СПОСОБ СКРИНИНГА НА РАК ЛЕГКИХ Российский патент 2024 года по МПК A61B6/00 A61B5/113 G01N33/48 G01N33/497 

Изобретение относится к медицине, а именно к торакальной онкологии, и может быть использовано для скрининга на рак легких.

Заболеваемость злокачественными новообразованиями в мире превышает 12 млн. человек, из них свыше 1300000 приходится на рак легкого (РЛ), что приводит к ежегодной гибели 183000 человек в Европе, 160000 в США и особо подчеркивает его медико-социальную значимость. В Российской Федерации рак легкого (РЛ) находится на втором месте в общей структуре онкологических заболеваний (11,6%) и на первом (20,4%) среди злокачественных опухолей у мужчин. Количество заболевших им ежегодно - свыше 50 тысяч человек, причем в итоге умирают от него 90-96% заболевших, свыше 50% уже в год постановки диагноза. Несмотря на развитие медицинских технологий 5-летняя выживаемость при РЛ во всех странах за последние полвека не меняется, не превышая 15-20%. При этом известно, что эффективность лечения находится в прямой зависимости от распространенности опухоли на момент начала реализации клинических мероприятий. Так, если для I стадии 5-летняя выживаемость может достигать 70-80%, то для IV не превышает 5%. Ранняя диагностика РЛ до настоящего времени остается так и не решенной проблемой, а более 2/3 заболевших начинают специализированное лечение, имея местнораспространенные, либо генерализованные опухолевые процессы (III-IV стадии): на I стадию приходится 10% больных, на II - 20%, на III - 30% и на IV - 40%. Проблема РЛ перестала быть только медицинской и приобрела социальный характер, что обусловлено как уровнем заболеваемости, так и неудовлетворительными отдаленными результатами лечения.

К основным методам диагностики РЛ относятся: 1) клинические; 2) лучевые; 3) эндоскопические методы; 4) хирургические; 5) лабораторные и функциональные.

Существует две основные клинико-анатомических формы опухолей легкого - центральный (70-75%) и периферический (25-30%) рак с тенденцией к увеличению доли последних. Обеим клинико-анатомическим формам РЛ свойственны различающиеся клинические и диагностические признаки, особенно на ранних стадиях, что определяет и спектр диагностических мероприятий. Если основным признаком раннего периферического РЛ является выявление бессимптомного опухолевого узла в паренхиме легкого, верификация которого чаще производится с использованием чрескожной трансторакальной трепан-биопсии, то ранний центральный рак нередко рентгено-негативен и обычно выявляется при фибробронхоскопии (ФБС), цитологическом исследовании мокроты, а в последние годы, с разной степенью успеха, при анализе выдыхаемого воздуха на специфические летучие органические соединения (ЛОС) [8].

Поскольку клинические проявления при РЛ, как правило, свидетельствует о значительной распространенности опухолевого процесса, осуществление диагностических мероприятий, направленных на раннюю диагностику возможно только в период бессимптомного развития опухоли, в первую очередь, на основании использования скрининга в группах риска.

Скрининг рака должен быть приемлемым для массового использования, недорогим, обладать высокой чувствительностью и специфичностью, высокой положительной и отрицательной предсказательной ценностью, а также быть безболезненным и безопасным для пациента, существенно не снижая качество жизни. Основными параметрами, определяющими эффективность различных методов скрининга рака легких (РЛ), являются высокие уровни специфичности и прогностической ценности положительного результата (ПЦПР), которые должны быть порядка 90-99%). Требования к чувствительности и прогностической ценности отрицательного результата (ПЦОР) менее жесткие - не менее 90% и 85%, соответственно.

Компьютерная рентгеновская томография (КТ) - метод неразрушающего послойного исследования, был предложен в 1972 году Г. Хаунсфилдом и А. Кормаком, удостоенными за эту разработку Нобелевской премии. Метод основан на измерении и сложной компьютерной обработке разности ослабления рентгеновского излучения различными по плотности тканями. В настоящее время рентгеновская компьютерная томография является основным томографическим методом исследования внутренних органов человека с использованием рентгеновского излучения. Рентгенологическая картина центрального РЛ зависит от формы роста, у 30-40% больных он выявляется на этапе гиповентиляции, у 50% -при резвившемся ателектазе. Основными рентгенологическими вариантами периферического рака легкого являются: 1) округлое образование с нерезкими, частично лучистыми контурами, с "вырезкой", негомогенной структуры, мультицентрическое; 2) округлое образование с неровными, бугристыми и нерезкими контурами; 3) округлое образование гомогенной структуры с ровными, умеренно нерезкими контурами; 4) негомогенное образование с лучистыми контурами. Диагностическими признаками злокачественной опухоли (категория Т) считается плотность, соответствующая индексу Хаунсвилда менее 165 ед., с учетом ее размеров, гомогенности, структуры, очертаний, четкости краев, а также изменений в окружающей паренхиме. Критерием метастатического поражения регионарных лимфоузлов (категория N) большинство исследователей считают диаметр короткой оси более 10 мм. Чувствительность КТ при диагностике первичной опухоли достигает 75-90%, при специфичности 40-60%). Чувствительность и специфичность КТ при оценке состояния внутригрудных лимфоузлов ниже - соответственно 44-59% и 65-70%.

При низкодозной КТ (НДКТ) протокол исследования изменен таким образом, что пациент получает дозу лучевой нагрузки ниже, чем при обычном исследовании - менее 1 мЗв (миллизиверт - 10^-3 Зв). Зиверт (Зв - Sievert- Sv -единица измерения эффективной и эквивалентной доз ионизирующего излучения в СИ; 1 Зв=1 Дж/кг=1 м²/с²). Например, для пациентов до 69 кг параметры настройки протокола НДКТ без итеративной реконструкции могут выглядеть так: коллимация 0,5×64; напряжение трубки (kV) -135; ток трубки (тА) - 15; DLP - 35.6; время ротации трубки - 0.5; эффективный ток трубки (effectivem As) - 6. [2]. Также технические параметры протокола НДКТ представлены на сайте Европейского общества торакальной визуализации (European Society of Thoracic Imaging). При сочетании итеративной реконструкции и фильтров пучка рентгеновского излучения возможно снижение эффективной дозы ультра-НДКТ до значений цифровой флюорографии - 0,06 мЗв. При расчете дозы лучевой нагрузки используется значение DLP (dose length product) и взвешивающий коэффициент - 0.017. Эффективной дозе менее 1 мЗв соответствуют значения DLP≤58 мГр × см.

Именно НДКТ явилась новым этапом в вопросе целесообразности проведения скрининга РЛ. В начале 21 века была проведена первая серия исследований по оценке его эффективности, в сравнении с оказавшейся менее эффективной рентгенографией грудной клетки. Перед запуском крупных рандомизированных НДКТ изучалась в когортных исследованиях: три японских исследования включили более 15000 человек, в результате выявлен 71 больной с РЛ, из них 63 (89%) пациента, имеющих I стадию. В ходе повторных исследований было выявлено еще 60 больных РЛ, из них 45 больных с I стадией опухолевого процесса [9].

Известно крупное исследование ELCAP (EarlyLungCancer Project; 1993-2005 гг.; n=31567) позволило выявить РЛ у 484 (1.53%) участников, причем у 412 (85%) на I стадии. На основании 40 месяцев наблюдения была смоделирована 10-летняя выживаемость, составившая 80% для всех больных и 88% - при I стадии РЛ [4].

Известно исследование эффективности НДКТ NLST (National Lung Screening Trial; 2011 г.; n=53454: группа скрининга n=26722 и контрольная n=26732) зафиксировало 309 смертей от РЛ в контрольной группе и 247 в группе НДКТ скрининга (на 20% ниже). Чувствительность НДКТ скрининга достигала 93,8%, при специфичности 73,4%. Существенного вреда здоровью участников, связанного с использованием НДКТ не отмечено [3].

В известном популяционном рандомизированном контролируемом исследовании NELSON (n=15792) было показано, что после 10-летнего периода наблюдения с 4 раундами НДКТ в качестве скрининга РЛ, у представителей основной группы выявили снижение уровня смертности от РЛ на 26% у мужчин и на 39% у женщин по сравнению с показателями группы сравнения. Половина всех обнаруженных опухолей были ранними, 69% из них были IA и IB стадий. Хирургическое лечение рака в группе скрининга встречалось в 3 раза чаще, чем в группе контроля (67,7% против 24,5%, р<0,001). За 10 лет наблюдения отношение рисков смерти между группами скрининга и контроля составило 0,74 (р=0,003) у мужчин, у женщин - 0,61 (р=0,0543). По итогам исследования были опубликованы рекомендации для проведения скрининга РЛ с использованием НДКТ - «LUNG-RADs» [7]. Мета-анализ Hoffman R.M. et. al. (2020 г.), включивший 9 исследований эффективности НДКТ при РЛ (n=96559) показал, что скрининг был связан с высокой вероятностью выявления I стадии РЛ (HR=2,93; 95%CI:2,16-3,98) и снижением риска смерти от РЛ на 16% (HR=0,84; 95%CI: 0,75-0,93) [5,6].

К недостатку перечисленных выше исследований относится отсутствие комплексной диагностики РЛ.

Из всего многообразия современного диагностического арсенала окончательное суждение о природе образований, подозрительных на опухолевые, независимо от их локализации, могут дать лишь минимально инвазивные и инвазивные методы, позволяющие произвести обязательное морфологическое исследование образцов патологической ткани. Именно проведение гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического изучения образцов опухолевой ткани, полученных при биопсии, либо во время лечебного хирургического вмешательства, позволяет адекватно оценить предиктивные и прогностические факторы и определить рациональный алгоритм специального лечения, индивидуализировав его. Эндоскопическая диагностика и семиотика центрального РЛ разработана давно и достаточно детально. Фибробронхоскопия (ФБС) с бронхобиопсией имеет достаточную чувствительность ~ 68-75% и высокую специфичность (свыше 90%). Однако, следует учитывать, что при скрининге РЛ основная находка - солитарные легочные узлы в паренхиме, недоступные для визуализации при обычной ФБС. Трансторакальная биопсия (ТТБ) среди прочих минимально инвазивных диагностических методов верификации удовлетворяет требованиям набольшей безопасности при весьма высокой информативности, особенно при использовании современных способов навигации трепан-игл. Под ТТБ понимают способ получения материала для исследования из зоны интереса в грудной полости путем чрезкожного прокола грудной стенки. Методика используется для подтверждения первичных и метастатических опухолевых процессов, локализующихся в легких, средостении, плевре, грудной стенке. Для ее обозначения в зарубежной литературе встречаются различные определения и аббревиатуры - трансторакальная игловая биопсия (transthoracic needle biopsy- TTNB), тонкоигловая аспирационная биопсия (fineneedle aspiration biopsies - FNAB). При проведении ТТБ возможно получение образцов для гистологического, цитологического исследования, либо для обоих вариантов. Биопсийные иглы, используемые при ТТБ могут быть трех типов: 1) аспирационные иглы для получения цитологического материала; 2) режущие иглы для ручного забора ткани и 3) автоматические трепан-иглы, позволяющие извлекать образцы для гистологического исследования. После позиционирования (рентген-контрастный маркер, сетка) игла проводится по кратчайшему расстоянию, под углом близким к 90°. Точное наведения иглы обеспечивают навигационные методики - рентгенологические и при пристеночном расположении ультразвуковые. До последнего времени наиболее распространенным было рентгенотелевидение, а в последние годы для навигации иглы все чаще используется КТ в обычном, спиральном и последовательном - секвентиальном вариантах, в частности, КТ-рентгеноскопии (CT-fluoroscopy - CTF). Важным условием эффективного использования КТ навигации является величина шага - каждый срез должен быть не больше, чем полудиаметр легочного узла (например, узел ≥ 3 см - шаг 1 см; узел 1-3 см - шаг 0,5 см; узел ≤ 1 см - шаг 0,3 см). При реализации ТТБ существует риск таких осложнений, как: 1) пневмоторакс; 2) кровотечения (внутриплевральные, либо гемоптоэ); 3) аллергические реакции на анестетик; 4) инфицирование, вплоть до эмпиемы плевры; 5) имплантационные метастазы; 6) воздушная эмболия; 7) гематомы средостения; 8) тампонада перикарда; 9) вазовагальные реакции. Частота летальных осложнений после ТТБ составляет менее 0,2-1%. ТТБ выполняемая современными автоматическими и полуавтоматическими иглами достаточного диаметра (14-18G) позволяют получить образцы патологической ткани, достаточные для проведения полноценного морфологического исследования.

Чувствительность ТТБ составляет 86-89%, специфичность - 94-97%, точность - 88-93%, ПЦПО - 92-97% и ПЦОО - 85-91%.

К нелучевым способам ранней диагностики РЛ, особенно его центральных форм, традиционно относится стандартное цитологическое исследование мокроты (ЦИМ), а в последнее время осуществляются попытки анализа газового состава выдыхаемого воздуха.

Известен способ скрининга злокачественных опухолей органов грудной полости путем стандартного цитологического исследования мокроты, включающего забор материала, фиксацию, обработку, оценку. Способ основан на поиске при микроскопии опухолевых клеток, метаплазии и дисплазии в образцах мокроты, нанесенных на предметное стекло и позволяет нередко установить не только злокачественную природу процесса, но и конкретную морфологическую разновидность РЛ. ЦИМ считается легко воспроизводимым, неинвазивным и недорогим методом ранней диагностики РЛ, имеет высокую специфичность, достигающую 98%. При центральном РЛ опухолевые клетки в мокроте удается обнаружить у 52-88% больных, а при периферическом - 33-61% [11,12]. Недостатком способа является весьма низкая чувствительность, не превышающая 5-15%, причем значительно чаще выявляются опухоли центральной локализации. Возможности данного теста в распознавании раннего РЛ ограничены в связи как с возможным отсутствием у больных опухолевых клеток в образце мокроты, так и по причине субъективности интерпретации результатов исследования. Даже среди опытных цитопатологов до настоящего времени нет единого мнения о критериях определения «атипичные клетки».

Техническим результатом изобретения является повышение точности неинвазивного и малоинвазивного раннего выявления злокачественных опухолей органов грудной полости.

Указанный технический результат изобретения достигается в способе скрининга на рак легких, заключающийся в том, что определяют состав выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с одновременным использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью, в котором анализ летучих органических соединений осуществляют с использованием 7 металлооксидных хеморезисторных газовых сенсоров при последовательно устанавливаемых температурах 350°, 400° и 450°C, проводят цитологический анализ мокроты с изготовлением и микроскопическим исследованием микропрепаратов, которые окрашивают гематоксилином и эозином, и при выявлении в отклике сенсоров на состав выдыхаемого воздуха статистически значимых отличий от контрольных значений, определенных заранее для используемых сенсоров, а также при обнаружении в микропрепаратах дисплазии и клеток рака выполняют низкодозную компьютерную томографию на 16-срезовом томографе, с шириной среза не более 1,25 мм, с параметрами исследования 120-140 kVp и 30-100mAs, выполнением трехмерной реконструкции и эффективной дозой в ходе одного исследования не более 1 mSv, и при выявлении очаговых изменений в паренхиме легких, производят стереотаксическую трансторакальную трепан-биопсию под послойной местной анестезией автоматическими биопсийными гильотинными иглами 14-16G с использованием роботизированной системы, совмещенной со 128-срезовым компьютерным томографом.

Способ иллюстрируется фиг.1-5, где:

на фиг. 1, 2 - представлены схема (А) и изображение (В)

непосредственных единовременных одномоментных «online» измерений.

на фиг. 3 - отклики на выдыхаемый воздух 7 сенсоров при температуре 350°С (3 выдоха).

на фиг. 4, 5 - показания сенсоров в парах этанола (150 ppm; 380 ppm; 760 ppm) и аммиака (1,7%; 3,5%; 6,4%).

на фиг.6,7,8 - графики РСА (principalcomponentanalysis - анализ основных компонентов) при разных температурах для пар из трех основных компонент с наивысшим уровнем объясненной дисперсии для данных пациента по сравнению с контрольными данными, вклад в дисперсию выборки показан в скобках.

на фиг. 9, 10 - совокупный коэффициент объясненной дисперсии в зависимости от количества основных компонентов PC (А) и кривые ROC для выбранных моделей на тестовых данных со значениями AUC в условных обозначениях,

на фиг. 11, 12, 13 - представлены автоматические иглы и пружинный механизм - биопсийный пистолет (А), роботизированная система, совмещенная со 128-срезовым компьютерным томографом (В) и процесс выполнения трансторакальной трепан-биопсии (С).

Отклик сенсоров представляет собой графический пик (фиг.3). Площадь пика используется при математических расчетах для анализа состава выдыхаемого воздуха. Разброс амплитуды откликов (пиков) при каждой температуре составил от 2 до 15% в зависимости от типа сенсора.

При попадании летучих органических соединений (ЛОС) выдыхаемого воздуха на поверхность чувствительного слоя сенсора происходят процессы окисления/восстановления, в результате чего изменяется проводимость сенсора и возникает импульс, что отображается как пик на графике. Изначально для каждого пациента анализировалось 6 выдохов в течение 10 секунд при скорости выходного потока из ячейки 2 л/мин (по 2 параллельных измерения на 3 температурных режима). Однако, статистически не значимый разброс значений откликов параллельных измерений в последующем позволил сократить число измерений при каждой температуре до 1 раза. В качестве аналитического сигнала берется интеграл пика и усредняется среди двух измерений для каждого из 7 сенсоров, в итоге для каждого пациента получается 21 значение, формирующее «отпечаток выдоха».

Для анализа выдыхаемого воздуха использовалась неселективная мультисенсорная система «электронный нос (E-nose)» на основе массива из 7 металлоксидных сенсоров. Металлоксидные сенсоры относятся к хеморезисторным газовым сенсорам, принцип действия которых основан на детектировании изменения сопротивления слоя оксида металла (SnO₂, WO₃, ZnO) в результате окисления или восстановления на его поверхности различных газов. Рабочая температура сенсоров такого типа находится в диапазоне 200-500°С. При различных температурах один и тот же сенсор обладает различной относительной чувствительностью к анализируемым соединениям, что позволяет виртуально увеличить количество используемых сенсоров. В мультисенсорной системе использовались полупроводниковые резистивные газовые сенсоры, изготовленные по толстопленочной технологии в лаборатории прикладной химической физики НИЦ "Курчатовский институт". Каждый сенсор представляет собой многослойную структуру, состоящую из полупроводникового газочувствительного слоя (собственно сенсора), диэлектрической подложки из оксида алюминия и слоя нагревателя. Полупроводниковый слой и слой нагревателя наносятся на разные стороны диэлектрической подложки методом трафаретной печати. Полупроводниковый газочувствительный слой состоит из нано- частиц диоксида олова с различными каталитическими добавками платины и/или палладия. Во время измерений температуры всех сенсоров ступенчато изменяли до 350°, 400° и 450°С. На каждой из 3 температурных площадок дожидались установления показаний сенсоров.

Именно те факты, что: 1) при трех различных температурах один и тот же сенсор меняет чувствительность, позволяя виртуально втрое увеличивать количество детекторов (с 7 до 21); 2) анализ выдыхаемого воздуха осуществляется путем непосредственных единовременных одномоментных «online» измерений, предотвращая появление неконтролируемых систематических погрешностей и существенно увеличивая производительность метода, определяет основные преимущества ранее неизвестной неселективной мультисенсорной системы «Е-nose».

Для оценки параметров измерения и характеристик мультисенсорной системы были проведены градуировки сенсоров по 3 веществам: этанол, 1-пропанол, аммиак. Процедура градуировки проводилась путем отбора в шприц (объемом 20 мл) насыщенных паров соединения и последующего их разбавления окружающим воздухом. Использовались: 96% этанол (ООО «Росбио») и 1-пропанол (Реахим, Харьковский завод реактивов), а также 10% водный раствор аммиака (ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика»). Для расчета концентраций использовались табличные данные парциальных давлений над раствором: этанол (5.95 кПа, при 20°С), 1-пропанол (1,99 кПа, при 20°С), аммиак 10% (11,59 кПа, при 20°С). Отклик сенсоров линеен для выбранного диапазона концентраций. Математический анализ отношения сигнал/шум показал ожидаемый нижний порог обнаружения (с учетом показаний всех сенсоров).

Критериями включения пациента в исследование являлись: 1) возраст участника от 30 лет и старше; 2) возможность перенести при необходимости дополнительное обследование в полном объеме, в рамках гарантий ОМС, для постановки окончательного диагноза (компьютерной томографии органов грудной полости, фибробронхоскопия, трансторакальной трепан-биопсии.; 3) курящие в настоящий момент или бросивших курить менее 10 лет назад; 4) параллельное проведение цитологического исследования образцов мокроты; 5) подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

В качестве критериев исключения пациентов использовались: 1) наличие опухолевого заболевания в анамнезе, выявленного менее 5 лет назад, за исключением рака кожи, рака шейки матки in situ; 2) тяжелые сопутствующие заболевания (наличие декомпенсированной патологии сердечно-сосудистой, дыхательной или эндокринной системы, декомпенсированная и субкомпенсированная полиорганная недостаточность, некорригируемая коагулопатия, нарушения мозгового кровообращения, нестабильная стенокардия; 3) ожидаемый срок жизни менее 1 года; 4) рак легкого и операции на легких в анамнезе.

Определения состава выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью и цитологическое исследование мокроты выполнено у 103 участников - 68 (66,0%) мужчин и 35 (34%) женщин. В полном объеме, с проведением в последующем НДКТ и ТТБ способ применен у 63 участников - 42 (66,7%) мужчин и 21 (33,3%) женщины, именно в отношении них и проводился последующий анализ. Средний возраст во второй группе добровольцев составил 53±6 лет. В целом группы были репрезентативны. Образцы проб выдыхаемого воздуха были собраны согласно хельсинкскому этическому протоколу, выданному в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, после подписания согласия каждого из участников. Усредненные показания 7 сенсоров при 3 разных температурах анализировали как 21 информативный признак. Поскольку распределение разброса среди каждой группы имело логнормальный характер, измеренные значения показаний сенсоров перед анализом по методу главных компонент (МГК) предварительно логарифмировались.

График счетов первых двух главных компонент (РС1 и РС2), описывающих более 83% объясненной дисперсии продемонстрировал статистически значимое разделение группы больных и участников контрольной группы по второй главной компоненте (РС2). Наибольшим вкладом в вариацию значений РС2 обладали сенсоры на предельные углеводороды (S1, S2) и сенсоры на -ОН группы (S5, S6, S7) при всех трех температурах. Была проведена процедура перекрестной проверки для тестового набора, таким образом, каждый из образцов тестового набора был классифицирован, чтобы определить, является ли результат истинно положительным (ИП), ложно положительным (ЛП), истинно отрицательным (ИО) или ложно отрицательным (ЛО). Качество полученного классификатора проверялось путем расчета чувствительности (ИП/(ИП+ЛО)*100%), специфичности ((ИО/ИО+ЛП)*100%) и точности ((ИП+ИО) / размер выборки*100%).

Показатели чувствительности, специфичности и точности при анализе проб выдыхаемого воздуха составили 93,4%, 99,8% и 92,1% соответственно.

В качестве цитологических критериев РЛ использовались клеточные, структурные и функциональные признаки. Так, для плоскоклеточного ороговевающего РЛ были свойственны следующие клеточные признаки: 1) резкий полиморфизм; 2) гиперхромия центрально расположенных ядер; 3) низкое ядерно-цитоплазматическое соотношение. Для плоскогоклеточного неороговевающего рака: 1) клетки с крупными гиперхромными ядрами и крупными нуклеолами; 2) атипические митозы; 3) высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение. Для аденокарцином - ядерно-цитоплазматическая полярность, а для мелкоклеточного рака -1) полигональные гиперхромные клетки и 2) нечеткие ядрышки, скудная цитоплазма. Структурными признаками плоскоклеточного неороговевающего рака легкого были 1) однослойные структуры; 2) межклеточные мостики, а ороговевающего еще и раковые жемчужины. Для аденокарцином были свойственны железистоподобные структуры, а для мелкоклеточного рака - конгруэнтные поверхности клеток.

Функциональными признаками плоскоклеточного ороговевающего РЛ были: 1) уплотненная цитоплазма с двойным контуром; 2) кератогиалинизированные структуры. Для плоскоклеточного неороговевающего рака свойственно отсутствие двойного контура цитоплазмы и чешуек. При аденокарциномах наблюдалась слизь в цитоплазме и в просвете структур. При мелкоклеточном раке наблюдалось отсутствие плоскоклеточной и железистой дифференцировки.

При цитологическом исследовании образцов мокроты результаты сведены в 5 групп: 1) без патологии - 7 (11,1%) участников; 2) гиперплазия (базально-клеточная и бокаловидных клеток) - 8 (12,7%) участников; 3) метаплазия (плоскоклеточная метаплазия без атипии клеток и атипическая плоскоклеточная метаплазия бронхиального эпителия) - 6 (9,52%) участников; 4) дисплазия подозрительная в отношении перехода в рак - 22 (34,9%) участников; 5) обнаружены клетки рака - 20 (31,7%) участник. Таким образом, обоснованные подозрения на рак легкого, по сумме 4 и 5 групп, при цитологическом исследовании высказаны у 66 участников (64,1%). После сопоставления результатов метода цитологического исследования мокроты с окончательными данными диагностики и морфологической верификации чувствительность его составила 38,7%, при высокой специфичности - 97,4%.

Совместное использование определения состава выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью и цитологического исследования мокроты по сравнению с изолированным использованием анализа выдыхаемого воздуха, позволяет статистически значимо (р=0,03) повысить чувствительность до 96,9% (95%CI:80,9%-99%) против 91,3% (95%CI:83%-96%), с некоторым допустимым снижением специфичности - 93,3% (95%CI:89%-97%) против 100% (95%CI:99%-100%).

При проведении низкодозной компьютерной томографии (НДКТ) исследования проводились на 16-срезовом томографе, причем ширина среза не превышала 1,25 мм, с параметрами исследования 120-140 kVp и 30-100 mAs при обязательном выполнении трехмерной реконструкции. Эффективная доза в ходе одного исследования не превышала 1 mSv. Результаты НДКТ записывались на диски. Благодаря гентри со скоростью вращения всего в полсекунды на один оборот и различным скоростям сканирования, настраиваемым с шагом в десятые доли секунды, пациентам можно было задерживать дыхание на более короткое время. Конструкция кольца скольжения гентри обеспечивала непрерывное вращение генератора, трубки, детектора и системы сбора данных вокруг пациента: апертура - 70 см; угол наклона ±30°; скорость наклона - 1°/сек; максимальное поле зрения при сканировании - SFOV - 50 см; скорость вращения: 360° за 0.5-4.0 сек. При анализе результатов термины «очаговые изменения», «узлы», «очаги», «узловые образования» и «очаговые образования», «паренхиматозные легочные узлы» использовались как синонимы. Чувствительность и специфичность НДКТ при диагностике очаговых образований в легких в нашем исследовании составили 89,3% и 57,4%, соответственно.

ТТБ осуществлялась под послойной местной анестезией с использованием 0,25-0,5% раствора новокаина, либо 2% лидокаина. При их непереносимости возможно использование растворов тримекаина, ультракаина, либо выполнение ТТБ в условиях общей анестезии. При реализации местной анестезии следует учитывать, что наиболее болезненными участками грудной стенки являются кожа и париетальная плевра, соответственно следует максимально бережно проходить эти слои и акцентировать на них введение анестетика. У большинства больных преобладают тягостные ощущения, связанные не с самой ТТБ, а с длительным неподвижным положением на процедурном столе.

Для выполнения трансторакальной биопсии (ТТБ) использовались автоматические биопсийные гильотинные иглы 14-16G (например, «BARD MAGNUM», США и «Bloodline», Италия) - двухпозиционные устройства, использующие автоматические пружинные механизмы (многоразовые биопсийные пистолеты, например Magnum и Bard) для последовательного продвижения внутренней иглы, относительно внешней, режущей. При использовании трепан-игл можно было изменять глубину проникновения в ткань внутренней иглы (1,5 и 2,2 см). Очевидным преимуществом автоматических игл является возможность получения неповрежденных образцов тканей. Реже использовались полуавтоматические гильотинные иглы с интегрированным ручным пружинным механизмом («Bloodline», Италия) 14-16G

После позиционирования игла проводилась по кратчайшему расстоянию, под углом близким к 90°. Часто биопсия производилась в момент задержки дыхания, что особенно актуально при расположении очага вблизи диафрагмы, в то время как очаги в верхних долях легких обычно можно трепанировать в условиях поверхностного дыхания. Одна рука должна фиксировать иглу на уровне кожи, стабилизируя и направляя ее, а вторая обеспечивает продвижение за павильон. При выполнении манипуляции в условиях рентгенотелевидения важное значение имеет наличие достаточных практических навыков у исполнителя, поскольку обычно имеется возможность почувствовать проникновение в зону интереса по тактильным ощущениям, как в более плотную ткань. После доставки к трепан-иглы к очагу производится забор материала - «выстрел» автоматической иглы, при этом стараются предотвратить попадание воздуха через иглу в плевральную полость.

Для навигации иглы при ТТБ использовалась роботизированная система для стереотаксической биопсии и интервенционных процедур «Robio ЕХ» (Perfint Healthcare), совмещенная со 128-срезовым компьютерным томографом Somatom Definition AS 128 (Siemens). Сканер томографа обеспечивает скоростной сбор данных с использованием двух источников рентгеновского излучения и двух детекторных массивов. Максимальная скорость вращения -0,33 сек за один оборот, при синхронизации сканирования с сердечным ритмом позволяет добиться временного разрешения 83 мсек, а увеличенная апертура гентри и расширенный диапазон сканирования, обеспечивают визуализацию значительного участка тела за короткое время. После сканирования области интереса полученные цифровые изображения передаются на рабочую станцию по стандарту DICOM, где выбираются мишени. По завершении расчетов полипозиционная телескопическая рука автоматически устанавливает направляющую в точку с рассчитанными координатами для проведения биопсии, с возможностью моторизованного перемещения по осям X и Y - 450 мм, а по оси Z - 100 мм. Допустимый наклон в кранио-каудуальной плоскости составляет ±450, орбитальный наклон (лево/право) - не менее ±90°. Встроенная система безопасности исключает столкновение установки с оборудованием, пациентом или персоналом при перемещениях. Важным условием эффективного использования КТ навигации является величина шага - каждый срез должен быть не больше, чем полудиаметр легочного узла (например, узел ≥3 см - шаг 1 см; узел 1-3 см - шаг 0,5 см; узел ≤ 1 см - шаг 0,3 см). После выполнения исследования с целью своевременного выявления возможных плевральных осложнений необходим рентгенологический контроль, который осуществляют непосредственно после ТТБ, через 2 часа и на следующие сутки.

Эффективность роботизированной стереотаксической ТТБ при определении характера паренхиматозных легочных узлов составила 86,3% (95%CI:81-92%), без значимых различий в зависимости от характера патологии и морфологической структуры (р>0,05), находясь в прямой зависимости от размеров очагов (при диаметре более 20 мм - 91,3%; 10-19 мм - 88,2% и менее 10 мм - 57,3%; р=0,0002-0,0003) и их расположения (для субплевральных - 93,4%; р=0,02-0,03, а для промежуточных и прикорневых - 81,1% и 77,6%). Осложнения после ТТБ развиваются у 18,2% (95%CI: 16-24%) больных, и не были связаны с размером узла (р=0,17-0,25), завися от расположения очага в легком (11.2% при субплевральном; 16,7% при промежуточном и 47,1% при прикорневом; р=0,0002-0,004), а в структуре осложнений большая часть пришлась на пневмоторакс - 18,4% (р=0,0001), 2,8% на гемоптоэ, и 0,5% на коллапс. Основным хирургическим осложнением после трансторакальной биопсии является ятрогенный пневмоторакс, необходимость дренирования которого возникла у 40,4% больных (р=0,13), что непосредственно было связано с локализацией трепанируемого узла в паренхиме легкого: для субплевральных очагов этот показатель составил 21,5%, для промежуточных - 30,9% (р1-2=0,3), а для прикорневых -73,2% (р1-3=0,01; р2-3=0,03).

В итоге, совместное использование определения состава выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью, цитологического исследования мокроты, и по определенным ими показаниям низкодозной компьютерной томографии с трансторакальной трепан-биопсией, по сравнению с изолированным использованием каждого из методов позволяет статистически значимо (р=0,02) повысить чувствительность до 98,8% (95%CI:82,7%-99,3%) против 91,3%) (95%CI:83%-96%), с достаточными показателями специфичности - 94,2% (95%CI:88%-97,3%).

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Первым этапом производят отбор проб выдыхаемого воздуха следующим образом. Для анализа выдыхаемого воздуха используют неселективную мультисенсорную систему «электронный нос (E-nose)» на основе массива из 7 металлоксидных сенсоров, разработанную в лаборатории ФГАОУВО «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики».

Последовательно устанавливают температуру сенсоров до 350°, 400° и 450°С. На каждой из 3 температурных площадок дожидаются установления показаний сенсоров. Пациент осуществляет каждый выдох в течение 10 секунд через стерильный загубник. Последовательно проводят измерения при температурах сенсоров 350°С, 400°С и 450°С.

Для анализа выдыхаемого воздуха реализуют схему непосредственных единовременных одномоментных «online» измерений, поскольку это позволяет устранить появление неконтролируемых систематических погрешностей, связанных с дополнительными процедурами отбора проб и существенно увеличивает производительность анализа. Для устранения эффекта памяти, связанного с десорбцией летучих органических соединений (ЛОС) со стенок ячейки и воздушных трактов установлен насос, который продувает воздушные тракты и ячейку с постоянной скоростью (1 л/мин), обеспечивая отсутствие дрейфа базовой линии сигнала сенсоров. Стоит подчеркнуть, что в онлайн режиме все измерения проводят относительно того уровня экзогенных ЛОС, который присутствует в атмосфере помещения. Это достигается за счет продувки ячейки нефильтрованным воздухом, поэтому можно отказаться от использования предварительной процедуры «очистки» легких - когда испытуемому перед измерением дают подышать фильтрованным воздухом в течение 3-5 минут. Такой способ существенно упрощает анализ и нивелирует нежелательный вклад экзогенных ЛОС.

В неравновесных условиях измерения для минимизации ошибки анализа, связанной с влиянием на регистрируемый сигнал скорости выдоха, в схему включают ротаметр, позволяющий контролировать скорость выдоха. Пациент в течение 10 секунд непрерывно выдыхает через стерильный загубник со средней скоростью 3,5 литра/мин. Таким образом, объем пробы для одного измерения составляет примерно 600 мл.

Вторым этапом осуществляют сбор мокроты без индукции для цитологического исследования в контейнеры объемом 50 мл, содержащие 25 мл фиксатора. Затем образцы помещают в холодильник (температурный режим от +2° до +8°С) на срок не более 5 дней перед дальнейшей обработкой. Из полученных образцов готовят 2 стекла для традиционного цитологического исследования, которые окрашивают гематоксилином и эозином. Окраска включает использование основного красителя гематоксилина, окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина, окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы. Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточные белки, например, тельца Леви. Цитоплазма является эозинофильной средой. Приготовленные препараты сушат при комнатной температуре в течение 15 минут. Непосредственно перед окрашиванием высушенные мазки фиксируют в 96° спирте 7 минут, промывают водой и высушивают. Окраску проводят гематоксилином Майера 20 минут, с ополаскиванием и последующим погружением (отсиниванием) на 15-20 минут в водопроводную воду. Мазки вновь окрашивают 0,25% раствором эозина, приготовленным из 1% основного раствора эозина, в течение 15 секунд. Промывают в воде и высушивают. Работа цитолога в основном ведется в светлом поле на объективах 40х, 60х и 100х. В стандартный набор объективов включены объективы планахромат 4х, 10х, 40х, 60х, 100xOil. Удобной опцией является промежуточный объектив планахромат 60х, который дает большее поле зрения и детализацию, чем традиционный объектив 100х, но при этом не требует иммерсионного масла для работы.

При получении обоснованных подозрений в отношении наличия рака легкого пациентам выполнялась низкодозная компьютерная рентгеновская томография на 16-срезовом томографе, с шириной среза, не превышающей 1,25 мм, с выполнением трехмерной реконструкции, при эффективной дозе в ходе одного исследования не более 1 mSv.

При обнаружении очаговой патологии в паренхиме легкого, обоснованно подозрительной на рак легкого выполнялась роботизированная стереотаксическая трансторакальная биопсия под послойной местной анестезией с использованием автоматических биопсийных гильотинных игл 14-16G с величиной шага (ширины среза) не больше, чем полудиаметр легочного узла. После выполнения исследования с целью своевременного выявления возможных плевральных осложнений необходим рентгенологический контроль, который осуществляют непосредственно после ТТБ, через 2 часа и на следующие сутки.

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Участник 3., 56 лет. Жалоб не было. Добровольное участие в исследовании. При использовании заявляемого способа получены следующие данные: цитологически - выраженная дисплазия бронхиального эпителия, с подозрением на рак; при анализе выдыхаемого воздуха - статистически значимое (р=0,006) отличие площади пиков на отпечатке дыхания от контрольной группы, продолжительность исследования - 11,5 минут. Выполнена НДКТ органов грудной полости. В S3 верхней доли правого легкого узел с нечетким неровным контуром, лучистый, с тяжами к плевре, 11×10×13 мм, неоднородный. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. Выполнена роботизированная стереотаксическая трансторакальная трепан-биопсия. Гистологическое и иммуногистохимическое заключение - плоскоклеточный рак G3. Клинический диагноз: периферический рак верхней доли правого легкого T1bN0M0; IA стадия. Направлен на хирургическое лечение.

Пример 2. Больной С., 72 года. Жалоб не было. Добровольное участие в исследовании. При использовании заявляемого способа получены следующие данные: цитологически - метаплазия бронхиального эпителия. При анализе выдыхаемого воздуха - статистически значимое (р=0,002) отличие площади пиков на отпечатке дыхания от контрольной группы. Продолжительность исследования - 7 минут. Выполнена НДКТ органов грудной полости. В S4 средней доли правого легкого довольно однородный овоидный узел с ровным контуром, 8×7×9 мм. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. Выполнена роботизированная стереотаксическая трансторакальная трепан-биопсия. Гистологическое и иммуногистохимическое заключение - высокодифференцированная аденокарцинома G1. Клинический диагноз: периферический рак средней доли правого легкого T1aN0M0; IA стадия. В связи с функциональными ограничениями направлен на стереотаксическую лучевую терапию.

Пример 3. Больной Д., 64 года. Жалобы на сухой кашель, умеренные боли в грудной клетке слева. К врачам по этому поводу не обращался. Добровольное участие в исследовании. При использовании заявляемого способа получены следующие данные: цитологически - клетки плоскоклеточного рака на фоне дисплазии бронхиального эпителия. При анализе выдыхаемого воздуха - статистически значимое (р=0,003) отличие площади пиков на отпечатке дыхания от контрольной группы, продолжительность исследования - 6,5 минут. Выполнена НДКТ органов грудной полости. В S6 нижней доли левого легкого узел с нечетким неровным контуром, с тяжами к корню легкого, втяжением и утолщением париетальной плевры, 43×38×41 мм, неоднородный, с участком распада в центре до 10 мм. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. Выполнена роботизированная стереотаксическая трансторакальная трепан-биопсия. Гистологическое и иммуногистохимическое заключение - низкодифференцированный плоскоклеточный рак G3. Клинический диагноз: периферический рак нижней доли левого легкого T1bN0M0; IIA стадия. Направлен на хирургическое лечение.

Таким образом, заявляемый способ, включающий определение состава выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью, цитологическим исследованием мокроты при выявлении статистически значимых отличий от контрольных значений, определенных заранее для используемых сенсоров, и одновременном обнаружении в микропрепаратах дисплазии и клеток рака выполняют низкодозную компьютерную томографию, а при выявлении очаговых изменений в паренхиме легких, обоснованно подозрительных на рак легкого, с целью получения материала для морфологического подтверждения диагноза дополнительно производят стереотаксическую трансторакальную трепан-биопсию под местной анестезией. Доказаны статистически значимые различия показателей чувствительности и специфичности между больными раком легкого и здоровыми участниками при использовании предлагаемого способа.

Небольшое время, необходимое для реализации первого этапа способа (среднее время 6,3 мин.) и возможность измерений в реальном времени (онлайн), а также возможность своевременного, безопасного, эффективного проведения безотлагательной уточняющей диагностики в качестве второго этапа, включающего низкодозную компьютерную томографию и стереотаксическую трансторакальную трепан-биопсию для получения материала для морфологического подтверждения диагноза - являются ключевыми моментами при дальнейшем перспективном его использовании в скрининговых программах диагностики рака легких.

Способ позволяет повысить точность неинвазивного и малоинвазивного раннего выявления злокачественных опухолей органов грудной полости.

Источники информации:

1. Арсеньев А.И., Танеев А.А., Нефедов А.О. и соавт. Способ скрининга злокачественных опухолей органов грудной полости // Патент на изобретение РФ №2707099. Заявка №2019112562. Приоритет изобретения от 24.04.2019 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 22.11.2019 г.

2. Гомболевский В.А., Чернина В.Ю., Николаев А.Н., Гончар АЛ., Лайпан А.Ш., Морозов СЛ. Способ скрининга рака легкого с помощью ультранизкодозной компьютерной томографии у пациентов с массой тела до 69 кг // Патент на изобретение РФ №2701922. /; заявитель ГБУЗ «НПКЦ ДиТ ДЗМ».

3. Aberle D.R., Adams A.M., Berg C.D. et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening // N. Engl. J. Med. - 2011. - 365(5). - P. 395-409. doi: 10.1056/NEJMoa1102873. PMID: 21714641.].

4. Henschke С.I., Yankelevitz D.F., Libby D.M. et al. Survival of Patients with stage I lung cancer detected on CT screening // N. Engl. J. Med. - 2006. - 355(17). - P. 1763-1771. doi: 10.1056/NEJMoa060476

5. Hoffman R.M., Atallah R.P., Struble R.D., Badgett R.G. Lung Cancer Screening with Low-Dose CT: a Meta-Analysis // J. Gen. Intern. Med. - 2020. - 35. - P. 3015-3025. doi: 10.1007/s11606-020-05951-7. PMID: 32583338.

6. Jonas D.E., Reuland D.S., Reddy S.M. et al. Screening for Lung Cancer With Low-Dose Computed Tomography: Updated Evidence Report and Systematic Review for the US Preventive Services Task Force // JAMA. - 2021. - 325(10). - P. 971-987. doi: 10.1001/jama.2021.0377.

7. de Koning H.J., van der Aalst С.М., de Jong P.A. et. al. Reduced lung-cancer mortality with volume CT screening in a randomized trial // N. Engl. J. Med. - 2020. - 382(6). - P. 503-513. doi: 10.1056/NEJMoa1911793. PMID: 31995683.

8. Nakhleh M.K., Amal H., Jeries R. et al. Diagnosis and Classification of 17 Diseases from 1404 Subjects via Pattern Analysis of Exhaled Molecules // ACS Nano. - 2017. - 11(1). - P. 112-125. doi: 10.1021/acsnano.6b04930.

9. Sone S., Li F., Yang Z.G., Honda T. et al. Results of three-year mass screening programme for lung cancer using mobile low-dose spiral computed tomography scanner // British Journal of Cancer. - 2001. - 1(84). - P. 25-32.

10. Stamatis G. Staging of lung cancer: the role of noninvasive, minimally invasive and invasive techniques // Eur. Respir. J. - 2015 - 46(2). - P. 521-531.

11. Wu G., Wang E. Li J., et al. Clinical value of liquid-based cytologic test in sputum examination of patients with lung cancer // Zhongguo Fei Ai ZaZhi. - 2006. - 9(2). - P. 192-195.

12. Wu G.X., Raz D.J. Lung Cancer Screening // Cancer Treat. Res. - 2016. - 170. - P. 1-23.

Изобретение относится к медицине, а именно к торакальной онкологии, и может быть использовано для скрининга на рак легких. Определяют состав выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с одновременным использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью, в котором анализ летучих органических соединений осуществляют с использованием 7 металлоксидных хеморезисторных газовых сенсоров при последовательно устанавливаемых температурах 350, 400 и 450°С. Проводят цитологический анализ мокроты с изготовлением и микроскопическим исследованием микропрепаратов, которые окрашивают гематоксилином и эозином. При выявлении в отклике сенсоров на состав выдыхаемого воздуха статистически значимых отличий от контрольных значений, определенных заранее для используемых сенсоров, а также при обнаружении в микропрепаратах дисплазии и клеток рака выполняют низкодозную компьютерную томографию на 16-срезовом томографе, с шириной среза не более 1,25 мм, с параметрами исследования 120-140 kVp и 30-100 mAs, выполнением трехмерной реконструкции и эффективной дозой в ходе одного исследования не более 1 mSv. При выявлении очаговых изменений в паренхиме легких, производят стереотаксическую трансторакальную трепан-биопсию под послойной местной анестезией автоматическими биопсийными гильотинными иглами 14-16G с использованием роботизированной системы, совмещенной со 128-срезовым компьютерным томографом. Способ обеспечивает повышение точности неинвазивного и малоинвазивного раннего выявления злокачественных опухолей органов грудной полости за счет комбинации методов определения состава выдыхаемого воздуха, цитологического анализа мокроты, компьютерной томографии и трансторакальной трепан-биопсии. 13 ил., 3 пр.

Способ скрининга на рак легких, заключающийся в том, что определяют состав выдыхаемого воздуха неселективным методом анализа летучих органических соединений с одновременным использованием металлооксидных сенсоров с перекрестной чувствительностью, в котором анализ летучих органических соединений осуществляют с использованием 7 металлооксидных хеморезисторных газовых сенсоров при последовательно устанавливаемых температурах 350, 400 и 450°С, проводят цитологический анализ мокроты с изготовлением и микроскопическим исследованием микропрепаратов, которые окрашивают гематоксилином и эозином, и при выявлении в отклике сенсоров на состав выдыхаемого воздуха статистически значимых отличий от контрольных значений, определенных заранее для используемых сенсоров, а также при обнаружении в микропрепаратах дисплазии и клеток рака выполняют низкодозную компьютерную томографию на 16-срезовом томографе, с шириной среза не более 1,25 мм, с параметрами исследования 120-140 kVp и 30-100 mAs, выполнением трехмерной реконструкции и эффективной дозой в ходе одного исследования не более 1 mSv, и при выявлении очаговых изменений в паренхиме легких, производят стереотаксическую трансторакальную трепан-биопсию под послойной местной анестезией автоматическими биопсийными гильотинными иглами 14-16G с использованием роботизированной системы, совмещенной со 128-срезовым компьютерным томографом.