СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА GBSSI У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/82 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим редактирование гена GBSSI в геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale).

Предшествующий уровень техники

Крахмал, содержащийся в эндосперме зерна, играет ключевую роль в определении качества зерна, включая его вкусовые характеристики и пищевую ценность. Мутация генов пути биосинтеза крахмала оказывает сильное влияние на качество и количество крахмала и является важной целью для селекции растений. Ген GBSS один из значимых генов пути биосинтеза крахмала, кодирующий гранулосвязанную синтазу крахмала (GBSS) в эндосперме (Chen J. et al., 2021). Ген GBSS состоит из двух изоформ: GBSSI, который функционирует в основном в запасаемых тканях (таких как эндосперм семян), и GBSSII, который играет роль в тканях растений, не хранящих запасы (например, в листьях), для временного накопления крахмала (P.L. Vrinten and Т. Nakamura, 2000). Введение мутаций, затрагивающих данный ген приводит к улучшению качества крахмала и, как следствие, качества зерна (Perez L. at al., 2019). Так как естественное появление мутаций способных нокаутировать работу гена в природе достаточно редко, для ускорения селекционного процесса необходимо направленное изменение гена GBSSI с помощью систем редактирования генома. Введение мутаций осуществляется с помощью геномного редактирования с использованием системы CRISPR/Cas9.

Редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9 - высокоточный молекулярный метод, способный внести точечный разрыв в необходимое место генома, меченное с помощью специально подобранной гидовой РНК, комплементарной затравки - мишени для Cas9. Впервые система редактирования с помощью CRISPR/Cas9 была использована для редактирования генома растений еще в 2013 году (Wenzhi J. at al., 2013). В ходе развития технологии редактирование гена GBSSI проводилось на таких культурах, как рис (Pérez L. at al., 2019), мягкая пшеница (Zhang S. at al., 2018), маниок (Carmo C.D., 2020), и т.д.

После проведения редактирования необходимо подтвердить наличие мутаций в каждом из сайтов редактирования для дальнейшей дифференциации растений на редактированные и нередактированные, во всех вышеперечисленных работах редактирование выявляли с помощью секвенирования следующего поколения (NGS).

Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой передовую биологическую технологию, используемую для определения последовательности нуклеотидов в геноме с высокой точностью и эффективностью. Подготовительным этапом для проведения секвенирования является подготовка генетического материала, включающая фрагментацию и прикрепление адаптеров, амплификацию образцов и создание кластеров на поверхности чипа или потока. Далее следует этап секвенирования, в процессе которого получают короткие последовательности, называемые "рилами". Риды обрабатываются и выравниваются на референсный геном или собираются в контиги с использованием биоинформатических инструментов.

Секвенирование нового поколения (NGS) представляет собой мощный инструмент для исследования генетической информации, но оно также является трудоемким и дорогостоящим процессом по нескольким факторам. Во-первых, NGS генерирует огромные объемы данных, особенно при анализе целых геномов или больших наборов образцов, что требует значительных вычислительных ресурсов и времени для их обработки и анализа. Во-вторых, секвенирование требует использования дорогостоящего оборудования и химических реагентов, что увеличивает финансовые затраты на проведение исследований. В-третьих, эффективное использование NGS требует высокой квалификации и опыта в обработке данных и биоинформатике, что делает этот процесс трудоемким и зависящим от наличия опытного исполнителя. Наконец, анализ и интерпретация данных, полученных с помощью NGS, также являются сложными и времязатратными процессами.

Проведение каждой новой модификации представляет собой индивидуальный процесс, который обусловлен необходимостью подбора новых сайтов и гидовых последовательностей для проведения редактирования. В связи с этим каждое новое редактирование требует создания уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область редактирования и специфичны для данного эксперимента. Олигонуклеотиды, использованные ранее в аналогичных экспериментах, не подходят для выявления проведенного нами редактирования, так как в нашем случае использовались новые сайты редактирования, и их количество также отличалось от предыдущих работ.

Таким образом, существует потребность более простом, способе обнаружения изменений нуклеотидных последовательностей целевых генов, в частности гена GBSSI, возникающих в геноме в результате редактирования с помощью системы CRJSPR/Cas9. Настоящее изобретение предлагает такой способ.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка способа выявления событий редактирования гена GBSSI у зерновых культур, который был бы более простым в осуществлении и менее трудоемким и финансово затратным.

Для решения этой задачи авторы предлагают использовать способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.

Заявленный способ предусматривает использование набора олигонуклеотидных праймеров (олигонуклеотидов), которые фланкируют трии сайта редактирования гена GBSSI (Фигура 1). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже в Таблице 1 и в Перечне последовательностей.

Способ осуществляется путем проведения полимеразной цепной реакции с представленными в Таблице 1 олигонуклеотидами, визуализацией продукта с помощью капиллярного электрофореза и дальнейшем сравнении размера фрагментов контрольного образца (растение, которое не подвергалось редактированию) и редактированных растений. Благодаря точному определению длины амплифицированных фрагментов на капиллярном электрофорезе, сдвиг - разница в размере контрольного и исследуемых образцов показывает наличие редактирования у исследуемых растений и размер инсерций и делеций.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Расположение сайтов редактирования и олигонуклеотидов, используемых для выявления редактирования в этих сайтах на гене GBSSIa

Фигура 2. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×1 гена GBSSIa

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Фигура 3. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×2 гена GBSSIa

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Фигура 4. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×3 гена GBSSIa

а) форезграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Фигура 5. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×1 гена GBSSIa

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Фигура 6. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×2 гена GBSSIa

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Фигура 7. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования W×3 гена GBSSIa

а) форезграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - редактирование не выявлено

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - редактирование не выявлено

Осуществление изобретения (Примеры)

Настоящее изобретение было валидировано на растениях являющихся аллополиплоидами, а именно яровой и озимой тритикале и твердой пшеницы, имеющих генотип с различающимися субгеномами (ABR в случае тритикале и АВ в случае твердой пшеницы).

Пример 1

На первом этапе проводилось выделение ДНК из 78 растений-регенерантов озимой и яровой тритикале прошедших редактирование гена GBSSIa. Выделение проводили из сухих листьев модифицированным СТАВ-методом (Springer et al., 2010) модифицированным для зерновых культур. Для дальнейшей постановки ПЦР олигонуклеотиды использовались в следующих комбинациях: SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6.

ПЦР-амплификацию проводили по единому режиму для всех пар олигонуклеотидов (95°С - 3 мин; 95°С - 20 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 20 сек -35 циклов; 72°С - 10 мин), в стандартной ПЦР-смеси (Mg2+ 2.5 мМ, dNTP 0.25 мМ) с добавлением 1 мкл ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. При постановке реакций в реакционную смесь так же добавляли 0.5 мкл ДМСО 100% для лучшей амплификации GC-богатых регионов. Продукты амплификации с ДМСО перед капиллярным форезом разводили дистиллированной водой в 20 раз с целью снижения концентрации солей для лучшего прохождения электрофореза.

Продукты амплификации визуализировали методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Нанофор 05 в присутствии маркера молекулярного веса. Капиллярный электрофорез на генетическом анализаторе проводится в соответствии с руководством пользователя, предоставляемым его производителем (Синтол, Россия). Параметры электрофореза зависели от длины капилляров и типа полимера, рекомендуемые параметры инжекции 1800 В, 5 секунд. Продукты амлификации, полученные в постановке ПЦР с олигонуклеотидами 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4; 3) SEQ ID NO: 5-6 визуализировали на фрагментном анализе одновременно.

Результаты постановок - получившиеся профили образцов, проходившие редактирование сравнивали с профилем контрольного образца, не проходившего редактирование и за счет изменения размера фрагментов выявляли редактирование и его тип.

Далее все образцы были отправлены на NGS. Библиотеки для NGS были подготовлены по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq.

Для каждого секвенируемого образца длина прочтения, качество и количество ридов в полученных fastq-файлах оценивались с помощью программы FastQC 0.11.9. Первичная обработка ридов осуществлялась с помощью программы Trimmomatic-0.39. После тримминга fastq файлы конвертировались в fasta файлы, которые анализировались в программе Unipro UGENE 33.0.

Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев (Фигура 2-4), что демонстрирует высокую эффективность и надежность метода в выявлении генетических изменений, данные результаты также подчеркивают перспективность и потенциал данного метода и его дальнейшего использования.

Пример 2

Данный набор олигонуклеотидов также был апробирован на 68 растениях твердой пшеницы, где продемонстрировал высокую эффективность и точность при выявлении редактирования. Выделение ДНК, ПЦР-амплификацию, постановку фрагментного анализа и NGS проводили аналогично Примеру 1. Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев, чем подтверждают возможность его использования для быстрого обнаружения генетических модификаций в твердой пшенице и, вероятно, в других ценных сельскохозяйственных культурах (Фигура 5-7).

Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Соглашения №075-15-2019-1667 от «31» октября 2019 г. о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня «Курчатовский геномный центр» в рамках реализации федерального проекта «Развитие научной и научно-производственной кооперации» национального проекта «Наука».

Список литературы

Carmo C.D. (15 April 2020 г.). Identification and validation of mutation points associated with waxy phenotype in cassava. BMC Plant Biology, p. 164.

Chen J. et al. (April 2021 г.). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.

P.L. Vrinten and T. Nakamura. (January 2000 г.). Wheat Granule-Bound Starch Synthase I and II Are Encoded by Separate Genes That Are Expressed in Different Tissues. Plant Physiology, p. 255-264.

Pérez L. at al. (4 February 2019 г. ). CRISPR/Cas9 mutations in the rice Waxy/GBSSI gene induce allele-specific and zygosity-dependent feedback effects on endosperm starch biosynthesis. Plant Cell Reports, p. 417-433.

Springer et al. (November 2010 г.). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and СТАВ. Cold Spring Harbor Protocols.

Wenzhi J. at al. (1 November 2013 г.). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p. 188.

Zhang S. at al. (26 November 2018 г.). Targeted mutagenesis using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas9 system in common wheat. BMC Plant Biology, p. 302.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень

последовательностей GBSSIa-1.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>GBSSIa-1</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>GBSSIa-1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБНУ ВНИИСБ</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural

Biotechnology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ

РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА GBSSI У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atggcggctctggtcacg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtcttgctccagggcgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaaggcgctgaacaaggagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aacttcttcttcccggtgcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggcctgctacctcaagag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagttgatcttgcgcccctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, в частности к генетическим маркерам, выявляющим генетические модификации гена GBSSI, полученные с использованием CRISPR/Cas9 на геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale). Раскрыт способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза. Изобретение позволяет выявлять события редактирования гена GBSSI у зерновых культур, возникающие в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ выявления событий редактирования гена GBSSI у зерновых культур, включающий в себя следующие этапы:

выделение геномной ДНК, параллельная постановка ПЦР-амплификации с парами олигонуклеотидов, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 6, визуализация продуктов амплификации при помощи капиллярного электрофореза, сравнение подвижности продуктов амплификации исследуемого и контрольного образцов и установление события редактирования в случае различия подвижности исследуемого и контрольного образцов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является пшеница.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является тритикале.