Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/861 C12N15/50 A61P31/14 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Созданы экспрессионные векторы на основе аденоассоциированного вируса, экспрессирующие рекомбинантные нейтрализующие антитела специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену (RBD) S-белка вируса SARS-CoV-2, предложено применение таких векторов для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.

Предшествующий уровень техники

Вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2 остаются серьезной проблемой для мирового здравоохранения, несмотря на наличия широкого спектра терапевтических и профилактических препаратов. Вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2 являются РНК-содержащими вирусами и имеют высокую степень генетической изменчивости, в следствие чего являются причиной возникновения тяжелых эпидемий и пандемий. Оба вируса способны передаваться воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактным способами и имеют тенденцию к быстрому распространению.

Грипп и COVID-19 могут протекать как в легкой, так и тяжелой форме. При этом тяжелые формы заболеваний чаще развиваются у пациентов старше 60 лет и имеющих хронические заболевания. Наиболее грозными осложнениями гриппа и COVID-19 являются - пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. При сочетанной инфекции вирусы гриппа и вирусы SARS-CoV-2 способны вызывать коморбидные состояния (Ozaras R, Cirpin R, Duran A, Duman H, Arslan O, Bakcan Y, Kaya M, Mutlu H, Isayeva L, Kebanlı F, Deger BA, Bekeshev E, Kaya F, Bilir S. Influenza and COVID-19 coinfection: Report of six cases and review of the literature. J Med Virol. 2020 Nov;92(11):2657-2665. doi: 10.1002/jmv.26125. Epub 2020 Jun 29. PMID: 32497283).

На сегодняшний день, основным способом контроля распространения гриппозной инфекции и инфекции COVID-19 является вакцинопрофилактика, которую дополняют противовирусные препараты. Сегодня зарегистрировано и находится на различных этапах клинических исследований большое количество вакцин как против гриппозной инфекции, так и против инфекции COVID-19. Однако такие вакцины действуют в отношении конкретно вируса гриппа или вируса SARS-CoV-2 и не способны эффективно защита против обоих вирусов одновременно. Кроме того, вакцины обеспечиваю формирование стойкого протективного иммунного ответа лишь через, как минимум, 14 дней после введения препарата. Таким образом, в первые две недели после вакцинации человек по-прежнему остается не защищенным. Таким образом, создание средства способного защищать от вируса гриппа и вируса SARS-CoV-2 в профилактическом режиме одновременно является актуальной задачей.

Известно решение (патент RU 2751485), где создан прототип вакцины против вируса гриппа А, вируса гриппа В и вируса COVID-19. Изобретение представляет собой комбинированную пентавалентную векторную вакцину против вируса гриппа А H1N1, H3N2, вируса гриппа В линий Виктория и Ямагата и вируса SARS-CoV-2 варианта альфа, на основе аденовируса человека 5 серотипа. Показана иммуногенность и протективность полученных рекомбинантных аденовирусов. Недостатком решения является относительная сложность в получении прототипа, так как необходимо наращивать, очищать и контролировать качество 5-ти рекомбинантных аденовирусов. Кроме того, последовательность S-белка вируса SARS-CoV-2 варианта альфа не является на сегодняшний день актуальной для создания вакцины, так как циркулирующие на данный момент штаммы вируса (XBB, BA.5, BA.X) генетически значительно далеки от варианта альфа.

Перспективным направление в создании противовирусных средств является получение моноклональных антител, специфичных к высоко консервативным участкам вирусных белков. Частным случаем моноклональных антител являются однодоменные антитела семейства верблюдовых, которые из-за наличия длинных петель CDR3 способны связывать труднодоступные эпитопы вирусных антигенов. Однако, недостатком моноклональных и особенно однодоменных антител является ограниченное время циркуляции в организме, вследствие чего они не подходят для продолжительной профилактики инфекционных заболеваний. В свою очередь вакцины индуцируют формирование иммунного ответа через определенный срок после введения, как правило несколько недель. Существует альтернативный способ пассивной иммунизации с применением аденоассоциированного вирусного вектора, обеспечивающего доставку и продолжительную экспрессию в организме антител заданной специфичности. Существуют данные об успешном применении такого подхода для индукции длительной защиты против ВИЧ [Casazza, J.P., Cale, E.M., Narpala, S. et al. Safety and tolerability of AAV8 delivery of a broadly neutralizing antibody in adults living with HIV: a phase 1, dose-escalation trial. Nat Med 28, 1022–1030 (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01762-x], вируса Эболы [Laura P. van Lieshout, Amira D. Rghei, Wenguang Cao, Shihua He, Geoff Soule, Wenjun Zhu, Sylvia P. Thomas, Debra Sorensen, Kathy Frost, Kevin Tierney, Brad Thompson, Stephanie Booth, David Safronetz, Raveendra R. Kulkarni, Byram W. Bridle, Xiangguo Qiu, Logan Banadyga, Sarah K. Wootton, AAV-monoclonal antibody expression protects mice from Ebola virus without impeding the endogenous antibody response to heterologous challenge, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, Volume 26, 2022, pages 505-518], Марбург вируса [Rghei, A.D., van Lieshout, L.P., Cao, W. et al. Adeno-associated virus mediated expression of monoclonal antibody MR191 protects mice against Marburg virus and provides long-term expression in sheep. Gene Ther (2022). https://doi.org/10.1038/s41434-022-00361-2] вируса гриппа [Adam VS, Crosariol M, Kumar S, Ge MQ, Czack SE, Roy S, Haczku A, Tretiakova A, Wilson JM, Limberis MP. Adeno-associated virus 9-mediated airway expression of antibody protects old and immunodeficient mice against influenza virus. Clin Vaccine Immunol. 2014 Nov;21(11):1528-33. doi: 10.1128/CVI.00572-14], а также интоксикации ботулотоксином типа А [Derkaev, A. A.; Ryabova, E. I.; Esmagambetov, I. B.; Shcheblyakov, D. V.; Godakova, S. A.; Vinogradova, I. D.; Noskov, A.N.; Logunov, D. Y.; Naroditsky, B. S.; Gintsburg, A. L. rAAV expressing recombinant neutralizing antibody for the botulinum neurotoxin type A prophylaxis. Front Microbiol 2022, 13:960937. doi: 10.3389/fmicb.2022.960937]. Выбор аденоассоциированного обусловлен его способностью трансдуцировать широкий спектр клеток мишеней, низкой иммуногенностью, безопасностью, а также длительной персистенцией в организме в виде эписомы.

В работе Del Rosario et al. (Del Rosario J.M.M.; Smith M, Zaki K.; Risley P.; Temperton N.; Engelhardt O.G.; Collins M.; Takeuchi Y.; Hufton S.E. Protection From Influenza by Intramuscular Gene Vector Delivery of a Broadly Neutralizing Nanobody Does Not Depend on Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity. Front Immunol. 2020, 11:627. doi: 10.3389/fimmu.2020.00627) получена рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса человека, экспрессирующие рекомбинантные антитела, специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А, а также, предложено их применение для долгосрочной профилактики гриппа А. Однако, в данном решении, существенным недостатком является использование Fc-фрагмента иммуноглобулина мыши в составе рекомбинантного антитела, который может быть иммуногенным при циркуляции в организме человека и вызывать тем самым побочные эффекты.

В патенте RU 2777404 получены аденоассоциированные вирусные векторы, экспрессирующие однодомененные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека. Показано, что введение таких векторов в эффективном количестве способно индуцировать защиту от летальной инфекции вирусом SARS-CoV-2 непосредственно после введения. Кроме того, показано, что такие аденоассоциированные вирусные векторы способные обеспечивать защиту против различных штаммов вируса SARS-CoV-2, том числе варианта Омикрон, в течении как минимум 9 месяцев после введения (Esmagambetov IB, Ryabova EI, Derkaev AA, Shcheblyakov DV, Dolzhikova IV, Favorskaya IA, Grousova DM, Dovgiy MA, Prokofiev VV, Gosudarev AI, Byrikhina DV, Zorkov ID, Iliukhina AA, Kovyrshina AV, Shelkov AY, Naroditsky BS, Logunov DY, Gintsburg AL. rAAV expressing recombinant antibody for emergency prevention and long-term prophylaxis of COVID-19. Front Immunol. 2023 Mar 30;14:1129245. doi: 10.3389/fimmu.2023.1129245. PMID: 37063833; PMCID: PMC10098153). Изобретение RU 2777404 было выбрано авторами в качестве прототипа. Однако прототип не способен обеспечивать защиту против вируса гриппа А.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового рекомбинантного антитела и экспрессионного вектора, способных обеспечить защиту от инфекций, вызываемых вирусом гриппа типа А и вирусом SARS-CoV-2 в профилактическом режиме одновременно.

Раскрытие изобретения

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала рекомбинантных вирусных векторов для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа типа А и вирусом SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в создании аденоассоциированных вирусных векторов, экспрессирующих рекомбинантные антитела, представляющие собой тетрамеризованные через глицин-сериновый линкер однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, специфичные к гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно. Данные аденоассоциированные вирусные вектора могут быть использованы для индукции пролонгированной экспрессии в организме указанных рекомбинантных антител. Кроме того, технический результат достигается тем, что созданные аденоассоциированные вирусные вектора могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А и различными штаммами вируса SARS-CoV-2.

Указанный технический результат достигается тем, что создан рекомбинантный аденоаcсоцированный вирусный вектор, несущий генетическую конструкцию SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14, экспрессирующую ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где одно однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, и другое однодоменное антитело имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, соответственно.

Также технический результат достигается тем, что экспрессируемое в составе вектора рекомбинантное антитело специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа А и рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно и таким образом обладает защитной активностью против вируса гриппа А и вируса SARS-CoV-2, одновременно.

Также технический результат достигается тем, что введение созданного препарата рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора в эффективном количестве обеспечивает продолжительную экспрессию в организме рекомбинантного антитела.

Разработан способ профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в эффективном количестве рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, экспрессирующего рекомбинантное антитело, специфически связывающее гемагглютинин вируса гриппа А и рецептор-связывающий домен RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 одновременно.

Также технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор rAAV2-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 или экспрессионный вектор rAAV2-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14 или экспрессионный вектор rAAV5-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 или экспрессионный вектор rAAV5-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-ого серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлено схематическое изображение рекомбинантного антитела Tetra1.

P2C5 – однодоменное антитело P2C5;

P1C6 – однодоменное антитело P1C6;

92 – однодоменное антитело 92;

23 – однодоменное антитело 23;

GS – глицин-сериновый линкер;

H – Шарнирный регион (Hinge) IgG1 человека;

Fc – Fc фрагмент IgG1 человека.

На фиг. 2 представлено схематическое изображение рекомбинантного антитела Tetra2.

92 – однодоменное антитело 92;

23 – однодоменное антитело 23;

P2C5 – однодоменное антитело P2C5;

P1C6 – однодоменное антитело P1C6;

GS – глицин-сериновый линкер;

H – Шарнирный регион (Hinge) IgG1 человека;

Fc – Fc фрагмент IgG1 человека.

На фиг. 3 представлены схематические изображения плазмид pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2.

E2A, E4, VA – гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации аденоассоциированного вируса;

REP – ген белков репликативного комплекса аденоассоциированного вируса 2-ого серотипа;

CAP2 – ген структурных белков аденоассоциированного вируса 2-ого серотипа;

CAP5 – ген структурных белков аденоассоциированного вируса 5-ого серотипа;

ITR – инвертированные концевые повторы генома аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа;

CMV – промотор цитомегаловируса человека;

Tetra1 и Tetra2 – гены соответствующих рекомбинантных антител;

Poly A – сигнал полиаденилирования.

На фиг. 4 представлены результаты иммуноблотинга, подтверждающего экспрессию рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе плазмид pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2 соответственно.

М – маркер молекулярного веса;

1 – образец культуральной жидкости не трансфецированных клеток (отрицательный контроль);

2 – образец культуральной жидкости клеток, трансфецированных плазмидой pAAV-Tetra1;

3 – образец культуральной жидкости клеток, трансфецированных плазмидой pAAV-Tetra2.

На фиг. 5 представлена электрофореграмма оценки чистоты и подлинности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.

М – маркер молекулярного веса;

1 – препарат rAAV5-Tetra1 после анионообменной хроматографии;

2 – препарат rAAV5-Tetra2 после анионообменной хроматографии;

3 – препарат rAAV2-Tetra1 после анионообменной хроматографии;

4 – препарат rAAV2-Tetra2 после анионообменной хроматографии;

5 – препарат rAAV5-Tetra1 после аффинной хроматографии;

6 – препарат rAAV5-Tetra2 после аффинной хроматографии;

7 – препарат rAAV2-Tetra1 после аффинной хроматографии;

8 – препарат rAAV2-Tetra2 после аффинной хроматографии;

9 – препарат rAAV5-Tetra1 после финального концентрирования;

10 – препарат rAAV5-Tetra2 после финального концентрирования;

11 – препарат rAAV2-Tetra1 после финального концентрирования;

12 – препарат rAAV2-Tetra2 после финального концентрирования;

VP1, VP2, VP3 – структурные белки аденоассоциированного вируса.

На фиг. 6 представлены результаты трансмиссионной электронной микроскопии фракции, содержащей преимущественно полные капсиды, препарата rAAV2-Tetra1.

Масштаб в 1 см – 50 нм.

На фиг. 7 представлены результаты трансмиссионной электронной микроскопии фракции, содержащей преимущественно пустые капсиды, препарата rAAV2-C.

Масштаб в 1 см – 50 нм.

На фиг. 8 изучение специфической активности рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2, экспрессируемых в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, в отношении гемагглютинина вируса гриппа А.

Ось ординат – уровень специфического сигнала ОД450нм;

ось абсцисс – название образцов культуральной жидкости.

rAAV5-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra1;

rAAV5-Tetra2 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra2;

rAAV2-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-Tetra1;

rAAV2-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-EGFP (отрицательный контроль);

rAAV5-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-EGFP (отрицательный контроль).

На фиг. 9 изучение специфической активности рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2, экспрессируемых в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, в отношении RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

Ось ординат – уровень специфического сигнала ОД450нм;

Ось абсцисс – название образцов культуральной жидкости.

rAAV5-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra1;

rAAV5-Tetra2 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-Tetra2;

rAAV2-Tetra1 – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-Tetra1;

rAAV2-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV2-EGFP (отрицательный контроль);

rAAV5-EGFP – образец культуральной жидкости клеток НЕК293, трансдуцированных препаратом rAAV5-EGFP (отрицательный контроль).

Осуществление изобретения

Для осуществления настоящего изобретения на первом этапе получали плазмидные системы необходимые для сборки рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов. Для этого, были использованы следующие плазмидные конструкции:

pHELP, несущая гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса;

pREP/CAP2, несущая гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа;

pREP/CAP5, несущая гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 5-го серотипа;

pAAV-Tetra1, несущая инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетическую конструкцию, экспрессирующую рекомбинантное антитело Tetra1;

pAAV-Tetra2, несущая инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетическую конструкцию, экспрессирующую рекомбинантное антитело Tetra2;

Специалистам в данной области известно, что для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать любые другие плазмидные системы. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоаcсоциированного вирусного вектора, несущего генетическую конструкцию, экспрессирующую ген рекомбинантного антитела Tetra1 и рекомбинантного антитела Tetra2.

Рекомбинантное антитело Tetra1 представляет собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где первое однодоменное антитело P2C5 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, второе однодоменное антитело P1C6 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, третье однодоменное антитело 92 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, и четвертое однодоменное антитело 23 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, соответственно. Схематичное изображение рекомбинантного антитела Tetra1 представлено на фиг. 1.

Рекомбинантное антитело Tetra2 представляет собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где первое однодоменное антитело 92 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, второе однодоменное антитело 12 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, третье однодоменное антитело P2C5 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и четвертое однодоменное антитело P1C6 имеет CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, соответственно. Схематичное изображение рекомбинантного антитела Tetra2 представлено на фиг. 2.

Также, специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательность рекомбинантного антитела , имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, либо имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, может содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре рекомбинантного антитела и не влияют на его способность связывать и нейтрализовать вирус гриппа А и вирус SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями.

Кроме того, специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, любые плазмидные системы могут быть использованы для получения рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора, содержащие последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность рекомбинантного антитела, имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9, либо имеющего CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12.

Все плазмидные конструкции получали в препаративных количествах путем трансформации клеток E. coli штамма Dh5α. После трансформации компетентных бактерий E.coli и их лизиса выделение суперскрученной ДНК проводили на наборе PlasmidSelect Xtra Starter Kit согласно инструкции производителя. После хроматографической очистки плазмидные ДНК переосаживали изопропиловым спиртом для избавления от ЭДТА и других составляющих буфера, способных к ингибированию процесса трансфекции.

Далее для получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов серотипа 2 rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, экспрессирующих рекомбинантные антитела соответственно вирусов Tetra1 и Tetra2, специфично связывающие гемагглютинин вируса гриппа А и RBD S белка вируса SARS-CoV-2, полученными плазмидами трансфецировали клеточную линию НЕК293, в которой происходила продукция и сборка рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, несущего гены рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно. Таким образом, для получения препарата rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 использовали плазмиды pHELP, несущую гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса, pREP/CAP2, несущую гены REP и CAP, аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа, pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, несущие инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетические конструкции, экспрессирующие рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно.

Для получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов серотипа 5 rAAV5-Tetra1 и rAAV5-Tetra2, экспрессирующих рекомбинантные антитела соответственно вирусов Tetra1 и Tetra2, специфично связывающие гемагглютинин вируса гриппа А и RBD S белка вируса SARS-CoV-2, полученными плазмидами трансфецировали клеточную линию НЕК293, в которой происходила продукция и сборка рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, несущего гены рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно. Таким образом, для получения препарата rAAV5-Tetra1 и rAAV5-Tetra2 использовали плазмиды pHELP, несущую гены аденовируса человека 5-ого серотипа, необходимые для репликации рекомбинантного аденоассоциированного вируса, pREP/CAP5, несущую ген REP аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и ген CAP аденоассоциированного вируса человека 5-го серотипа, pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, несущие инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированного вируса человека 2-го серотипа и генетические конструкции, экспрессирующие рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно.

Клетки НЕК293 культивировали в суспензионных условиях в биореакторе BIOSTAT RM 20/50 (Sartorius stedim biotech, Германия) с использованием BIOSTAT CultiBag RM (Sartorius stedim biotech, Германия) с использованием питательной среды BalanCD HEK293 (FujiFilm Irvine scientific, Нидерланды). Трансфекцию клеток указанными плазмидами осуществляли при помощи реагента PEI 25kDa (Polyscience, США).

Первичную очистку препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 осуществляли при помощи тангенцальной фильтрации с использованием системы AKTA Flux S и картриджа Hollow fiber 300 kDa (Cytiva, США) и аффинной хроматографии с использованием системы AKTA PURE 25 (Cytiva, США) и колонки, упакованной сорбентом AVB sepharose (Cytiva, США). Обогащение препаратов полными капсидами осуществляли при помощи системы AKTA PURE 25 (Cytiva, США) и монолитной колонки CIMmultusQA.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для продукции и сборки рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора можно использовать другие системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.

Далее, были изучены количественные и качественные характеристики препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, была изучена трансдуцирующая активность, чистота, подлинность, количество геномных копий и продукция рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных препаратов.

При изучении полученных препаратов rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 in vivo, была оценена экспрессия рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в сыворотке крови мышей, получивших препараты rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 соответственно.

Была подобрана эффективная доза препаратов rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, обеспечивающая 100 %-ную защиту от заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2 (варианты В.1.1.1 и Омикрон ВА.5) и 60 %.-ную защиту от заболевания, вызванного вирусом гриппа А подтипа H1N1.

Кроме того, разработан способ профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2 и вирусом гриппа А, заключающийся во введении млекопитающим в эффективной дозе препарата rAAV2-Tetra1.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмидных конструкций

Плазмиды pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2 наращивали в клетках E.coli. Для этого бактерии трансформировали целевыми плазмидами методом теплового шока. Компетентные клетки получали по стандартным протоколам. При проведении трансформации к компетентным клеткам штамма Dh5α добавляли 5-10 нг целевой плазмидной ДНК, инкубировали на льду 30 минут. После инкубации пробирку с клетками помещали в водяную баню при температуре 42 °C на 45 секунд. Затем инкубировали на льду в течение 10 минут, добавляли 1 мл среды SOB и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа на шейкер-инкубаторе. Впоследствии с помощью селективных антибиотиков их помещали в чашки Петри на твердую среду и инкубировали при 37 °С в течении ночи. После 16 часов инкубации отобранные колонии высевали в колбы с 100 мл среды LB и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 210 об/мин 16-18 часов при 37 °С.

Целевые плазмидные ДНК полученные из бактерий Е.coli штаммов DH5α выделяли с помощью 3-стадийной хроматографической очистки при помощи набора Plasmid select Xtra starter kit (Cytiva, США) и хроматографа AKTA pure 25 (Cytiva, США) или при помощи коммерческого набора PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США). Выделение выполняли согласно протоколу производителей. Результат оценивали с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле (0,8%). Визуализировали результаты с помощью системы гель-документирования Gel Doc EZ (Bio-Rad). Схематичные изображения плазмид представлены на фиг. 3.

Таким образом, в данном примере была получена система плазмидных векторов (pHELP, pREP/CAP2, pREP/CAP5, pAAV-Tetra1, pAAV-Tetra2), необходимая для продукции рекомбинантных аденоассоциированных вирусов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.

Пример 2. Подтверждение экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2

Для подтверждения экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе полученных плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2, проводили трансфекцию клеток СНО. Для этого клетки СНО рассевали в 12-луночный планшет в концентрации 1 млн клеток в лунку в 2 мл питательной среды BalanCD Tranfectory CHO (FujiFilm, Нидерланды). На следующий день проводили трансфекцию клеток плазмидами pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2. Трансфекционную смесь готовили на среде OptiMEM (HyClone, США). В качестве трансфецирующего агента использовали PEI (Polyscience, США). ДНК использовали в количестве 1 мкг/мл культуральной жидкости. Через 7 дней после трансфекции, культуральную жидкость анализировали в иммуноблоте с использованием анти-человеческих антител, меченных HRP - 933NA (Cytiva, США). Культуральную жидкость подвергали электрофорезу в ПААГ в восстанавливающих условиях, затем осуществляли перенос на цитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм (Bio-Rad, США). Далее мембрану блокировали раствором 5% сухого молока на ФСБ-Т и далее добавляли антитела 933NA 1 на 5000 на 1 час при комнатной температуре. Далее проводили 5-ти кратную отмывку и люминесцирующего субстрата. После, результаты детектировали прибором Amersham Imager 600 (Cytiva, США). В результате (фиг.4) в образцах культуральной жидкости (треки 2 и 3) были детектированы бэнды, соответствующие по молекулярной массе рекомбинантным антителам Tetra1 и Tetra2 в восстанавливающих условиях (около 80 кДа). В отрицательном контроле (трек 1), специфических полос детектировано не было.

Таким образом, в примере 2 была подтверждена экспрессия рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе плазмид pAAV-Tetra1 и pAAV-Tetra2 соответственно.

Пример 3. Продукция и очистка препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2

Для получения препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, полученные в примере 1 плазмиды трансфецировали в культуру клеток линии HEK293. Для этого суспензионную культуру клеток HEK293 культивировали в среде BalanCD HEK293 (Fujifilm Irvine Scientifics, Нидерланды) приготовленной согласно инструкции производителя. Для культивации использовали колбы Эрленмейера с вентилируемой крышкой объемами 125, 500 и 1000 мл (Corning) с помощью шейкер-инкубатора Multitron (Infors HT) со скоростью перемешивания 110 об/мин при амплитуде 50 мм. В условиях культивирования использовали 37 °С, 80% влажности и 5% CO₂. Пассажи проводили при достижении концентрации клеток 2-3*10⁶ кл/мл. Далее клеточную суспензию засевали в одноразовый культуральный мешок BIOSTAT CultiBag RM и культивировали до достижения объема культуральной жидкости 9 л и концентрации 0,7-1,0*10⁶ клеток на мл. Далее проводили трансфекцию с использованием трансфецирующего агента PEI linear 25 kDa (Polyscience). Конечная концентрация ДНК, используемая для трансфекции, составляла 1 мкг/мл культуральной среды. В качестве среды для трансфекции использовали Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium (Gibco™, Thermo Fisher Scientific) в объеме 10% от конечного клеточной суспензии. Трансфецирующий агент использовали в концентрации 1 мг/мл. Объем PEI к ДНК брали в соотношении 4:1. Процентное содержание плазмидных ДНК составляло pHELP – 50%, pREP/CAP2 или pREP/CAP5 – 25%, pAAV-Tetra1 или pAAV-Tetra2 – 25% соответственно. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре 5-10 минут для образования транфецирующего комплекса. После, смесь вносили в одноразовый биореактор. После трансфекции клетки культивировали в течение 3 суток со скоростью качания 12-20 в минуту, сатурации 40-70%, рН=7-7,4. Скорость потока воздуха от 0,2 до 0,5 л/мин и содержание СО₂ в воздушной смеси 5%.

Таким образом, в результате проделанной работы была получена клеточная суспензия содержащая рекомбинантные аденоассоциированные вирусные частицы rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 соответственно, содержащие гены рекомбинантных антител, Tetra1 и Tetra2.

Пример 4. Очистка препарата rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2

По истечении 3 дней культивирования проводили лизис клеточной суспензии добавлением в биореактор 1% твин-20, трис-HCl до 20 мМ, хлорида натрия до 50 мМ, хлорида магния до 2 мМ, бензонуклеаза (Merck) 20U на мл культуральной жидкости. Лизис проводили при комнатной температуре в течении 4 часов при скорости качания 12 в минуту. После лизиса проводили осветление культуральной жидкости при помощи фильтрации через глубинные фильтры Sartoclear depth filter cassette 0,08 кв. м. 0,8/0,2 мкм (Sartorius Stedim Biotech, Германия).

Далее осветленный лизат подвергали концентрированию и диафильтрации буфером 20 мМ трис, 150 мМ натрия хлорид, 2 мМ магния хлорид, 0,001 % полоксомер 188, рН=8. Концентрирование и диафильтрацию проводили на установке AKTA flux S с использованием кассеты Hollow fiber 300 кДа, 4800 см. кв. в соотношении 50/5.

Дальнейшую чистку rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 проводили с использованием сорбента AVB Sepharose (Cytiva Life Sciences, Швеция) согласно инструкции производителя. Пример электрофореграммы очищенных препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 представлен на фиг. 2. Полученный препарат концентрировали с использованием центрифужных концентраторов 50 кДа Amicon Ultra-15 (Merck, Германия) до объема 1-2 мл. Обогащение препаратов полными капсидами проводили при помощи анионообменной хроматографии с использованием монолитной колонки CIMmultusQA 1 мл. Образец после аффинной хроматографии разбавляли в 20 раз буфером 20 мМ Бис-трис пропан, 10 мМ магния хлорид, 0,001 % полоксомер 188, рН=9. Отделение пустых и полных капсидов осуществляли при помощи линейного градиента (50 колоночных объемов) буфера 20 мМ Бис-трис пропан, 10 мМ магния хлорид, 250 мМ хлорид натрия, 0,001 % полоксомер 188, рН=9. Количество полных и пустых капсидов в полученных препаратах оценивали при помощи трансмиссионной электронной микроскопии. Результаты трансмиссионной электронной микроскопии образцов анионообменной хроматографии представлены на фиг. 3 и 4. Далее фракции с высоким содержанием полных капсидов стерилизовали мембранным фильтром 0,22 мкм (MF-Millipore) и использовали в дальнейшей работе. Концентрацию вирусных частиц (препарата) оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) при длине волны 260 нм. Препарат замораживали и хранили при -70°С. Для определения титра геномных копий в полученных препаратах использовали набор AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2 согласно инструкции производителя.

Таким образом, в данном примере были получены очищенные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 в количестве достаточном для проведения экспериментов in vivo и iv vitro.

Пример 4. Изучение чистоты и подлинности препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2

Для оценки чистоты и подлинности, полученных препаратов препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, применяли метод электрофореза в ПААГ. Для этого очищенный препарат вносили в 4-20% полиакриламидном геле (4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 μl #4561096, Bio-Rad) с использованием красителя для образцов 4x Laemmli Sample Buffer (#161-0747, BioRad) с добавлением 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) для анализа в восстанавливающих условиях. Визуализацию геля проводили при помощи прибора Gel Doc EZ imager (Bio-Rad, США). В результате в препаратах препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 были детектированы белки VP1, VP2 и VP3, значимого количества примесей детектировано не было. Электрофореграмма результатов анализа представлена на фиг. 5.

Из полученных результатов следует, что полученный препарат действительно является аденоассоциированным вирусом, так в нем присутствуют все структурные белки, а именно VP1, VP2, VP3. Молекулярные массы белков полностью совпадают с теоретическими.

Кроме того, при анализе препаратов методом трансмиссионной электронной микроскопии (фиг. 6 и 7) показано, что в образцах присутствуют частицы размером около 22 нм формы икосаэдра, что соответствует теоретическим размерам и форме аденоассоциированного вируса. На фиг. 6 представлена фотография электронной микроскопия фракции, содержащей преимущественно полные капсиды, а на фиг. 7 представлена фотография электронной микроскопия фракции, содержащей преимущественно пустые капсиды, отличающиеся от полных наличием затемнения в центре.

Таким образом, в данном примере была подтверждена чистота и подлинность препаратов препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.

Пример 5. Оценка трансдуцирующей способности rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 и экспрессии рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2

Для оценки трансдуцирующей способности и экспрессии трансгена (рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2) антител в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, очищенным препаратом трансдуцировали культуру клеток HEK293. Для этого на 96-луночный планшет высевали клетки в среде DMEM (4 мМ глутамина, 10% FBS, бикарбонат натрия 3,8 г/л) в объеме 100 мкл с концентрацией 0,5*10⁶ клеток/мл. Спустя 4 часа вносили от 5 до 10 мкл препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 (по 10⁷ гк/лунка). Спустя 72 часа отбирали культуральную жидкость для дальнейшего анализа. Присутствие рекомбинантных антител Tetra1 и Tetra2 соответственно, оценивали при помощи метода ИФА. Для этого в лунки 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный RBD вируса SARS-CoV-2 (100 нг/лунку) или рекомбинантным стеблевым доменом гемагглютинина вируса гриппа А (100 нг/лунку). Затем, планшет отмывали 3-х кратно раствором PBS-T и далее инкубировали 30 мин при комнатной температуре с раствором обезжиренного молока на PBS-T. Далее вносили культуральную жидкость от клеток, трансдуцированных полученными препаратами, в нескольких повторах. Планшет с образцами инкубировали в течении 30 мин при 37 °С и далее проводили 3-кратную отмывку. После добавляли раствор вторичных антител 933 NA (GE life science, США). Планшет с образцами снова инкубировали в течении 30 мин при 37 °С и далее проводили 5-кратную отмывку. Далее добавляли субстрат ТМВ на 15 мин, после чего реакцию останавливали добавлением раствора 1М соляной кислоты. Оптическую плотность измеряли при 450 нм. Результаты представлены на фиг.8 и 9.

Из полученных результатов следует, что клетки, трансдуцированные препаратами rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2, экспрессируют рекомбинантные антитела Tetra1 и Tetra2, соответственно, специфичные к RBD S белка вируса SARS-CoV-2 (фиг. 9) и гемагглютинину вируса гриппа А (фиг. 8).

Таким образом, в данном примере была подтверждена экспрессия рекомбинантных антител, специфичных к RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и гемагглютинину вируса гриппа А, в составе препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2.

Пример 6. Изучение протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса SARS-CoV-2

Протективную активность препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2 вариант В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10⁷ TCID50/мл и 3,5х10⁷ БОЕ/мл. Животным вводили внутримышечно в заднюю поверхность бедра 10¹¹ гк препарата и далее заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID₅₀ на животное, через 7 дней после введения препарата, согласно табл.1.

Табл. 1. Результаты изучения протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса вирус SARS-CoV-2

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе 10⁵TCID50 Оценка эффективности (%, выживаемсоти) rAAV5-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 5 шт. 80 rAAV5-Tetra2 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 5 шт. 60 rAAV2-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 5 шт. 100 rAAV2-Tetra2 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 5 шт. 80 Плацебо - в/м За 7 дней до заражения 5 шт. 0

В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.

Полная гибель зараженных животных, получивших плацебо, наблюдалась к 5 суткам после инфицирования. Выживаемость в группах животных, получивших rAAV5-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 составила 80%, в группе животных, получивших rAAV5-Tetra2 составила 60% и, наконец, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra1, составила 100%.

Таким образом, в данном примере было продемонстрировано, что разработанные препараты препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для защиты от заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2. Наибольшей протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2 В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) обладает препарат rAAV2-Tetra1.

Пример 7. Изучение протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса гриппа А

Протективную активность препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом гриппа А, у мышей линии BALB/c статуса СПФ (свободны от патогенной микрофлоры), полученные из питомника «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.

В работе использовали вирус гриппа A/California/04/2009 (H1N1), адаптированный для мышей, полученный в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Животным вводили внутримышечно в заднюю поверхность бедра 10¹¹ гк препарата и далее заражали вирусом гриппа А интраназально в дозе 5ЛД50 на животное, через 7 дней после введения препарата, согласно табл.2.

Табл. 2. Результаты изучения протективной активности препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 против летальной дозы вируса гриппа А

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе 5ЛД50 Оценка эффективности (%, выживаемсоти) rAAV5-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 10 шт. 40 rAAV5-Tetra2 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 10 шт. 50 rAAV2-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 10 шт. 60 rAAV2-Tetra2 10¹¹ гк/мышь в/м За 7 дней до заражения 10 шт. 70 Плацебо - в/м За 7 дней до заражения 10 шт. 0

В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.

Полная гибель зараженных животных, получивших плацебо, наблюдалась к 14 суткам после инфицирования. Выживаемость в группе животных, получивших rAAV5-Tetra1, составила 40%, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra2, составила 50%, в группе животных, получивших rAAV5-Tetra1 составила 60% и, наконец, в группе животных, получивших rAAV2-Tetra2, составила 70%.

Таким образом, в данном примере было продемонстрировано, что разработанные препараты препаратов rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для защиты от заболевания, вызванного вирусом гриппа А. Наибольшей протективной активностью в отношении вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1) обладает препарат rAAV2-Tetra2.

Пример 8. Cпособ профилактики заболеваний, вызванных различными вариантами вируса SARS-CoV-2

Для дальнейшего изучения протективной активности был выбран препарат rAAV2-Tetra1 как наиболее перспективный. Эффективность препарата rAAV2-Tetra1 против COVID-19 в режиме профилактики оценивали также на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта В.1.1.1 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020), а также варианта ВА.5 (hCoV-19/Russia/SPE-RII-25357S/2022), у АСЕ2-трансгенных мышей. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID₅₀ на животное, через 6 месяцев после введения препарата rAAV2-Tetra1 в дозе 10¹¹ гк/мышь. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Табл. 3. Результаты экспериментального изучения эффективности препарата rAAV2-Tetra1 в режиме профилактики

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе 10⁵TCID50 Оценка эффективности (% выживаемости ) rAAV2-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 6 месяцев до заражения варианта В.1.1.1 5 шт. 100 rAAV2-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 6 месяцев до заражения варианта ВА.5 5 шт. 100 Плацебо - в/м За 6 месяцев до заражения варианта В.1.1.1 5 шт. 0 Плацебо - в/м За 6 месяцев до заражения варианта ВА.5 5 шт. 40

В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.

По результатам исследования было показано, что однократное внутримышечное введение препарата rAAV2-Tetra1 в дозе от 10¹¹ гк/животное позволяет защитить животных от инфекции, вызванной различными штаммами (вариантами) вируса SARS-CoV-2, в режиме профилактики как минимум в течение 6 месяцев.

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для экстренной профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-CoV-2.

Пример 9. Cпособ профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А

Эффективность препарата rAAV2-Tetra1 против вируса гриппа А в режиме профилактики оценивали на модели инфекции мышей линии BALB/c вирусом гриппа A/California/04/2009 (H1N1) адаптированным для мышей. Животных заражали вирусом гриппа А интраназально в дозе 5ЛД50 на животное, через 6 месяцев после введения препарата rAAV2-Tetra1 в дозе 10¹¹ гк/мышь. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Табл. 4. Результаты экспериментального изучения эффективности препарата rAAV2-Tetra1 в режиме профилактики

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе 5ЛД50 Оценка эффективности (% выживаемости ) rAAV2-Tetra1 10¹¹ гк/мышь в/м За 6 месяцев до заражения 10 шт. 100 Плацебо - в/м За 6 месяцев до заражения 10 шт. 0

В течение 21 дня после заражения оценивали выживаемость животных.

По результатам исследования было показано, что однократное внутримышечное введение препарата rAAV2-Tetra1 в дозе от 10¹¹ гк/животное позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом гриппа А подтипа H1N1, в режиме профилактики как минимум в течении 6 месяцев.

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные препараты rAAV5-Tetra1, rAAV5-Tetra2, rAAV2-Tetra1 и rAAV2-Tetra2 могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа А.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность и промышленную применимость созданных векторов на основе аденоассоциированного вируса человека 2-ого и 5-ого серотипов, экспрессирующих рекомбинантные антитела и обладающих защитными свойствами против инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, а также инфекции, вызванной вирусом гриппа А.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="rAAV-Tetra.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-10-26">

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное Государственное

Бюджетное Учреждение «Национальный исследовательский центр

эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»

Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budget Institution, National

Research Center for Epidemiology and Microbiology Named after

Honorary Academician N.F. Gamaleya of the Ministry of Health of the

Russian Federation</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Экспрессионный вектор на основе

аденоассоциированного вируса, несущий гены рекомбинантных антител, и

его применение для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом

гриппа А и вирусом SARS-CoV-2</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>14</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GYTYCSYD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IIRRDGST</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>15</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..15</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>KSWACSSGEYLYQGD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GFLFRATD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AIDREGSH</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GVGTYTGGSR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>11</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..11</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GYISNYRNLKR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>VINSGGTS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AAGWVQPGRELNDSAYTY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GRIFRTYD</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RISWSGGS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lama sp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>NADPSSVVGAIGAGYVY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="13">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2379</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2379</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggt

ctctgagactctcctgtgtagcgtctggatacacctactgcagttacgacatgagttggtaccgccaggc

tccagggaaggagcgcgagttcgtttcaattattcgccgtgatggttctacggcgtacacagacgccgtg

aagggccgattcgccatctcccgagacaacgccaagaacacactgtatctgcaaatgaacagcctggaac

ctgaggacacggccatgtattactgtaaatcttgggcttgcagcagcggtgaatacttgtatcagggcga

ctggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggc

ggcggctcaggcggaggaggttcccaggtgcagctggtgcagtctgggggaggctcggtgcaggctggag

ggtctctgacactctcctgtaaagattctccttaccgcatctataaccgctacatggcgtggttccgcca

acttccaggacaggcgcgcgagggggttgcggcaatcgatagtcagggtaggacaacctacgcagactcc

gtgaaaggccggttcaccatctccaaagacaacgccgccaacactctaaatctgcaaatccacagcctga

aagttgaggacactgccatgtactactgtgcggcagatgttgtcttctaccaggaaccctatcctctcgc

accaacttcgtataagcattggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggtggtggcggatcaggt

ggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctggtggagtctgggggag

gctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgcgcagcctctggatacatatctaactatcgtaa

tctcaagcgcatggggtggttccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagttattaacagc

ggtggtactagtactagttattccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgacaaga

acacgatttatctgcaaatgctcagcctgaaagctgaggacagtgcgatatactactgtgcggccggctg

ggtgcagccgggccgggaacttaacgatagtgcgtatacgtactggggccaggggacccaggtcaccgtc

tcctcaggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgagg

tgcagctggtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctc

tggacgcattttccgaacgtatgacatgggctggtaccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtc

gcacgaattagttggagtggtggtagcacaaactatgcagacttcgtgaagggccggttcaccatctcca

aagacagcgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattt

ctgtaatgcagatccctccagcgtcgttggggcaatcggcgcgggatatgtctactggggccaggggacc

caggtcaccgtctcctcagaacctaagtcctgtgacaagacccacacctgtccaccttgtcctgctccag

agctgcttggaggtccaagcgtgttcctgtttcctcccaaacctaaggacaccctgatgatctccaggac

accagaagtgacctgtgtcgttgtggacgtctctcacgaggatcctgaggtgaagttcaactggtatgtg

gatggtgtggaggtccacaatgccaagaccaaacccagagaggaacagtacaacagcacctacagagtcg

tgagtgtgttgaccgtgctgcatcaagactggctgaatggcaaggaatataagtgcaaagtgagcaacaa

agcacttcctgctcccatcgagaagaccatctccaaagccaaaggacaacctagagaacctcaagtctac

accctgccaccctccagagaagagatgaccaaaaaccaagtgtctctgacctgtcttgtcaaaggcttct

atccctctgacattgctgtggagtgggagagcaatggacaacctgagaacaactataagaccacaccacc

tgtcctggacagtgatggctccttctttctgtatagtaagctgacagtggacaagagcaggtggcagcaa

ggcaatgtcttctcctgcagtgtgatgcatgaagccttgcacaaccactacacccagaagagcctgtctt

tgtctcctggcaagtgataa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="14">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>2379</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..2379</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggt

ctctgagactctcctgcgcagcctctggatacatatctaactatcgtaatctcaagcgcatggggtggtt

ccgccaggctccagggaaggagcgcgagggggtcgcagttattaacagcggtggtactagtactagttat

tccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacgacaagaacacgatttatctgcaaatgc

tcagcctgaaagctgaggacagtgcgatatactactgtgcggccggctgggtgcagccgggccgggaact

taacgatagtgcgtatacgtactggggccaggggacccaggtcactgtctcctcaggtggtggcggatca

ggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctggtggagtcggggg

gaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcattttccgaacgta

tgacatgggctggtaccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtcgcacgaattagttggagtggt

ggtagcacaaactatgcagacttcgtgaagggccggttcaccatctccaaagacagcgccaagaacacgg

tgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtatttctgtaatgcagatccctccag

cgtcgttggggcaatcggcgcgggatatgtctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcaggt

ggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttccgaggtgcagctgg

tggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgtagcgtctggatacac

ctactgcagttacgacatgagttggtaccgccaggctccagggaaggagcgcgagttcgtttcaattatt

cgccgtgatggttctacggcgtacacagacgccgtgaagggccgattcgccatctcccgagacaacgcca

agaacacactgtatctgcaaatgaacagcctggaacctgaggacacggccatgtattactgtaaatcttg

ggcttgcagcagcggtgaatacttgtatcagggcgactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

ggtggtggcggatcaggtggaggtggatctggcggcggcggctcaggcggaggaggttcccaggtgcagc

tggtgcagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgacactctcctgtaaagattctcctta

ccgcatctataaccgctacatggcgtggttccgccaacttccaggacaggcgcgcgagggggttgcggca

atcgatagtcagggtaggacaacctacgcagactccgtgaaaggccggttcaccatctccaaagacaacg

ccgccaacactctaaatctgcaaatccacagcctgaaagttgaggacactgccatgtactactgtgcggc

agatgttgtcttctaccaggaaccctatcctctcgcaccaacttcgtataagcattggggccaggggacc

caggtcaccgtctcctcagaacctaagtcctgtgacaagacccacacctgtccaccttgtcctgctccag

agctgcttggaggtccaagcgtgttcctgtttcctcccaaacctaaggacaccctgatgatctccaggac

accagaagtgacctgtgtcgttgtggacgtctctcacgaggatcctgaggtgaagttcaactggtatgtg

gatggtgtggaggtccacaatgccaagaccaaacccagagaggaacagtacaacagcacctacagagtcg

tgagtgtgttgaccgtgctgcatcaagactggctgaatggcaaggaatataagtgcaaagtgagcaacaa

agcacttcctgctcccatcgagaagaccatctccaaagccaaaggacaacctagagaacctcaagtctac

accctgccaccctccagagaagagatgaccaaaaaccaagtgtctctgacctgtcttgtcaaaggcttct

atccctctgacattgctgtggagtgggagagcaatggacaacctgagaacaactataagaccacaccacc

tgtcctggacagtgatggctccttctttctgtatagtaagctgacagtggacaagagcaggtggcagcaa

ggcaatgtcttctcctgcagtgtgatgcatgaagccttgcacaaccactacacccagaagagcctgtctt

tgtctcctggcaagtgataa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая экспрессионный вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, применение экспрессионного вектора для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, и иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор. В одном варианте реализации экспрессионный вектор несет ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека. Изобретение расширяет арсенал средств для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 9 пр.

1. Экспрессионный вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, несущий ген рекомбинантного антитела, представляющего собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом IgG1 человека, где одно однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и другое однодоменное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.

2. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой:

(а) рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа или (б) рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа.

3. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14, кодирующие рекомбинантные антитела, представляющие собой тетрамеризованные глицин-сериновыми линкерами однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека.

4. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессируемое в его составе рекомбинантное антитело специфично связывает гемагглютинин вируса гриппа А.

5. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессируемое в его составе рекомбинантное антитело специфично связывает рецептор-связывающий домен RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

6. Экспрессионный вектор по п. 1, отличающийся тем, что его введение млекопитающим в эффективном количестве обеспечивает продолжительную экспрессию в организме рекомбинантного антитела, специфичного гемагглютинину вируса гриппа А и рецептор-связывающему домену RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

7. Экспрессионный вектор по пп. 4-6, отличающийся тем, что его введение млекопитающим в эффективном количестве обеспечивает длительную защиту от заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.

8. Применение экспрессионного вектора по пп. 1-7 для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2.

9. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызываемых вирусом гриппа А и вирусом SARS-CoV-2, содержащее экспрессионный вектор по пп. 1-7.

10. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV2-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.

11. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV2-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 2-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.

12. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV5-Tetra1, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13.

13. Иммунобиологическое средство по п. 9, отличающееся тем, что содержит экспрессионный вектор rAAV5-Tetra2, представляющий собой рекомбинантный аденоассоциированный вирус 5-го серотипа и содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14.