогонки геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза, исходя из размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE или TAE и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с использованием красителя SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain фирмы Thermo Fisher (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм).

[00578] Чистоту полученного зкДНК-вектора можно оценить с помощью любого известного в данной области метода. В качестве одного неограничивающего примера способа, вклад зкДНК-плазмиды в общее УФ-поглощение образца можно оценить путем сравнения интенсивности флуоресценции зкДНК-вектора со стандартом. Например, если, на основании определения УФ-поглощения, на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, то это соответствует присутствию 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому эта полоса соответствует - например, если полный зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае будет соответствовать 0,25 мкг при введении 1,0 мкг. Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, рассчитывают затем по уравнению линейной регрессии количество полосы зкДНК-вектора, которое потом можно использовать для определения процента, приходящегося на зкДНК-вектор в общем введенном количестве, или процента чистоты.

[00579] В целях сравнения в Примере 1 описано получение зкДНК-векторов с использованием метода на основе клеток насекомых и матрицы полинуклеотидного конструкта, которое также описано в Примере 1 заявки PCT/US18/49996, включенной в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для получения зкДНК-векторов по данному изобретению в соответствии с Примером 1, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. Не ограничиваясь теорией, в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ITR и экспрессионнуый конструкт, причем по меньшей мере один из ITR модифицирован относительно последовательности ITR дикого типа, реплицируется для получения зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора происходит в две стадии: во-первых, вырезания («спасения») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.д.) посредством белков Rep и, во-вторых, Rep-опосредованной репликации вырезанного зкДНК-вектора.

[00580] Примером способа получения зкДНК-векторов с использованием клетки насекомого является его получение из зкДНК-плазмиды, как описано в данном документе. На Фиг. 1А и 1В, матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ITR, так и правый модифицированный ITR, со следующими последовательностями между ITR: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) элемент посттранскрипционного ответа (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA)). Также между всеми компонентами были введены уникальные сайты узнавания эндонуклеазы рестрикции (R1-R6) (изображенные на Фиг. 1A и Фиг. 1B), чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) встраивали в сайт клонирования для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду pFastBac HT B, полученную от ThermoFisher Scientific.

[00581] Продуцирование зкДНК-бактмид:

[00582] Компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) трансформировали тестируемыми, либо контрольными плазмидами согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид индуцировали рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac. Рекомбинантные бактерии отбирали путем скрининга с положительной селекцией на основе сине-белого скрининга в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG с антибиотиками для селекции трансформантов и поддержания бакмид и транспозазных плазмид. Белые колонии, образующиеся в результате транспозиции, которая разрушает индикаторный ген β-галактозида, собирали и культивировали в 10 мл среды.

[00583] Рекомбинантные зкДНК-бактерии были выделены из E.coli и трансфицированы в клетки насекомых Sf9 или Sf21 с использованием FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Прилипшие клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах Т25 при 25 °С. Через четыре дня культуральную среду (содержащую вирус Р0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр 0,45 мкм, разделяя частицы инфекционного бакуловируса и клетки или клеточный дебрис.

[00584] Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21, и культивировали в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в орбитальном шейкере-инкубаторе при 130 об/мин при 25 °С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до достижения клетками диаметра 18-19 нм (от наивного диаметра 14-15 нм) и плотности ок. 4.0E+6 клеток/мл. Между 3 и 8 днями после инфицирования частицы бакуловируса P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, а затем фильтровали через фильтр 0,45 мкм.

[00585] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. Конкретнее, четыре клеточные культуры Sf9 по 20 мл при 2,5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27 °С. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также по изменению жизнеспособности клеток, каждый день в течение 4-5 дней.

[00586] «Rep-плазмида» была получена в экспрессионном векторе pFASTBAC^TM-Dual (ThermoFisher), содержащем либо Rep78 (SEQ ID NO: 131 или 133) и Rep52 (SEQ ID NO: 132), либо Rep68 (SEQ ID NO: 130) и Rep40 (SEQ ID NO: 129). Rep-плазмиду трансформировали в компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher)) в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Индуцировали рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac для образования рекомбинантных бактмид («Rep-бакмид»). Рекомбинантные бакмиды отбирали путем положительной селекции, которая включала сине-белый скрининг в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селекционной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне Луриа-Бертани (LB)). Рекомбинантные бакмиды (Rep-бакмиды) выделяли из E. coli, и Rep-бакмиды трансфицировали в клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.

[00587] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дней и из культуры выделяли инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток Sf9 или Sf21 насекомых и культивировали в 50-500 мл среды. Между 3 и 8 днями после заражения частицы бакуловируса P1 в среде собирали путем выделения клеток либо центрифугированием, либо фильтрацией, либо с помощью другого процесса фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, четыре клеточные культуры Sf9 по 20 мл при 2,5×10⁶ клеток/мл обрабатывали бакуловирусом Р1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли по скорости увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также по изменению жизнеспособности клеток, каждый день в течение 4-5 дней.

[00588] Получение и характеризация зкДНК-вектора

[00589] Среду для культивирования клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, и (2) Rep-бакуловирус, описанный выше, добавляли затем в свежую культуру клеток Sf9 (2,5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25 °С. Через 4-5 дней после коинфекции определяли диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности ок. 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и клеточные осадки собирали. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - либо воды, либо буфера. зкДНК-вектор выделяли и очищали от клеток с использованием протокола очистки Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, обработка 0,2 мг осадка клеточной массы на колонку).

[00590] Значения выхода зкДНК-векторов, полученных из клеток насекомых Sf9 и очищенных, первоначально определяли на основе УФ-поглощения при 260 нм. Правильность конфигурации очищенных зкДНК-векторов с замкнутыми концами можно оценить с использованием электрофоретической методологии, описанной в Примере 5.

ПРИМЕР 2: Продуцирование синтетической зкДНК путем вырезания из молекулы двухцепочечной ДНК

[00591] Синтетический способ получения зкДНК-векторов описан в Примерах 2-6 международной заявки PCT/US19/14122, поданной 18 января 2019 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Один типичный пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода предусматривает вырезание двухцепочечной молекулы ДНК. Вкратце, зкДНК-вектор может быть получен с использованием двухцепочечного конструкта ДНК, например, см. Фиг. 7А-8Е заявки PCT/US19/14122. В некоторых вариантах реализации двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой зкДНК-плазмиду, см., например, Фиг. 6 международной патентной заявки PCT/US2018/064242, поданной 6 декабря 2018 г.).

[00592] В некоторых вариантах реализации конструкт для получения зкДНК-вектора содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе.

[00593] В иллюстративных целях в Примере 2 описано получение зкДНК-векторов в качестве примеров ДНК-векторов с замкнутыми концами, полученных с использованием этого способа. Однако, хотя зкДНК-векторы описаны в этом Примере в качестве примера, иллюстрирующего in vitro синтетические способы продуцирования для получения ДНК-вектора с замкнутыми концами путем вырезания двухцепочечного полинуклеотида, содержащего ITR и экспрессионную кассету (например, последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты), с последующим лигированием свободных 3'- и 5'-концов, как описано в данном документе, специалисту в данной области известно, что, как указано выше, можно модифицировать двухцепочечную полинуклеотидную молекулу ДНК таким образом, чтобы получить любой желаемый ДНК-вектор с замкнутыми концами. включая, без ограничений, ДНК с утолщенными концами (doggybone), гантелеобразную (dumbbell) ДНК и т.п. Типичные примеры зкДНК-векторов для продуцирования антител или слитых белков, которые могут быть получены способом синтеза, описанным в Примере 2, обсуждаются в разделе, озаглавленном «III. зкДНК-векторы в целом». Типичные примеры антител и слитых белков, экспрессируемых зкДНК-векторами, описаны в разделе, озаглавленном «II.C. Типичные примеры антител и слитых белков, экспрессируемых зкДНК-векторами».

[00594] Способ включает (i) вырезание последовательности, кодирующей экспрессионную кассету, из двухцепочечного конструкта ДНК, и (ii) образование шпилечных структур в одном или нескольких ITR, и (iii) соединение свободных 5'- и 3'-концов путем лигирования, например, с помощью ДНК-лигазы Т4.

[00595] Двухцепочечный ДНК-конструкт содержит, в порядке от 5' к 3': первый сайт эндонуклеазы рестрикции; левый (в направлении 5') ITR; экспрессионную кассету правый (в направлении 3') ITR; и второй сайт эндонуклеазы рестрикции. Двухцепочечный ДНК-конструкт затем вводят в контакт с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции для генерирования двухцепочечных разрывов в обоих сайтах эндонуклеазы рестрикции. Оба сайта могут быть мишенями одной эндонуклеазы, или на каждый сайт могут быть нацелена отдельная эндонуклеаза, при условии, что сайты рестрикции не входят в матрицу зкДНК-вектора. В результате этого происходит вырезание последовательности между сайтами эндонуклеаз рестрикции из остальной части двухцепочечного ДНК-конструкта (см. Фиг. 9 заявки PCT/US19/14122). После лигирования образуется ДНК-вектор с замкнутыми концами.

[00596] Один или оба ITR, используемых в указанном способе, могут представлять собой ITR дикого типа. Также могут использоваться модифицированные ITR, причем модификация может включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов из ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C' (см., например, Фиг. 6-8 и 10, Фиг. 11B заявки PCT/US19/14122), и могут иметь две или более шпилечных петель (см., например, Фиг. 6-8, Фиг. 11B заявки PCT/US19/14122) или одну шпилечную петлю (см., например, Фиг. 10A-10B, Фиг. 11B заявки PCT/US19/14122). Модифицированный ITR со шпилечной петлей может быть получен генетической модификацией существующего олигонуклеотида (oligo) или биологическим и/или химическим синтезом de novo.

[00597] В неограничивающем примере, левый и правый ITR-6 (SEQ ID NO: 111 и 112) включают делеции 40 нуклеотидов в плечах B-B' и C-C' по сравнению с ITR ААВ2 дикого типа. Прогнозируется, что нуклеотиды, оставшиеся в модифицированном ITR, образуют единичную шпилечную структуру. Свободная энергия Гиббса расправления структуры составляет около -54,4 ккал/моль. Также могут быть проведены другие модификации ITR, включая необязательную делецию функционального сайта связывания Rep или сайта Trs.

ПРИМЕР 3: Продуцирование зкДНК посредством конструирования олигонуклеотидов

[00598] Другой пример способа получения зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, включающего сборку различных олигонуклеотидов, представлен в Примере 3 заявки PCT/US19/14122, в котором зкДНК-вектор получают путем синтеза олигонуклеотидов 5'- и 3'-ITR и лигирования олигонуклеотидов ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету. Фиг. 11B заявки PCT/US19/14122 демонстрирует пример способа лигирования олигонуклеотида 5'-ITR и олигонуклеотида 3'-ITR с двухцепочечным полинуклеотидом, содержащим экспрессионную кассету.

[00599] Как раскрыто в данном документе, олигонуклеотиды ITR могут содержать WT-ITR (например, см. Фиг. 3A, Фиг. 3C) или модифицированные ITR (например, см. Фиг. 3B и Фиг. 3D). (См. также, например, Фиг. 6A, 6B, 7A и 7B заявки PCT/US19/14122, которая включена в данный документ в полном объеме). Типичные олигонуклеотиды ITR включают, без ограничений, SEQ ID NO: 134-145 (например, см. Таблицу 7 в заявке PCT/US19/14122). Модифицированные ITR могут включать делецию, вставку или замену одного или нескольких нуклеотидов относительно ITR дикого типа в последовательностях, образующих плечо B и B' и/или плечо C и C'. Олигонуклеотиды ITR, содержащие WT-ITR или mod-ITR, как описано в данном документе, предназначенные для использования в бесклеточном синтезе, могут быть получены путем генетической модификации или биологического и/или химического синтеза. Как описано в данном документе, олигонуклеотиды ITR в Примерах 2 и 3 могут содержать WT-ITR или модифицированные ITR (mod-ITR) в симметричных или асимметричных конфигурациях, как обсуждается в данном документе.

ПРИМЕР 4: Продуцирование зкДНК с использованием одноцепочечной молекулы ДНК

[00600] В другом примере способа продуцирования зкДНК-вектора с использованием синтетического метода, представленном в Примере 4 заявки PCT/US19/14122, используется одноцепочечная линейная ДНК, содержащая два смысловых ITR, которые фланкируют последовательность кассеты смысловой экспрессии и ковалентно присоединены к двум антисмысловым ITR, которые фланкируют антисмысловую экспрессионную кассету, и концы указанной одноцепочечной линейной ДНК затем лигируют с образованием одноцепочечной молекулы с замкнутыми концами. Один неограничивающий пример включает синтез и/или продуцирование молекулы одноцепочечной ДНК, отжиг частей молекулы с образованием одной линейной молекулы ДНК, которая имеет одну или несколько областей вторичной структуры со спаренными основаниями, и затем лигирование свободных 5'- и 3'-концов друг с другом для образования замкнутой одноцепочечной молекулы.

[00601] Типичная одноцепочечная молекула ДНК для продуцирования зкДНК-вектора содержит, в направлении от 5' к 3':

первый смысловой ITR;

смысловую последовательность экспрессионной кассеты;

второй смысловой ITR;

второй антисмысловой ITR;

антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и

первый антисмысловой ITR.

[00602] Молекула одноцепочечной ДНК для использования в типичном примере способа по Примеру 4 может быть получена с использованием любой методологии синтеза ДНК, описанной в данном документе, например, синтезом ДНК in vitro, или путем расщепления конструкта ДНК (например, плазмиды) нуклеазами и плавления полученных фрагментов дцДНК с образованием фрагментов одноцепочечной ДНК (оцДНК).

[00603] Отжиг может быть осуществлен при снижении температуры до значения ниже расчетных температур плавления пар смысловой и антисмысловой последовательностей. Температура плавления зависит от содержания конкретных нуклеотидных оснований и характеристик используемого раствора, например, концентрации соли. Специалист в данной области может легко рассчитать температуры плавления для любой данной комбинации последовательности и раствора.

[00604] Свободные 5'- и 3'-концы отожженной молекулы могут быть лигированы друг с другом или лигированы с молекулой шпильки с образованием зкДНК-вектора. Типичные примеры подходящих методик лигирования и молекул шпилек описаны в Примерах 2 и 3.

ПРИМЕР 5: Очистка и/или подтверждение продуцирования зкДНК

[00605] Любой из продуктов ДНК-вектора, полученных способами, описанными в данном документе, например, включая способы получения на основе клеток насекомых, описанные в Примере 1, или синтетические способы продуцирования, описанные в Примерах 2-4, могут быть очищены, например, для удаления примесей, неиспользованных компонентов, или побочных продуктов с использованием методов, общеизвестных специалистам в данной области; и/или могут быть проанализированы для подтверждения того, что продуцируемый ДНК-вектор (в данном случае - зкДНК-вектор) является требуемой молекулой. Примером способа очистки ДНК-вектора, например, зкДНК, является использование протокола очистки Qiagen Midi Plus (Qiagen) и/или очистки на геле.

[00606] Ниже приведен типичный пример способа подтверждения идентичности зкДНК-векторов.

[00607] Оценку зкДНК-векторов можно проводить путем идентификации методом электрофореза в агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как показано на Фиг. 4D, причем (a) наличие на денатурирующих гелях характеристических полос, мигрирующих с вдвое большим размером, по сравнению с нативными гелями, после расщепления эндонуклеазой рестрикции и проведения гель-электрофоретического анализа, и (b) присутствие мономерных и димерных (2x) полос на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала является характерным признаком присутствия зкДНК-вектора.

[00608] Структуры выделенных зкДНК-векторов были дополнительно проанализированы путем расщепления очищенной ДНК эндонуклеазами рестрикции, отобранными для обеспечения а) наличия только одного сайта разреза в зкДНК-векторах, и b) результирующих фрагментов достаточно большого размера, чтобы их было четко видно при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как продемонстрировано на фиг. 4C и 4D, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой можно различить по размеру их продуктов реакции - например, ожидается, что ДНК-вектор с прерывистой структурой будет давать фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как для зкДНК-вектора с непрерывной структурой следует ожидать образования фрагментов размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.

[00609] Таким образом, для того, чтобы качественно продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ковалентно замкнутые концы, как это требуется по определению, образцы расщепляли эндонуклеазой рестрикции, идентифицированной, в контексте последовательности конкретного ДНК-вектора, как имеющей один сайт рестрикции, предпочтительно, приводящей к образованию двух продуктов расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза в денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК), линейная ДНК, не имеющая ковалентно замкнутых концов, будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., в то время как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты в 2 раза большего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), так как две цепи ДНК связаны и при разворачивании будут иметь вдвое большую длину (но являются одноцепочечными). Кроме того, расщепление мономерной, димерной и n-мерной форм ДНК-векторов будет во всех случаях давать фрагменты одинакового размера из-за связывания мультимерных ДНК-векторов «конец-к-концу» (см. Фиг. 4E).

[00610] Используемое в данном документе выражение «анализ для идентификации ДНК-векторов методом электрофореза на агарозном геле в нативном геле и денатурирующих условиях» относится к анализу для оценки степени замкнутости зкДНК путем проведения расщепления эндонуклеазой рестрикции с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Далее приведен один такой пример анализа, хотя рядовому специалисту в данной области будет понятно, что возможны многие варианты этого примера, известные в данной области техники. Эндонуклеазу рестрикции выбирают так, чтобы она представляла собой фермент, создающий один разрез зкДНК-вектора, представляющего интерес, который будет генерировать продукты, имеющие длину приблизительно 1/3 и 2/3 от длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем геле. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки GE Healthcare ILUSTRA™ MicroSpin™ G-25, представляют собой некоторые из известных в данной области техники вариантов средств, используемых при расщеплении эндонуклеазами. Анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей эндонуклеазой (эндонуклеазами) рестрикции, 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen, элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10-кратного денатурирующего раствора (10× = 0,5 М NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10-кратного раствора красителя, не забуференного, и проведение анализа вместе с маркерами молекулярного веса ДНК, полученными путем добавления 10-кратного денатурирующего раствора в эксперименте с 4 репликами, на 0,8-1,0% геле, предварительно инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и прогонки геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза, исходя из размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE или TAE и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с использованием красителя SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain фирмы Thermo Fisher (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм). Вышеописанный способ на основе геля может быть адаптирован для целей проведения очистки путем выделения зкДНК-вектора из полосы геля и обеспечения возможности его ренатурации.

[00611] Чистоту полученного зкДНК-вектора можно оценить с помощью любого известного в данной области метода. В качестве одного неограничивающего примера способа, вклад зкДНК-плазмиды в общее УФ-поглощение образца можно оценить путем сравнения интенсивности флуоресценции зкДНК-вектора со стандартом. Например, если, на основании определения УФ-поглощения, на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, то это соответствует присутствию 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому эта полоса соответствует – например, если полный зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае будет соответствовать 0,25 мкг при введении 1,0 мкг. Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, рассчитывают затем по уравнению линейной регрессии количество полосы зкДНК-вектора, которое потом можно использовать для определения процента, приходящегося на зкДНК-вектор в общем введенном количестве, или процента чистоты.

ПРИМЕР 6: Получение антител или слитых белков из зкДНК-плазмиды

[00612] Чтобы продемонстрировать способность зкДНК-вектора экспрессировать антитело, были получены зкДНК-плазмиды, кодирующие моноклональное антитело адуканумаб.

[00613] Адуканумаб представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое изучается для лечения болезни Альцгеймера путем воздействия на агрегированные формы бета-амилоидного белка. На Фиг. 6А представлен типичный пример плазмиды, которая была получена и определена как экспрессирующая полноразмерный адуканумаб. Фиг. 6В демонстрирует схему зкДНК-вектора, который можно получить с использованием зкДНК-плазмиды согласно Фиг. 6А. Экспрессионная кассета на Фиг. 6В демонстрирует систему двойного промотора, причем для каждой из тяжелой цепи и легкой цепи антитела к адуканумабу используются разные промоторы. зкДНК-плазмида, которую использовали для получения антитела к адуканумабу, включает уникальную комбинацию промоторов для экспрессии тяжелой и легкой цепей, которая обеспечивает надлежащее соотношение тяжелой и легкой цепей для образования функционального антитела. Специалисту в данной области понятно, как выбрать промоторы для каждой из легкой и тяжелой цепей желаемого антитела для продуцирования желаемых соотношений экспрессируемых тяжелой и/или легкой цепей, чтобы способствовать эффективному образованию интактного антитела.

[00614] зкДНК-плазмиду, обозначаемую как «плазмида pFBdual-зкДНК-адуканумаб» или «зкДНК-IgG-плазмида», как изображено на Фиг. 6А, получали, как описано в Примере 1, и использовали для транзиентной трансфекции клеток 293. Клетки 293-6E выращивали в бессывороточной среде для экспрессии FreeStyle™ 293 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Клетки выдерживали в колбах Эрленмейера (Corning Inc., Актон, Массачусетс) при 37 °C с 5% CO₂ на орбитальном шейкере (VWR Scientific, Честер, Пенсильвания). За один день до трансфекции клетки высевали с соответствующей плотностью в колбы Эрленмейера фирмы Corning. В день трансфекции ДНК и реагент для трансфекции смешивали в оптимальном соотношении и затем добавляли в колбу с клетками, готовыми к трансфекции. Рекомбинантную плазмиду, кодирующую целевой белок, транзиентно трансфицировали в суспензию клеточных культур 293-6Е. Плотность и жизнеспособность клеток в день 2, день 4 и день 5 после трансфекции приведены в Таблице 13. Образцы супернатанта клеточных культур, собранные в день 2, день 4 и день 5, использовали для оценки экспрессии белка. Супернатант клеточной культуры, собранный в день 6 после трансфекции, использовали для очистки.

[00615]

Таблица 13: Плотность клеток и жизнеспособность ceTTX-IgG1-Adu в клетках 293-6E Образец Плотность (х10⁶ клеток/мл) Жизнеспособность (%) U8948CK300-1, день 2 1,80 95,36 U8948CK300-1, день 4 2,36 83,98 U8948CK300-1, день 5 2,20 72,28

[00616] Экспрессия и очистка антитела: Для оценки уровня экспрессии белка супернатанты клеточной культуры собирали в дни 2, 4 и 5 после трансфекции и анализировали методамим ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга (данные не приведены). Для очистки белка бульон клеточной культуры центрифугировали и супернатант фильтровали. Отфильтрованный супернатант загружали на предварительно набитую колонку со смолой Monofinity A Resin, 1 мл (GenScript) со скоростью 1,0 мл/мин, с последующей промывкой и элюированием соответствующими буферами. Элюированные фракции объединяли и заменяли буфер на фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,2. Очищенный белок анализировали методами ДСН-ПААГ (Фиг. 8A), вестерн-блоттинга (Фиг. 8B) и гель-проникающей ВЭЖХ (SEC-HPLC) (данные не приведены) с использованием стандартных протоколов измерения молекулярной массы, выхода и чистоты.

[00617] В общем, адуканумаб экспрессировался из зкДНК-вектора, продуцируемого из плазмиды pFBdual-зкДНК-адуканумаб в клетках 293-6E, выращиваемых в суспензионной культуре. Антитело экспрессировалось на уровне, определяемом с помощью анализа методом ДСН-ПААГ (Фиг. 8А). После одностадийной очистки антитело детектировалось с расчетными молекулярными массами ок. 55 кДа и ок. 25 кДа в восстанавливающих условиях и ок. 150 кДа в невосстанавливающих условиях (Фиг. 8В). Эти данные указывают на то, что тяжелая и легкая цепи антитела самоорганизуются в полноразмерное антитело в данной системе.

ПРИМЕР 7: Крупномасштабное производство рекомбинантного антитела in vitro

[00618] зкДНК-плазмиду, содержащую последовательности, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь адуканумаба, можно получить, как описано ранее в Примерах 1 и 5, и трансфицировать в крупномасштабную суспензионную культуру, например, клеток FreeStyle^TM 293-F (R790-07, Life Technologies), которые были адаптированы для роста в бессывороточных условиях. Адаптированные для суспензионного и бессывороточного выращивания клетки FreeStyleTM293-F (Life Technologies) культивируют в среде экспрессии FreeStyleTM293 (Life Technologies) в стерильных колбах Эрленмейера на 125 мл с вентилируемыми пробками (Sigma) при плотностях в диапазоне 1-5×10⁵ жизнеспособных клеток/мл, при вращении со скоростью 135 об/мин на платформе орбитального шейкера. Каждую колбу объемом 125 мл, содержащую 30 мл клеток с концентрацией 1×10⁶ жизнеспособных клеток/мл, трансфицируют реагентом для трансфекции зкДНК Fugene6 (Fugene6:зкДНК 3:1) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавляют реагент для селекции (selection) (50 мг/мл), и клетки поддерживают в режиме селекции в течение 2 недель при плотностях в диапазоне 2-5×10⁵ жизнеспособных клеток/мл с последующим размножением в колбе для шейкера объемом 1 л (Sigma), центрифужном стакане на 1 л (Sigma) или биореакторе WAVE объемом 5 л (GE Healthcare). Образцы отбирают каждые 48 ч, и уровни экспрессии IgG определяют методом ИФА на антитела против IgG человека. На пике экспрессии супернатанты культур собирают, центрифугируют при 1000×g в течение 15 минут, пропускают через фильтры 0,45 мкм (mm) (Sartorius) и хранят при 4 °C с 0,1% азида натрия (Sigma) до использования. Антитела могут быть очищены методом аффинной хроматографии на колонке HiTrap Protein-G HP объемом 5 мл (GE Healthcare) с использованием системы ÄKTA Prime (GE Healthcare) и отфильтрованных буферов 0,2 мкм. Например, колонку уравновешивают 10 объемами колонки (CV) промывочного буфера с фосфатным солевым раствором (PBS) (pH 7,0) и нагружают супернатантом со скоростью потока 2 мл/мин, с последующим пропусканием 10 объемов колонки промывочного буфера. Антитело элюируют 0,2 М глициновым буфером (рН 2,3) и фракции по 2,5 мл собирают в пробирки, содержащие 0,5 мл 1 М Трис-HCl рН 8,6 для нейтрализации.

ПРИМЕР 8: Получение зкДНК-вектора, экспрессирующего полноразмерный адуканумаб, и экспрессия антитела из зкДНК in vitro

[00619] зкДНК-плазмиду или зкДНК-вектор, которые экспрессируют адуканумаб или GFP, получали, как описано в Примерах 1 и 5, с использованием зкДНК-плазмиды Adu-Full-IgG1 (плазмида pFBdual-зкДНК-адуканумаб или плазмида зкДНК-IgG) (фиг. 6A), приготовленной согласно Примеру 1. Выходы полученного и очищенного зкДНК-вектора (называемого «зкДНК IgG») или зкДНК-плазмиды определяли на основе УФ-поглощения при 260 нм. зкДНК-вектор или зкДНК-плазмиду трансфицировали в клетки HEK293T с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine™ 3000 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 72 часа клетки лизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), собирали цельный клеточный супернатант и концентрировали с использованием фильтров (Amicon). Итоговое продуцирование антител анализировали вестерн-блоттингом. Клеточные супернатанты и образцы лизата нормировали по концентрации так, чтобы были загружены равные количества белка. Подготовленные образцы кипятили при 70 °С в термоблоке в течение 10 минут, а затем помещали на лед. Образцы прогоняли на геле ДСН-ПААГ при 200 В в течение 32 минут и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методик. В качестве положительного контроля использовали коммерчески доступный человеческий IgG (Abcam, Sigma). Мембрану блокировали с помощью блокирующего буфера (Odyssey) при комнатной температуре в течение 30 минут. Белковые полосы визуализировали окрашиванием мембраны понсо S в течение 5 минут с последующей промывкой дистиллированной водой и обесцвечиванием с помощью TBST (раствор трис-буфера с NaCl и Твин 20). Затем мембрану зондировали в течение ночи при 4 °С при осторожном перемешивании с первичным антителом против человеческого IgG (Genscript), конъюгированным с пероксидазой хрена, разбавленным 1:5000 в блокирующем буфере. После этого блот промывали TBST три раза по 5 минут каждый раз и проявляли с помощью набора ECL (субстрат SuperSignal West Femto) и визуализировали с помощью системы визуализации геля (Syngene Box Mini).

[00620] Эффективность трансфекции ппри использовании процедуры трансфекции Lipofectamine™ 3000 оценивали путем анализа флуоресценции клеток 293T, трансфицированных плазмидой зкДНК-GFP (Фиг. 9A, верхняя панель) или зкДНК-вектором-GFP (Фиг. 9A, нижняя панель). Оба образца имели значительную флуоресценцию, как видно на Фиг. 9А, что указывает на успешную трансфекцию в обоих случаях. Несмотря на значительное содержание белка в каждом образце (Фиг. 9B, нижняя панель), присутствие экспрессированного адуканумаба было обнаружено только в образцах из клеток, трансфицированных плазмидой зкДНК-IgG или конструктами зкДНК-IgG (Фиг. 9B, верхняя панель, наблюдаются как тяжелые, так и легкие цепи). Это указывает на экспрессию адуканумаба зкДНК-вектором в клетках 293Т.

ПРИМЕР 9: Подтверждение идентичности экспрессируемого антитела

[00621] Плазмиды, содержащие представляющую интерес нуклеиновую кислоту, кодирующую адуканумаб, были приготовлены для экспрессии в эмбриональных почечных клетках человека (HEK293-6E). Клетки HEK293-6E выращивали в бессывороточной среде (среда для экспрессии FreeStyle™ 293, Thermo Fisher Scientific). Клетки поддерживали в колбах Эрленмейера при 37 °С с 5% СО₂ на орбитальном шейкере. За день до трансфекции клетки высевали с соответствующей плотностью в колбы Эрленмейера. В день трансфекции ДНК и реагент для трансфекции смешивали в оптимальном соотношении и затем добавляли в колбу с клетками, готовыми к трансфекции. Рекомбинантную плазмиду, кодирующую целевой белок, транзиентно трансфицировали в суспензионные клеточные культуры HEK293-6E. Супернатанты клеточных культур, собранные на 6-й день, использовали для очистки.

[00622] Бульон для культивирования клеток центрифугировали, фильтровали и загружали на колонку для аффинной очистки (предварительно набитая колонка со смолой Monofinity A Resin™, GenScript) при соответствующей скорости потока. После промывки и элюирования, элюированные фракции объединяли и буфер заменяли на буфер для конечной композиции. Очищенный белок анализировали методами (а) электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, (б) вестерн-блоттинга с использованием козьего анти-человеческого IgG-HRP (GenScript) и козьего анти-человеческого каппа-HRP в качестве первичных антител, с хемилюминесцентным детектированием, и (с) эксклюзионной хроматографии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience) для определения молекулярной массы и чистоты. Концентрацию белка определяли по поглощению при A260/280. Результаты представлены на Фиг. 10A. Анализ ВЭЖХ выявил один пик (Фиг. 10А). При прогоне образцов этого белка на геле ДСН-ПААГ (Фиг. 8A), в невосстанавливающих условиях наблюдалась одна полоса (дорожка 2), в то время как в восстанавливающих условиях наблюдались две полосы (дорожка 1). Это согласуется с предположением, что белок представляет собой антитело, в котором субъединицы легкой цепи и тяжелой цепи остаются дисульфидно-связанными в невосстанавливающих условиях и мигрируют как одна полоса, но при восстановительных условиях разделяются на отдельные субъединицы, мигрируя в виде двух полос. Вестерн-блоттинг показал сходную картину полос (Фиг. 8B) и дополнительно подтвердил присутствие антитела, поскольку детектирование проводилось по первичным антителам, специфичным для человеческого IgG и легкой цепи каппа человека.

[00623] Способность очищенного адуканумаба распознавать его лиганд - бета-амилоид (1-42) («Абета») - оценивали методом ИФА. Амилоид агрегировал in vitro и прилипал к планшету, с последующим воздействием адуканумаба или контрольных антител в различных концентрациях и в течение различных периодов времени, а затем колориметрической экспозицией. Синтетический пептид Аβ1-42 (AnaSpec, Фремонт, Калифорния, США) восстанавливали в гексафторизопропаноле в концентрации 1 мг/мл, сушили на воздухе и концентрировали под вакуумом с образованием пленки. Пленку растворяли в ДМСО и олигомерах АВ42, и фибриллы АВ42 получали путем разбавления восстановленного ДМСО мономера в фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 100 мкг/мл и инкубировали при 37 ^oС в течение по меньшей мере 3 дней и 1 недели, соответственно. Планшеты для ИФА были покрыты агрегированным амилоидом.

[00624] Вкратце, готовили Абета, проводили вестерн-блоттинг и окрашивали в соответствии с методами, описанными Stine et al., Methods Mol. Biol. (2011) 670: 13-32. Эквивалентные количества Абета прогоняли на геле на каждой из дорожек 3, 4 и 5. После переноса на нитроцеллюлозу каждую дорожку отделяли и зондировали различными первичными антителами: очищенным адуканумабом, описанным в данном документе, на дорожке 3, очищенным антителом против бета-амилоида (17-24) (BioLegend, клон 4G8) на дорожке 4, и очищенным антителом против бета-амилоида (1-16) (BioLegend, клон 6E10) на дорожке 5. После промывки каждый образец зондировали козьим анти-человеческим IgG-HRP (дорожка 3) (GenScript) или козьим антимышиным IgG-HRP (дорожки 4 и 5) (GenScript) в качестве вторичного антитела и проявляли субстратом HRP. Результаты представлены на Фиг. 10B. Экспрессированный плазмидой адуканумаб связывался (bound) с иммобилизованным на нитроцеллюлозе мономером Абета, как и два других антитела против Абета, что указывает на способность очищенного адуканумаба распознавать свой лиганд, как и ожидалось.

Пример 10. Экспрессия антитела in vivo у мышей дикого типа.

[00625] зкДНК-вектор с левым ITR дикого типа и усеченным мутантным правым ITR и с трансгенной областью, кодирующей тяжелую цепь и легкую цепь адуканумаба, каждую под контролем своего собственного промотора EF1, получали и очищали, как описано выше в Примерах 1 и 5 («вектор зкДНК-IgG»). Вектор зкДНК-IgG или контрольный зкДНК-вектор, содержащий трансген люциферазы под контролем специфичного для печени промотора hAAT, вводили самцам мышей C57bl/6J в возрасте приблизительно 6 недель. Неинкапсулированные зкДНК-векторы вводили в дозе 0,005 мг на животное (4 животных в группе) путем гидродинамической внутривенной инъекции через латеральную хвостовую вену в объеме 2,2 мл. Образцы крови брали у каждого обработанного животного в дни 3, 7, 14, 21, и в завершающий день исследований 28. Присутствие экспрессированного адуканумаба в образцах сыворотки измеряли методом ИФА, используя поликлональное антитело против человеческого иммуноглобулина, которое распознает человеческие антитела любой специфичности, в коммерчески доступном наборе Discovery Human/NHP IgG, согласно инструкциям производителя (Meso Scale Discovery).

[00626] Как продемонстрировано на Фиг. 11, человеческие антитела легко детектировались в дни 3 и 7 в образцах сыворотки мышей, получавших вектор зкДНК-IgG, но не наблюдались у мышей, получавших зкДНК, экспрессирующую люциферазу, а не человеческое антитело. Максимальный уровень экспрессии в сыворотке, наблюдаемый в указанные два момента времени для этого конкретного вектора, составлял приблизительно 500 нг/мл.

Пример 11. Экспрессия антитела in vivo в мышиной модели болезни Альцгеймера

[00627] зкДНК-вектор с последовательностями, кодирующими тяжелую цепь и легкую цепь адуканумаба, можно получить, как было описано ранее в Примерах 1 и 5. Композиция зкДНК-вектора будет составлена с липидными наночастицами (ЛНЧ) и введена мышам Tg2576 (Kawarabayashi et al., J. Neurosci 21(2):372-381 (2001)) и нормальным мышам. ЛНЧ с зкДНК-векторами вводят соответствующим мышам в дозах от 0,3 до 5 мг/кг в объеме 1,2 мл. Каждая доза должна вводиться путем гидродинамического внутривенного введения или, например, внутрибрюшинной инъекцией. Введение нормальным мышам служит контролем, а также может быть использовано для определения наличия и количества моноклональных антител (mAb) адуканумаба. Будут проведены анализы связывания как in vitro, так и ex vivo (ИФА с агрегированным амилоидом и иммуногистохимия (IHC) среза головного мозга), соответственно, как описано в данном документе и в Примере 6.

[00628] После острой дозы, например, однократной дозы ЛНЧ-TTX-Adu, будут определяться концентрации зкДНК в плазме и в головном мозге методом ИФА в различные моменты времени, например, через 10, 20, 30, 40, 50, 100 и 200 дней или более, и т.д. Конкретнее, замороженный мозг гомогенизируют в 10 объемах (10 мл/г влажной ткани) раствора, содержащего 50 мМ NaCl, 0,2% диэтиламина (ДЭА), с ингибиторами протеаз, и обрабатывают ультразвуком в течение приблизительно 15-20 с на льду. Образцы центрифугируют при 100000 g в течение 30 минут при 4 °C и супернатант сохраняют в виде экстрагированной ДЭА растворимой фракции амилоида β. Оставшийся осадок ресуспендируют в 10 объемах 5М гуанидина гидрохлорида (Gu-HCl), обрабатывают ультразвуком и центрифугируют, как описано выше. Полученный супернатант сохраняют в виде экстрагированной гуанидином нерастворимой фракции амилоида β (Αβ), а оставшийся осадок выбрасывают. Для определения концентрации антитела в плазме и головном мозге, 96-луночные микропланшеты (Nunc Maxisorp, Corning Costar) покрывают пептидом Αβ(1-42) (Αβ42) при концентрации 5 мкг/мл в холодном буфере для нанесения покрытия в течение ночи при 4 °C. Образцы плазмы или экстрагированных ДЭА гомогенатов мозга из (т.е. без детергентов) разбавляют до конечных рабочих концентраций и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. Связывание определяют с помощью репортерного антитела, например, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) козьего античеловеческого поликлонального антитела (Jackson ImmunoResearch), с последующим измерением активности HRP с использованием субстрата TMB (тетраметилбензидин). Концентрации определяют путем сравнения с калибровочной кривой, полученной с использованием очищенных антител. Альтернативно, присутствие антитела (Ab) в плазме подтверждают методом вестерн-блоттинга, как описано в

[00629] Связывание in vivo антитела с отложениями Αβ после однократного введения мышам Tg2576 можно также определить, используя биотинилированное вторичное античеловеческое антитело, и его можно сравнить с окрашиванием антителом пан-Αβ 5F3, выполненным ex vivo на последовательном срезе, в качестве положительного контроля. Ткани фиксируют формалином и заливают парафином, срезы 5 мкм (μπι), депарафинизированные, и может использоваться высокотемпературная демаскировка антигена с помощью ЭДТА-бората (Ventana CC1). Затем на ткани может быть нанесено козье античеловеческое вторичное антитело в разведении 1:500 и ткани окрашивают гематоксилином.

[00630] Ожидается, что системно вводимая зкДНК ЛНЧ-TTX-Adu будет экспрессироваться в плазме и головном мозге и связываться с паренхиматозными амилоидными бляшками с высокой аффинностью.

ПРИМЕР 12: Анализ снижения амилоидной нагрузки после введения дозы зкДНК

[00631] Эффективность экспрессируемого зкДНК адуканумаба в снижении амилоидной нагрузки будет оцениваться после хронического введения трансгенным мышам Tg2576. Например, дозы в диапазоне от 0,3, 1, 3, 10 до 30 мг/кг и т.д., или фосфатно-солевой буфер (PBS) будут вводиться в заданных временных рамках, например, еженедельно или ежемесячно. Уровни лекарственного средства в плазме и головном мозге будут измеряться методом ИФА, как описано выше в Примере 8. Образцы плазмы собирают через 24-72 часа после введения последней дозы, и уровни антител измеряют для определения зависимости доза-эффект.

[00632] Общая амилоидная нагрузка на головной мозг в коре и гиппокампе будет определена методами иммуногистохимии. Конкретнее, мозг рассекают и фиксируют погружением в 10% нейтральный забуференный формалин на 48-72 часа. Фиксированный мозг затем обрабатывают и заливают в горизонтальной ориентации. Каждый блок разделяют на секции, пока не будет идентифицирован гиппокамп, после чего получают 300 последовательных срезов по 5 мкм (по 3 среза на слайде). Окрашивают каждый 14-й слайд как для 6E10, так и для тиофлавина-S (приблизительно 1 срез через каждые 225 мкм). Иммуногистохимия для определения амилоида головного мозга будет использовать, например, мышиное моноклональное антитело против Αβ 1-16 (Clone 6E10, Covance, Принстон, Нью-Джерси) в качестве первичного антитела при разведении 1:750, и набор Ultramap против щелочной фосфатазы мышей (Ventana Medical Systems, Туксон, Аризона), и проводить количественное определение с использованием прикладной программы VISIOPHARM^®, как описано в данном документе. Слайды предварительно обрабатывают 88%-ным раствором муравьиной кислоты, а затем помещают на иммуностейнер Ventana Discovery XT. Слайды докрашивают гематоксилином Ventana (Ventana Medical Systems, Туксон, Аризона), накрывают покровным стеклом и сушат на воздухе в течение ночи.

[00633] После иммуноокрашивания 6E10, слайды сканируют с помощью системы визуализации целых слайдов Aperio XT (Aperio Technologies, Inc., Виста, Калифорния) с 20-кратным увеличением, в соответствии с инструкциями производителя. Цифровые изображения можно затем просматривать и вручную аннотировать как отдельные маски, а затем анализировать с использованием алгоритма, написанного с помощью программного обеспечения VISIOPHARM^®. Алгоритм определяет площадь аннотированного гиппокампа или коры и области паренхиматозного и сосудистого амилоида в этих анатомических областях при 10-кратном виртуальном увеличении. Обучение прикладной программы осуществляется, например, на 50 слайдах. Слайды также окрашивают тиофлавином-S (Thio-S), как описано в (Bussiere et al., Am J Pathol 165:987-995 (2004)), и заливают заливочной средой VECTASHIELD^® с DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (Vector Laboratories Берлингейм, Калифорния). После окрашивания тиофлавином-S слайды анализируют и сканируют с помощью системы визуализации, например, системы флуоресцентной визуализации целого слайда Aperio FL (Aperio Technologies, Inc., Виста, Калифорния) с 20-кратным увеличением, в соответствии с инструкциями производителя. Как и в случае 6E10, гиппокамп или кору головного мозга аннотируют вручную в виде отдельных масок, а затем анализируются с использованием алгоритма, написанного с помощью программного обеспечения VISIOPHARM^®, и адаптированного для флуоресценции. Алгоритм определяет площадь гиппокампа и коры, а также области паренхиматозного и сосудистого амилоида в этих анатомических областях при 10-кратном виртуальном увеличении. Обучение прикладной программы может быть проведено на 10 слайдах. Ожидается, что общая площадь, занятая окрашенными отложениями, будет значительно уменьшена по сравнению с контролем, использующим фосфатно-солевой буфер (PBS).

ПРИМЕР 13: Экспрессия антитела и Fc-слитого белка на основе зкДНК in vitro

[00634] Для оценки способности зкДНК экспрессировать другие антитела и иммуноглобулиноподобные молекулы, помимо адуканумаба, эксперименты, описанные в Примере 8, были повторены с двумя дополнительными конструктами зкДНК - одним, кодирующим легкую и тяжелую цепи бевацизумаба (антитело, специфически связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF)) в генной кассете, и другим кодирующим Fc-слитый белок афлиберцепт (человеческий Fc IgG1, слитый с VEGF-связывающими участками внеклеточных доменов человеческих рецепторов VEGF 1 и 2). Результаты вестерн-блоттинга на невосстановленных образцах представлены на Фиг. 12 (приведены два изображения одного и того же блота с разным временем экспозиции - 6 секунд и 12 секунд). Адуканумаб снова экспрессировали в клетках, трансфицированных плазмидой зкДНК-Adu и вектором зкДНК-Adu, как было ранее описано в Примере 8 (дорожки 5 и 7). Бевацизумаб сходным образом экспрессировали в клетках, трансфицированных вектором зкДНК-бевацизумаб (дорожка 11). Афлиберцепт также экспрессировался в клетках, трансфицированных вектором зкДНК-афлиберцепт (дорожка 9). Эти результаты демонстрируют, что экспрессия в клетках различных IgG и иммуноглобулиноподобных молекул из конструктов зкДНК является возможной.

ССЫЛКИ НА ИСТОЧНИКИ

[00635] Все публикации и ссылки, включая, без ограничений, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании и примерах, приведенных в данном документе, настоящим включены посредством ссылки в полном объеме, как если бы для каждой отдельной публикации или ссылки было конкретно и индивидуально указано про ее включение посредством ссылки в данный документ явным образом. Любая патентная заявка, в отношении которой данная заявка испрашивает приоритет, также включена в данный документ посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылок.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДЖЕНЕРЕЙШЕН БИО ИНК.

<120> НЕВИРУСНЫЕ ДНК-ВЕКТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ

АНТИТЕЛ

И СЛИТЫХ БЕЛКОВ [11]

<130> 080170-091100-WOPT

<140>

<141>

<150> 62/680,087

<151> 2018-06-04

<150> 62/680,092

<151> 2018-06-04

<150> 62/630,670

<151> 2018-02-14

<150> 62/630,676

<151> 2018-02-14

<160> 190

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 1

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag ctgcctgcag g

141

<210> 2

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t

141

<210> 3

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 3

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg

130

<210> 4

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt

60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact

120

aggggttcct

130

<210> 5

<211> 143

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 5

ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc

60

agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt

120

gggcaactcc atcactaggg taa

143

<210> 6

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 6

ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc

60

agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt

120

ggccaactcc atcactagag gtat

144

<210> 7

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 7

ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc

60

agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg

120

gccaact

127

<210> 8

<211> 166

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 8

tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc

60

gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc

120

gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag

166

<210> 9

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 9

ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg

60

cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt

120

gggcaactcc atcactaggg gtat

144

<210> 10

<211> 143

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 10

ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc

60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga

120

gcgcgcagag agggagtggg caa

143

<210> 11

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 11

atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc

60

ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg

120

agtgcgcata gagggagtgg ccaa

144

<210> 12

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 12

agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct

60

ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag

120

tggccaa

127

<210> 13

<211> 166

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 13

cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc

60

gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt

120

cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga

166

<210> 14

<211> 144

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 14

atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc

60

ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga

120

gcgcgcatta gagggagtgg gcaa

144

<210> 15

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 15

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg

120

<210> 16

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 16

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 17

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg

129

<210> 18

<211> 101

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 18

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g

101

<210> 19

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 19

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg

139

<210> 20

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 20

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg

137

<210> 21

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 21

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg

135

<210> 22

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 22

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg

133

<210> 23

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 23

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga

120

gcgcgcagct gcctgcagg

139

<210> 24

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 24

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc

120

gcgcagctgc ctgcagg

137

<210> 25

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 25

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc

120

gcagctgcct gcagg

135

<210> 26

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 26

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc

120

agctgcctgc agg

133

<210> 27

<211> 131

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 27

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag

120

ctgcctgcag g

131

<210> 28

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 28

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct

120

gcctgcagg

129

<210> 29

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 29

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc

120

ctgcagg

127

<210> 30

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 30

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 31

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 31

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg

130

<210> 32

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 32

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct

120

<210> 33

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 33

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct

122

<210> 34

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 34

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc

120

ct

122

<210> 35

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 35

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg

60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct

129

<210> 36

<211> 101

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 36

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc

60

gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t

101

<210> 37

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 37

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct

139

<210> 38

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 38

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct

137

<210> 39

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 39

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct

135

<210> 40

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 40

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct

133

<210> 41

<211> 139

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 41

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg

60

gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac

120

tccatcacta ggggttcct

139

<210> 42

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 42

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc

60

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc

120

catcactagg ggttcct

137

<210> 43

<211> 135

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 43

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga

60

cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttcct

135

<210> 44

<211> 133

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 44

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc

60

tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc

120

actaggggtt cct

133

<210> 45

<211> 131

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 45

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt

60

tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac

120

taggggttcc t

131

<210> 46

<211> 129

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 46

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg

60

gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta

120

ggggttcct

129

<210> 47

<211> 127

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 47

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt

60

cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg

120

ggttcct

127

<210> 48

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 48

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca

120

gg

122

<210> 49

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 49

cgatcgttcg at

12

<210> 50

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 50

atcgaaccat cg

12

<210> 51

<211> 12

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 51

atcgaacgat cg

12

<210> 52

<211> 165

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 52

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60

ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc

120

gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct

165

<210> 53

<211> 140

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 53

cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc

60

cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg

120

cgcagagaga tcactagggg

140

<210> 54

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 54

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg

60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

91

<210> 55

<211> 91

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 55

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc

60

ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

91

<210> 56

<211> 10808

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 56

aaagtagccg aagatgacgg tttgtcacat ggagttggca ggatgtttga ttaaaaacat

60

aacaggaaga aaaatgcccc gctgtgggcg gacaaaatag ttgggaactg ggaggggtgg

120

aaatggagtt tttaaggatt atttagggaa gagtgacaaa atagatggga actgggtgta

180

gcgtcgtaag ctaatacgaa aattaaaaat gacaaaatag tttggaacta gatttcactt

240

atctggttcg gatctcctag gcggccggcc cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca

300

ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga

360

gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc ttgtagttaa

420

tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt agccatgcgc ggccgcggcc tgaaataacc

480

tctgaaagag gaacttggtt aggtaccttc tgaggcggaa agaaccagct gtggaatgtg

540

tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg

600

catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt

660

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cactagtgga gccgagagta

720

attcatacaa aaggagggat cgccttcgca aggggagagc ccagggaccg tccctaaatt

780

ctcacagacc caaatccctg tagccgcccc acgacagcgc gaggagcatg cgctcagggc

840

tgagcgcggg gagagcagag cacacaagct catagaccct ggtcgtgggg gggaggaccg

900

gggagctggc gcggggcaaa ctgggaaagc ggtgtcgtgt gctggctccg ccctcttccc

960

gagggtgggg gagaacggta tataagtgcg gcagtcgcct tggacgttct ttttcgcaac

1020

gggtttgccg tcagaacgca ggtgaggggc gggtgtggct tccgcgggcc gccgagctgg

1080

aggtcctgct ccgagcgggc cgggccccgc tgtcgtcggc ggggattagc tgcgagcatt

1140

cccgcttcga gttgcgggcg gcgcgggagg cagagtgcga ggcctagcgg caaccccgta

1200

gcctcgcctc gtgtccggct tgaggcctag cgtggtgtcc gcgccgccgc cgcgtgctac

1260

tccggccgca ctctggtctt tttttttttt gttgttgttg ccctgctgcc ttcgattgcc

1320

gttcagcaat aggggctaac aaagggaggg tgcggggctt gctcgcccgg agcccggaga

1380

ggtcatggtt ggggaggaat ggagggacag gagtggcggc tggggcccgc ccgccttcgg

1440

agcacatgtc cgacgccacc tggatggggc gaggcctggg gtttttcccg aagcaaccag

1500

gctggggtta gcgtgccgag gccatgtggc cccagcaccc ggcacgatct ggcttggcgg

1560

cgccgcgttg ccctgcctcc ctaactaggg tgaggccatc ccgtccggca ccagttgcgt

1620

gcgtggaaag atggccgctc ccgggccctg ttgcaaggag ctcaaaatgg aggacgcggc

1680

agcccggtgg agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga agagggcctg gtccctcacc

1740

ggctgctgct tcctgtgacc ccgtggtcct atcggccgca atagtcacct cgggcttttg

1800

agcacggcta gtcgcggcgg ggggagggga tgtaatggcg ttggagtttg ttcacatttg

1860

gtgggtggag actagtcagg ccagcctggc gctggaagtc atttttggaa tttgtcccct

1920

tgagttttga gcggagctaa ttctcgggct tcttagcggt tcaaaggtat cttttaaacc

1980

cttttttagg tgttgtgaaa accaccgcta attcaaagca accggtatgg actggacctg

2040

gcgaattctt ttccttgtag cagcggctac tggtgcacat tcattggttg agtcaggcgg

2100

tggggtagta cagcctggcc ggtcccttag gctctcctgc gccgcgtccg ggttcgcgtt

2160

tagctcctac gggatgcact gggttagaca ggctcctgga aagggactgg aatgggttgc

2220

agtcatttgg tttgacggga ccaaaaaata ctatacagat tccgttaagg ggaggtttac

2280

aatcagtaga gataatagta aaaacacgtt gtatcttcaa atgaatactc tcagagccga

2340

agatacagca gtatattact gcgcccgcga tcggggaata ggcgctcgga ggggacccta

2400

ctatatggat gtgtggggta aaggtacgac cgtgactgtg agctctgcgt ccaccaaagg

2460

tccaagtgtt tttcccctcg ccccttcaag caagtcaacc tcaggcggta ctgctgcttt

2520

gggatgtctg gttaaagatt actttccaga gcctgtgact gtgagttgga attcaggcgc

2580

tcttaccagc ggtgttcaca cattccccgc agtcttgcaa tcctctggtt tgtattccct

2640

gagtagcgta gtcacggtgc ctagcagtag cctcgggaca caaacgtaca tttgcaatgt

2700

gaatcacaaa cccagtaata ccaaggttga taagcgggtc gaacctaaat cctgtgacaa

2760

gacccacaca tgtcctccgt gcccggctcc cgagctgctg ggcgggccgt ccgtattcct

2820

gtttccccct aaaccgaaag acactttgat gatatcacgg acacccgagg ttacgtgtgt

2880

ggtcgtcgat gtttctcacg aggaccccga agtcaaattc aattggtacg tggatggtgt

2940

tgaggttcac aacgccaaaa ctaaaccccg cgaggagcag tacaattcaa cctatagggt

3000

tgtgagtgtc cttactgtcc tccatcaaga ttggctgaac ggcaaagaat ataaatgcaa

3060

agtctcaaac aaagctctgc cagccccgat agaaaagacc atctccaaag ctaaggggca

3120

acccagagaa cctcaagtgt acaccctccc tccatcaagg gaggagatga cgaaaaatca

3180

agtaagcttg acctgtcttg taaaagggtt ctacccaagt gatatagctg tagaatggga

3240

gagtaatggg cagcccgaga ataattacaa aacgacaccg cccgtgctgg actcagacgg

3300

tagctttttc ctctacagca aacttactgt agataaaagt aggtggcagc agggaaatgt

3360

tttttcctgt tcagtcatgc atgaagcatt gcacaaccat tacacccaga agtctctcag

3420

tttgagcccg ggcaagtaat gaccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac

3480

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt

3540

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat

3600

gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg

3660

tggtatggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc

3720

cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat

3780

tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat

3840

catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat

3900

gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc

3960

gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac

4020

tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagtg

4080

gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac

4140

cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca

4200

tgcgcccagg gctgagcgcg ggtagatcag agcacacaag ctcacagtcc ccggcggtgg

4260

ggggaggggc gcgctgagcg ggggccaggg agctggcgcg gggcaaactg ggaaagtggt

4320

gtcgtgtgct ggctccgccc tcttcccgag ggtgggggag aacggtatat aagtgcggta

4380

gtcgccttgg acgttctttt tcgcaacggg tttgccgtca gaacgcaggt gagtggcggg

4440

tgtggcttcc gcgggccccg gagctggagc cctgctctga gcgggccggg ctgatatgcg

4500

agtgtcgtcc gcagggttta gctgtgagca ttcccacttc gagtggcggg cggtgcgggg

4560

gtgagagtgc gaggcctagc ggcaaccccg tagcctcgcc tcgtgtccgg cttgaggcct

4620

agcgtggtgt ccgccgccgc gtgccactcc ggccgcacta tgcgtttttt gtccttgctg

4680

ccctcgattg ccttccagca gcatgggcta acaaagggag ggtgtggggc tcactcttaa

4740

ggagcccatg aagcttacgt tggataggaa tggaagggca ggaggggcga ctggggcccg

4800

cccgccttcg gagcacatgt ccgacgccac ctggatgggg cgaggcctgt ggctttccga

4860

agcaatcggg cgtgagttta gcctacctgg gccatgtggc cctagcactg ggcacggtct

4920

ggcctggcgg tgccgcgttc ccttgcctcc caacaagggt gaggccgtcc cgcccggcac

4980

cagttgcttg cgcggaaaga tggccgctcc cggggccctg ttgcaaggag ctcaaaatgg

5040

aggacgcggc agcccggtgg agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga agagggcctt

5100

gcccctcgcc ggccgctgct tcctgtgacc ccgtggtcta tcggccgcat agtcacctcg

5160

ggcttctctt gagcaccgct cgtcgcggcg gggggagggg atctaatggc gttggagttt

5220

gttcacattt ggtgggtgga gactagtcag gccagcctgg cgctggaagt cattcttgga

5280

atttgcccct ttgagtttgg agcgaggcta attctcaagc ctcttagcgg ttcaaaggta

5340

ttttctaaac ccgtttccag gtgttgtgaa agccaccgct aattcaaagc aatccggaat

5400

gcttccaagt cagttgatag ggtttttgct gctgtgggtg cctgcttcaa gaggtattca

5460

gatgactcaa tctccttctt ctctgtcagc cagcgtaggt gatcgcgtca ccatcacctg

5520

tcgagcctca cagtccattt ctagctatct caattggtat cagcagaagc caggaaaagc

5580

ccctaaactt ctcatatacg ccgcctctag tctccaaagt ggggtgccca gtcggttcag

5640

tggctccgga tctgggactg atttcacttt gactatatct agtctccagc ctgaggattt

5700

tgctacatat tattgtcaac aatcctactc tacacccctg acgttcggtg gcggaacgaa

5760

ggttgaaata aagaggactg tggccgcccc atcagttttc attttcccgc cgtctgatga

5820

acaactcaaa agcggcacag catctgtagt ctgccttttg aacaactttt atccacggga

5880

ggcaaaagtg caatggaaag tggataatgc tctgcaaagt ggtaacagcc aagaaagtgt

5940

aaccgaacag gattccaaag actcaaccta ttccctcagt tccacactca cactgtctaa

6000

ggctgattac gagaagcata aggtttacgc ctgtgaagtt acgcaccaag gactctctag

6060

tccagttact aaaagcttta atcgggggga atgttagtga tgtgccttct agttgccagc

6120

catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg

6180

tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc

6240

tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg

6300

ctggggatgc ggtgggctct atggcggcgc gccgcatggc tacgtagata agtagcatgg

6360

cgggttaatc attaactaca cctgcaggag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc

6420

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc

6480

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcaggtc gacgcatgcg gtaccgggag

6540

atgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac

6600

ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg

6660

ttcggtccca gggctggcac tctgtcgata ccccaccgag accccattgg gaccaatacg

6720

cccgcgtttc ttccttttcc ccaccccaac ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg

6780

cagccaacgt cggggcggca agccctgcca tagccactac gggtacgtag gccaaccact

6840

agaactatag ctagagtcct gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat

6900

gcgaaccact tcatccgggg tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtctacc

6960

gatctcctga agccagggca gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc

7020

cgccaatgcc tgacgatgcg tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag

7080

aaatgcctcg acttcgctgc tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat

7140

gaaggcacga acccagttga cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg

7200

tatgcgctca cgcaactggt ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt

7260

ggcggttttc atggcttgtt atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa

7320

gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac

7380

gcagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa

7440

gtatgggcat cattcgcaca tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg

7500

ctcttgatct tttcggtcgt gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg

7560

actccgatta cctcgggaac ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg

7620

accaagaagc ggttgttggc gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc

7680

gtagtgagat ctatatctat gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg

7740

ccaccgcgct catcaatctc ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct

7800

acgtgcaagc agattacggt gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac

7860

gggaagaagt gatgcacttt gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag

7920

ccgagatcgg cttcccggcc gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata

7980

gtctttacca tgcccttggc cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga

8040

aaatgaagag tttgctttag ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg

8100

gactgatttc agtttacaac tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat

8160

ctattttgtt cagtttaaga ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat

8220

ttattactca accgtaaccg attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac

8280

cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg

8340

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa

8400

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc

8460

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc

8520

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat

8580

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc

8640

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct

8700

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg

8760

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc

8820

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga

8880

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa

8940

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta

9000

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc

9060

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg

9120

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga

9180

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg

9240

agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct

9300

gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg

9360

agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc

9420

cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa

9480

ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc

9540

cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt

9600

cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc

9660

ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt

9720

tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc

9780

catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt

9840

gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata

9900

gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga

9960

tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag

10020

catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa

10080

aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt

10140

attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga

10200

aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa

10260

acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc

10320

aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga

10380

gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag

10440

ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt

10500

ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta

10560

gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag

10620

cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg

10680

cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcaa ataagcgttg

10740

atattcagtc aattacaaac attaataacg aagagatgac agaaaaattt tcattctgtg

10800

acagagaa

10808

<210> 57

<211> 453

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Любая аминокислота

<400> 57

Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 58

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 59

<211> 1310

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 59

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga

60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc

120

atgcgctcag ggctgagcgc ggggagagca gagcacacaa gctcatagac cctggtcgtg

180

ggggggagga ccggggagct ggcgcggggc aaactgggaa agcggtgtcg tgtgctggct

240

ccgccctctt cccgagggtg ggggagaacg gtatataagt gcggcagtcg ccttggacgt

300

tctttttcgc aacgggtttg ccgtcagaac gcaggtgagg ggcgggtgtg gcttccgcgg

360

gccgccgagc tggaggtcct gctccgagcg ggccgggccc cgctgtcgtc ggcggggatt

420

agctgcgagc attcccgctt cgagttgcgg gcggcgcggg aggcagagtg cgaggcctag

480

cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc tagcgtggtg tccgcgccgc

540

cgccgcgtgc tactccggcc gcactctggt cttttttttt tttgttgttg ttgccctgct

600

gccttcgatt gccgttcagc aataggggct aacaaaggga gggtgcgggg cttgctcgcc

660

cggagcccgg agaggtcatg gttggggagg aatggaggga caggagtggc ggctggggcc

720

cgcccgcctt cggagcacat gtccgacgcc acctggatgg ggcgaggcct ggggtttttc

780

ccgaagcaac caggctgggg ttagcgtgcc gaggccatgt ggccccagca cccggcacga

840

tctggcttgg cggcgccgcg ttgccctgcc tccctaacta gggtgaggcc atcccgtccg

900

gcaccagttg cgtgcgtgga aagatggccg ctcccgggcc ctgttgcaag gagctcaaaa

960

tggaggacgc ggcagcccgg tggagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaagagggc

1020

ctggtccctc accggctgct gcttcctgtg accccgtggt cctatcggcc gcaatagtca

1080

cctcgggctt ttgagcacgg ctagtcgcgg cggggggagg ggatgtaatg gcgttggagt

1140

ttgttcacat ttggtgggtg gagactagtc aggccagcct ggcgctggaa gtcatttttg

1200

gaatttgtcc ccttgagttt tgagcggagc taattctcgg gcttcttagc ggttcaaagg

1260

tatcttttaa accctttttt aggtgttgtg aaaaccaccg ctaattcaaa

1310

<210> 60

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 60

gcgcgctcgc tcgctc

16

<210> 61

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 61

ggttga

6

<210> 62

<211> 4

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 62

agtt

4

<210> 63

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 63

ggttgg

6

<210> 64

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 64

agttgg

6

<210> 65

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 65

agttga

6

<210> 66

<211> 6

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 66

rrttrr

6

<210> 67

<211> 581

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 67

gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat

60

ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt

120

actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc

180

tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt

240

aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct

300

attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt

360

ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac

420

gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct

480

ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca

540

ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c

581

<210> 68

<211> 225

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 68

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct

60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc

225

<210> 69

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 69

actgaggc

8

<210> 70

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 70

gcctcagt

8

<210> 71

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 71

gagcgagcga gcgcgc

16

<210> 72

<211> 1923

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 72

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta

60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc

120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg

180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc

240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat

300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc

360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga

420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg

480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg

540

cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta

600

attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg

660

gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg

720

cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg

780

aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg

840

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc

900

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt

960

ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc

1020

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc

1080

ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg

1140

aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag

1200

gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc

1260

tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg

1320

gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg

1380

ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc

1440

ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg

1500

taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct

1560

gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg

1620

aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc

1680

cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg

1740

ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc

1800

ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg

1860

acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag

1920

cca

1923

<210> 73

<211> 1272

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 73

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc

60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc

120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc

180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc

240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt

300

ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag

360

taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa

420

gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg

480

ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc

540

tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt

600

gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag

660

cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt

720

ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat

780

cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt

840

ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct

900

gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg

960

cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag

1020

cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc

1080

ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag

1140

cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt

1200

tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac

1260

ctttggaact ga

1272

<210> 74

<211> 1177

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 74

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc

60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac

120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac

180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca

240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc

300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag

360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa

420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt

480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga

540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca

600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt

660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta

720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt

780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca

840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca

900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg

960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg

1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca

1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc

1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt

1177

<210> 75

<211> 547

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 75

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactga

547

<210> 76

<211> 556

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 76

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt

180

agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc

240

aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt

300

ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc

360

ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct

420

tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa

480

aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc

540

caacctttgg aactga

556

<210> 77

<211> 1179

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 77

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg

60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt

120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca

180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc

240

gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt

300

acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg

360

gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg

420

cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct

480

ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg

540

caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc

600

gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga

660

gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct

720

ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca

780

gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg

840

acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg

900

tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat

960

tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg

1020

gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa

1080

ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca

1140

gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga

1179

<210> 78

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 78

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt

60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t

141

<210> 79

<211> 317

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 79

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt

60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca

120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa

180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag

240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag

300

gcctaggctt ttgcaaa

317

<210> 80

<211> 241

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 80

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag

60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga

120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat

180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga

240

c

241

<210> 81

<211> 215

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 81

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa

60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc

120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg

180

gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac

215

<210> 82

<211> 546

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 82

ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc

60

tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc

120

cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag

180

gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag

240

gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct

300

gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt

360

gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca

420

ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa

480

gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg

540

gaactg

546

<210> 83

<211> 576

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 83

tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa

60

cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata

120

atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag

180

tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc

240

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta

300

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg

360

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt

420

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca

480

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag

540

gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag

576

<210> 84

<211> 150

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 84

ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc

60

gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct

120

gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct

150

<210> 85

<211> 1313

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 85

ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga

60

ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc

120

atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg

180

gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg

240

tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt

300

agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg

360

gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc

420

gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg

480

ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc

540

tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct

600

gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta

660

aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc

720

gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg

780

aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc

840

tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca

900

ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg

960

gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct

1020

tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc

1080

gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt

1140

tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg

1200

aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt

1260

attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa

1313

<210> 86

<211> 213

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 86

taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta

60

tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag

120

ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt

180

tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta

213

<210> 87

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 87

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 88

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 88

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 89

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 89

Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala

1 5 10 15

Ser Arg Gly

<210> 90

<211> 7

<212> PRT

<213> Обезьяний вирус 40

<400> 90

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 91

<211> 21

<212> ДНК

<213> Обезьяний вирус 40

<400> 91

cccaagaaga agaggaaggt g

21

<210> 92

<211> 16

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность бипартатного NLS нуклеоплазмина

<400> 92

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400> 93

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность NLS C-myc

<400> 94

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro

1 5 10

<210> 95

<211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Gly Gly Tyr

35

<210> 96

<211> 42

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Домен IBB из последовательности импортина-альфа

<400> 96

Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys

20 25 30

Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val

35 40

<210> 97

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400> 97

Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro

1 5

<210> 98

<211> 8

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> Описание неизвестного:

Последовательность T-белка миомы

<400> 98

Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp

1 5

<210> 99

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu

1 5

<210> 100

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 100

Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro

1 5 10

<210> 101

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 101

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga

60

gcgagcgcgc

70

<210> 102

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 102

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga

60

gcgagcgcgc

70

<210> 103

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 103

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 104

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 104

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 105

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 105

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 106

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 106

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 107

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 107

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 108

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 108

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 109

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 109

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag

60

tgagcgagcg agcgcgc

77

<210> 110

<211> 77

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 110

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag

60

tgagcgagcg agcgcgc

77

<210> 111

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 111

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

51

<210> 112

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 112

gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c

51

<210> 113

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 113

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 114

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 114

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 115

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 115

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 116

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 116

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 117

<211> 5

<212> PRT

<213> Вирус гриппа

<400> 117

Asp Arg Leu Arg Arg

1 5

<210> 118

<211> 7

<212> PRT

<213> Вирус гриппа

<400> 118

Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys

1 5

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> Вирус гепатита дельта

<400> 119

Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu

1 5 10

<210> 120

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 120

Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 121

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 121

Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Lys Lys

20

<210> 122

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 122

Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys

1 5 10 15

Lys

<210> 123

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 123

gtttaaac

8

<210> 124

<211> 8

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 124

ttaattaa

8

<210> 125

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 125

aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt

60

cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc

120

tgcggcgcgc gcagcacctt t

141

<210> 126

<211> 317

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 126

ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt

60

agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca

120

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa

180

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag

240

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag

300

gcctaggctt ttgcaaa

317

<210> 127

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 127

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 128

<211> 60

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 128

gagacagaca cactcctgct atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac

60

<210> 129

<211> 1260

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус-2

<400> 129

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag

60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt

1200

taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga

1260

<210> 130

<211> 1932

<212> ДНК

<213> Аденоассоциированный вирус-2

<400> 130

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc

60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat

120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag

180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg

240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg

300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt

360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc

420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa

480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg

540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag

600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact

660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag

720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg

780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc

840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa

900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc

960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag

1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc

1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg

1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc

1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc

1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg

1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag

1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg

1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca

1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg

1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg

1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc

1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt

1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg

1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa

1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga

1920

cactctctct ga

1932

<210> 131

<211> 1876

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 131

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg

60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa

1876

<210> 132

<211> 1194

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 132

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag

60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag

120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg

180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta

240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc

300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg

360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt

420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc

480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa

540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg

600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg

660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag

720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc

780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag

840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc

900

aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg

960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga

1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa

1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc

1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa

1194

<210> 133

<211> 1876

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 133

cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg

60

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt

120

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga

180

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct

240

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac

300

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat

360

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac

420

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt

480

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag

540

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc

600

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag

660

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac

720

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc

780

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac

840

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg

900

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct

960

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac

1020

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt

1080

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg

1140

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag

1200

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat

1260

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca

1320

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga

1380

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt

1440

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc

1500

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac

1560

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca

1620

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc

1680

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc

1740

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat

1800

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg

1860

catctttgaa caataa

1876

<210> 134

<211> 51

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 134

ctaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg c

51

<210> 135

<211> 65

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 135

ctaggactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct

60

cagtc

65

<210> 136

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 136

ggactgaggc cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag

60

tcctgca

67

<210> 137

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 137

gtgcgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggcgcactc a

41

<210> 138

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 138

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt cctgca

56

<210> 139

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 139

ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtc

54

<210> 140

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 140

ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacggcctca gtcctgca

48

<210> 141

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 141

ctaggactga ggccgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtc

46

<210> 142

<211> 67

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 142

ggactgaggc ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcgcctcag

60

tcctgca

67

<210> 143

<211> 47

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 143

atacctaggc acgcgtgtta ctagttatta atagtaatca attacgg

47

<210> 144

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 144

atacctaggg gccgcacgcg tgttactag

29

<210> 145

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 145

atacactcag tgcctgcagg cacgtggtcc ggagatccag ac

42

<210> 146

<211> 3754

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 146

cctaggtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct

60

tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatcgcggcc gctcaatatt ggccattagc

120

catattattc attggttata tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt

180

gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg

240

gcattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc

300

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa

360

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac

420

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca

480

agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg

540

gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt

600

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc

660

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat

720

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg

780

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc

840

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg

900

agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc

960

cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc

1020

cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa

1080

gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc

1140

gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct

1200

gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg

1260

gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt

1320

gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac

1380

ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt

1440

ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg

1500

gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc

1560

ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg

1620

cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc

1680

ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag

1740

ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg

1800

cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg

1860

accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttttagcct tcttcttttt cctacagctc

1920

ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcatttgt cgacagaatt cctcgaagat

1980

ccgaaggggt tcaagcttgg cattccggta ctgttggtaa agccagttta aacgccgcca

2040

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg

2100

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct

2160

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca

2220

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga

2280

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct

2340

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc

2400

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc

2460

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga

2520

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg

2580

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc

2640

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg

2700

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt

2760

aattaattaa gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt

2820

gggtatacat ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg

2880

atatgtaatt actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg

2940

ttatttacgc tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac

3000

tgatattctt aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct

3060

gtatctagct attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt

3120

gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt

3180

gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg

3240

gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg

3300

ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc

3360

tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc

3420

cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg

3480

tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa

3540

tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggctcta gagcatggct acgtagataa

3600

gtagcatggc gggttaatca ttaactacac ctgcagcagg aacccctagt gatggagttg

3660

gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc cctgcaggac tgaggccggg cgaccaaagg

3720

tcgcccgacg cccgggcggc ctcagtcctg cagg

3754

<210> 147

<211> 8418

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 147

ggcagctgcg cgctcgctcg ctcacctagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga

60

cctttggtcg cccggcctag gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca

120

tcactagggg ttccttgtag ttaatgatta acccgccatg ctacttatcg cggccgctca

180

atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata ttggctattg

240

gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct catgtccaat

300

atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc

360

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc

420

tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt

480

aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca

540

cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg

600

taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca

660

gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt

720

cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt

780

attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg

840

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc

900

gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag

960

cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg

1020

cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg

1080

acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc

1140

tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc

1200

tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg

1260

gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg

1320

ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct

1380

gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt

1440

aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg

1500

ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg

1560

gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc

1620

ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa

1680

tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg

1740

aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag

1800

gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag

1860

cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc

1920

ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgtttt agccttcttc

1980

tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca tttgtcgaca

2040

gaattcctcg aagatccgaa ggggttcaag cttggcattc cggtactgtt ggtaaagcca

2100

gtttaaacgc cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca

2160

tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg

2220

agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc

2280

ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct

2340

accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc

2400

aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt

2460

tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg

2520

gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg

2580

ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg

2640

gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc

2700

tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga

2760

agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg

2820

acgagctgta caagtaatta attaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc

2880

tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca

2940

tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt

3000

taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat

3060

ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc

3120

tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt

3180

gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg

3240

cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg

3300

tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc

3360

cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt

3420

gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt

3480

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca

3540

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga

3600

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg ctctagagca

3660

tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacacctgca gcaggaaccc

3720

ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctccctgc aggactgagg

3780

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tcctgcaggg agcgagcgag

3840

cgcgcagctg cctgcacggg cgcgccggta ccgggagatg ggggaggcta actgaaacac

3900

ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc aataaaaaga cagaataaaa

3960

cgcacgggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct

4020

gtcgataccc caccgagacc ccattgggac caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca

4080

ccccaacccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaagc

4140

cctgccatag ccactacggg tacgtaggcc aaccactaga actatagcta gagtcctggg

4200

cgaacaaacg atgctcgcct tccagaaaac cgaggatgcg aaccacttca tccggggtca

4260

gcaccaccgg caagcgccgc gacggccgag gtctaccgat ctcctgaagc cagggcagat

4320

ccgtgcacag caccttgccg tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg

4380

agaccgaaac cttgcgctcg ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc

4440

ccaaggttgc cgggtgacgc acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagttgacat

4500

aagcctgttc ggttcgtaaa ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca

4560

gaaccttgac cgaacgcagc ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg

4620

actgtttttt tgtacagtct atgcctcggg catccaagca gcaagcgcgt tacgccgtgg

4680

gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag

4740

cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt

4800

aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag

4860

ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat cagccggact ccgattacct cgggaacttg

4920

ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct

4980

ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat

5040

ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc

5100

aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac

5160

gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat

5220

atcgacccaa gtaccgccac ctaacaattc gttcaagccg agatcggctt cccggccgcg

5280

gagttgttcg gtaaattgtc acaacgccgc gaatatagtc tttaccatgc ccttggccac

5340

gcccctcttt aatacgacgg gcaatttgca cttcagaaaa tgaagagttt gctttagcca

5400

taacaaaagt ccagtatgct ttttcacagc ataactggac tgatttcagt ttacaactat

5460

tctgtctagt ttaagacttt attgtcatag tttagatcta ttttgttcag tttaagactt

5520

tattgtccgc ccacacccgc ttacgcaggg catccattta ttactcaacc gtaaccgatt

5580

ttgccaggtt acgcggctgg tctgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa

5640

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg

5700

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg

5760

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag

5820

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga

5880

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct

5940

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc

6000

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg

6060

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc

6120

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca

6180

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag

6240

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct

6300

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc

6360

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga

6420

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca

6480

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat

6540

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac

6600

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt

6660

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt

6720

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag

6780

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct

6840

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt

6900

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc

6960

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt

7020

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg

7080

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg

7140

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct

7200

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc

7260

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt

7320

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt

7380

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg

7440

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat

7500

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg

7560

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc

7620

gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc

7680

ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag

7740

agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc

7800

gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa

7860

gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg

7920

aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt

7980

gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc

8040

gcgtcccatt cgccattcag gctgcaaata agcgttgata ttcagtcaat tacaaacatt

8100

aataacgaag agatgacaga aaaattttca ttctgtgaca gagaaaaagt agccgaagat

8160

gacggtttgt cacatggagt tggcaggatg tttgattaaa aacataacag gaagaaaaat

8220

gccccgctgt gggcggacaa aatagttggg aactgggagg ggtggaaatg gagtttttaa

8280

ggattattta gggaagagtg acaaaataga tgggaactgg gtgtagcgtc gtaagctaat

8340

acgaaaatta aaaatgacaa aatagtttgg aactagattt cacttatctg gttcggatct

8400

cctagtgagc tccctgca

8418

<210> 148

<211> 225

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 148

tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct

60

ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct

120

gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg

180

ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc

225

<210> 149

<211> 1177

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 149

ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc

60

tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac

120

ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac

180

agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca

240

tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc

300

ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag

360

tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa

420

tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt

480

tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga

540

cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca

600

agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt

660

tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta

720

attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt

780

accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca

840

gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca

900

ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg

960

tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg

1020

gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca

1080

gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc

1140

tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt

1177

<210> 150

<211> 1326

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 150

ctgcagggcc cactagtgga gccgagagta attcatacaa aaggagggat cgccttcgca

60

aggggagagc ccagggaccg tccctaaatt ctcacagacc caaatccctg tagccgcccc

120

acgacagcgc gaggagcatg cgcccagggc tgagcgcggg tagatcagag cacacaagct

180

cacagtcccc ggcggtgggg ggaggggcgc gctgagcggg ggccagggag ctggcgcggg

240

gcaaactggg aaagtggtgt cgtgtgctgg ctccgccctc ttcccgaggg tgggggagaa

300

cggtatataa gtgcggtagt cgccttggac gttctttttc gcaacgggtt tgccgtcaga

360

acgcaggtga gtggcgggtg tggcttccgc gggccccgga gctggagccc tgctctgagc

420

gggccgggct gatatgcgag tgtcgtccgc agggtttagc tgtgagcatt cccacttcga

480

gtggcgggcg gtgcgggggt gagagtgcga ggcctagcgg caaccccgta gcctcgcctc

540

gtgtccggct tgaggcctag cgtggtgtcc gccgccgcgt gccactccgg ccgcactatg

600

cgttttttgt ccttgctgcc ctcgattgcc ttccagcagc atgggctaac aaagggaggg

660

tgtggggctc actcttaagg agcccatgaa gcttacgttg gataggaatg gaagggcagg

720

aggggcgact ggggcccgcc cgccttcgga gcacatgtcc gacgccacct ggatggggcg

780

aggcctgtgg ctttccgaag caatcgggcg tgagtttagc ctacctgggc catgtggccc

840

tagcactggg cacggtctgg cctggcggtg ccgcgttccc ttgcctccca acaagggtga

900

ggccgtcccg cccggcacca gttgcttgcg cggaaagatg gccgctcccg gggccctgtt

960

gcaaggagct caaaatggag gacgcggcag cccggtggag cgggcgggtg agtcacccac

1020

acaaaggaag agggccttgc ccctcgccgg ccgctgcttc ctgtgacccc gtggtctatc

1080

ggccgcatag tcacctcggg cttctcttga gcaccgctcg tcgcggcggg gggaggggat

1140

ctaatggcgt tggagtttgt tcacatttgg tgggtggaga ctagtcaggc cagcctggcg

1200

ctggaagtca ttcttggaat ttgccccttt gagtttggag cgaggctaat tctcaagcct

1260

cttagcggtt caaaggtatt ttctaaaccc gtttccaggt gttgtgaaag ccaccgctaa

1320

ttcaaa

1326

<210> 151

<211> 573

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 151

gtaagagttt tatgtttttt catctctgct tgtatttttc tagtaatgga agcctggtat

60

tttaaaatag ttaaattttc ctttagtgct gatttctaga ttattattac tgttgttgtt

120

gttattattg tcattatttg catctgagaa cccttaggtg gttatattat tgatatattt

180

ttggtatctt tgatgacaat aatgggggat tttgaaagct tagctttaaa tttcttttaa

240

ttaaaaaaaa atgctaggca gaatgactca aattacgttg gatacagttg aatttattac

300

ggtctcatag ggcctgcctg ctcgaccatg ctatactaaa aattaaaagt gtgtgttact

360

aattttataa atggagtttc catttatatt tacctttatt tcttatttac cattgtctta

420

gtagatattt acaaacatga cagaaacact aaatcttgag tttgaatgca cagatataaa

480

cacttaacgg gttttaaaaa taataatgtt ggtgaaaaaa tataactttg agtgtagcag

540

agaggaacca ttgccacctt cagattttcc tgt

573

<210> 152

<211> 1993

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 152

acgatcggga actggcatct tcagggagta gcttaggtca gtgaagagaa gaacaaaaag

60

cagcatatta cagttagttg tcttcatcaa tctttaaata tgttgtgtgg tttttctctc

120

cctgtttcca cagacaagag tgagatcgcc catcggtata atgatttggg agaacaacat

180

ttcaaaggcc tgtaagttat aatgctgaaa gcccacttaa tatttctggt agtattagtt

240

aaagttttaa aacacctttt tccaccttga gtgtgagaat tgtagagcag tgctgtccag

300

tagaaatgtg tgcattgaca gaaagactgt ggatctgtgc tgagcaatgt ggcagccaga

360

gatcacaagg ctatcaagca ctttgcacat ggcaagtgta actgagaagc acacattcaa

420

ataatagtta attttaattg aatgtatcta gccatgtgtg gctagtagct cctttcctgg

480

agagagaatc tggagcccac atctaacttg ttaagtctgg aatcttattt tttatttctg

540

gaaaggtcta tgaactatag ttttgggggc agctcactta ctaactttta atgcaataag

600

atctcatggt atcttgagaa cattattttg tctctttgta gtactgaaac cttatacatg

660

tgaagtaagg ggtctatact taagtcacat ctccaacctt agtaatgttt taatgtagta

720

aaaaaatgag taattaattt atttttagaa ggtcaatagt atcatgtatt ccaaataaca

780

gaggtatatg gttagaaaag aaacaattca aaggacttat ataatatcta gccttgacaa

840

tgaataaatt tagagagtag tttgcctgtt tgcctcatgt tcataaatct attgacacat

900

atgtgcatct gcacttcagc atggtagaag tccatattcc tttgcttgga aaggcaggtg

960

ttcccattac gcctcagaga atagctgacg ggaagaggct ttctagatag ttgtatgaaa

1020

gatatacaaa atctcgcagg tatacacagg catgatttgc tggttgggag agccacttgc

1080

ctcatactga ggtttttgtg tctgcttttc agagtcctga ttgccttttc ccagtatctc

1140

cagaaatgct catacgatga gcatgccaaa ttagtgcagg aagtaacaga ctttgcaaag

1200

acgtgtgttg ccgatgagtc tgccgccaac tgtgacaaat cccttgtgag taccttctga

1260

ttttgtggat ctactttcct gctttctgga actctgtttc aaagccaatc atgactccat

1320

cacttaaggc cccgggaaca ctgtggcaga gggcagcaga gagattgata aagccagggt

1380

gatgggaatt ttctgtggga ctccatttca tagtaattgc agaagctaca atacactcaa

1440

aaagtctcac cacatgactg cccaaatggg agcttgacag tgacagtgac agtagatatg

1500

ccaaagtgga tgagggaaag accacaagag ctaaaccctg taaaaagaac tgtaggcaac

1560

taaggaatgc agagagaaga agttgccttg gaagagcata ccaactgcct ctccaatacc

1620

aatggtcatc cctaaaacat acgtatgaat aacatgcaga ctaagcaggc tacatttagg

1680

aatatacatg tatttacata aatgtatatg catgtaacaa caatgaatga aaactgaggt

1740

catggatctg aaagagagca agggggctta catgagaggg tttggaggga ggggttggag

1800

ggagggaggt attattcttt agttttacag ggaacgtagt aaaaacatag gcttctccca

1860

aaggagcaga gcccatgagg agctgtgcaa ggttccccag cttgatttta cctgctcctc

1920

aaattccctt gatttgtttt tattataatg actttactcc tagcttttag tgtcagatag

1980

aaaacatgga agg

1993

<210> 153

<211> 1350

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 153

taggaggctg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagaccagc ctgggcaaca

60

tagtgtgatc ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag

120

tccccagcca cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat ggtccaggct

180

gcagtgagcc atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct

240

cacaacaaca acaacaacaa caaaaaggct gagctgcacc atgcttgacc cagtttctta

300

aaattgttgt caaagcttca ttcactccat ggtgctatag agcacaagat tttatttggt

360

gagatggtgc tttcatgaat tcccccaaca gagccaagct ctccatctag tggacaggga

420

agctagcagc aaaccttccc ttcactacaa aacttcattg cttggccaaa aagagagtta

480

attcaatgta gacatctatg taggcaatta aaaacctatt gatgtataaa acagtttgca

540

ttcatggagg gcaactaaat acattctagg actttataaa agatcacttt ttatttatgc

600

acagggtgga acaagatgga ttatcaagtg tcaagtccaa tctatgacat caattattat

660

acatcggagc cctgccaaaa aatcaatgtg aagcaaatcg cagcccgcct cctgcctccg

720

ctctactcac tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg

780

ataaactgca aaaggctgaa gagcatgact gacatctacc tgctcaacct ggccatctct

840

gacctgtttt tccttcttac tgtccccttc tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac

900

tttggaaata caatgtgtca actcttgaca gggctctatt ttataggctt cttctctgga

960

atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt

1020

gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg

1080

gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat

1140

tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca

1200

ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg

1260

ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg

1320

cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt

1350

<210> 154

<211> 1223

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 154

tgacagagac tcttgggatg acgcactgct gcatcaaccc catcatctat gcctttgtcg

60

gggagaagtt cagaaactac ctcttagtct tcttccaaaa gcacattgcc aaacgcttct

120

gcaaatgctg ttctattttc cagcaagagg ctcccgagcg agcaagctca gtttacaccc

180

gatccactgg ggagcaggaa atatctgtgg gcttgtgaca cggactcaag tgggctggtg

240

acccagtcag agttgtgcac atggcttagt tttcatacac agcctgggct gggggtgggg

300

tgggagaggt cttttttaaa aggaagttac tgttatagag ggtctaagat tcatccattt

360

atttggcatc tgtttaaagt agattagatc ttttaagccc atcaattata gaaagccaaa

420

tcaaaatatg ttgatgaaaa atagcaacct ttttatctcc ccttcacatg catcaagtta

480

ttgacaaact ctcccttcac tccgaaagtt ccttatgtat atttaaaaga aagcctcaga

540

gaattgctga ttcttgagtt tagtgatctg aacagaaata ccaaaattat ttcagaaatg

600

tacaactttt tacctagtac aaggcaacat ataggttgta aatgtgttta aaacaggtct

660

ttgtcttgct atggggagaa aagacatgaa tatgattagt aaagaaatga cacttttcat

720

gtgtgatttc ccctccaagg tatggttaat aagtttcact gacttagaac caggcgagag

780

acttgtggcc tgggagagct ggggaagctt cttaaatgag aaggaatttg agttggatca

840

tctattgctg gcaaagacag aagcctcact gcaagcactg catgggcaag cttggctgta

900

gaaggagaca gagctggttg ggaagacatg gggaggaagg acaaggctag atcatgaaga

960

accttgacgg cattgctccg tctaagtcat gagctgagca gggagatcct ggttggtgtt

1020

gcagaaggtt tactctgtgg ccaaaggagg gtcaggaagg atgagcattt agggcaagga

1080

gaccaccaac agccctcagg tcagggtgag gatggcctct gctaagctca aggcgtgagg

1140

atgggaagga gggaggtatt cgtaaggatg ggaaggaggg aggtattcgt gcagcatatg

1200

aggatgcaga gtcagcagaa ctg

1223

<210> 155

<211> 215

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 155

gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa

60

cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc

120

tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg

180

gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accac

215

<210> 156

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 156

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca cctaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctaggtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120

actccatcac taggggttcc t

141

<210> 157

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 157

gcgcgctcgc tcgctcacc

19

<210> 158

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 158

ctaggtgagc gagcgagcgc gc

22

<210> 159

<211> 75

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 159

cctgcaggac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg

60

cctcagtcct gcagg

75

<210> 160

<211> 130

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 160

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagt

60

gcgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcactcag tgagcgagcg agcgcgcagc

120

tgcctgcagg

130

<210> 161

<211> 142

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 161

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctcc ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg

60

acctttggtc gcccggcctc agtcctaggg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc

120

aactccatca ctaggggttc ct

142

<210> 162

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 162

gcgcgctcgc tcgctcactg agtgcgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcact

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 163

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 163

gcgcgctcgc tcgctcactg a

21

<210> 164

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 164

gtgagcgagc gagcgcgc

18

<210> 165

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 165

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc

60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 166

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 166

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc

60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 167

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 167

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc

60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 168

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 168

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg

60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 169

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 169

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 170

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 170

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 171

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 171

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc

60

gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 172

<211> 89

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 172

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc

60

gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc

89

<210> 173

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 173

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc

60

ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 174

<211> 87

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 174

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg

60

gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc

87

<210> 175

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 175

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 176

<211> 85

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 176

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc

60

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc

85

<210> 177

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 177

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 178

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 178

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg

60

cctcagtgag cgagcgagcg cgc

83

<210> 179

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 179

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc

60

tcagtgagcg agcgagcgcg c

81

<210> 180

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 180

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc

60

tcagtgagcg agcgagcgcg c

81

<210> 181

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 181

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 182

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 182

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 183

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 183

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgca g

81

<210> 184

<211> 81

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 184

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgca g

81

<210> 185

<211> 72

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 185

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc

60

gagcgagcgc gc

72

<210> 186

<211> 80

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 186

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct

60

cagtgagcga gcgagcgcgc

80

<210> 187

<211> 79

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 187

gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc

60

agtgagcgag cgagcgcgc

79

<210> 188

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

олигонуклеотид

<400> 188

ggagtcaaag ttctgtttgc cctgatctgc atcgctgtgg ccgaggcc

48

<210> 189

<211> 99

<212> ДНК