ИНТРАТЕКАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2022 года по МПК A61K39/395 A61K9/00 A61K48/00 A61P25/28 C12N15/864 

ВКЛЮЧЕНИЕ ПУТЕМ ССЫЛКИ ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ МАТЕРИАЛА

Заявитель включает таким образом путем ссылки «Список последовательностей, поданный вместе с этой заявкой.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исследователи в области биомедицины и фармации работали над разработкой новых и более эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний, поражающих центральную нервную систему. Однако биология самой центральной нервной системы, в том числе эффективность гематоэнцефалического барьера в защите головного мозга, создает серьезную проблему для доставки лекарственных средств. Это приводит к отсутствию доступного лечения многих заболеваний центральной нервной системы, таких как инсульт, нейродегенеративные нарушения и опухоли головного мозга.

Нейродегенерация является обобщающим термином для прогрессирующей утраты структуры или функции нейронов, включая гибель нейронов. Многие нейродегенеративные заболевания, включающие амиотрофический боковой склероз (ALS), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и болезнь Гентингтона, возникают в результате нейродегенеративных процессов. Для лечения таких нейродегенеративных заболеваний был описан ряд терапий, включающий терапию с использованием моноклональных антител.

Аденоассоциированный вирус (AAV) является дефицитным по репликации парвовирусом, одноцепочечный ДНК-геном которого составляет приблизительно 4,7 т.о. в длину, включая инвертированные концевые повторы (ITR) длиной 145 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность генома AAV серотипа 2 (AAV2) представлена в Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) с уточнением Ruffing ET ah, J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). Цис-действующие последовательности, управляющие репликацией (rep) вирусной ДНК, инкапсуляцией/упаковкой и интеграцией в хромосомы клеток-хозяев, содержатся в ITR. Три промотора AAV (называемые p5, p19 и p40 по их относительным местоположениям на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и p19) в сочетании с дифференциальным сплайсингом одного интрона AAV (в положениях нуклеотидов 2107 и 2227) приводят к продукции четырех белков rep (rep 78, rep 68, rep 52 и rep 40) с гена rep. Белки rep обладают множеством ферментативных свойств, которые, в конечном счете, отвечают за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется с промотора p40 и кодирует три капсидных белка VP1, VP2 и VP3. Альтернативный сплайсинг и неконсенсусные сайты начала трансляции отвечают за продукцию трех родственных капсидных белков. Один консенсусный сайт полиаденилирования находится в положении 95 карты генома AAV. Жизненный цикл и генетика AAV рассмотрены в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992). Кодирующие последовательности генома AAV могут устанавливаться в трансположении, что позволяет создавать AAV векторы, несущие представляющий интерес, а не эндогенные вирусные гены. Эти AAV векторы способны к переносу генов in vivo. Существует несколько серотипов AAV, и они обладают различным тропизмом к ткани. Известные серотипы включают, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AV9, AAV10 и AAV11. AAV9 описан в патенте США с № 7198951 и Gao et al., J. Virol, 78: 6381 -6388 (2004).

Интратекальное введение AAV вектора, несущего антитело в виде одноцепочечного секретируемого scFv против SOD1-мишени, было описано как потенциальный терапевтический подход для ALS. См., например, P Patel et al., Molecular Therapy (2014): 22, 3, 498-510.

Нужны другие способы доставки иммуноглобулиновых конструкций, в том числе, без ограничения, полноразмерных антител, в центральную нервную систему.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композиции, которая содержит AAV вектор, разработанный для интратекальной доставки в центральную нервную систему, причем указанная композиция содержит по меньшей мере одну экспрессионную кассету, которая содержит последовательности, кодирующие продукт иммуноглобулина, для доставки в ЦНС, функционально связанную с контролирующими ее экспрессию последовательностями, и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. В одном аспекте композицию вводят в отсутствие химического или физического нарушения гематоэнцефалического барьера. В одном примере иммуноглобулиновая конструкция содержит иммуноглобулин с модификацией, чтобы иметь уменьшенное или неопределяемое сродство к неонатальному Fc-рецептору (FcRn).

В одном аспекте описана композиция, которая содержит AAV вектор, разработанный для интратекальной доставки для лечения заболевания центральной нервной системы, причем указанная композиция содержит AAV вектор, содержащий капсид AAV, мишенью которого является клетка центральной нервной системы, с упаковкой в нем по меньшей мере одной последовательности инвертированного концевого повтора AAV и последовательностей, кодирующих иммуноглобулиновую конструкцию, функционально связанную с контролирующими ее экспрессию последовательностями, при этом композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент Соответственно, когда кодируемый иммуноглобулин мутируют или конструируют так, чтобы иметь уменьшенное или неопределяемое сродство к неонатальному Fc-рецептору (FcRn).

Изобретение относится к применению композиции, содержащей биомассу по меньшей мере одного AAV вектора, кодирующего иммуноглобулиновую конструкцию, которая может быть использована для лечения неврологического нарушения и/или инфекционного заболевания центральной нервной системы.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, описанной здесь, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфический для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка, пациенту.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения ALS, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, описанной здесь, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфический для связанного с ALS фермента супероксиддисмутазы 1 (SOD1) и его вариантов, при условии, что антитело против SOD1 отличается от ScFv-фрагмента, связывающей белок Derlin-1 области, и/или конструкцию антитела к ингибитору роста аксонов.

Тем не менее, в другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения болезни Паркинсона или родственных синуклеинопатий, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора кодирует одно или более из антитела к киназе-2 с богатыми лейцином повторами, антитела к дардарину (LRRK2), антитела к альфа-синуклеину и/или антитела к DJ-1 (PARK7).

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения рассеянного склероза, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора кодирует иммуноглобулин, направленный к одному или более из α4-интегрина, CD20, CD25, IL12, p40+IL23p40, LINGO-1, CD40 и rHIgM22, CD52, IL17, CD19 и/или SEMA4D.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения инфекционного заболевания центральной нервной системы, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора кодирует иммуноглобулин, направленный к патогену, который вызывает указанное инфекционное заболевание. Примеры, без ограничения, включают один или более иммуноглобулинов, направленных к одному или более из Mycobacterium tuberculosis (возбудителя туберкулеза), Neisseria meningitides (возбудителя менингита), Streptococcus pneumonia, Listeria monocytogens (возбудителя листериоза), Borrelia burdorferia (возбудителя болезни Лайма), вируса дефицита человека (возбудителя синдрома приобретенного иммунодефицита), вирусов семейства Herpesviridae, вируса ветряной оспы, вируса Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловируса и/или вируса JC. Другие примеры мишеней иммуноглобулинов приведены в других разделах этой заявки и включены сюда путем.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с прионами, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора кодирует иммуноглобулин, направленный на один или более основных прионных белков или PrPSc.

Тем не менее, другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из последующего подробного описания настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1A представляет собой график, который показывает концентрацию происходящего от макаки-резуса иммуноадгезина (201IA) в спинномозговой жидкости (CSF) для двух животных, получающих AAV9 вектор, экспрессирующий иммуноадгезин под контролем промотора куриного β-актина (CB), который интратекально доставлялся с помощью субокципитальной пункции. CSF собирали периодически после введения вектора, при этом 400 дней были последним моментом времени сбора. Шкала для CSF составляет до 800 нг/мл.

Фигура 1B представляет собой график, который показывает концентрацию происходящего от макаки-резуса иммуноадгезина (201IA) в сыворотке для двух животных, получающих AAV9 вектор, экспрессирующий иммуноадгезин под контролем промотора куриного β-актина (CB), который интратекально доставлялся с помощью субокципитальной пункции. Сыворотку собирали периодически после введения вектора, при этом 400 дней были последним моментом времени сбора. Шкала для концентрации в сыворотке составляет до 120 мкг/мл.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанные здесь композиции и схемы могут быть использованы для доставки иммуноглобулиновых конструкций в центральную нервную систему. Здесь описаны композиции, содержащие AAV с иммуноглобулиновыми конструкциями для интратекальной доставки в центральную нервную систему (ЦНС).

В рамках изобретения, иммуноглобулиновая конструкция (в том числе антитело или фрагмент антитела, определенные здесь) кодирует составляющую на основе полипептида, которая связывается с антигеном или рецептором клеточной поверхности, расположенным в центральной нервной системе. Такой рецептор может быть расположен на бактерии, вирусе, грибе или другом патогене, который инфицировал центральную нервную систему, и/или белках, связанных с нарушением центральной нервной системы и/или таким патогеном, например, секретируемых белках и/или агрегатах белков.

Используемый здесь термин «иммуноглобулин» включает антитела, их функциональные фрагменты и иммуноадгезины. Антитела могут существовать в самых разных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, однодоменные антитела семейства верблюдовых, внутриклеточные антитела («интратела»), рекомбинантные антитела, полиспецифическое антитело, фрагменты антител, такие как Fv, Fab, F(ab)₂, F(ab)₃, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, антитела в виде одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), тандем/бис-scFv, Fc, pFc', scFvFc (или scFv-Fc), дисульфид-Fv (dsFv), биспецифические антитела (bc-scFv), такие как антитела BiTE; антитела семейства верблюдовых, антитела с измененной поверхностью, гуманизированные антитела, полностью человеческие антитела, однодоменное антитело (sdAb, также известное как NANOBODY®), химерные антитела, химерные антитела, содержащие по меньшей мере одну константную область человека, и т.п. «Фрагмент антитела» относится к по меньшей мере части вариабельной области иммуноглобулина, которая связывается с своей мишенью, например антигеном или рецептором клеточной поверхности.

В одном варианте осуществления описанная здесь композиция обеспечивает AAV-опосредованную доставку иммуноглобулина, который включает кристаллизуемый фрагмент (Fc-часть), включая, например, такой, который присутствует в полноразмерном антителе, биспецифическом антителе, иммуноадгезине [содержащем константные домены иммуноглобулина и, как правило, также шарнирные и Fc-области], моноклональном антителе, иммуноглобулинах в виде двух тяжелых цепей верблюдовых или акулы. Использование AAV для доставки полноразмерных антител и комбинаций из двух антител было описано, например, в международной заявке с № PCT/US15/30533 ʺCompositions Comprising AAV Expressing Dual Antibody Constructs and Uses Thereof", поданной 13 мая 2015, международной заявке с PCT/US15/27491 "Methods and Compositions for Treating Metastatic Breast Cancer and Other Cancers in the Brain", поданной 24 апреля 2015, и которые включены сюда путем ссылки. Необязательно, композиция может содержать две или более различных AAV-иммуноглобулиновых конструкций, как здесь описано.

В другом варианте осуществления описанная здесь композиция обеспечивает AAV-опосредованную доставку иммуноглобулина, который включает Fc-часть, например Fab-фрагмент (антигенсвязывающий фрагмент, обычно образующийся в результате расщепления Ат папаином), F(ab')₂-фрагмент (содержащий два антигенсвязывающих фрагмента, обычно образующийся в результате расщепления Ат пепсином), Fab'-фрагмент (обычно образующийся в результате восстановления F(ab')₂), Fab'-SH, F(ab)₃ (фрагмент триспецифического антитела), Fv (иммуноглобулин, содержащий только два вариабельных домена), однодоменное антитело (sdAb или нанотело V_HH), например, антитело семейства верблюдовых или акулы, или scFv-конструкцию. Такая композиция может включать две или более различных конструкций AAVscFv.

Термин «гетерологичный» при использовании по отношению к белку или нуклеиновую кислоту означает, что белок или нуклеиновая кислота содержит две или более последовательностей или подпоследовательностей, которые не встречаются в одной и той же взаимосвязи друг к другу в природе. Например, как правило, рекомбинантно получают нуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательностей из несвязанных генов, расположенных для создания новой функциональной нуклеиновой кислоты. Например, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота имеет промотор из одного гена, расположенный для управления экспрессией кодирующей последовательности из другого гена. Таким образом, по отношению к кодирующей последовательности, промотор является гетерологичным.

Используемый здесь термин «экспрессионная кассета» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит ген(ы) иммуноглобулина (например, вариабельной области иммуноглобулина, константной области иммуноглобулина, полноразмерной легкой цепи, полноразмерной тяжелой цепи или другого фрагмента иммуноглобулиновой конструкции), промотор и может включать другие регуляторные последовательности для них, при этом кассета может быть доставлена с помощью генетического элемента (например, плазмиды) в упаковывающую клетку-хозяина и упакована в капсид вирусного вектора (например, вирусной частицы). Как правило, такая экспрессионная кассета для создания вирусного вектора содержит последовательности иммуноглобулина, описанные здесь, фланкированные сигналами упаковки вирусного генома, и другие контролирующие экспрессию последовательности, такие как те, которые здесь описаны.

Используемый здесь термин «биомасса вектора» или «биомасса AAV вектора» относится к популяции копий генома вирусной частицы AAV, содержащей упакованную в нее не относящуюся к AAV последовательность, которая кодирует иммуноглобулин(ы), как здесь определено. Соответственно, когда биомасса вектора включает достаточное количество копий генома (GC) рекомбинантного AAV вектора для достижения желаемого физиологического эффекта. Когда достигается желаемый физиологический эффект, величина биомассы вектора в композиции, дозе или схеме может называться «эффективным количеством» rAAV вектора или биомассы вектора.

Если не указано иное, «центральная нервная система» относится к спинному мозгу и головному мозгу и отличается от «периферической нервной системой», которая исключает спинной мозг и головной мозг. В центральной нервной системе существуют различные типы клеток, включающие нейроны и глиальные клетки. Глиа в зрелых системах включает астроциты, олигодендроциты и микроглиальные клетки. Капсиды AAV для векторов, используемых в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают из тех, которые будут трансдуцировать по меньшей мере один из этих типов клеток центральной нервной системы и/или экспрессироваться в нем.

Используемые здесь термины «интратекальная доставка» или «интратекальное введение» относятся к пути введения лекарственного средства с помощью инъекции в позвоночный канал, конкретнее в субарахноидальное пространство, так что оно достигает спинномозговой жидкости (CSF). Интратекальная доставка может включать люмбальную пункцию, внутрижелудочковую (в том числе интрацеребровентрикулярную (ICV)), субокципитальную/интрацистернальную и/или C1-2 пункцию. Например, материал может быть введен для диффузии по всему субарахноидальному пространству с помощью люмбальной пункции. В другом примере инъекция может быть в мостомозжечковую цистерну.

Используемые здесь термины «интрацистернальная доставка» или «интрацистернальное введение» относятся к пути введения лекарственного средства непосредственно в спинномозговую жидкость мостомозжечковой цистерны, конкретнее с помощью субокципитальной пункции или с помощью прямой инъекции в мостомозжечковую цистерну или через постоянно размещенную трубку.

Как описано здесь, термин «приблизительно» при использовании для изменения числового значения означает вариацию ±10%, если не указано иное.

Используемые на протяжении этого описании и в формуле изобретения термины «включать» и «содержать» и его варианты, в том числе «включает», «включающий», «содержит» и «содержащий», среди других вариантов, включают другие компоненты, элементы, целые числа, стадии и т.п. Термин «состоит из» или «состоящий из» исключает другие компоненты, элементы, целые числа, стадии и т.п.

Для экспрессии с AAV вектора конструкции нуклеиновой кислоты, которые кодируют иммуноглобулины, применимые для лечения одного или более нейродегенеративных нарушений, могут быть сконструированы или выбраны для доставки с помощью композицию AAV настоящего изобретения. Такие нарушения могут включать, без ограничения, трансмиссивные губчатые энцефалопатии (например, болезнь Крейтцфельда-Якоба), болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз (ALS), рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, травматическое повреждение головного мозга, повреждение спинного мозга (ATI335, Anti-nogol от Novartis), мигрень (ALD403 от Alder Biopharmaceuticals, LY2951742 от Eli, RN307 от Labrys Biologics), лизосомальные болезни накопления, инсульт и инфекционные заболевания, поражающие центральную нервную систему.

Тем не менее, другие нуклеиновые кислоты могут кодировать иммуноглобулин, который направлен на белок 1, содержащий богатые лейцином повторы и иммуноглобулиноподобный домен (LINGO-1), который является функциональным компонентом рецептора Nogo и который связан с эссенциальным дрожанием у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, болезнью Паркинсона или эссенциальным дрожанием. Одним из таких имеющихся в продаже антител является окрелизумаб (Biogen, BIIB033). См., например, патент США с № 8425910.

В одном варианте осуществления конструкции нуклеиновых кислот кодируют иммуноглобулиновые конструкции, которые могут быть использованы для пациентов с ALS. Примеры подходящих антител включают антитела к связанному с ALS фермента супероксиддисмутазы 1 (SODl) и их варианты (например, антитело против варианта G93A, C4F6 SOD1 ALS); MS785, которое направлено на связывающую белок Derlin-1 область); антитела к ингибитору роста аксонов (NOGO-A или Reticulon 4), например GSK1223249, озанезумаб (гуманизированное Ат, GSK, также описанное как применимое для рассеянного склероза).

Могут быть сконструированы или выбраны последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуноглобулины, которые могут быть использованы в случае пациентов с болезнью Альцгеймера. Такие конструкции антител включают, например, адуманукаб (Biogen), бапинейзумаб (Elan, гуманизированное мАт, направленное на N-конец Aβ); соланезумаб (Eli Lilly, гуманизированное мАт против центральной части растворимого Aβ); гантенерумаб (Chugai and Hoffmann-La Roche, является полноразмерным человеческим мАт, направленным как на N-конец, так и на центральную часть Aβ); кренезумаб (Genentech, гуманизированное мАт, которое оказывает действие на мономерные и конформационные эпитопы, в том числе олигомерные и протофибриллярные формы Aβ; BAN2401 (Esai Co., Ltd, гуманизированное мАт изотипа иммуноглобулин G1 (IgG1), который селективно связывается с протофибриллами Aβ и, как считается, или усиливает клиренс протофибрилл Aβ, и/или нейтрализует их токсические эффекты на нейроны в головном мозге), GSK 933776 (гуманизированное моноклональное антитело изотипа IgG1, направленное против N-конца Aβ), AAB-001, AAB-002, AAB-003 (сконструированный с использованием Fc бапинейзумаб), SAR228810 (гуманизированное мАт, направленное против протофибрилл и низкомолекулярного Aβ), BIIB037/BART (полноразмерный человеческий IgG1 против нерастворимого фибриллярного Aβ человека, Biogen Idec), антитело против Aβ, такое как m266, tg2576 (с относительной специфичностью в отношении олигомеров Аβ) [Brody and Holtzman, Annu Rev Neurosci, 2008; 31:175-193]. Мишенями других антител могут быть бета-амилоидные белки, Aβ, бета-секретаза и/или тау-белок.

В приведенных здесь примерах проиллюстрированы три конструкции scFv к Aβ, разработанные для исключения Fc-области полноразмерного антитела к амилоиду бета (Aβ). Эти конструкции были разработаны для снижения риска связанных с амилоидом дефектов изображений и/или для ограничения подвергания сосудов воздействию высоких концентраций моноклональных антител. В одном варианте осуществления иллюстративный scFv связывается с фибриллярным β-амилоидом. См., например, scFv, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, в которой вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность аминокислот с 21 по 143, а вариабельная область легкой цепи имеет последовательность аминокислот с 159 по 265. Также включены варианты этого scFv. Например, по отношению к SEQ ID NO:8, другая сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20), другой линкер может быть использован вместо линкера Gly-Ser (аминокислот с 144 по 158), или может быть удалена гистидиновая метка (аминокислоты с 266 по 271). Здесь представлены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности scFv, описанные здесь. См., например, SEQ ID NO:7.

В другом варианте осуществления иллюстративный scFV направлен против олигомерного, растворимого и фибриллярного β-амилоида. См., например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, содержащую вариабельную область тяжелой цепи из аминокислот с 21 по 113 и вариабельную область легкой цепи из аминокислот с 147 по 258. Также включены варианты этого scFV. Например, по отношению к SEQ ID NO:10, другая сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20), другой линкер может быть использован вместо линкера Gly-Ser (аминокислот с 132 по 146), или может быть удалена гистидиновая метка (аминокислоты 259-264). Здесь представлены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности scFv, описанные здесь. См., например, SEQ ID NO:9.

Тем не менее, в другом варианте осуществления иллюстративный scFv направлен к растворимому β-амилоида. См., например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, содержащую вариабельную область тяжелой цепи из аминокислот с 21 по 113 и вариабельную область легкой цепи из аминокислот с 147 по 258. Также включены варианты этого scFv. Например, по отношению к SEQ ID NO:12 другая сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20), другой линкер может быть использован вместо линкера Gly-Ser (аминокислот с 132 по 146), или может быть удалена гистидиновая метка (аминокислоты 259-264). Здесь представлены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислотные последовательности scFv, описанные здесь. См., например, SEQ ID NO:11.

Тем не менее, в других вариантах осуществления антитело к β-амилоиду получают из моноклональных антител изотипа IgG4 к β-амилоиду-мишени с целью минимизации эффекторных функций, или выбирают конструкцию, отличную от scFv, в которой отсутствует Fc-область, во избежание связанных с амилоидом дефектов изображений (ARIA) и воспалительной реакции. В некоторых из этих вариантов осуществления вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи одной или более конструкций scFv используется в другой подходящей иммуноглобулиновой конструкции по изобретению. Эти scFv и другие сконструированные иммуноглобулины могут уменьшать полупериод жизни иммуноглобулина в сыворотке по сравнению с иммуноглобулинами, содержащими Fc-области. Уменьшение концентрации в сыворотки направленных против амилоида молекул может еще больше снизить риск возникновения ARIA, поскольку чрезвычайно высокие уровни направленных против амилоида антител в сыворотке могут дестабилизировать сосуды головного мозга с высокой массой амилоидных бляшек, вызывая проницаемость сосудов.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие другие иммуноглобулиновые конструкции для лечения пациентов с болезнью Паркинсона, могут быть разработаны или сконструированы для экспрессии конструкций, включая, например, антитела к киназе 2 с богатыми лейцином повторами, дардарина (LRRK2); антитела к синуклеину и альфа-синуклеину и антитела к DJ-1 (PARK7). Другие антитела могут включать, PRX002 (Prothena и Roche) для лечения болезни Паркинсона или родственных синуклеинопатий. Эти антитела, в частности, антитела к синуклеину, могут также использоваться при лечении одной или более лизосомальных болезней накопления.

Можно разработать или выбрать конструкции нуклеиновых кислот, кодирующие иммуноглобулиновую конструкцию для лечения рассеянного склероза. Такие иммуноглобулины могут включать или быть получены из таких антител, как натализумаб (гуманизированное антитело к α4-интегрину, iNATA, Tysabri, Biogen Idee и Elan Pharmaceuticals), который был одобрен в 2006 году, алемтузумаб (Campath-1H, гуманизированное антитело к CD52), ритуксимаб (ритузин, химерное антитело к CD20), даклизумаб (Zenepax, гуманизированное антитело к CD25), окрелизумаб (гуманизированное антитело к CD20, Roche), устекинумаб (CNTO-1275, человеческое антитело к IL12p40+IL23p40); антитело к LINGO-1 и ch5D12 (химерное антитело к CD40), и rHIgM22 (ремиелинизирующее моноклональное антитело, Acorda and the Mayo Foundation for Medical Education and Research). Тем не менее, другие антитела к α4-интегрину, антитела к CD20, антитела к CD52, антитела к IL17, антитела к CD19, антитела к SEMA4D и антитела к CD40 могут быть доставлены с помощью AAV векторов, описанных здесь.

ААV-опосредованная доставка антител против различных инфекций центральной нервной системы также предполагается в настоящем изобретении. Такие инфекционные заболевания могут включать грибковые заболевания, такие как криптококковый менингит, абсцесс головного мозга, инфекция эпидурального пространства спинного мозга, вызванная, например, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, грибами порядка Mucorales, Aspergillus spp. и Candida spp.; протозойные заболевания, такие как токсоплазмоз, малярия и первичный амебный менингоэнцефалит, вызванные такими агентами, как, например, Toxoplasma gondii, Taenia solium, Plasmodium falciparus, Spirometra mansonoides (спарганоз), Echinococcus spp. (вызывающий нейрогидатидоз) и амебиаз головного мозга; бактериальные заболевания, такие как, например, туберкулез, проказа, нейросифилис, бактериальный менингит, болезнь Лайма (Borrelia burgdorferi), лихорадка Скалистых гор (Rickettsia rickettsia), нокардиоз ЦНС (Nocardia spp.), туберкулез ЦНС (Mycobacterium tuberculosis), листериоз ЦНС (Listeria monocytogenes), абсцесс головного мозга и нейроборрелиоз; вирусные инфекции, такие как, например, вирусный менингит, восточный лошадиный энцефалит (EEE), энцефалит Сент-Луис, вирус и/или энцефалит Западного Нила, бешенство, вирус энцефалита Калифорнии, энцефалит Ла-Кросс, коревой энцефалит, полиомиелит, возбудителем которого могут быть, например, вирусы семейства Herpesviridae (HSV), HSV-1, HSV-2 (герпетический энцефалит у новорожденных), вирус ветряной оспы (VZV), энцефалит Бикерстаффа, вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (CMV, например, TCN-202 разрабатывается Theraclone Sciences), вирус герпеса человека 6 (HHV-6), вирус B (Herpervirus simiae), вызванный флавивирусом энцефалит, японский энцефалит, лихорадка долины Мюррея, вирус JC (прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия), вирус Нипах (NiV), корь (подострый склерозирующий панэнцефалит); и другие инфекции, такие как, например, подострый склерозирующий панэнцефалит, прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия; вирус иммунодефицита человека (синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД)); Streptococcus pyogenes и другие β-гемолитические стрептококки (например, аутоиммунные нейропсихиатрические расстройства у детей, связанные со стрептококковой инфекцией, PANDAS) и/или синдром Сиденгама, синдром Гийена-Барре и прионы.

Примеры подходящих конструкций антител могут включать те, которые описаны, например, в WO 2007/012924A2, 29 января 2015 г., который включен сюда путем ссылки.

Например, другие последовательности нуклеиновых кислот могут кодировать направленные против прионов иммуноглобулиновые конструкции. Такие иммуноглобулины могут быть направлены против основного прионного белка (PrP, для прионного белка или устойчивого к протеазам белка, также известного как CD230 (кластер дифференцирования 230). Аминокислотную последовательность PrP предоставляет, например, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000302, включенный сюда путем ссылки. Белок может существовать в нескольких изоформах, нормальной изоформе PrP^c, вызывающей заболевание изоформе PrP^Sc и изоформе, расположенной в митохондриях. Неправильно свернутый вариант PrP^Sc связан с рядом когнитивных расстройств и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота, синдром Герстмана-Штрауслера-Шейнкера, смертельная семейная бессонница и куру.

После выбора мишени и иммуноглобулина могут быть получены и/или синтезированы кодирующие последовательности для выбранного иммуноглобулина (например, тяжелой и/или легкой цепи(ей)). Способы секвенирования белка, пептида или полипептида (например, в качестве иммуноглобулина) известны специалистам в данной области техники. Как только последовательность белка становится известна, существуют сетевые и коммерчески доступные компьютерные программы, а также основанные на услугах компании, которые преобразуют аминокислотную последовательности обратно в кодирующие нуклеотидные последовательности. См., например, программу backtranseq от EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/ ; Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html); ExPasy (http://www.expasy.org/tools/). В одном варианте осуществления кодирующие последовательности РНК и/или кДНК разрабатывают для оптимальной экспрессии в клетках человека.

Оптимизированные по частоте использования кодонов кодирующие области могут быть разработаны различными способами. Эта оптимизация может быть выполнена с использованием методов, доступных в режиме онлайн (например, GeneArt), опубликованных методов или компании, которая предоставляет услуги оптимизации по частоте использования кодонов, например DNA2.0 (Menlo Park, CA). Один алгоритм оптимизации по частоте использования кодонов описан, например, в публикации международной заявки на патент с WO 2015/012924, которая включена сюда путем ссылки. См. также, например, публикацию заявки на патент США с № 2014/0032186 и публикацию заявки на патент США с № 2006/0136184. Соответственно, когда вся длина открытой рамки считывания (ORF) для продукта является модифицированной. Однако в некоторых вариантах осуществления может быть изменен только фрагмент ORF. Используя один из этих способов, можно применять частоты к любой конкретной последовательности полипептида и получать НК-фрагмент оптимизированной по частоте использования кодонов кодирующей области, которая кодирует полипептид.

Существует ряд вариантов для осуществления фактических изменений кодонов или для синтеза оптимизированных по частоте использования кодонов кодирующих областей, разработанных, как здесь описано. Такие модификации или синтез могут быть выполнены с использованием стандартных и обычных молекулярно-биологических манипуляций, хорошо известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. В одном из подходов, используя стандартные методы, синтезируют ряд комплементарных олигонуклеотидных пар длиной 80-90 нуклеотидов каждая, охватывающий длину желаемой последовательности. Эти олигонуклеотидные пары синтезированы таким образом, что при отжиге они образуют двухцепочечные фрагменты из 80-90 пар оснований, содержащие «липкие» концы, например, каждый олигонуклеотид в этой паре синтезируют с наращиванием 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более оснований за пределами области, которая комплементарна другому олигонуклеотиду в паре. Одноцепочечные концы каждой пары олигонуклеотидов предназначены для отжига с одноцепочечным концом другой пары олигонуклеотидов. Парам олигонуклеотидов дают возможность отжигаться, и приблизительно от пяти до шести из этих двухцепочечных фрагментов затем дают возможность отжигаться вместе через липкие одноцепочечные концы, а затем их лигируют вместе и клонируют в стандартный бактериальный вектор для клонирования, например, вектор TOPO®, доступный от Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif. Затем конструкцию секвенируют стандартными способами. Некоторые из этих конструкций, состоящие из 5-6 фрагментов из 80-90 пар оснований пар, лигированных вместе, т.е. фрагменты из приблизительно 500 пар оснований, получают таким образом, что вся желаемая последовательность представлена в ряде плазмидных конструкций. Затем вставки этих плазмид вырезают с помощью соответствующих рестрикционных ферментов и лигируют вместе, образуя конечную конструкцию. Конечную конструкцию затем клонируют в стандартный бактериальный вектор для клонирования и секвенируют. Специалистам в данной области техники будут разу же очевидны дополнительные методы. Кроме того, синтез генов легко доступен коммерчески.

Описанные здесь гены иммуноглобулинов могут быть использованы для экспрессии «дикого типа», опубликованного или коммерчески доступного, или других известных константных доменов иммуноглобулина или могут быть сконструированы таким образом, чтобы уменьшать аффинность связывания (сродство), или исключать связывание, с Fc-связывающим сайтом, присутствующим в иммуноглобулинах. Существует несколько различных типов Fc-рецепторов, которые классифицируются в зависимости от типа антитела, которое они распознают. Используемый здесь термин «FcRn» относится к неонатальному Fc-рецептору, который связывает IgG. Он похож по структуре на белок класса I MHC. У людей он кодируется геном FCGRT. Fc-рецептор расположен на поверхности различных типах клеток, включая, например, эпителиальные клетки гематоэнцефалического барьера. Используемый здесь термин «FcRn-связывающий домен» относится к домену белка, который непосредственно или опосредованно связывается с FcRn. FcRn может представлять собой FcRn млекопитающего. В дальнейших вариантах осуществления FcRn представляет собой FcRn человека. FcRn-связывающий домен, непосредственно связывающийся с FcRn, представляет собой Fc-область антитела. Между тем, области, способные к связыванию с полипептидом, таким как альбумин или IgG, который обладает связывающей FcRn человека активностью, могут опосредованно связываться с FcRn человека через альбумин, IgG или т.п. Таким образом, такая связывающая FcRn человека область может быть областью, которая связывается с полипептидом, обладающим связывающей FcRn человека активностью. Используемый здесь термин «Fc-область» относится к FcRn-связывающему домену, который непосредственно связывается с FcRn, FcRn млекопитающего или FcRn человека. В частности, Fc-область представляет собой Fc-область антитела. Fc-область может представлять собой Fc-область млекопитающего или, конкретнее, Fc-область человека. В частности, Fc-область может быть расположена во втором и третьем константном домене иммуноглобулина человека (CH2 и CH3). Кроме того, Fc-область может быть шарнирной областью CH2 и CH3. В одном варианте осуществления иммуноглобулиновая конструкция представляет собой IgG. В дальнейшем варианте осуществления Fc-область представляет собой Fc-область IgG1 человека. Могут также использоваться другие изотипы Ig.

Способы и компьютерные программы для осуществления таких совмещений доступны и хорошо известны специалистам в данной области техники. Замены также могут быть записаны как (идентифицированная с помощью однобуквенного кода аминокислота)-#положения-(идентифицированная с помощью однобуквенного кода аминокислота), в соответствии с чем первая аминокислота представляет собой замещенную аминокислоту, а вторая аминокислота представляет собой замещающую аминокислоту в указанном положении. Используемые здесь термины «замещение» и «замещение аминокислоты», и «аминокислотная замена» относятся к замене аминокислоты в аминокислотной последовательности другой аминокислотой, причем последняя отличается от замещенной аминокислоты. Способы замены аминокислоты хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, но без ограничения ими, мутации нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность. Способы введения аминокислотных замен в IgG описаны, например, в случае заявки WO 2013/046704, которая включена путем ссылки для обсуждения методов модификации аминокислот, хотя в этом документе описывается увеличение сродства к FcRn, а не уменьшение или исключение сродства, как здесь описано.

Термин «аминокислотная замена» и его синонимы, описанные выше, как предполагается, включает модификацию аминокислотной последовательности путем замены одной аминокислоты другой, заменяющей аминокислотой. Замена может быть консервативной заменой. Термин «консервативные», по отношению к двум аминокислоты, как предполагается, означает, что аминокислоты обладают общим свойством, признанным специалистом в данной области. Термин «неконсервативные», по отношению к двум аминокислоты, как предполагается, означает, что аминокислоты имеют отличия по, во всяком случае, одному свойству, признанному специалистом в данной области. Например, такие свойства могут включать аминокислоты, имеющие гидрофобные некислотные боковые цепи, аминокислоты, имеющие гидрофобные боковые цепи (которые могут быть дополнительно дифференцированы как кислотные или некислотные), аминокислоты, имеющие алифатические гидрофобные боковые цепи, аминокислоты, имеющие ароматические гидрофобные боковые цепи, аминокислоты с полярно-нейтральными боковыми цепями, аминокислоты с электрически заряженными боковыми цепями, аминокислоты с электрически заряженными кислотными боковыми цепями и аминокислоты с электрически заряженными основными боковыми цепями. Как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе аминокислоты известны в данной области техники и могут быть использованы в качестве замещающих аминокислот в вариантах осуществления. Таким образом, консервативная аминокислотная замена может включать замену первой аминокислоты, имеющей гидрофобную боковую цепь, другой аминокислотой, имеющей гидрофобную боковую цепь; тогда как неконсервативная аминокислотная замена может включать замену первой аминокислоты с кислотной гидрофобной боковой цепью другой аминокислотой, имеющей отличную боковую цепь, например, основную гидрофобную боковую цепь или гидрофильную боковую цепь. Тем не менее, другие консервативные или неконсервативные замены будут определены специалистом в данной области техники.

Тем не менее, в других вариантах осуществления замещение в данном положении будет представлять собой аминокислоту или одну из группы аминокислот, которая будет очевидна для специалиста в данной области техники для достижения указанной здесь цели.

В одном варианте осуществления иммуноглобулиновую конструкцию, определенную здесь, создают так, чтобы нативная последовательность, расположенная в консервативной области Fc-области иммуноглобулина, была удалена, чтобы исключить связывание с FcRn и свести к минимуму или исключить перенос белковых иммуноглобулиных конструкций через гематоэнцефалический барьер (из области ЦНС) и в большой круг кровообращения. В одном примере это может быть достигнуто путем изменения одной или более аминокислот FcRn-связывающего домена, например, путем модификации кодона для выбранной аминокислоты (аминокислот). См., например, US 8618252 B2.

Дополнительно или альтернативно, иммуноглобулиновые конструкции (например, варианты Fc) конструируют так, чтобы они обладали усиленной эффекторной функцией. См., например, T. Matsushita, Korean J Hematol, 2011 Sep; 46(3): 148-150; патент США с № 6946292.

Нумерация аминокислот тяжелой цепи, используемая здесь для определения местоположения мутантов, основана на системе нумерации EU (ЕС) [уникальной нумерации IMGT, Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969); http://www.imgt.org/-IMGTScientificChart/-Numbering/Hu_IGHGnber.html]] и относится к положениям в FcRn-связывающем домене, в частности в Fc-области. Аналогичным образом, замены указываются как, например, «EU387R» или «EU440E», причем число, представленное после «EU», означает положение замены в соответствии с нумерацией EU, а буква после номера представляет собой замещенную аминокислоту, представленную в одном буквенном коде. Другие системы нумерации включают, например, Kabat, E.A., T.T. Wu, H.M. Perry, K.S. Gottesman, C. Foeler. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. No. 91-3242 U.S. Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda).

Промотор(ы) могут быть выбраны из различных источников, например немедленно-ранний энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV) человека, ранний энхансер/промотор SV40, промотор полиовируса JC, промоторы основного белка миелина (MBP) или глиальных фибриллярных кислых белков (GFAP), связанный с латентностью вируса простого герпеса (HSV-1) промотор (LAP), промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), нейронспецифический промотор (NSE), промотор фактора роста тромбоцитов (PDGF), hSYN, промотор меланиноконцентрирующего гормона (MCH), CBA, промотор матриксного металлопротеина (MPP) и промотор куриного бета-актина.

В некоторых вариантах осуществления экспрессионная кассета, описанная здесь, содержит по меньшей мере один внутренний сайт связывания рибосомы, т.е. IRES, расположенный между кодирующими областями тяжелой и легкой цепей. Альтернативно, тяжелая и легкая цепь могут быть разделены саморасщепляющимся пептидным линкером фурина-2а (см., например, Radcliffe and Mitrophanous, Gene Therapy (2004), 11, 1673-1674. Экспрессионная кассета может содержать по меньшей мере один энхансер, т.е. энхансер CMV. Тем не менее, другие энхансерные элементы могут включать, например, энхансер аполипопротеина, энхансер данио, энхансерный элемент GFAP и специфические для головного мозга энхансеры, такие как те, которые описаны в WO 2013/1555222, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков. Дополнительно или альтернативно, может быть выбран другой, например, гибридный немедленно-ранний промотор (IE) цитомегаловируса человека (HCMV))-промотор PDGR или другие элементы промотор-энхансер. Для усиления экспрессии другими элементами могут быть интроны (типа интрона Promega™ или химерного куриный глобин-человеческий иммуноглобулин интрона).

Термины «идентичный» или процент «идентичности» применительно к двум или более нуклеиновым кислотам или полипептидным последовательностям относятся к двум или более последовательностей или последовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е. с составляющей приблизительно 70% идентичностью, предпочтительно с составляющей 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокой идентичностью в указанной области (например, любой из модифицированных ORF, представленных здесь, при сравнении и совмещении для максимального соответствия во всем окне сравнения или намеченной области), как измерено с использованием алгоритмов для сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с использованием параметров по умолчанию, описанных ниже, или путем совмещения вручную и визуального контроля (см., например, веб-сайт NCBI или т.п.). В качестве другого примера полинуклеотидные последовательности можно сравнить с помощью Fasta, программы в GCG версии 6.1. Fasta обеспечивает совмещения и предоставляет процент идентичности последовательностей областей наибольшего частичного совпадения между запрашиваемой последовательностью и последовательностью поиска. Например, процент идентичности последовательностей нуклеиновых кислот может быть определен, используя Fasta с использованием параметров по умолчанию для нее (размер слова=6 и коэффициент NOPAM для матрицы замен), как это предусмотрено в GCG версии 6.1, включенной сюда путем ссылки. Как правило, эти программы используются с параметрами по умолчанию, хотя специалист в данной области техники может изменить эти параметры по мере необходимости. В качестве альтернативы, специалист в данной области техники может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, который обеспечивает, по меньшей мере, уровень идентичности или совмещения, который обеспечивается упоминаемыми алгоритмами и программами. Это определение также относится к комплименту последовательности или может быть применено к нему. Определение также включает последовательности, которые имеют делеции и/или добавления, а также те, которые содержат замены. Как описано ниже, предпочтительные алгоритмы могут учитывать пробелы и т.п. Предпочтительно, когда идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 25, 50, 75, 100, 150, 200 аминокислот или нуклеотидов, и часто в области, длина которой составляет 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 аминокислот или нуклеотидов, или по всей длине аминокислотной или нуклеотидной последовательности.

Как правило, когда совмещение выполняется на основе аминокислотной последовательности, совмещение содержит вставки и делеции, которые так идентифицированы относительно эталонной последовательности AAV, и нумерация аминокислотных остатков основана на эталонной шкале, предусмотренной для совмещения. Однако любая конкретная последовательность AAV может иметь меньше аминокислотных остатков, чем эталонная шкала. В настоящем изобретении при обсуждении родительской последовательности термин «то же положение» или «соответствующее положение» относится к аминокислоте с одним и тем же номером остатка в каждой из последовательностей, относительно эталонной шкалы для совмещенных последовательности. Однако, при выводе из совмещения, каждый из белков может иметь эти аминокислоты с разными номерами остатков. Совмещение выполняется с использованием любой из ряда общедоступных или коммерчески доступных программ для совмещения нескольких последовательностей. Программы для совмещения последовательностей доступны для аминокислотных последовательностей, например программы «Clustal X», «MAP», «PIMA», «MSA», «BLOCKMAKER», «MEME» и «Match-Box». Как правило, любая из этих программ используется с параметрами по умолчанию, хотя специалист в данной области техники может изменить эти параметры по мере необходимости. В качестве альтернативы, специалист в данной области техники может использовать другой алгоритм или компьютерную программу, который обеспечивает, по меньшей мере, уровень идентичности или совмещения, который обеспечивается упоминаемыми алгоритмами и программами. См., например, J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., ʺA comprehensive comparison of multiple sequence alignmentsʺ, 27(13):2682-2690 (1999).

В другом варианте осуществления предусматривается модифицированный иммуноглобулин, характеризующийся исключением его сродства к FcRn и сохраняющий физиологически эффективную активность. Одна или более модификаций аминокислот могут быть выбраны для исключения функционального связывания с FcRn. В одном варианте осуществления мутация снижает сродство иммуноглобулина к FcRn до менее чем 10% нативного белка. Соответственно, когда иммуноглобулины с этими мутациями связываются по существу обычно со всеми другими Fc-рецепторами. После выбора аминокислотной последовательности последовательности нуклеиновых кислот могут быть сконструированы, и/или описанные ранее последовательности могут быть сконструированы, как описано выше. Эти модификации осуществляются путем конструирования кодирующей области нуклеиновой кислоты с использованием сайт-направленного мутагенеза или других методов генной инженерии, которые известны специалистам в данной области техники.

В одном варианте осуществления описанные здесь гены иммуноглобулинов создают в генетическом элементе (например, плазмиде), применимом для создания AAV векторов, которые переносят последовательности иммуноглобулиных конструкций, переносимые в них. Приведенные здесь примеры и SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно, иллюстрируют геномы AAV векторов с тремя различными конструкциями scFv, направленными на Aβ-мишени. Выбранный вектор может быть доставлен в упаковывающую AAV клетку любым подходящим способом, включая трансфекцию, электропорацию, липосомную доставку, технологии слияния мембран, покрытые ДНК гранулы с высокой скоростью, вирусную инфекцию и слияние протопластов. Также можно создать стабильные упаковывающие клетки. Методы, используемые для создания таких конструкций, известны специалистам в области манипуляций с нуклеиновой кислотой и включают генную инженерию, рекомбинантную инженерию и синтетические методы. См., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).

AAV векторы

AAV вектор, описанный здесь, может содержать одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует один или более полипептидов тяжелой и/или легкой цепи или другие полипептиды иммуноглобулиновой конструкции. Соответственно, когда композиция содержит один или более AAV векторов, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие все полипептиды, которые образуют иммуноглобулиновую конструкцию in vivo. Например, полноразмерное антитело состоит из четырех полипептидов: двух копий полипептида тяжелой (H) цепи и двух копий полипептида легкой (L) цепи. Каждая из тяжелых цепей содержит одну N-концевую вариабельную область (VH) и три C-концевые константные области (CH1, CH2 и CH3), а каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную область (VL) и одну C-концевую константную область (CL). Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела. В этом отношении AAV вектор, описанный здесь, может содержать одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептиды тяжелой цепи (например, константный и вариабельный) и полипептиды легкой цепи иммуноглобулиной конструкции. Альтернативно, AAV вектор может содержать первую экспрессионную кассету, которая кодирует по меньшей мере один константный полипептид тяжелой цепи и по меньшей мере один вариабельный полипептид тяжелой цепи, и вторую экспрессионную кассету, которая кодирует константный и вариабельный полипептиды легкой цепи иммуноглобулиновой конструкции. В еще одном варианте осуществления AAV- вектор может содержать первую экспрессионную кассету, кодирующую первый полипептид тяжелой цепи, вторую экспрессионную кассету, кодирующую второй полипептид тяжелой цепи, и третью экспрессионную кассету, кодирующую полипептид легкой цепи, который разделяют две тяжелые цепи. В другом варианте осуществления AAV вектор может экспрессировать 1, 2, 3 или 4 открытые рамки считывания (ORF) для scFv, каждая из которых может быть одной и той же или отличной.

Как правило, экспрессионная кассета для AAV вектора содержит 5' инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, кодирующие иммуноглобулиновую конструкцию последовательности и любые регуляторные последовательности, и 3' ITR AAV. Однако могут быть подходящими другие конфигурации этих элементов. Был описан укороченный вариант 5' ITR, названный ΔITR, из которой удалены D-последовательность и сайт концевого разрешения (trs). В других вариантах осуществления используются полноразмерные 5' и 3' ITR AAV.

Если необходимо создать псевдотипированный AAV, ITR при экспрессии выбирают из источника, который отличается от источника капсида AAV. Например, ITR AAV2 могут быть выбраны для использования с капсидом AAV, обладающим особой эффективностью в нацеливании на ЦНС или ткани или клетки в ЦНС. В одном варианте осуществления последовательности ITR из AAV2 или их варианты с делециями (ΔITR) используются для удобства и для ускорения разрешения регуляторного органа. Однако могут быть выбраны ITR из других AAV источников. Если источником ITR является AAV2, а капсид AAV из другого AAV источника, полученный вектор можно назвать псевдотипированным. Однако могут быть использованы другие источники ITR AAV.

Сокращение «scAAV» относится к самокомплементарности. «Самокомплементарный AAV" относится к конструкции, в которой кодирующая область, переносимая последовательностью нуклеиновой кислоты рекомбинантного AAV, была разработана для образования внутримолекулярной двухцепочечной ДНК-матрицы. При инфицировании, а не в ожидании клеточно-опосредованного синтеза второй цепи, две комплементарные половинки scAAV будут ассоциироваться с образованием одной двухцепочечной ДНК (дцДНК) единицы, которая готова к немедленной репликации и транскрипции. См., например, D.M. McCarty et al, ʺSelf-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesisʺ, Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254. Самокомплементарные AAV описаны, например, в патентах США с № 6596535, 7125717 и 7456683, каждый из которых включен сюда путем ссылки во всей своей полноте.

Экспрессионная кассета, как правило, содержит промоторную последовательность как часть контролирующих экспрессии последовательностей, например, расположенную между выбранной последовательностью 5' ITR и кодирующей иммуноглобулиновую конструкцию последовательностью. Тканеспецифические промоторы, конститутивные промоторы, регулируемые промоторы (см., например, WO 2011/126808 и WO 2013/04943] или промотор, реагирующий на физиологические сигналы, могут быть использованы в описанных здесь векторах. Помимо промотора экспрессионная кассета и/или вектор может содержать другие подходящие последовательности инициации транскрипции, ее терминации, энхансерные последовательности, эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования (полиА); последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусную последовательность Козак); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию кодированного продукта.

Эти контрольные последовательности «функционально связаны» с последовательностями генов иммуноглобулиновой конструкции. Используемый здесь термин «функционально связаны» относится и к контролирующим экспрессию последовательностям, которые расположены рядом с интересующим геном, и к контролирующим экспрессию последовательностям, которые действуют в трансположении или на расстоянии, чтобы контролировать представляющий интерес ген.

В одном варианте осуществления предусмотрен самокомплементарный AAV. Этот вирусный вектор может содержать Δ5' ITR и 3' ITR AAV. В другом варианте осуществления предусмотрен одноцепочечный вирусный вектор на основе AAV. Способы создания и выделения вирусных векторов на основе AAV, подходящих для доставки субъекту, известны в данной области техники. См., например, патент США с № 7790449; патент США с № 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; и US 7588772 B2]. В одной системе линия клеток-продуцентов транзиторно трансфицируется конструкцией, которая кодирует трансген, фланкированный ITR, и конструкцией(ями), которая кодирует rep и cap. Во второй системе линия упаковывающих клеток, которая стабильно обеспечивает rep и cap, транзиторно трансфицируется конструкцией, кодирующей трансген, фланкированный ITR. В каждой из этих систем AAV вирионы продуцируются в ответ на инфицирование аденовирусом- или герпесвирусом-помощником, что требует отделения rAAV от контаминирующего вируса. Совсем недавно были разработаны системы, которые не требуют инфицирования вирусом-помощником для восстановления AAV - необходимые функции помощника (т.е. E1, E2a, VA и E4 аденовируса или UL5, UL8, UL52 и UL29 герпесвируса и полимераза герпесвируса) также поставляются, in trans, системой. В этих более новых системах функции помощника могут быть обеспечены путем транзиторной трансфекции клеток конструкциями, которые кодируют требуемые функции помощника, или могут быть сконструированы клетки, которые стабильно содержат гены, кодирующие вспомогательные функции, экспрессия которых может контролироваться на транскрипционном или посттранскрипционном уровня. В еще одной системе трансген, фланкированный ITR и генами rep/cap, вводят в клетки насекомых путем инфицирования векторами на основе бакуловируса. В целях ознакомления с этими системами продуцирования см., в общем, Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929, содержание каждого из которых включено сюда путем ссылки во всей его полноте. Способы создания и использования этих и других систем продуцирования AAV также описаны в следующих патентах США, содержание каждого из которых включено сюда путем ссылки во всей его полноте: 5139941, 5741683, 6057152, 6204059, 6268213, 6491907, 6660514, 6951753, 7094604, 7172893, 7201898, 7229823 и 7439065.

Доступное пространство для упаковки может быть сохранено путем объединения более чем одной единицы транскрипции в одну экспрессионную кассету, таким образом уменьшая количество требуемых регуляторных последовательностей. Например, один промотор может управлять экспрессией одной РНК, которая кодирует два или три или более генов, а трансляция находящихся 3' генов управляется последовательностями IRES. В другом примере один промотор может управлять экспрессией РНК, которая содержит, в одной открытой рамке (ORF), два или три или более генов, отделенных друг от друга последовательностями, кодирующими саморасщепляющийся пептид (например, 2А) и/или сайт узнавания протеазой (например, фурином). Таким образом, ORF кодирует один полипротеин, который либо во время, либо после трансляции расщепляется на отдельные белки (такие как, например, тяжелая цепь и легкая цепь). Следует, однако, отметить, что хотя эти системы IRES и полипротеинов могут использоваться для экономии пространства для упаковки AAV, их можно использовать только для экспрессии компонентов, которыми может управлять один и тот же промотор. В другом альтернативном варианте трансгенная способность AAV может быть увеличена за счет предоставления ITR из двух геномов AAV, которые могут отжигаться с образованием конкатамеров «голова к хвосту». В другом альтернативном варианте могут быть выбраны двунаправленные промоторы.

В приведенных ниже примерах описан AAV вектор, имеющий капсид AAV9. Используемый здесь термин «капсид AAV9» относится к AAV9, имеющему аминокислотную последовательность с номером доступа в GenBank: AAS99264, которая включена сюда путем ссылки. Настоящим изобретением охватываются некоторые вариации этой кодированной последовательности, которые могут включать последовательности, идентичные на по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 97% или по меньшей мере приблизительно 99% упомянутой аминокислотной последовательности с номером доступа в GenBank: AAS99264 и US7906111 (также WO 2005/033321). Были описаны способы получения капсида, кодирующие его последовательности и способы получения rAAV-вирусных векторов. См., например, Gao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086 (2003) и US 2013/0045186A1. Создание AAV9 векторов описано, например, в патенте США с № 7906111, который включен сюда путем ссылки. Однако могут быть выбраны другие источники капсидов AAV и других вирусных элементов, а также другие иммуноглобулиновые конструкции и другие векторные элементы. Способы создания AAV векторов широко описаны в литературе и патентных документах, включая, например, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. Источник капсидов AAV может быть выбран из AAV, мишенью которого является ЦНС, специфические клетки в ЦНС и/или специфические антигены или рецепторы. Подходящий AAV может включать, например, AAV9 [US 7906111; US 2011-0236353-A1], rh10 [WO 2003/042397] и/или hu37 [см., например, US 7906111; US 2011-0236353-A1]. Однако другие AAV, в том числе, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 [патент США с № 7790449; патент США с № 7282199] и другие, могут быть выбраны для получения описанных здесь AAV векторов.

ПРИМЕНЕНИЯ И СХЕМЫ

Соответственно, когда композиция настоящего изобретения разработана таким образом, что AAV векторы несут нуклеотидные экспрессионные кассеты, кодирующие иммуноглобулиновые конструкции и регуляторные последовательности, которые управляет экспрессией иммуноглобулина с них в выбранной клетке. После введения векторов в ЦНС векторы доставляют экспрессионные кассеты в ЦНС и экспрессируют белковые иммуноглобулиновые конструкции in vivo. Описано применение описанных здесь композиций с терапевтической целью, а также применение этих композиций в различных схемах, которые могут необязательно включать доставку одного или более других активных агентов.

Как указано выше, композиция может содержать AAV вектор одного типа, как здесь описано, который содержит экспрессионную кассету для доставки иммуноглобулиновой конструкции in vivo. Альтернативно, композиция может содержать два или более различных AAV векторов, каждый с упаковкой в него различных экспрессионных кассет. Например, два или более различных AAV могут иметь различные экспрессионные кассеты, которые экспрессируют полипептиды иммуноглобулина, которые собираются in vivo с образованием одной функциональной иммуноглобулиновой конструкции. В другом примере два или более AAV могут иметь различные экспрессионные кассеты, которые экспрессируют полипептиды иммуноглобулина для разных мишеней, например, для обеспечения двух функциональных иммуноглобулиновых конструкций (например, первой иммуноглобулиновой конструкции и второй иммуноглобулиновой конструкции). В еще одном альтернативном варианте два или более различных AAV могут экспрессировать иммуноглобулиновые конструкции, направленные на одну и ту же мишень, причем одна из иммуноглобулиновых конструкций была модифицирована для исключения связывания с FcRn, а вторая иммуноглобулиновая конструкция сохраняет свою способность или обладает повышенной способностью к связыванию с FcRn. Такая композиция может быть применима для одновременного предоставления антител с повышенным удержанием в ЦНС и антител для системной доставки иммуноглобулиновой конструкции.

Описанная здесь схема может включать в дополнение к одной или нескольким комбинациям, описанным здесь, дополнительную комбинацию с одним или более из биологического препарата, препарата в виде небольших молекул или другой терапии. Биологический препарат, описанный здесь, основан на пептиде, полипептиде, белке, ферменте, молекуле нуклеиновой кислоты, векторе (в том числе вирусных векторах) или т.п.

Соответственно, когда описанные здесь композиции содержат эффективное количество одного или более AAV, суспендированных в фармацевтически подходящем носителе и/или смешанных с подходящими наполнителями, предназначенными для доставки субъекту с помощью инъекции, осмотического насоса, интратекального катетера или для доставки с помощью другого устройства или другим путем. В одном примере композиция разработана для интратекальной доставки. В одном варианте осуществления интратекальная доставка включает инъекцию в позвоночный канал, например субарахноидальное пространство. Однако могут быть выбраны другие пути доставки и фармацевтически приемлемые носители для композиций AAV, включая, например, внутричерепную, интраназальную, интрацистернальную доставку, доставку в спинномозговую жидкость, среди других подходящих прямых или системных путей, т.е. резервуар Оммайя.

Композиции могут быть разработаны так, чтобы содержать количество AAV, которое находится в диапазоне от приблизительно 1×10⁹ копий генома (GC) до приблизительно 5×10¹⁴ GC. В одном примере количество вектора составляет приблизительно 3×10¹³ GC, но другие количества, такие как приблизительно 1×10⁹ GC, приблизительно 5×10⁹ GC, приблизительно 1×10¹⁰ GC, приблизительно 5×10¹⁰ GC, приблизительно 1×10¹¹ GC, приблизительно 5×10¹¹ GC, приблизительно 1×10¹² GC, приблизительно 5×10¹² GC или приблизительно 5×10¹³ GC. Такие композиции могут содержать биомассу одного AAV, который экспрессирует иммуноглобулин, направленный на выбранную мишень. В другом варианте осуществления такие композиции могут содержать биомассу двух AAV, которые коэкспрессируют иммуноглобулин, который собирается в целевой клетке-хозяине с образованием желаемого иммуноглобулина (например, полноразмерного антитела) против выбранной мишени. В другом варианте осуществления композиция может содержать биомассу двух или более AAV, каждый из которых экспрессирует отличную иммуноглобулиновую конструкцию. В таких композициях экспрессированные белки могут объединяться с образованием одного иммуноглобулина, или в них могут экспрессироваться два или более иммуноглобулинов, имеющих различные мишени. Эти различные мишени могут относиться к разным лигандам одного и того же типа клеток или одного и того же вируса (или другой мишени) или к двум совершенно разным патогенам. Композиции разрабатывают для интратекальной доставки. В одном варианте осуществления выполняют люмбальную пункцию, в ходе которой от приблизительно 15 мл (или менее) до приблизительно 25 мл спинномозговой жидкости удаляют, и вектор суспендируют в совместимом носителе и доставляют пациенту.

rAAV, предпочтительно суспендированный в физиологически совместимом носителе и необязательно смешанный с одним или более наполнителей, может вводиться человеку или не являющемуся человеком млекопитающему-пациенту. Подходящие носители могут быть легко выбраны специалистом в данной области техники с учетом показания, для которого предписан трансфертный вирус. Например, один подходящий носитель включает физиологический раствор, который может быть приготовлен с использованием ряда буферных растворов (например, забуференного фосфатом физиологического раствора). Другие приводимые в качестве примера носители включают раствор В Эллиота, стерильный физиологический раствор, лактозу, сахарозу, мальтозу и воду. Выбор носителя не является ограничением настоящего изобретения. Необязательно, композиции настоящего изобретения могут содержать, помимо rAAV и носителя(ей), другие обычные фармацевтические ингредиенты, такие как консерванты или химические стабилизаторы.

В одном варианте осуществления описанные здесь композиции используются для получения лекарственных средств для лечения нарушений и заболеваний центральной нервной системы.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, описанной здесь, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфического для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка, пациенту.

Тем не менее, в другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения болезни Паркинсона или родственных синуклеинопатий, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора кодирует одно или более из антитела к киназе-2 с богатыми лейцином повторами, антитела к дардарину (LRRK2), антитела к альфа-синуклеину и/или антитела к DJ-1 (PARK7).

Тем не менее, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу лечения рассеянного склероза, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора кодирует иммуноглобулин, направленный к одному или более из α4-интегрина, CD20, CD25, IL12, p40+IL23p40, LINGO-1, CD40 и rHIgM22, CD52, IL17, CD19 и/или SEMA4D.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения ALS, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, описанной здесь, в которой биомасса по меньшей мере одного AAV вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфический для связанного с ALS фермента супероксиддисмутазы 1 (SOD1) и его вариантов, связывающей белок Derlin-1 области, и/или конструкцию антитела к ингибитору роста аксонов. В одном варианте осуществления вектор и/или композиция содержит Fc-фрагмент иммуноглобулина к SOD1.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с прионами, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора кодирует иммуноглобулин, направленный на один или более основных прионных белков или PrPSc.

Доступны модели на животных для оценки эффективности лечения ряда нарушений и заболеваний, описанных здесь. См., например, модели на животных для оценки болезни Альцгеймера, описанные, например, в D Van Dam and P. P. De Deyn, Br J Pharmacol, 2011 Oct; 164(4):1285-1300. Модели для оценки препаратов от болезни Паркинсона также описаны, например, в HT Tran et al, Cell Reports, Vol. 7, Issue 6, p2054-2065, June 26, 2014. См. также RM Ransajoff, Nature Neuroscience, Aug 2012, Vol 15, 1074-1077 (рассеянный склероз); M.A Pouladi et al, Natuer Reviews Neuroscience, 14, 708-721 (2013) (болезнь Хантингдона); N Fernandez-Borges, et al., Cur top Med Chem 2013; 13(19): 2504-21 (препараты от прионов); PMcGoldrick, et al, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, Vol. 1832, Issue 9, September 2013, pp. 1421-1436 and JM Moser et al, Mol Genet Genomics, 2013 Jun; 288(5-6): 207-29 (ALS). Тем не менее, другие модели известны специалистам в данной области техники.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения инфекционного заболевания центральной нервной системы, который включает интратекальную доставку композиции AAV вектора по изобретению, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора кодирует иммуноглобулин, направленный против патогена, который вызывает указанное инфекционное заболевание. Примеры, без ограничения, включают один или более иммуноглобулинов, направленных против одного или более из Mycobacterium tuberculosis (возбудителя туберкулеза), Neisseria meningitides (возбудителя менингита), Streptococcus pneumonia, Listeria monocytogens (возбудителя листериоза), Borrelia burdorferia (возбудителя болезни Лайма), вируса дефицита человека (возбудителя синдрома приобретенного иммунодефицита), вирусов семейства Herpesviridae, вируса ветряной оспы, вируса Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловируса и/или вируса JC.

Необязательно, описанные здесь композиции AAV вводят в отсутствие дополнительного постороннего фармакологического или химического агента или другого физического нарушения гематоэнцефалического барьера.

В комбинированной терапии описанную здесь иммуноглобулиновую конструкцию, доставляемую с помощью AAV, вводят до, во время или после начала терапии с использованием другого агента, а также любой их комбинации, т.е. до и во время, до и после, во время и после, или до, во время и после начала терапии.

Описанные здесь композиции могут быть использованы в схеме, включающей совместное введение других активных агентов. Любой подходящий способ или путь можно использовать для введения таких других агентов. Пути введения включают, например, системное, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Необязательно, описанные здесь композиции AAV могут также вводиться одним из этих путей.

Следующие примеры являются только иллюстративными и не являются ограничением описанного здесь изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Экспрессия в ЦНС AAV9-опосредованной доставки направленного против SIV иммуноадгезина

Для оценки возможности длительной продукции антител в ЦНС после интратекальной доставки AAV, вектор, кодирующий иммуноадгезин, вводили двум не являющимся людьми приматам, и концентрацию трансгенного продукта в спинномозговой жидкости (CSF) оценивали с помощью ELISA. Вектор AAV9, экспрессирующий происходящий от макаки-резуса иммуноадгезин (201IA), был сконструирован, как описано ранее для AAV8, за исключением того, что промотор CB (куриного бета-актина с энхансером цитомегаловируса) был использован вместо промотора цитомегаловируса [Greig JA, et al. (2014) Intramuscular Injection of AAV8 in Mice and Macaques Is Associated with Substantial Hepatic Targeting and Transgene Expression. PLoS ONE 9(11): e112268] и капсид AAV9 вместо капсида AAV8.

Вкратце, оптимизированную по частоте использования кодонов нуклеотидную последовательность для иммуадгезина (201IA) макаки-резуса против SIV mac251 gpl20 IgG-201 (Glamann et al. J Virol. 1998;74(15):7158-7163. doi:10.1128/JVI.74.15.7158-7163.2000. с обновлением) клонировали в экспрессионную конструкцию AAV. Конструкция была фланкирована инвертированными концевыми повторами AAV2 и содержала промотор CB7, химерный интрон и последовательность полиаденилирования глобина кролика (pAAV.CB7.CI.201IA.rBG). Последовательность этой плазмиды была подтверждена [SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2 соответствует кодированной последовательности 201IA)].

Вектор rAAV9.CB7.CI.201IA.rBG (3×10¹² копий генома (GC)/кг) доставляли в спинномозговую жидкость (CSF) двух яванских макак (идентификаторы 0411 и 9860) с помощью субокципитальной пункции. Сыворотку и CSF собирали периодически после введения вектора. Концентрацию 201IA в CSF и сыворотке определяли с помощью ELISA следующим образом.

Все процедуры проводились при комнатной температуре, если не указано иное. Планшеты промывали с помощью промывателя для микропланшетов BioTek 405TS, используя PBS+0,05% Tween-20. mac251 gpl20 (Immune Technology Corp.), разведенный до 2 мкг/мл в PBS, инкубировали в течение ночи в 96-луночных планшетах для ELISA EasyWash™ Costar® (Corning) при 4^οС. Затем планшеты блокировали блокирующим буфером для специфической для 201IA ELISA (PBS+5% инактивированной при нагревании фетальной телячьей сыворотки+1 мМ EDTA+0,07% Tween-20). Разведенные образцы добавляли в планшеты и разводили в 2 раза до конца планшета по меньшей мере четыре раза. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37^οС и снова блокировали в блокирующем буфере для специфического для 201IA ELISA. Затем планшеты инкубировали с поликлональным козьим античеловеческим IgG-биотином AffynPure (Jackson ImmunoResearch Labs), разведенным в PBS, затем со стрептавидином-пероксидазой хрена (Abeam), разведенной в PBS. Субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) использовали для проявления реакции в планшетах. После остановки колориметрической реакции с помощью H2SO₄ планшеты считывали с использованием считывающего устройства для планшетов SpectraMax M3 (Molecular Devices) при 450 нм.

Результаты для каждого из двух животных проиллюстрированы на фиг.1А и 1B, которые показывают концентрацию 201IA в спинномозговой жидкости и сыворотке, соответственно, от момента введения до дня 400 после введения дозы. Шкала концентрации для CSF представлена в нг/мл, тогда как уровни экспрессии в сыворотке измеряли в микрограммах (мкг)/мл.

Пример 2 - Мутация I253A в 201IA для отмены связывания с FcRn

Нуклеотидная последовательность длиной 768 п.о., комплементарная гену 201IA, но содержащая мутацию, соответствующую I253A или H453A аминокислотной последовательности тяжелой цепи (нумерация Кабат), была получена от GeneArt (Life Technologies). Последовательность была фланкирована сайтами рестрикции PstI и BstZ17I, соответствующими сайтам в pAAV.CB7.CI.201IA.rBG. Мутированные последовательности отдельно клонировали в pAAV.CB7.CI.201IA.rBG путем расщепления рестриктазами, используя указанные ферменты (NEB), и лигирования (TaKaRa Inc.), как описано производителями. Секвенирование по Сенгеру (GeneWiz) использовали для подтверждения комплементарности pAAV.CB7.CI.201IA.rBG [SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:2 соответствует кодированной последовательности 201IA)], pAAV.CB7.CI.201IA(I253A).rBG [SEQ ID NO:3 (кодирующей SEQ ID NO:4)] и pAAV.CB7.CI.201IA(H435A).rBG [SEQ ID NO:5 (кодирующей SEQ ID NO: 6] по обе стороны от желаемой мутации.

AAV9 векторы созданы с использованием этих плазмид, используя описанные в примере 1 способы.

Пример 3 - Создание иллюстративных конструкций AAV.scFv

Были приготовлены три иллюстративные конструкции scFv. Эти конструкции были разработаны для исключения Fc-области, сохраняя при этом связывание полноразмерного Ат против амилоида бета (Aβ). Эти конструкции были разработаны для снижения риска связанных с амилоидом дефектов изображений и/или для ограничения подвергания сосудов воздействию высоких концентраций моноклональных антител.

A. scFv адуканумаба

Полноразмерное антитело было описано как антитело, мишенью которого является фибриллярный Aβ [Weiner et al. Nature Reviews, Immunology, 6: 404-416 (май 2006 г.)]. Для создания scFv аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (аминокислоты 21-143 SEQ ID NO:8) и вариабельного домена легкой цепи (аминокислоты 159-2655 SEQ ID NO:8) рекомбинантного полностью человеческого мАт против Aβ изотипа IgG1 (адуканумаба, Biogen), которые были идентифицированы на основе опубликованной ВОЗ последовательности [Международных непатентованных наименований для фармацевтических веществ (МНН), WHO Drug Information, Vol 27, No. 4, 2013, p401-402; см. также WO 2014/089500A1], были оптимизированы по частоте использования кодонов при обратном преобразовании в последовательность нуклеиновой кислоты. Домены тяжелой и легкой цепей были соединены с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер Gly-Ser (GGGGGGGGGGGGGGS, аминокислоты 144-158 SEQ ID NO:8). Кодирующая последовательность для сигнального пептида секреции IL-2 (аминокислоты 1-20 SEQ ID NO: 8) была слита с 5'-концом последовательности нуклеиновой кислоты, и кодирующая 6xHis-метку последовательность была помещена на 3'-конце нуклеиновой кислоты для облегчения очистки. Эти последовательности, разработанные авторами настоящего изобретения, были заказаны и синтезированы коммерческим предприятием, ведущим деятельность на договорных началах. Плазмида содержит, среди других элементов плазмиды, геном AAV вектора, состоящий из: SEQ ID NO:13: 5'AAV2-ITR, промотора IE CMV, промотора CB, интрона куриного бета-актина, последовательности scFv, полиА бета-глобина кролика и AAV2-3'ITR. Эту плазмиду коэкспрессировали с плазмидой, экспрессирующей капсид AAV9, в упаковывающей линии клеток 293. Также были коэкспрессированы в упаковывающей линии клеток 293 функции rep AAV и функции аденовируса-помощника, необходимые для упаковки генома AAV, содержащего кодирующую scFV последовательность и другие регуляторные элементы, фланкированные ITR AAV, в капсид AAV9. Полученный в результате рекомбинантный вектор, который имеет капсид AAV9 и упакованный геном AAV вектора [SEQ ID NO:13], был назван AAV9.CB7.CI.aducanumabscFv.rGB.

В описанном здесь исследовании выход вектора, определяемый с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR), составлял 5,89×10¹³ копий генома (GC/мл). Векторные серии оценивали с использованием методов ddPCR для определения титров генома AAV вектора с помощью ddPCR, как описано в M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14.

B. scFv кренезумаба

Кренезумаб является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом против человека 1-40 и 1-42 Aβ (также называемого β-амилоидом), разработанным AC Immune и используемый Genentech на основании лицензии. Кренезумаб также известен как MABT5102A. Он характеризуется наличием последовательностей HVR-области на фиг. 2 WO 2015/120233A1 и последовательностей SEQ ID NO:2-9 в нем. Было описано, что это антитело способно нацеливаться на олигомерные, растворимые и фибриллярные Aβ.

scFv кренезумаба получали, как описано выше для адуканумаба, замещая аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи [аминокислоты 21-131 SEQ ID NO:10] и вариабельного домена легкой цепи [аминокислоты 147-258 SEQ ID NO:10] кренезумаба, который были синтезированы на основе опубликованной ВОЗ последовательности [Международных непатентованных наименований для фармацевтических веществ (МНН), WHO Drug Information, Vol 25, No. 2, pp. 163-164 (2011); см. также WO 2015/120233A]. Полученный в результате рекомбинантный вектор, который имеет капсид AAV9 и упакованный геном AAV вектора [SEQ ID NO:14], был назван AAV9.CB7.CI.crenezumabscFv.rGB.

В описанном здесь исследовании выход вектора, определяемый с помощью ddPCR, составлял 3,79×10¹³ GC/мл. Векторные серии очищали и оценивали с использованием ddPCR, как описано в M. Lock et al., Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14.

C. scFv соланезумаба

Соланезумаб является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом, доступным от Eli Lilly. Хотя было описано, что он в высокой степени гомологичен кренезумабу, его мишенью является только растворимый Аβ, тогда как мишенью кренезумаба является олигомерный, растворимый и фибриллярный Аβ. Соланезумаб характеризуется наличием последовательностей HVR-области в патенте США с № 7195761. Последовательности, используемые для конструирования scFV, были получены из Международных непатентованных наименований для фармацевтических веществ (МНН), WHO Drug Information, Vol. 23, № 3, pp. 263-264 (2009).

scFv соланезумаба получали, как описано выше для адуканумаба, используя аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи [аминокислоты 21-131 SEQ ID NO:12] и вариабельного домена легкой цепи [аминокислоты 147-258 SEQ ID NO:12] соланезумаба которые были синтезированы на основе опубликованной ВОЗ последовательности [Международных непатентованных наименований для фармацевтических веществ (МНН), WHO Drug Information, Vol. 25, No. 2, pp. 163-164 (2011); см. также WO 2015/120233A]. Полученный в результате рекомбинантный вектор, который имеет капсид AAV9 и упакованный геном AAV вектора [SEQ ID NO:15], был назван AAV9.CB7.CI.solanezumabscFv.rGB.

В описанном здесь исследовании определенный с помощью ddPCR выход составлял 5,25×10¹³ GC/мл. Векторные серии очищали и титровали с помощью ddPCR, как описано.

D. ELISA для обнаружения направленных против Aβ scFv

Экспрессирующие scFv плазмиды из частей A-C выше использовали для получения стандартов для ELISA до упаковки плазмиды в капсид AAV9. Для очистки стандартов для специфической для scFv ELISA плазмиду pAAV трансфицировали в клетки 293. ScFv секретировались в супернатант клеточной культуры. Воспользовавшись His-метки на конце scFvs, scFv очистили, пропустив супернатант через колонку His-trap [GE Healthcare]. Остальная часть супернатанта протекает через колонку, не связываясь с ней. Связанный материал (scFv) с His-меткой затем элюировали с использованием высокосолевого буфера.

Для обнаружения направленных против Aβ scFv использовали следующий иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA). Планшеты покрывают 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого амилоида бета при 4^οС в течение ночи с использованием амилоида смешанных видов (агрегированных и мономерных формы пептида). Анализ проводят следующим образом. Промойте планшеты 5 раз с использованием PBS+0,05% Tween-20. Осуществите блокирование с использованием PBS+1% бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа при комнатной температуре. Добавьте сыворотку/мозговой лизат/очищенные направленные против Aβ scFv. Три scFv, описанные в частях A, B и C этого примера, были сконструированы с использованием His-метки для облегчения анализа ELISA, и они были очищены от супернатанта 293 с использованием колонки His-trap [1-мл колонки His-Trap FF, GE Healthcare] в соответствии с инструкциями производителя [http://www.gelifesciences.com/- webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciencesus/products/AlternativeProductStructure_17555/17524701]. Инкубируйте при 37^οC в течение одного часа. Промойте планшеты 5 раз с использованием PBS+0,05% Tween- 20. Добавьте антитело против His-метки (AbCam abl l87), разведенное 1:10000 в PBS. Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Промойте планшеты 5 раз с использованием PBS+0,05% Tween-20. Проявите реакцию с использованием субстрата TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) в течение 30 минут при комнатной температуре. Добавьте 2 н H₂SO_4, чтобы остановить реакцию. Осуществите считывание при 450 нм и 540 нм на считывающем устройстве для планшетов.

E. Экспериментальное исследование направленных против Aβ scFv в модели на мыши 3xTG

AAV9.CB7.aducanumabSCFV.RBG, AAV9.CB7.crenezumabSCFV.RBG, AAV9.CB7.solanezumabSCFV.RBG или PBS вводят интрацеребровентрикулярно (ICV) 6-недельным мышам 3хTG (MMRRC Repository/Jackson) [см., например, R. Sternicdzuk, et al, ʺCharacterization of the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease: part 2. Behavioral and cognitive changesʺ. Brain Res. 2010 Aug 12;1348:149-55. doi: 10.1016/j.brainres.2010.06.011. Epub 2010 Jun 15 and R. Sterniczuk, et al, ʺCharacterization of the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease: part 1. Circadian changesʺ, Brain Res. 2010 Aug 12;1348:139-48. doi: 10.1016/j.brainres.2010.05.013. Epub 2010 May 31.] в количестве 1×10¹¹ GC/ мышь, 6 мышей на когорту введения дозы. Контрольные мыши (не развивают патологию Альцгеймера): B6129SF2/J (Jackson). Сыворотка берется ежемесячно, чтобы контролировать экспрессию scFv. Мыши подвергаются тесту в водном лабиринте Морриса и/или поведенческому тесту на чередование в Y-лабиринте через 6 месяцев после введения вектора [сморите, например, Webster et al. Using mice to model Alzheimer's dementia: an overview of the clinical disease and the preclinical behavioral changes in 10 mouse models. Front Genet. 2014; 5: 88.]. Водный лабиринт Морриса разработан для измерения пространственной памяти, управления движением и когнитивного картирования [Whishaw, I.Q. (1995). "A comparison of rats and mice in a swimming pool place task and matching to place task: some surprising differences". Physiology & Behavior. 58 (4): 687-693. doi:10.1016/0031-9384(95)00110-5; Crusio, Wim (1999). "Methodological considerations for testing learning in mice". In Crusio, W.E.; Gerlai, R.T. Handbook of molecular-genetic techniques for brain and behavior research (1st ed.). Amsterdam: Elsevier. pp. 638-651.]. Y-лабиринт используется для оценки пространственной рабочей памяти у крыс и мышей, особенно для задач спонтанного чередования. Лабиринт может быть коммерчески приобретен, например, у Panlab. Мышей подвергают эвтаназии в возрасте 12 месяцев для гистологической оценки связанной с Аβ патологии и количественной оценки с помощью ELISA scFv/амилоида из лизата головного мозга. В других предварительных исследованиях изучается эффективность scFv у более старых мышей (с введением дозы в ~4-6 месяцев, что является средним возрастом появления видимой патологии, связанной с Аβ, в этой модели). Когортам мышей вводят дозы в возрасте 6 недель и в возрасте 4-6 месяцев для гистологической оценки патологии, связанной с тау-белком, с последующей эвтаназией мышей в возрасте 15 месяцев.

Эта заявка содержит последовательности и список последовательностей, который включен сюда путем ссылки. Все публикации, патенты и патентные заявки, в том числе приоритетная заявка на патент США 62/247498, поданная 28 октября 2015 года, приведенная в этой заявке, включены при этом путем ссылки во всей их полноте, как если бы было специально и индивидуально указано, что каждая отдельная публикация или заявка на патент включена путем ссылки. Хотя вышеприведенное изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера с целью ясности понимания, специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники будет сразу же очевидно с учетом идей этого изобретения, что некоторые изменения и модификации могут быть внесены в него без отклонения от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.

Таблица (произвольный текст списка последовательностей)

Следующая информация предоставляется для последовательностей, содержащих произвольный текст под числовым идентификатором <223>

SEQ ID NO:(содержащая произвольный текст) Произвольный текст под <223> 1 <220>
<221> прочий_признак
<222> (275)..(404)
<223> 3' ITR (комплемент)
<220>
<221> прочий_признак
<222> (3226)..(3355)
<223> 5' ITR
<220>
<221> прочий_признак
<222> (3423)..(3804)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> кодирующая последовательность
<222> (5161)..(6690)
<223> 201IA 3 <220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(130)
<223> 5' ITR
<220>
<221> прочий_признак
<222> (198)..(579)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> промотор
<222> (582)..(863)
<223> промотор CB
<220>
<221> Интрон
<222> (958)..(1930)
<223> интрон куриного бета-актина
<220>
<221> кодирующая последовательность
<222> (1936)..(3465)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> полиA_сигнал
<222> (3529)..(3655)
<223> полиА глобина кролика
<220>
<221> прочий_признак
<222> (3744)..(3873)
<223> 3' ITR (комплемент)
<220>
<221> прочий_признак
<222> (4636)..(5493)
<223> маркер AP(R) 4 <223> Синтетическая конструкция 5 <221> прочий_признак
<222> (275)..(404)
<223> 3' ITR (комплемент)
<220>
<221> прочий_признак
<222> (3423)..(3804)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> промотор
<222> (3807)..(4088)
<223> промотор CB
<220>
<221> TATA_сигнал
<222> (4061)..(4064)
<223> полиА глобина кролика
<220>
<221> Интрон
<222> (4183)..(5155)
<223> интрон куриного бета-актина
<220>
<221> кодирующая последовательность
<222> (5161)..(6690)
<223> промотор IE CMV 6 <220>
<223> Синтетическая конструкция 7 <223> сконструированная кодирующая scFv адуканумаба последовательность 8 <223> Аминокислотная последовательность конструкции scFv адуканумаба
<220>
<221> Сигнал
<222> (1)..(20)
<223> Сигнал секреции IL2
<220>
<221> прочий_признак
<222> (21)..(143)
<220>
<221> прочий_признак
<222> (144)..(158)
<223> линкер Gly-Ser
<220>
<221> прочий_признак
<222> (159)..(265)
<223> Вариабельная область легкой цепи
<220>
<221> прочий_признак
<222> (266)..(271)
<223> 6xHis-метка (Explasy) 9 <223> Созданная конструкция scFv кренезумаба 10 <223> Аминокислотная последовательность сконструированного scFv кренезумаба
<220>
<221> Сигнал
<222> (1)..(20)
<223> сигнал секреции IL-2
<220>
<221> прочий_признак
<222> (21)..(131)
<223> Вариабельная область тяжелой цепи
<220>
<221> прочий_признак
<222> (131)..(146)
<223> линкер Gly-Ser
<220>
<221> прочий_признак
<222> (147)..(258)
<223> Вариабельная область легкой цепи
<220>
<221> прочий_признак
<222> (259)..(264)
<223> 6xHis-метка 11 <223> Нуклеотидная последовательность созданной конструкции scFv соланезумаба: 12 <223> Аминокислотная последовательность созданной конструкции scFv соланезумаба
<220>
<221> Сигнал
<222> (1)..(20)
<223> сигнал секреции IL2
<220>
<221> прочий_признак
<222> (21)..(131)
<223> Вариабельная область тяжелой цепи
<220>
<221> прочий_признак
<222> (132)..(146)
<220>
<221> прочий_признак
<222> (147)..(258)
<223> Вариабельная область легкой цепи
<220>
<221> прочий_признак
<222> (259)..(264)
<223> 6xHis-метка 13 <223> геном AAV вектора.CB7.CI.aducanumabscFvRBG
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (1)..(130)
<223> 5' AAV2-ITR
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (198)..(579)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> промотор
<222> (582)..(863)
<223> промотор CB
<220>
<221> Интрон
<222> (958)..(1930)
<223> промотор куриного бета-актина
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2002)..(2370)
<223> вариабельная область тяжелой цепи адуканумаба
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2371)..(2415)
<223> линкер Gly-Ser
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2416)..(2736)
<223> вариабельная область легкой цепи адуканумаба
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2737)..(2754)
<223> His-метка
<220>
<221> полиA_сигнал
<222> (2821)..(2947)
<223> полиА глобина кролика
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (3036)..(3165)
<223> 3' ITR 14 <223> pAAV.CB7.CI.crenezumabScFv.RBG
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (1)..(130)
<223> AAV2-5' ITR
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (198)..(579)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> промотор
<222> (582)..(863)
<223> промотор CB
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1942)..(2001)
<223> сигнал секреции IL-2
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2001)..(2334)
<223> вариабельная область тяжелой цепи кренезумаба
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2335)..(2379)
<223> линкер Gly-Ser
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2380)..(2715)
<223> вариабельная область легкой цепи кренезумаба
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2716)..(2733)
<223> His-метка
<223> полиA глобина кролика
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (3015)..(3144)
<223> AAV2-3' ITR 15 <223> pAAV.CB7.CI.solanezumabscFv.RBG
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (1)..(130)
<223> AAV2-5' ITR
<220>
<221> область_повтора(ов)
<222> (198)..(579)
<223> промотор IE CMV
<220>
<221> промотор
<222> (582)..(863)
<223> промотор CB
<220>
<221> Интрон
<222> (958)..(1930)
<223> интрон куриного бета-актина
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1942)..(2001)
<223> сигнал секреции IL-2
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2002)..(2334)
<223> вариабельная область тяжелой цепи соланезумаба
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2335)..(2379)
<223> линкер Gly-Ser
<220>
<221> прочий_признак
<222> (2380)..(2715)
<223> вариабельная область легкой цепи соланезумаба
<220>
<221> полиA_сигнал
<222> (2800)..(2926)
<223> полиА глобина кролика
<220>
<221> прочий_признак
<222> (3015)..(3144)
<223> AAV2-3' ITR

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены композиции для лечения болезни Альцгеймера, содержащие по меньшей мере один AAV вектор. Предложен способ лечения болезни Альцгеймера, включающий интратекальную доставку пациенту одной из вышеуказанных композиций, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфический для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективное лечение болезни Альцгеймера. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Композиция, содержащая по меньшей мере один AAV вектор, разработанный для интратекальной доставки для лечения нейродегенеративного нарушения, причем нейродегенеративное нарушение представляет собой болезнь Альцгеймера, причем указанная композиция содержит AAV вектор, содержащий капсид AAV, мишенью которого является клетка центральной нервной системы, с упаковкой в нем по меньшей мере одной последовательности инвертированного концевого повтора AAV и последовательностей, кодирующих иммуноглобулиновую конструкцию, функционально связанную с контролирующими ее экспрессию последовательностями, при этом композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, причем иммуноглобулиновая конструкция представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv).

2. Композиция по п.1, причем композиция содержит биомассу по меньшей мере одного вектора, который экспрессирует иммуноглобулин, специфический для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка.

3. Композиция по п.2, в которой scFv имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, которая содержит биомассу AAV, содержащего по меньшей мере две различных кассеты для экспрессии антител.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, которая содержит биомассу AAV, содержащего одну кассету для экспрессии иммуноглобулина.

6. Композиция по п.1, которая доставляется интратекально и лечит как заболевание центральной нервной системы, так и системно.

7. Композиция по п.1, в случае которой иммуноглобулиновая конструкция включает иммуноглобулин с модификацией, чтобы иметь уменьшенное или неопределяемое сродство к неонатальному Fc-рецептору (FcRn).

8. Композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая биомассу по меньшей мере одного вектора, содержащего капсид AAV, мишенью которого является клетка центральной нервной системы, с упаковкой в нем по меньшей мере одной последовательности инвертированного концевого повтора AAV и последовательностей, кодирующих иммуноглобулиновую конструкцию, функционально связанную с контролирующими ее экспрессию последовательностями, причем биомасса по меньшей мере одного вектора экспрессирует иммуноглобулиновую конструкцию, специфическую для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка, и при этом композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, и причем иммуноглобулиновая конструкция представляет собой scFv.

9. Композиция по п.8, в которой scFv имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12.

10. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий интратекальную доставку композиции по любому из пп. 1-3, в которой биомасса по меньшей мере одного вектора экспрессирует иммуноглобулин, специфический для Aβ, бета-секретазы и/или тау-белка, пациенту.

11. Способ по п.10, в котором указанную композицию вводят в отсутствие химического или физического нарушения гематоэнцефалического барьера.