РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США под регистрационным № 62/776393, поданной 6 декабря 2018 года, полное изобретение которой включено в данный документ посредством ссылки.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[2] Содержание перечня последовательностей, поданного в электронном виде в текстовом файле ASCII (название SA9-468TW_SequenceListing_ST25; размер 28470 байт; дата создания 2 декабря 2019 г.) включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[3] Путь коагуляции частично включает образование ферментативного комплекса фактора VIIIa (FVIIIa) и фактора IXa (FIXa) (комплекс Xase) на поверхности тромбоцитов. FIXa представляет собой сериновую протеазу с относительно слабой каталитической активностью без своего кофактора FVIIIa. Комплекс Xase расщепляет фактор X (FX) с образованием фактора Xa (FXa), который в свою очередь взаимодействует с фактором Va (FVa), расщепляя протромбин и создавая тромбин. Гемофилия B представляет собой нарушение свертываемости крови, вызванное мутациями и/или делециями в гене FIX, что приводит к дефициту активности FIX.
[4] При гемофилии свертывание крови нарушается из-за отсутствия определенных плазматических факторов свертывания крови. Гемофилия B (также известная как болезнь Кристмаса) является одним из наиболее распространенных наследственных нарушений свертываемости крови в мире. Она вызвана дефицитом фактора IX, что может быть результатом либо пониженного синтеза белка фактора IX, либо дефектной молекулой с пониженной активностью. Она приводит к снижению активности свертывания крови in vivo и in vitro и требует обширного медицинского мониторинга в течение всей жизни страдающего индивидуума. Без эффективной профилактики рецидивирующие гемартрозы приводят к развитию прогрессирующей и инвалидизирующей артропатии и ухудшению качества жизни (Giangrande P., Expert Opin Pharmacother. 2005; 6:1517-24).
[5] Лечение гемофилии B происходит с помощью замены отсутствующего фактора свертывания крови на концентраты экзогенных факторов, высокообогащенные фактором IX. Однако получение такого концентрата из крови сопряжено с техническими трудностями. Следовательно, в данной области существует потребность в терапии на основе FIX, которая преодолевает трудности и ограничения существующих видов заместительной терапии. Генная терапия представляет собой потенциальный подход для длительного лечения гемофилии B с помощью стабильной интеграции кассеты экспрессии трансгена, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX, в геном целевых клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[6] В настоящем изобретении представлены способы предупреждения или лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX), где лентивирусный вектор упакован в сверхэкспрессирующие (суперэкспрессирующие) CD47 клетки HEK293T, которые характеризуются более высоким уровнем экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, полученный в немодифицированных клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™), и где эффективная доза снижена по сравнению с контрольной дозой контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, что и при использовании указанного лентивирусного вектора.
В некоторых вариантах осуществления контрольный лентивирусный вектор содержит 19 молекул/мкм2 CD47 на поверхности контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно 3,0 раза, по меньшей мере приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно 4,0 раза, по меньшей мере приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно 5,0 раза, по меньшей мере приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере приблизительно 6,0 раза, по меньшей мере приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере приблизительно 7,0 раза, по меньшей мере приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере приблизительно 8,0 раза, по меньшей мере приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере приблизительно 9,0 раза, по меньшей мере приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем у контрольного лентивирусного вектора, полученного в клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™).
[7] В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет менее чем приблизительно 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (ТЕ/кг), менее чем 4×1010 ТЕ/кг, менее чем 3×1010 ТЕ/кг, менее чем 2×1010 ТЕ/кг, менее чем 1×1010 ТЕ/кг, менее чем 9×109 ТЕ/кг, менее чем 8×109 ТЕ/кг, менее чем 7×109 ТЕ/кг, менее чем 6×109 ТЕ/кг, менее чем 5×109 ТЕ/кг, менее чем 4×109 ТЕ/кг, менее чем 3×109 ТЕ/кг, менее чем 2×109 ТЕ/кг, менее чем 1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9×108 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 8×108 ТЕ/кг.
[8] В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется одна или несколько из следующих характеристик после введения: (а) пониженная макрофагальная трансдукция лентивирусного вектора по сравнению с контрольным лентивирусным вектором; (b) пониженный аллоспецифический иммунный ответ на лентивирусный вектор по сравнению с контрольным лентивирусным вектором; (c) активность FIX, составляющая по меньшей мере 30% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере 3 недели после введения; (d) тканеспецифическая экспрессия лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке; и (e) любая комбинация (a)-(d).
[9] В некоторых вариантах осуществления аллоспецифический иммунный ответ предусматривает высвобождение цитокина в ответ на лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из MIP-1a, MIP-1b, MCP-1 и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MIP-1a после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MIP-1a после введения контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MIP-1b после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MIP-1b после введения контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MCP-1 после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MCP-1 после введения контрольного лентивирусного вектора.
[10] В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 125%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 175%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 225%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 275% или по меньшей мере приблизительно 300% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере три недели после введения лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере приблизительно 150% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере три недели после введения лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления активность FIX в плазме крови через 24-48 часов после введения лентивирусного вектора увеличивается по сравнению с субъектом, которому вводят контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления активность FIX в плазме крови увеличивается после введения в по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, по меньшей мере приблизительно 180 раз, по меньшей мере приблизительно 190 раз или по меньшей мере приблизительно 200 раз по сравнению с субъектом, которому вводят контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора.
[11] В некоторых вариантах осуществления у субъекта наблюдается повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В некоторых вариантах осуществления повышенный уровень локализации характеризуется числом копий вектора (VCN) лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, по меньшей мере приблизительно 180 раз, по меньшей мере приблизительно 190 раз или по меньшей мере приблизительно 200 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В некоторых вариантах осуществления повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 10 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В некоторых вариантах осуществления повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 50 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В некоторых вариантах осуществления повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 100 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта.
[12] В некоторых вариантах осуществления CD47 представляет собой CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления CD47 человека содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере 99% или приблизительно 100% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор не содержит полипептид MHC-I. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке-хозяине, экспрессирующей CD47 в высокой концентрации по сравнению с клетками HEK293T (ATCC® CRL-11268™).
[13] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
[14] В настоящем изобретении также представлены способы предупреждения или лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту менее чем 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (ТЕ/кг) лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX), где лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7.
[15] В некоторых вариантах осуществления доза составляет приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1×1010 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 9×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 8×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 7×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 6×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 5×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 4×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 3×109 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 2×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 1×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 9×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 8×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 7×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 6×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 5×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 4×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 3×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 2×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг или приблизительно 1×108 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет менее чем 5×1010 ТЕ/кг, менее чем 4,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 4×1010 ТЕ/кг, менее чем 3,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 3×1010 ТЕ/кг, менее чем 2,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 2×1010 ТЕ/кг, менее чем 1,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 1×1010 ТЕ/кг, менее чем 9,5×109 ТЕ/кг, менее чем 9×109 ТЕ/кг, менее чем 8,5×109 ТЕ/кг, менее чем 8×109 ТЕ/кг, менее чем 7,5×109 ТЕ/кг, менее чем 7×109 ТЕ/кг, менее чем 6,5×109 ТЕ/кг, менее чем 6×109 ТЕ/кг, менее чем 5,5×109 ТЕ/кг, менее чем 5×109 ТЕ/кг, менее чем 4,5×109 ТЕ/кг, менее чем 4×109 ТЕ/кг, менее чем 3,5×109 ТЕ/кг, менее чем 3×109 ТЕ/кг, менее чем 2,5×109 ТЕ/кг, менее чем 2×109 ТЕ/кг, менее чем 1,5×109 ТЕ/кг, менее чем 1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 1×108 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от 1×108 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×108 до 5×109 ТЕ/кг, от 1×108 до 1×109 ТЕ/кг, от 1×108 до 1×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 4×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 5×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 2×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 3×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 4×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 5×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 6×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 7×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 8×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 9×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 4×1010 до 5×1010 ТЕ/кг или от 4,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от 1×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 4,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 4×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 3,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 3×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 2,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 2×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 1,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 9×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 8×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 7×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 5×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 4×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 3×109 ТЕ/кг и от 1×109 до 2×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от 1×1010 до 2×1010 ТЕ/кг, от 1,1×1010 до 1,9×1010 ТЕ/кг, от 1,2×1010 до 1,8×1010 ТЕ/кг, от 1,3×1010 до 1,7×1010 ТЕ/кг или от 1,4×1010 до 1,6×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза составляет от приблизительно 4×109 ТЕ/кг до приблизительно 6×109 ТЕ/кг.
[16] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или нескольких доз. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят с помощью внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом-ребенком. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом-взрослым.
В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12.
[17] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит тканеспецифический промотор. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор, который избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени, предусматривает промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления целевая клетка печени представляет собой гепатоцит. В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты стабильно интегрирована в геном гепатоцита.
[18] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит донорный сайт сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит акцепторный сайт сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, rev-зависимый элемент (RRE) или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность gag представляет собой полноразмерную или усеченную последовательность gag. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит энхансер, целевую последовательность для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, последовательность интрона или любую их комбинацию.
[19] В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора вводят за один раз или разделяют на по меньшей мере две субдозы. В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора повторяют по меньшей мере дважды.
[20] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 7.
[21] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой альбумин, Fc-область иммуноглобулина, последовательность XTEN, C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, последовательность на основе PAS, последовательность на основе HAP, пептидную последовательность CTP, трансферрин, альбумин-связывающий компонент или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации этих полипептидов. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная аминокислотная последовательность связана с N-концом или C-концом аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид с активностью FIX, или встроена между двумя аминокислотами в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент встроен в полипептид с активностью FIX непосредственно после аминокислоты, соответствующей аминокислоте 103 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 105 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 142 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 149 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 162 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 166 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 174 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 224 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 226 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 228 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 413 из SEQ ID NO: 2 или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления полипептид FIX представляет собой полипептид FIX варианта R338L.
[22] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин экспрессирует CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин модифицирована для сверхэкспрессии CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин не экспрессирует MHC-I. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой CD47high/MHC-I-. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку HEK 293T CD47high/MHC-I-.
[23] В настоящем изобретении также представлены лентивирусные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, которая содержит (i) тканеспецифический промотор и (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную под SEQ ID NO: 1, где тканеспецифический промотор управляет экспрессией последовательности нуклеиновой кислоты в клетке печени.
[24] В настоящем изобретении также представлены лентивирусные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, которая содержит (i) донорный сайт сплайсинга; (ii) акцепторный сайт сплайсинга; (iii) последовательность gag; (iv) rev-зависимый элемент; (v) энхансер; (vi) посттранскрипционный регуляторный элемент, (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, и (viii) целевую последовательность для микроРНК.
[25] В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид с активностью FIX, который содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12.
[26] В некоторых вариантах осуществления поверхность лентивирусного вектора содержит более высокий уровень белка CD47, чем у контрольного лентивирусного вектора, полученного в клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™). В некоторых вариантах осуществления поверхность лентивирусного вектора не содержит MHC-I.
[27] Настоящее изобретение также направлено на способы лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет менее чем приблизительно 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (ТЕ/кг), менее чем 4×1010 ТЕ/кг, менее чем 3×1010 ТЕ/кг, менее чем 2×1010 ТЕ/кг, менее чем 1×1010 ТЕ/кг, менее чем 9×109 ТЕ/кг, менее чем 8×109 ТЕ/кг, менее чем 7×109 ТЕ/кг, менее чем 6×109 ТЕ/кг, менее чем 5×109 ТЕ/кг, менее чем 4×109 ТЕ/кг, менее чем 3×109 ТЕ/кг, менее чем 2×109 ТЕ/кг, менее чем 1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9×108 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 8×108 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1×1010 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 9×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 8×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 7×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 6×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 5×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 4×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 3×109 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 2×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 1×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 9×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 8×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 7×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 6×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 5×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 4×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 3×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 2×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг или приблизительно 1×108 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет менее чем 5×1010 ТЕ/кг, менее чем 4,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 4×1010 ТЕ/кг, менее чем 3,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 3×1010 ТЕ/кг, менее чем 2,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 2×1010 ТЕ/кг, менее чем 1,5×1010 ТЕ/кг, менее чем 1×1010 ТЕ/кг, менее чем 9,5×109 ТЕ/кг, менее чем 9×109 ТЕ/кг, менее чем 8,5×109 ТЕ/кг, менее чем 8×109 ТЕ/кг, менее чем 7,5×109 ТЕ/кг, менее чем 7×109 ТЕ/кг, менее чем 6,5×109 ТЕ/кг, менее чем 6×109 ТЕ/кг, менее чем 5,5×109 ТЕ/кг, менее чем 5×109 ТЕ/кг, менее чем 4,5×109 ТЕ/кг, менее чем 4×109 ТЕ/кг, менее чем 3,5×109 ТЕ/кг, менее чем 3×109 ТЕ/кг, менее чем 2,5×109 ТЕ/кг, менее чем 2×109 ТЕ/кг, менее чем 1,5×109 ТЕ/кг, менее чем 1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 1×108 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет от 1×108 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×108 до 5×109 ТЕ/кг, от 1×108 до 1×109 ТЕ/кг, от 1×108 до 1×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 4×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 5×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 2×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 3×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 4×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 5×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 6×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 7×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 8×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 9×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 2,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 3,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг, от 4×1010 до 5×1010 ТЕ/кг или от 4,5×1010 до 5×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет от 1×109 до 5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 4,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 4×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 3,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 3×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 2,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 2×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 1,5×1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 1010 ТЕ/кг, от 1×109 до 9×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 8×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 7×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 6×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 5×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 4×109 ТЕ/кг, от 1×109 до 3×109 ТЕ/кг и от 1×109 до 2×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет от 1×1010 до 2×1010 ТЕ/кг, от 1,1×1010 до 1,9×1010 ТЕ/кг, от 1,2×1010 до 1,8×1010 ТЕ/кг, от 1,3×1010 до 1,7×1010 ТЕ/кг или от 1,4×1010 до 1,6×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза составляет от приблизительно 4×109 ТЕ/кг до приблизительно 6×109 ТЕ/кг.
[28] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или нескольких доз. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят с помощью внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом-ребенком. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом-взрослым.
[29] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность является такой, как изложено под SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также направлено на векторы, содержащие раскрытую в данном документе последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит тканеспецифический промотор. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор, который избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени, предусматривает промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления целевая клетка печени представляет собой гепатоцит.
[30] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит донорный сайт сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит акцепторный сайт сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, rev-зависимый элемент (RRE), или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления последовательность gag представляет собой полноразмерную или усеченную последовательность gag. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит энхансер, целевую последовательность для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, последовательность интрона или любую их комбинацию.
[31] Настоящее изобретение также относится к клетке, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты или вектор, раскрытые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO, клетку HEK293, клетку BHK21, клетку PER.C6®, клетку NS0 и клетку CAP. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления клетка экспрессирует белок CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка модифицирована для сверхэкспрессии CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно 3,0 раза, по меньшей мере приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно 4,0 раза, по меньшей мере приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно 5,0 раза, по меньшей мере приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере приблизительно 6,0 раза, по меньшей мере приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере приблизительно 7,0 раза, по меньшей мере приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере приблизительно 8,0 раза, по меньшей мере приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере приблизительно 9,0 раза, по меньшей мере приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз больше белка CD47 на поверхности клетки по сравнению с контрольной клеткой, которая не модифицирована для сверхэкспрессии CD47. В некоторых вариантах осуществления CD47 представляет собой CD47 человека. В некоторых вариантах осуществления клетка не экспрессирует MHC-I.
[32] Настоящее изобретение также направлено на способы получения лентивирусного вектора, предусматривающие культивирование раскрытой в данном документе клетки в подходящих условиях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[33] На ФИГ. 1 представлена векторная карта лентивирусного вектора ("LV-coFIX-1-R338L"), содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с активностью FIX.
[34] На ФИГ. 2A-2B представлены графические изображения активности FIX в плазме крови у мышей HemB после введения в возрасте восьми недель лентивирусного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX. На ФИГ. 2А показана активность FIX в плазме крови при введении LV-coFIX-1-R338L посредством инъекции в хвостовую вену в дозе 3E9, 7,5E9, 2E10 или 6E10 ТЕ/кг, а на ФИГ. 2В показана соответствующая кривая доза-ответ. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (ФИГ. 2В).
[35] На ФИГ. 3A-3B представлены графические изображения активности FIX в плазме крови (ФИГ. 3A) и антигена FIX в плазме крови (ФИГ. 3B) в различные моменты времени не более 6 месяцев для мышей HemB, которым в возрасте 8 недель вводили LV-coFIX-1-R338L посредством инъекции в хвостовую вену в дозе 7,5E9 (кружки), 2E10 (квадраты) или 6E10 (треугольники) ТЕ/кг. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (ФИГ. 3A-3B).
[36] На ФИГ. 4A-4B представлено графическое изображение постоянной экспрессии FIX в различные моменты времени не более 6 месяцев (ФИГ. 4A) и зависимость доза-ответ LV-FIX при аналогичных дозах (ФИГ. 4B) на неонатальной, подростковой или взрослой стадиях. Мышам HemB вводили посредством внутривенной инъекции LV-coFIX-1-R338L в возрасте восьми недель (квадраты) или двух дней (кружки) в дозе 7,5E9, 2E10 или 6E10 ТЕ/кг; или мышам HemB в двухнедельном возрасте вводили (треугольники) посредством внутривенной инъекции LV-coFIX-1-R338L в дозе 3E9, 7,5E9 или 2E10 ТЕ/кг, как указано (ФИГ. 4A). Зависимость доза-ответ измеряли по активности FIX при различных дозах, тестируемых на ФИГ. 4А у мышей HemB в возрасте восьми недель (квадраты), двух недель (треугольники) и двух дней (кружки). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (ФИГ. 4A-4B).
[37] На ФИГ. 5 представлен график, иллюстрирующий число копий вектора (VCN) лентивирусного вектора в макрофагах мышей NOD после введения контрольного лентивирусного вектора (LV; черные кружки) или лентивирусного вектора, характеризующегося высокими поверхностными уровнями CD47 (CD47hi LV; серые кружки), и определяли количество молекул лентивирусного вектора, присутствующих в макрофагах. Данные в отношении VCN клеток HEK293T показаны как контрольные. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение.
[38] На ФИГ. 6A-6C представлены графические изображения активности FIX в плазме крови (ФИГ. 6A), антигена FIX в плазме крови (ФИГ. 6B) и функции FIX (представленной временем APTT; ФИГ. 6C) у обезьян Macaca nemestrina после введения лентивирусного вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с активностью FIX, упакованный в контрольный лентивирусный вектор (LV-FIX; № 1, № 2 и № 3), лентивирусный вектор, характеризующийся высокими поверхностными уровнями CD47 (CD47hi LV-FIX; № 4, № 5 и № 6), или контрольный носитель (№ 7).
[39] На ФИГ. 7A-7B представлены графические изображения устойчивой, опосредованной лентивирусным вектором экспрессии FIX у обезьян Macaca nemestrina после введения лентивирусного вектора CD47high, содержащего лентивирусный вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX, вводимый в дозе E9 ТЕ/кг, что представлено активностью FIX в плазме крови (ФИГ. 7A) и антигеном FIX в плазме (FIX. 7B). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (ФИГ. 7A-7B).
[40] На ФИГ. 8A-8D представлены графические изображения уровней ALT (ФИГ. 8A), уровней AST (ФИГ. 8B), лимфоуровней (ФИГ. 8C) и температуры тела (ФИГ. 8D) у обезьян Macaca nemestrina после введения носителя (белые кружки), контрольного лентивирусного вектора (LV; черные кружки) или лентивирусного вектора, характеризующегося высокими поверхностными уровнями CD47 (CD47hi LV; серые кружки), лентивирусного вектора, содержащего лентивирусный вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX.
[41] На ФИГ. 9A-9C представлены графические изображения уровней экспрессии MIP-1a (9A), MIP-1b (9B) и MCP-1 (9C) у обезьян Macaca nemestrina после введения носителя (черные кружки), контрольного лентивирусного вектора (LV; черные квадраты) или лентивирусного вектора, характеризующегося высокими поверхностными уровнями CD47 (CD47hi LV; белые квадраты), лентивирусного вектора, содержащего лентивирусный вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX.
[42] На ФИГ. 10 представлена диаграмма рассеяния, иллюстрирующая тканеспецифическое распределение (представленное VCN) лентивирусных векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX, после введения обезьянам Macaca nemestrina, носителя (треугольник), контрольного лентивирусного вектора (перевернутый треугольник) или CD47hi LV; кружки). Каждый набор данных представляет собой данные по отдельной обезьяне Macaca nemestrina.
[43] На ФИГ. 11А и 11В представлены графические изображения устойчивой опосредованной лентивирусным вектором экспрессии FIX у обезьян Macaca nemestrina после введения лентивирусного вектора CD47high, содержащего лентивирусный вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX, вводимый в дозе E9 2,5 ТЕ/кг, что представлено активностью FIX в плазме (ФИГ. 11A) и антигеном FIX в плазме крови (FIG. 11В).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[44] В настоящем изобретении описаны лентивирусные векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с активностью FIX, и способы их применения. Соответственно, в некоторых аспектах настоящее изобретение направлено на генную терапию, предусматривающую введение лентивирусных векторов, содержащих молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды с активностью FIX. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения нарушений свертываемости крови, таких как гемофилия (например, гемофилия B), предусматривающим введение субъекту лентивирусного вектора, содержащего кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты FIX, нацеленную на печень (например, на гепатоциты). В настоящем изобретении удовлетворена важная потребность в данной области посредством инструмента генной терапии, что приводит в результате к стабильной интеграции кассеты экспрессии трансгена, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид с активностью FIX, в геном целевых клеток.
[45] Такая система демонстрирует повышенную долгосрочную экспрессию полипептидов, характеризующихся активностью FIX, в целевых клетках (например, гепатоцитах) при введении лентивирусного вектора субъекту в по меньшей мере дозе, составляющей 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (ТЕ/кг) или меньше, например, приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг или меньше, или приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг или меньше, или приблизительно 1×108 ТЕ/кг или меньше.
[46] Иллюстративные конструкции по настоящему изобретению проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах и перечне последовательностей.
[47] С целью обеспечения четкого понимания описания и формулы изобретения ниже представлены следующие определения.
I. Определения
[48] Следует отметить, что форма единственного числа объекта относится к одному или нескольким из таких объектов; например, под "нуклеотидной последовательностью" понимают одну или несколько нуклеотидных последовательностей. В связи с этим формы единственного числа, термины "один или несколько" и "по меньшей мере один" могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо.
[49] Термин "приблизительно" используется в данном документе в значении примерно, порядка, около или ориентировочно. Если используется выражение "приблизительно" совместно с числовым диапазоном, то это изменяет тот диапазон с помощью расширения границ выше и ниже приведенных числовых величин. В целом, термин "приблизительно" используется в данном документе для модификации числового значения выше и ниже заявленного значения с отклонением на 10 процентов вверх или вниз (выше или ниже).
[50] Термин "выделенный" для целей настоящего изобретения означает биологический материал (клетку, полипептид, полинуклеотид или их фрагмент, вариант или производное), который был удален из его изначальной окружающей среды (окружающей среды, в которой он встречается в естественных условиях). Например, полинуклеотид, присутствующий в естественном состоянии в растении или животном, не является выделенным, однако тот же полинуклеотид, отделенный от соседних нуклеиновых кислот, в которых он присутствует в естественных условиях, считается "выделенным". Никакого конкретного уровня очистки не требуется. Полученные рекомбинантным путем полипептиды и белки, экспрессирующиеся в клетках-хозяевах, считаются выделенными для целей настоящего изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично либо в значительной степени очищены с помощью любой подходящей методики.
[51] "Нуклеиновые кислоты", "молекулы нуклеиновой кислоты", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" используются взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме сложных фосфатных эфиров рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; "молекулам РНК") или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; "молекулам ДНК") или любым сложным фосфатным эфирам их аналогам, таким как фосфоротиоаты и сложные тиоэфиры, находящимся либо в одноцепочечной форме, либо в виде двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин молекула нуклеиновой кислоты и, в частности, молекула ДНК или РНК, относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какими либо конкретными третичными формами. Таким образом, этот термин включает двухцепочечную ДНК, обнаруженную, inter alia, в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), плазмидах, суперспиральной ДНК и хромосомах. В рамках обсуждения структуры конкретной двухцепочечной молекулы ДНК последовательности могут описываться в данном документе в соответствии с обычными правилами, предусматривающими приведение только последовательности в направлении 5'-3' вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (т. е. цепи, имеющей последовательность, гомологичную mRNA). "Рекомбинантная молекула ДНК" представляет собой молекулу ДНК, которая была подвергнута молекулярно-биологической манипуляции. ДНК включает без ограничения кДНК, геномную ДНК, плазмидную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК. "Композиция на основе нуклеиновой кислоты" по настоящему изобретению содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
[52] Как используется в данном документе, "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" представляют собой часть полинуклеотида, состоящую из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или TAA), как правило, не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не составляют часть кодирующей области. Границы кодирующей области обычно определяются старт-кодоном на 5'-конце, кодирующим амино-конец получаемого полипептида, и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце, кодирующим карбоксильный конец получаемого полипептида. Две или более кодирующие области могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, в одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (различных) векторах. Отсюда следует, что один вектор может содержать только одну кодирующую область или две или более кодирующих областей.
[53] Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, ассоциированы с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка после начала экспорта растущей белковой цепи через гранулярный эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области известно, что сигнальные пептиды обычно сливаются с N-концом полипептида и отщепляются от полного или "полноразмерного" полипептида с образованием секретируемой или "зрелой" формы полипептида. В определенных вариантах осуществления используют нативный сигнальный пептид или функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность к управлению секрецией полипептида, функционально ассоциированного с ним. Альтернативно, можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например, активатор тканевого плазминогена человека (TPA), или сигнальный пептид β-глюкуронидазы мыши, или его функциональное производное.
[54] Используемый в данном документе термин "полипептид, обладающий активностью FIX" относится к полипептиду, который имеет одну или несколько видов активности, ассоциированных с фактором IX свертывания крови. Для оценки функции системы свертывания крови, в том числе FIX, доступен ряд тестов: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), хромогенный анализ, анализ ROTEM®, тест на протромбиновое время (PT) (также используемый для определения INR), тестирование фибриногена (часто по методу Клаусса), подсчет тромбоцитов, тестирование функции тромбоцитов (часто с помощью PFA-100), TCT, время кровотечения, тест на смешивание (исправляется ли отклонение, если плазма крови пациента смешана с нормальной плазмой крови), анализы фактора свертывания крови, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Лейден, протромбиновая мутация G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT), тесты различных функций тромбоцитов, тромбоэластография (TEG или Sonoclot), тромбоэластометрия (TEM®, например, ROTEM®) или время лизиса эуглобулина (ELT).
[55] Тест aPTT является показателем функционирования, измеряющим эффективность как "внутреннего" (также называемого контактным с помощью активации), так и общего путей коагуляции. Этот тест обычно используется для измерения свертывающей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания, например FIX. Он используется вместе с протромбиновым временем (PT), которое измеряет внешний путь активации свертывания крови.
[56] Анализ ROTEM® предоставляет информацию о всей кинетике гемостаза: времени свертывания крови, образовании сгустка, стабильности и лизисе сгустка. Различные параметры тромбоэластометрии зависят от активности плазматической системы свертывания крови, функции тромбоцитов, фибринолиза или многих факторов, влияющих на эти взаимодействия. Этот анализ может дать полное представление о вторичном гемостазе.
[57] Термин "ниже" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 3' от эталонной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах осуществления расположенные ниже нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой начала транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже относительно сайта начала транскрипции.
[58] Термин "выше" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 5' от эталонной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах осуществления расположенные выше нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены со стороны 5'-конца относительно кодирующей области или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов расположены выше сайта начала транскрипции.
[59] Как используется в данном документе, термин "регуляторная область гена" или "регуляторная область" относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей области, и которые влияют на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию ассоциированной кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности, распознающие сайты полиаденилирования, сайты процессинга РНК, сайты связывания эффекторов и структуры "стебель-петля". Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, то сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно будут размещены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.
[60] Полинуклеотид, который кодирует продукт гена, например полипептид, может содержать промотор и/или другие элементы, осуществляющие контроль экспрессии (например, транскрипции или трансляции), функционально ассоциированные с одной или несколькими кодирующими областями. В функциональной ассоциации кодирующая область для продукта гена, например полипептида, связана с одной или несколькими регуляторными областями таким образом, что экспрессия продукта гена находится под влиянием или контролем регуляторной(-ых) области(-ей). Например, кодирующая область и промотор считаются "функционально ассоциированными", если индуцирование функции промотора приводит к транскрипции mRNA, кодирующей продукт гена, кодируемого кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует способности промотора управлять экспрессией продукта гена или не препятствует способности ДНК-матрицы транскрибироваться. Другие элементы контроля экспрессии, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально ассоциированы с кодирующей областью для управления экспрессией продукта гена.
[61] "Последовательности, осуществляющие контроль транскрипции", относятся к регуляторным последовательностям ДНК, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы и т.п., которые обеспечивают осуществление экспрессии кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Специалистам в данной области известны различные области, осуществляющие контроль транскрипции. Они включают без ограничения области, осуществляющие контроль транскрипции, функционирующие в клетках позвоночных, такие как без ограничения промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (промотор гена немедленного раннего ответа вместе с интроном-A), вируса обезьян 40 (промотор гена раннего ответа) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие области, осуществляющие контроль транскрипции, включают области, полученные из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и β-глобина кролика, а также другие последовательности, способные осуществлять контроль экспрессии генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области, осуществляющие контроль транскрипции, включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
[62] Аналогично, разнообразные элементы, осуществляющие контроль трансляции, известны средним специалистам в данной области. Они включают без ограничения сайты связывания рибосомы, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, сайт внутренней посадки рибосомы или IRES, также называемый CITE-последовательностью).
[63] Термин "экспрессия", используемый в данном документе, относится к процессу, посредством которого из полинуклеотида вырабатывается продукт гена, например, РНК или полипептид. Он включает без ограничения транскрипцию полинуклеотида в информационную РНК (mRNA), транспортную РНК (tRNA), малую шпилечную РНК (shRNA), малую интерферирующую РНК (siRNA) или любой другой продукт РНК, а также трансляцию mRNA в полипептид. Экспрессия приводит к образованию "продукта гена". В контексте настоящего описания продукт гена может представлять собой нуклеиновую кислоту, например, информационную РНК, полученную с помощью транскрипции гена, или полипептид, транслируемый с транскрипта. Продукты гена, описанные в данном документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например, полиаденилированием или сплайсингом, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например, метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами или протеолитическим расщеплением. Термин "выход", используемый в данном документе, относится к количеству полипептида, полученному посредством экспрессии гена.
[64] "Вектор" относится к любому носителю для клонирования нуклеиновой кислоты и/или ее переноса в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты так, чтобы обеспечить репликацию присоединенного сегмента. "Репликон" относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует как автономная единица репликации in vivo, т. e. способен реплицироваться под своим собственным контролем. Термин "вектор" включает как вирусные, так и невирусные носители для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. Из уровня техники известно и используется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные вирусы эукариот или модифицированные бактериальные вирусы. Вставка полинуклеотида в подходящий вектор может быть осуществлена с помощью лигирования соответствующих полинуклеотидных фрагментов в выбранный вектор, который имеет комплементарные "липкие" концы.
[65] Векторы могут быть сконструированы так, чтобы кодировать селектируемые маркеры или репортерные гены, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, в которые встроен вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортерных генов обеспечивает идентификацию и/или отбор клеток-хозяев, которые содержат и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры генов селектируемых маркеров, известных и используемых в данной области, включают гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; и гены, которые используются в качестве фенотипических маркеров, т.е. гены, регулирующие синтез антоцианов, ген изопентанилтрансферазы и т.п. Примеры репортерных генов, известных и используемых в данной области, включают люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus) и т.п. Селектируемые маркеры также можно рассматривать как репортерные гены.
[66] Термин "селектируемый маркер" относится к идентифицирующему фактору, обычно гену антибиотика или устойчивости к химическому воздействию, в отношении которого можно осуществлять селекцию на основе эффекта маркерного гена, т. е. устойчивость к антибиотику, устойчивость к гербициду, колориметрические маркеры, ферменты, флуоресцентные маркеры и т.п., где эффект используют для отслеживания наследуемости нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, и/или идентификации клетки или организма, которые унаследовали нуклеиновую кислоту, представляющую интерес. Примеры генов селектируемых маркеров, известных и используемых в данной области, включают гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; и гены, которые используются в качестве фенотипических маркеров, т.е. гены, регулирующие синтез антоцианов, ген изопентанилтрансферазы и т.п.
[67] Термин "репортерный ген" относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей идентифицирующий фактор, который может быть идентифицирован на основе эффекта репортерного гена, где эффект используется для отслеживания наследования нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, для идентификации клетки или организма, который унаследовал нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, и/или для измерения индукции или транскрипции генной экспрессии. Примеры репортерных генов, известных и используемых в данной области, включают люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), β-галактозидазу (LacZ), β-глюкуронидазу (Gus) и т.п. Гены селективных маркеров также можно рассматривать как репортерные гены.
[68] "Промотор" и "промоторная последовательность" используются взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной к осуществлению контроля экспрессии кодирующей последовательности или функциональной РНК. Как правило, кодирующая последовательность расположена с 3'-конца от промоторной последовательности. Промоторы могут быть получены целиком из нативного гена или состоять из различных элементов, полученных из различных промоторов, встречающихся в природе, или даже содержать сегменты синтетической ДНК. Специалистам в данной области будет понятно, что различные промоторы могут управлять экспрессией гена в различных тканях или типах клеток, или на различных стадиях развития, или в ответ на различные условия окружающей среды или физиологические условия. Промоторы, которые обусловливают экспрессию гена в большинстве типов клеток в большинстве случаев, обычно называют "конститутивными промоторами". Промоторы, которые обусловливают экспрессию гена в конкретном типе клеток, обычно называют "клеточноспецифическими промоторами" или "тканеспецифическими промоторами". Промоторы, которые обусловливают экспрессию гена на конкретной стадии развития или дифференцировки клеток, обычно называют "промоторами, специфическими для стадии развития" или "промоторами, специфическими в отношении дифференцировки клеток". Промоторы, которые являются индуцируемыми и обусловливают экспрессию гена после подвергания воздействию или обработки клетки средством, биологической молекулой, химическим веществом, лигандом, световым излучением или т.п., которые индуцируют промотор, обычно называют "индуцируемыми промоторами" или "регулируемыми промоторами". Кроме того, следует понимать, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей полностью определены не были, то фрагменты ДНК различной длины могут характеризоваться идентичной промоторной активностью.
[69] Как правило, промоторная последовательность ограничена со стороны ее 3'-конца сайтом инициации транскрипции и продолжается выше (в 5'-направлении) с включением минимального числа оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на выявляемых уровнях выше фонового. В пределах промоторной последовательности можно будет обнаружить сайт инициации транскрипции (в подходящем случае определенный, например, посредством картирования с помощью нуклеазы S1), а также домены связывания белка (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы.
[70] Термин "плазмида" относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки и, как правило, представлен в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, интегрирующиеся в геном последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности, линейные, кольцевые или сверхспиральные, из одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, полученные из любого источника, в которых присоединен или добавлен с помощью рекомбинации ряд нуклеотидных последовательностей с образованием уникальной конструкции, которая способна обеспечивать введение в клетку промоторного фрагмента и последовательности ДНК, кодирующей выбранный продукт гена, вместе с соответствующей 3'-нетранслируемой последовательностью.
[71] "Клонирующий вектор" относится к "репликону", который представляет собой единицу длины нуклеиновой кислоты, которая реплицируется последовательно и которая содержит точку начала репликации, такую как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты так, чтобы обеспечить репликацию присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны реплицироваться в одном типе клеток, например бактериях, а экспрессироваться в другом, например эукариотических клетках. Клонирующие векторы обычно содержат одну или несколько последовательностей, которые можно использовать для отбора клеток, содержащих вектор, и/или один или несколько сайтов множественного клонирования для вставки последовательностей нуклеиновых кислот, представляющих интерес.
[72] Термин "вектор экспрессии" относится к носителю, сконструированному с возможностью обеспечения экспрессии вставленной последовательности нуклеиновой кислоты после вставки в клетку-хозяина. Вставленная последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с регуляторными областями, как описано выше.
[73] Векторы вводят в клетки-хозяева с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например, трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, слияния клеток, DEAE-декстрана, преципитации фосфатом кальция, липофекции (слияние лизосом), использования генной пушки или транспортера ДНК-вектора. Используемый в данном документе термин "лентивирусный вектор" относится к гибридной вирусной частице, дефектной по репликации. В некоторых контекстах лентивирусный вектор относится к частице лентивирусного вектора и включенному в нее геному лентивируса. В некоторых контекстах лентивирусный вектор относится к геному лентивируса, включая любые его модификации.
[74] Используемые в данном документе термины "культура", "культивировать" и "культивирование" означают инкубацию клеток в условиях in vitro, которые обеспечивают рост или деление клеток или поддержание клеток в живом состоянии. Используемый в данном документе термин "культивируемые клетки" означает клетки, которые размножаются in vitro.
[75] Подразумевается, что используемый в данном документе термин "полипептид" охватывает "полипептид" в ед. числе, а также "полипептиды" во мн. числе и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин "полипептид" относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "аминокислотная цепь" или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение "полипептида", и при этом термин "полипептид" можно использовать вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с любым из них. Термин "полипептид" также предназначен для обозначения продуктов постэкспрессионных модификаций полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизация известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификация не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может происходить из природного биологического источника или быть получен с помощью рекомбинантной технологии, но не обязательно быть получен в результате трансляции определенной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе с помощью химического синтеза.
[76] Термин "аминокислота" включает аланин (Ala или A); аргинин (Arg или R); аспарагин (Asn или N); аспарагиновую кислоту (Asp или D); цистеин (Cys или C); глутамин (Gln или Q); глутаминовую кислоту (Glu или E); глицин (Gly или G); гистидин (His или H); изолейцин (Ile или I): лейцин (Leu или L); лизин (Lys или K); метионин (Met или M); фенилаланин (Phe или F); пролин (Pro или P); серин (Ser или S); треонин (Thr или T); триптофан (Trp или W); тирозин (Tyr или Y) и валин (Val или V). Нетрадиционные аминокислоты также находятся в пределах объема настоящего изобретения и включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как описанные в Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Чтобы получить такие не встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно использовать процедуры, описанные в Noren et al. Science 244:182 (1989) and Ellman et al., выше. Вкратце, эти процедуры включают химическую активацию супрессорной tRNA не встречающимся в природе аминокислотным остатком с последующей транскрипцией и трансляцией РНК in vitro. Введение нетрадиционной аминокислоты может также достигаться с применением химических способов образования пептидной связи, известных из уровня техники. Используемый в данном документе термин "полярная аминокислота" включает аминокислоты, которые характеризуются нулевым суммарным зарядом, однако характеризуются отличными от нуля частичными зарядами в различных частях их боковых цепей (например, M, F, W, S, Y, N, Q, C). Такие аминокислоты могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях. Используемый в данном документе термин "заряженная аминокислота" включает аминокислоты, которые характеризуются отличным от нуля суммарным зарядом на их боковых цепях (например, R, K, H, E, D). Такие аминокислоты могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях
[77] Также в настоящее изобретение включены фрагменты или варианты полипептидов и любая их комбинация. Термин "фрагмент" или "вариант" применительно к доменам связывания полипептидов или связывающим молекулам по настоящему изобретению включает любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства (например, аффинность связывания FcRn с доменом связывания FcRn или вариантом Fc, коагуляционную активность для полипептида, обладающего активностью FIX) эталонного полипептида. Фрагменты полипептидов включают фрагменты, полученные посредством протеолиза, а также фрагменты, полученные посредством делеции, в дополнение к конкретным фрагментам антитела, обсуждаемым в другом месте данного документа, но не включают встречающийся в природе полноразмерный полипептид (или зрелый полипептид). Варианты доменов связывания полипептидов или связывающих молекул по настоящему изобретению включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Варианты могут быть встречающимися в природе или не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получить с помощью известных из уровня техники методик мутагенеза. Варианты полипептидов могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или добавления.
[78] "Замена консервативной аминокислоты" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в уровне техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислота в полипептиде замещена другой аминокислотой из того же семейства боковых цепей, то замена считается консервативной. В другом варианте осуществления нить из аминокислот можно подвергнуть консервативному замещению сходной в структурном отношении нитью, которая отличается порядком расположения и/или составом представителей семейства боковых цепей.
[79] Термин "процентная идентичность", известный из уровня техники, означает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определенную с помощью сравнения последовательностей. В уровне техники "идентичность" также означает степень сходства последовательности между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, в соответствующих случаях определенную по степени соответствия между нитями таких последовательностей. "Идентичность" может быть легко рассчитана с помощью известных способов, в том числе без ограничения тех, которые описаны в Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987) и Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). Предпочтительные способы определения идентичности разработаны с обеспечением самой высокой степени соответствия между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности запрограммированы в находящихся в открытом доступе компьютерных программах. Выравнивание последовательностей и расчеты процентной идентичности можно осуществлять с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей, такого как программа Megalign из программного пакета для биоинформационных вычислений LASERGENE (DNASTAR Inc., Мадисон, Висконсин, США), пакета программ GCG (Wisconsin Package версии 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Мадисон, Висконсин, США), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) и DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St., Мадисон, Висконсин, 53715, США).
[80] В контексте настоящей заявки будет понятно, что в случаях использования программного обеспечения для анализа последовательностей результаты анализа будут основываться на "значениях по умолчанию" рассматриваемой программы, если не указано иное. Используемые в данном документе "значения по умолчанию" будут означать любой набор значений или параметров, которые изначально загружаются с программным обеспечением при первом запуске.
[81] "Слитый" или "химерный" белок содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связывается в природе. Аминокислотные последовательности, которые в обычных условиях существуют в отдельных белках, могут быть объединены в слитом полипептиде, или аминокислотные последовательности, которые в обычных условиях существуют в одном и том же белке, могут быть размещены в новом порядке в слитом полипептиде, например, при слиянии домена FIX по настоящему изобретению с Fc-доменом Ig. Слитый белок создают, например, с помощью химического синтеза или с помощью создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются в требуемом соотношении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, ассоциированную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной непептидной связью или нековалентной связью.
[82] Используемый в данном документе термин "сайт вставки" относится к положению в полипептиде, характеризующемся активностью FIX, или его фрагменте, варианте или производном, которое находится непосредственно выше положения, в которое может быть вставлен гетерологичный компонент. "Сайт вставки" указывается как число, причем число представляет собой номер аминокислоты в варианте FIX R338L человека (SEQ ID NO: 11-12) которому соответствует сайт вставки, который находится непосредственно на N-конце положения вставки, если не указано иное.
[83] Фраза "непосредственно ниже аминокислоты" в контексте настоящего описания относится к положению сразу после концевой карбоксильной группы аминокислоты. Аналогично, фраза "непосредственно выше аминокислоты" относится к положению сразу возле концевой аминогруппы аминокислоты.
[84] Термины "вставленный", "вставлен", "вставленный в" или грамматически родственные термины, используемые в данном документе, относятся к положению гетерологичного компонента в рекомбинантном полипептиде FIX по сравнению с аналогичным положением в нативном зрелом FIX человека. Используемые в данном документе термины относятся к характеристикам рекомбинантного полипептида FIX по сравнению с нативным зрелым FIX человека и не указывают, не подразумевают или не предполагают какие-либо способы или процесс, с помощью которых был получен рекомбинантный полипептид FIX.
[85] Используемый в данном документе термин "период полужизни" относится к биологическому периоду полужизни конкретного полипептида in vivo. Период полужизни может быть представлен временем, необходимым для того, чтобы половина введенного субъекту количества была выведена из кровообращения и/или других тканей животного. Если кривую выведения данного полипептида строят в виде функции времени, то кривая обычно является двухфазной с быстрой α-фазой и более длинной β-фазой. Обычно α-фаза отображает уравновешивание содержания введенного полипептида Fc между внутри- и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. Обычно β-фаза отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах осуществления FIX и химерные белки, содержащие FIX, являются однофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а имеют только единственную бета-фазу. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления термин период полужизни, используемый в данном документе, относится к периоду полужизни полипептида в β-фазе.
[86] Термин "соединенный", используемый в данном документе, относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно присоединенной соответственно ко второй аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть непосредственно присоединена или сопоставлена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью или, в качестве альтернативы, расположенная посередине последовательность может ковалентно соединять первую последовательность со второй последовательностью. Термин "соединенный" означает не только слияние первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью на С-конце или N-конце, но также включает вставку всей первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами во второй аминокислотной последовательности (или соответственно в первой аминокислотной последовательности). В одном варианте осуществления первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью с помощью пептидной связи или линкера. Первая нуклеотидная последовательность может быть соединена со второй нуклеотидной последовательностью с помощью фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представлять собой пептид или полипептид (в случае полипептидных цепей), или нуклеотид или цепь нуклеотидов (в случае цепей нуклеотидов), или любой химический компонент (как в случае полипептидных, так и полинуклеотидных цепей). Термин "соединенный" также обозначается дефисом (-).
[87] Используемый в данном документе термин "ассоциированный с" относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте осуществления термин "ассоциированный с" означает ковалентную непептидную связь или нековалентную связь. Эта связь может быть обозначена двоеточием, т.е. (:). В другом варианте осуществления это означает любую ковалентную связь, за исключением пептидной связи. Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или дисульфидный мостик с тиольной группой во втором остатке цистеина. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области CH1 и CL ассоциированы дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242, используя систему нумерации согласно Kabat (положение 226 или 229, система нумерации EU). Примеры ковалентных связей включают без ограничения пептидную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, обратную донорно-акцепторную Pi-связь, двойную связь, тройную связь, четверную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптичность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катионную пи-связь или солевую связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), силу Ван-дер-Ваальса, лондоновскую дисперсионную силу, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийную силу или химическую полярность.
[88] Термин "гибрид мономер-димер", используемый в данном документе, относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые ассоциированы друг с другом дисульфидной связью, где первая цепь содержит фактор свертывания крови, например FIX, и первую Fc-область, а вторая цепь содержит, по сути состоит или состоит из второй Fc-области без фактора свертывания крови. Таким образом, гибридная конструкция мономер-димер представляет собой гибрид, включающий аспект мономера, имеющий только один фактор свертывания, и аспект димера, имеющий две Fc-области.
[89] Гемостаз, как используется в данном документе, означает остановку или замедление кровотечения или кровоизлияния или остановку или замедление кровотока через кровеносный сосуд или часть тела.
[90] Гемостатическое нарушение, как используется в данном документе, означает генетически наследуемое или приобретенное состояние, характеризующееся склонностью к кровоизлиянию, происходящему спонтанно либо в результате травмы, из-за нарушенной способности или неспособности образовывать фибриновый сгусток. Примеры таких нарушений включают формы гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия A (дефицит фактора VIII), гемофилия B (дефицит фактора IX или "болезнь Кристмаса") и гемофилия C (дефицит фактора XI, легкая склонность к кровотечению). Другие гемостатические нарушения включают, например, болезнь фон Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит PTA), дефицит фактора XII, дефициты или аномалии структуры фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который представляет собой дефект или дефицит GPIb. GPIb, рецептор для vWF, может быть дефектным и приводить к невозможности образования первичного сгустка (первичного гемостаза) и повышенной склонности к кровотечению, а также к тромбастении Гланцманна-Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) имеет место недостаточная выработка печенью факторов коагуляции; это может увеличивать риск кровотечения.
[91] Лентивирусные векторы, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, по настоящему изобретению можно использовать профилактически. Используемый в данном документе термин "профилактическое лечение" относится к введению молекулы до эпизода кровотечения. В одном варианте осуществления субъект, нуждающийся в общем гемостатическом средстве, подвергают или в скором времени подвергнут хирургическому вмешательству. Например, лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить до или после хирургического вмешательства в качестве профилактического средства. Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить во время или после хирургического вмешательства для контроля эпизода острого кровотечения. Хирургическое вмешательство может включать без ограничения трансплантацию печени, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.
[92] Лентивирусные векторы по настоящему изобретению также используются для лечения, по необходимости. Термин "лечение по необходимости" относится к введению лентивирусного вектора по настоящему изобретению в ответ на симптомы эпизода кровотечения или перед действием, которое может вызвать кровотечение. В одном аспекте лечение по необходимости может быть назначено субъекту, когда начинается кровотечение, например после травмы, или когда ожидается кровотечение, например перед хирургическим вмешательством. В другом аспекте лечение по требованию можно проводить перед видами активности, повышающими риск кровотечения, такими как контактные виды спорта.
[93] Используемый в данном документе термин "острое кровотечение" относится к эпизоду кровотечения, независимо от первопричины. Например, у субъекта может быть травма, уремия, наследственное нарушение свертываемости крови (например, дефицит FIX), нарушение тромбоцитов или резистентность из-за выработки антител к факторам свертывания крови.
[94] Термины "лечить", "лечение", "осуществление лечения", используемые в данном документе, относятся, например, к уменьшению тяжести заболевания или состояния; сокращению продолжительности течения заболевания; улучшению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием; обеспечению благоприятных эффектов субъекту с заболеванием или состоянием без обязательного излечения заболевания или состояния или профилактике одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. В одном варианте осуществления термин "лечение" или "осуществление лечения" означает поддержание остаточного уровня FIX, составляющего по меньшей мере приблизительно 1 МЕ/дл, 2 МЕ/дл, 3 МЕ/дл, 4 МЕ/дл, 5 МЕ/дл, 6 МЕ/дл, 7 МЕ/дл, 8 МЕ/дл, 9 МЕ/дл, 10 МЕ/дл, 11 МЕ/дл, 12 МЕ/дл, 13 МЕ/дл, 14 МЕ/дл, 15 МЕ/дл, 16 МЕ/дл, 17 МЕ/дл, 18 МЕ/дл, 19 МЕ/дл или 20 МЕ/дл, у субъекта с помощью введения лентивирусного вектора по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления осуществление лечения или лечение означают поддержание остаточного уровня содержания FIX от приблизительно 1 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 2 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 3 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 4 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 5 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 6 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 7 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 8 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 9 до приблизительно 20 МЕ/дл или от приблизительно 10 до приблизительно 20 МЕ/дл. Лечение или осуществление лечения заболевания или состояния также могут включать поддержание активности FIX у субъекта на уровне, сравнимом с по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% активности FIX у субъекта, не страдающего гемофилией. В одном варианте осуществления термин "лечение" или "осуществление лечения" означает поддержание остаточного уровня FIX, составляющего по меньшей мере приблизительно 30 МЕ/дл, 40 МЕ/дл, 50 МЕ/дл, 60 МЕ/дл, 70 МЕ/дл, 80 МЕ/дл, 90 МЕ/дл, 100 МЕ/дл, 110 МЕ/дл, 120 МЕ/дл, 130 МЕ/дл, 140 МЕ/дл или 150 МЕ/дл, у субъекта с помощью введения лентивирусного вектора по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления лечение или осуществление лечения означает поддержание остаточного уровня FIX от приблизительно 10 до приблизительно 20 МЕ/кг, от приблизительно 20 до приблизительно 23 МЕ/кг, от приблизительно 30 до приблизительно 40 МЕ/кг, от приблизительно 40 до приблизительно 50 МЕ/кг, от приблизительно 50 до приблизительно 60 МЕ/кг, от приблизительно 60 до приблизительно 70 МЕ/кг, от приблизительно 70 до приблизительно 80 МЕ/кг, от приблизительно 80 до приблизительно 90 МЕ/кг, от приблизительно 90 до приблизительно 100 МЕ/кг, от приблизительно 110 до приблизительно 120 МЕ/кг, от приблизительно 120 до приблизительно 130 МЕ/кг, от приблизительно 130 до приблизительно 140 МЕ/кг или от приблизительно 140 до приблизительно 150 МЕ/кг. Лечение или осуществление лечения заболевания или состояния также могут включать поддержание активности FIX у субъекта на уровне, сравнимом с по меньшей мере приблизительно 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% или 150% активности FIX у субъекта, не страдающего гемофилией. Минимальный остаточный уровень, необходимый для лечения, может быть измерен с помощью одного или нескольких известных способов и может быть скорректирован (увеличен или уменьшен) для каждого человека.
[95] "Введение" в контексте настоящего описания означает передачу фармацевтически приемлемой молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей FIX, полипептида FIX или вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую FIX, по настоящему изобретению субъекту фармацевтически приемлемым путем. Пути введения могут быть внутривенными, например, внутривенная инъекция и внутривенная инфузия. Дополнительные пути введения включают, например, подкожное, внутримышечное, пероральное, назальное и легочное введение. Молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды и векторы можно вводить в составе фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно вспомогательное вещество.
[96] В контексте настоящего описания фраза "субъект, нуждающийся в этом" включает субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, которым будет полезно введение молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или вектора по настоящему изобретению, например, для улучшения гемостаза. В одном варианте осуществления субъекты включают без ограничения индивидуумов с гемофилией. В другом варианте осуществления субъекты включают без ограничения индивидуумов, у которых выработался ингибитор FIX и, таким образом, они нуждаются в обходной терапии. Субъектом может являться взрослый или несовершеннолетний (например, в возрасте до 12 лет). В некоторых вариантах осуществления субъект является женщиной. В других вариантах осуществления субъект является мужчиной.
[97] Используемый в данном документе термин "фактор свертывания крови" относится к молекулам или их аналогам, встречающимся в природе или полученным рекомбинантным путем, которые предупреждают или снижают продолжительность эпизода кровотечения у субъекта. Другими словами, он подразумевает молекулы, характеризующиеся положительной свертывающей активностью, т.е. отвечающими за превращение фибриногена в сеть из нерастворимого фибрина, обусловливающую коагулирование или свертывание крови. "Активируемый фактор свертывания крови" представляет собой фактор свертывания крови в неактивной форме (например, в форме его зимогена), который способен к переходу в активную форму.
[98] Свертывающая активность, используемая в данном документе, означает способность принимать участие в каскаде биохимических реакций, который приводит к образованию фибринового сгустка и/или уменьшает тяжесть, продолжительность или частоту кровоизлияния или эпизода кровотечения.
[99] Используемые в данном документе термины "гетерологичный" или "экзогенный" относятся к таким молекулам, которые в данном контексте обычно не встречаются, например, в клетке или в полипептиде. Например, экзогенная или гетерологичная молекулы могут быть введены в клетку и присутствуют только после проведения манипуляции с клеткой, например, с помощью трансфекции или других способов генной инженерии, или гетерологичная аминокислотная последовательность может быть представлена в белке, в котором она обычно не встречается.
[100] Используемый в данном документе термин "гетерологичная нуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая не встречается в природе с данной полинуклеотидной последовательностью. В одном варианте осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, способный увеличивать период полужизни FIX. В другом варианте осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который увеличивает гидродинамический радиус FIX. В других вариантах осуществления гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, который улучшает одно или несколько фармакокинетических свойств FIX без значительного влияния на его биологическую активность или функцию (например, его прокоагулянтную активность). В некоторых вариантах осуществления FIX связан или соединен с полипептидом, кодируемым гетерологичной нуклеотидной последовательностью с помощью линкера. Неограничивающие примеры полипептидных компонентов, кодируемых гетерологичными нуклеотидными последовательностями, включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающий компонент, трансферрин, полипептиды на основе PAS согласно заявке на патент США № 20100292130, последовательность на основе HAP, трансферрин или его фрагмент, C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, альбумин-связывающую малую молекулу, последовательность XTEN, компоненты, связывающие FcRn (например, полные Fc-области или их части, которые связываются с FcRn), одноцепочечные Fc-области (ScFc-области, например, описанные в US 2008/0260738, WO 2008/012543 или WO 2008/1439545), полиглициновые линкеры, полисериновые линкеры, пептиды и короткие полипептиды из 6-40 аминокислот на основе двух типов аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P), характеризующиеся различной степенью образования вторичной структуры, составляющей, среди прочего, от менее чем 50% до более чем 50%, или две или более их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления полипептид, кодируемый гетерологичной нуклеотидной последовательностью, связан с компонентом, не являющимся полипептидом. Неограничивающие примеры неполипептидных компонентов включают полиэтиленгликоль (PEG), альбумин-связывающие малые молекулы, полисиаловую кислоту (PAS), гидроксиэтилкрахмал (HES), их производные или любые их комбинации.
[101] Используемый в данном документе термин "Fc-область" определяется как часть полипептида, которая соответствует Fc-области нативного Ig, т.e. образована с помощью димерной ассоциации соответствующих Fc-доменов двух его тяжелых цепей. Нативная Fc-область образует гомодимер с другой Fc-областью. В отличие от этого, термины "генетически слитая Fc-область" или "одноцепочечная Fc-область" (scFc-область), используемые в данном документе, относятся к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-доменов, генетически соединенных в одну полипептидную цепь (т.е. кодируемых одной непрерывной генетической последовательностью).
[102] В одном варианте осуществления "Fc-область" относится к части одной тяжелой цепи Ig, начинающейся в шарнирной области непосредственно выше сайта расщепления папаином (т.е. остатка 216 в IgG, если принять первый остаток константной области тяжелой цепи за 114) и заканчивающейся на С-конце антитела. Соответственно, полный Fc-домен содержит по меньшей мере шарнирный домен, CH2-домен и CH3-домен.
[103] Fc-область константной области Ig, в зависимости от изотипа Ig может включать в себя домены CH2, CH3 и CH4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие Fc-область Ig, наделяют химерный белок несколькими требуемыми свойствами, включая увеличенную стабильность, увеличенный период полужизни в сыворотке крови (см. Capon et al., 1989, Nature 337:525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор (FcRn) (патенты США №№ 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1, которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки).
[104] Используемый в данном документе в отношении нуклеотидных последовательностей термин "оптимизированный" относится к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептид, где полинуклеотидная последовательность была подвергнута мутации для улучшения какого-либо свойства этой полинуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления оптимизацию осуществляют для повышения уровней транскрипции, повышения уровней трансляции, повышения уровней mRNA в устойчивом состоянии, увеличения или уменьшения связывания регуляторных белков, таких как общие факторы транскрипции, увеличения или уменьшения сплайсинга или увеличения выхода полипептида, продуцируемого полинуклеотидной последовательностью. Примеры изменений, которые можно вносить в полинуклеотидную последовательность для ее оптимизации, включают оптимизацию кодонов, оптимизацию содержания G/C, удаление последовательностей повторов, удаление обогащенных AT элементов, удаление криптических сайтов сплайсинга, удаление элементов, действующих в цис-положении, которые подавляют транскрипцию или трансляцию, добавление или удаление последовательностей поли-T или поли-A, добавление последовательностей около сайта начала транскрипции, которые усиливают транскрипцию, таких как консенсусные последовательности Козак, удаление последовательностей, которые могут образовывать структуры "стебель-петля", удаление дестабилизирующих последовательностей и две или более их комбинации.
II. Генная терапия на основе лентивируса, кодирующего FIX
[105] Соматическая генная терапия исследовалась как возможное лечение нарушений свертываемости крови, в частности гемофилии. Генная терапия является особенно привлекательным видом лечения гемофилии из-за ее способности излечивать заболевание за счет непрерывного эндогенного продуцирования FIX после однократного введения вектора, кодирующего FIX. Гемофилия B хорошо подходит для подхода замены гена, поскольку ее клинические проявления связаны со снижением экспрессии функционального FIX.
[106] Лентивирусные векторы становятся все более популярными в качестве носителей для доставки генов из-за их большой емкости и способности поддерживать экспрессию трансгена посредством интеграции. Лентивирусные векторы были оценены в многочисленных клинических программах по изучению клеточной терапии ex vivo и продемонстрировали многообещающие профили эффективности и безопасности.
[107] В настоящем изобретении представлены способы предупреждения или лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор упакован в лентивирусную частицу, которая характеризуется более высокий уровнем экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, например, контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™) без высокого уровня экспрессии поверхностного белка CD47, т.е. с нормальным (естественным) уровнем экспрессии поверхностного белка CD47. В некоторых вариантах осуществления эффективная доза является пониженной по сравнению с контрольной дозой контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, что и при использовании указанного лентивирусного вектора.
[108] В других аспектах настоящего изобретения представлены способы предупреждения или лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающий введение субъекту менее чем 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (ТЕ/кг) лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX), где лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
[109] В некоторых вариантах осуществления субъект демонстрирует пониженную макрофагальную трансдукцию лентивирусного вектора после введения по сравнению с контрольным лентивирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления субъект демонстрирует пониженный аллоспецифический иммунный ответ на лентивирусный вектор после введения по сравнению с контрольным лентивирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере 30% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере 3 недели после введения. В некоторых вариантах осуществления у субъекта после введения проявляется тканеспецифическая экспрессия лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке.
[110] В некоторых вариантах осуществления аллоспецифический ответ включает высвобождение цитокина в ответ на введенный лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкая экспрессия цитокина, ассоциированная с алло-специфическим ответом после введения лентивирусного вектора, по сравнению с экспрессией цитокина после введения контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления цитокин представляет собой провоспалительный цитокин. В некоторых вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, интерлейкина-2 (IL-2), интерферона гамма и любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MIP-1a после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MIP-1a после введения контрольного лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MIP-1b после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MIP-1b после введения контрольного лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии MCP-1 после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией MCP-1 после введения контрольного лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии IL-2 после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией IL-2 после введения контрольного лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется более низкий уровень экспрессии интерферона гамма после введения лентивирусного вектора по сравнению с экспрессией интерферона гамма после введения контрольного лентивирусного вектора.
[111] В некоторых вариантах осуществления экспрессия цитокина снижена на по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% по сравнению с экспрессией цитокина после введения контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления экспрессия цитокина после введения лентивирусного вектора не выявляется. В некоторых вариантах осуществления субъект после введения лентивирусного вектора характеризуется невыявляемым уровнем экспрессии цитокина, выбранного из группы, состоящей из MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, интерлейкина-2 (IL-2), интерферона гамма и любой их комбинации.
[112] В некоторых вариантах осуществления у субъекта проявляется повышенная активность FIX в плазме после введения лентивирусного вектора по сравнению с активностью FIX в плазме крови до введения. В некоторых вариантах осуществления увеличение наблюдается через по меньшей мере 1 день, по меньшей мере приблизительно 2 дня, по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 4 дня, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 8 дней, по меньшей мере приблизительно 9 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 11 дней, по меньшей мере приблизительно 12 дней, по меньшей мере приблизительно 13 дней, по меньшей мере приблизительно 14 дней, по меньшей мере приблизительно 3 недели, по меньшей мере приблизительно 4 недели, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель или по меньшей мере приблизительно 8 недель после введения. В некоторых вариантах осуществления активность FIX в плазме крови увеличивается через период времени, составляющий от приблизительно 12 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 12 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 48 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 60 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 48 часов или от приблизительно 48 часов до приблизительно 60 часов после введения лентивирусного вектора по сравнению с субъектом, которому вводят контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления активность FIX после введения лентивирусного вектора составляет по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 125%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 175%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 225%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 275% или по меньшей мере приблизительно 300% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере одну неделю, две недели или три недели после введения лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере приблизительно 150% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере три недели после введения лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере приблизительно 200% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере три недели после введения лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется активность FIX, составляющая по меньшей мере приблизительно 225% по сравнению с нормальной активностью FIX через по меньшей мере три недели после введения лентивирусного вектора.
[113] В некоторых вариантах осуществления активность FIX в плазме крови увеличивается после введения в по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, по меньшей мере приблизительно 180 раз, по меньшей мере приблизительно 190 раз или по меньшей мере приблизительно 200 раз по сравнению с субъектом, которому вводят контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора.
[114] В некоторых вариантах осуществления после введения лентивирусный вектор специфически локализуется в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке субъекта, где более высокая концентрация лентивирусного вектора обнаруживается в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке по сравнению с другими органами тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления другой орган в теле субъекта выбран из группы, состоящей из яичка, лимфатического узла, мышцы, тимуса, почки, легкого, сердца, лобной доли коры головного мозга, таламуса, хвостатого ядра, холмиков, мозжечка, мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления у субъекта наблюдается повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. Локализацию лентивирусного вектора можно измерить и/или выразить с использованием любых способов и/или единиц, известных из уровня техники. В некоторых вариантах осуществления повышенный уровень локализации характеризуется числом копий вектора (VCN) лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, по меньшей мере приблизительно 180 раз, по меньшей мере приблизительно 190 раз, по меньшей мере приблизительно 200 раз, по меньшей мере приблизительно 250 раз, по меньшей мере приблизительно 300 раз, по меньшей мере приблизительно 400 раз или по меньшей мере приблизительно 500 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта.
[115] В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке, где повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 10 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке, где повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 50 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке, где повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 100 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта. В определенных вариантах осуществления у субъекта проявляется повышенный уровень локализации лентивирусного вектора в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке, где повышенный уровень локализации характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое в по меньшей мере 150 раз выше в печени, селезенке или как в печени, так и в селезенке после введения лентивирусного вектора по сравнению с органом, отличным от печени и селезенки, у субъекта.
A. Ингибирование иммунного ответа
[116] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор, например лентивирусная частица, содержит на своей поверхности один или несколько полипептидов, которые ингибируют иммунный ответ на лентивирусный вектор после введения субъекту-человеку. Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к лентивирусным векторам или способам введения лентивирусных векторов субъекту, где лентивирусный вектор содержит CD47 на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления поверхность лентивирусного вектора содержит одну или несколько молекул CD47. CD47 является "маркером собственного" белка, который повсеместно экспрессируется на клетках человека. Экспрессия CD47 на поверхности ингибирует индуцированный макрофагами фагоцитоз эндогенных клеток за счет взаимодействия CD47 и экспрессируемого макрофагами SIRPα. Клетки, экспрессирующие CD47 на высоких уровнях, с меньшей вероятностью становятся мишенью и разрушаются человеческими макрофагами in vivo.
[117] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит высокую концентрацию молекул полипептида CD47 на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий белок CD47, где экспрессируется гетерологичный полинуклеотид, кодирующий CD47. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор дополнительно содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий белок CD47, где экспрессируется гетерологичный полинуклеотид, кодирующий CD47.
[118] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор характеризуется более высоким уровнем белка CD47, поскольку он продуцируется в клеточной линии с высоким уровнем экспрессии CD47. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке CD47high, где клетка характеризуется высоким уровнем экспрессии CD47 на клеточной мембране. В конкретных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке CD47high HEK 293T, где HEK 293T модифицирована для повышенной экспрессии CD47 по сравнению с экспрессией CD47 в немодифицированных клетках HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетка HEK 293T модифицирована для сверхэкспрессии эндогенного CD47 по сравнению с немодифицированными клетками HEK 293T. В некоторых вариантах осуществления клетка HEK 293T модифицирована с помощью трансдукции клетки HEK293T гетерологичным вектором, экспрессирующим CD47. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный вектор, экспрессирующий CD47, включает ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор представляет собой γ-ретровирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный вектор, экспрессирующий CD47, не может быть перекрестно упакован посредством лентивирусного вектора.
[119] В определенных аспектах настоящее изобретение направлено на способы предупреждения или лечения гемофилии у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, где лентивирусный вектор характеризуется более высоким уровнем экспрессии поверхностного белка CD47, чем у контрольных лентивирусных векторов, продуцируемых в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™), и где эффективная доза снижена по сравнению с контрольной дозой контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, что и при использовании указанного лентивирусного вектора. Не будучи связанной каким-либо механизмом, экспрессия CD47 на поверхности лентивирусного вектора, как полагают, защищает от разрушения и/или удаления лентивирусного вектора иммунной системой субъекта и предупреждает и/или снижает иммунный ответ в отношении лентивирусного вектора.
[120] В некоторых вариантах осуществления CD47 представляет собой CD47 человека (номер доступа NCBI NP_001768.1). В определенных вариантах осуществления CD47 содержит аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере 99% или приблизительно 100% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 14. В конкретных вариантах осуществления CD47 человека содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 14.
[121] В некоторых вариантах осуществления CD47 экспрессируется лентивирусным вектором. В других вариантах осуществления CD47 не экспрессируется лентивирусным вектором. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор экспрессируется в клетке-хозяине, где клетка-хозяин модифицирована для экспрессии CD47. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин модифицирована для сверхэкспрессии CD47. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке-хозяине, экспрессирующей CD47 в высокой концентрации по сравнению с клетками HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В конкретных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетках HEK293T, модифицированных для сверхэкспрессии CD47 по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T.
[122] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор характеризуется более высоким уровнем экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор. В определенных вариантах осуществления контрольный лентивирусный вектор продуцируется в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™), которые, как известно, продуцируют 19 молекул/мкм2 (см., например, Sosale et al., Methods & Clinical Development 3:16080 (2016) на ФИГ. S1(d). В некоторых вариантах осуществления контрольный лентивирусный вектор содержит менее чем 20 молекул/мкм2 CD47 на поверхности контрольного лентивирусного вектора.
[123] В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 100 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 75 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 50 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 40 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 30 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 20 раз, от по меньшей мере приблизительно 2 раз до по меньшей мере приблизительно 10 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 100 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 75 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 50 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 40 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 30 раз, от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 20 раз, от по меньшей мере приблизительно 20 раз до по меньшей мере приблизительно 100 раз, от по меньшей мере приблизительно 20 раз до по меньшей мере приблизительно 75 раз, от по меньшей мере приблизительно 20 раз до по меньшей мере приблизительно 50 раз, от по меньшей мере приблизительно 20 раз до по меньшей мере приблизительно 40 раз или от по меньшей мере приблизительно 20 раз до по меньшей мере приблизительно 30 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольных лентивирусных векторов, продуцируемых в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В конкретных вариантах осуществления лентивирусные векторы содержат от по меньшей мере приблизительно 10 раз до по меньшей мере приблизительно 30 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно 3,0 раза, по меньшей мере приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно 4,0 раза, по меньшей мере приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно 5,0 раза, по меньшей мере приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере приблизительно 6,0 раза, по меньшей мере приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере приблизительно 7,0 раза, по меньшей мере приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере приблизительно 8,0 раза, по меньшей мере приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере приблизительно 9,0 раза, по меньшей мере приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 45 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз больше, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз или по меньшей мере приблизительно 100 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™).
[124] В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 10 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 15 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 20 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 25 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит в по меньшей мере приблизительно 30 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем на поверхности контрольного лентивирусного вектора, продуцируемого в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™).
[125] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере 20 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 25 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 30 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 35 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 40 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 45 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 50 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 55 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 60 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 65 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 70 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 75 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 80 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 85 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 90 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 95 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 100 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 125 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 150 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 175 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 200 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 225 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 250 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 275 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 300 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 325 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 350 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 375 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 400 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 425 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 450 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 475 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 500 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 525 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 550 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 575 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 600 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 625 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 650 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 675 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 700 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 725 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 750 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 800 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 850 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 900 молекул/мкм2, по меньшей мере приблизительно 950 молекул/мкм2 или по меньшей мере приблизительно 1000 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора.
[126] В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 400 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 450 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 500 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 600 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 700 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 800 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 900 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно 1000 молекул/мкм2 белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора.
[127] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор экспрессируется в клетке-хозяине, которую дополнительно модифицируют для снижения иммуногенности полученного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит незначительное количество экспонированного на поверхности главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC-I) или совсем содержит его. Экспонированный на поверхности MHC-I демонстрирует пептидные фрагменты "несобственных" белков изнутри клетки, такие как фрагменты белка, указывающие на инфекцию, с облегчением таким образом иммунного ответа против клетки. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке MHC-Ilow, где клетка характеризуется пониженным уровнем экспонированного на поверхности MHC-I на клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке MHC-I- (или "MHC-Ifree", "MHC-1neg" или "MHC-negative"), где клетка не имеет экспонированного на поверхности MHC-I.
[128] Клетки MHC-I- или MHC-Ilow могут быть получены с использованием любых известных из уровня техники инструментов. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью нарушения экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих один или несколько белков в MHC. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью нарушения экспрессии гена, кодирующего бета-2-микроглобулин (B2M; Ensembl ENSG00000166710; регистрационный номер в NCBI ABB01003). В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью постоянного нарушения экспрессии гена, кодирующего бета-2-микроглобулин (B2M). В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью блокирования экспрессии гена, кодирующего бета-2-микроглобулин (B2M). В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью введения мутации в ген, кодирующий бета-2-микроглобулин (B2M), где мутация приводит к потере экспрессии гена, кодирующего B2M. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью нокаута гена, кодирующего бета-2-микроглобулин (B2M). В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- или MHC-Ilow получают с помощью модификации клеток HECK 293T для блокирования или уменьшения экспонированного на поверхности MHC-I. Немодифицированные клетки HEK293-T содержат экспонированный на поверхности MHC-I. См., например, Dellgren et al., PLoS One 10(8):e0135385 (2015).
[129] В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки MHC-I- HEK293T, где клетки не содержат экспонированного на поверхности MHC-I. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-I- содержат менее чем 1% экспонированного на поверхности MHC-1 по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки MHC-Ilow HEK293T, где клетки HEK293T модифицированы для того, чтобы содержать менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 85%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 75%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 65%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 55%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 45%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 35%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 9%, менее чем приблизительно 8%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 6%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2%, менее чем приблизительно 1% экспонированного на поверхности MHC-I по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-Ilow содержат менее чем 5% MHC-I, экспонированного на поверхности по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-Ilow содержат менее чем 4% MHC-1, экспонированного на поверхности по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-Ilow содержат менее чем 3% MHC-1, экспонированного на поверхности по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T. В некоторых вариантах осуществления клетки MHC-Ilow содержат менее чем 2% MHC-1, экспонированного на поверхности по сравнению с немодифицированными клетками HEK293T.
[130] В конкретных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит липидную оболочку, характеризующуюся высокой концентрацией полипептидов CD47 и не содержащую экспонированного на поверхности MHC-I. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клеточной линии CD47high/MHC-Ilow, например, в клеточной линии CD47high/MHC-Ilow HEK 293T. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в линии клеток CD47high/MHC-I-, например, в линии клеток CD47high/MHC-I- HEK 293T.
[131] В другом варианте осуществления введение лентивирусного вектора, описанного в данном документе, и/или последующая экспрессия трансгена белка FIX не вызывают иммунного ответа у субъекта. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ включает выработку антител к FIX. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ включает секрецию цитокинов. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ включает активацию B-клеток, T-клеток или как B-клеток, так и T-клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой ингибирующий иммунный ответ, где иммунный ответ у субъекта снижает активность белка FIX по сравнению с активностью FIX у субъекта, у которого не развился иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления экспрессия белка FIX с помощью введения лентивирусного вектора по настоящему изобретению обеспечивает предупреждает ингибирующий иммунный ответ в отношении белка FIX или белка FIX, экспрессируемого из выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или лентивирусного вектора.
B. Дозирование
[132] Лентивирусные векторы, частицы лентивирусных векторов и способы их применения по настоящему изобретению обеспечивают предупреждение и/или лечение гемофилии с применением более низких доз лентивирусного вектора, чем полученного контрольного лентивирусного вектора в сравнении с контрольным лентивирусным вектором, продуцируемым в клетках HEK293 (ATCC® CRL-1573™). В некоторых вариантах осуществления лентивирусные векторы по настоящему изобретению эффективны в дозе, которая снижена по сравнению с контрольной дозой контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, что и при использовании указанного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20% или по меньшей мере приблизительно 25% от контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления доза составляет по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45% или по меньшей мере приблизительно 50% от контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления доза составляет по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70% или по меньшей мере приблизительно 75% от контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления доза составляет по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95% от контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора.
[133] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 5,0×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,9×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,8×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,7×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,6×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,1×1010 ТЕ/кг, приблизительно 4,0×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,9×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,8×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,7×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,6×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,1×1010 ТЕ/кг, приблизительно 3,0×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,9×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,8×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,7×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,6×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,1×1010 ТЕ/кг, приблизительно 2,0×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,9×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,8×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,7×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,6×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,4×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,3×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,2×1010 ТЕ/кг, приблизительно 1,1×1010 ТЕ/кг или приблизительно 1,0×1010 ТЕ/кг.
[134] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 9,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 9,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 8,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 7,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 6,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 5,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 4,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,1×109 ТЕ/кг, приблизительно 3,0×109 ТЕ/кг, приблизительно 2,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,9×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,8×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,7×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,6×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,4×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,3×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,2×109 ТЕ/кг, приблизительно 1,1×109 ТЕ/кг или приблизительно 1,0×109 ТЕ/кг.
[135] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 9,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 9,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 8,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 7,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 6,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 5,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 4,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 3,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,1×108 ТЕ/кг, приблизительно 2,0×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,9×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,8×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,7×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,6×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,4×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,3×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,2×108 ТЕ/кг, приблизительно 1,1×108 ТЕ/кг или приблизительно 1,0×108 ТЕ/кг.
[136] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет менее чем приблизительно 5,0×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,9×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,8×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,7×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,6×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,4×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,3×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,2×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,1×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,0×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,9×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,8×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,7×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,6×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,4×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,3×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,2×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,1×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,0×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,9×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,8×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,7×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,6×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,4×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,3×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,2×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,1×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,0×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,9×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,8×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,7×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,6×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,4×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,3×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,2×1010 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,1×1010 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 1,0×1010 ТЕ/кг.
[137] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет менее чем приблизительно 9,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,1×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,0×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,1×109 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 1,0×109 ТЕ/кг.
[138] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет менее чем приблизительно 9,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 9,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 8,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 7,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 6,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 5,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 4,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 3,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,9×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,8×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,7×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,6×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,4×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,3×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,2×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,1×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 2,0×108 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,9×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,8×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,7×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,6×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,4×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,3×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,2×109 ТЕ/кг, менее чем приблизительно 1,1×109 ТЕ/кг или менее чем приблизительно 1,0×109 ТЕ/кг.
[139] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 4×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 6×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 7×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 8×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 9×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 4×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 6×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 7×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 8×109 ТЕ/кг и приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 9×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 9,5×109 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 2×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 3×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 4×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 5×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 4×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг или от приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг.
[140] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4,5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3,5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 2,5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 2×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 1,5×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 9×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 8,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 8×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 7×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 6,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 6×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 2×109, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 1,5×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 1×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 9,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 9×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 8,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 8×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 7,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 7×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 6,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 6×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 4×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 3×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 2,5×108 ТЕ/кг, от приблизительно 1×108 ТЕ/кг и приблизительно 2×108 или от приблизительно 1×108 ТЕ/кг до приблизительно 1,5×108 ТЕ/кг.
[141] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет от приблизительно 1×1010 ТЕ/кг до приблизительно 2×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,1×1010 ТЕ/кг до приблизительно 1,9×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,2×1010 ТЕ/кг до приблизительно 1,8×1010 ТЕ/кг, от приблизительно 1,3×1010 ТЕ/кг до приблизительно 1,7×1010 ТЕ/кг или от приблизительно 1,4×1010 ТЕ/кг до приблизительно 1,6×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 1,5×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 2×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 2×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 6×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 6×1010 ТЕ/кг.
[142] В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет от приблизительно 1×109 ТЕ/кг до приблизительно 2×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1,1×109 ТЕ/кг до приблизительно 1,9×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1,2×109 ТЕ/кг до приблизительно 1,8×109 ТЕ/кг, от приблизительно 1,3×109 ТЕ/кг до приблизительно 1,7×109 ТЕ/кг или от приблизительно 1,4×109 ТЕ/кг до приблизительно 1,6×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет от приблизительно 4×109 до приблизительно 6×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 1,5×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 4×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 4,5×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 5×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 5,5×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 6×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 6×109 ТЕ/кг.
[143] В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 2,5×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 2,5×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 3,0×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 3,0×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 7,5×109 ТЕ/кг. В определенных вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 7,5×109 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 2×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 2×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет приблизительно 6×1010 ТЕ/кг. В некоторых вариантах осуществления доза лентивирусного вектора составляет 6×1010 ТЕ/кг.
[144] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или нескольких доз. В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора вводят за один раз или разделяют на несколько субдоз, например две субдозы, три субдозы, четыре субдозы, пять субдоз, шесть субдоз или более чем шесть субдоз. В некоторых вариантах осуществления вводят более чем один лентивирусный вектор.
[145] В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора вводят по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза, по меньшей мере четыре раза, по меньшей мере пять раз, по меньшей мере шесть раз, по меньшей мере семь раз, по меньшей мере восемь раз, по меньшей мере девять раз или по меньшей мере десять раз. В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора вводят один раз приблизительно каждые две недели, один раз приблизительно каждые три недели или один раз приблизительно каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления дозу лентивирусного вектора вводят один раз приблизительно каждые 10 дней, один раз приблизительно каждые 14 дней, один раз приблизительно каждые две недели, один раз приблизительно каждые 15 дней, один раз приблизительно каждые три недели, один раз приблизительно каждые 20 дней, один раз приблизительно каждые четыре недели, один раз приблизительно каждый месяц, два раза приблизительно каждый месяц, один раз приблизительно каждые 5 недель, один раз приблизительно каждые 6 недель, один раз приблизительно каждые 7 недель, один раз приблизительно каждые 8 недель, один раз приблизительно каждые 2 месяца, один раз приблизительно каждые 9 недель, один раз приблизительно каждые 10 недель, один раз приблизительно каждые 11 недель, один раз приблизительно каждые 12 недель, один раз приблизительно каждые 3 месяца, один раз приблизительно каждые 13 недель, один раз приблизительно каждые 14 недель, один раз приблизительно каждые 15 недель, один раз приблизительно каждые 16 недель, один раз приблизительно каждые 4 месяца, один раз приблизительно каждые 17 недель, один раз приблизительно каждые 18 недель, один раз приблизительно каждые 19 недель, один раз приблизительно каждые 20 недель, один раз приблизительно каждые 5 месяцев, один раз приблизительно каждую 21 неделю, один раз приблизительно каждые 22 недели, один раз приблизительно каждые 23 недели, один раз приблизительно каждые 24 недели, один раз приблизительно каждые 25 недель, один раз приблизительно каждые 26 недель или один раз приблизительно каждые 6 месяцев.
[146] В некоторых вариантах осуществления вводят первую дозу лентивирусного вектора, осуществляют мониторинг экспрессии трансгена у субъекта и вводят вторую дозу субъекту, если субъект характеризуется экспрессией трансгена ниже заранее определенного порога. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 100%, менее чем приблизительно 95%, менее чем приблизительно 90%, менее чем приблизительно 85%, менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 75%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 65%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 55%, менее чем приблизительно 50%, менее чем приблизительно 45%, менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 35%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 3% или менее чем приблизительно 1% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 50% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 25% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 10% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 5% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 4% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 3% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 2% целевых клеток экспрессируют трансген. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят вторую (третью, четвертую, пятую, шестую, седьмую, восьмую, девятую или десятую) дозу лентивирусного вектора, если менее чем приблизительно 1% целевых клеток экспрессируют трансген.
[147] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят с помощью внутривенной инъекции. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор вводят посредством инъекции, отличной от внутривенной (например, подкожно или внутрикожно).
[148] В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом-ребенком, тогда как в других аспектах субъект является субъектом-взрослым. В некоторых вариантах осуществления субъект является мужчиной. В других вариантах осуществления субъект является женщиной.
[149] Раскрытые в данном документе лентивирусные векторы можно использовать в низких или уменьшенных дозах (например, 1010 ТЕ/кг или ниже, 109 ТЕ/кг или ниже или 108 ТЕ/кг или ниже) in vivo у млекопитающего, например, пациента-человека, при этом применение подхода генной терапии для лечения заболевания или нарушения, связанных с кровотечением, выбранных из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения из полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, внутриротового кровотечения, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровотечения, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения центральной нервной системы, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения в оболочке подвздошно-поясничной мышцы было бы терапевтически полезным. В одном из вариантов осуществления заболевание или нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию. В другом варианте осуществления заболевание или нарушение свертываемости крови представляют собой гемофилию A.
[150] В некоторых вариантах осуществления целевые клетки (например, гепатоциты) обрабатывают in vitro низкими дозами (например, 1010 ТЕ/кг или меньше, 109 ТЕ/кг или меньше или 108 ТЕ/кг или меньше) лентивирусных векторов, раскрытых в данном документе, перед введением пациенту. В некоторых вариантах осуществления целевые клетки (например, гепатоциты) обрабатывают in vitro с помощью приблизительно 3,0×109 ТЕ/кг лентивирусных векторов, описанных в данном документе, перед введением пациенту. В еще других вариантах осуществления клетки от пациента (например, гепатоциты) обрабатывают ex vivo низкими дозами (например, 1010 ТЕ/кг или меньше, 109 ТЕ/кг или меньше или 108 ТЕ/кг или меньше) лентивирусных векторов, раскрытых в данном документе, перед введением пациенту.
[151] В некоторых вариантах осуществления активность FIX в плазме крови после введения лентивирусных векторов, описанных в данном документе (вводимых, например, при 1010 ТЕ/кг или ниже, 109 ТЕ/кг или ниже, или 108 ТЕ/кг или ниже), увеличивается на по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 110%, по меньшей мере приблизительно 120%, по меньшей мере приблизительно 130%, по меньшей мере приблизительно 140%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 160%, по меньшей мере приблизительно 170%, по меньшей мере приблизительно 180%, по меньшей мере приблизительно 190%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 210%, по меньшей мере приблизительно 220%, по меньшей мере приблизительно 230%, по меньшей мере приблизительно 240%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 260%, по меньшей мере приблизительно 270%, по меньшей мере приблизительно 280%, по меньшей мере приблизительно 290% или по меньшей мере приблизительно 300% по сравнению с физиологически нормальными уровнями циркулирующего FIX.
[152] В одном варианте осуществления активность FIX в плазме крови после введения лентивирусного вектора по настоящему изобретению увеличивается на значение, составляющее по меньшей мере от приблизительно 3000% до приблизительно 5000% по сравнению с физиологически нормальными уровнями FIX в кровотоке. В некоторых вариантах осуществления через 21 день после введения лентивирусного вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью FIX, описанной в данном документе, активность FIX в плазме крови увеличивается в по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз, по меньшей мере приблизительно 100 раз, по меньшей мере приблизительно 110 раз, по меньшей мере приблизительно 120 раз, по меньшей мере приблизительно 130 раз, по меньшей мере приблизительно 140 раз, по меньшей мере приблизительно 150 раз, по меньшей мере приблизительно 160 раз, по меньшей мере приблизительно 170 раз, по меньшей мере приблизительно 180 раз, по меньшей мере приблизительно 190 раз или по меньшей мере приблизительно 200 раз по сравнению с субъектом, которому вводят соответствующий лентивирусный вектор, содержащий эталонную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
[153] В настоящем изобретении также представлены способы лечения, предупреждения или уменьшения интенсивности гемостатического нарушения (например, нарушения свертываемости крови, такого как гемофилия А) у субъекта, нуждающегося в этом, предусматривающие введение субъекту терапевтически эффективного количества лентивирусного вектора, содержащего молекулу выделенной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, где лентивирусный вектор вводят в виде по меньшей мере одной дозы, составляющей 5×1010 или меньше ТЕ/кг, 109 или меньше ТЕ/кг или 108 или меньше ТЕ/кг.
[154] Лечение, облегчение и предупреждение с помощью лентивирусного вектора по настоящему изобретению может представлять собой шунтирующую терапию. У субъекта, получающего шунтирующую терапию, может уже наблюдаться развитый ингибитор фактора свертывания, например FIX, или у него может развиться ингибитор фактора свертывания крови.
[155] С помощью лентивирусных векторов по настоящему изобретению осуществляют лечение или предупреждение гемостатического нарушения посредством обеспечения образования фибринового сгустка. Полипептид, обладающий активностью FIX, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, может обеспечивать активацию участника каскада свертывания. Фактор свертывания крови может участвовать во внешнем пути, внутреннем пути или обоих.
[156] Лентивирусные векторы по настоящему изобретению можно применять для лечения нарушений гемостаза, которые, как известно, поддаются лечению с помощью FIX. Нарушения гемостаза, которые можно лечить с применением способов по настоящему описанию, включают без ограничения гемофилию A, гемофилию B, болезнь фон Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит PTA), дефицит фактора XII, а также дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение из полости рта, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцы, внутриротовое кровотечение, травму, травму головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшное кровотечение, внутригрудное кровоизлияние, перелом кости, кровотечение в центральной нервной системе, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве и кровотечение в оболочке подвздошно-поясничной мышцы.
[157] В некоторых вариантах осуществления гемостатическое нарушение представляет собой наследственное нарушение. В одном варианте осуществления субъект страдает гемофилией А. В других вариантах осуществления нарушение гемостаза является результатом дефицита FIX. В других вариантах осуществления нарушение гемостаза может быть результатом дефектного фактора свертывания крови FIX.
[158] В другом варианте осуществления гемостатическое нарушение может представлять собой приобретенное нарушение. Приобретенное нарушение может быть обусловлено первопричинным вторичным заболеванием или состоянием. Несвязанное состояние может представлять собой, в качестве примера, без ограничения рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное нарушение может быть обусловлено пожилым возрастом или приемом лекарственных препаратов для лечения первопричинного вторичного нарушения (например, химиотерапии рака).
[159] Настоящее изобретение также относится к способам лечения субъекта, у которого не имеется гемостатического нарушения или вторичного заболевания или состояния, приводящего к приобретению гемостатического нарушения. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в гемостатическом средстве общего действия, включающему введение терапевтически эффективного количества лентивирусного вектора по настоящему изобретению. Например, в одном варианте осуществления субъект, нуждающийся в гемостатическом средстве общего действия, подвергается или вскоре подвергнется хирургическому вмешательству. Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить до или после хирургического вмешательства в качестве профилактического средства.
[160] Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить во время или после хирургического вмешательства для контроля эпизода острого кровотечения. Хирургическое вмешательство может включать без ограничения трансплантацию печени, резекцию печени или трансплантацию стволовых клеток.
[161] В другом варианте осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно использовать для лечения субъекта с эпизодом острого кровотечения, у которого не имеется гемостатического нарушения. Эпизод острого кровотечения может быть результатом тяжелой травмы, например хирургического вмешательства, автомобильной аварии, ранения, рваного огнестрельного ранения или другого травматического события, приводящего к неконтролируемому кровотечению.
[162] Лентивирусный вектор можно использовать для профилактического лечения субъекта с гемостатическим нарушением. Лентивирусный вектор можно использовать для лечения эпизода острого кровотечения у субъекта с гемостатическим нарушением.
[163] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят в комбинации с по меньшей мере одним другим средством, которое способствует гемостазу. Указанное другое средство, которое способствует гемостазу, представляет собой терапевтический препарат с продемонстрированной свертывающей активностью. В качестве примера, но не ограничения, гемостатическое средство может включать фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин или фибриноген или активированные формы любого из вышеперечисленных. Фактор свертывания крови или гемостатическое средство также могут включать антифибринолитические лекарственные средства, например, эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту.
[164] В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция (например, лентивирусный вектор) представляет собой композицию, в которой FIX присутствует в активируемой форме при введении субъекту. Такая активируемая молекула может активироваться in vivo в месте свертывания после введения субъекту.
[165] Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую поверхность слизистой оболочки, например, перорально, сублингвально, трансбуккально, сублингвально, назально, ректально, вагинально или посредством легочного пути. Лентивирусный вектор может быть имплантирован в твердую биополимерную подложку или связан с ней, что обеспечивает медленное высвобождение вектора в требуемом месте.
[166] В одном варианте осуществления путь введения лентивирусных векторов является парентеральным. Используемый в данном документе термин "парентеральный" включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Внутривенная форма парентерального введения является предпочтительной. Хотя все эти формы введения явно рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения, формой для введения будет раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного введения. Обычно подходящая фармацевтическая композиция для инъекций может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующее средство (например, альбумин человека) и т. д. Однако в других способах, совместимых с изложенными в данном документе идеями, лентивирусный вектор можно доставлять непосредственно в место локализации нежелательной клеточной популяции, за счет чего увеличивается воздействие терапевтического средства на пораженную ткань.
C. Лентивирусный вектор
[167] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к лентивирусным векторам, частицам лентивирусного вектора и/или способам их применения, где лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX). В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX представляет собой FIX человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX представляет собой вариант FIX человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX представляет собой вариант R338L FIX человека. В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX представляет собой вариант Padua.
[168] В некоторых вариантах осуществления полипептид с активностью FIX представляет собой гибридную молекулу мономер-димер, содержащую FIX. Термин "гибрид мономер-димер", используемый в данном документе, относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые ассоциированы друг с другом дисульфидной связью, где первая цепь содержит FIX и первую Fc-область, а вторая цепь содержит, по сути состоит или состоит из второй Fc-области без FIX. Таким образом, гибридная конструкция мономер-димер представляет собой гибрид, включающий аспект мономера, имеющий только один фактор свертывания, и аспект димера, имеющий две Fc-области.
C.1. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX
[169] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, является кодон-оптимизированной. В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
[170] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
[171] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2.
[172] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3.
[173] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4.
[174] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5.
[175] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6.
[176] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидам 139-1386 нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7.
[177] В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под (i) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 7.
[178] В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под (i) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 7.
C.1.a. Гетерологичные компоненты
[179] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная молекула, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один гетерологичный компонент. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент слит с С-концом или N-концом полипептида с активностью FIX, где полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент вставлен в один или несколько сайтов внутри полипептида с активностью FIX, где полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент представляет собой гетерологичный полипептид. В определенных аспектах гетерологичный компонент представляет собой XTEN. В некоторых аспектах гетерологичный компонент содержит по меньшей мере один XTEN, вставленный в один или несколько сайтов внутри полипептида с активностью FIX. В других аспектах гетерологичный компонент представляет собой компонент, увеличивающий период полужизни (например, компонент, увеличивающий период полужизни in vivo), который вставлен в полипептид с активностью FIX. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент вставлен в полипептид с активностью FIX в сайте вставки, раскрытом в публикации международной заявки WO 2017/024060, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки. В определенных вариантах осуществления гетерологичный компонент вставлен в полипептид с активностью FIX непосредственно после аминокислоты, соответствующей аминокислоте 103 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 105 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 142 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 149 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 162 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 166 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 174 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 224 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 226 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 228 из SEQ ID NO: 2, аминокислоте 413 из SEQ ID NO: 2 или любой их комбинации.
[180] В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент представляет собой партнера по связыванию FcRn (например, Fc и альбумин или их фрагмент). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный компонент представляет собой партнера по связыванию FcRn, который слит с С-концом или N-концом полипептида с активностью FIX.
[181] Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов (например, компоненты, увеличивающие период полужизни) включают альбумин, фрагменты альбумина, Fc-фрагменты иммуноглобулинов, партнеров по связыванию FcRn, С-концевой пептид (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, последовательность на основе HAP, трансферрин, полипептиды на основе PAS согласно заявке на патент США № 20100292130, полиглициновые линкеры, полисериновые линкеры, пептиды и короткие полипептиды из 6-40 аминокислот двух типов аминокислот, выбранных, среди прочих, из глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P) с различными степенями вторичной структуры от менее чем 50% до более 50%.
[182] В некоторых аспектах гетерологичный компонент увеличивает время полужизни in vivo или in vitro полипептида с активностью FIX, продуцируемого лентивирусным вектором по настоящему изобретению. В других аспектах гетерологичный компонент облегчает визуализацию или локализацию полипептида с активностью FIX, продуцируемого лентивирусным вектором по настоящему изобретению. Визуализация и/или определение местоположения полипептида с активностью FIX может осуществляться in vivo, in vitro, ex vivo или в их комбинациях. В других аспектах гетерологичный компонент увеличивает стабильность полипептида с активностью FIX, продуцируемого лентивирусным вектором по настоящему изобретению. Используемый в данном документе термин "стабильность" относится к признанной в данной области мере поддержания одного или нескольких физических свойств полипептида с активностью FIX в ответ на условия окружающей среды (например, повышенную или пониженную температуру). В некоторых аспектах физическое свойство представляет собой поддержание ковалентной структуры полипептида с активностью FIX (например, отсутствие протеолитического расщепления, нежелательного окисления или дезамидирования). В других аспектах физическим свойством также может быть присутствие полипептида с активностью FIX в правильно уложенном состоянии (например, отсутствие растворимых или нерастворимых агрегатов или преципитатов).
[183] В определенных аспектах гетерологичный компонент, который увеличивает период полужизни слитого белка FIX по настоящему изобретению, включает без ограничения гетерологичный полипептид, например, альбумин, Fc-область иммуноглобулина, последовательность XTEN, C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, последовательность на основе PAS, последовательность на основе HAP, пептидную последовательность CTP, трансферрин, альбумин-связывающий компонент или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации этих полипептидов. В других связанных аспектах гетерологичный компонент, обеспечивающий продление периода полужизни, может включать сайт присоединения компонента, не являющегося полипептидом, такого как полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), полисиаловая кислота или любые производные, варианты или комбинации этих компонентов.
[184] В определенных аспектах полипептид с активностью FIX по настоящему изобретению содержит один, два, три или более гетерологичных компонентов, каждый из которых может представлять одинаковые или разные молекулы. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих XTEN. В других вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих XTEN, и один или несколько Fc-доменов. В одном конкретном варианте осуществления лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую XTEN, вставленную в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, и нуклеотидную последовательность, кодирующую Fc, слитый с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX.
C.1.a.i. XTEN
[185] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный компонент представляет собой XTEN. Используемый в данном документе термин "последовательность XTEN" относится к полипептидам увеличенной длины с не встречающимися в природе, по сути неповторяющимися последовательностями, которые состоят в основном из небольших гидрофильных аминокислот, с последовательностью, имеющей низкую степень или не имеющей вторичной или третичной структуры в физиологических условиях. Являясь партнером слитого белка, XTEN могут служить в качестве носителя, придавая определенные требуемые фармакокинетические, физико-химические и фармацевтические свойства при связывании с последовательностью FIX по настоящему изобретению с образованием слитого белка. Такие требуемые свойства включают без ограничения улучшенные фармакокинетические параметры и характеристики растворимости. Используемый в данном документе термин "XTEN" конкретным образом исключает антитела или фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела или Fc-фрагменты легкой цепи или тяжелой цепи.
[186] В некоторых аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую XTEN или его фрагмент, вариант или производное, где нуклеотидная последовательность, кодирующая XTEN, вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. В определенных аспектах два из гетерологичных компонентов представляют собой последовательности XTEN. В некоторых аспектах три из гетерологичных компонентов представляют собой последовательности XTEN. В некоторых аспектах четыре из гетерологичных компонентов представляют собой последовательности XTEN. В некоторых аспектах пять из гетерологичных компонентов представляют собой последовательности XTEN. В некоторых аспектах шесть или более из гетерологичных компонентов представляют собой последовательности XTEN.
[187] В некоторых вариантах осуществления последовательность XTEN представляет собой пептид или полипептид, содержащий более чем приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления XTEN представляет собой пептид или полипептид, содержащий более чем от приблизительно 20 до приблизительно 3000 аминокислотных остатков, более чем от 30 до приблизительно 2500 остатков, более чем от 40 до приблизительно 2000 остатков, более чем от 50 до приблизительно 1500 остатков, более чем от 60 до приблизительно 1000 остатков, более чем от 70 до приблизительно 900 остатков, более чем от 80 до приблизительно 800 остатков, более чем от 90 до приблизительно 700 остатков, более чем от 100 до приблизительно 600 остатков, более чем от 110 до приблизительно 500 остатков или более чем от 120 до приблизительно 400 остатков. В одном конкретном варианте осуществления XTEN содержит аминокислотную последовательность длиной более чем 42 аминокислоты и короче чем 144 аминокислоты в длину.
[188] Последовательность XTEN может содержать один или несколько мотивов последовательностей из 5-14 (например, от 9 до 14) аминокислотных остатков или аминокислотную последовательность, на по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную мотиву последовательности, где мотив содержит, по сути состоит или состоит из 4-6 типов аминокислот (например, 5 аминокислот), выбранных из группы, состоящей из глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P). См. патент США № 2010-0239554 A1.
[189] Примеры последовательностей XTEN, которые можно применять в соответствии с настоящим раскрытием, раскрыты в публикациях патентов США №2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1 или 2011/0172146 A1, или публикациях международных заявок № WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, WO 2014/011819 A2, WO 2015/023891 или WO 2017/024060, каждая из которых в полном ее объеме включена в данный документ посредством ссылки.
C.1.a.ii. Fc-области или партнеры по связыванию FcRn
[190] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный компонент представляет собой Fc-область (например, партнера по связыванию FcRn) или ее фрагмент. В определенных аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую Fc-область (например, партнера по связыванию FcRn), которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. Как используется в данном документе "Fc" или "Fc-область" могут представлять собой функционального партнера по связыванию неонатального Fc-рецептора (FcRn), содержащего Fc-домен, его вариант или фрагмент, если не указано иное. Партнер по связыванию FcRn представляет собой любую молекулу, которая может специфически связываться рецептором FcRn с последующим активным транспортом рецептором FcRn партнера по связыванию FcRn, в том числе без ограничения альбумин. Таким образом, термин Fc включает любые варианты Fc IgG, которые являются функциональными. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, была описана на основе данных рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al., Nature 372:379 1994, включенный в данный документ в его полном объеме посредством ссылки). Основная область контакта Fc с FcRn находится вблизи стыка доменов CH2 и CH3. Все области контакта Fc-FcRn находятся в пределах одной тяжелой цепи Ig. Партнеры по связыванию FcRn включают без ограничения целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые содержат полную связывающую область FcRn. Fc может содержать СН2- и СН3-домены иммуноглобулина с шарнирной областью иммуноглобулина или без нее. Также включены фрагменты, варианты или производные Fc, которые сохраняют требуемые свойства Fc-области в слитом белке, например, увеличение периода полужизни, например периода полужизни in vivo. Мириады мутантов, фрагментов, вариантов и производных описаны, например, в публикациях согласно РСТ № WO 2011/069164 A2, WO 2012/006623 A2, WO 2012/006635 A2 или WO 2012/006633 A2, все из которых включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
[191] Нуклеотидная последовательность, кодирующая один или несколько Fc-доменов, может быть вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-домен, слита с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с активностью FIX. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-домен, слита с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид с активностью FIX. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая Fc-домен, слита с нуклеотидной последовательностью, кодирующей другой гетерологичный компонент, например XTEN, который вставлен в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, или слит с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец нуклеотидной последовательности, кодирующей XTEN. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую второй Fc-домен. Экспрессированный второй Fc-домен может быть ассоциирован с первым Fc-доменом, например, посредством одной или нескольких ковалентных связей.
C.1.a.iii. Альбумины
[192] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный компонент представляет собой альбумин, альбумин-связывающий домен или альбумин-связывающую малую молекулу или ее вариант, производное или фрагмент. В определенных аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид альбумина или его фрагмент, вариант или производное, которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. Сывороточный альбумин человека (HSA или HA), белок из 609 аминокислот в его полноразмерной форме, отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также функционирует как переносчик эндогенных и экзогенных лигандов. Термин "альбумин", используемый в данном документе, включает полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог. Примеры альбумина или его фрагментов или вариантов раскрыты в публикациях заявок на патент США №№ 2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1 или 2008/0153751 A1 или в публикациях заявок согласно PCT №№ 2008/033413 A2, 2009/058322 A1 или 2007/021494 A2, которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
[193] Альбуминсвязывающие полипептиды (ABP) могут включать без ограничения бактериальные альбуминсвязывающие домены, альбуминсвязывающие пептиды или фрагменты альбумин-связывающих антител, которые могут связываться с альбумином. Домен 3 из стрептококкового белка G, как описано в Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) и Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002), представляет собой пример бактериального альбумин-связывающего домена. Примеры альбумин-связывающих пептидов включают серию пептидов, имеющих коровую последовательность DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 15). См., например, Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Примеры фрагментов альбумин-связывающих антител раскрыты в Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007) и Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008), которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
[194] В некоторых аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт связывания для неполипептидной малой молекулы, ее варианта или производного, которые могут связываться с альбумином (например, малая альбумин-связывающая молекула), которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. Примером таких альбумин-связывающих компонентов является 2-(3-малеимидопропанамидо)-6-(4-(4-йодофенил)бутанамидо)гексаноат (метка "Альбу"), как раскрыто в Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).
[195] В некоторых вариантах осуществления последовательность альбумин-связывающего полипептида в экспрессируемом полипептиде фланкирована на С-конце, N-конце или обоих концах пептидной линкерной последовательностью Gly-Ser. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly-Ser представляет собой Gly4Ser (SEQ ID NO: 16). В других вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly-Ser представляет собой (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 17).
C.1.a.iv. CTP
[196] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный компонент представляет собой C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека или его фрагмент, вариант или производное. В определенных аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую CTP или его фрагмент, вариант или производное, которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. Известно, что введение одного или нескольких пептидов CTP в рекомбинантный белок увеличивает период полужизни такого белка. См., например, патент США № 5712122, включенный в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Иллюстративные пептиды CTP включают DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 18) или SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 19). См., например, публикацию заявки на патент США № US 2009/0087411 A1, включенную в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления последовательность CTP в экспрессируемом полипептиде фланкирована на С-конце, N-конце или обоих концах пептидной линкерной последовательностью Gly-Ser. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly-Ser представляет собой Gly4Ser (SEQ ID NO: 16). В других вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly-Ser представляет собой (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 17).
C.1.a.v. PAS
[197] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный компонент представляет собой пептид на основе PAS. В определенных аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид на основе PAS или его фрагмент, вариант или производное, которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. "Пептид на основе PAS" или "последовательность на основе PAS", используемые в данном документе, означают аминокислотную последовательность, содержащую в основном остатки аланина и серина или содержащую в основном остатки аланина, серина и пролина, при этом аминокислотная последовательность образует произвольную спиральную конформацию при физиологических условиях. Соответственно, последовательность на основе PAS представляет собой структурный блок, аминокислотный полимер из или последовательность-кассету, которые содержат аланин, серин и пролин, состоят по сути из них или состоят из них, которые можно применять в качестве части гетерологичного компонента в слитом белке. Аминокислотный полимер также может образовывать конформацию случайного клубка, когда остатки, отличные от аланина, серина и пролина, добавляются в качестве минорного компонента в последовательность на основе PAS. Под "дополнительным составляющим" подразумевается, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть добавлены в последовательность на основе PAS в определенной мере, например, не более приблизительно 12%, т. e. приблизительно 12 из 100 аминокислот последовательности на основе PAS, не более приблизительно 10%, не более приблизительно 9%, не более приблизительно 8%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, т. e. приблизительно 2% или приблизительно 1% аминокислот. Аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr и Val. В физиологических условиях пептид на основе PAS образует конформацию случайного клубка и, таким образом, может опосредовать повышенную стабильность in vivo и/или in vitro.
[198] Неограничивающие примеры пептидов на основе PAS включают ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 20), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 21), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 22), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 23), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 24), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 25), ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 26) или их любые варианты, производные, фрагменты или комбинации. Дополнительные примеры последовательностей на основе PAS известны, например, из публикации заявки на патент США № 2010/0292130 A1 и публикации заявки согласно PCT № WO 2008/155134 A1. Выдан европейский патент EP2173890.
[199] В некоторых вариантах осуществления последовательность на основе PAS в экспрессируемом полипептиде фланкирована на С-конце, N-конце или обоих концах пептидной линкерной последовательностью Gly-Ser. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly-Ser представляет собой Gly4Ser (SEQ ID NO: 16). В других вариантах осуществления пептидный линкер на основе Gly/Ser представляет собой (Gly4Ser)2 (SEQ ID NO: 17).
C.1.a.vi. HAP
[200] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один гетерологичный фрагмент представляет собой пептид гомоаминокислотного полимера (НАР) или его фрагмент, вариант или производное. В определенных аспектах лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид гомоаминокислотного полимера (НАР) или его фрагмент, вариант или производное, которая вставлена в нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью FIX, слита с частью нуклеотидной последовательности, кодирующей С-конец полипептида с активностью FIX, или и то, и другое, где полученный слитый полипептид характеризуется прокоагулянтной активностью. Пептид на основе HAP может содержать повторяющуюся последовательность из глицина, которая имеет длину по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, 120 аминокислот, 140 аминокислот, 160 аминокислот, 180 аминокислот, 200 аминокислот, 250 аминокислот, 300 аминокислот, 350 аминокислот, 400 аминокислот, 450 аминокислот или 500 аминокислот. Последовательность на основе HAP способна обеспечивать продление периода полужизни компонента, слитого или связанного с последовательностью HAP. Неограничивающие примеры последовательности на основе HAP включают без ограничения (Gly)n, (Gly4Ser)n или S(Gly4Ser)n, где n равняется 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В одном варианте осуществления n равняется 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. В другом варианте осуществления n равняется 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200. См., например, Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).
C.2. Регуляторные элементы
[201] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит элемент контроля генной экспрессии. Последовательность, осуществляющая контроль экспрессии гена, может, например, представлять собой промотор млекопитающего или вируса, такой как конститутивный или индуцируемый промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают без ограничения промоторы следующих генов: гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, промотор гена бета-актина и другие конститутивные промоторы. Иллюстративные вирусные промоторы, которые функционируют конститутивно в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (HIV), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молони и других ретровирусов, а также промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса.
[202] Также можно использовать другие конститутивные промоторы. Промоторы, используемые в качестве последовательностей экспрессии генов по настоящему изобретению, также включают индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы обеспечивают экспрессию в присутствии индуцирующего средства. Например, промотор металлотионеина индуцируется для ускорения транскрипции и трансляции в присутствии определенных ионов металлов. Могут использоваться другие индуцируемые вещества.
[203] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает экспрессию трансгена под контролем тканеспецифического промотора и/или энхансера. В другом варианте промотор или другая последовательность контроля экспрессии избирательно усиливает экспрессию трансгена в клетках печени. Примеры специфических для печени промоторов включают без ограничения промотор гена тиретина мыши (mTTR), эндогенный промотор гена фактора VIII человека (F8), промотор гена альфа-1-антитрипсина человека (hAAT), минимальный промотор гена альбумина человека и промотор гена альбумина мыши. В одном конкретном варианте осуществления промотор предусматривает промотор mTTR. Промотор mTTR описан в R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697. Промотор F8 описан в Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере один тканеспецифический промотор, т. е. промотор, который регулировал бы экспрессию полипептида с активностью FIX в конкретной ткани или типе клеток. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор в лентивирусном векторе избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический промотор, который избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени, предусматривает промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122, промотор ЕТ (№ в GenBank AY661265; см. также Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)) или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления целевая клетка печени представляет собой гепатоцит.
[204] Уровни экспрессии можно дополнительно повышать для достижения терапевтической эффективности с использованием одного или нескольких энхансеров. Один или несколько энхансеров могут быть предоставлены отдельно или вместе с одним или несколькими промоторными элементами. Как правило, последовательность, контролирующая экспрессию, содержит множество энхансерных элементов и тканеспецифический промотор. В одном варианте осуществления энхансер содержит одну или несколько копий энхансера гена α-1-микроглобулина/бикунина (Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30). В другом варианте осуществления энхансер получен из сайтов связывания специфических в отношении печени факторов транскрипции, таких как EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, при этом Enh1 содержит HNF1 (смысловая) - HNF3 (смысловая) - HNF4 (антисмысловая) - HNF1 (антисмысловая) - HNF6 (смысловая) - EBP (антисмысловая) - HNF4 (антисмысловая).
[205] Примеры других подходящих векторов и регуляторных элементов генов описаны в WO 02/092134, EP1395293 или патентах США №№ 6808905, 7745179 или 7179903, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[206] В целом, последовательности, осуществляющие контроль экспрессии, должны включать, при необходимости, 5'-нетранскрибирующие и 5'-нетранслирующие последовательности, вовлеченные соответственно в инициацию транскрипции и трансляции, такие как TATA-бокс, кэппирующая последовательность, последовательность CAAT и т.п. В частности, такие 5'-нетранскрибирующие последовательности будут включать промоторную область, которая включает промоторную последовательность для контроля транскрипции функционально связанной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности, контролирующие экспрессию генов, необязательно включают энхансерные последовательности или расположенные выше активаторные последовательности, если это требуется.
[207] Поскольку лентивирусный вектор может трансдуцировать все типы клеток печени, экспрессию трансгена (например, FIX) в разных типах клеток можно контролировать, используя разные промоторы в лентивирусном векторе. Таким образом, лентивирусный вектор может содержать специфические промоторы, которые будут контролировать экспрессию трансгена FIX в различных тканях или типах клеток, таких как различные ткани или типы клеток печени. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор может содержать специфический в отношении эндотелия промотор, который мог бы контролировать экспрессию трансгена FIX в эндотелиальной ткани печени, или специфический в отношении гепатоцитов промотор, который мог бы контролировать экспрессию трансгена FIX в гепатоцитах, или и то, и другое.
[208] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит тканеспецифический промотор или тканеспецифический промотор, который контролирует экспрессию трансгена FIX в тканях, отличных от печени. В некоторых вариантах осуществления выделенную молекулу нуклеиновой кислоты стабильно интегрируют в геном целевой клетки или целевой ткани, например, в геном гепатоцита или в геном эндотелиальной клетки печени.
[209] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере один донорный сайт сплайсинга. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере один акцепторный сайт сплайсинга.
[210] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, rev-зависимый элемент (RRE) или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит полноразмерную последовательность gag. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит усеченную последовательность gag. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит полноразмерную последовательность pol. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит усеченную последовательность pol. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит полноразмерную последовательность rev. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит усеченную последовательность rev. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит полноразмерную последовательность RRE. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит усеченную последовательность RRE.
[211] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит энхансер, промотор, целевую последовательность для микроРНК (miRNA), посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, последовательность интрона или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит энхансер, который способствует экспрессии нуклеотидной последовательности в клетке печени.
[212] В некоторых вариантах осуществления будет полезно включить в лентивирусный вектор одну или несколько целевых последовательностей miRNA, которые, например, функционально связаны с трансгеном FIX. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена по меньшей мере одна целевая последовательность miRNA, функционально связанная с нуклеотидной последовательностью FIX или иным образом вставленная в лентивирусный вектор. Более чем одна копия целевой последовательности miRNA, включенная в лентивирусный вектор, может повысить эффективность системы.
[213] Также включены различные целевые последовательности miRNA. Например, в лентивирусных векторах, которые экспрессируют более чем один трансген, трансген может находиться под контролем более чем одной целевой последовательности miRNA, которые могут быть одинаковыми или разными. Целевые последовательности miRNA могут быть расположены в тандеме, но также включены другие схемы расположения. Трансгенная кассета экспрессии, содержащая целевые последовательности miRNA, также может быть вставлена в вектор в антисмысловой ориентации. Антисмысловая ориентация может быть применима в получении вирусных частиц во избежание экспрессии продуктов генов, которые в противном случае могут быть токсичными для клеток-продуцентов.
[214] В других вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 копий одной и той же или разных целевых последовательностей miRNA. Однако в некоторых других вариантах осуществления лентивирусный вектор не будет включать какую-либо целевую последовательность miRNA. Выбор того, включать ли целевую последовательность miRNA (и сколько), будет определяться такими параметрами, как предполагаемая целевая ткань, требуемый уровень экспрессии и т. д.
[215] В одном варианте осуществления целевая последовательность представляет собой целевую miR-223, которая, как сообщается, наиболее эффективно блокирует экспрессию в коммитированных предшественниках миелоида и по меньшей мере частично в более примитивных HSPC. Целевая miR-223 может блокировать экспрессию в дифференцированных миелоидных клетках, включая гранулоциты, моноциты, макрофаги, миелоидные дендритные клетки. Целевая miR-223 также может быть подходящей для применения в генной терапии, основанной на устойчивой экспрессии трансгена в лимфоидном или эритроидном клонах. Целевая miR-223 также может очень эффективно блокировать экспрессию в HSC человека.
[216] В другом варианте осуществления целевая последовательность представляет собой мишень для miR142 (tccataaagt aggaaacact aca (SEQ ID NO: 27)). В одном варианте осуществления лентивирусный вектор содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть копий целевых последовательностей miR-142. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит четыре копии целевых последовательностей miR-142. В определенных вариантах осуществления комплементарная последовательность гемопоэтических специфических микроРНК, такая как miR-142 (142T) или "142-3pT", включена в 3'-нетранслируемую область лентивирусного вектора, что делает транскрипт, кодирующий трансген, чувствительным к miRNA-опосредованной понижающей регуляции. С помощью данного способа можно предотвратить экспрессию трансгена в антигенпрезентирующих клетках (АРС) гемопоэтической линии дифференцировки с поддержанием при этом ее в клетках, отличных от гемопоэтических (Brown et al., Nat Med 2006). Эта стратегия может наложить строгий посттранскрипционный контроль на экспрессию трансгена и, таким образом, обеспечивает стабильную доставку и долгосрочную экспрессию трансгенов. В некоторых вариантах осуществления посредством регуляции с помощью miR-142 предотвращается иммуноопосредованное выведение трансдуцированных клеток и/или индуцируется образование антигенспецифических регуляторных T-клеток (Treg) и опосредуется устойчивая иммунологическая толерантность к антигену, кодируемому трансгеном.
[217] В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность представляет собой целевую miR181. В Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165 раскрыты miR-181, miRNA, специфично экспрессирующиеся в В-клетках костного мозга мышей (Chen and Lodish, 2005). Также раскрыто, что некоторые miRNA человека связаны с формами лейкоза.
[218] Целевая последовательность может быть полностью или частично комплементарной miRNA. Термин "полностью комплементарная" означает, что целевая последовательность имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 100% комплементарна последовательности miRNA, которая ее распознает. Термин "частично комплементарная" означает, что целевая последовательность является лишь частично комплементарной последовательности miRNA, которая ее распознает, при этом частично комплементарная последовательность по-прежнему распознается miRNA. Другими словами, частично комплементарная целевая последовательность в контексте настоящего изобретения эффективно распознается соответствующей miRNA и предотвращает или снижает экспрессию трансгена в клетках, экспрессирующих эту miRNA. Примеры целевых последовательностей miRNA описаны в WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413 или WO2010/125471, которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
[219] В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX в лентивирусном векторе по настоящему изобретению, включает, состоит или состоит по сути из лентивирусного вектора, содержащего coFIX-1-R338L (SEQ ID NO: 1).
C.3. Лентивирусные векторы
[220] Лентивирусы включают представителей группы лентивирусов крупного рогатого скота, группы лентивирусов лошадиных, группы лентивирусов кошачьих, группы лентивирусов овечьих и козьих, а также группы лентивирусов приматов. Разработка лентивирусных векторов для генной терапии была рассмотрена в Klimatcheva et al. (1999) Frontiers in Bioscience 4:481-496. Конструирование и применение лентивирусных векторов, подходящих для генной терапии, описано, например, в патентах США №№ 6207455 и 6615782. Примеры лентивируса включают без ограничения HIV-1, HIV-2, псевдотип HIV-1/HIV-2, HIV-1/SIV, FIV, вирус артрита-энцефалита козьих (CAEV), вирус инфекционной анемии лошадиных и вирус иммунодефицита крупного рогатого скота.
[221] Схематическое представление лентивирусного вектора по настоящему изобретению показано на ФИГ. 1. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению является лентивирусным вектором "третьего поколения". Как используется в данном документе, термин лентивирусный вектор "третьего поколения" относится к лентивирусной системе упаковки, которая имеет характеристики векторной системы второго поколения, и в которой, кроме того, отсутствует функциональный ген tat, например, системе, в которой ген tat был удален или инактивирован. Как правило, ген, кодирующий rev, обеспечивают в отдельной конструкции для экспрессии. См., например, Dull et al. (1998) J. Virol. 72: 8463-8471. Как используется в данном документе, система лентивирусного вектора "второго поколения" относится к лентивирусный системе упаковки, в которой отсутствуют функциональные вспомогательные гены, такой как система, в которой были удалены или инактивированы вспомогательные гены vif, vpr, vpu и nef. См., например, Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:871-875. Как используется в данном документе, "система упаковки" относится к набору вирусных конструкций, содержащих гены, которые кодируют вирусные белки, участвующие в упаковке рекомбинантного вируса. Как правило, конструкции системы упаковки в конечном итоге встраиваются в упаковывающую клетку.
[222] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор третьего поколения по настоящему изобретению представляет собой самоинактивирующийся лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор псевдотипа VSV.G. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит промотор, специфический в отношении млекопитающих, для экспрессии трансгена. В некоторых вариантах осуществления промотор, специфический в отношении млекопитающих, представляет собой промотор цитомегаловируса (CMV). В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит промотор, специфический в отношении гепатоцита, для экспрессии трансгена. В некоторых вариантах осуществления промотор, специфический в отношении гепатоцита, представляет собой усиленный промотор транстиретина. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит одну или несколько целевых последовательностей для miR-142 для обеспечения снижения иммунного ответа на продукт трансгена. В некоторых вариантах осуществления включение одной или нескольких целевых последовательностей для miR-142 в лентивирусный вектор по настоящему изобретению обеспечивает требуемый профиль экспрессии трансгена. Например, включение одной или нескольких целевых последовательностей для miR-142 может подавлять экспрессию трансгена во внутрисосудистых и внесосудистых линиях гемопоэтических клеток, тогда как экспрессия трансгена в клетках, отличных от гематопоэтических, сохраняется. Онкогенез не был выявлен у мышей, склонных к опухоли, получавших лентивирусную векторную систему по настоящему изобретению. См. Brown et al. (2007) Blood 110:4144-52, Brown at al. (2006) Nat. Ned. 12:585-91 и Cantore et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7(277):277ra28.
[223] Лентивирусные векторы по настоящему изобретению включают полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, характеризующиеся активностью FIX, описанной в данном документе. В одном варианте осуществления полипептид, обладающий активностью FIX, функционально связан с последовательностью контроля экспрессии. Как используется в данном документе, две последовательности нуклеиновой кислоты являются функционально связанными, если они ковалентно связаны таким образом, что обеспечивается сохранение функциональности каждого компонента, представляющего собой последовательность нуклеиновой кислоты. Считается, что кодирующая последовательность и последовательность, осуществляющая контроль экспрессии гена, функционально связаны, в случае если они ковалентно связаны таким образом, чтобы поместить экспрессию, или транскрипцию, и/или трансляцию кодирующей последовательности под влияние или контроль последовательности, осуществляющей контроль экспрессии гена. Две последовательности ДНК считаются функционально связанными, если индукция промотора в 5'-последовательности, контролирующей экспрессию гена, приводит к транскрипции кодирующей последовательности, и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки считывания, (2) не препятствуют способности промоторной области управлять транскрипцией кодирующей последовательности или (3) не препятствуют способности соответствующего транскрипта РНК транслироваться с образованием белка. Таким образом, последовательность, контролирующая экспрессию гена, является функционально связанной с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если последовательность, контролирующая экспрессию гена, способна влиять на транскрипцию этой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы полученный транскрипт транслировался в требуемый белок или полипептид.
[224] В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой вектор рекомбинантного лентивируса, способный трансдуцировать неделящиеся клетки. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой вектор рекомбинантного лентивируса, способного трансдуцировать клетки печени (например, гепатоциты). Геном лентивируса и провирусная ДНК, как правило, содержат три гена, обнаруженные в ретровирусах: gag, pol и env, которые фланкированы двумя последовательностями длинных концевых повторов (LTR). Ген gag кодирует внутренние структурные (матрикс, капсид и нуклеокапсид) белки; ген pol кодирует РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу), протеазу и интегразу; а ген env кодирует гликопротеины вирусной оболочки. 5'- и 3'-LTR служат для стимуляции транскрипции и полиаденилирования РНК вириона. LTR содержит все другие последовательности, действующие в цис-положении, необходимые для репликации вируса. Лентивирусы имеют дополнительные гены, в том числе vif, vpr, tat, rev, vpu, nef и vpx (в HIV-1, HIV-2 и/или SIV).
[225] Рядом с 5'-LTR находятся последовательности, необходимые для обратной транскрипции генома (сайт связывания праймера, представляющего собой tRNA) и для эффективного капсидирования вирусной РНК в частицы (сайт Psi). Если последовательности, необходимые для капсидирования (или упаковки ретровирусной РНК в инфекционные вирионы), отсутствуют в вирусном геноме, то цис-дефект предотвращает капсидирование геномной РНК.
[226] Однако полученный в результате мутант остается способным управлять синтезом всех белков вириона. В настоящем изобретении представлен способ получения рекомбинантного лентивирусного вектора, способного трансдуцировать неделящуюся клетку, предусматривающий трансфекцию подходящей клетки-хозяина двумя или более векторами, несущими функции упаковки, а именно, gag, pol и env, а также rev и tat. Как будет раскрыто в данном документе ниже, для определенных применений желательны векторы, лишенные функционального гена tat. Таким образом, например, первый вектор может обеспечивать нуклеиновую кислоту, кодирующую gag вируса и pol вируса, а другой вектор может обеспечивать нуклеиновую кислоту, кодирующую env вируса, с получением упаковывающей клетки. Введение вектора, обеспечивающего гетерологичный ген, обозначенного в данном документе как вектор для переноса, в эту упаковывающую клетку обеспечивает получение клетки-продуцента, которая высвобождает инфекционные вирусные частицы, несущие представляющий интерес чужеродный ген.
[227] В соответствии с указанной выше конфигурацией векторов и чужеродных генов второй вектор может предусматривать нуклеиновую кислоту, кодирующую ген вирусной оболочки (env). Ген env может происходить практически из любого подходящего вируса, включая ретровирусы. В некоторых вариантах осуществления белок env представляет собой амфотропный белок оболочки, который обеспечивает трансдукцию клеток человека и других видов.
[228] Примеры происходящих из ретровирусов генов env включают без ограничения следующие: мышиный вирус лейкемии Молони (MoMuLV или MMLV), мышиный вирус саркомы Харви (HaMuSV или HSV), мышиный вирус опухоли молочной железы (MuMTV или MMTV), вирус лейкемии гиббонов (GaLV или GALV), вирус иммунодефицита человека (HIV) и вирус саркомы Рауса (RSV). Также можно использовать другие гены env, такие как ген белка G вируса везикулярного стоматита (VSV) (VSV G), вируса гепатита и гриппа. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты env вируса функционально ассоциирована с регуляторными последовательностями, описанными в другом месте данного документа.
[229] В определенных вариантах осуществления в лентивирусном векторе удалены гены вирулентности HIV, env, vif, vpr, vpu и nef без ущерба для способности вектора трансдуцировать неделящиеся клетки. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор предусматривает делецию области U3 в 3'-LTR. Делеция области U3 может являться полной делецией или частичной делецией.
[230] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению, содержащий нуклеотидную последовательность полипептида, обладающего активностью FIX, описанного в данном документе, может быть трансфицирован в клетку с (а) первой нуклеотидной последовательностью, содержащей гены gag, pol или gag и pol, и (b) второй нуклеотидной последовательностью, содержащей гетерологичный ген env; где в лентивирусном векторе отсутствует функциональный ген tat. В других вариантах осуществления клетку дополнительно трансфицируют четвертой нуклеотидной последовательностью, содержащей ген rev. В определенных вариантах осуществления в лентивирусном векторе отсутствуют функциональные гены, выбранные из vif, vpr, vpu, vpx и nef, или их комбинация.
[231] В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок gag, Rev-зависимый элемент, центральный полипуриновый тракт (cPPT) или любую их комбинацию.
[232] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит на своей поверхности один или несколько полипептидов, которые улучшают нацеливание и/или активность лентивирусного вектора или кодируемого полипептида, обладающего активностью FIX. Один или несколько полипептидов могут быть включены во время отпочкования лентивирусного вектора из клетки-хозяина. Во время продуцирования лентивирусов вирусные частицы отпочковываются от продуцирующей клетки-хозяина. В процессе отпочкования вирусная частица покрывается липидной оболочкой, которая образована липидной мембраной клетки-хозяина. В результате липидная оболочка вирусной частицы может включать связанные с мембраной полипептиды, которые ранее присутствовали на поверхности клетки-хозяина.
[233] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор экспрессирует на своей поверхности один или несколько полипептидов, которые ингибируют иммунный ответ на лентивирусный вектор после введения субъекту-человеку. В некоторых вариантах осуществления поверхность лентивирусного вектора содержит одну или несколько молекул CD47. CD47 является "маркером собственного" белка, который повсеместно экспрессируется на клетках человека. Экспрессия CD47 на поверхности ингибирует индуцированный макрофагами фагоцитоз эндогенных клеток за счет взаимодействия CD47 и экспрессируемого макрофагами SIRPα. Клетки, экспрессирующие CD47 на высоких уровнях, с меньшей вероятностью становятся мишенью и разрушаются человеческими макрофагами in vivo.
[234] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит высокую концентрацию молекул полипептида CD47 на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в линии клеток, которая характеризуется высоким уровнем экспрессии CD47. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке CD47high, где клетка характеризуется высоким уровнем экспрессии CD47 на клеточной мембране. В конкретных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке CD47high HEK 293T, где HEK 293T характеризуется высоким уровнем экспрессии CD47 на клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления клетка HEK 293T модифицирована для повышения экспрессии CD47 по сравнению с немодифицированными клетками HEK 293T. В определенных вариантах осуществления CD47 представляет собой CD47 человека.
[235] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит CD47 человека, который содержит аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14.
[236] В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор характеризуется невысоким уровнем экспрессии основного комплекса гистосовместимости класса I (MHC-I) на поверхности или отсутствием таковой. Экспрессируемый на поверхности MHC-I презентирует пептидные фрагменты "несобственных" белков из клетки, такие как фрагменты белка, указывающие на инфекцию, способствуя иммунному ответу против клетки. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке MHC-Ilow, где клетка характеризуется пониженным уровнем экспрессии MHC-I на клеточной мембране. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клетке MHC-I- (или "MHC-Ifree", "MHC-1neg" или "MHC-negative"), где в клетке отсутствует экспрессия MHC-I.
[237] В конкретных вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит липидную оболочку, характеризующуюся высокой концентрацией полипептидов CD47 и отсутствием полипептидов MHC-I. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в линии клеток CD47high/MHC-Ilow, например, линии клеток CD47high/MHC-Ilow HEK 293T. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор продуцируется в клеточной линии CD47high/MHC-Ifree, например, в клеточной линии CD47high/MHC-Ifree HEK 293T. Примеры лентивирусных векторов раскрыты в патенте США № 9050269 и международных публикациях № WO9931251, W09712622, W09817815, W09817816 и WO9818934, которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
III. Фармацевтические композиции
[238] Композиции, содержащие лентивирусный вектор, молекулу нуклеиновой кислоты, полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, или клетку-хозяин по настоящему изобретению, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать вспомогательные вещества и/или вспомогательные средства, которые способствуют переработке активных соединений в препараты, предназначенные для доставки в место действия.
[239] В одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию, содержащую (а) молекулу нуклеиновой кислоты, лентивирусный вектор, полипептид или клетку-хозяин, раскрытые в данном документе; и (b) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
[240] Фармацевтическая композиция может быть составлена для парентерального введения (т. е. внутривенного, подкожного или внутримышечного) с помощью болюсной инъекции. Составы для инъекций могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для смешивания с подходящим носителем, например апирогенной водой.
[241] В одном варианте осуществления путь введения лентивирусных векторов является парентеральным. Используемый в данном документе термин "парентеральный" включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Внутривенная форма парентерального введения является предпочтительной. Хотя все эти формы введения явно рассматриваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения, формой для введения будет раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного введения. Обычно подходящая фармацевтическая композиция для инъекций может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующее средство (например, альбумин человека) и т.д. Однако в других способах, совместимых с изложенными в данном документе идеями, лентивирусный вектор можно доставлять непосредственно в место локализации нежелательной клеточной популяции, за счет чего увеличивается воздействие терапевтического средства на пораженную ткань.
[242] Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и буферные среды. В рассматриваемом изобретении фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения 0,01-0,1 M и предпочтительно 0,05 M фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Другие распространенные среды-носители для парентерального введения включают растворы фосфата натрия, раствор Рингера с декстрозой, раствор декстрозы и хлорида натрия, лактатный раствор Рингера или нелетучие масла. Среды-носители для внутривенного введения включают растворы с добавками жидкости и питательных веществ, растворы с добавками электролитов, такие как те, что на основе раствора Рингера с декстрозой, и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатообразующие средства и инертные газы, и т.п.
[243] Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы ее легко было вводить с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и предпочтительно будет защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, с помощью поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ.
[244] Предотвращения действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических средств, например, сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно обеспечивать с помощью включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
В любом случае стерильные инъекционные растворы можно получить с помощью включения активного соединения (например, полипептида самого по себе или в комбинации с другими активными средствами) в необходимом количестве в соответствующем растворителе вместе с одним ингредиентом или их комбинацией, перечисленными в данном документе, в случае необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. Как правило, дисперсии получают с помощью включения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае со стерильными порошками для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумное высушивание и сублимационное высушивание, которые приводят к получению порошка активного ингредиента и любого дополнительного требуемого ингредиента из их раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации. Препараты для инъекций обрабатывают, наполняют ими контейнеры, такие как ампулы, пакеты, бутылки, шприцы или флаконы, и закупоривают в асептических условиях в соответствии со способами, известными из уровня техники. Кроме того, препараты могут упаковываться и продаваться в форме набора. Такие изделия предпочтительно будут иметь этикетки или листки-вкладыши в упаковке, на которых указано, что соответствующие композиции применимы для лечения субъекта, страдающего нарушениями свертывания крови или предрасположенного к ним.
[245] Инъекционные депо-составы можно получать с помощью образования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биоразлагаемых полимерах, таких как сополимер лактида и гликолида. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера и природы используемого полимера можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Другими иллюстративными биоразлагаемыми полимерами являются сложные полиортоэфиры и полиангидриды. Инъекционные составы-депо также могут быть получены с помощью захвата лекарственного средства в липосомах или микроэмульсиях.
[246] Фармацевтическая композиция также может быть составлена для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащих общепринятые основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
[247] В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению составлена с фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, фактор свертывания крови включает без ограничения фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор фон Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевый фактор (rsTF) или активированные формы любого из вышеуказанных. Фактор свертывания крови в гемостатическом средстве также может включать антифибринолитические лекарственные средства, например, эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту.
[248] Режимы дозирования можно корректировать с получением оптимального требуемого эффекта. Например, можно вводить однократную болюсную дозу, можно вводить несколько разделенных доз на протяжении некоторого периода времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как указывают потребности терапевтической ситуации. Предпочтительным является составление композиций для парентерального введения в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и равномерности дозирования. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).
[249] Предполагается, что промежуточные дозы в вышеуказанных диапазонах также входят в объем настоящего изобретения. Субъектам можно вводить такие дозы ежесуточно, через сутки, еженедельно или по любой другой схеме, определенной эмпирическим анализом. Иллюстративное лечение включает введение в виде нескольких доз в течение длительного периода, например по меньшей мере шести месяцев.
[250] Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно вводить субъекту на разных стадиях развития. Например, у людей разные стадии развития могут быть классифицированы как новорожденный (например, до 1 месяца), младенец (от 1 месяца до 2 лет), ребенок (от 2 до 12 лет), подросток (от 12 лет до 16 лет) или взрослый (старше 16 лет). В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят новорожденному. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят субъекту-человеку в возрасте до приблизительно 1 месяца. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят младенцу. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят субъекту-человеку в возрасте от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2 лет. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят ребенку. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят субъекту-человеку в возрасте от приблизительно 2 до приблизительно 12 лет. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят подростку. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят субъекту-человеку в возрасте от приблизительно 12 до приблизительно 16 лет. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят взрослому. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор по настоящему изобретению вводят человеку старше чем приблизительно 16 лет. Специалист в данной области сможет определить стадию развития у других организмов. Например, специалист в данной области поймет, что двухнедельная мышь является подростком.
[251] Дозировка и частота введения лентивирусных векторов по настоящему изобретению могут варьироваться в зависимости от различных факторов, известных специалистам в данной области.
[252] Лентивирусный вектор по настоящему изобретению можно необязательно вводить в комбинации с другими средствами, эффективными в лечении нарушения или состояния, которое нужно подвергать лечению (например, профилактическом или терапевтическом).
[253] Как используется в данном документе, введение лентивирусных векторов по настоящему изобретению в сочетании или комбинации со вспомогательной терапией означает последовательное, одновременное, одинаковое по протяженности, сопутствующее, параллельное или совпадающее во времени введение или применение терапии и раскрытых полипептидов. Специалистам в данной области будет понятно, что введение или применение различных компонентов комбинированной терапевтической схемы может быть спланировано по времени для повышения общей эффективности лечения. Квалифицированный специалист (например, врач) легко сможет определить эффективные комбинированные терапевтические схемы без излишнего экспериментирования на основе выбранной дополнительной терапии и положений настоящего описания.
[254] Кроме того, следует понимать, что лентивирусные векторы по настоящему изобретению можно использовать в сочетании или комбинации со средством или средствами (например, для обеспечения комбинированной терапевтической схемы). Иллюстративные средства, которые можно объединять с лентивирусным вектором по настоящему изобретению, включают средства, которые представляют современный стандарт оказания медицинской помощи при конкретном нарушении, подлежащем лечению. Такие средства могут быть химическими или биологическими по природе. Термин "биологический препарат" или "биологическое средство" относятся к любому фармацевтически активному средству, полученному из живых организмов и/или их продуктов, которое предназначено для применения в качестве терапевтического препарата.
[255] Количество средства, предназначенного для применения в комбинации с лентивирусными векторами по настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от субъекта или может вводиться в соответствии с тем, что известно из уровня техники. См., например, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents в GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed., 1996). В другом варианте осуществления вводят количество такого средства, соответствующее стандарту лечения.
[256] В определенных вариантах осуществления лентивирусные векторы по настоящему изобретению вводят в сочетании с иммуносупрессивным, противоаллергическим или противовоспалительным средствами. Как правило, такие средства относятся к веществам, которые действуют с подавлением или маскировкой иммунной системы субъекта, подлежащего лечению согласно данному документу. Такие средства включают вещества, которые подавляют продуцирование цитокинов, отрицательно регулируют или подавляют экспрессию аутоантигенов или маскируют антигены MHC. Примеры таких средств включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины; азатиоприн; циклофосфамид; бромокриптин; даназол; дапсон; глутаральдегид; антиидиотипические антитела для антигенов MHC и фрагментов MHC; циклоспорин А; стероиды, такие как глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон; антагонисты цитокинов или цитокиновых рецепторов, включая антитела против интерферона γ, β или α, антитела против фактора некроза опухоли α, антитела против фактора некроза опухоли β, антитела против интерлейкина 2 и антитела против рецептора IL-2; антитела против LFA-1, включая антитела против CD11a и против CD18; антитела против L3T4; гетерологичный антилимфоцитарный глобулин; антитела против всех типов Т-клеток; растворимый пептид, содержащий домен связывания LFA-3; стрептокиназу; TGF-β; стрептодорназу; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин и рапамицин. В определенных вариантах осуществления средство представляет собой антигистаминное средство. "Антигистаминное средство", используемое в данном документе, представляет собой средство, которое оказывает антагонизирующий эффект в отношении физиологического эффекта гистамина. Примерами антигистаминных средств являются хлорфенирамин, дифенгидрамин, прометазин, кромолин натрия, астемизол, малеат азатадина, малеат брофенирамина, малеат карбиноксамина, гидрохлорид цетиризина, фумарат клемастина, гидрохлорид ципрогептадина, малеат дексбромфенирамина, малеат дексхлорфенирамина, дименгидринат, гидрохлорид дифенгидрамина, сукцинат доксиламина, гидрохлорид фексофендадина, гидрохлорид терфенадина, гидрохлорид гидроксизина, лоратидин, гидрохлорид меклизина, цитрат трипеланнамина, гидрохлорид трипеленнамина и гидрохлорид трипролидина.
[257] Иммуносупрессивные, противоаллергические или противовоспалительные средства могут быть включены в схему введения лентивирусного вектора. Например, введение иммуносупрессивных или противовоспалительных средств можно начинать до введения раскрытых лентивирусных векторов и после этого можно продолжать с одной или несколькими дозами. В определенных вариантах осуществления иммуносупрессивные или противовоспалительные средства вводят в качестве премедикации перед лентивирусными векторами.
[258] Как обсуждалось ранее, лентивирусные векторы по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения нарушений свертывания крови in vivo. В данном отношении следует понимать, что лентивирусные векторы по настоящему изобретению могут быть составлены для облегчения введения и обеспечения стабильности активного средства. Предпочтительно, фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. Разумеется, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить в виде одной или нескольких доз с получением фармацевтически эффективного количества полипептида.
[259] В дополнение к активному соединению жидкая лекарственная форма может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана.
[260] Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей также описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin. Некоторые примеры вспомогательных веществ включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерина моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция также может содержать рН-буферные реагенты и смачивающие или эмульгирующие средства.
[261] В некоторых вариантах осуществления композицию вводят способом, выбранным из группы, состоящей из местного введения, внутриглазного введения, интратекального введения и субдурального введения. Парентеральное введение может представлять собой внутривенное или подкожное введение.
[262] В некоторых вариантах осуществления композицию применяют для лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечением, у субъекта, нуждающегося в этом. Заболевание или состояние, связанные с кровотечением, выбраны из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения из полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, внутриротового кровотечения, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровотечения, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения в оболочке подвздошно-поясничной мышцы, и любых их комбинаций. В еще одних вариантах осуществления у субъекта запланировано проведение хирургического вмешательства. В еще одних вариантах осуществления лечение является профилактическим или проводится по необходимости.
[263] Для оценки функции системы свертывания крови доступен ряд тестов: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT), хромогенный анализ, анализ ROTEM®, тест на протромбиновое время (PT) (также используемый для определения INR), тестирование фибриногена (часто по методу Клаусса), подсчет тромбоцитов, тестирование функции тромбоцитов (часто с помощью PFA-100), TCT, время кровотечения, тест смешивания (исправляется ли отклонение, если плазма крови пациента смешана с нормальной плазмой крови), анализы фактора свертывания крови, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Лейден, протромбиновая мутация G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT), тесты различных функций тромбоцитов, тромбоэластография (TEG или Sonoclot), тромбоэластометрия (TEM®, например, ROTEM®) или время лизиса эуглобулина (ELT).
[264] Тест aPTT является показателем функционирования, измеряющим эффективность как "внутреннего" (также называемого контактным с помощью активации), так и общего путей коагуляции. Этот тест обычно используется для измерения свертывающей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания, например, FVIII или FIX. Он используется вместе с протромбиновым временем (PT), которое измеряет внешний путь активации свертывания крови.
[265] Анализ ROTEM® предоставляет информацию о всей кинетике гемостаза: времени свертывания, образовании сгустка, стабильности и лизисе сгустка. Различные параметры тромбоэластометрии зависят от активности плазматической системы свертывания крови, функции тромбоцитов, фибринолиза или многих факторов, влияющих на эти взаимодействия. Этот анализ может дать полное представление о вторичном гемостазе.
IV. Молекулы нуклеиновой кислоты
[266] В настоящем изобретении также представлены выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, обладающий активностью FIX. В определенных вариантах осуществления выделенная молекула кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1.
[267] В некоторых вариантах осуществления выделенная молекула кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность идентична нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
[268] В определенных вариантах осуществления выделенная молекула кислоты дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под (i) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 1-84 из SEQ ID NO: 7.
[269] В определенных вариантах осуществления выделенная молекула кислоты дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, характеризуется по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с: (i) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, содержит нуклеотидную последовательность, изложенную под (i) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 2; (ii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 4; (iv) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 5; (v) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 6 или (vi) нуклеотидами 85-138 из SEQ ID NO: 7.
[270] В настоящем изобретении также предусмотрены векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор, например, любой лентивирусный вектор, раскрытый в данном документе. В определенных вариантах осуществления вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
[271] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 91% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 92% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 93% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 94% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит нуклеотидную последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 1.
[272] В некоторых вариантах осуществления вектор дополнительно содержит один или несколько описанных в данном документе регуляторных элементов. В определенных вариантах осуществление вектор содержит тканеспецифический промотор. В определенных вариантах осуществления тканеспецифический промотор избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени. В определенных вариантах осуществления тканеспецифический промотор, который избирательно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в целевой клетке печени, предусматривает промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления целевая клетка печени представляет собой гепатоцит.
V. Тканеспецифическая экспрессия
[273] В некоторых вариантах осуществления будет полезно включить в лентивирусный вектор одну или несколько целевых последовательностей miRNA, которые, например, функционально связаны с оптимизированным трансгеном FIX. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена по меньшей мере одна целевая последовательность miRNA, функционально связанная с оптимизированной нуклеотидной последовательностью FIX или иным образом вставленная в лентивирусный вектор. Более чем одна копия целевой последовательности miRNA, включенная в лентивирусный вектор, может повысить эффективность системы.
[274] Также включены различные целевые последовательности miRNA. Например, в лентивирусных векторах, которые экспрессируют более чем один трансген, трансген может находиться под контролем более чем одной целевой последовательности miRNA, которые могут быть одинаковыми или разными. Целевые последовательности miRNA могут быть расположены в тандеме, но также включены другие схемы расположения. Трансгенная кассета экспрессии, содержащая целевые последовательности miRNA, также может быть вставлена в вектор в антисмысловой ориентации. Антисмысловая ориентация может быть применима в получении вирусных частиц во избежание экспрессии продуктов генов, которые в противном случае могут быть токсичными для клеток-продуцентов.
[275] В других вариантах осуществления лентивирусный вектор содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 копий одной и той же или разных целевых последовательностей miRNA. Однако в некоторых других вариантах осуществления лентивирусный вектор не будет включать какую-либо целевую последовательность miRNA. Выбор того, включать ли целевую последовательность miRNA (и сколько), будет определяться такими известными параметрами, как предполагаемая целевая ткань, требуемый уровень экспрессии и т. д.
[276] В одном варианте осуществления целевая последовательность представляет собой целевую miR-223, которая, как сообщается, наиболее эффективно блокирует экспрессию в коммитированных предшественниках миелоида и по меньшей мере частично в более примитивных HSPC. Целевая miR-223 может блокировать экспрессию в дифференцированных миелоидных клетках, включая гранулоциты, моноциты, макрофаги, миелоидные дендритные клетки. Целевая miR-223 также может быть подходящей для применения в генной терапии, основанной на устойчивой экспрессии трансгена в лимфоидном или эритроидном клонах. Целевая miR-223 также может очень эффективно блокировать экспрессию в HSC человека.
[277] В другом варианте осуществления целевая последовательность представляет собой мишень для miR142 (например, tccataaagt aggaaacact aca (SEQ ID NO: 27)). В одном варианте осуществления лентивирусный вектор содержит 4 копии целевых последовательностей для miR-142. В определенных вариантах осуществления комплементарная последовательность гемопоэтических специфических микроРНК, такая как miR-142 (142T), включена в 3'-нетранслируемую область лентивирусного вектора, что делает транскрипт, кодирующий трансген, чувствительным к miRNA-опосредованной понижающей регуляции. С помощью данного способа можно предотвратить экспрессию трансгена в антигенпрезентирующих клетках (АРС) гемопоэтической линии дифференцировки с поддержанием при этом ее в клетках, отличных от гемопоэтических (Brown et al., Nat Med 2006). Эта стратегия может наложить строгий посттранскрипционный контроль на экспрессию трансгена и, таким образом, обеспечивает стабильную доставку и долгосрочную экспрессию трансгенов. В некоторых вариантах осуществления посредством регуляции с помощью miR-142 предотвращается иммуноопосредованное выведение трансдуцированных клеток и/или индуцируется образование антигенспецифических регуляторных T-клеток (Treg) и опосредуется устойчивая иммунологическая толерантность к антигену, кодируемому трансгеном.
[278] В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность представляет собой целевую miR181. В Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165 раскрыты miR-181, miRNA, специфично экспрессирующиеся в В-клетках костного мозга мышей (Chen and Lodish, 2005). Также раскрыто, что некоторые miRNA человека связаны с формами лейкоза.
[279] Целевая последовательность может быть полностью или частично комплементарной miRNA. Термин "полностью комплементарная" означает, что целевая последовательность имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая на 100% комплементарна последовательности miRNA, которая ее распознает. Термин "частично комплементарная" означает, что целевая последовательность является лишь частично комплементарной последовательности miRNA, которая ее распознает, при этом частично комплементарная последовательность по-прежнему распознается miRNA. Другими словами, частично комплементарная целевая последовательность в контексте настоящего изобретения эффективно распознается соответствующей miRNA и предотвращает или снижает экспрессию трансгена в клетках, экспрессирующих эту miRNA. Примеры целевых последовательностей miRNA описаны в WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413 или WO2010/125471, которые включены в данный документ в их полных объемах посредством ссылки.
VI. Клетки-хозяева и способы создания
[280] В настоящем изобретении также представлена клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или лентивирусный вектор по настоящему изобретению. Некоторые аспекты настоящего изобретения направлены на создание или получение лентивирусных векторов, предусматривающие трансфекцию и/или трансформацию клетки-хозяина лентивирусным вектором, раскрытым в данном документе. Используемый в данном документе термин "трансформация" следует употреблять в широком смысле для обозначения введения ДНК в реципиентную клетку-хозяина, которое изменяет генотип и вследствие этого приводит к изменению в реципиентной клетке.
[281] "Клетки-хозяева" относятся к клеткам, трансформированным лентивирусным вектором, раскрытым в данном документе. Клетки-хозяева по настоящему изобретению предпочтительно происходят из млекопитающих; наиболее предпочтительно происходят из человека или мыши. Специалистам в данной области ставится в заслугу способность преимущественно определять конкретные линии клеток-хозяев, которые лучше всего подходят для их цели. Иллюстративные линии клеток-хозяев включают без ограничения CHO, DG44 и DUXB11 (линии клеток яичников китайского хомячка, DHFR-минус), HELA (клетки карциномы шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьяны), COS (производное CVI с T-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомячка), BALBC/3T3 (фибробласты мыши), HAK (линия клеток почки хомячка), SP2/O (миеломы мыши), P3.times.63-Ag3.653 (миеломы мыши), BFA-1c1BPT (эндотелиальные клетки крупного рогатого скота), RAJI (лимфоцит человека), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 и HEK 293 (почки человека). В одном конкретном варианте осуществления клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из: клетки CHO, клетки HEK293 (например, клетки HEK293T), клетки BHK21, клетки PER.C6®, клетки NS0, клетки CAP и любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева по настоящему изобретению происходят из насекомых. В одном конкретном варианте осуществления клетки-хозяева представляют собой клетки SF9. Линии клеток-хозяев обычно доступны из коммерческих служб, Американской коллекции тканевых культур или из опубликованной литературы.
[282] Введение молекул нуклеиновой кислоты или векторов по настоящему изобретению в клетку-хозяина можно осуществлять посредством различных методик, хорошо известных специалистам в данной области. Они включают без ограничения трансфекцию (в том числе электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, осаждение с фосфатом кальция, слияние клеток с ДНК в оболочке, микроинъекцию и инфицирование интактным вирусом. См., Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Более предпочтительно, введение плазмиды в хозяина осуществляют посредством электропорации. Трансформированные клетки выращивают в условиях, подходящих для продуцирования легких цепей и тяжелых цепей, и анализируют в отношении синтеза белков тяжелой и/или легкой цепей. Иллюстративные аналитические методики включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или анализ на клеточном сортере с активацией флуоресценции (FACS), иммуногистохимический анализ и т.п.
[283] Клетки-хозяева, содержащие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты или лентивирусные векторы по настоящему описанию, выращивают в подходящей среде для выращивания. Используемый в данном документе термин "подходящая среда для выращивания" означает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для выращивания клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. Среда необязательно может содержать один или несколько факторов для отбора. Среда необязательно может содержать сыворотку крови новорожденных телят или фетальную телячью сыворотку крови (FCS). В одном варианте осуществления среда по существу не содержит IgG. В ростовой среде, как правило, будет происходить отбор клеток, содержащих ДНК-конструкцию, например, с помощью отбора по чувствительности к лекарственному средству или дефициту незаменимого питательного вещества, что дополняется наличием селектируемого маркера в ДНК-конструкции или трансфицируемого совместно с ДНК-конструкцией. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступных средах, содержащих сыворотку крови, или бессывороточных средах (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном варианте осуществления среда представляет собой CD OptiCHO (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). В другом варианте осуществления среда представляет собой CD17 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Отбор среды, подходящей для конкретной используемой линии клеток, находится в пределах уровня знаний специалистов среднего уровня квалификации в данной области.
[284] В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяин дополнительно модифицируют, как описано в данном документе. Например, клетка-хозяин может быть модифицирована для сверхэкспрессии CD47, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин модифицирована таким образом, чтобы в ней отсутствовал экспонированный на поверхности MHC-I. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин модифицирована так, чтобы в ней был снижен уровень экспонированного на поверхности MHC-I по сравнению с немодифицированной клеткой-хозяином. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку HEK 293T CD47high/MHC-Ilow.
[285] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам получения лентивирусного вектора, предусматривающим культивирование описанной в данном документе клетки-хозяина в подходящих условиях и выделение лентивирусного вектора. В некоторых аспектах настоящее изобретение направлено на способы получения лентивирусного вектора, раскрытого в данном документе, предусматривающие культивирование описанной в данном документе клетки-хозяина в подходящих условиях и выделение лентивирусного вектора.
[286] Все из различных аспектов, вариантов осуществления и возможностей выбора, описанных в данном документе, можно комбинировать во всех без исключения вариантах.
[287] Все публикации, патенты и заявки на патенты, упоминаемые в настоящем описании, включены в данный документ посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была конкретно и отдельно указана как включенная посредством ссылки.
[288] При наличии описания настоящего изобретения в общих чертах может быть достигнуто дополнительное понимание, если обратиться к представленным в данном документе примерам. Эти примеры служат лишь для иллюстративных целей и не предполагаются как ограничивающие.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. LV-coFIX-1-R338L опосредует долгосрочную экспрессию FIX и зависимость доза-ответ у взрослых мышей HemB
[289] Кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант FIX человека, имеющий замену R338L ("Padua") (coFIX-1-R338L; SEQ ID NO: 1) клонировали в лентивирусный вектор с созданием LV-coFIX-1-R338L (ФИГ. 1). Для определения профиля зависимости доза-ответ LV-FIX в животных моделях LV-coFIX-1-R338L, получаемый в клетках 293T, оценивали на взрослой мыше HemB. Мышам HemB в возрасте восьми недель вводили LV-coFIX-1-R338L с помощью инъекции в хвостовую вену в дозе 3E9, 7,5E9, 2E10 или 6E10 ТЕ/кг (n=2-10 животных/уровень дозы). Опосредованная LV-FIX активность FIX в плазме крови и уровень антигена контролировали с помощью хромогенного анализа FIX и анализа ELISA. Устойчивый уровень FIX в плазме крови каждого животного показан на ФИГ. 2A, а кривая зависимости доза-ответ LV-coFIX-1-R338L показана на ФИГ. 2В. В мышиной модели HemB LV-coFIX-1-R338L продемонстрировал профиль зависимости доза-ответ Log-Log, и уровень дозы LV-coFIX-1-R338L, необходимый для достижения 10-200% нормальной циркулирующей активности FIX, был определен как составляющий от 5E9 до 2E10 ТЕ/кг у мышей HemB.
[290] Профиль долгосрочной экспрессии FIX у животных, получавших LV-coFIX-1-R338L, в группах с 3 более высокими дозами отслеживали в течение 6 месяцев после лечения с помощью LV. Наносили на график уровни активности циркулирующего FIX (ФИГ. 3A) и антигена (ФИГ. 3B). Постоянный уровень LV-опосредованной экспрессии FIX наблюдался у всех экспериментальных животных, потеря экспрессии FIX не была выявлена в течение всего периода исследования, что продемонстрировало долгосрочную стабильность лечения интеграционной генной терапией. Кроме того, наблюдали более низкий процент нормального уровня антигена FIX (ФИГ. 3A) по сравнению с процентом активности FIX (ФИГ. 3B), что отражает использование мутации усиления функции R338L в трансгене FIX.
Пример 2. LV-coFIX-1-R338L имел аналогичную эффективность трансдукции у взрослых и новорожденных животных
[291] Лентивирусный вектор может интегрироваться в геном хозяина, чтобы опосредовать долгоживущую экспрессию трансгена, поэтому в отличие от быстрой потери опосредованной AAV экспрессии трансгена после лечения новорожденных ожидалось, что опосредованная лентивирусами экспрессия трансгена будет поддерживать постоянный профиль экспрессии трансгена не только у взрослых животных, но также и у новорожденных животных, получавших лечение с помощью LV-FIX. Для оценки эффективности трансдукции и профиля экспрессии трансгена лентивируса FIX после лечения новорожденных, двухдневные детеныши HemB получали лечение с помощью LV-coFIX-1-R338L посредством инъекции в височную вену при 7,5E9, 2E10 и 6E10 ТЕ/кг. По сравнению с лечением на стадии взрослого (вводимым через 8 недель), системное лечение LV-coFIX-1-R338L опосредовало стойкий аналогичный уровень экспрессии FIX на протяжении периода исследования продолжительностью шесть месяцев при каждом уровне дозы, что позволяло предположить, что введение лентивируса FIX могло обеспечивать эффективное лечение как взрослых, так и педиатрических пациентов. Также оценивали лечение мышей-подростков (вводимое через две недели) с помощью LV-coFIX-1-R338L посредством инъекции в височную вену в дозах 3E9, 7,5E9 или 2E10 ТЕ/кг. Уровни экспрессии FIX при каждом уровне дозы были выше, чем сопоставимые дозы у мышей, которым вводили лечение через 8 недель или два дня (n=6 животных/уровень дозы/возраст; ФИГ. 4A).
Активность FIX измеряли для определения зависимости доза-ответ LV-coFIX-1-R338L у мышей HemB, которым вводили посредством инъекции в височную вену через 8 недель и два дня в дозах 7,5E9, 2E10 и 6E10 ТЕ/кг и через две недели в дозах 3E9, 7,5E9 или 2E10 ТЕ/кг. В соответствии с данными в перспективе на ФИГ. 4A, мыши, которым вводили лечение через две недели (мыши-подростки), проявляли более высокую активность FIX по сравнению с мышами, которым вводили лечение через два дня или восемь недель (ФИГ. 4B).
Пример 3. Оценка CD47high LV-coFIX-1-R338L на приматах, отличных от человека
[292] Для модуляции иммунных свойств лентивирусных векторов была создана линия клеток HEK293T, сверхэкспрессирующая CD47 человека. Лентивирусные векторные частицы с высоким поверхностным уровнем CD47 человека продемонстрировали более низкое поглощение клетками Купфера и более высокую трансдукцию гепатоцитов у мышей NOD (мыши NOD могут распознавать CD47 человека). Кроме того, меньшее количество частиц лентивирусного вектора, характеризующихся высокой поверхностной экспрессией CD47 человека, поглощалось макрофагами по сравнению с контрольными лентивирусными векторами, не сверхэкспрессирующими CD47 (ФИГ. 5).
[293] Чтобы дополнительно оценить эффект высокого поверхностного уровня CD47 человека в отношении трансдукции в печени in vivo, CD47high LV-coFIX-1-R338L сравнивали с LV-coFIX-1-R338L у приматов, отличных от человека, (NHP) после внутривенного введения в дозе 7,5E9 ТЕ/кг, n=3/группа лечения. Чтобы избежать рестрикции лентивирусного вектора у NHP после лечения, использовали обезьян Macaca nemestrina.
[294] Уровень циркулирующего FIX человека после лечения посредством лентивирусного вектора измеряли с помощью специфической активности (ФИГ. 6A) и анализа антигена к FIX человека (ФИГ. 6B). CD47high LV-coFIX-1-R338L обеспечивало в три раза более высокую экспрессию FIX человека после лечения посредством лентивирусного вектора по сравнению с LV-coFIX-1-R338L, на 200-300% и 50-150% от нормального уровня активности FIX соответственно (ФИГ. 6А). Использование CD47high LV-coFIX-1-R338L может потенциально уменьшить LV-FIX и снижать острую токсичность, ассоциированную с лечением посредством лентивирусного вектора.
[295] Помимо уровней экспрессии FIX человека, гемостаз подвергшихся лечению животных также контролировали с помощью анализа APTT (ФИГ. 6C). В то время как время APTT у животных, обработанных носителем, оставалось в том же диапазоне, значительно сокращенное время APTT наблюдалось для всех животных, подвергавшихся лечению посредством LV-FIX (ФИГ. 6С), что указывало на то, что белок FIX человека, полученный в результате лечения лентивирусным вектором, являлся функционально активным.
Пример 4. Зависимость доза-ответ CD47high LV-coFIX-1-R338L у приматов, отличных от человека
[296] Для определения профиля зависимости доза-ответ CD47high LV-coFIX-1-R338L у NHP были протестированы две более низкие дозы CD47high LV-coFIX-1-R338L, составляющие 1,5E9 и 3E9 ТЕ/кг (n=3/уровень дозы). Опосредованную лентивирусным вектором экспрессию FIX человека контролировали с помощью анализа специфической активности (ФИГ. 7A) и уровня антигена устойчиво циркулирующего FIX человека (ФИГ. 7B).
[297] В соответствии с результатами, наблюдаемыми у мышей HemB, кривая зависимости доза-ответ log/log наблюдалась также для LV-coFIX-1-R338L у NHP. Диапазон доз CD47high LV-coFIX-1-R338L, необходимый для достижения 10-100% нормального уровня циркулирующего FIX, составлял 3,5-6E9 ТЕ/кг, что ниже, чем у мышей HemB. Сдвиг диапазона терапевтических доз происходит из-за того, что уровень экспрессии FIX человека у NHP в 5-10 раз выше по сравнению с мышами HemB при том же уровне дозы, что может быть связано с разными видами животных и распознаванием CD47 человека (CD47 человека не распознается у мышей HemB).
[298] Животные, которым вводили LV-coFIX-1-R338L, проявляли очень слабые острые иммунные ответы, на что указывали уровни ALT (ФИГ. 8A), уровни AST (ФИГ. 8B), уровни лимфо (ФИГ. 8C) и температура тела (ФИГ. 8D) после введения. Снижение цитокинового ответа наблюдалось после введения CD47high LV-coFIX-1-R338L по сравнению с контрольным вектором LV (ФИГ. 9A-9C). В то время как небольшое увеличение MIP-1a, MIP-1b и MCP-1 наблюдалось после введения контрольного LV, MIP-1a, MIP-1b и MCP-1, экспрессия была ниже и в некоторых случаях не определялась после введения CD47high LV-coFIX-1-R338L. Как и ожидалось, LV-coFIX-1-R338L локализовался главным образом в печени и селезенке, имея число копий вектора (VCN) в печени и селезенке, которое было более чем в 100 раз больше, чем в других органах (ФИГ. 10). Эти данные дают возможность предположить, что CD47high LV-coFIX-1-R338L индуцирует пониженный аллоспецифический иммунный ответ с повышенной устойчивостью к фагоцитозу и улучшенным переносом генов в гепатоцитах.
Пример 5. Дополнительное исследование зависимости доза-ответ CD47high LV-coFIX-1-R338L у приматов, отличных от человека
[299] Дополнительных Macaca nemestrina подвергали лечению посредством CD47high LV-coFIX-1-R338L в дозе 2,5E9 ТЕ/кг с помощью внутривенного введения. Опосредованную лентивирусным вектором экспрессию FIX человека контролировали с помощью анализа специфической активности (ФИГ. 11A) и уровня антигена устойчиво циркулирующего FIX человека (ФИГ. 11B). После лечения посредством LV активность стабильно циркулирующего FIX человека составляла приблизительно 33% от нормы, а количество циркулирующего антигена FIX человека составляло 700 нг/мл, что коррелировало с 14% нормального уровня антигена FIX.
***
[300] Предыдущее описание конкретных вариантов осуществления настолько полно раскрывает общий характер настоящего изобретения, что другие могут, с использованием знаний в пределах квалификации в данной области, легко модифицировать и/или адаптировать такие конкретные варианты осуществления для различных вариантов применения без проведения дополнительных экспериментов, не отступая от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации предназначены для того, чтобы находиться в пределах значения и диапазона эквивалентов раскрытых вариантов осуществления, основанных на идее и принципе, представленных в данном документе. Следует понимать, что фразеология или терминология в данном документе предназначена для описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология настоящего описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете учений и руководящих указаний.
[301] Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области при рассмотрении описания и практическом применении настоящего изобретения, раскрытого в данном документе. Предполагается, что описание и примеры должны рассматриваться только в качестве иллюстративных, а действительные объем и сущность настоящего изобретения указаны в нижеследующей формуле изобретения.
[302] Все патенты и публикации, цитируемые в данном документе, включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC.
<120> ЛЕНТИВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, ЭКСПРЕССРУЮЩИЕ ФАКТОР IX
<130> SA9-468PC
<150> US 62/776,393
<151> 2018-12-06
<160> 27
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 1248
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-1-R338L
<400> 1
tacaatagtg ggaagctgga ggaatttgtg cagggcaacc tggagagaga atgcatggag 60
gaaaagtgta gcttcgagga agcccgcgag gtgtttgaaa atacagagcg aaccacagag 120
ttctggaagc agtatgtgga cggcgatcag tgcgagagca acccctgtct gaatggcgga 180
agttgcaaag acgatatcaa ctcatacgaa tgctggtgtc ctttcgggtt tgaaggcaaa 240
aattgcgagc tggacgtgac atgtaacatt aagaatggac ggtgcgagca gttttgtaaa 300
aactctgccg ataataaggt ggtgtgcagc tgtactgaag gatatcgcct ggctgagaac 360
cagaagtcct gcgaaccagc agtgcccttc ccttgtggga gggtgagcgt ctcccagact 420
tcaaaactga ccagagcaga gacagtgttt cccgacgtgg attacgtcaa cagcactgag 480
gccgaaacca tcctggacaa cattactcag tctacccaga gtttcaatga ctttactcgg 540
gtggtcgggg gcgaggatgc taaaccaggc cagttcccct ggcaggtggt cctgaacgga 600
aaggtggatg cattttgcgg agggtctatc gtgaatgaga aatggattgt caccgccgct 660
cactgcgtgg aaaccggagt caagatcaca gtggtcgctg gggagcacaa cattgaggaa 720
acagaacata ctgagcagaa gcggaatgtg atccgcatca ttcctcacca taactacaat 780
gcagccatca acaaatacaa tcatgacatt gccctgctgg aactggatga gcctctggtg 840
ctgaacagct acgtcactcc aatctgcatt gctgacaaag agtataccaa tatcttcctg 900
aagtttggat cagggtacgt gagcggctgg ggaagagtct tccacaaggg caggagcgcc 960
ctggtgctcc agtatctgcg agtgcctctg gtcgatcgag ctacctgtct gctctctacc 1020
aagtttacaa tctacaacaa catgttctgc gctgggtttc acgagggagg acgagactcc 1080
tgtcagggcg attctggggg cccacatgtg acagaggtcg aaggcaccag cttcctgact 1140
ggcatcattt cctggggaga ggaatgtgca atgaagggaa aatacgggat ctacaccaaa 1200
gtgagccgct atgtgaactg gatcaaggaa aaaaccaaac tgacctaa 1248
<210> 2
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-1b-R338L
<400> 2
atgcagagag tcaacatgat tatggctgag tcacctgggc tgattactat ttgcctgctg 60
ggctacctgc tgtccgccga gtgtaccgtg ttcctggacc atgagaacgc aaataagatc 120
ctgaacaggc ccaaaagata caatagtggg aagctggagg aatttgtgca gggcaacctg 180
gagagagaat gcatggagga aaagtgtagc ttcgaggaag cccgcgaggt gtttgaaaat 240
acagagcgaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300
ccctgtctga atggcggaag ttgcaaagac gatatcaact catacgaatg ctggtgtcct 360
ttcgggtttg aaggcaaaaa ttgcgagctg gacgtgacat gtaacattaa gaatggacgg 420
tgcgagcagt tttgtaaaaa ctctgccgat aataaggtgg tgtgcagctg tactgaagga 480
tatcgcctgg ctgagaacca gaagtcctgc gaaccagcag tgcccttccc ttgtgggagg 540
gtgagcgtct cccagacttc aaaactgacc agagcagaga cagtgtttcc cgacgtggat 600
tacgtcaaca gcactgaggc cgaaaccatc ctggacaaca ttactcagtc tacccagagt 660
ttcaatgact ttactcgggt ggtcgggggc gaggatgcta aaccaggcca gttcccctgg 720
caggtggtcc tgaacggaaa ggtggatgca ttttgcggag ggtctatcgt gaatgagaaa 780
tggattgtca ccgccgctca ctgcgtggaa accggagtca agatcacagt ggtcgctggg 840
gagcacaaca ttgaggaaac agaacatact gagcagaagc ggaatgtgat ccgcatcatt 900
cctcaccata actacaatgc agccatcaac aaatacaatc atgacattgc cctgctggaa 960
ctggatgagc ctctggtgct gaacagctac gtcactccaa tctgcattgc tgacaaagag 1020
tataccaata tcttcctgaa gtttggatca gggtacgtga gcggctgggg aagagtcttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctccag tatctgcgag tgcctctggt cgatcgagct 1140
acctgtctgc tgtctaccaa gtttacaatc tacaacaaca tgttctgcgc tgggtttcac 1200
gagggaggac gagactcctg tcagggcgat tctgggggcc cacatgtgac agaggtcgaa 1260
ggcaccagct tcctgactgg catcatttcc tggggagagg aatgtgcaat gaagggaaaa 1320
tacgggatct acaccaaagt gagccgctat gtgaactgga tcaaggaaaa aaccaaactg 1380
acctaa 1386
<210> 3
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-2-R338L
<400> 3
atgcagaggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60
ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacaggc ccaagaggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180
gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gttcgagaac 240
accgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300
ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480
tacaggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540
gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660
ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720
caggtcgtgc tgaatggcaa agtcgatgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780
tggattgtga ctgccgccca ttgcgtggaa accggggtga agatcactgt ggtggctggg 840
gagcacaaca tcgaggaaac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggattatc 900
ccccatcaca actacaatgc cgccatcaat aagtacaacc atgatattgc cctgctggag 960
ctggatgaac ccctggtcct gaacagctat gtgactccca tctgcattgc cgacaaggag 1020
tataccaaca tcttcctgaa atttggcagc ggctatgtct ctggctgggg cagggtgttc 1080
cataagggga ggagcgccct ggtcctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagggcc 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaata tgttttgcgc tggcttccat 1200
gaggggggca gggacagctg ccagggggac agcgggggcc cccatgtgac tgaggtggag 1260
ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggggagg agtgcgccat gaaggggaag 1320
tatggcatct acaccaaagt ctccagatac gtcaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 4
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-3-R338L
<400> 4
atgcagaggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60
ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacaggc ccaagaggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180
gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gttcgagaac 240
accgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300
ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480
tacaggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540
gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660
ttcaacgact tcaccagggt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gtttccctgg 720
caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780
tggatcgtga ccgctgccca ttgcgtggaa accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840
gagcacaaca tcgaagagac cgagcacacc gaacagaaaa ggaacgtgat caggatcatc 900
cctcaccata actacaatgc cgccattaac aagtacaatc acgacatcgc tctgctggaa 960
ctggatgaac ccctggtgct gaacagctac gtgaccccta tctgcatcgc cgacaaggag 1020
tatactaaca tctttctgaa gtttggcagc ggctatgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080
cacaaaggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggatagggct 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc cggcttccac 1200
gaaggcggca gggactcttg ccagggcgac agcggcggcc cccatgtgac cgaggtggaa 1260
ggcactagct ttctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320
tacggcatct acactaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaagaaaa gaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 5
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-4-R338L
<400> 5
atgcagaggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60
ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacaggc ccaagaggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180
gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gttcgagaac 240
accgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300
ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420
tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480
tacaggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540
gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600
tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660
ttcaacgact tcaccagggt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720
caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780
tggatcgtga ccgccgccca ctgcgtggag accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840
gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggatcatc 900
ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960
ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020
tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260
ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320
tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 6
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-5-R338L
<400> 6
atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tctcctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60
ggctatctgc tgtccgctga gtgcactgtc ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacaggc ccaagaggta taactctggc aagctggagg agtttgtgca ggggaacctg 180
gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240
actgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tatgtggacg gggaccagtg cgagtctaac 300
ccttgcctga acgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgccct 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420
tgcgagcagt tctgcaagaa ctctgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg cactgagggc 480
tataggctgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgcggcaga 540
gtgtctgtga gccagaccag caagctgacc agagctgaga ctgtcttccc cgacgtggac 600
tatgtgaaca gcaccgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagtc tacccagtct 660
ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcctggcca gttcccctgg 720
caggtcgtgc tgaacggcaa agtggacgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780
tggatcgtga ctgctgctca ctgcgtggaa accggggtga agatcaccgt ggtggccggc 840
gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggatcatc 900
ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960
ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020
tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260
ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320
tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 7
<211> 1386
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-6-R338L
<400> 7
atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tctcctggcc tgatcactat ctgcctgctg 60
ggctacctgc tgagcgccga gtgcactgtc ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120
ctgaacaggc ccaagagata caactctggc aagctggagg agtttgtgca ggggaacctg 180
gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240
actgagagga ccactgagtt ctggaagcag tatgtggacg gggaccagtg cgagtctaac 300
ccttgcctga acgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctacgagtg ctggtgccct 360
ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gatgtgactt gcaacatcaa gaacggcagg 420
tgcgagcagt tctgcaagaa ctctgccgac aacaaagtcg tgtgcagctg cactgagggc 480
tacagactgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgcggcaga 540
gtgtctgtga gccagaccag caagctgacc agagccgaaa ccgtgttccc cgacgtggac 600
tatgtgaaca gcactgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcactcagtc tacccagtct 660
ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcctggcca gttcccctgg 720
caggtcgtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780
tggatcgtga ctgccgccca ctgcgtggag actggggtga agatcactgt ggtggctggg 840
gagcacaaca tcgaggaaac cgagcacact gagcagaaga ggaacgtgat caggattatc 900
ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960
ctggatgaac ccctggtgct gaacagctac gtgaccccta tctgcatcgc cgacaaggag 1020
tacactaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140
acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200
gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260
ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320
tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380
acctaa 1386
<210> 8
<211> 1389
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нуклеотидная последовательность фактора IX
<400> 8
atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60
ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120
ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaatcta 180
gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240
actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300
ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360
tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420
tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480
tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540
gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600
tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660
tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720
caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780
tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840
gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900
cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960
ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020
tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080
cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140
acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200
gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260
gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320
tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380
acttgataa 1389
<210> 9
<211> 1389
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFIX-1
<400> 9
atgcagagag tcaacatgat tatggctgag tcacctgggc tgattactat ttgcctgctg 60
ggctacctgc tgtccgccga gtgtaccgtg ttcctggacc atgagaacgc aaataagatc 120
ctgaacaggc ccaaaagata caatagtggg aagctggagg aatttgtgca gggcaacctg 180
gagagagaat gcatggagga aaagtgtagc ttcgaggaag cccgcgaggt gtttgaaaat 240
acagagcgaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300
ccctgtctga atggcggaag ttgcaaagac gatatcaact catacgaatg ctggtgtcct 360
ttcgggtttg aaggcaaaaa ttgcgagctg gacgtgacat gtaacattaa gaatggacgg 420
tgcgagcagt tttgtaaaaa ctctgccgat aataaggtgg tgtgcagctg tactgaagga 480
tatcgcctgg ctgagaacca gaagtcctgc gaaccagcag tgcccttccc ttgtgggagg 540
gtgagcgtct cccagacttc aaaactgacc agagcagaga cagtgtttcc cgacgtggat 600
tacgtcaaca gcactgaggc cgaaaccatc ctggacaaca ttactcagtc tacccagagt 660
ttcaatgact ttactcgggt ggtcgggggc gaggatgcta aaccaggcca gttcccctgg 720
caggtggtcc tgaacggaaa ggtggatgca ttttgcggag ggtctatcgt gaatgagaaa 780
tggattgtca ccgccgctca ctgcgtggaa accggagtca agatcacagt ggtcgctggg 840
gagcacaaca ttgaggaaac agaacatact gagcagaagc ggaatgtgat ccgcatcatt 900
cctcaccata actacaatgc agccatcaac aaatacaatc atgacattgc cctgctggaa 960
ctggatgagc ctctggtgct gaacagctac gtcactccaa tctgcattgc tgacaaagag 1020
tataccaata tcttcctgaa gtttggatca gggtacgtga gcggctgggg aagagtcttc 1080
cacaagggca ggagcgccct ggtgctccag tatctgcgag tgcctctggt cgatcgagct 1140
acctgtctga ggtctaccaa gtttacaatc tacaacaaca tgttctgcgc tgggtttcac 1200
gagggaggac gagactcctg tcagggcgat tctgggggcc cacatgtgac agaggtcgaa 1260
ggcaccagct tcctgactgg catcatttcc tggggagagg aatgtgcaat gaagggaaaa 1320
tacgggatct acaccaaagt gagccgctat gtgaactgga tcaaggaaaa aaccaaactg 1380
acctaatga 1389
<210> 10
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сигнальная последовательность фактора IX
<400> 10
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys
20 25
<210> 11
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пропептид фактора IX
<400> 11
Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 12
<211> 415
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> FIX R338L
<400> 12
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<211> 323
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CD47
<400> 14
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 15
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> коровая последовательность альбумин-связывающего пептида
<400> 15
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 16
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный линкер
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный линкер
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид CTP
<400> 18
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 19
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЕПТИД CTP
<400> 19
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 20
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид PAS
<400> 20
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
20
<210> 21
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид PAS
<400> 21
Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser
20
<210> 22
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид на основе PAS
<400> 22
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
20
<210> 23
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид на основе PAS
<400> 23
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 24
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид на основе PAS
<400> 24
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala
20
<210> 25
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид на основе PAS
<400> 25
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
20
<210> 26
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид на основе PAS
<400> 26
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala
20
<210> 27
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целевой miR142
<400> 27
tccataaagt aggaaacact aca 23
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ФАКТОР VIII | 2019 |
|
RU2803163C2 |
| ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ ПАЦИЕНТОВ С АНЕМИЕЙ ФАНКОНИ | 2017 |
|
RU2801241C2 |
| ГЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЛУБОКИХ ИНТРОННЫХ МУТАЦИЙ | 2016 |
|
RU2759335C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ДЕГЕНЕРАЦИИ ЖЕЛТОГО ПЯТНА | 2015 |
|
RU2703145C2 |
| ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ, КОДИРУЮЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАРИАНТЫ FIX С ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ, ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ГЕМОФИЛИИ В | 2018 |
|
RU2773956C2 |
| АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ IX PADUA | 2017 |
|
RU2770006C2 |
| УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА СРЕДСТВ АДОПТИВНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ | 2015 |
|
RU2741899C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК | 2019 |
|
RU2809803C2 |
| ВАРИАНТ СРЕДСТВА ДЛЯ RNAi | 2018 |
|
RU2789647C2 |
| АНТИ-CD47 АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2693078C2 |
Изобретение относится к лечению гемофилии B. Способ профилактики или лечения гемофилии включает введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует полипептид с активностью фактора IX (FIX). Лентивирусный вектор упакован в клетки HEK293T, суперэкспрессирующие CD47, которые имеют более высокий уровень экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в немодифицированных клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™). Эффективная доза уменьшена относительно контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, как у лентивирусного вектора. Осуществление изобретения обеспечивает профилактику или лечение гемофилии В. 12 з.п. ф-лы, 23 ил., 5 пр.
1. Способ профилактики или лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 99% идентичную SEQ ID NO: 1, которая кодирует полипептид с активностью фактора IX (FIX), причем лентивирусный вектор упакован в клетки HEK293T, суперэкспрессирующие CD47, которые имеют более высокий уровень экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в немодифицированных клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™), и причем эффективная доза уменьшена относительно контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, как у лентивирусного вектора.
2. Способ по п.1, в котором:
лентивирусный вектор содержит по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2,0 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3,0 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4,0 раза, по меньшей мере в 4,5 раза, по меньшей мере в 5,0 раз, по меньшей мере в 5,5 раз, по меньшей мере в 6,0 раз, по меньшей мере в 6,5 раз, по меньшей мере в 7,0 раз, по меньшей мере в 7,5 раз, по меньшей мере в 8,0 раз, по меньшей мере в 8,5 раз, по меньшей мере в 9,0 раз, по меньшей мере в 9,5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 13 раз, по меньшей мере в 14 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 35 раз, по меньшей мере в 40 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в клетках HEK293T (ATCC® CRL-11268™); и/или
CD47 представляет собой CD47 человека, причем необязательно CD47 человека содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 14.
3. Способ по п.1, в котором:
эффективная доза составляет менее приблизительно 5×1010 трансдуцирующих единиц/кг (TU/кг), менее 4×1010 TU/кг, менее 3×1010 TU/кг, менее 2×1010 TU/кг, менее 1×1010 TU/кг, менее 9×109 TU/кг, менее 8×109 TU/кг, менее 7×109 TU/кг, менее 6×109 TU/кг, менее 5×109 TU/кг, менее 4×109 TU/кг, менее 3×109 TU/кг, менее 2×109 TU/кг менее 1×109 TU/кг, менее приблизительно 9×108 TU/кг или менее приблизительно 8×108 TU/кг;
субъект демонстрирует одно или несколько следующих свойств после введения:
(a) пониженную трансдукцию макрофагов посредством лентивирусного вектора относительно контрольного лентивирусного вектора;
(b) уменьшенный аллоспецифичный иммунный ответ на лентивирусный вектор относительно контрольного лентивирусного вектора, причем необязательно аллоспецифичный иммунный ответ включает высвобождение цитокина в ответ на лентивирусный вектор, причем цитокин выбирают из группы, состоящей из MIP-1a, MIP-1b, MCP-1 и любой их комбинации;
(c) активность FIX, составляющую по меньшей мере 30%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через 3 недели после введения;
(d) тканеспецифичную экспрессию лентивирусного вектора в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке; и
(e) любую комбинацию (a)-(d);
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MIP-1a после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MIP-1a после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MIP-1b после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MIP-1b после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MCP-1 после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MCP-1 после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует активность FIX, составляющую по меньшей мере 75%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 125%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 175%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 225%, по меньшей мере 250%, по меньшей мере 275% или по меньшей мере 300%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через три недели после введения лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует активность FIX, составляющую по меньшей мере приблизительно 150%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через три недели после введения лентивирусного вектора; и/или
субъект демонстрирует повышенную локализацию лентивирусного вектора в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта, причем необязательно:
повышенная локализация характеризуется количеством копий (VCN) лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 13 раз, по меньшей мере в 14 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 35 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 110 раз, по меньшей мере в 120 раз, по меньшей мере в 130 раз, по меньшей мере в 140 раз, по меньшей мере в 150 раз, по меньшей мере в 160 раз, по меньшей мере в 170 раз, по меньшей мере в 180 раз, по меньшей мере в 190 раз или по меньшей мере в 200 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта;
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 10 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта;
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 50 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта; и/или
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 100 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта.
4. Способ по п.3, в котором активность FIX в плазме у субъекта через 24-48 часов после введения эффективной дозы лентивирусного вектора повышена относительно активности FIX в плазме у субъекта, которому ввели ту же дозу контрольного лентивирусного вектора, причем необязательно активность FIX в плазме повышается после введения по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 13 раз, по меньшей мере в 14 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 35 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 110 раз, по меньшей мере в 120 раз, по меньшей мере в 130 раз, по меньшей мере в 140 раз, по меньшей мере в 150 раз, по меньшей мере в 160 раз, по меньшей мере в 170 раз, по меньшей мере в 180 раз, по меньшей мере в 190 раз или по меньшей мере в 200 раз относительно субъекта, которому ввели контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора.
5. Способ по п.1, в котором:
лентивирусный вектор не содержит полипептид MHC-I.
6. Способ по п.1, в котором:
доза составляет 5×1010 TU/кг, 4,5×1010 TU/кг, 4×1010 TU/кг, 3,5×1010 TU/кг, 3×1010 TU/кг, 2,5×1010 TU/кг, 2×1010 TU/кг, 1,5×1010 TU/кг, 1×1010 TU/кг, 9,5×109 TU/кг, 9×109 TU/кг, 8,5×109 TU/кг, 8×109 TU/кг, 7,5×109 TU/кг, 7×109 TU/кг, 6,5×109 TU/кг, 6×109 TU/кг, 5,5×109 TU/кг, 5×109 TU/кг, 4,5×109 TU/кг, 4×109 TU/кг, 3,5×109 TU/кг, 3×109 TU/кг, 2,5×109 TU/кг, 2×109 TU/кг, 1,5×109 TU/кг, 1×109 TU/кг, 9,5×108 TU/кг, 9×108 TU/кг, 8,5×108 TU/кг, 8×108 TU/кг, 7,5×108 TU/кг, 7×108 TU/кг, 6,5×108 TU/кг, 6×108 TU/кг, 5,5×108 TU/кг, 5×108 TU/кг, 4,5×108 TU/кг, 4×108 TU/кг, 3,5×108 TU/кг, 3×108 TU/кг, 2,5×108 TU/кг, 2×108 TU/кг, 1,5×108 TU/кг или 1×108 TU/кг;
доза составляет менее 5×1010 TU/кг, менее 4,5×1010 TU/кг, менее 4×1010 TU/кг, менее 3,5×1010 TU/кг, менее 3×1010 TU/кг, менее 2,5×1010 TU/кг, менее 2×1010 TU/кг, менее 1,5×1010 TU/кг, менее 1×1010 TU/кг, менее 9,5×109 TU/кг, менее 9×109 TU/кг, менее 8,5×109 TU/кг, менее 8×109 TU/кг, менее 7,5×109 TU/кг, менее 7×109 TU/кг, менее 6,5×109 TU/кг, менее 6×109 TU/кг, менее 5,5×109 TU/кг, менее 5×109 TU/кг, менее 4,5×109 TU/кг, менее 4×109 TU/кг, менее 3,5×109 TU/кг, менее 3×109 TU/кг, менее 2,5×109 TU/кг, менее 2×109 TU/кг, менее 1,5×109 TU/кг, менее 1×109 TU/кг, менее 9,5×108 TU/кг, менее 9×108 TU/кг, менее 8,5×108 TU/кг, менее 8×108 TU/кг, менее 7,5×108 TU/кг, менее 7×108 TU/кг, менее 6,5×108 TU/кг, менее 6×108 TU/кг, менее 5,5×108 TU/кг, менее 5×108 TU/кг, менее 4,5×108 TU/кг, менее 4×108 TU/кг, менее 3,5×108 TU/кг, менее 3×108 TU/кг, менее 2,5×108 TU/кг, менее 2×108 TU/кг, менее 1,5×108 TU/кг или менее 1×108 TU/кг;
доза составляет от 1×108 до 5×1010 TU/кг, от 1×108 до 5×109 TU/кг, от 1×108 до 1×109 TU/кг, от 1×108 до 1×1010 TU/кг, от 1×109 до 5×1010 TU/кг, от 2×109 до 5×1010 TU/кг, от 3×109 до 5×1010 TU/кг, от 4×109 до 5×1010 TU/кг, от 5×109 до 5×1010 TU/кг, от 1×109 до 6×109 TU/кг, от 2×109 до 6×109 TU/кг, от 3×109 до 6×109 TU/кг, от 4×109 до 6×109 TU/кг, от 5×109 до 6×109 TU/кг, от 6×109 до 5×1010 TU/кг, от 7×109 до 5×1010 TU/кг, от 8×109 до 5×1010 TU/кг, от 9×109 до 5×1010 TU/кг, от 1010 до 5×1010 TU/кг, от 1,5×1010 до 5×1010 TU/кг, от 2×1010 до 5×1010 TU/кг, от 2,5×1010 до 5×1010 TU/кг, от 3×1010 до 5×1010 TU/кг, от 3,5×1010 до 5×1010 TU/кг, от 4×1010 до 5×1010 TU/кг или от 4,5×1010 до 5×1010 TU/кг;
доза составляет от 1×109 до 5×1010 TU/кг, от 1×109 до 4,5×1010 TU/кг, от 1×109 до 4×1010 TU/кг, от 1×109 до 3,5×1010 TU/кг, от 1×109 до 3×1010 TU/кг, от 1×109 до 2,5×1010 TU/кг, от 1×109 до 2×1010 TU/кг, от 1×109 до 1,5×1010 TU/кг, от 1×109 до 1010 TU/кг, от 1×109 до 9×109 TU/кг, от 1×109 до 8×109 TU/кг, от 1×109 до 7×109 TU/кг, от 1×109 до 6×109 TU/кг, от 1×109 до 5×109 TU/кг, от 1×109 до 4×109 TU/кг, от 1×109 до 3×109 TU/кг, и от 1×109 до 2×109 TU/кг;
доза составляет от 1×1010 до 2×1010 TU/кг, от 1,1×1010 до 1,9×1010 TU/кг, от 1,2×1010 до 1,8×1010 TU/кг, от 1,3×1010 до 1,7×1010 TU/кг или от 1,4×1010 до 1,6×1010 TU/кг;
доза составляет от приблизительно 4×109 TU/кг до приблизительно 6×109 TU/кг;
причем дозу лентивирусного вектора вводят за один раз или делят по меньшей мере на две части дозы; и/или
дозу лентивирусного вектора повторяют по меньшей мере два раза.
7. Способ по п.1, в котором лентивирусный вектор вводят внутривенной инъекцией.
8. Способ по п.1, в котором:
лентивирусный вектор содержит тканеспецифичный промотор, причем необязательно тканеспецифичный промотор выборочно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в клетке-мишени печени, причем:
тканеспецифичный промотор содержит промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию, и/или
клеткой-мишенью печени является гепатоцит, причем необязательно выделенная молекула нуклеиновой кислоты стабильно встроена в геном гепатоцита;
сайт донора сплайсинга;
сайт акцептора сплайсинга;
последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, элемент, реагирующий на rev (RRE), или любую их комбинацию, причем необязательно последовательностью gag является полноразмерная или усеченная последовательность gag; и/или
лентивирусный вектор содержит энхансер, последовательность-мишень для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, интронную последовательность или любую их комбинацию; и/или
причем лентивирусный вектор продуцируют в клетке-хозяине, причем:
клетка-хозяин суперэкспрессирует CD47, или клетку-хозяина модифицируют для суперэкспрессии CD47;
клетка-хозяин не экспрессирует MHC-I;
клеткой-хозяином является CD47high/MHC-I-; и/или
клеткой-хозяином является клетка CD47high/MHC-I- HEK 293T.
9. Способ по п.1, в котором субъектом является субъект-ребенок.
10. Способ по п.1, в котором субъектом является взрослый субъект.
11. Способ по п.1, в котором субъектом является субъект-подросток.
12. Способ по п.1, в котором лентивирусный вектор дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид, причем:
гетерологичный полипептид представляет собой альбумин, Fc-область иммуноглобулина, XTEN, С-концевой пептид (СТР) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, полипептид полисиаловой кислоты (PAS), пептид полимера гомоаминокислоты (HAP), С-концевой пептид (СТР), трансферрин, связывающий альбумин фрагмент или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации этих полипептидов; и
гетерологичный полипептид связан с N-концом или С-концом полипептида с активностью FIX или вставлена в полипептид с активностью FIX.
13. Способ по п.1, в котором контрольный лентивирусный вектор содержит 19 молекул/мкм2 CD47 на поверхности контрольного лентивирусного вектора.
| CANTORE ALESSIO et al., "Liver-Directed Gene Therapy for Hemophilia B with Immune Stealth Lentiviral Vectors", Blood: Journal of the American society of hematology | |||
| Устройство для охлаждения водою паров жидкостей, кипящих выше воды, в применении к разделению смесей жидкостей при перегонке с дефлегматором | 1915 |
|
SU59A1 |
| American society of hematology, US,Vol | |||
| Реверсивный дисковый культиватор для тросовой тяги | 1923 |
|
SU130A1 |
| Suppl | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РУДНО-УГОЛЬНЫХ БРИКЕТОВ | 1922 |
|
SU605A1 |
| ALESSIO CANTORE et al., | |||
