СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА SBEIIA У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим редактирование гена SBEIIA в геноме твёрдой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale).

Предшествующий уровень техники

Качество зерна в значительной степени зависит от качества крахмала, содержащегося в эндосперме. Внесение мутаций в гены пути биосинтеза крахмала может положительно повлиять на качество и количество крахмала, полисахарида, служащего важным источником энергии для растений (Chen et al., 2021). Крахмал состоит из двух полимеров глюкозы: амилозы, образованной линейными глюкозидными цепями, и амилопектина. Амилопектин основной компонент крахмала (65-85%) образующий кластерные структуры (Thompson, 2000). В отличие от амилозы, для синтеза амилопектина требуется множество ферментов, включая синтазы растворимого крахмала (SS) и ферменты разветвления крахмала (SBE). (Jin et al., 2023)

Среди генов SBE было обнаружено два основных семейсва SBE I и SBE II, были обнаружены у различных высших растений. Ферменты SBE1 (семейство SBEI) и SBE3 (семейство SBE II) составляют ~70% и ~30% соответственно от общего биосинтеза амилопектина в эндосперме (Han et al., 2004).

Ранее описано, что редактирование гена SBEIIa приводит к увеличению содержания амилозы на 25%. ( Sun et al. , 2017), для более подробного изучения механизмов действия гена SBEIIa мы использовали систему редактирования генома с применением CRISPR/Cas9, направленную на изменение гена SBEIIa.

Редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9 - высокоточный молекулярный метод, способный внести точечный разрыв в необходимое место генома, меченное с помощью специально подобранной гидовой РНК, комплементарной затравки - мишени для Cas9. Впервые система редактирования с помощью CRISPR/Cas9 была использована для редактирования генома растений еще в 2013 году (Wenzhi J. at al., 2013). В ходе развития технологии редактирование гена проводилось разными способами на таких культурах, как рис (Sun et al., 2017) и кукуруза (Blauth et al., 2001).

После проведения редактирования необходимо подтвердить наличие мутаций в каждом из сайтов редактирования для дальнейшей дифференциации растений на редактированные и нередактированные, во всех вышеперечисленных работах генетические модификации выявляли с помощью секвенирования следующего поколения (NGS).

Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой мощный инструмент для исследования генетической информации, но оно также является трудоемким и дорогостоящим процессом по нескольким факторам. Во-первых, NGS генерирует огромные объемы данных, особенно при анализе целых геномов или больших наборов образцов, что требует значительных вычислительных ресурсов и времени для их обработки и анализа. Во-вторых, секвенирование требует использования дорогостоящего оборудования и химических реагентов, что увеличивает финансовые затраты на проведение исследований. В-третьих, эффективное использование NGS требует высокой квалификации и опыта в обработке данных и биоинформатике, что делает этот процесс трудоемким и зависящим от наличия опытного исполнителя. Наконец, анализ и интерпретация данных, полученных с помощью NGS, также являются сложными и времязатратными процессами.

Проведение каждой новой модификации представляет собой индивидуальный процесс, который обусловлен необходимостью подбора новых сайтов и гидовых последовательностей для проведения редактирования. В связи с этим каждое новое редактирование требует создания уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область редактирования и специфичны для данного эксперимента. Олигонуклеотиды, использованные ранее в аналогичных экспериментах, не подходят для выявления проведенного нами редактирования, так как в нашем случае использовались новые сайты редактирования, и их количество также отличалось от предыдущих работ.

Таким образом, существует потребность более простом, способе обнаружения изменений нуклеотидных последовательностей целевых генов, в частности гена SBEIIA, возникающих в геноме в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. Настоящее изобретение предлагает такой способ.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка способа выявления событий редактирования гена SBEIIA у зерновых культур, который был бы более простым в осуществлении, менее трудоемким и финансово затратным.

Для решения этой задачи авторы предлагают использовать способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.

Заявленный способ предусматривает использование набора олигонуклеотидных праймеров (олигонуклеотидов), которые фланкируют два сайта редактирования гена SBEIIA (Фигура 1). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже в Таблице 1 и в Перечне последовательностей.

Таблица 1. - Последовательности олигонуклеотидов с указанием флуорофоров и размеров амплифицируемых фрагментов Название Последовательности олигонуклеотидов с указанием флуорофоров SEQ ID NO: Размер фрагмента SBE4-F (6ROX-HP)tt-ttt-t(dT-FAM-HP-C8N3)TCAGGATGATTATGGTGTTTGGGA 1 238 SBE4-R GAGCCTGCACAGAGAACTTGAT 2 SBE5-F (6Sy630-N3)tt-ttt-t(dT-FAM-HP-C8N3)TGGCAATCCAGGAGCATTCATA 3 328 SBE5-R AAGAACAAGCAAACCAAGCTCATG 4

Способ осуществляется путем проведения полимеразной цепной реакции с представленными в Таблице 1 олигонуклеотидами, визуализацией продукта с помощью капиллярного электрофореза и дальнейшем сравнении размера фрагментов контрольного образца (растение, которое не подвергалось редактированию) и редактированных растений. Благодаря точному определению длины амплифицированных фрагментов на капиллярном электрофорезе, сдвиг - разница в размере контрольного и исследуемых образцов показывает наличие редактирования у исследуемых растений и размер инсерций и делеций.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Расположение сайтов редактирования и олигонуклеотидов, используемых для выявления редактирования в этих сайтах на гене SBEIIA

Фигура 2. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования SBEIIa4 гена SBEIIA

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 2А - редактирования нет, 2В - делеция 2 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2R - делеция 3 bp (50%) и редактирования нет (50%)

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 2А - редактирования нет, 2В - делеция 2 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2R - делеция 3 bp (50%) и редактирования нет (50%).

Фигура 3. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования SBEIIa5 гена SBEIIA

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 2А - делеция 2 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2В - редактирования нет, 2R - редактирования нет

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 2А - делеция 2 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2В - редактирования нет, 2R - редактирования нет.

Фигура 4. Фореграммы образцов твёрдой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования SBEIIa4 гена SBEIIA

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 2А - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2В - редактирования нет

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 2А - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 2В - редактирования нет.

Фигура 5. Фореграммы образцов твёрдой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования SBEIIa5 гена SBEIIA

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 2А -редактирования нет, 2В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%)

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 2А -редактирования нет, 2В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%).

Осуществление изобретения (Примеры)

Данное изобретение было валидировано на растениях являющихся аллополиплоидами, а именно яровой и озимой тритикале и твердой пшеницы, имеющих генотип с различающимися субгеномами (ABR в случае тритикале и AB в случае твёрдой пшеницы).

Пример 1

На первом этапе проводилось выделение ДНК из 78 растений-регенерантов озимой и яровой тритикале прошедших редактирование гена SBEIIA. Выделение проводили из сухих листьев CTAB-методом (Springer et al., 2010) модифицированным для зерновых культур. Для дальнейшей постановки ПЦР олигонуклеотиды использовались в следующих комбинациях: SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 4.

ПЦР-амплификацию проводили по единому режиму для всех пар олигонуклеотидов (95°С - 3 мин; 95°С - 20 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 20сек - 35 циклов; 72°С - 10 мин), в стандартной ПЦР-смеси (Mg2+ 2.5 мМ, dNTP 0.25 мМ) с добавлением 1 мкл ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. При постановке реакций в реакционную смесь так же добавляли 0.5 мкл ДМСО 100% для лучшей амплификации GC-богатых регионов. Продукты амплификации с ДМСО перед капиллярным форезом разводили дистиллированной водой в 20 раз с целью снижения концентрации солей для лучшего прохождения электрофореза.

Продукты амплификации визуализировали методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Нанофор 05 в присутствии маркера молекулярного веса. Капиллярный электрофорез на генетическом анализаторе проводится в соответствии с руководством пользователя, предоставляемым производителем (Синтол, Россия). Параметры электрофореза зависели от длины капилляров и типа полимера, рекомендуемые параметры инжекции 1800 В, 5 секунд. Продукты амлификации, полученные в постановке ПЦР с олигонуклеотидами 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4 визуализировали на фрагментном анализе одновременно.

Результаты постановок - получившиеся профили образцов, проходившие редактирование сравнивали с профилем контрольного образца, не проходившего редактирование и за счет изменения размера фрагментов выявляли редактирование и его тип.

Далее все образцы были отправлены на NGS. Библиотеки для NGS были подготовлены по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq.

Для каждого секвенируемого образца длина прочтения, качество и количество ридов в полученных fastq-файлах оценивались с помощью программы FastQC 0.11.9. Первичная обработка ридов осуществлялась с помощью программы Trimmomatic-0.39. После тримминга fastq файлы конвертировались в fasta файлы, которые анализировались в программе Unipro UGENE 33.0.

Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев (Фигуры 2-3), что демонстрирует высокую эффективность и надежность метода в выявлении генетических изменений, данные результаты также подчеркивают перспективность и потенциал данного метода и его дальнейшего использования.

Пример 2

Данный набор олигонуклеотидов также был апробирован на 68 растениях твердой пшеницы, где продемонстрировал высокую эффективность и точность при выявлении редактирования. Выделение ДНК, ПЦР-амплификацию, постановку фрагментного анализа и NGS проводили аналогично Примеру 1. Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев, чем подтверждают возможность его использования для быстрого обнаружения генетических модификаций в твёрдой пшенице и, вероятно, в других ценных сельскохозяйственных культурах (Фигуры 4-5).

Финансирование работ по созданию настоящего изобретения проводилось из средств Соглашения № 075-15-2019-1667 от «31» октября 2019 г. о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации на осуществление государственной поддержки создания и развития центра геномных исследований мирового уровня «Курчатовский геномный центр» в рамках реализации федерального проекта «Развитие научной и научно-производственной кооперации» национального проекта «Наука».

Список литературы

Blauth et al. (March 2001 г.). Identification of Mutator Insertional Mutants of Starch-Branching Enzyme 2a in Corn. Plant physiology, р. 1396-1405.

Chen J. et al. (April 2021 г.). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.

Han et al. (February 2004 г.). Genes coding for starch branching enzymes are major contributors to starch viscosity characteristics in waxy rice (Oryza sativa L.). Plant Science, р. 357-364.

Jin et al. (July 2023 г.). The OsNAC24-OsNAP protein complex activates OsGBSSI and OsSBEI expression to fine-tune starch biosynthesis in rice endosperm. Plant Biotechnol Journal.

Springer et al. (November 2010 г.). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and CTAB. Cold Spring Harbor Protocols.

Sun et al. . (March 2017 г.). Generation of High-Amylose Rice through CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis of Starch Branching Enzymes. Sec. Plant Biotechnology.

Thompson, D. (November 2000 г.). On the non-random nature of amylopectin branching. Carbohydrate Polymers, р. 223-239.

Wenzhi J. at al. (1 November 2013 г.). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, р. 188.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень

последовательностей SBEIIA.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>SBEIIA</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>SBEIIA</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБНУ ВНИИСБ</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural

Biotechnology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ

РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА SBEIIA У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcaggatgattatggtgtttggga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagcctgcacagagaacttgat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcaatccaggagcattcata</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aagaacaagcaaaccaagctcatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим генетические модификации гена SBEIIA, полученные с использованием CRISPR/Cas9 на геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale). Раскрыт способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза. Изобретение позволяет выявлять события редактирования гена SBEIIA у зерновых культур, возникающие в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ выявления событий редактирования в сайтах редактирования SBEIIa4 и SBEIIa5 гена SBEIIA у зерновых культур, включающий в себя следующие этапы:

выделение геномной ДНК, параллельная постановка ПЦР-амплификации со следующими парами олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4, визуализация при помощи капиллярного электрофореза, сравнение подвижности продуктов амплификации исследуемого и контрольного образца, полученного от растения, которое не подвергалось редактированию, и установление события редактирования в случае различия подвижности исследуемого и контрольного образца.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является пшеница.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является тритикале.