СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА RSR1 У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/82 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим редактирование гена RSR1 в геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale).

Предшествующий уровень техники

Качество зерна в значительной степени зависит от качества крахмала, содержащегося в эндосперме. Внесение мутаций в гены пути биосинтеза крахмала может положительно повлиять на качество и количество крахмала, полисахарида, служащего важным источником энергии для растений (Chen et al., 2021). Ген RSR1 играет важную роль в процессе синтеза крахмала, так как он участвует в процессе регуляции активности других генов, ответственных за синтез.

Исследования показывают, что изменения в гене RSR1 могут привести к изменениям в структуре и свойствах крахмала в растениях (Borisjuk et al., 2019). Это может влиять на качество и количество крахмала, производимого растениями. Например, мутации в гене RSR1 могут привести к изменению содержания амилозы и амилопектина в крахмале, что изменит его функциональные характеристики (Liu et al., 2016). Кроме того, ген RSR1 вовлечен в регуляцию времени синтеза крахмала в растении. Это может быть важным фактором для адаптации растения к различным условиям роста и потребностям в энергии.

Изучение гена RSR1 и его влияния на синтез крахмала имеет большое значение для сельского хозяйства и биотехнологии, так как понимание этой связи может помочь улучшить выращивание растений с оптимизированным содержанием крахмала, что в свою очередь может быть полезно для производства.

Для ускорения процесса селекции твердой пшеницы и тритикале, мы использовали систему редактирования генома с применением CRISPR/Cas9, направленную на изменение гена RSRJ.

Редактирование с помощью системы CRISPR/Cas9 - высокоточный молекулярный метод, способный внести точечный разрыв в необходимое место генома, меченное с помощью специально подобранной гидовой РНК, комплементарной затравки - мишени для Cas9. Впервые система редактирования с помощью CRISPR/Cas9 была использована для редактирования генома растений еще в 2013 году (Wenzhi J. at al., 2013). В ходе развития технологии редактирование гена RSR1 проводилось разными способами на таких культурах, как рис (Fiaz S. et al., 2019) и пшеница (Liu et al., 2016).

После проведения редактирования необходимо подтвердить наличие мутаций в каждом из сайтов редактирования для дальнейшей дифференциации растений на редактированные и нередактированные, во всех вышеперечисленных работах генетические модификации выявляли с помощью секвенирования следующего поколения (NGS).

Секвенирование следующего поколения (NGS) представляет собой мощный инструмент для исследования генетической информации, но оно также является трудоемким и дорогостоящим процессом по нескольким факторам. Во-первых, NGS генерирует огромные объемы данных, особенно при анализе целых геномов или больших наборов образцов, что требует значительных вычислительных ресурсов и времени для их обработки и анализа. Во-вторых, секвенирование требует использования дорогостоящего оборудования и химических реагентов, что увеличивает финансовые затраты на проведение исследований. В-третьих, эффективное использование NGS требует высокой квалификации и опыта в обработке данных и биоинформатике, что делает этот процесс трудоемким и зависящим от наличия опытного исполнителя. Наконец, анализ и интерпретация данных, полученных с помощью NGS, также являются сложными и времязатратными процессами.

Проведение каждой новой модификации представляет собой индивидуальный процесс, который обусловлен необходимостью подбора новых сайтов и гидовых последовательностей для проведения редактирования. В связи с этим каждое новое редактирование требует создания уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые фланкируют область редактирования и специфичны для данного эксперимента. Олигонуклеотиды, использованные ранее в аналогичных экспериментах, не подходят для выявления проведенного нами редактирования, так как в нашем случае использовались новые сайты редактирования, и их количество также отличалось от предыдущих работ.

Таким образом, существует потребность более простом, способе обнаружения изменений нуклеотидных последовательностей целевых генов, в частности гена RSR1, возникающих в геноме в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. Настоящее изобретение предлагает такой способ.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка способа выявления событий редактирования tghslRSRI у зерновых культур, который был бы более простым в осуществлении и менее трудоемким и финансово затратным.

Для решения этой задачи авторы предлагают использовать способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ГИДР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза.

Заявленный способ предусматривает использование набора олигонуклеотидных праймеров (олигонуклеотидов), которые фланкируют два сайта редактирования гена RSR1 (Фигура 1). Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже в Таблице 1 и в Перечне последовательностей.

Способ осуществляется путем проведения полимеразной цепной реакции с представленными в Таблице 1 олигонуклеотидами, визуализацией продукта с помощью капиллярного электрофореза и дальнейшем сравнении размера фрагментов контрольного образца (растение, которое не подвергалось редактированию) и редактированных растений. Благодаря точному определению длины амплифицированных фрагментов на капиллярном электрофорезе, сдвиг - разница в размере контрольного и исследуемых образцов показывает наличие редактирования у исследуемых растений и размер инсерций и делеций.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Расположение сайтов редактирования и олигонуклеотидов, используемых для выявления редактирования в этих сайтах на гене RSR1

Фигура 2. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR23 гена RSR1

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - делеция 1 bp (50%) и делеция 15 bp (50%), 1В - делеция 6 bp, 1R - делеция 3 bp (50%) и нет редактирования (50%)

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - делеция 1 bp (50%) и делеция 15 bp (50%), 1В - делеция 6 bp, 1R - делеция 3 bp (50%) и нет редактирования (50%).

Фигура 3. Фореграммы образцов тритикале с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR24 гена

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - делеция 4 bp, 1В - делеция 1 bp (50%) и инсерция 1 bp (50%), 1R - делеция 17 bp

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - делеция 4 bp, 1В - делеция 1 bp (50%) и инсерция 1 bp (50%), 1R - делеция 17 bp.

Фигура 4. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR23 гена RSR1

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - делеция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1В редактирования нет

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%), 1В редактирования нет

Фигура 5. Фореграммы образцов твердой пшеницы с парой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4 для выявления генетических модификаций в сайте редактирования RSR24 гена. RSR1

а) фореграмма контрольного (немодифицированного) образца

б) фореграмма исследуемого образца - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%)

в) картирование ридов исследуемого образца на референсную немодифицированную последовательность - выявлено редактирование: хромосома 1А - редактирования нет, 1В - инсерция 1 bp (50%) и редактирования нет (50%).

Осуществление изобретения (Примеры)

Настоящее изобретение было валидировано на растениях являющихся аллополиплоидами, а именно яровой и озимой тритикале и твердой пшенице, имеющих генотип с различающимися субгеномами (ABR в случае тритикале и АВ в случае твердой пшеницы).

Пример 1

На первом этапе проводилось выделение ДНК из 78 растений-регенерантов озимой и яровой тритикале прошедших редактирование гена RSR1. Выделение проводили из сухих листьев СТАВ-методом (Springer et al., 2010) модифицированным для зерновых культур. Для дальнейшей постановки ПНР олигонуклеотиды использовались в следующих комбинациях: SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 4.

ПЦР-амплификацию проводили по единому режиму для всех пар олигонуклеотидов (95°С - 3 мин; 95°С - 20 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 20 сек - 35 циклов; 72°С - 10 мин), в стандартной ПЦР-смеси (Mg2+2.5 мМ, dNTP 0.25 мМ) с добавлением 1 мкл ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. При постановке реакций в реакционную смесь так же добавляли 0.5 мкл ДМСО 100% для лучшей амплификации GC-богатых регионов. Продукты амплификации с ДМСО перед капиллярным форезом разводили дистиллированной водой в 20 раз с целью снижения концентрации солей для лучшего прохождения электрофореза.

Продукты амплификации визуализировали методом капиллярного электрофореза с помощью генетического анализатора Нанофор 05 в присутствии маркера молекулярного веса. Капиллярный электрофорез на генетическом анализаторе проводится в соответствии с руководством пользователя, предоставляемым производителем (Синтол, Россия). Параметры электрофореза зависели от длины капилляров и типа полимера, рекомендуемые параметры инжекции 1800 В, 5 секунд. Продукты амлификации, полученные в постановке ПЦР с олигонуклеотидами 1) SEQ ID NO: 1-2; 2) SEQ ID NO: 3-4 визуализировали на фрагментном анализе одновременно.

Результаты постановок - получившиеся профили образцов, проходившие редактирование сравнивали с профилем контрольного образца, не проходившего редактирование и за счет изменения размера фрагментов выявляли редактирование и его тип.

Далее все образцы были отправлены на NGS. Библиотеки для NGS были подготовлены по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System). Секвенирование проводилось на приборе Illumina MiSeq.

Для каждого секвенируемого образца длина прочтения, качество и количество ридов в полученных fastq-файлах оценивались с помощью программы FastQC 0.11.9. Первичная обработка ридов осуществлялась с помощью программы Trimmomatic-0.39. После тримминга fastq файлы конвертировались в fasta файлы, которые анализировались в программе Unipro UGENE 33.0.

Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев (Фигуры 2-3), что демонстрирует высокую эффективность и надежность метода в выявлении генетических изменений, данные результаты также подчеркивают перспективность и потенциал данного метода и его дальнейшего использования.

Пример 2

Данный набор олигонуклеотидов также был апробирован на 68 растениях твердой пшеницы, где продемонстрировал высокую эффективность и точность при выявлении редактирования. Выделение ДНК, ПЦР-амплификацию, постановку фрагментного анализа и NGS проводили аналогично Примеру 1. Полученные результаты фрагментного анализа совпали с результатами NGS в 100% случаев, чем подтверждают возможность его использования для быстрого обнаружения генетических модификаций в твердой пшенице и, вероятно, в других ценных сельскохозяйственных культурах (Фигуры 4-5).

Список литературы

Borisjuk et al. (10 Mart 2019 г.). Genetic Modification for Wheat Improvement: From Transgenesis to Genome Editing. Biomed Res Int.

Chen J. et al. (April 2021 г.). Towards targeted starch modification in plants. Current Opinion in Plant Biology.

Fiaz S. et al. (19 February 2019 г.). Applications of the CRISPR/Cas9 System for Rice Grain Quality Improvement: Perspectives and Opportunities. Int J Mol Sci.

Liu et al.. (23 September 2016 г.). Virus-Induced Gene Silencing Identifies an Important Role of the TaRSRl

Springer et al. (November 2010 г.). Isolation of Plant DNA for PCR and Genotyping Using Organic Extraction and СТАВ. Cold Spring Harbor Protocols.

Wenzhi J. at al. (1 November 2013 г.). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Research, p. 188.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень

последовательностей RSR1-2.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-11-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>RSR1-2</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>RSR1-2</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБНУ ВНИИСБ</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>All-Russia Research Institute of Agricultural

Biotechnology</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СОБЫТИЙ

РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНА RSR1 У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ НАБОРА

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgccgacataaacttcaacctc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttacttcttgccgaggaactgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caaattgaccttgggatgttcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cacgaactcctccttggacag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к генетическим маркерам, выявляющим генетические модификации гена RSR1, полученные с использованием CRISPR/Cas9 на геноме твердой пшеницы (Triticum durum) и озимой и яровой тритикале (×Triticosecale). Раскрыт способ, основанный на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами, фланкирующими сайт предполагаемого редактирования, с последующей детекцией результатов ПЦР с помощью капиллярного электрофореза. Изобретение позволяет выявлять события редактирования гена RSR1 у зерновых культур, возникающие в результате редактирования с помощью системы CRISPR/Cas9. 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ выявления событий редактирования в сайтах редактирования RSR23 и RSR24 гена RSR1 у зерновых культур, включающий в себя следующие этапы:

выделение геномной ДНК, параллельная постановка ПЦР-амплификации со следующими парами олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 4, визуализация при помощи капиллярного электрофореза, сравнение подвижности продуктов амплификации исследуемого и контрольного образца, полученного от растения, которое не подвергалось редактированию, и установление события редактирования в случае различия подвижности исследуемого и контрольного образца.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является пшеница.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что зерновой культурой является тритикале.