КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ НАКОПЛЕНИЯ, АГРЕГАЦИИ И ОБРАЗОВАНИЯ КЛУБКОВ ТАУ-БЕЛКА Российский патент 2024 года по МПК A61K48/00 A61K35/30 A61K38/17 A61P25/00 A61P25/16 A61P25/28 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка и, более конкретно, к методике ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка посредством введения генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1 для индукции экспрессии данных генов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой хроническое нейродегенеративное заболевание, имеющее симптомы, чаще всего включающие потерю памяти, затруднения с языком, нарушение когнитивных функций, резкие перепады настроения и т.д.

Болезнь Альцгеймера нейропатологически отличается присутствием бляшек в клетках, нервных тканях, сосудах мозга, и нейрофибриллярных клубков (NFT), образующихся в результате накопления тау-белка. Болезнь Альцгеймера также отличается образованием скоплений или бляшек амилоида β и потерей синапсов и т.д. Причина для большинства случаев Альцгеймера все еще остается неизвестной. Кроме того, до сих пор не было лечения против болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера служит причиной самых обычных случаев деменции, действуя в качестве главной причины смерти, наряду с сердечнососудистыми заболеваниями и раком. Прогнозируется, что частота болезни Альцгеймера будет возрастать со средней продолжительностью жизни людей.

Кроме того, для принятия комплекса мер и лечения пациентов с болезнью Альцгеймера требуются огромные расходы с пациентами, страдающими от значительного ментального расстройства. Следовательно, существует потребность в эффективном способе предупреждения и лечения пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера.

В том, что касается болезни Альцгеймера, большое количество исследований в недавнее время было сосредоточено на тау-белке. В самом деле, уровень тау в спинномозговой жидкости возрастает на продромальной стадии болезни Альцгеймера, и данный повышенный уровень стабильно поддерживается на протяжении прогрессирования данного заболевания после его начала. NFT, который представляет собой гиперфосфорилированный тау-белок, обнаруживается с ранней стадии болезни Альцгеймера, и его уровень стабильно возрастает с прогрессированием данного заболевания. То есть, опосредованные тау повреждение и дисфункция нейронов являются патологическими находками у большинства пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера. NFT также является биомаркером других таупатий, таких как лобно-височная деменция (FTD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), болезнь Пика, хроническая травматическая энцефалопатия (СТЕ) и т.д., помимо AD. Терапевтические продукты против данных заболеваний до сих пор оставались неразработанными.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Приводящее к настоящему раскрытию исследование, проведенное авторами настоящего изобретения, привело к экспериментальным данным о том, что экспрессия транскрипционных факторов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного Nurr1, введенных в мозговые клетки, ингибировала накопление, агрегацию или клубки тау-белков. В частности, при экспрессии Nurr1 в комбинации с соактиватором Foxa2 обнаружили то, что данные два гена имеют мощный синергический эффект ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка. В некоторых воплощениях также обнаружили то, что экспрессия одного Nurr1 имеет существенные эффекты ингибирования тау-белка.

Следовательно, одним аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащей вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или один ген Nurr1.

Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования фосфорилирования тау-белка, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для ингибирования фосфорилирования тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurrl и Foxa2 или геном Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения таупатий, причем данная композиция содержит вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для предупреждения или лечения таупатий, причем данная композиция содержит нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

Решение проблемы

Авторы настоящего изобретения осуществили исследовательские попытки, относящиеся к способам ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, который известен как главная причина таупатий. В результате авторы настоящего изобретения открыли, что введение генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1, с последующей экспрессией данных генов оказывало эффекты ингибирования накопления, агрегации или образования нейрофибриллярных клубков (NFL) тау-белка и фосфорилирования тау-белка.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, ия содержащая вектор, несущий ген Nurr1, но не ген Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или образованием клубков тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенным в них геном Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий ген Nurr1.

Согласно одному воплощению настоящего раскрытия таупатия представляет собой заболевание, выбранное из группы, состоящей из тау-позитивной болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви, лобно-височной деменции (FTD), мультиинфарктной деменции (MID), лобно-височной лобарной дегенерации (FTLD), прогрессирующего надъядерного паралича (PSP), болезни Пика, хронической травматической энцефалопатии (СТЕ), кортикобазальной дегенерации (CBD), глобулярной глиальной таупатий, болезни Гентингтона, ганглиоглиомы, ганглиоцитомы, первичной возрастной таупатий (PART), заболевания, характеризующегося появлением аргирофильных зерен, свинцовой энцефалопатии, липофусциноза, болезни Литико-Бодига и менингиоангиоматоза, но не ограничивается ими.

В настоящем раскрытии ген Foxa2, наряду с геном Nurr1 можно использовать в предупреждении и лечении болезни Альцгеймера, которая представляет собой тип таупатий. Обнаружили то, что экспрессия посредством введения Nurr1 и Foxa2 или введения одного Nurr1 облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера. Данные патологические симптомы могут включать (1) накопление тау-белка, (2) накопление бета-амилоида, 3) старение клеток мозга, 4) потерю синапсов и 5) накопление периферических иммунных клеток. Кроме того, совместная экспрессия Nurr1 и Fox2 или экспрессия одного Nurr1 приводила к нейротрофикации клеток мозга и, таким образом, продемонстрировала эффекты предупреждения и лечения болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий.

В одном воплощении способа по настоящему раскрытию выражение «введение (трансдуцирование) Nurr1 и Foxa2» относится к введению нуклеиновых кислот, совместно кодирующих два данных гена, в клетки мозга. Два данных гена могут вводиться отдельно или одновременно.

В способе по настоящему раскрытию выражение «введение (трансдуцирование) Nurr1» относится к введению нуклеиновой кислоты, кодирующей ген Nurr1, в клетки мозга.

Для введения генов, кодирующих Nurr1 и/или Foxa2, в клетки мозга можно использовать технические способы введения гена в клетки, которые хорошо известны в данной области, например, анализ осаждения ДНК-кальций, способ с использованием липосом, способ с использованием полиаминов, способ электропорации, способ с использованием ретровируса, способ с использованием аденовируса, способ с использованием аденоассоциированного вируса (AAV) и тому подобные.

Можно использовать вирусные или невирусные векторы, когда они несут Nurr1 и/или Foxa2. Примеры вирусных векторов включают аденоассоциированные вирусы (AAV), аденовирусы, ретровирусы и/или лентивирусы. Примеры невирусных векторов включают молекулы РНК, плазмиды, липосомные комплексы, молекулярные конъюгаты и/или белки генных ножниц (CRISPR, например, Cas9). Следовательно, введение Nurr1 и/или Foxa2 согласно настоящему раскрытию охватывает, в качестве одного воплощения, вставку нуклеиновых кислот, кодирующих Nurr1 и Foxa2, в разные экспрессионные векторы или в один экспрессионный вектор и затем вставку данного(ных) экспрессионного(ных) вектора(ров) в клетки мозга.

В некоторых воплощениях осуществления экспрессии Nurr1 и/или Foxa2 можно использовать методики редактирования генов. Методики редактирования генов используются для демонстрации целевого генетического признака посредством свободного корректирования генетической информации живого организма. Примеры системы, которую можно использовать в методиках генетического редактирования, включают нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN) и короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas 9).

Термин «направляемая РНК нуклеаза» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеазе, которая может распознавать и расщеплять в конкретном положении в целевом геноме, и, в частности, относится к нуклеазе, имеющей специфичность в отношении мишени посредством РНК-проводника. Данная направляемая РНК нуклеаза может представлять собой, но, в частности, не ограничивается белком Cas, происходящим из микробной иммунной системы CRISPR, и, более конкретно, направляемая РНК нуклеаза может включать нуклеазу на основе ассоциированного с CRISPR белка 9 (Cas9) и ее вариант - Cas9 никазу.

Термин «белок Cas» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к главному белковому компоненту системы CRISPR/Cas и представляет собой белок, который может действовать в качестве активированной эндонуклеазы. Белок Cas может образовать комплекс совместно с РНК CRISPR (крРНК) и транс-активирующей крРНК (тракрРНК) с демонстрацией его активности.

Нуклеаза Cas9 распознает специфическую нуклеотидную последовательность в геноме животных и растительных клеток, включая человеческие клетки, вызывая, посредством этого двухнитевой разрыв (DSB). Двухнитевой разрыв охватывает расщепление двухцепочечной ДНК с образованием тупого конца или липкого конца. DSB эффективно репарируются в клетках механизмом гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ), и в данной процедуре исследователем может быть введена в целевой сайт желательная мутация. Направляемая РНК нуклеаза может представлять собой искусственную или сконструированную не встречающуюся в природе направляемую РНК нуклеазу.

Cas9 никаза может включать одну или более чем одну мутацию в одном из ее каталитических доменов, где данная одна или более чем одна мутация выбрана из группы, состоящей из D10A, Е762А и D986A в домене RuvC, или одна или более чем одна мутация выбрана из группы, состоящей из Н840А, N854A и N863A в домене HNH. Никаза Cas9, в отличие от нуклеазы Cas9, вызывает однонитевой разрыв. Следовательно, используют две РНК-проводника, которые обеспечивают работу Cas9 никазы и функционируют в виде пары. Данные две РНК-проводника направляют специфичное в отношении последовательности связывание комплекса CRISPR с каждой целевой последовательностью, и направляют расщепление одной нити дуплекса ДНК около каждой целевой последовательности с индукцией двух однонитевых разрывов в разных нитях ДНК.

Белок Cas или информация о гене могут быть получены из известной базы данных, такой как GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI). В частности, белок Cas может представлять собой белок Cas9. Кроме того, белок Cas может представлять собой белок Cas, происходящий из рода Staphylococcus, рода Streptococcus, рода Neisseria, рода Pasteurella, рода Francisella или рода Campylobacter, и, более конкретно, белок Cas9 рода Staphylococcus, но не ограничиваясь ими. Однако настоящее раскрытие не ограничивается вышеописанными примерами. В настоящем раскрытии белок Cas может представлять собой рекомбинантный белок.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, могут использоваться без ограничения, при условии, что данные нуклеиновые кислоты имеют нуклеотидные последовательности, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, как известно в данной области. Также данные нуклеиновые кислоты могут иметь нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие функциональные эквиваленты Nurr1 и/или Foxa2. Функциональные эквиваленты относятся к полипептиду, имеющему гомологию последовательности (или идентичность) по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80% с аминокислотными последовательностями Nurr1 и/или Foxa2. Например, данные функциональные эквиваленты могут включать полипептид, имеющий гомологию последовательности 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Данный функциональный эквивалент может быть получен в результате присоединения, замены или делеции части каждой из аминокислотных последовательностей. Делеция или замена аминокислот предпочтительно находится в области, которая непосредственно не ассоциирована с физиологической активностью полипептида по настоящему раскрытию.

Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белок Nurr1 и/или Foxa2, могут быть получены с использованием способа генной инженерии, известного в данной области. Примеры способов генной инженерии включают ПЦР-амплификацию для осуществления амплификации нуклеиновых кислот из генома, химический синтез или методику получения последовательности кДНК.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии и, таким образом, могут быть вставлены в экспрессионный вектор. Термин «связанный функциональным образом» означает то, что один фрагмент нуклеиновой кислоты связывается с другим фрагментом нуклеиновой кислоты таким образом, что функция или экспрессия одного фрагмента нуклеиновой кислоты подвергается влиянию другого фрагмента нуклеиновой кислоты. Кроме того, термин «последовательность контроля экспрессии» означает последовательность ДНК, которая контролирует экспрессию связанной функциональным образом последовательности нуклеиновой кислоты в конкретной клетке-хозяине. Такая последовательность контроля включает промотор для инициации транскрипции, последовательность любого оператора для осуществления контроля транскрипции, последовательность для кодирования подходящего сайта связывания рибосомы с мРНК и последовательность для осуществления контроля терминации транскрипции и трансляции. Все из данных последовательностей, в общем, могут быть выражены как «ДНК-конструкция, включающая нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurrl и/или Foxa2».

Термин «экспрессионный вектор» относится к плазмиде, вирусному вектору или другим посредникам, в которые могут быть вставлены нуклеиновые кислоты, кодирующие структурные гены, и в которых данные нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться в клетках-хозяевах, как известно в данной области. В одном воплощении экспрессионный вектор может представлять собой вирусный вектор. Примеры вирусных векторов включают аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе вируса оспы птиц, лентивирусные векторы и тому подобные, но не ограничиваются ими. В особенности, предпочтительными являются способы с использованием аденоассоциированного вируса (AAV) или лентивируса.

Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) конструируют введением материалов, способных к образованию вируса, в конкретные клетки, и лентивирусные векторы конструируют посредством нескольких стадий таким образом, что вирусы могут быть получены в конкретной линии клеток. Главными преимуществами векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV) или лентивирусных векторов для генотерапии являются эффективность и стабильность.

Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновые кислоты по настоящему раскрытию, может быть введен в клетки мозга известным в данной области способом, например, временной трансфекцией, микроинъекцией, трансдукцией, слиянием клеток, осаждением фосфатом кальция, опосредованной липосомами трансфекцией, опосредованной DEAE декстраном трансфекцией, опосредованной полибреном трансфекцией, электропорацией, генной пушкой и другими известными способами, используемыми для введения нуклеиновых кислот в клетки, но не ограничиваясь ими. Например, гены Nurr1 и/или Foxa2 могут быть вставлены в AAV или лентивирусный вектор для конструирования экспрессионного вектора, и данный вектор затем трансдуцируется в упаковывающие клетки. Трансдуцированные упаковывающие клетки инкубируют и затем фильтруют с получением раствора AAV или лентивируса, и данный раствор используют для инфицирования клеток мозга, нейронов и/или клеток-предшественников нейронов, вводя, посредством этого, гены Nurr1 и/или Foxa2 в клетки мозга. Затем, после подтверждения того, что Nurr1 и/или Foxa2 экспрессируются одни или одновременно с использованием селективного маркера, включенного в AAV или лентивирусный вектор, можно получать желательные клетки мозга.

Согласно одному воплощению клетки мозга с введенными и экспрессируемыми в них генами Nurr1 и Foxa2 можно получать способом, включающим следующие стадии:

(a) конструирование рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК-конструкцию, имеющую нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и Foxa2;

(b) трансфицирование линии клеток, продуцирующей вирус, рекомбинантным вирусным вектором с получением рекомбинантного вируса, экспрессирующего Nurr1 и Foxa2; и

(c) инфицирование клеток мозга рекомбинантным вирусом, экспрессирующим Nurr1 и Foxa2.

Во-первых, ДНК-конструкцию, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и Foxa2, получают, как описано выше.

Согласно одному воплощению клетки мозга с введенным и экспрессируемым в них Nurr1 могут быть получены способом, включающим следующие стадии:

(a) конструирование рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК-конструкцию, имеющую нуклеиновую кислоту, кодирующую Nurr1;

(b) трансфицирование линии клеток, продуцирующей вирус, рекомбинантным вирусным вектором с получением рекомбинантного вируса, экспрессирующего Nurr1; и

(c) инфицирование клеток мозга рекомбинантным вирусом, экспрессирующим Nurr1.

ДНК-конструкция, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую Nurr1 и/или Foxa2, также может быть получена, как описано выше.

Данная ДНК-конструкция может быть связана функциональным образом с последовательностью контроля экспрессии, например, с промотором, и вставлена в вирусный вектор, известный в данной области, конструируя, посредством этого, рекомбинантный вирусный вектор. Затем данный рекомбинантный вирусный вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, кодирующие Nurr1 и/или Foxa2, вводится в продуцирующую вирус линию клеток, получая, посредством этого, рекомбинантный вирус, экспрессирующий Nurr1 и/или Foxa2. Линию клеток, продуцирующую вирус, соответствующий используемому вирусному вектору, можно использовать в качестве линии клеток, продуцирующей вирус. Затем клетки мозга инфицируются рекомбинантным AAV или лентивирусом, экспресирующим Nurr1 и Foxa2 или Nurr1. Это может проводиться с использованием любых способов, известных в данной области.

Клетки мозга, экспрессирующие белки Nurr1 и/или Foxa2 согласно настоящему раскрытию, могут пролиферировать и инкубироваться любым способом, известным в данной области.

Клетки мозга по настоящему раскрытию инкубируются в культуральной среде, которая помогает выживанию или пролиферации желательного типа клеток мозга. Предпочтительно используется культуральная среда, часто пополненная свободными аминокислотами вместо сыворотки. Данную культуральную среду предпочтительно дополняют добавкой, разработанной для непрерывной инкубации клеток мозга. Примеры данной добавки включают среду N2 и добавку В27, которые имеются в продаже у Gibco, бычью сыворотку и тому подобные. Во время инкубации данную среду предпочтительно заменяют свежей средой при соблюдении условий для среды и клеток. В данном случае клетки мозга можно субкультивировать при непрерывной пролиферации клеток мозга до конфлюентности с образованием нейросфер. Субкультивирование может проводиться приблизительно каждые 7-8 суток, в зависимости от конкретного протокола и наблюдаемых характеристик роста данных клеток.

Как описано в данном документе введение и экспрессия Nurr1 и/или Foxa2 в клетках мозга облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий, такие как (1) накопление бета-амилоида, (2) накопление тау-белка, (3) старение клеток мозга, (4) потеря синапсов и (5) накопление периферических иммунных клеток, и приводит к нейротрофикации клеток мозга и, таким образом, помогает предупреждать и лечить болезнь Альцгеймера, которая является видом таупатий. Экспрессия Nurr1 и Foxa2 или Nurr1 облегчает патологические симптомы болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий, и демонстрирует эффекты предупреждения и лечения болезни Альцгеймера, которая является видом таупатий.

В другом аспекте согласно настоящему раскрытию предложено применение клеток мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 для лечения таупатий.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложено применение клеток мозга с введенным в них Nurr1 для лечения таупатий.

Например, данные клетки можно терапевтически использовать посредством прямого введения клеток мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 или Nurr1 в место черного вещества, в зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению. Кроме того, клетки мозга с введенными в них Nurr1 и Foxa2 или Nurrl, можно терапевтически использовать посредством введения или трансплантации в виде композиции, содержащей их терапевтически эффективное количество. Настоящее раскрытие также включает способ лечения таупатий.

Один аспект настоящего раскрытия относится к композиции, генотерапевтическому средству или средству клеточной терапии, содержащему клетки мозга с введенными в них Foxa2 и Nurrl или Nurr1 в качестве активного ингредиента, для предупреждения или лечения заболевания (например, болезни Альцгеймера), вызванного накоплением, агрегацией или NFL тау-белка.

Данное генотерапевтическое средство или средство клеточной терапии по настоящему раскрытию предупреждает накопление тау-белка и/или бета-амилоида и защищает клетки мозга, включая нейроны и глию, от повреждения, посредством этого обеспечивая пополнение (регенерацию) или новое построение (восстановление) нейронов, связанных с памятью.

Термин «регенерация» относится к пополнению потерянной части образованного органа или индивида, и термин «восстановление», который может именоваться «воссоздание», относится к реконструкции ткани и к реконструкции вновь ткани или органа из клеток или тканей, которые один раз были разъединены.

Композицию или средство клеточной терапии по настоящему раскрытию можно готовить в виде подходящего препарата посредством включения приемлемого носителя, в зависимости от способа введения. Известны подходящие препараты для разных способов введения, и они могут включать препараты, которые типично проходят через мембрану и облегчают миграцию.

Кроме того, композиция по настоящему раскрытию может использоваться в виде обычного медицинского препарата. Парентеральный препарат может быть получен в виде стерильного водного раствора, неводного растворителя, суспендирующего средства, эмульсии или лиофилизирующего средства. Для перорального введения композиция по настоящему раскрытию может быть приготовлена в виде таблетки, пастилки, капсулы, эликсира, суспензии, сиропа или облатки. Для инъекций данная композиция может быть приготовлена в однодозовой ампуле или многодозовом контейнере. Кроме того, композицию для лечения по настоящему раскрытию можно вводить совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Например, для перорального введения можно использовать связующее вещество, смазку, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергирующее средство, стабилизатор, суспендирующее средство, краситель, отдушку или тому подобные. Для инъекций можно использовать буфер, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотоничный агент, стабилизатор или тому подобные. Для местного введения можно использовать субстрат, эксципиент, смазку, консервант или тому подобные.

Кроме того, способ лечения таупатий посредством применения композиции для лечения по настоящему раскрытию может включать введение субъекту или пациенту посредством общего пути, в котором вводится заданное вещество подходящим способом. Примеры способа введения включают внутричерепное введение, внутрижелудочковое ведение, введение в позвоночный канал, внутрибрюшинное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, внутрикожное введение, пероральное введение, местное введение, введение в нос, внутрилегочное введение и ректальное введение, но не ограничиваются ими. Однако данная пероральная композиция может расщепляться в клетках при пероральном ведении, и, следовательно, предпочтительным является то, что активное лекарственное средство является покрытым, или пероральную композицию готовят в виде препарата для защиты от деградации в желудке.

Данная фармацевтическая композиция также может вводиться любым устройством, которое может доставлять активное вещество в клетку-мишень. Предпочтительные способы введения и препараты включают инъекцию в гиппокамп с использованием стереотактической системы, внутрижелудочковую инъекцию, инъекцию в спинномозговую жидкость, внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию, внутримышечную инъекцию или капельную инъекцию. Данные инъекции можно получать с использованием водного растворителя, такого как физиологический раствор или раствор Рингера, и неводного растворителя, такого как растительное масло, сложный эфир высшей жирной кислоты (например, этилолеат), спирт (например, этанол, бензиловый спирт, пропиленгликоль или глицерин). Данные инъекции могут содержать фармацевтический носитель, такой как стабилизатор для предупрежения порчи (например, аскорбиновая кислота, гидросульфит натрия, пи рол а кто сульфат натрия, ВНА (бутилированный гидроксианизол), токоферол, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и т.д.), эмульгатор, буфер для регулировки рН, консервант для ингибирования микробного роста (например, фенилртутинитрат, тиомерсал, бензалкония хлорид, фенол, крезол, бензиловый спирт и т.д.). Предпочтительно способ лечения таупатий посредством применения композиции для лечения по настоящему раскрытию включает введение композиции для лечения по настоящему раскрытию в фармацевтически эффективном количестве. Данное фармацевтически эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области согласно факторам, хорошо известным в области медицины, включающим тип заболевания, возраст, массу тела, здоровье и пол субъекта (пациента), чувствительность субъекта (пациента) к лекарственному средству, путь введения, способ введения, число введний, период лечения, смешивание, лекарственное(ные) средство(ва), используемое(мые) в комбинации.

Другой аспект настоящего раскрытия относится к способу лечения заболевания (например, болезни Альцгеймера), вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, включающему прямую трансплантацию в место поражения композиции, содержащей клетки мозга с введенными в них Foxa2 и Nurr1 или Nurr1 в терапевтически эффективном количестве. Трансплантацию и инкубацию клеток можно проводить с использованием известных способов, которые широко известны специалисту в данной области.

Термин «терапевтически эффективное количество» клеток относится к достаточному количеству для прекращения или облегчения физиологического эффекта у субъекта или пациента, вызванного таупатией. Терапевтически эффективное количество использованных клеток может зависеть от нужд субъекта (пациента), возраста, физиологического состояния и здоровья субъекта (пациента), заданного терапевтического эффекта, размера и области ткани, нуждающейся в лечении, тяжести поражения и выбранного пути доставки. Кроме того, низкая клеточная доза клеток может вводиться в один или более чем один сайт в заданной целевой ткани в виде маленьких многочисленных трансплантатов. Клетки по настоящему раскрытию могут быть полностью выделенными перед трансплантацией, например, с образованием суспензии одиночных клеток, или могут быть почти полностью выделенными перед трансплантацией, например, с образованием маленьких агрегатов клеток. Данные клетки могут вводиться посредством пересадки или перемещения такой суспензии или маленьких агрегатов клеток в заданный сайт ткани, реконструируя или регенерируя функционально недостаточную область.

Для субъекта или пациента может правильно использоваться подходящий интервал дозы клеток, подлежащих введению, для достижения терапевтической эффективности в пределах обычной квалификации специалиста в данной области. Например, интервал дозы клеток может находиться в интервале приблизительно от 1000 до 1000000000 или более, но не эффективном для низкой дозы, и может не исключать возможности побочных действий для высокой дозы, и, следовательно, от 100000 до 50000000 может быть предпочтительным.

Однако доза клеток может быть наконец правильно определена решением лечащего врача при рассмотрении типа препарата, способа введения, возраста или массы субъекта (пациента), симптомов пациента и тому подобного, но настоящее раскрытие не ограничивается ими.

Подходящая доза композиции по настоящему раскрытию варьирует, в зависимости от таких факторов, как способ получения, способ введения, возраст, масса тела или пол субъекта (пациента), тяжесть заболевания, пища, время введения, путь введения, скорость выведения и чувствительность ответа, и врач обычной квалификации может легко принять решение и прописать эффективную дозу для желательного лечения. В общем, фармацевтическая композиция по настоящему раскрытию содержит от 1×10³ до 1×10¹³ гв (геномы вектора)/мкл вирусного вектора или вирусного гена и может типично инъецироваться в дозе от 1×10⁶ до 3×10¹⁵ гв/дозу вирусного вектора или вирусного гена от одного до пяти раз, и для длительных эффектов, инъекцию можно вновь проводить аналогичным способом после нескольких месяцев или нескольких лет.

В настоящем раскрытии данную композицию можно использовать в виде описанного выше медицинского препарата.

В настоящем раскрытии термин «генотерапевтическое средство» относится к лекарственному средству, где в человеческий организм вводится генетический материал или носитель, несущий генетический материал, с целью лечения заболевания или тому подобного.

Для композиции по настоящему раскрытию, которая применима в качестве генотерапевтического средства, фармацевтически приемлемый носитель является стерильным и биосовместимым. Следовательно, можно использовать одно или более чем одно из физиологического раствора, стерильной воды, раствора Рингера, буферизованного физиологического раствора, инъекционного раствора альбумина, раствора декстрозы, раствора мальтодекстрина, глицерина, этанола и их комбинации, по мере необходимости, могут быть добавлены другие типичные добавки, такие как антиоксидант, буфер и бактериостатический агент. Также в композицию дополнительно добавляют разбавитель, диспергент, поверхностно-активное вещество, связующее вещество и смазку, которая затем может быть приготовлена в инъецируемый препарат, такой как водный раствор, суспензия или эмульсия, пилюля, капсула или таблетка. Кроме того, антитела или другие лиганды, специфичные в отношении органа-мишени, могут связываться с носителем таким образом, что данный носитель может действовать специфично в отношении органа-мишени.

Вышеописанное содержание может быть применимым или может соответствовать композиции, за исключением того, что прямо используется вектор, экспрессирующий Nurr1 и Foxa2 или Nurr1, вместо клеток мозга, экспрессирующих Nurr1 и Foxa2 или Nurr1.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложен способ предупреждения или лечения таупатий, включающий введение субъекту композиции, содержащей клетки мозга, трансформированные Nurr1 и Foxa2 или только Nurr1, в терапевтически эффективном количестве.

Полезные эффекты изобретения

Характеристики и преимущества настоящего раскрытия обобщаются следующим образом.

(a) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1l и Foxa2 или ген Nurr1.

(b) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

(c) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

(d) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для ингибирования фосфорилирования тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

(e) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

(f) Согласно настоящему раскрытию предложена композиция для предупреждения или лечения заболевания, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

(g) Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2 или ген Nurr1.

(h) Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения таупатий, содержащая нейроны или глию с введенными в них генами Nurr1 и Foxa2 или геном Nurr1.

(i) Ингибитор и композиция по настоящему раскрытию при применении могут использоваться в предупреждении или лечении мозгового нервного заболевания, такого как болезнь Альцгеймера, вызванного накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Приведенные выше и другие аспекты, характеристики и преимущества настоящего раскрытия будут более очевидными из следующего подробного описания, взятого в сочетании с сопровождающими графическими материалами, в которых:

На ФИГ. 1 показана методика анализа системы доставки генов с использованием вируса AAV9;

На ФИГ. 2 показаны результаты анализа доставки генов (уровни экспрессии GFP (зеленый флуоресцентный белок) в гиппокампе и желудочке головного мозга) с использованием вируса AAV9;

На ФИГ. 3 показаны результаты иммуноокрашивания, которые подтверждают флуоресценцию бета-амилоида и тау-белка в области гиппокампа мышей, у которых гены Nurrl и Foxa2 были введены в клетки мозга;

На ФИГ. 4 показаны результаты иммуноокрашивания, которые подтверждают флуоресценцию тау-белка и фосфорилированного тау-белка (фосфор-тау, pTau) в области гиппокампа мышей, у которых гены Nurr1 и Foxa2 были введены в клетки мозга;

На ФИГ. 5 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);

На ФИГ. 6 показаны результаты анализа Y лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);

На ФИГ. 7 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (записанная картина движения) мышей, которым был инъецирован Nurrl - и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);

На ФИГ. 8 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (расстояние до цели) мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);

На ФИГ. 9 показаны результаты анализа водного лабиринта, в котором сравнивается поведенческий индикатор (средняя скорость) мышей, которым был инъецирован Nurr1- и Foxa2-AAV9 вирус, и поведенческий индикатор мышей, которым был инъецирован контрольный вирус (GFP-AAV9);

На ФИГ. 10 показаны изображения, показывающие результаты иммуноокрашивания с использованием фосфорилированного тау-белка (p-tau) и Tuj1 в контрольной группе с введением PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), группе с введением одного Nurr1 или группе с совместным введением Nurr1 и Foxa2 у 3xFAD трансгенных (Tg) мышей; и

ФИГ. 11 представляет собой график, иллюстрирующий результаты иммуноокрашивания с использованием фосфорилированного тау-белка (p-tau) и Tuj1 в контрольной группе с введением PBS, группе с введением одного Nurrl или группе с совместным введением Nurr1 и Foxa2 у 3xFAD Tg мышей.

Наилучший способ осуществления изобретения

Композиция для ингибирования накопления, агрегации или спутывания тау-белка, содержащая вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2.

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее раскрытие будет более подробно описано со ссылкой на примеры. Данные примеры служат только для более конкретной иллюстрации настоящего раскрытия, и для специалистов в данной области было бы очевидно, что объем настоящего раскрытия не ограничивается данными примерами согласно сущности настоящего раскрытия.

Термины, используемые в данном документе, определяются следующим образом.

Термин «клетки мозга» относится к клеткам, расположенным в мозгу, и данные клетки мозга состоят из нейронов (клеток-нейронов), глии (глиальных клеток) и тому подобного.

Термин «нейрон» относится к клеткам из центральной системы, и термины «нейрон» и «клетка-нейрон» можно использовать в данном документе взаимозаменяемо.

Термин «глиальные клетки» относится к клеткам, которые составляют наибольшую часть клеток, присутствующих в мозгу, и глиальные клетки включают астроциты или микроглиальные клетки.

Астроциты участвуют в защите и подаче питания к нейронам и в воспалении, и микроглиальные клетки представляют собой клетки, ответственные за воспаление в мозгу, и известны как группа клеток, которые играют важную роль в мозговых заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера.

Термин «трансдукция» относится к процессу, в котором генетический признак передается от одной клетки к другой клетке посредством бактериофага. Когда любой тип бактерий инфицируется бактериофагом, фаговая ДНК связывается с ДНК хозяина. При высвобождении фагов посредством лизиса клеток из бактериальных клеток часто высвобождаются бактериофаги, содержащие некоторую ДНК хозяина, а не некоторую из их собственной ДНК. При инфицировании других бактерий такими фагами ген предыдущего хозяина вновь вводится в бактерию таким образом, что данная бактерия может иметь новый признак. Термин «трансдукция» в биологическом исследовании обычно относится к способу, при котором конкретный экзогенный ген вводится и экспрессируется в клетках-мишенях с использованием вирусного вектора.

Термин «ингибирование накопления, агрегации или клубков» включает идеи, охватывающие случаи, где накопление, агрегация или клубки тау-белков и/или амилоида β ингибируются посредством предупреждения их продукции, и случаи, где накопление, агрегация или клубки уже продуцированных тау-белков и/или амилоида β ингибируются посредством деградации.

Термин «субъект» может относиться к позвоночному, подлежащему анализу в отношении лечения, наблюдения или экспериментов, предпочтительно к млекопитающему, например, к корове, свинье, лошади, козе, собаке, кошке, крысе, мыши, кролику, морской свинке, человеку или тому подобным.

Термин «образец ткани или клетки» относится к набору аналогичных клеток, полученных из ткани субъекта или пациента. Источником образца ткани или клеток может быть свежелиофилизированный и/или консервированный образец органа или ткани, или солидная ткань из биопсии или аспирата; кровь или любые компоненты крови; или клетки в оптимальное время беременности или развития мишени. Данный образец ткани может представлять собой первичные или культивируемые клетки, или линию клеток.

Термин «лечение» относится к подходу для получения полезных или предпочтительных клинических результатов. Для цели настоящего раскрытия полезные или предпочтительные клинические результаты охватывают, без ограничения, временное облегчение симптома, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (то есть, отсутствие ухудшения) болезненного состояния, задержку прогрессирования заболевания или уменьшение скорости прогрессирования заболевания, (частичное или общее) улучшение, временное смягчение или облегчение болезненного состояния, возможность быть либо выявляемым, либо невыявляемым и тому подобное. Кроме того, термин «лечение» может относиться к увеличению коэффициента выживаемости по сравнению с ожидаемым коэффициентом выживаемости, когда субъект не получает лечения. Термин «лечение» указывает все типы способов, такие как терапевтическое лечение и профилактические или предупредительные меры. Лечения включают лечения, требующиеся против расстройств, подлежащих предупреждению, или уже развившихся расстройств. Термин «временное облегчение» расстройства относится к уменьшению степени болезненного состояния и/или нежелательного клинического симптома, и/или к откладыванию или удлинению течения прогрессирования заболевания по сравнению с расстройствами, не подвергавшимися лечению.

Термин «генотерапевтическое средство» относится к лекарственному средству, в котором генетический материал или носитель, несущий генетический материал, вводится в организм человека с целью лечения заболевания или тому подобного.

Термин «средство клеточной терапии» относится к лекарственному средству (согласно правилам U.S. FDA (Управление США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств)), используемому с целью лечения, диагностики и профилактики с использованием клеток и тканей, полученных посредством выделения из человека, культивирования и специальной манипуляции, то есть, к лекарственному средству, используемому с целью лечения, диагностики и профилактики посредством серии действий пролиферации и отбора живых аутологических, аллогенных или ксеногенных клеток in vitro для восстановления функций клеток или тканей или изменения биологических характеристик клеток другим способом. Средства клеточной терапии, главным образом, классифицируются на терапевтические средства на основе соматических клеток и терапевтические средства на основе стволовых клеток, в зависимости от уровня дифференциации клеток.

Термин «млекопитающее», нуждающееся в лечении, относится к любому животному, классифицируемому в качестве млекопитающего, включая человека, домашний скот и сельскохозяйственных животных, животное для зоопарков, спорта или домашних животных, таких как собака, лошадь, кошка, крупный рогатый скот или обезьяна. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.

Термин «введение» относится к введению композиции по настоящему раскрытию субъекту или пациенту с применением любого подходящего способа. Композиция по настоящему раскрытию может вводиться посредством разных путей перорального или парентерального введения, при условии, что данная композиция может достигнуть ткани-мишени. Данная композиция может вводиться внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, местно, в нос, внутрилегочно и ректально, но настоящее раскрытие не ограничивается ими.

Здесь термин «эффективное количество» относится к желательному количеству, требующемуся для задержки или полного прерывания начала или прогрессирования определенного заболевания, подлежащего лечению. В настоящем раскрытии данная композиция может вводиться в фармацевтически эффективном количестве. Специалисту в данной области было бы очевидно то, что правильное количество используемой ежесуточно композиции определяется медицинским лечением в пределах интервала точного медицинского решения.

Для цели настоящего раскрытия конкретное терапевтически эффективное количество для определенного субъекта или пациента предпочтительно применяется по-разному согласно разным факторам, включающим типы и степени реакций, которые следует достигнуть, конкретную композицию, включающую то, используется ли другой препарат согласно обстоятельствам, возрасту, массе, общему физическому состоянию, полу и диете субъекта (пациента), времени и пути введения, скорости секреции композиции, продолжительности лечения и лекарственным средствам, вводимым совместно или используемым в то же самое время наряду с конкретной композицией, и аналогичные факторы, хорошо известные в области медицины.

Если не определено иначе, все технические термины, используемые в настоящем раскрытии, имеют такие же значения, которые являются обычно понятными специалисту в области, к которой относится настоящее раскрытие. Кроме того, предпочтительные способы или образцы раскрываются в данном описании изобретения, и аналогичные или эквивалентные способы или образцы также включаются в объем настоящего раскрытия. Содержание всех публикаций, раскрытых в данном документе в качестве ссылок, включается в данный документ.

Пример 1: исследование эффекта лечения таупатий и облегчения снижения когнитивных функций (способности к обучению и памяти) посредством введения гена Nurr1 и Foxa2

Материалы и метод

(1) Уход за животными и эксперименты

Все методики для экспериментов на животной модели 3xFAD были одобрены Институциональным комитетом по уходу и применению животных (IACUC) в Ханьянском колледже медицины (Hanyang College of Medicine) под номером одобрения 2018-0047А. Кроме того, все методики для экспериментов на животной модели 3xFAD проводили согласно руководствам по применению экспериментальных животных в Ханьянском университете (Hanyang University). Животных содержали в помещении с барьерами, свободном от специфических патогенов, с циклом 12-часового света/темноты и поддерживали на стандартном корме (5053 PicoLab®Rodent Diet 20). Размеры животных для настоящих экспериментов определяли посредством анализов in vitro и пилотного анализа настоящих экспериментов без предшествующих статистических расчетов. Данные эксперименты проводили согласно руководству NIH (Национальные институты здравоохранения). Для минимизации отклонения поведенческие анализы, главным образом, анализировали два экспериментатора способом эксперимента вслепую. В экспериментах использовали трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 и 15 месяцев.

(2) Стереотаксическая инъекция AAV в модельную мышь с болезнью Альцгеймера

Трансгенным мышам с болезнью Альцгеймера (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 месяцев (18 мес.) и в возрасте 15 месяцев (15 мес.) инъецировали вирусные векторы, содержащие Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс Foxa2-AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 10¹² вг/мкл, группа Nurr1+Foxa2), или Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс контрольный AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 5×10¹¹ вг/мкл, группа одного Nurr1), или контрольной группе, имеющей один вирус AAV9 (2 мкл, 10¹² вг/мкл, только контрольная группа), в гиппокамп (1,5 мм позади брегмы; плюс/минус 1 мм латерально от срединной линии; -2 мм вентрально по отношению к твердой мозговой оболочке) и в мозговой желудочек (0,9 мм позади брегмы; плюс/минус 1,7 мм латерально от срединной линии; -2,2 мм вентрально по отношению к твердой мозговой оболочке) за 10 минут под анестезией, индуцированной золетилом 50 (0,1 мг/кг), смешанным с ромпумом (93,28 мкг/кг). Иглу (26 калибра) оставляли в месте инъекции на 5-10 минут после завершения каждой инъекции и медленно удаляли. При подтверждении неточной инъекции в места гиппокампа и мозгового желудочка (ICV) данных мышей исключали из анализа.

(3) Продукция вируса

Лентивирусные векторы, экспрессирущие Nurr1 или Foxa2 под контролем промотора CMV (цитомегаловирус), получали посредством вставки соответствующих кДНК в сайт множественного клонирования pCDH (System Biosciences, Mountain View, CA). Лентивирусные векторы pGIPZ-shNurr1 и pGIPZ-shFoxa2 приобретали у Open Biosystems (Rockford, IL). Пустые остовы векторов (pCDH и pGIPZ) использовали в качестве негативных контролей. Данные лентивирусы продуцировали и использовали для трансдукции культур in vitro, как описано выше (Yi SH, Не ХВ, Rhee YH, Park СН, Takizawa Т, Nakashima К, Lee SH (2014) Foxa2 acts as a co-activator potentiating expression of the Nurr1-induced DA phenotype via epigenetic regulation. Development 141: 761-772). Титры лентивирусов определяли с использованием набора для количественного измерения лентивируса ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) QuickTiter™ (Cell Biolabs, San Diego, CA), и для каждой реакции трансдукции использовали 200 мкл/лунку (24-луночный планшет) или 2 мл/6 см чашки 10⁶ трансдуцирующих единиц (TU)/мл (60-70 нг/мл). Для индукции экспрессии in vivo посредством стереотаксической инъекции получали AAV, экспрессирующий Nurr1 или Foxa2 (меченный гемагглютинином (НА)) под контролем промотора CMV, посредством субклонирования соответствующих кДНК в вектор pAAV-MCS (Addgene, Cambridge, MA). Для оценки эффективности экспрессии трансгена также генерировали AAV, экспрессирующие GFP. Упаковка и продукция AAV (серотип 9 или 2) осуществлялись Корейским институтом науки и технологии (Сеул, Корея). Титры AAV определяли с использованием набора для количественного измерения AAV QuickTiter™ (Cell Biolabs). Исследования соэкспрессии проводили посредством инфицирования клеток смесями индивидуальных вирусных препаратов (1:1, об./об.).

(4) Иммуноокрашивание

Культивируемые клетки и полученные на криотоме срезы мозга окрашивали следующими первичными антителами: против Nurr1 (1:500, кроличье, 20-е сутки эмбрионального развития, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX и 1:1000, мышиное, R&D Systems); Foxa2 (1:500, козье, Santa Cruz Biotechnology); GFP (1:2000, кроличье, Life Technologies); GFAP (1:200, мышиное, MP Biomedicals, Santa Ana, CA); Iba-1 (1:200, кроличье, Wako), NeuN (1:100, мышиное, EMD Milipore); TAU (1:500, мышиное, Santa Cruz Biotechnology); pTAU (1:500, кроличье, ABcam).

Культивируемые клетки фиксировали в 4%-ном парафармальдегиде (PFA) в растворе PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и блокировали 0,3% Triton Х-100 и 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) в течение 40 минут. Кроме того, данные клетки культивировали совместно с первичными антителами в течение ночи при 4°С. Вторичные антитела для визуализации были следующими: Су3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories) или Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies). Окрашенные клетки монтировали совместно с заливочным раствором VECTASHIELD и DAPI (Vector Laboratories), и изображения получали посредством эпифлуоресцентного микроскопа (Leica) и конфокального микроскопа (Leica PCS SP5).

(5) Поведенческие анализы (5)-1. Способ водного лабиринта

Способ водного лабиринта, также именуемый водный лабиринт Морриса, широко используется в исследовании пространственной памяти и обучения. Животных помещают в лужи, непрозрачно окрашенные сухим нежирным молоком или нетоксичной краской, где животным нужно плыть до скрытой спасительной платформы. Поскольку животные находятся в непрозрачной воде, данные животные не могут видеть платформу и не могут полагаться на запахи для нахождения путей спасения. Вместо этого, животным нужно полагаться на внешние ориентиры или ориентиры вне лабиринта. По мере того как животные становятся более привыкшими к данной работе, данные животные могут находить платформу быстрее. Эта парадигма, разработанная Ричардом Г. Моррисом в 1984 г., стала одним из «золотых стандартов» в поведенческой нейронауке.

(5)-2. Способ Y-лабиринта

Способ Y-лабиринта широко используется для оценки поведения в доклинических исследованиях для изучения пространственного обучения и памяти. В способе Y-лабиринта животных помещают в конец одной из трех ветвей лабиринта в форме Y, где данные животные решают, двигаться ли налево или направо на перекрестке. Данные анализы можно повторять несколько раз для одного животного. Наблюдатель записывал ряд выборов животных в Y-лабиринте (например, число посещений конкретной ветви, общее число посещений трех ветвей, число раз выбора левой ветви животными, число раз выбора правой ветви животными). Применение анализа Y-лабиринта охватывает анализ спонтанного чередования и анализ конгнитивной памяти. В анализе спонтанного чередования наблюдатель наблюдал и записывал то, имели ли животные тенденцию к посещению ветви, которую недавно не посещали (например, измеренное число спонтанных чередований). Обнаружили, что данные анализы являются чувствительными к повреждению гиппокампа, генетической манипуляции и препаратам, приводящим к потере памяти.

(6) Подсчет клеток и статистический анализ

Иммуноокрашенные и окрашенные DAPI клетки подсчитывали в случайных областях каждого покровного стекла культуры посредством применения окулярной сетки при увеличении 200× или 400×. Для всех графических материалов данные выражаются как среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего), и статистические критерии обосновываются в установленном порядке. Статистические сравнения делали с использованием t-критерия Стьюдента (напарного) или 2-факторного или однофакторного ANOVA (дисперсионный анализ), с последующим апостериорным анализом Бонферрони с использованием SPSS (Statistics 21; IBM Inc. Bentonville, AR, США), n, значения P и способы статистического анализа указываются в легендах графических материалов. Значение Р меньше, чем 0,05 рассматривалось значимым.

Результаты

(1) Влияние введения гена Nurr1 и Foxa2 на таупатию

Поскольку аденоассоциированный вирус (AAV) является очень слабоиммуногенным в человеческом организме, для конструирования системы доставки гена Nurr1 и Foxa2, специфично нацеленной на глию, использовали серотип AAV9, который имеет тенденцию инфицировать, главным образом, нейроны и глию в мозгу. Для осуществления экспрессии генов Nurr1 и Foxa2 использовали промотор CMV или GFAP. Nurr1+Foxa2-AAV9 находился в гиппокампе и мозговом желудочке (ICV), которые являются местами поражения болезни Альцгеймера - вида таупатий.

Для проведения анализа доставки генов с использованием вируса AAV9 вирус AAV9, который является специфичным в отношении астроцитов и экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора GFAP, инъецировали как в гиппокамп, так и в мозговой желудочек (ICV) мышей. Через три недели после инъекции вируса GFP-AAV9 измеряли экспрессию GFP (ФИГ. 1). В результате инъекцирования GFP-AAV9 в гиппокамп и мозговой желудочек (ICV) GFP экспрессировался по всему гиппокампу и особенно в GFAP+астроцитах (ФИГ. 2). GFAP, NeuN и Iba1 использовали в качестве маркеров для астроцитов, зрелых нейронов и микроглии соответственно. Соэкспрессия GFAP и GFP, отсутствие соэкспрессии GFP и NeuN, и отсутствие соэкспрессии GFP и Iba1 указывали на то, что вирус специфично экспрессировал данные гены в астроцитах.

Тау-белки представляют собой группу ассоциированных с микротрубочками белков (MAP) в аксонах нормальных нервных клеток. При агрегации тау-белка в мозгу, она влечет за собой тау-опосредованное повреждение и дисфункцию нейронов, которые описываются в качестве типичного этиологического фактора и симптома болезни Альцгеймера.

Гены Nurr1 и Foxa2 специфично вводили в гиппокамповые глиальные клетки и глиальные клетки мозгового желудочка мышей 3xFAD в возрасте 15 и 18 месяцев, которые являются животными моделями болезни Альцгеймера, имеющими агрегированные в мозгу тау-белки, аналогично человеческим пациентам. Через два месяца после введения данных генов тау-белки количественно анализировали посредством иммуноокрашивания в гиппокамповой области.

На ФИГ. 3А показано значимое снижение тау-специфичных клубков в гиппокамповой области мышей 3xFAD с инъекцией Nurr1+Foxa2-AAV9 по сравнению с тау-специфичными клубками контрольных мышей 3xFAD с инъекцией AAV9. На ФИГ. 3В показаны количественные данные тау+клубков.

Тау-белки присутствуют даже в нормальном состоянии, но известно то, что ненормальные тау-белки вызывают нейродегенеративные заболевания, а гиперфосфорилирование тау-белков является характеристикой нормальных тау-белков.

Гены Nurr1 и Foxa2 специфично вводили в гиппокамповые глиальные клетки и глиальные клетки мозгового желудочка мышей 3xFAD в возрасте 15 и 18 месяцев. Через два месяца после введения данных генов фосфорилированные тау-белки (фосфор-тау, pTau) количественно анализировали посредством иммуноокрашивания в гиппокамповой области.

В результате обнаружили то, что мыши 3xFAD с инъекцией AAV9-pGFAP-Nurr1+Foxa2 имеют пониженные уровни фосфорилированного тау по сравнению с контрольными мышами с инъекцией AAV9 при измерении посредством иммуногистохимии (IHC) (ФИГ. 4).

Данный результат показывает то, что сверхэкспрессия Nurr1 и Foxa2 может уменьшать абсолютное количество образовавшихся тау-клубков или количество фосфорилированного тау-белка, свидетельствуя о терапевтическом влиянии сверхэкспрессии Nurr1 и Foxa2 на тау-патологию.

(2) Облегчение снижения когнитивных функций (обучение и память) посредством доставки гена Nurr1 и Foxa2 в мышиную модель болезни Альцгеймера (AD) при анализе посредством поведенческих анализов с использованием водного лабиринта и Y-лабиринта

Проводили исследование для того, чтобы понять влияние глиальной экспрессии Nurr1 и Foxa2 на лечение болезни Альцгеймера - вида таупатий. В данном отношении Nurr1 и Foxa2 специфично экспрессировались в гиппокамповых глиальных клетках и глиальных клетках мозговых желудочков мышей 3xFAD в возрасте 15-18 месяцев, которые подверглись началу болезни Альцгеймера посредством мутагенеза трех генов: АРР, PS1 и tau. Мыши в возрасте 15-18 месяцев были в значительной степени старыми, принимая во внимание тот факт, что мыши в среднем живут примерно 24 месяца. Через три месяца после доставки генов Nurr1 и Foxa2 модельным мышам с болезнью Альцгеймера данных мышей анализировали на когнитивные способности.

Болезнь Альцгеймера, которая представляет собой вид таупатий, является нейродегенеративным заболеванием, отличающимся медленным прогрессированием ухудшения памяти и когнитивных способностей. Анализы водного лабиринта и Y-лабиринта поводили в качестве животных анализов болезни Альцгеймера. И анализ водного лабиринта, и анализ Y-лабиринта представляют собой разрешенные к использованию репрезентативные экспериментальные способы экспериментов по эффективности в отношении памяти и когнитивных способностей, и они используются в качестве индикаторов поведенческих анализов для определения прогрессирования болезни Альцгеймера и терапевтических эффектов на болезнь Альцгеймера.

Примерно через две недели после инъекции вируса Nurr1+Foxa2-AAV9 мышам в возрасте 15-18 месяцев поведенческие анализы водного лабиринта и Y-лабиринта поводили один раз в две недели в течение двух месяцев. Поведенческие индексы сравнивали между мышами с инъекцией вируса Nurr1+Foxa2-AAV9 и контрольного вируса (GFP-AAV9). В результате поведенческого анализа у животных моделей мыши с экспрессией Nurr1+Foxa2 демонстрировали лучшие поведенческие индексы и большие скорости ответа по сравнению с контрольными мышами, указывая на то, что глиальная экспрессия Nurr1 и Foxa2 осуществляла значимое улучшение когнитивной активности, ответственной за обучение и память, и, таким образом, терапевтический эффект на болезнь Альцгеймера - вид таупатий. То есть, идентифицировали то, что экспрессия Nurr1 и Foxa2 в мозговых клетках имеет клинический генотерапевтический эффект на болезнь Альцгеймера (ФИГ. 5, 6, 7, 8 и 9).

Пример 2: исследование ингибирования образования p-tau белка (фосфорилированного тау-белка) посредством введения гена Nurr1 и Foxa2

Далее исследовали, может ли образование фосфорилированного тау-белка ингибироваться посредством введения гена Nurr1 и Foxa2.

Трансгенным по болезни Альцгеймера мышам (3xTg-AD) (Jackson Laboratory, Maine, США) в возрасте 18 и 15 месяцев с индукциями мутаций АРР, PS1 и tau вводили Nurr1-AAV9 (1 мкл) плюс Foxa2-AAV9 (1 мкл) (всего 2 мкл, 10¹² вг/мкл, группа Nurr1+Foxa2), один Nurr1-AAV9 (1 мкл) или физиологический раствор (PBS) в гиппокамп и мозговой желудочек анестезированных мышей посредством стереотаксической микроинъекции. Через два месяца после введения трансгенных по болезни Альцгеймера мышей умерщвляли, фиксировали в параформальдегиде (PFA) и затем блокировали в течение 1 часа посредством добавления 0,6% Triton Х-100 в 1% растворе BSA (бычий сывороточный альбумин)/PBS. Затем первичные антитела (p-tau, Tuj1) связывались с тем же самым раствором, и осуществлялось окрашивание ткани в течение ночи при 4°С. Вторичное окрашивание проводили посредством Су3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories), Alexa Fluor 488 (1:200, Life Technologies) в качестве вторичных антител для визуализации. Окрашенные клетки монтировали совместно с заливочным раствором VECTASHIELD, DAPI (Vector Laboratories), и область энторинальной коры визуализировали посредством конфокального микроскопа (Leica PCS SP5). Полученные изображения показаны на ФИГ. 10, и их количественно измеренные результаты показаны на ФИГ. 11 и в Таблице 1.

Как подтверждается на ФИГ. 10 и 11, результаты анализа подтвердили то, что уровень фосфорилированного тау-белка, экспрессируемого в нейронах мозга Tg мышей 3xFAD, был значительно сниженным при введении и экспрессии Nurr1 и Foxa2, и был значительно сниженным при введении и экспрессии одного Nurr1.

Результаты анализа показали то, что при совместной экспрессии транскрипционных факторов Nurr1 и Foxa2 или экспрессии одного Nurr1 у Tg мышей 3xFAD в качестве модельных мышей с болезнью Альцгеймера уровень фосфорилированного тау-белка в нейронах снижался по сравнению с контрольной группой. Рассматривая то, что фосфорилированный тау-белок представляет собой вещество, составляющее нейрофибриллярные клубки - главную характеристику болезни Альцгеймера, и они накапливаются в нейронах с вызовом клеточной гибели нейронов, в конечном счете приводя к расстройству памяти, ожидается, что введение Nurr1 и Foxa2 совместно или одного Nurrl согласно настоящему раскрытию подлежит применению в лечении таупатий и болезни Альцгеймера.

Промышленная применимость

Настоящее раскрытие относится к композиции для ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка и, более конкретно, к методике ингибирования накопления, агрегации или образования клубков тау-белка посредством введения генов Nurr1 и Foxa2 совместно или одного гена Nurr1 для индукции экспрессии данных генов.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генной терапии с использованием вектора, несущего гены Nurr1 и Foxa2, и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера, вызванной накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка. Изобретение позволяет ингибировать фосфорилирование, накопление, агрегацию или спутывание тау-белка за счет совместного введения и экспрессии генов Nurr1 и Foxa2. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Применение композиции, содержащей вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2, и фармацевтически приемлемый носитель, для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера, вызванной накоплением, агрегацией или спутыванием тау-белка.

2. Применение композиции, содержащей вектор, несущий гены Nurr1 и Foxa2, и фармацевтически приемлемый носитель, для ингибирования фосфорилирования, накопления, агрегации или спутывания тау-белка.

3. Применение по п. 1 или 2, где указанный вектор представляет собой вирусный вектор или невирусный вектор.