АНТИТЕЛА, БЛОКИРУЮЩИЕ CD73 Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 C07K16/40 C12N15/13 A61K39/395 A61P35/00 

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № US 62/837214, поданной 23 апреля 2019 г., которая полностью включена в данную заявку посредством ссылки, включая все чертежи.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе с Перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла, названного «CD73-6_ST25», созданного 1 апреля 2020 г., размер которого составляет 62 килобайта. Информация в электронном формате о Перечне последовательностей полностью включена в данную заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В соответствии с настоящим изобретением предложены антитела и их фрагменты, которые связывают и ингибируют CD73. В соответствии с настоящим изобретением также предложены клетки, продуцирующие такие соединения; способы получения таких соединений и антител, их фрагментов, вариантов и производных; фармацевтические композиции, содержащие их; способы применения соединений для диагностики, лечения или профилактики заболеваний, например, рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CD73 (экто-5'-нуклеотидаза) представляет собой заякоренный гликозилфосфатидилинозитолом (ГФИ) белок размером 70 кДа, который обычно экспрессируется на эндотелиальных клетках и субпопуляциях гематопоэтических клеток. CD73, вместе с CD39, регулирует метаболизм аденозинтрифосфата (АТФ). CD39 (НТФДаза-1) превращает АТФ в АМФ, причем высвобождаются только следовые количества АДФ, тогда как CD73 катализирует превращение АМФ в аденозин.

Аденозинтрифосфат (АТФ) и его метаболиты АМФ и аденозин играют важную роль в клеточном метаболизме, передаче сигналов и иммунном гомеостазе. Высвобождение внеклеточных аденозинтрифосфатов (АТФ) в ответ на гибель клеток или клеточный стресс приводит к активации иммунных ответов. Тем не менее, их метаболит аденозин проявляет иммуносупрессорную активность. Внеклеточный аденозин накапливается в раковых тканях и является частью важного механизма ускользания опухоли от иммунного ответа. Среди других эффектов, аденозин, происходящий из опухоли, сильно ингибирует инфильтрирующие опухоль эффекторные Т-клетки через рецепторы А2А, активирующие аденилатциклазу.

Сообщали об экспрессии CD73 в различных опухолевых клетках, включая клетки лейкоза, рака мочевого пузыря, глиомы, глиобластомы, рака яичников, меланомы, рака предстательной железы, рака щитовидной железы, рака пищевода и рака молочной железы. Экспрессия CD73 также была ассоциирована с прометастатическим фенотипом при меланоме и раке молочной железы. Сообщалось, что терапия антителом, которое связывает CD73 мыши, может ингибировать рост и метастазирование опухоли молочной железы у мышей (Stagg, и др. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:1547-1552). Было показано, что генетическая делеция рецепторов А2А может вызывать зависимое от Т-клеток отторжение опухоли (Ohta, и др., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:13132-13137). Нокдаун с применением миРНК или сверхэкспрессия CD73 на опухолевых клетках может модулировать рост и метастазирование опухоли (Beavis и др., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14711 -716; Stagg и др. (2010), выше; Jin и др. (2010) Cancer Res. 70: 2245-55). Мыши CD73-/-защищены от трансплантированных и спонтанных опухолей (Stagg и др. (2010) Cancer Res. 71: 2892-2900). Было показано, что у людей высокая экспрессия CD73 является отрицательным прогностическим фактором при трижды негативном раке молочной железы (Loi и др., 2013, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 11091-11096). Тем не менее, хотя CD73 экспрессируется на опухолевых клетках, он также экспрессируется на различных клетках иммунной системы, в частности, на CD4 и CD8 Т-клетках, а также на В-клетках. Кроме того, еще одним осложняющим фактором является то, что многие антитела, описанные в литературе, как правило, принадлежали к изотипам мыши, с которыми способны связываться рецепторы Fcγ, что мешает отличить любой потенциально блокирующий эффект от Fc-опосредованных эффектов.

Несмотря на давний интерес к CD73 в качестве терапевтической мишени, сохраняется потребность в антителах с более высокой эффективностью ингибирования ферментативной активности CD73, которые пригодны для применения в терапии человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения предлагают антитела, которые связываются с эпитопом, присутствующим на CD73, экспрессированном на поверхности клеток, включая опухолевые клетки, и которые ингибируют ферментативную (экто-5'нуклеотидазную) активность фермента CD73. Указанные антитела содержат каркасные области человеческого происхождения с минимальным содержанием последовательности нечеловеческого происхождения (например, из мыши). Антитела могут связывать CD73 внутридимерным способом и могут ингибировать ферментативную активность как растворимого CD73, так и связанного с мембраной белка CD73, экспрессированного на поверхности клеток. Предпочтительно, данные антитела можно применять в качестве исключительно блокирующих CD73 антител, например, они ингибируют ферментативную активность связанного с мембраной белка CD73, экспрессированного на поверхности клеток, по существу не связывая Fcγ-рецепторы и/или по существу не направляя АЗКЦ на экспрессирующую CD73 клетку. Необязательно антитела сохраняют домен Fc и сохраняют связывание с FcRn человека. Предпочтительно, у указанных антител может быть низкий риск иммуногенности, например, низкая или пониженная (по сравнению с исходным антителом мыши) вероятность вызвать ответ антител человека против антител мыши (НАМА) при введении человеку.

Антитела связываются с эпитопом, присутствующим на полипептиде CD73 человека, экспрессированном на поверхности клеток, включая, но не ограничиваясь опухолевыми клетками, и ингибируют ферментативную (экто-5'-нуклеотидазную) активность фермента CD73. Они обладают особенно предпочтительной способностью ингибировать подавление пролиферации Т-клеток, опосредованное CD73, и, следовательно, могут вызывать повышение биологической активности, включая, но не ограничиваясь пролиферацией, цитотоксических CD4 и/или CD8 Т-клеток, например, которое наблюдают в анализе пролиферации Т-клеток. В одном варианте реализации ингибирование или нейтрализацию ферментативной активности CD73 определяют путем оценки способности антитела или фрагмента антитела повышать пролиферацию Т-клеток, когда вызвана пролиферация указанных Т-клеток in vitro (например, посредством костимуляции TCR) в присутствии АМФ (например, экзогенно добавленного АМФ).

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, или их антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36. В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, или их антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 33.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, или их антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 43, 44, 45 или 46. В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, или их антигенсвязывающий домен, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 43.

В одном варианте реализации предложены направленные против CD73 антитело или фрагмент антитела, содержащие тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 39.

В одном варианте реализации предложены направленные против CD73 антитело или фрагмент антитела, содержащие тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 48.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит его (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGHV1-3 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGHJ4 человека); и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGKV1-33 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGKJ2 человека). Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 59 по Кабату (HCDR2), представляет собой остаток лейцина или глутамина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 60 по Кабату (HCDR2), представляет собой остаток треонина или лизина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 97 по Кабату (HCDR3), представляет собой остаток глицина или аспарагина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области легкой цепи в положении 30 по Кабату (LCDR1), представляет собой остаток серина или треонина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области легкой цепи в положении 53 по Кабату (LCDR2), представляет собой остаток треонина или аспарагина.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит его (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 2, 8 и 9, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGHV1-3 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGHJ4 человека); и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 10, 11 и 7, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGKV1-33 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGKJ2 человека). В одном варианте реализации VH дополнительно содержит одну, две или три аминокислотные замены в CDR тяжелой цепи по Кабату в положениях тяжелой цепи по Кабату, выбранных из группы, состоящей из 59 (HCDR2), 60 (HCDR2) и 97 (HCDR3). Необязательно остаток лейцина в положении 59 заменен на остаток глутамина. Необязательно остаток треонина в положении 60 заменен на остаток лизина. Необязательно остаток глицина в положении 97 заменен на остаток аспарагина. В одном варианте реализации VL дополнительно содержит замену аминокислоты в CDR легкой цепи по Кабату в положениях по Кабату легкой цепи 30 (LCDR1) и/или 53 (LCDR2), необязательно дополнительно при этом остаток серина в положении 30 заменен на остаток треонина, необязательно дополнительно при этом остаток треонина в положении 53 заменен на остаток аспарагина.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит его (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 2, 12 и 13, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGHV1-3 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGHJ4 человека); и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 14, 15 и 7, и последовательности аминокислот каркасных областей FR1, FR2 и FR3 из гена IGKV1-33 человека (и, необязательно, дополнительные последовательности аминокислот каркасной области 4 (FR4) из гена IGKJ2 человека).

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в настоящем документе, вариабельная область тяжелой цепи (VH) может быть охарактеризована как содержащая одну, две, три, четыре или пять замен аминокислот в положениях по Кабату, выбранных из группы, состоящей из 2, 30, 48, 69 и 73, тяжелой цепи, необязательно при этом остаток, присутствующий в последовательности человека в конкретном положении, заменен на остаток, присутствующий в донорной последовательности мыши в этом конкретном положении; и вариабельная область легкой цепи (VL) может быть охарактеризована как содержащая замену аминокислоты в положении 67 по Кабату легкой цепи, необязательно при этом остаток, присутствующий в последовательности человека в конкретном положении, заменен на остаток, присутствующий в донорной последовательности мыши в этом конкретном положении. В одном варианте реализации VL содержит замену в положении 67 по Кабату легкой цепи и, необязательно, дополнительно содержит одну, две или три аминокислотные замены в положениях по Кабату, выбранных из группы, состоящей из 2, 67 и 87, легкой цепи, необязательно при этом остаток, присутствующий в последовательности человека в конкретном положении, заменен на остаток, присутствующий в донорной последовательности мыши в этом конкретном положении. В одном варианте реализации антитело или связывающий домен антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую замены аминокислот V2I, Т30А, M48I, I69L и T73K, и вариабельную область легкой цепи, содержащую замену аминокислоты S67Y, причем нумерация представлена по Кабату.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 2 по Кабату тяжелой цепи представляет собой изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 30 по Кабату тяжелой цепи представляет собой аланин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 48 по Кабату тяжелой цепи представляет собой изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 69 по Кабату тяжелой цепи представляет собой лейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 73 по Кабату тяжелой цепи представляет собой лизин.

В одном варианте реализации VH содержит остаток изолейцина в положении 2 по Кабату, аланин в положении 30, изолейцин в положении 48, лейцин в положении 69 и лизин в положении 73.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 67 по Кабату легкой цепи представляет собой тирозин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 60 по Кабату легкой цепи представляет собой аспарагиновую кислоту.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 2 по Кабату легкой цепи представляет собой изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 87 по Кабату легкой цепи представляет собой фенилаланин.

В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату; необязательно VL не содержит других замен в каркасной области по Кабату на остатки, не являющиеся человеческими, и/или содержит каркасную область по Кабату VL, которая является полностью человеческой, кроме замены в остатке 67.

В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату и аспарагиновую кислоту в положении 60.

В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату, аспарагиновую кислоту в положении 60 и изолейцин в положении 2.

В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату, аспарагиновую кислоту в положении 60, изолейцин в положении 2 и фенилаланин в положении 87.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит указанный антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности аминокислот SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности аминокислот, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36. В одном варианте реализации VH содержит CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в последовательностях SEQ ID NO: 2, 12 и 13, и VL содержит CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 14, 15 и 7. В одном варианте реализации VH содержит остаток изолейцина в положении 2 по Кабату, аланин в положении 30, изолейцин в положении 48, лейцин в положении 69 и лизин в положении 73. В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит указанный антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 с соответствующими последовательностями аминокислот, представленными в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, и каркасные области из человека (например, FR1, FR2, FR3 и FR4 человеческого происхождения); и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL), содержащие соответствующие последовательности аминокислот, представленные в SEQ ID NO: 5, 6 и 7, и каркасные области из человека (например, FR1, FR2, FR3 и FR4 человеческого происхождения), причем (VH) содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности аминокислот SEQ ID NO: 37 или 42, и вариабельная область легкой цепи (VL) содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичную последовательности аминокислот, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 33-36 или 43-46). Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 59 по Кабату (HCDR2), представляет собой остаток лейцина или глутамина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 60 по Кабату (HCDR2), представляет собой остаток треонина или лизина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области тяжелой цепи в положении 97 по Кабату (HCDR3), представляет собой остаток глицина или аспарагина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области легкой цепи в положении 30 по Кабату (LCDR1), представляет собой остаток серина или треонина. Необязательно остаток, присутствующий в вариабельной области легкой цепи в положении 53 по Кабату (LCDR2), представляет собой остаток треонина или аспарагина. В одном варианте реализации VH содержит остаток изолейцина в положении 2 по Кабату, аланин в положении 30, изолейцин в положении 48, лейцин в положении 69 и лизин в положении 73. В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату.

В любом варианте реализации VH можно охарактеризовать как содержащий последовательности аминокислот акцепторной каркасной области VH человека, и VL содержит последовательности аминокислот акцепторной каркасной области VL человека. В одном варианте реализации VH-сегмент акцепторной каркасной области VH человека происходит из сегмента гена IGHV1-3 человека, а J-сегмент происходит из сегмента гена IGHJ4 человека. В одном варианте реализации акцепторная каркасная область VH человека происходит из сегмента гена IGHV1-3*01 человека. В одном варианте реализации человеческая акцепторная каркасная область домена VL происходит из сегмента гена IGKV1-33 человека, необязательно человеческая акцепторная каркасная область домена VL происходит из сегмента гена IGKV1-33*01 человека. В одном варианте реализации акцепторная каркасная область домена VL человека содержит J-сегмент из сегмента гена IGKJ2 человека.

В одном варианте реализации антитело или фрагмент антитела содержит домен Н4+VH и домен L1, L2, L3 или L4 VL. В одном варианте реализации антитело представляет собой антитело H4+L1.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит указанный антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 33, 34, 35 или 36.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем указанное антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела H4+L1.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают полипептид CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 37, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 33.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают полипептид CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем антитело или фрагмент антитела содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 38, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 39.

В одном варианте реализации антитело или фрагмент антитела содержит домен 2Н4+VH и домен 2L1, 2L2, 2L3 или 2L4 VL. В одном варианте реализации антитело представляет собой антитело 2H4+2L1.

В одном варианте реализации предложен направленный против CD73 антигенсвязывающий домен или белок, который содержит указанный антигенсвязывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, полиспецифический связывающий белок, биспецифическое антитело и т.д.), содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NO: 43, 44, 45 или 46.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем указанное антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела 2H4+2L1.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают полипептид CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 43.

В одном варианте реализации предложено антитело или фрагмент антитела, которые связывают полипептид CD73 человека и которые нейтрализуют АТФазную активность CD73, причем антитело или фрагмент антитела содержат тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 48.

В одном варианте реализации антитела не являются обедняющими и нейтрализуют ферментативную активность CD73 в окружении опухоли.

В одном варианте реализации антитело представляет собой антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. Например, антитело может представлять собой антитело, содержащее домен Fc изотипа IgG4 человека, или антитело, содержащее домен Fc любого изотипа IgG человека (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), модифицированный для уменьшения или утраты связывания между доменом Fc и рецептором Fcγ человека (например, CD16), необязательно модифицированный для уменьшения связывания между доменом Fc и множеством рецепторов Fcγ человека, например, CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и CD64). В одном варианте реализации антитела содержат домен Fc подтипа IgG человека (например, IgG1), содержащий модификацию аминокислоты, которая приводит к снижению (по сравнению с антителом, содержащим домен Fc IgG1 человека дикого типа) или по существу к полной утрате связывания с каждым из CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и CD64.

В любом варианте реализации тяжелая цепь антитела содержит константный домен СН1 человека и модифицированный домен Fc человека, необязательно изотипа IgG1 человека, необязательно дополнительно содержащий последовательность аминокислот, представленную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 17, 18 или 19. В любом варианте реализации легкая цепь антитела содержит константный домен легкой цепи человека, необязательно при этом константный домен представляет собой домен каппа человека.

В одном аспекте антитела в соответствии с настоящим изобретением не вызывают или не повышают внутриклеточную интернализацию, или в более общем смысле, понижающую модуляцию, экспрессированного на поверхности клетки полипептида CD73 и/или не зависят от нее для проявления своей ингибирующей активности в отношении CD73. Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут оказывать большую ингибирующую активность (способность по существу нейтрализовать ферментативную активность CD73), чем антитела, которые ингибируют CD73, вызывая интернализацию CD73. В отличие от антител, которые ингибируют растворимый CD73 посредством других механизмов (например, вызывая образование олигомера CD73-антитело), антитела в соответствии с настоящим изобретением способны ингибировать ферментативную активность CD73 при высоком (например, 10-кратном) избытке антитело:фермент. Кроме того, в отличие от антител, которые связывают эпитоп на рекомбинантном CD73, который может быть модифицирован или может отсутствовать на CD73 на поверхности клетки (например, антитело 7G2), или связывают его с аффинностью, которая слишком низка, чтобы привести к эффективности в экспрессирующих CD73 клетках, антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с высокой аффинностью с эпитопом, который присутствует и/или остается интактным на CD73 на поверхности клетки, что дает антителам способность эффективно нейтрализовать ферментативную активность клеточного CD73. Антитела в соответствии с настоящим изобретением ингибируют ферментативную активность CD73 в клетках, но необязательно могут также ингибировать экто-5'-нуклеотидазную активность растворимого рекомбинантного CD73 (что наблюдали в бесклеточном анализе с использованием растворимого димерного полипептида CD73).

В одном аспекте антитела в соответствии с настоящим изобретением способны ингибировать активность полипептида CD73 человека, не связываясь с активным центром фермента полипептида CD73, и/или являются неконкурентными ингибиторами CD73, например, они ингибируют активность полипептида CD73 человека без детектируемого снижения связывания между полипептидом CD73 и его природным субстратом.

В одном аспекте антитела в соответствии с настоящим изобретением утрачивают связывание с мутантами CD73, содержащими замену в остатке K136. В одном аспекте наблюдается снижение связывания антител в соответствии с настоящим изобретением с мутантами CD73, содержащими замену в остатках K136 (на основании последовательности SEQ ID NO: 1; и по сравнению с CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1); необязательно также наблюдается снижение связывания антител с мутантами CD73, содержащими замену в остатках А99, Е129, K133, Е134 и А135 (в последовательности SEQ ID NO: 1; и по сравнению с CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; необязательно дополнительно наблюдается снижение связывания антител с мутантами CD73, содержащими замену в остатках K97, Е125, Q153 и K330 (на основании последовательности SEQ ID NO: 1; и по сравнению с CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.

В одном варианте реализации антитела связываются с эпитопом на каждой полипептидной цепи CD73 в димере CD73 (то есть связываются с CD73 внутридимерным способом), необязательно дополнительно при этом эпитоп присутствует на одной и той же поверхности димера CD73. Таким образом, антитела могут связываться бивалентно с одним димером CD73, то есть, в положении, которое является более «закрытым», в котором сайты связывания антител пространственно более отдалены друг от друга, чем в «открытом» положении. Ввиду связывания со связанным с лигандом CD73, антитела, описанные в данном документе, могут быть пригодны для связывания с CD73, когда он связан с АМФ, например, для лечения индивида или рака, характеризующегося (например, как известно или предполагается, характеризующегося) окружением опухоли, в котором предшественник АДФ и/или АМФ присутствуют на значительных уровнях до лечения. Антитела могут быть пригодны для лечения индивида или рака, при котором (например, как известно или предполагается) для окружения опухоли характерны высокие уровни АДФ (например, продуцированного умирающими клетками, который захватывает CD73 на стромальном и клеточном инфильтрате (например, на клетках TReg) с образованием высоких уровней АМФ), а также, в более общем случае, АМФ, аденозин, присутствие или уровни экспрессии CD73 или экспрессирующих CD73 клеток, высокие (например, по сравнению со здоровыми тканями) количества или частоты встречаемости экспрессирующих CD73 клеток и/или высокие уровни экспрессии CD73 на клетках (например, которые оценивали с помощью иммуногистохимического анализа), высокие (например, по сравнению со здоровыми тканями) уровни растворимых полипептидов CD73 (например, которые оценивали с помощью ELISA или, в общем, любого анализа детектирования на основе антител) или присутствие или уровни экспрессии рецептора аденозина или экспрессирующих рецептор аденозина клеток. Молекулы CD73 в окружении опухоли могут находиться в связанной с субстратом конформации, и способность связывать и ингибировать связанный с субстратом клеточный CD73 (например, клетки, экспрессирующие CD73, предварительно инкубированные с субстратом, таким как АМФ), дополнительно к несвязанному с субстратом CD73, может обусловить большую способность ингибировать CD73 in vivo. Необязательно перед лечением можно оценить уровень растворимого белка CD73, количество или частоту встречаемости экспрессирующих CD73 клеток и/или уровни экспрессии CD73 на клетках в окружении опухоли. Антитела могут быть особенно полезны для лечения индивида, имеющего значительные уровни (например, высокие уровни по сравнению с референсными) растворимого белка CD73, количества или частоты встречаемости экспрессирующих CD73 клеток и/или уровни экспрессии CD73 на клетках в образце опухоли.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело или фрагмент антитела, которое связывает полипептид CD73 человека, экспрессированный на поверхности клеток, и ингибирует ферментативную (экто-5'нуклеотидазную) активность полипептида CD73, причем антитело способно бивалентно связываться с одним димером полипептидов CD73 (с растворимым димером полипептидов CD73 или с димером полипептидов CD73, экспрессированным клеткой). Необязательно антитело связывается первым связывающим антиген доменом с первым полипептидом CD73 в димере и вторым связывающим антиген доменом со вторым полипептидом CD73. В одном аспекте антитело представляет собой аллостерический ингибитор полипептида CD73.

Эпитоп на CD73, с которым связываются указанные антитела, присутствует на полипептидах CD73, экспрессируемых рядом клеток, например, раковыми клетками, CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками, В-клетками, трансфицированными клетками, и связывание происходит с высокой аффинностью, что определяют с помощью проточной цитометрии. Например, для антитела может быть характерна ЕС₅₀, определенная с помощью проточной цитометрии, составляющая не более 5 мкг/мл, необязательно не более 2 мкг/мл, не более 1 мкг/мл, не более 0,5 мкг/мл, не более 0,1 мкг/мл или не более 0,05 мкг/мл для связывания с клетками, которые экспрессируют на поверхности полипептид CD73. В одном варианте реализации клетки представляют собой клетки, которые заставили экспрессировать CD73 на своей поверхности. В одном варианте реализации клетки представляют собой клетки, которые эндогенно экспрессируют CD73 на поверхности, например, раковые клетки, клетки лейкоза, клетки рака мочевого пузыря, клетки глиомы, клетки глиобластомы, клетки рака яичников, клетки меланомы, клетки рака предстательной железы, клетки рака щитовидной железы, клетки рака пищевода или клетки рака молочной железы.

В одном варианте реализации нейтрализующие CD73 антитела можно охарактеризовать как способные вызывать снижение 5'-эктонуклеотидазной активности CD73 в клетках по меньшей мере на 60%, 75% или 80%. В одном варианте реализации для нейтрализующих CD73 антител может быть характерна ЕС₅₀ для ингибирования 5'-эктонуклеотидазной активности CD73, экспрессируемого клеткой, составляющая не более 1 мкг/мл, необязательно не более 0,5 мкг/мл, необязательно не более 0,2 мкг/мл.

Необязательно ингибирование 5'-эктонуклеотидазной активности CD73, экспрессируемого клеткой, определяют путем оценки нейтрализации 5'-эктонуклеотидазной активности в экспрессирующих CD73 клетках (например, клетках MDA-MB-231) путем количественного анализа гидролиза АМФ с образованием аденозина.

Необязательно ингибирование 5'-эктонуклеотидазной активности CD73, экспрессируемого клеткой, определяют путем оценки способности антитела или фрагмента антитела повышать пролиферацию Т-клеток, когда вызвана пролиферация указанных Т-клеток (например, от здорового донора-человека) in vitro (например, посредством костимуляции TCR, стимуляции сигнализации CD3 и CD28, например, путем приведения Т-клеток в контакт с гранулами, функционализированными агонистами CD3 и агонистами CD28) в присутствии АМФ (например, экзогенно добавленного АМФ). Необязательно пролиферацию Т-клеток оценивают с использованием анализа, описанного в разделе Примеры в данном документе (см. Пример 5 и Методы).

В одном аспекте антитело против CD73 связывает общую антигенную детерминанту, присутствующую как на растворимом CD73, так и на CD73, экспрессированном на поверхности клеток.

В одном аспекте антитело против CD73 связывает антигенную детерминанту в каждой полипептидной цепи CD73 в димере CD73 (внутридимерным способом), например, когда антигенные детерминанты присутствуют на общей поверхности димера CD73.

В одном аспекте антитело против CD73 связывает эпитоп на CD73, содержащий остаток K136 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитело против CD73 связывает эпитоп на CD73, содержащий один, два, три или четыре остатка, выбранных из группы, состоящей из K97, Е125, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитело против CD73 связывает эпитоп на CD73, содержащий один, два, три, четыре или пять остатков, выбранных из группы, состоящей из А99, Е129, K133, Е134 и А135 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитело против CD73 связывается по меньшей мере частично внутри домена или фрагмента из аминокислотных остатков на белке CD73 человека (например, гомодимерном белке CD73), содержащего аминокислотные остатки K97, А99, E125, Е129, K133, Е134, А135, K136, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1). В одном аспекте антитело против CD73 связывает эпитоп на CD73, содержащий по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или более остатков, выбранных из группы, состоящей из K97, А99, Е125, Е129, K133, Е134, А135, K136, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитело против CD73 проявляет пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке K136 (в последовательности SEQ ID NO: 1), по сравнению с полипептидом CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; необязательно мутантный полипептид CD73 содержит мутацию K136A.

В одном аспекте антитело против CD73 проявляет пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из: K97, Е125, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1), по сравнению с полипептидом CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; необязательно мутантный полипептид CD73 содержит следующие мутации: K97A, Е125А, Q153A и/или K330A (например, K97A, Е125А и K330A; K97A, Е125А и/или Q153A).

В одном аспекте антитело против CD73 проявляет пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из: А99, Е129, K133, Е134 и А135 (в последовательности SEQ ID NO: 1), по сравнению с полипептидом CD73 дикого типа, содержащим последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1; необязательно мутантный полипептид CD73 содержит следующие мутации: A99S, Е129А, K133A, E134N и A135S.

В одном варианте реализации предложены способы применения антител для лечения или предотвращения заболевания, например, инфекционного заболевания или рака. В одном аспекте антитела вводят индивиду, страдающему от рака, в количестве и с частотой, достаточной, чтобы нейтрализовать активность CD73 в микроокружении опухоли. Водном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для снижения образования и/или концентрации аденозина в микроокружении опухоли. Водном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для повышения образования и/или концентрации АТФ в микроокружении опухоли. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для нейтрализации активности CD73, экспрессированного опухолевыми клетками. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для нейтрализации активности CD73, экспрессированного CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками и/или В-клетками.

Антитела будут полезны для ингибирования опосредованного CD73 катаболизма АМФ с образованием аденозина, например, для уменьшения концентрации аденозина в микроокружении опухоли. Данные антитела, следовательно, будут полезны для обращения иммуносупрессорного действия CD73 и/или аденозина на Т-клетки, В-клетки и другие клетки, которые экспрессируют рецепторы аденозина, например, при лечении рака. В одном варианте реализации антитело против CD73 нейтрализует опосредованное аденозином ингибирование пролиферации, продукции цитокинов, цитотоксичности и/или активности NFkB в Т-клетках.

Поскольку опосредованный CD73 катаболизм АМФ с образованием аденозина является необратимым, в то время как катаболизм посредством CD73 АТФ с образованием АДФ и АДФ с образованием АМФ является обратимым (с помощью киназы NDK и аденилаткиназы, соответственно), антитела, которые блокируют необратимый катаболизм, опосредованный CD73, будут увеличивать запас АМФ и, тем самым, будут полезны для повышения концентраций АДФ и АТФ, например, в микроокружении опухоли. Указанные антитела могут быть полезны для повышения образования АДФ из АМФ и образования АТФ из АДФ. Поскольку АТФ играет иммуностимулирующую роль, антитела против CD73 могут быть полезны для активации Т-клеток, например, при лечении рака.

Антитела будут полезны для ингибирования продукции, количеств и/или концентраций аденозина в микроокружении опухоли.

Антитела, которые нейтрализуют активность растворимого димера полипептида CD73 человека, могут дополнительно нейтрализовать CD73 в любом другом подходящем контексте, например, в репортерной клетке, которую заставили экспрессировать CD73, в Т-клетке и т.д.

Предложен способ лечения индивида, указанный способ включает введение индивиду (например, индивиду, страдающему от заболевания, опухоли и т.д.) терапевтически активного количества любого из антигенсвязывающих соединений против CD73, описанных в настоящем документе. В одном аспекте предложен способ лечения индивида, указанный способ включает, состоит по существу из или состоит из: введения индивиду (например, индивиду, страдающему от заболевания, опухоли и т.д.) терапевтически активного количества антигенсвязывающего соединения в соответствии с настоящим изобретением.

В одном аспекте предложен способ уменьшения количества аденозина, продуцируемого экспрессирующей CD73 клеткой (например, иммунной клеткой и/или опухолевой клеткой у индивида), или способ нейтрализации ферментативной активности клеточного CD73, указанный способ включает, состоит по существу из или состоит из: приведения экспрессирующей CD73 клетки в контакт с антигенсвязывающим соединением в соответствии с настоящим изобретением (например, направленным против CD73 антителом или фрагментом антитела, или композицией, содержащей его). В одном варианте реализации этап приведения экспрессирующей CD73 клетки в контакт с антигенсвязывающим соединением в соответствии с настоящим изобретением включает введение индивиду терапевтически активного количества антигенсвязывающего соединения. В одном варианте реализации у индивида есть рак.

В одном аспекте предложен способ уменьшения количества аденозина, присутствующего в окружении опухоли (например, в организме индивида), указанный способ включает, состоит по существу из или состоит из: введения индивиду терапевтически активного количества соединения в соответствии с настоящим изобретением (например, направленного против CD73 антитела или фрагмента антитела, или композиции, содержащей его). В одном варианте реализации у индивида есть рак. Необязательно индивид представляет собой человека, у которого есть рак или который предрасположен к раку.

Для антител необязательно характерна аффинность связывания (K_D) с полипептидом CD73 человека (например, в виде димера CD73), которую определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР, например, в соответствии со способами, описанными в разделе Примеры), менее (лучше) 10^-9 М, предпочтительно менее 10^-10 M или предпочтительно менее 10^-11 М, и/или связывание с полипептидом CD73 человека с ЕС₅₀ менее (лучшее связывание) 1 мкг/мл. В некоторых случаях можно уточнить, что аффинность связывания представляет собой аффинность бивалентного связывания.

В одном варианте реализации ЕС₅₀ указанного антитела составляет не более 0,5 мкг/мл, в некоторых случаях не более 0,2 мкг/мл, в некоторых случаях не более 0,1 мкг/мл для связывания с клетками (например, опухолевыми клетками, клетками MDA-МВ-231), экспрессирующими CD73 человека на своей поверхности.

Для антител необязательно характерна ЕС₅₀ для нейтрализации ферментативной активности CD73 в экспрессирующих CD73 клетках (например, опухолевых клетках, клетках MDA-MB-231) менее (лучше) 1 мкг/мл, необязательно менее 0,5 мкг/мл.

В одном варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, у которого сохраняется специфичность связывания и способность нейтрализовать ферментативную активность CD73 (например, которую определяют путем оценки способности антитела или фрагмента антитела повышать пролиферацию Т-клеток, когда вызвана пролиферация указанных Т-клеток in vitro в присутствии АМФ (например, экзогенно добавленного АМФ). В одном варианте реализации антитело по существу так же эффективно или по меньшей мере так же эффективно, как и исходное антитело, содержащее соответствующие последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 40 и 41, в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73, необязательно при этом ЕС₅₀ антитела для нейтрализации ферментативной активности CD73 находится в пределах 1-log, 0,5-log ЕС₅₀ исходного антитела. В одном варианте реализации указанное антитело более эффективно, чем исходное антитело, содержащее соответствующие последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 40 и 41, в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73, причем необязательно ЕС₅₀ антитела для нейтрализации ферментативной активности CD73 ниже, чем у исходного антитела, содержащего соответствующие последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 40 и 41.

В одном варианте реализации антитело по существу так же эффективно или по меньшей мере так же эффективно, как и исходное антитело, содержащее соответствующие последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 27 и 28, в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73, необязательно при этом ЕС₅₀ антитела для нейтрализации ферментативной активности CD73 находится в пределах 1-log или 0,5-log ЕС₅₀ исходного антитела. В одном варианте реализации указанное антитело более эффективно, чем исходное антитело, содержащее соответствующие последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 27 и 28, в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73, необязательно при этом ЕС₅₀ антитела для нейтрализации ферментативной активности CD73 меньше, чем у исходного антитела, имеющего соответствующие последовательности аминокислот VH и VL SEQ ID NO: 27 и 28.

Также предложены изолированные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (например, наборы нуклеиновых кислот), кодирующие антитело (или его тяжелую или легкую цепь) или домен VH и/или VL согласно настоящему изобретению, вектор или набор векторов, содержащих такую нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), клетка, содержащая такой вектор, и способ получения направленного против CD73 антитела или фрагмента антитела человека, включающий культивирование такой клетки в условиях, подходящих для экспрессии направленного против CD73 антитела или фрагмента антитела. В соответствии с настоящим изобретением также предложены композиции, такие как фармацевтически приемлемые композиции, и наборы, содержащие такие белки, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки и, как правило, один или более дополнительных ингредиентов, которые могут представлять собой активные ингредиенты или неактивные ингредиенты, которые способствуют составлению, доставке, стабильности или другим характеристикам композиции (например, различные носители). В соответствии с настоящим изобретением дополнительно предложены различные новые и пригодные способы получения и применения таких антител, нуклеиновых кислот, векторов, клеток, организмов и/или композиций, например, для модулирования опосредованной CD73 биологической активности, например, для лечения заболеваний, связанных с ней, в частности, рака.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы получения или тестирования антитела или фрагмента антитела, которое связывает и нейтрализует ферментативную активность CD73.

В настоящем изобретении также предложен способ усиления активности лимфоцитов (например, Т-клеток) у нуждающегося в этом субъекта или восстановления активности лимфоцитов (например, Т-клеток), или способ ослабления опосредованного аденозином ингибирования активности лимфоцитов (например, Т-клеток), указанный способ включает введение субъекту эффективного количества любой из указанных выше композиций. В одном варианте реализации субъект представляет собой пациента, страдающего от рака. Например, пациент может страдать от солидной опухоли, например, коло ректального рака, рака почки, рака яичников, рака легких, рака молочной железы или злокачественной меланомы. В качестве альтернативы, пациент может страдать от гематопоэтического рака, например, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, множественной миеломы или неходжкинской лимфомы.

Указанные аспекты более полно изложены в описании, представленном в данном документе, и при его изучении будут очевидны дополнительные аспекты, особенности и преимущества.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигурах 1А-1В показаны кривые титрования, полученные для гуманизированных вариантов, содержащих вариабельные области тяжелой цепи Н0, Н1, Н2, Н3 и Н4, каждая из которых находится в комбинации с каждой из вариабельных областей легкой цепи L0, L1, L2, L3 и L4, и исходного антитела мыши HPLP, исследованные на трансфицированных линиях клеток, экспрессирующих белок CD73 человека (Фигура 1А) или яванского макака (Фигура 1В).

На Фигуре 2 показано блокирование ферментативной активности растворимого рекомбинантного CD73. На верхней левой панели (А) показано, что был измерен высокий уровень люминесценции при смешивании субстратов АТФ и CTG. При добавлении АМФ в реакционную смесь реакция CTG ингибировалась, что приводило к снижению люминесценции. В присутствии белка rhCD73, который гидролизует АМФ, уровень люминесценции восстанавливался. Показано блокирование ферментативной активности CD73 различными гуманизированными вариантами.

На Фигурах 3А-3С и 4А-4С показаны две серии экспериментов, проведенных для сравнения гуманизированных антител по их эффективности обращать опосредованное АМФ ингибирование пролиферации Т-клеток. На Фигурах 3А и 4А показан контроль пролиферации Т-клеток и ее ингибирование посредством АМФ для каждой серии экспериментов. На Фигурах 3В и 4В показана эффективность антител против CD73 в отношении восстановления пролиферации CD4+ Т-клеток, а на Фигурах 3С и 4С показана эффективность антител против CD73 в отношении восстановления пролиферации CD8+ Т-клеток. Пролиферацию клеток определяли по разведению маркера Cell Trace Violet. Данные выражены в виде среднего по двум повторам +/- стандартное отклонение.

На Фигурах 5А-5С показано, что пролиферация Т-клеток восстанавливалась всеми антителами против CD73. На фиг. 5А показан контроль пролиферации субпопуляции Т-клеток и ее ингибирование посредством АМФ. На Фигуре 5В показана эффективность антител Н4+Lx и исходного антитела HPLP в отношении восстановления пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток. На Фигуре 5С показана эффективность антител 2H4+2Lx (цепи 2Н4+ в комбинации с цепями 2L1, 2L2, 2L3 или 2L4) и исходного антитела 2HP2LP в отношении восстановления пролиферации CD4+ и CD8+ Т-клеток. Данные выражены в виде среднего по двум повторам +/- стандартное отклонение.

На Фигурах 6А и 6В показано, что пролиферация Т-клеток, восстановленная гуманизированными вариантами, воспроизводима, соответственно, в двух типичных донорах-людях. Показана эффективность вариантов 2H4+2Lx антитела против CD73 в отношении восстановления пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток. Данные выражены в виде среднего по двум повторам +/- стандартное отклонение.

На Фигуре 7 показано, что пролиферация CD4+ Т-клеток ингибируется АТФ и восстанавливается вариантами антитела 2H4+2Lx. Контроль пролиферации CD4+ Т-клеток и ее ингибирование посредством 100 мкМ АТФ, показанные при исследовании в двух типичных донорах D795 (фиг. 7А) и D664 (фиг. 7В). Данные выражены в виде среднего по двум повторам +/- стандартное отклонение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В настоящем описании формы единственного числа могут означать один или более. В пункте(-ах) формулы изобретения, при использовании в сочетании с термином «включающий», формы единственного числа могут означать один или более чем один. В данном документе «другой» может означать по меньшей мере второй или более.

Если используется термин «включающий», то его необязательно можно заменить на «состоящий по существу из» или на «состоящий из».

CD73 человека, также известный как экто-5'-нуклеотидаза и как 5'-рибонуклеотидфосфогидролаза, ЕС 3.1.3.5, кодируемый геном NT5E, проявляет 5'-нуклеотидазную, а именно АМФ-, НАД- и НМН-нуклеозидазные активности. При нейтральном рН CD73 катализирует превращение пуриновых 5'-мононуклеотидов в нуклеозиды, предпочтительным субстратом является АМФ. Данный фермент состоит из димера из 2 идентичных субъединиц с молекулярной массой 70 кДа, связанных гликозилфосфатидилинозитольной связью с внешней поверхностью плазматической мембраны. Последовательность аминокислот пребелка CD73 человека (мономера), включая сигнальную последовательность (аминокислоты 1-26), представлена в Genbank под номером доступа NP_002517, сведения о которой полностью включены в данную заявку посредством ссылки и приведены далее:

В контексте данного документа «нейтрализовать ферментативную активность CD73» относится к процессу, в котором 5'-нуклеотидазная (5'-эктонуклеотидазная) активность CD73 ингибируется. Это включает, в частности, ингибирование опосредованного CD73 образования аденозина, т.е., ингибирование опосредованного CD73 катаболизма АМФ с образованием аденозина. Это можно измерить, например, в бесклеточном анализе, в котором измеряют способность тестируемого соединения ингибировать превращение АМФ в аденозин, либо непосредственно, либо опосредованно. В одном варианте реализации препарат антител вызывает снижение по меньшей мере на 50% превращения АМФ в аденозин, снижение по меньшей мере на 70% превращения АМФ в аденозин или снижение по меньшей мере на 80% превращения АМФ в аденозин, что определяют, например, в способах анализа, описанных в данной заявке.

Всякий раз, когда в данном описании "лечение рака" или тому подобные формулировки упоминаются в отношении направленного против CD73 связывающего агента (например, антитела), они означают: (а) способ лечения рака, причем указанный способ включает этап введения (для по меньшей мере одного лечения) направленного против CD73 связывающего агента (предпочтительно в фармацевтически приемлемом материале-носителе) индивиду, млекопитающему, в частности, человеку, нуждающемуся в таком лечении, в дозе, которая позволяет лечить рак (терапевтически эффективном количестве), предпочтительно в дозе (количестве), указанной в настоящем документе; (b) применение направленного против CD73 связывающего агента для лечения рака, или направленный против CD73 связывающий агент для применения для указанного лечения (в частности, у человека); (с) применение направленного против CD73 связывающего агента для производства фармацевтического состава для лечения рака, способ применения направленного против CD73 связывающего агента для производства фармацевтического состава для лечения рака, включающий смешивание направленного против CD73 связывающего агента с фармацевтически приемлемым носителем, или фармацевтический состав, содержащий эффективную дозу направленного против CD73 связывающего агента, подходящую для лечения рака; или (d) любую комбинацию а), b) и с), в соответствии с объектом изобретения, допустимым для патентования в стране, в которой подана настоящая заявка.

Термин «антитело» в данном документе относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена в тяжелых цепях, антитела относят к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них дополнительно подразделяют на подклассы или изотипы, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и тому подобные изотипы. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар поли пептидных цепей, каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» (приблизительно 50-70 кДа) цепь. N-конец каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, которая в первую очередь отвечает за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (V_L) и вариабельная тяжелая цепь (V_H) относятся к данным легкой и тяжелой цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. IgG являются примерами классов антител, используемых в данной заявке, потому что они представляют собой наиболее распространенные антитела в физиологических условиях и потому что их наиболее просто получить в лабораторных условиях. Необязательно антитело представляет собой моноклональное антитело. Конкретными примерами антител являются гуманизированные, химерные, человеческие или другим образом подходящие человеку антитела. Термин «антитела» также включает любой фрагмент или производное любого из описанных в данной заявке антител.

Термин «специфически связывается» означает, что антитело может предпочтительно связываться в анализе конкурентного связывания с партнером по связыванию, например, CD73, что оценивают, используя либо рекомбинантные формы белков, либо эпитопы из них, либо нативные белки, присутствующие на поверхности изолированных клеток-мишеней. Способы анализа конкурентного связывания и другие способы определения специфического связывания дополнительно описаны ниже и хорошо известны в данной области.

Если указано, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом, то это означает, что антитело конкурирует с моноклональным антителом в анализе связывания с применением либо рекомбинантных молекул CD73, либо экспрессированных на поверхности молекул CD73. Например, если тестируемое антитело уменьшает связывание референсного антитела с полипептидом CD73 или экспрессирующей CD73 клеткой в анализе связывания, то говорят, что указанное антитело «конкурирует», соответственно, с референсным антителом.

Термин «аффинность» в данном документе означает силу связывания антитела с эпитопом. Аффинность антитела задается константой диссоциации Kd, которую определяют как [AT]x[АГ]/[АТ-АГ], где [АТ-АГ] представляет собой молярную концентрацию комплекса антитело-антиген, [AT] представляет собой молярную концентрацию несвязанного антитела и [АГ] представляет собой молярную концентрацию несвязанного антигена. Константу аффинности K_a определяют как 1/Kd. Способы определения аффинности МАТ можно найти в Harlow, и др., Antibodies: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, 1988), Coligan и др., ред., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. и Wiley Interscience, Нью-Йорк, (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), указанные материалы полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Одним стандартным способом, хорошо известным в данной области для определения аффинности МАТ, является применение скрининга методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (такого как анализ с применением аналитического устройства для ППР BIAcore™).

В рамках контекста в данном документе «детерминанта» обозначает место взаимодействия или связывания на полипептиде.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или участок на антигене, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфическим связывающим антиген антителом или пептидом, т.е., аминокислотные остатки внутри «области узнавания» антитела. Это наиболее простая форма или наименьшая структурная область на сложной молекуле антигена, которая может соединяться, например, с антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» представляет собой эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые являются смежными на линейной последовательности аминокислот (первичной структуре). Термин «конформационный или структурный эпитоп» представляет собой эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых являются смежными и, следовательно, представляют собой раздельные части линейной последовательности аминокислот, которые сближены друг с другом посредством укладки молекулы (вторичной, третичной и/или четвертичной структур). Конформационный эпитоп зависит от 3-мерной структуры. Термин «конформационный», следовательно, часто используют взаимозаменяемо с термином «структурный».

Термин «обеднять» или «обеднение», в отношении экспрессирующих CD73 клеток, означает процесс, способ или соединение, которые приводят к уничтожению, устранению, лизису или индукции такого уничтожения, устранения или лизиса, чтобы отрицательно повлиять на количество таких экспрессирующих CD73 клеток, присутствующих в образце или в организме субъекта.

Термин «интернализация», используемый взаимозаменяемо с термином «внутриклеточная интернализация», относится к молекулярным, биохимическим и клеточным событиям, связанным с процессом перемещения молекулы с внеклеточной поверхности клетки на внутриклеточную поверхность клетки. Процессы, отвечающие за внутриклеточную интернализацию молекул, хорошо известны и могут включать, среди прочего, интернализацию внеклеточных молекул (таких как гормоны, антитела и малые органические молекулы); ассоциированных с мембраной молекул (таких как рецепторы на поверхности клеток); и комплексов ассоциированных с мембраной молекул, связанных с внеклеточными молекулами (например, лиганда, связанного с трансмембранным рецептором, или антитела, связанного с ассоциированной с мембраной молекулой). Таким образом, формулировка «вызвать и/или повысить интернализацию» включает события, при которых вызывается внутриклеточная интернализация и/или скорость и/или масштаб внутриклеточной интернализации повышается.

Термин «агент» используют в данной заявке для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, который проявляет биологическую активность.

Для целей, описанных в данной заявке, «гуманизированное» или «человеческое» антитело относится к антителу, в котором константная и вариабельная область каркасной области одного или более иммуноглобулинов человека соединена со связывающей областью, например, определяющей комплементарность областью (CDR), иммуноглобулина животного. Такие антитела разработаны, чтобы сохранить специфичности связывания не принадлежащего человеку антитела, из которого получены указанные связывающие области, но избежать реакции иммунной системы против не принадлежащего человеку антитела. Такие антитела можно получить из трансгенных мышей или других животных, которые были «сконструированы», чтобы они продуцировали специфические человеческие антитела в ответ на провокацию антигеном (см., например, Green и др. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg и др. (1994) Nature 368:856; Taylor и др. (1994) Int Immun 6:579, информация из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки). Полностью человеческое антитело также можно сконструировать с помощью способов генетической или хромосомной трансфекции, а также технологии фагового дисплея, все из которых известны в данной области (см., например, McCafferty и др. (1990) Nature 348:552-553). Человеческие антитела также могут вырабатываться активированными in vitro В-клетками (см., например, патенты США номер 5567610 и 5229275, содержания которых полностью включены в данную заявку посредством ссылки).

Термин «гипервариабельный участок», используемый в данной заявке, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок, как правило, содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat и др. 1991) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917), или см. аналогичную систему определения необходимых аминокислот, отвечающих за связывание антигена. Обычно, нумерацию аминокислотных остатков в данном участке осуществляют с помощью способа, описанного в Kabat и др., выше. Такие формулировки, как «положение по Кабату», «нумерация остатков вариабельного домена по Кабату» и «согласно Кабату», используемые в данном документе, относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации по Кабату фактическая линейная последовательность аминокислот пептида может содержать меньшее количество аминокислот, что соответствует укорачиванию, или дополнительные аминокислоты, что соответствует вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52а согласно Кабату) после остатка 52 в CDR Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82 с и т.д. согласно Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Кабату можно определить для данного антитела путем выравнивания в участках гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Кабату последовательностью.

Термин остатки «каркаса» или «FR» в данном документе означает участок вариабельного домена антитела за исключением участков, определенных как CDR. Каждый каркас вариабельного домена антитела можно дополнительно подразделить на непрерывные участки, разделенные участками CDR (FR1, FR2, FR3 и FR4).

Термины «домен Fc», «часть Fc» и «область Fc» относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно аминокислоты (АК) 230 до приблизительно АК 450 тяжелой цепи γ (гамма) человека или аналогичной ей последовательности в другом типе тяжелых цепей антитела (например, α, δ, ε и μ для антитела человека), или встречающегося в природе ее аллотипа. Если не указано иное, в настоящем описании используют общепринятую нумерацию аминокислот по Кабату для иммуноглобулинов (см. Кабат и др. (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5oe изд., Министерство здравоохранения Соединенных Штатов Америки, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд).

Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который практически или по существу не содержит компонентов, которые при нормальных условиях сопутствуют ему при нахождении в природном состоянии. Чистоту и гомогенность обычно определяют, применяя методики аналитической химии, такие как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, который является преобладающим видом из присутствующих в препарате, является по существу очищенным.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в данной заявке по отношению к полимеру из аминокислотных остатков. Указанные термины распространяются на полимеры аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков представляет собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также на встречающиеся в природе полимеры аминокислот и не встречающиеся в природе полимеры аминокислот.

Термин «рекомбинантный», используемый, например, по отношению к клетке, или нуклеиновой кислоте, белку или вектору, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем внедрения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка произошла из клетки, модифицированной таким образом. Следовательно, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не обнаруживаются внутри нативной (нерекомбинантной) формы клетки, или экспрессируют нативные гены, которые иным образом аномально экспрессируются, экспрессируются на пониженном уровне или не экспрессируются вовсе.

В рамках контекста в данной заявке, термин антитело, которое «связывает» полипептид или эпитоп, означает антитело, которое связывает указанную детерминанту со специфичностью и/или аффинностью.

Термин «идентичность» или «идентичный», используемый по отношению к родству между последовательностями двух или более полипептидов, относится к степени родства между последовательностями полипептидов, которую определяют по количеству совпадений между цепочками из двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» является мерой процента точных совпадений меньшей из двух или более последовательностей с выровненными с использованием гэпов (при необходимости) последовательностями, что вычисляют с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (т.е., «алгоритмов»). Идентичность родственных полипептидов можно легко рассчитать с помощью известных способов. Такие способы включают, но не ограничены способами, описанными в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ред., Oxford University Press, Нью-Йорк, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ред., Academic Press, Нью-Йорк, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть 1, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., ред., Humana Press, Нью-Джерси, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. и Devereux, J., ред., M. Stockton Press, Нью-Йорк, 1991; и Carillo и др., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

Способы определения идентичности разработаны, чтобы определить наибольшее совпадение между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Способы определения идентичности между двумя последовательностями с помощью компьютерных программ включают пакет программ GCG, включая GAP (Devereux и др., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна на National Center for Biotechnology Information (NCBI) и в других источниках (BLAST Manual, Altschul и др. NCB/NLM/NIH Бетесда, Мэриленд. 20894; Altschul и др., выше). Хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана также можно использовать для определения идентичности.

Получение антител.

В основе настоящего изобретения, отчасти, лежит открытие модифицированных акцепторных каркасных последовательностей человека, в которые можно встроить CDR антитела, так что у полученной вариабельной области, направленной против CD73, наблюдают высокую эффективность нейтрализации ферментативной активности CD73 человека. Преимуществом указанных антител является низкая или пониженная иммуногенность у людей, например, более низкая способность или вероятность вызывать нежелательный направляемый антителом против CD73 иммунный ответ при введении человеку. Примеры таких антител согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие домен Н4+ или 2Н4+VH в комбинации с доменом L1, L2, L3, L4, 2L1, 2L2, 2L3 или 2L4 VL. Примеры антител в соответствии с настоящим изобретением включают антитела, содержащие пары доменов VH и VL любого из антител H4+L1, H4+L2, H4+L3, H4+L4, 2H4+L1, 2H4+L2, 2H4+L3 или 2H4+L4.

В одном аспекте антитело или фрагмент антитела, которое связывает полипептид CD73 человека, содержит каркасы VH и VL (например, FR1, FR2, FR3 и FR4) человеческого происхождения. В одном аспекте антитело или фрагмент антитела содержит: HCDR1 (CDR1 тяжелой цепи), содержащий последовательность аминокислот SYNMY, представленную в SEQ ID NO: 2; HCDR2 (CDR2 тяжелой цепи), содержащий последовательность аминокислот YIDPYNGGSSYNQKFKG, представленную в SEQ ID NO: 12, необязательно дополнительно при этом остаток глутамина (Q) в положении 13 SEQ ID NO: 12 может быть заменен на остаток лейцина (L), причем остаток лизина (K) в положении 14 SEQ ID NO: 12 может быть необязательно заменен на остаток треонина (Т); HCDR3 (CDR3 тяжелой цепи) содержащий последовательность аминокислот GYNNYKAWFAY, представленную в SEQ ID NO: 13, необязательно дополнительно при этом остаток аспарагина (N) в положении 3 SEQ ID NO: 13 может быть заменен на остаток глицина (G); LCDR1 (CDR1 легкой цепи), содержащий последовательность аминокислот KASQSVTNDVA, представленную в SEQ ID NO: 14, необязательно дополнительно при этом остаток треонина (Т) в положении 7 SEQ ID NO: 14 может быть заменен на остаток серина (S); LCDR2 (CDR2 легкой цепи), содержащий последовательность аминокислот YASNRYT, представленную в SEQ ID NO: 15, необязательно при этом остаток аспарагина (N) в положении 4 SEQ ID NO: 15 может быть заменен на остаток треонина (Т); и LCDR3 (CDR3 легкой цепи), содержащий последовательность аминокислот QQDYSSLT, представленную в SEQ ID NO: 7.

В одном варианте реализации HCDR2 содержит последовательность аминокислот Формулы I:

Y - I - D - P - Y - N - G - G - S - S - Y - N - Xaa₁ - Хаа₂ - F - K - G (SEQ ID NO: 3) или ее подпоследовательность, где Xaa₁ представляет собой Q (Gln) или L (Leu), и где Хаа₂ представляет собой K (Lys) или T (Thr).

В одном варианте реализации HCDR3 содержит последовательность аминокислот Формулы II:

G - Y - Xaa₁ - N - Y - K - A - W - F - A - Y (SEQ ID NO: 4) или ее подпоследовательность, где Xaa₁ представляет собой N (Asp) или G (Gly).

В одном варианте реализации LCDR1 содержит последовательность аминокислот Формулы III:

K - A - S - Q - S - V - Xaa₁ - N - D - V - A (SEQ ID NO: 5),

или ее подпоследовательность, где Xaa₁ представляет собой T (Thr) или S (Ser).

В одном варианте реализации LCDR2 содержит последовательность аминокислот Формулы IV:

Y - А - S - Xaa₁ - R - Y - T (SEQ ID NO: 6),

или ее подпоследовательность, где Xaa₁ представляет собой T (Thr) или N (Asn).

В одном аспекте изолированное антитело, которое связывает полипептид CD73 человека, содержит: HCDR1, содержащий последовательность аминокислот SYNMY, представленную в SEQ ID NO: 2; HCDR2, содержащий последовательность аминокислот YIDPYNGGSSYNLTFKG, представленную в SEQ ID NO: 8; HCDR3, содержащий последовательность аминокислот GYGNYKAWFAY, представленную в SEQ ID NO: 9; LCDR1, содержащий последовательность аминокислот KASQSVSNDVA, представленную в SEQ ID NO: 10; LCDR2, содержащий последовательность аминокислот YASTRYT, представленную в SEQ ID NO: 11; и LCDR3, содержащий последовательность аминокислот QQDYSSLT, представленную в SEQ ID NO: 7.

В одном аспекте изолированное антитело, которое связывает полипептид CD73 человека, содержит: HCDR1, содержащий последовательность аминокислот SYNMY, представленную в SEQ ID NO: 2; HCDR2, содержащий последовательность аминокислот YIDPYNGGSSYNQKFKG, представленную в SEQ ID NO: 12; HCDR3, содержащий последовательность аминокислот GYNNYKAWFAY, представленную в SEQ ID NO: 13; LCDR1, содержащий последовательность аминокислот KASQSVTNDVA, представленную в SEQ ID NO: 14; LCDR2, содержащий последовательность аминокислот YASNRYT, представленную в SEQ ID NO: 15; и LCDR3, содержащий последовательность аминокислот QQDYSSLT, представленную в SEQ ID NO: 7.

В одном варианте реализации антитело содержит каркасную область тяжелой цепи из подгруппы IGHV1-3 человека (необязательно вместе с IGHJ4), необязательно IGHV1-3 представляет собой IGHV1-3*01. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи из подгруппы IGKV1-33 человека (необязательно вместе с IGKJ2), необязательно из IGKV1-33*01.

Антитело может дополнительно содержать одну, две, три, четыре, пять или более замен аминокислот в каркасных областях тяжелой и/или легкой цепи человека, например, для улучшения аффинности, стабильности или других свойств антитела.

Примеры последовательностей аминокислот VH и VL антител против CD73 представлены в Примере 6 (показана последовательность для цепи Н4+ и в Таблице 5 - для антител 2H4+2Lx) и в Таблице 1 для цепей L1-L4.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий домен или антитело, или фрагмент антитела, которые связывают полипептид CD73 человека, содержащий:

(a) CDR-H1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2;

(b) CDR-H2, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, 8 или 12;

(c) CDR-H3, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, 9 или 13;

(d) CDR-L1, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 5, 10 или 14;

(e) CDR-L2, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 6, 11 или 15;

(f) CDR-L3, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 7; и

(g) последовательности каркасных областей тяжелой и легкой цепи человека.

В одном варианте реализации антитело содержит каркасную область тяжелой цепи из подгруппы IGHV1-3 человека вместе с IGHJ4, необязательно указанные антитела содержат IGHV1-3*01, вместе с IGHJ4. В одном варианте реализации гуманизированное антитело содержит каркасную область легкой цепи из подгруппы IGKV1-33 человека, необязательно IGKV1-33*01, вместе с IGKJ2.

Необязательно в любом варианте реализации может быть указано, что антитело может представлять собой антитело, отличное от исходного антитела мыши, например, исходного антитела мыши, содержащего VH и VL с соответствующими последовательностями SEQ ID NO: 27 и 28, или содержащего VH и VL с соответствующими последовательностями SEQ ID NO: 40 и 41.

Необязательно, человеческая каркасная область содержит одну или более мутаций, например, обратных мутаций для введения остатка, присутствующего в конкретном положении у млекопитающего, не являющегося человеком (например, мыши).

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 2 по Кабату тяжелой цепи представляет собой изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 30 по Кабату тяжелой цепи представляет собой аланин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 48 по Кабату тяжелой цепи представляет собой изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 69 по Кабату тяжелой цепи представляет собой лейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 73 по Кабату тяжелой цепи представляет собой лизин.

В одном варианте реализации VH содержит остаток изолейцина в положении 2 по Кабату, аланин в положении 30, изолейцин в положении 48, лейцин в положении 69 и лизин в положении 73.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 67 по Кабату легкой цепи представляет собой тирозин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 60 по Кабату легкой цепи представляет собой серии или аспарагиновую кислоту.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 2 по Кабату легкой цепи представляет собой валин или изолейцин.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 87 по Кабату легкой цепи представляет собой тирозин или фенилаланин.

В одном варианте реализации VL содержит остаток тирозина в положении 67 по Кабату, серии в положении 60, изолейцин в положении 2 и тирозин в положении 87.

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 28 по Кабату тяжелой цепи представляет собой треонин (Т).

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота в положении 66 по Кабату тяжелой цепи представляет собой аргинин (R).

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота положении 67 по Кабату тяжелой цепи представляет собой валин (V).

В одном аспекте любого варианта реализации, описанного в данной заявке, аминокислота положении 71 по Кабату тяжелой цепи представляет собой аргинин (R).

Положения в доменах VH и VL в настоящем документе описаны с использованием системы нумерации по Кабату (Kabat et al. (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5oe изд., Министерство здравоохранения Соединенных Штатов Америки, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд).

В одном аспекте антитело против CD73 содержит домен VH, последовательность которого идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или на 100%) последовательности домена VH, представленной в SEQ ID NO: 37 или 42.

В одном аспекте антитело или фрагмент антитела против CD73 содержит домен VL, последовательность которого идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности домена VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 33-36 или 43-46.

В одном аспекте антитело или фрагмент антитела против CD73 содержит домен VH, последовательность которого идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности домена VH, представленной в SEQ ID NO: 42, и домен VL, последовательность которого идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности домена VL, представленной в любой из SEQ ID NO: 43 -46.

В одном аспекте антитело или фрагмент антитела против CD73 содержит тяжелую цепь, последовательность которой идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности тяжелой цепи антитела H4+L1, представленной в SEQ ID NO: 38. В одном варианте реализации антитело или фрагмент антитела содержит легкую цепь, последовательность которой идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности легкой цепи антитела H4+L1, представленной в SEQ ID NO: 39.

В одном аспекте антитело или фрагмент антитела против CD73 содержит тяжелую цепь, последовательность которой идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности тяжелой цепи антитела 2Н4+2L1, представленной в SEQ ID NO: 47. В одном варианте реализации антитело или фрагмент антитела содержит легкую цепь, последовательность которой идентична по меньшей мере приблизительно на 80% (например, идентична по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% или идентична на 100%) последовательности легкой цепи антитела 2Н4+2L1, представленной в SEQ ID NO: 48.

ДНК, кодирующую антитело, можно получить и поместить в подходящий вектор экспрессии для трансфекции подходящего хозяина. Хозяина затем используют для рекомбинантной продукции антитела, или его вариантов, таких как гуманизированный вариант данного моноклонального антитела, активные фрагменты антитела, химерные антитела, содержащие участок распознавания антигена из антитела, или варианты, содержащие детектируемую молекулу.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением, можно легко выделить и секвенировать, применяя обычные процедуры (например, применяя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител мыши). В одном аспекте предложена нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь антитела против CD73 согласно любому варианту реализации, описанному в настоящем документе. После выделения ДНК можно поместить в векторы экспрессии, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, клетки обезьян COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы добиться синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Такие последовательности ДНК можно модифицировать для любой из большого числа целей, например, для гуманизирования антител, получения фрагментов или производных, или для модификации последовательности антитела, например, в сайте связывания антигена, чтобы оптимизировать специфичность связывания антитела. В одном варианте реализации предложена изолированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь и/или тяжелую цепь антитела, а также рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая (например, в своем геноме) такую нуклеиновую кислоту. Рекомбинантная экспрессия в бактериях ДНК, кодирующей антитело, хорошо известна в данной области техники (см., например, Skerra и др., Curr. Opinion in Immunol., 5, стр. 256 (1993); и Pluckthun, Immunol. 130, стр. 151 (1992).

Фрагменты и производные антител (которые входят в объем термина «антитело» или «антитела», используемого в данном описании, если не указано иное или нет явных противоречий с контекстом) можно получить с помощью методик, которые известны в данной области техники. «Фрагменты» содержат часть интактного антитела, как правило, сайт связывания антигена или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2 и Fv; диатела; любой фрагмент антитела, который представляет собой полипептид, имеющий первичную структуру, состоящую из одной непрерывной последовательности смежных аминокислотных остатков (называемый в данном документе «одноцепочечным фрагментом антитела» или «одноцепочечным полипептидом»); и полиспецифические (например, биспецифические) антитела, образованные из фрагментов антител.

Обычно, аффинность антитела против CD73, предложенного в данной заявке, к полипептиду CD73 (например, полипептиду CD73, полученному, как описано в разделе Примеры в данном документе) находится в диапазоне от приблизительно 10⁴ до приблизительно 10¹¹ М^-1 (например, от приблизительно 10⁸ до приблизительно 10¹⁰ М^-1). Например, в конкретном аспекте настоящего изобретения предложено антитело против CD73 со средней константой диссоциации (K_D) от CD73 менее 1x10⁹ M, что определяют с помощью, например, скрининга методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (например, с помощью анализа на аналитическом устройстве для ППР BIAcore™). В более конкретном типичном аспекте настоящего изобретения предложены антитела против CD73 с K_D от CD73 от приблизительно 1x10^-8 M до приблизительно 1x10^-10 M, или от приблизительно 1x10^-9 М до приблизительно 1x10^-11 M.

Антитела можно охарактеризовать, например, по средней KD, не более чем приблизительно (т.е., лучшей аффинности) 100, 60, 10, 5 или 1 наномолярной, предпочтительно субнаномолярной или в некоторых случаях не более чем приблизительно 500, 200, 100 или 10 пикомолярной. KD можно определить, например, путем иммобилизации полученных рекомбинантным способом белков CD73 человека на поверхности микрочипа, а затем нанесения антитела, которое нужно исследовать, в растворе. В одном варианте реализации указанный способ дополнительно включает этап (d) селекции антител из (b), которые способны конкурировать с контрольным антителом за связывание с CD73.

В одном варианте реализации антитела против CD73 могут быть получены таким образом, что они не проявляют существенного связывания с Fcγ-рецепторами человека, например, любым одним или более из CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и/или CD64). Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, которые, как известно, не проявляют или проявляют пониженное связывание с Fcγ-рецепторами. В альтернативном варианте фрагменты антител, которые не содержат (или содержат части) константных областей, такие как фрагменты F(ab')2, можно применять для предотвращения связывания с Fc-рецептором. Связывание с Fc-рецептором можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, включая, например, тестирование связывания антитела с белком Fc-рецептора в анализе BIACORE. Кроме того, как правило, можно использовать любой изотип IgG антитела, в котором Fc-часть модифицирована (например, путем введения 1, 2, 3, 4, 5 или более замен аминокислот) для минимизирования или устранения связывания с Fc-рецепторами (см., например, WO 03/101485, описание которого включено в данную заявку посредством ссылки). Анализы, которые используют для оценки связывания с Fc-рецептором, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO 03/101485.

В одном варианте реализации антитело может содержать одну или более определенных мутаций в Fc-области, которые приводят к образованию "Fc-молчащих" антител, которые на минимальном уровне взаимодействуют с эффекторными клетками. Замалчивания эффекторных функций можно добиться путем введения мутации в Fc-области антител, и такие мутации были описаны в данной области техники: мутация N297A, мутации LALA (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20(6):685-691); и D265A (Baudino и др., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69) см. также Heusser и др., WO 2012/065950, описания которых включены в данную заявку посредством ссылки. В одном варианте реализации антитело содержит одну, две, три или более замен аминокислот в шарнирной области. В одном варианте реализации антитело представляет собой IgG1 или IgG2 и содержит одну, две или три замены в остатках 233-236, необязательно 233-238 (нумерация EU). В одном варианте реализации антитело представляет собой IgG4 и содержит одну, две или три замены в остатках 327, 330 и/или 331 (нумерация EU). Примерами Fc-молчащих антител против IgG1 являются мутант LALA, содержащий мутации L234A и L235A в последовательности аминокислот Fc IgG1. Другим примером мутации, замалчивающей Fc, является мутация в остатке D265 или в D265 и Р329, например, используемая в антителе IgG1, называемая мутацией DAPA (D265A, Р329А) (US 6737056). Другое молчащее антитело IgG1 содержит мутацию в остатке N297 (например, мутацию N297A, N297S), которая приводит к образованию агликозилированных/негликозилированных антител. Другие молчащие мутации включают: замены в остатках L234 и G237 (L234A/G237A); замены в остатках S228, L235 и R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); замены в остатках Н268, V309, А330 и А331 (H268Q/V309L/A330S/A331S); замены в остатках С220, С226, С229 и Р238 (C220S/C226S/C229S/P238S); замены в остатках С226, С229, Е233, L234 и L235 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; замены в остатках K322, L235 и L235 (K322A/L234A/L235A); замены в остатках L234, L235 и Р331 (L234F/L235S/P331S); замены в остатках 234, 235 и 297; замены в остатках Е318 и K320 и K322 (L235E/E318A/K320A/K322A); замены в остатках (V234A, G237A, P238S); замены в остатках 243 и 264; замены в остатках 297 и 299; замены, такие как замены в остатках 233, 234, 235, 237 и 238, определенных по системе нумерации EU, включающие последовательность, выбранную из РАААР, PAAAS и SAAAS (см. WO 2011/066501).

В одном варианте реализации антитело может содержать одну или более определенных мутаций в Fc-области. Например, такое антитело может содержать домен Fc, происходящий из IgG1 человека, содержащий мутацию в остатке(-ах) по Кабату 234, 235, 237, 330 и/или 331. Один пример такого домена Fc содержит замены в остатках L234, L235 и Р331 по Кабату (например, L234A/L235E/P331S или (L234F/L235E/P331S). Другой пример такого домена Fc содержит замены в остатках по Кабату L234, L235, G237 и Р331 (например, L234A/L235E/G237A/P331S). Другой пример такого домена Fc содержит замены в остатках по Кабату L234, L235, G237, А330 и Р331 (например, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S). В одном варианте реализации антитело содержит домен Fc, необязательно изотипа IgG1 человека, содержащий: замену L234X₁, замену L235X₂ и замену Р331Х₃, где X₁ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, Х₂ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, и Х₃ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от пролина; необязательно при этом X₁ представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; необязательно при этом Х₂ представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; необязательно при этом Х₃ представляет собой серии или его консервативную замену. В другом варианте реализации антитело содержит домен Fc, необязательно изотипа IgG1 человека, содержащий: замену L234X₁, замену L235X₂, замену G237X₃ и замену Р331Х₄, где X₁ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, Х₂ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, Х₃ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от глицина, и Х₄ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от пролина; необязательно при этом X₁ представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; необязательно при этом Х₂ представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; необязательно Х₃ представляет собой аланин или его консервативную замену; необязательно Х₄ представляет собой серии или его консервативную замену. В другом варианте реализации антитело содержит домен Fc, необязательно изотипа IgG1 человека, содержащий: замену L234X₁, замену L235X₂, замену G237X₃, замену G330X₄ и замену P331X₅, где X₁ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, X₂ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, Х₃ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от глицина, Х₄ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от аланина, и Х₅ представляет собой любой аминокислотный остаток, отличный от пролина; необязательно при этом X₁ представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; необязательно при этом Х₂ представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; необязательно Х₃ представляет собой аланин или его консервативную замену; необязательно Х₄ представляет собой серии или его консервативную замену; необязательно Х₅ представляет собой серии или его консервативную замену.

В используемом в данном документе сокращенном обозначении принят следующий формат: Остаток дикого типа: Положение в полипептиде: Мутантные остатки, причем положения остатков указаны в соответствии с нумерацией EU по Кабату.

В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот, представленную ниже, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, 95% или 99% идентичную ей, но в которой сохранились аминокислотные остатки в положениях 234, 235 и 331 по Кабату (подчеркнуты):

В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот, представленную ниже, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, 95% или 99% идентичную ей, но в которой сохранились аминокислотные остатки в положениях 234, 235 и 331 по Кабату (подчеркнуты):

В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот, представленную ниже, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, 95% или 99% идентичную ей, но в которой сохранились аминокислотные остатки в положениях 234, 235, 237, 330 и 331 по Кабату (подчеркнуты):

В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот, представленную ниже, или последовательность, по меньшей мере на 90%, 95% или 99% идентичную ей, но в которой сохранились аминокислотные остатки в положениях 234, 235, 237 и 331 по Кабату (подчеркнуты):

У Fc-молчащих антител отсутствует или низка активность АЗКЦ, что означает, что Fc-молчащее антитело проявляет активность АЗКЦ, которая ниже 50% специфического клеточного лизиса. Предпочтительно у антитела по существу отсутствует активность АЗКЦ, например, Fc-молчащее антитело проявляет активность АЗКЦ (специфический клеточный лизис), которая ниже 5% или ниже 1%. У Fc-молчащих антител также может отсутствовать FcγR-опосредованное перекрестное связывание CD73 на поверхности экспрессирующей CD73 клетки.

В одном варианте реализации антитело содержит замену в константной области тяжелой цепи в любом одном, двух, трех, четырех, пяти или более остатках, выбранных из группы, состоящей из: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 и 409 (нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации EU по Кабату). В одном варианте реализации антитело содержит замену в остатках 234, 235 и 322. В одном варианте реализации антитело содержит замену в остатках 234, 235 и 331. В одном варианте реализации антитело содержит замену в остатках 234, 235, 237 и 331. В одном варианте реализации антитело содержит замену в остатках 234, 235, 237, 330 и 331. В одном варианте реализации домен Fc относится к подтипу IgG1 человека. Аминокислотные остатки указаны в соответствии с нумерацией EU по Кабату.

В одном варианте реализации антитело содержит домен Fc, содержащий замену аминокислоты, которая повышает связывание с полипептидами FcRn человека, чтобы увеличить период полужизни антитела in vivo. Типичные мутации описаны в источнике Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20(6):685-691, описание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Примерами замен, используемых в антителах изотипа IgG1 человека, являются замены в остатках по Кабату М252, S254 и Т256; замены в остатках Т250 и М428; замены в остатке N434; замены в остатках Н433 и N434; замены в остатках Т307, Е380 и N434; замены в остатках Т307, Е380 и N434; замены в остатках М252, S254, Т256, H433, N434 и 436; замены в остатке I253; замены в остатках Р257, N434, D376 и N434. На любом желаемом этапе можно оценить способность антигенсвязывающего соединения ингибировать ферментативную активность CD73, в частности, блокировать 5'-нуклеотидазную активность CD73 и снижать продукцию аденозина экспрессирующей CD73 клеткой, и, в свою очередь, восстанавливать активность и/или снимать опосредованное аденозином ингибирование лимфоцитов.

Способность антитела ингибировать ферментативную активность CD73 можно исследовать в анализе в бесклеточной системе с применением рекомбинантного растворимого CD73 человека (в виде димеров) и АМФ, в котором превращение АМФ в аденозин (и/или его ингибирование) детектируют непосредственно (например, путем измерения субстратов и продуктов, т.е. АМФ, аденозина и/или фосфата), или опосредованно. В одном примере АМФ и/или аденозин детектируют с помощью ВЭЖХ до и после инкубации тестируемого соединения с рекомбинантным CD73.

Ингибиторную активность антитела в отношении CD73 также можно оценить любым из множества других способов. Например, в непрямом анализе применяют реагент на основе люциферазы (например, систему CellTiter-Glo®, доступную для приобретения у Promega), чтобы детектировать исчезновение АМФ. Реакция люциферазы в данном анализе ингибируется АМФ. Добавление фермента CD73 в реакционную смесь разрушает АМФ и снимает ингибирование, вызывая детектируемый сигнал.

Способы анализа с применением растворимого CD73 будут включать тестирование в условиях, в которых антитела представлены в значительном молярном избытке (например, 10-кратном, 20-кратном, 50-кратном, 100-кратном и т.д.) над димерами полипептида CD73. Когда они представлены в молярном избытке над ферментом, антитела против CD73 будут более не способны образовывать мультимерные комплексы антител и димеров CD73; затем можно выбрать антитела, у которых сохранилась способность ингибировать ферментативную активность CD73.

Способность антитела ингибировать 5'-эктонуклеотидазную ферментативную активность CD73 можно в качестве альтернативы или дополнения также исследовать в клеточном анализе (применяя клетки, которые экспрессируют CD73). Предпочтительно, антитела можно сначала исследовать или подвергнуть скринингу в анализе в бесклеточной системе, чтобы определить антитела, которые блокируют активность фермента, чтобы снизить вероятность выбора антител, которые ингибируют CD73, вызывая интернализацию CD73, а затем исследовать в виде очищенного антитела в клеточном анализе. Клеточный анализ можно проводить, как показано в разделе Примеры в данном документе, или как описано в публикации РСТ № WO 2016/055609, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки. Например, экспрессирующие CD73 клетки (например, линию клеток MDA-MB-231) высевают в 96-луночные планшеты с плоским дном лунок в присутствии антител против CD73 и инкубируют, как описано в WO 2016/055609. АМФ добавляют к клеткам и инкубируют при 4°С (чтобы избежать понижающей модуляции CD73). Планшеты затем центрифугируют и супернатант переносят в 96-луночный культуральный планшет с плоским дном лунок. Затем проводят количественный анализ свободного фосфата, полученного в результате гидролиза АМФ с образованием аденозина. Снижение гидролиза АМФ с образованием аденозина в присутствии антитела свидетельствует о том, что антитело ингибирует клеточный CD73.

В одном варианте реализации препарат антител вызывает снижение по меньшей мере на 50% ферментативной активности полипептида CD73, предпочтительно снижение по меньшей мере на 60%, 70% или 80% ферментативной активности полипептида CD73 (например, растворимого гомодимерного полипептида CD73; экспрессированного клетками CD73).

Активность антитела также можно измерить в непрямом анализе в отношении его способности модулировать активность лимфоцитов, например, чтобы снять опосредованное аденозином ингибирование активности лимфоцитов или чтобы вызвать активацию активности лимфоцитов. Это можно осуществить, например, применяя анализ высвобождения цитокинов. В другом примере антитело можно оценить в непрямом анализе в отношении его способности модулировать пролиферацию лимфоцитов.

В одном варианте реализации антитело нейтрализует 5'-эктонуклеотидазную активность гомодимерного полипептида CD73 человека в растворе. В одном варианте реализации антитело связывает и ингибирует ферментативную активность растворимого полипептида CD73 человека, в частности, антитела, которое нейтрализует опосредованный CD73 катаболизм АМФ с образованием аденозина. В одном варианте реализации антитело связывает CD73 бивалентным образом. В одном варианте реализации антитело представляет собой необедняющее антитело, например, Fc-молчащее антитело, которое по существу не связывается с рецепторами Fcγ человека. В одном варианте реализации антитело нейтрализует CD73 в растворе без необходимости индукции образования олигомеров полипептид CD73:антитело против CD73.

В одном варианте реализации антитело специфично связывает CD73 человека на поверхности клетки и способно нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность растворимого полипептида CD73 человека. В одном варианте реализации антитело не вызывает олигомеризацию растворимого CD73.

В одном варианте реализации антитело специфично связывает CD73 человека на поверхности клетки и способно нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность клеточного CD73 (CD73, экспрессируемого клетками). В одном варианте реализации антитело специфично связывает и нейтрализует 5'-эктонуклеотидазную активность CD73 человека на поверхности клетки, и не интернализуется в экспрессирующие CD73 клетки при связывании с CD73. Антитело не вызывает мультимеризацию и последующую интернализацию CD73. В одном варианте реализации антитело связывает и способно ингибировать ферментативную активность рекомбинантного полипептида CD73 человека в растворе, причем указанное антитело не интернализуется в экспрессирующие CD73 клетки. В одном варианте реализации неинтернализующееся антитело связывает CD73 бивалентным образом. В одном варианте реализации антитело представляет собой необедняющее антитело, например, Fc-молчащее антитело. Антитело способно нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность димерного полипептида CD73 человека в растворе, более того, без необходимости вызывать образование олигомеров полипептиды CD73:антитела против CD73.

В одном варианте реализации антитело специфично двухвалентно связывается с полипептидами CD73 человека и ингибирует ферментативную активность клеточного CD73 человека (и необязательно дополнительно рекомбинантного растворимого CD73 человека), причем указанное антитело не вызывает или не повышает внутриклеточную интернализацию CD73 в экспрессирующих CD73 клетках. Предпочтительно, антитело по существу не связывается с Fcγ-рецептором (например, посредством своего домена Fc).

В одном аспекте антитело специфично связывает CD73 человека на поверхности клетки, предварительно инкубированной с АМФ, и способно нейтрализовать его 5'-эктонуклеотидазную активность. Необязательно нейтрализацию 5'-эктонуклеотидазной активности определяют путем оценки нейтрализации 5'-эктонуклеотидазной активности в экспрессирующих CD73 клетках (например, клетках MDA-MB-231) путем количественного анализа гидролиза АМФ с образованием аденозина.

В одном аспекте нейтрализацию 5'-эктонуклеотидазной активности CD73, экспрессируемого клеткой, определяют путем оценки способности антитела повышать пролиферацию Т-клеток, когда вызвана пролиферация указанных Т-клеток in vitro (например, посредством костимуляции TCR, стимуляции передачи сигналов CD3 и CD28, например, путем приведения Т-клеток в контакт с гранулами, функционализированными агонистами CD3 и агонистами CD28) в присутствии АМФ (например, экзогенно добавленного АМФ). В одном аспекте нейтрализацию активности 5'-эктонукпеотидазы оценивают, применяя анализ пролиферации Т-клеток, описанный в разделе «Методы» в разделе «Примеры».

Антитела можно охарактеризовать по их способности связываться с клетками, трансфицированными мутантами CD73, по сравнению со способностью антитела против CD73 связывать полипептид CD73 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1). Снижение связывания между антителом против CD73 и мутантным полипептидом CD73 означает, что наблюдается снижение аффинности связывания (например, что измеряют с помощью известных способов, таких как тестирование методом FACS клеток, экспрессирующих определенного мутанта, или путем анализа связывания с мутантными полипептидами с помощью метода Biacore) и/или снижение общей способности антитела против CD73 к связыванию (например, о чем свидетельствует уменьшение B_max на графике концентрации антитела против CD73 в зависимости от концентрации полипептида). Значимое снижение связывания свидетельствует о том, что мутированный остаток непосредственно участвует в связывании с антителом против CD73 или находится в непосредственной близости от связывающего белка, когда антитело против CD73 связано с CD73.

В некоторых вариантах реализации значимое снижение связывания означает, что аффинность и/или способность связывания между антителом против CD73 и мутантным полипептидом CD73 снижена более чем на 40%, более чем на 50%, более чем на 55%, более чем на 60%, более чем на 65%, более чем на 70%, более чем на 75%, более чем на 80%, более чем на 85%, более чем на 90% или более чем на 95% по сравнению со связыванием между антителом и полипептидом CD73 дикого типа. В некоторых вариантах реализации связывание снижается ниже детектируемых пределов. В некоторых вариантах реализации о значимом снижении связывания свидетельствует связывание антитела против CD73 с мутантным полипептидом CD73, составляющее менее 50% (например, менее 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% или 10%) от связывания, наблюдаемого между антителом против CD73 и полипептидом CD73 дикого типа.

В одном аспекте антитела против CD73 проявляют пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке K136 (в последовательности SEQ ID NO: 1); необязательно мутантный полипептид CD73 содержит мутацию: K136A.

В одном аспекте антитела против CD73 проявляют пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из: K97, Е125, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1); необязательно мутантный полипептид CD73 содержит следующие мутации: K97A, Е125А, Q153A и/или K330A (например, K97A, Е125А и K330A; K97A, Е125А и/или Q153A).

В одном аспекте антитела против CD73 проявляют пониженное связывание с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из: А99, Е129, K133, Е134 и А135 (в последовательности SEQ ID NO: 1); необязательно мутантный полипептид CD73 содержит следующие мутации: A99S, Е129А, K133A, E134N и/или A135S.

Необязательно, в одном аспекте, антитела против CD73 не проявляют пониженного связывания с полипептидом CD73, содержащим мутацию в остатке, выбранном из группы, состоящей из: Q70, R73, А74, А107 и R109 (в последовательности SEQ ID NO: 1); необязательно мутантный полипептид CD73 содержит следующие мутации: A99S, Q70S, R73A, А74Е, A107I и/или R109G.

В одном аспекте антитела против CD73 связывают эпитоп на CD73, содержащий остаток K136 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитела против CD73 связывают эпитоп на CD73, содержащий один, два, три или четыре остатка, выбранных из группы, состоящей из K97, Е125, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитела против CD73 связывают эпитоп на CD73, содержащий один, два, три, четыре или пять остатков, выбранных из группы, состоящей из А99, Е129, K133, Е134 и А135 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

В одном аспекте антитела против CD73 связывают эпитоп на CD73, содержащий один, два, три, четыре, пять или более остатков, выбранных из группы, состоящей из K97, А99, Е125, Е129, K133, Е134, А135 и K136 (в последовательности SEQ ID NO: 1). В одном аспекте антитела против CD73 связывают эпитоп на CD73, содержащий один, два, три, четыре, пять или более остатков, выбранных из группы, состоящей из K97, А99, Е125, Е129, K133, Е134, А135, K136, Q153 и K330 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

Необязательно, в одном аспекте, антитела против CD73 не связывают эпитоп на CD73, содержащий один, два, три, четыре или пять остатков, выбранных из группы, состоящей из Q70, R73, А74, А107 и R109 (в последовательности SEQ ID NO: 1).

Антитело против CD73 можно включить в фармацевтический состав в концентрации, включая от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем рН указанного состава составляет от 2,0 до 10,0. Указанный состав может дополнительно содержать буферную систему, консервант(ы), агент(ы), регулирующий(-е) тоничность, хелатирующий(-е) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный состав, т.е., состав, содержащий воду. Такой состав обычно представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный раствор. Термин «водный состав» описывает состав, содержащий по меньшей мере 50% по массе воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» описывает раствор, содержащий по меньшей мере 50% по массе воды, и термин «водная суспензия» описывает суспензию, содержащую по меньшей мере 50% по массе воды.

В другом варианте реализации фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, в который врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением.

В другом варианте реализации фармацевтический состав представляет собой высушенный состав (например, лиофилизированный или высушенный распылением), готовый для применения без какого-либо предварительного растворения.

В дополнительном аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл или выше, и причем рН указанного состава составляет от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0.

В другом варианте реализации рН состава находится в диапазоне, выбранном из перечня, состоящего из: от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0 и от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5.

В дополнительном варианте реализации буфер выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, однозамещенного фосфата натрия, двузамещенного фосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смеси. Каждый из данных конкретных буферов представляет собой альтернативный вариант реализации.

В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит изотонический агент. В дополнительном варианте реализации состав также содержит хелатирующий агент. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Для удобства можно сослаться на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^oe издание, 1995.

Возможно, что в пептидном фармацевтическом составе могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать смачивающие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, маслянистые среды, белки (например, человеческие сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттер-ион (например, аминокислоту, такую как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, разумеется, не должны нежелательно влиять на общую стабильность фармацевтического состава.

Фармацевтические композиции, содержащие антитело, можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в несколько мест, например, в места местного применения, например, в места на коже и слизистой оболочке, в места, в которых не требуется абсорбция, например, введение в артерию, в вену, в сердце, и в места, в которых происходит абсорбция, например, введение в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость. Введение фармацевтических композиций можно осуществить несколькими путями введения, например, подкожным, внутримышечным, интраперитонеальным, внутривенным, лингвальным, сублингвальным, буккальным, через рот, пероральным, в желудок и кишечник, назальным, легочным, например, через бронхиолы и альвеолы, или их комбинацией, эпидермальным, дермальным, трансдермальным, вагинальным, ректальным, офтальмологическим путем, например, через конъюнктиву, через мочеиспускательный канал и парентерально, пациентам, нуждающимся в таком лечении.

Диагностика и лечение злокачественных новообразований

Также предложены способы лечения индивида, в частности, пациента-человека, с применением антитела или фрагмента антитела против СD73, описанного в настоящем документе. В одном варианте реализации в соответствии с настоящим изобретением предложено применение антитела или фрагмента антитела, описанного в настоящем документе, для получения фармацевтической композиции для введения пациенту-человеку. Как правило, пациент страдает от рака или инфекционного заболевания (например, вирусной или бактериальной инфекции), или у него есть риск их развития.

Например, в одном аспекте предложен способ восстановления или усиления активности иммунных клеток (например, лимфоцитов) у пациента, нуждающегося в этом, включающий этап введения указанному пациенту нейтрализующего антитела против CD73 в соответствии с настоящим изобретением. В одном варианте реализации указанный способ направлен на повышение активности иммунных клеток (например, Т-клеток) у пациентов, страдающих заболеванием, таким как рак или инфекционное заболевание, при котором предпочтительна повышенная активность и/или инфильтрация иммунных клеток в очаге заболевания (например, в окружении опухоли или очаге инфекции), или которое вызвано или характеризуется иммуносупрессией, иммуносупрессорными клетками или, например, аденозином, вырабатываемым CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками, В-клетками).

Указанные способы будут особенно полезны для лечения индивидов с опухолью, при которой есть подозрение, что микроокружение опухоли (и опосредованная CD73 продукция аденозина в нем) может способствовать отсутствию распознавания иммунной системой (ускользанию от иммунного ответа). Для окружения опухоли, например, могут быть характерны экспрессирующие CD73 иммунные клетки, например, CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки, В-клетки и/или экспрессирующие CD73 опухолевые клетки.

Указанные способы и антитела против CD73 можно применять для лечения и/или предотвращения различных видов рака и других пролиферативных заболеваний. Поскольку эти способы действуют путем уменьшения количества аденозина, который ингибирует противоопухолевую активность лимфоцитов, и, возможно, дополнительно путем повышения АТФ, который может повышать противоопухолевую активность лимфоцитов, они применимы для широкого спектра видов рака, включая, в частности, солидные опухоли, при которых аденозин в микроокружении опухоли может играть значительную роль в подавлении противоопухолевого иммунного ответа. В одном варианте реализации настоящего изобретения у пациента-человека, получающего лечение антителом против CD73, есть рак печени, рак костей, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, рак молочной железы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), кастрационно-резистентный рак предстательной железы (CRPC), меланома, рак матки, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичек, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, неходжкинская лимфома, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак полового члена, солидные опухоли детского возраста, лимфоцитарная лимфома, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карцинома почки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичная лимфома ЦНС, опухолевый ангиогенез, опухоль позвоночника, глиома ствола головного мозга, аденома гипофиза, саркома Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, вызванный окружающей средой рак, в том числе рак, вызванный асбестом, гематологические злокачественные новообразования, включая, например, множественную миелому, В-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина/первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, неходжкинские лимфомы, острую миелоидную лимфому, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную крупно-В-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, иммунобластную крупно клеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, мантийноклеточную лимфому, острый лимфобластный лейкоз, грибовидный микоз, анапластическую крупноклеточную лимфому, Т-клеточную лимфому и Т-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, и любые комбинации указанных видов рака. Настоящее изобретение также можно применять для лечения метастатических раковых заболеваний. Пациентов можно протестировать или выбрать по одному или более из описанных выше клинических признаков до, во время или после лечения.

Поскольку способы и антитела против CD73 действуют путем уменьшения количества аденозина, который ингибирует активность и/или инфильтрацию иммунных клеток (например, лимфоцитов), и, возможно, дополнительно путем повышения АТФ, который может повышать активность лимфоцитов, они применимы для широкого спектра инфекционных заболеваний, включая, предпочтительно, любые инфекции, вызванные инфицированием вирусами, бактериями, простейшими, плесенью или грибами.

В одном варианте реализации антитело против CD73 вводят в количестве, эффективном для достижения и/или поддержания у индивида (например, в течение 1, 2, 3, 4 недель и/или до последующего введения антигенсвязывающего соединения) концентрации в крови, составляющей по меньшей мере ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀, необязательно по существу ЕС₁₀₀, для нейтрализации ферментативной активности CD73. В одном варианте реализации активное количество антитела против CD73 представляет собой количество, эффективное для достижения ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀, необязательно по существу ЕС₁₀₀, для нейтрализации ферментативной активности CD73 во внесосудистой ткани индивида. В одном варианте реализации активное количество антитела против CD73 представляет собой количество, эффективное для достижения (или поддержания) у индивида ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀, необязательно по существу ЕС₁₀₀, для ингибирования или нейтрализации ферментативной активности CD73.

В одном варианте реализации антитело против CD73 вводят в количестве, эффективном для достижения и/или поддержания (например, в течение 1, 2, 3, 4 недель и/или до последующего введения антитела против CD73) у индивида концентрации в крови, составляющей по меньшей мере ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀, необязательно по существу ЕС₁₀₀, для ингибирования опосредованного CD73 катаболизма АМФ с образованием аденозина (например, что определяют путем оценки нейтрализации 5'-эктонуклеотидазной активности в клетках MDA-MB-231 путем количественного анализа гидролиза АМФ с образованием аденозина). В одном варианте реализации количество антитела против CD73 представляет собой количество, эффективное для достижения (или поддержания) ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀, необязательно по существу ЕС₁₀₀, для ингибирования опосредованного CD73 катаболизма АМФ с образованием аденозина во внесосудистой ткани индивида.

В одном варианте реализации предложен способ лечения или предотвращения рака у индивида, указанный способ включает введение индивиду, страдающему заболеванием, антитела против CD73 в количестве, которое позволяет достичь или поддерживать в течение определенного периода времени концентрации в кровотоке, необязательно в представляющей интерес внесосудистой ткани (например, в опухоли или в окружении опухоли), которая выше, чем концентрация, необходимая для 50%-ного, 70%-ного или полного (например, 90%-ного) насыщения рецепторов экспрессирующих CD73 клеток в кровотоке (например, что оценивают в МКПК). Необязательно достигнутая концентрация по меньшей мере на 20%, 50% или 100% выше, чем концентрация, необходимая для насыщения определенных рецепторов.

В одном варианте реализации предложен способ лечения или предотвращения рака у индивида, указанный способ включает введение индивиду антитела против CD73 в количестве, которое позволяет достичь или поддерживать в течение определенного периода времени концентрацию в кровотоке, необязательно в представляющей интерес внесосудистой ткани (например, опухоли или в окружении опухоли), которая выше, чем ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀ или необязательно ЕС₁₀₀, для связывания с клетками, экспрессирующими CD73 (например, что оценивают путем титрования антитела против CD73 на клетках, экспрессирующих CD73, например, клетках MDA-MB-231). Необязательно достигнутая концентрация по меньшей мере на 20%, 50% или 100% выше, чем ЕС₅₀, необязательно ЕС₇₀ или необязательно ЕС₁₀₀, для связывания с клетками, экспрессирующими CD73.

В любом варианте реализации у антитела может, например, наблюдаться ЕС₅₀, в некоторых случаях ЕС₇₀ или в некоторых случаях ЕС₁₀₀ для связывания с экспрессирующими CD73 клетками среди МКПК человека, составляющая 0,5-100 нг/мл, в некоторых случаях 1-100 нг/мл, в некоторых случаях 30-100 нг/мл, например, приблизительно 30-90 нг/мл (например, что оценивают путем титрования антитела против CD73 на клетках, экспрессирующих CD73, например, клетках MDA-MB-231).

ЕС₅₀ для нейтрализации ферментативной активности CD73 с помощью антитела против CD73 может составлять, например, приблизительно от 0,01 мкг/мл до 1 мкг/мл, необязательно от 0,1 мкг/мл до 10 мкг/мл, необязательно от 0,1 мкг/мл до 1 мкг/мл. Например, ЕС₅₀ может составлять приблизительно 0,1 мкг/мл, приблизительно 0,2 мкг/мл или приблизительно 0,3 мкг/мл. Таким образом, количество указанного антитела против CD73, например, вводят, чтобы достичь и/или поддерживать концентрацию в крови, составляющую по меньшей мере 0,1 мкг/мл, в некоторых случаях по меньшей мере 0,2 мкг/мл, в некоторых случаях по меньшей мере 1 мкг/мл или в некоторых случаях по меньшей мере 2 мкг/мл.

Когда мишенью являются ткани за пределами сосудистой сети (окружение опухоли, например, при лечении солидных опухолей), обычно считается, что необходима приблизительно в 10 раз более высокая доза по сравнению с дозой, которая приводит к соответствующей концентрации в кровотоке. Ожидается, что количество антитела против CD73, введенное для достижения (и/или поддержания) концентрации в кровотоке (крови), равной приблизительно 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл, приведет к достижению (и/или поддержанию) концентрации во внесосудистой ткани (например, в опухолевой ткани), равной приблизительно 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, соответственно.

В одном варианте реализации антитело против CD73, например, вводят в количестве, достаточном для достижения и/или поддержания концентрации в ткани (например, в окружении опухоли), равной по меньшей мере 0,1 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 0,2 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 1 мкг/мл или необязательно по меньшей мере 2 мкг/мл. Антитело можно, например, вводить в количестве, достаточном для достижения и/или поддержания концентрации в крови, равной по меньшей мере приблизительно 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл, например, в диапазоне 1-100 мкг/мл, 10-100 мкг/мл, 1-50 мкг/мл, 1-20 мкг/мл или 1-10 мкг/мл. Вводимое количество можно скорректировать таким образом, чтобы обеспечить поддержание необходимой концентрации в течение определенного периода времени после введения (например, 1, 2, 3, 4 недель и т.д.).

В некоторых вариантах реализации вводят такое количество антитела против CD73, чтобы получить концентрацию в крови (сыворотке) или во внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), которая соответствует по меньшей мере ЕС₇₀ или ЕС₁₀₀ для нейтрализации ферментативной активности CD73. Антитело можно, например, вводить в количестве, достаточном для достижения и/или поддержания концентрации в крови или во внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), равной по меньшей мере приблизительно 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл.

ЕС₅₀, ЕС₇₀ или ЕС₁₀₀ можно оценить, например, в клеточном анализе нейтрализации ферментативной активности CD73 (например, нейтрализации 5'-эктонуклеотидазной активности в клетках MDA-MB-231, путем количественного анализа гидролиза АМФ с образованием аденозина). «ЕС₅₀» в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73 относится к эффективной концентрации антитела против CD73, которая вызывает 50% от максимального ответа или эффекта в отношении нейтрализации ферментативной активности). «ЕС₇₀» в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73 относится к эффективной концентрации антитела против CD73, которая вызывает 70% от максимального ответа или эффекта. «ЕС₁₀₀» в отношении нейтрализации ферментативной активности CD73 относится к эффективной концентрации антитела против CD73, которая вызывает по существу максимальный ответ или эффект в отношении такой нейтрализации ферментативной активности.

В некоторых вариантах реализации, в частности, для лечения солидных опухолей, предполагается, что достигнутая концентрация приведет к концентрации в тканях (за пределами сосудистой сети, например, в опухоли или окружении опухоли), которая соответствует по меньшей мере ЕС₅₀ для нейтрализации ферментативной активности, и необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно равна ЕС₁₀₀.

В одном варианте реализации количество антитела против CD73 составляет от 1 до 20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации указанное количество вводят индивиду еженедельно, каждые две недели, ежемесячно или каждые два месяца.

В одном варианте реализации предложен способ лечения индивида-человека, включающий введение указанному индивиду эффективного количества антитела против CD73 в соответствии с настоящим изобретением в течение по меньшей мере одного цикла введения (необязательно по меньшей мере 2, 3, 4 или более циклов введения), причем указанный цикл представляет собой период, составляющий восемь недель или менее, причем в каждом из по меньшей мере одного цикла вводят одну, две, три или четыре дозы антитела против CD73 по 1-20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации антитело против CD73 вводят путем внутривенной инфузии.

Подходящие протоколы лечения для лечения человека включают, например, введение пациенту количества, описанного в настоящем документе, антитела против CD73, причем указанный способ включает по меньшей мере один цикл введения, в котором вводят по меньшей мере одну дозу антитела против CD73. Необязательно, вводят по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз антитела против CD73. В одном варианте реализации цикл введения длится от 2 недель до 8 недель.

Пациента, страдающего от рака, можно лечить антителом против CD73 с предварительным этапом детектирования, или без него, для оценки экспрессии CD73 на клетках в микроокружении опухоли (например, на опухолевых клетках, CD4 Т-клетках, CD8 Т-клетках, В-клетках). Необязательно способы лечения могут включать этап обнаружения нуклеиновой кислоты или полипептида CD73 в биологическом образце из опухоли из индивида (например, ткани рака или ткани, находящейся вблизи или в отдалении от рака, прилегающей к раку ткани, прилегающей неопухолевой ткани или прилегающей нормальной ткани). Определение того, что биологический образец содержит клетки, экспрессирующие CD73 (например, экспрессирующие CD73 на высоком уровне, определение высокой интенсивности окрашивания антителом против CD73 по сравнению с референсной, например, здоровой тканью), свидетельствует о том, что у пациента есть рак, который можно очень успешно лечить антителом против CD73. В одном варианте реализации способ включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида CD73 в биологическом образце и сравнение указанного уровня с референсным уровнем, соответствующим здоровому индивиду. Определение того, что биологический образец содержит клетки, экспрессирующие нуклеиновую кислоту или полипептид CD73 на уровне, который повышен по сравнению с референсным уровнем (например, здоровой тканью), свидетельствует о том, что у пациента есть рак, который можно успешно лечить антителом против CD73 в соответствии с настоящим изобретением. Необязательно детектирование полипептида CD73 в биологическом образце включает детектирование полипептида CD73, экспрессированного на поверхности злокачественной клетки или CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки или В-клетки.

Определение того, есть ли у индивида рак, для которого характерны клетки, экспрессирующие полипептид CD73, может, например, включать получение биологического образца (например, путем проведения биопсии) из индивида, который содержит клетки из окружения рака (например, опухоли или прилегающей к опухоли ткани), приведение указанных клеток в контакт с антителом, которое связывает полипептид CD73, и детектирование того, экспрессируют ли клетки CD73 на своей поверхности. Необязательно определение того, есть ли у индивида клетки, которые экспрессируют CD73, включает проведение иммуногистохимического анализа.

Композиции антител можно успешно применять в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами, включая агенты, обычно используемые для конкретной терапевтической цели, для которой вводится антитело. Дополнительный терапевтический агент обычно вводят в количествах и используя схемы лечения, обычно используемые для этого агента при монотерапии конкретного заболевания или патологического состояния, подлежащего лечению. Такие терапевтические агенты включают, но не ограничены противораковыми агентами и химиотерапевтическими агентами.

В одном варианте реализации антитела против CD73 повышают эффективность агентов, которые нейтрализуют ингибиторную активность PD-1 человека, например, которые ингибируют взаимодействие между PD-1 и PD-L1. Соответственно, в одном варианте реализации второй или дополнительный второй терапевтический агент представляет собой антитело или другой агент, который нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека.

Белок запрограммированной гибели 1 (PD-1) (также называемый "белком запрограммированной клеточной гибели 1") является ингибиторным представителем семейства рецепторов CD28. Полноразмерную последовательность PD-1 человека можно найти под номером доступа в GenBank U64863. Ингибирование или нейтрализация ингибиторной активности PD-1 может включать применение полипептидного агента (например, антитела, полипептида, слитого с доменом Fc, иммуноадгезина и т.д.), который предотвращает индуцированную PD-L1 передачу сигналов PD-1. На сегодняшний день существует по меньшей мере шесть агентов, блокирующих сигнальный путь PD-1/PD-L1, которые доступны на рынке или проходят клиническую оценку. Один агент представляет собой BMS-936558 (ниволумаб/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; прежнее название MDX-1106). Ниволумаб (торговое наименование Опдиво®) представляет собой одобренное FDA полностью человеческое MAT IgG4 против PD-L1, которое ингибирует связывание лиганда PD-L1 как с PD-1, так и CD80 и описано как антитело 5С4 в WO 2006/121168, описание которого включено в данную заявку посредством ссылки. Для пациентов с меланомой наиболее значимый общий ответ (ОО) наблюдали при дозе 3 мг/кг, тогда как при других типах рака его наблюдали при дозе 10 мг/кг. Ниволумаб, как правило, вводили в дозе 10 мг/кг раз в 3 недели до тех пор, пока не происходило прогрессирование рака. Термины «снижает ингибиторную активность PD-1 человека», «нейтрализует PD-1» или «нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека» относятся к процессу, в котором ингибируется способность PD-1 передавать сигнал в результате взаимодействия PD-1 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-L1 или PD-L2. Агент, который нейтрализует ингибиторную активность PD-1, снижает, блокирует, ингибирует, прекращает или препятствует передаче сигнала в результате взаимодействия PD-1 с одним или более его партнерами по связыванию, такими как PD-L1, PD-L2. Таким образом, такой агент может уменьшать отрицательный костимулирующий сигнал, опосредованный или проходящий через белки на поверхности клетки, экспрессированные на Т-лимфоцитах, чтобы усиливать эффекторные функции Т-клеток, такие как пролиферация, продукция цитокинов и/или цитотоксичность.

MK-3475 (человеческое MAT IgG4 против PD1 от Merck), также называемый ламбролизумабом или пембролизумабом (торговое наименование Китруда®), был одобрен FDA для лечения меланомы и тестируется при других типах рака. Пембролизумаб исследовали при дозе 2 мг/кг или 10 мг/кг раз в 2 или 3 недели до тех пор, пока не происходило прогрессирование заболевания. MK-3475, также известный как Merck 3745 или SCH-900475, также описан в WO 2009/114335.

MPDL3280A/RG7446 (атезолизумаб, торговое название Тецентрик™, антитело против PD-L1 от Roche/Genentech) представляет собой человеческое МАТ против PD-L1, которое содержит сконструированный домен Fc, разработанный для оптимизации эффективности и безопасности путем минимизирования связывания FcγR и последующей антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ). Дозы ≤ 1, 10, 15 и 25 мг/кг MPDL3280A вводили раз в 3 недели в течение до 1 года. В 3 фазе клинического испытания, MPDL3280A вводят в дозе 1200 мг путем внутривенной инфузии раз в три недели при НМРЛ.

АМР-224 (амплиммун (Amplimmune) и GSK) представляет собой иммуноадгезин, содержащий внеклеточный домен PD-L2, слитый с доменом Fc. Другие примеры агентов, которые нейтрализуют PD-1, могут включать антитело, которое связывает PD-L2 (антитело против PD-L2) и блокирует взаимодействие между PD-1 и PD-L2.

Другим примером является пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (гуманизированное MAT IgG1 против PD1 от CureTech/Teva), пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (см., например, WO 2009/101611); указанный агент тестировали на тридцати пациентах с чувствительной к ритуксимабу рецидивирующей фолликулярной лимфомой (FL), которым вводили внутривенно 3 мг/кг СТ-011 каждые 4 недели, всего 4 инфузии, в комбинации с ритуксимабом в дозе 375 мг/м² еженедельно в течение 4 недель, начиная через 2 недели после первой инфузии СТ-011.

Дополнительные известные антитела против PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают АМР-224 (слитый белок B7-DC/IgG1, запатентованный GSK), АМР-514, описанный в WO 2012/145493, антитело MEDI-4736 (дурвалумаб, торговое наименование Имфинзи™, антитело против PD-L1, разработанное AstraZeneca/Medimmune), описанное в WO 2011/066389 и US 2013/034559, антитело YW243.55.S70 (антитело против PD-L1), описанное в WO 2010/077634, MDX-1105, также известное как BMS-936559, представляет собой антитело против PD-L1, разработанное Bristol-Myers Squibb, описанное в WO 2007/005874, и антитела и ингибиторы, описанные в WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 и WO 2013/019906, описания которых включены в данную заявку посредством ссылки. Дополнительные примеры антител против PD-1 описаны в WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), например, антитела, содержащие CDR1, 2 и 3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, соответственно, и CDR1, 2 и 3 вариабельного домена тяжелой цепи антитела с последовательностями SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, соответственно, причем в упомянутых SEQ ID NO используется нумерация согласно WO 2015/085847, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки. Антитела, которые конкурируют с любыми из данных антител за связывание с PD-1 или PD-L1, также можно применять. В некоторых вариантах реализации нейтрализующий PD-1 агент представляет собой антитело против PD-L1, которое ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах реализации нейтрализующий PD-1 агент представляет собой антитело против PD-1, которое ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. Примером антитела против PD-1 является пембролизумаб (выведенный на рынок Merck & Со. как Китруда™, см. также WO 2009/114335, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки). Примером антитела против PD-L1 является антитело MEDI-4736 (дурвалумаб, торговое наименование Имфинзи™, антитело против PD-L1, разработанное AstraZeneca/Medimmune).

В указанных способах лечения связывающее CD73 соединение и второй терапевтический агент можно вводить отдельно, совместно или последовательно, или в виде коктейля. В некоторых вариантах реализации связывающее антиген соединение вводят перед введением второго терапевтического агента. Например, связывающее CD73 соединение можно вводить приблизительно за 0-30 дней до введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации связывающее CD73 соединение вводят за от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или приблизительно от 1 до 5 дней до введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации связывающее CD73 соединение вводят одновременно с введением указанных терапевтических агентов. В некоторых вариантах реализации связывающее CD73 соединение вводят после введения второго терапевтического агента. Например, связывающее CD73 соединение можно вводить приблизительно через 0-30 дней после введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации связывающее CD73 соединение вводят через от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или от приблизительно 1 до 5 дней после введения второго терапевтического агента.

Примеры

Способы

Клонирование, получение и очистка рекомбинантного huCD73 Молекулярная биология

Белок huCD73 клонировали из кДНК MIAPACA-2, применяя следующие праймеры TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGTGTCCCCGAGCCGCGCG (SEQ ID NO: 20) (прямой) и CCGCCCCGACTCTAGAtcaGTGATGGTGATGATGGTGcttgatccgaccttcaactg SEQ ID NO: 21) (обратный). Очищенный продукт ПЦР затем клонировали в вектор экспрессии, применяя систему клонирования InFusion. Метку 6xHis добавляли в С-концевую часть белка для этапа очистки.

Последовательность аминокислот клонированного huCD73:

Экспрессия и очистка белков huCD73

После подтверждения клонированной последовательности клетки подвергали нуклеофекции и совокупность продуцирующих клеток затем субклонировали с получением клона клетки, продуцирующей белок huCD73. Собирали супернатант клона huCD73, выращенного в устройстве для культивирования роллерного типа, и очищали, используя колонку Ni-NTA и элюирование с применением 250 мМ имидазола. Очищенные белки затем загружали на колонку для эксклюзионной хроматографии S200. Очищенный белок, соответствующий димеру, помещали в буферный раствор, содержащий трис 20 мМ, рН 7,5, NaCl 120 мМ и CaCl2 4 мМ, для анализа активности ферментов, тогда как в буфер для состава добавляли 20% глицерина.

Анализ ППР для оценки KD AT на рекомбинантном белке CD73

Измерения ППР проводили на устройстве Biacore™ Т200 при 25°С. Белок A (GE Healthcare) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare). Поверхность чипа активировали с помощью EDC/NHS (N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида и N-гидроксисукцинимида (Biacore™, GE Healthcare). Белок А разбавляли до 10 мкг/мл в буфере для связывания (10 мМ ацетат, рН 5,6) и вводили в систему до достижения соответствующего уровня иммобилизации (т.е. 2000 RU). Деактивирование оставшихся активированных групп осуществляли с использованием 100 мМ этаноламина с рН 8 (Biacore™, GE Healthcare). Исследование аффинности проводили в соответствии со стандартным протоколом анализа кинетики связывания, рекомендованным производителем (Biacore™, GE Healthcare kinetic wizard). Серийные разведения человеческого рекомбинантного растворимого белка CD73 в диапазоне от 1,23 до 300 нМ последовательно впрыскивали на захваченные антитела против CD73 и позволяли им диссоциировать в течение 10 минут перед регенерацией. Весь набор сенсограмм аппроксимировали с использованием кинетической модели связывания 1:1. Рассчитывали бивалентные аффинности и кинетические константы скорости ассоциации и диссоциации.

Анализ методом проточной цитометрии для оценки распознавания CD73 антителами

10⁵ клеток MDA-MB-231, ресуспендированных в буфере FCSB, распределяли по 96-луночным микропланшетам со скругленным дном лунок (по 50 мкл на лунку). В планшеты добавляли диапазон доз МАТ против CD73 и инкубировали клетки в течение 1 часа при +5±3°С. Клетки трижды промывали в FCSB путем центрифугирования планшетов при 400 g в течение 3 мин при 4°С. К клеткам добавляли конъюгированное с РЕ вторичное AT F(ab')2 козы против IgG (H+L) человека, разведенное в FCSB, и планшеты инкубировали в течение 30 дополнительных минут при +5±3°С. Клетки промывали три раза, как описано выше, и анализировали на проточном цитометре.

Строили графики зависимости медианы интенсивности флуоресценции от концентрации МАТ и рассчитывали ЕС₅₀ с использованием программы GraphPad Prism™.

Ферментативный анализ in vitro с рекомбинантным CD73 человека или яванского макака Вкратце, рекомбинантный CD73 человека или яванского макака инкубировали в белых 96-луночных микропланшетах с плоским дном лунок в присутствии диапазона доз МАТ против CD73 или МАТ изотипического контроля. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при +37±1°С. АТФ (12,5 мкМ) и АМФ (125 мкМ) добавляли в каждую лунку и инкубировали планшеты при +37±1°С в течение 30 дополнительных минут. В лунки добавляли люциферазу/содержащий люциферин CellTiter-Glo™ (Promega), планшеты инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте и измеряли излученный свет, используя устройство Enspire™ (Perkin Elmer).

• Условия:

• АТФ+АМФ: максимальное ингибирование люциферазы (100%)

• CD73+АТФ+АМФ: ингибирование люциферазы отсутствует (0%)

Строили графики зависимости остаточной активности фермента от концентрации AT против CD73, применяя программное обеспечение GraphPad Prism7™.

Анализ пролиферации Т-клеток.

Получали периферическую кровь из здоровых доноров и выделяли мононуклеарные клетки в градиенте фиколла. Проводили дополнительное обогащение лимфоцитами в градиенте 52% перколла™ (осадки клеток) и окрашивали их 2 мкМ CellTrace™ Violet (Thermofisher). 5x10⁴-1x10⁵ окрашенных клеток распределяли по 96-луночным планшетам со скругленным дном лунок, инкубировали в течение 1 часа при 37°С с антителами против CD73 и активировали в течение от 3 до 5 дней путем добавления гранул, покрытых антителом против CD3/против CD28. Ингибирования пролиферации Т-клеток добивались путем добавления 200 мкМ АМФ. Пролиферацию Т-клеток и способность AT блокировать иммуносупрессорное действие АМФ оценивали с помощью проточной цитометрии путем количественного анализа разведения красителя на пролиферирующих Т-клетках. Строили графики зависимости процента пролиферирующих Т-клеток от концентрации AT против CD73, применяя программное обеспечение GraphPad Prism™. Некоторые эксперименты проводили на цельных МКПК из здоровых доноров или пациентов с раком; протокол был таким, как описано выше, за исключением того, что супрессии Т-клеток добивались путем добавления от 0,5 до 1 мМ АТФ.

Для сравнения доноров или пациентов, пролиферацию Т-клеток нормировали с использованием следующей формулы:

Анализ аллогенной реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ)

Мононуклеарные клетки из здоровых доноров выделяли в градиенте фиколла, и моноциты очищали путем иммуномагнитной селекции с применением микрогранул с CD14 (Miltenyi Biotec). Моноциты дифференцировали в дендритные клетки (МоДК) путем культивирования в течение 5-7 дней в присутствии ГМ-КСФ (400 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл). В день получения ДК, CD4+ Т-клетки из аллогенных доноров очищали с помощью иммуномагнитного обеднения клетками, не являющимися CD4+ Т-клетками (Miltenyi Biotec), и окрашивали Cell Trace™ Violet. ДК (10⁴ клеток/лунку) и Т-клетки (5x10⁴ клеток/лунку) смешивали в 96-луночных планшетах со скругленным дном лунок в присутствии диапазонов доз МАТ против huCD73 и постоянной дозы АТФ. Пролиферацию Т-клеток и способность AT обращать опосредованную АТФ супрессию оценивали, как описано для анализа пролиферации Т-клеток.

Пример 1. Моделирование и получение антител против huCD73 с каркасными последовательностями человека

Исходное антитело 3С12, описанное в публикации РСТ WO 2016/055609, содержащее последовательности аминокислот VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 27 и 28, соответственно, модифицировали путем вставки в VH каркасных областей тяжелой цепи (FR1, FR2, FR3) из подгруппы IGHV1-3*01 человека вместе с IGHJ4*01 (FR4) и вставки в VL каркасных областей легкой цепи (FR1, FR2, FR3) из подгруппы IGKV1-33*01 человека вместе с IGKJ2*01 (FR4).

Трехмерные модели, основанные на различных сегментах генов VH и VL человека, накладывали друг на друга, и все различия аминокислот тщательно изучали по одному. Молекулярный дизайн in silico проверяли с использованием 3D-моделей как исходных химерных (HPLP), так и гуманизированных (H0L0) антител. Также оценивали внутрицепочечные и внецепочечные связи между остатками, чтобы выявить и избежать нарушения любой важной низкоэнергетической связи.

Последовательности VH и VL каждого разработанного домена клонировали в векторы, содержащие константные домены, происходящие из huIgG1, содержащие замены L234A/L235E/G237A/A330S/P331S, и константный домен huCk, соответственно. Двумя полученными векторами котрансфицировали линию клеток СНО. Созданный пул клеток использовали для получения антитела в среде СНО. Антитело затем очищали, применяя белок А. Последовательности тяжелой и легкой цепей, используемые для моделирования химерного варианта Fab 3С12 с константными областями IgG1 человека, включая домен Fc, содержащий замены L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (сохраняющие N297-связанное гликозилирование), были следующими:

Тяжелая цепь HP Fab (вариабельный домен подчеркнут)

Легкая цепь LP Fab (вариабельный домен подчеркнут)

Тяжелая цепь Н0 Fab (вариабельный домен подчеркнут)

Легкая цепь L0 Fab (вариабельный домен подчеркнут)

Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи исходного антитела HPLP представлены ниже:

HP VH

LP VL

Дизайн тяжелой цепи

Для исследования того, образует ли остаток 12 (также положение 2 в соответствии с нумерацией по Кабату) гидрофобную связь с CDR_H3-Y109 и играет ли он роль в позиционировании или гибкости CDR_H3, остаток валина в положении 2 был заменен на изолейцин. Боковые цепи V2 и 12 не совмещаются в двух моделях. V2 также образует гидрофобную связь с H0-Y109 (Y108 по Кабату), но положение Y109 слегка модифицировано, и H0-Y109 образует водородную связь с LC-Y55 (Y54 по Кабату). Y55 представляет собой остаток CDR_L2. Замена V2 может влиять на положение как CDR_H3, так и CDR_L2.

Для того чтобы исследовать, влияют ли остатки в положениях 28 и 30 (каркасная область 1, положения 28 и 30 также по Кабату) на связывание с антигеном, в этих положениях была проведена заменена на аланин. Исходное антитело содержит последовательность YAFA по сравнению с YTFT в антителе H0L0. Остатки А28 и А30 выставлены на молекулярной поверхности вблизи паратопа. Представляется вероятным, что треонин в положении 28, вероятно, отрицательно повлияет на связывание с антигеном. С другой стороны, А30, как представляется, вряд ли будет иметь решающее значение.

Для того чтобы исследовать, играет ли остаток в положении 44 (также 44 по Кабату) какую-либо роль для поверхности контакта VH/VL, осуществляли обратную мутацию этого остатка, тем самым сохраняя серии, присутствующий в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность GKS по сравнению с GQR антитела H0L0. R44 расположен на поверхности контакта VH/VL, очень близко к L45 боковой цепи.

Для того чтобы исследовать, важен ли остаток в положении 48 (также 48 по Кабату), осуществляли обратную мутацию этого остатка, тем самым сохраняя остаток, присутствующий в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность WIG по сравнению с WMG антитела H0L0. I48 и М48, по-видимому, занимают важные положения непосредственно под CDR_H2 и участвуют в сложной гидрофобной сети.

Для того чтобы исследовать, важны ли остатки в положениях 67 (положение 66 по Кабату) и 68 (положение 67 по Кабату), осуществляли обратную мутацию этих остатков, тем самым сохраняя остатки, присутствующие в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность KAT по сравнению с RVT в антителе H0L0. Выявили очень разные конформации петли между F64 (F63 по Кабату) и K67/R67 (K66/R66 по Кабату) в двух моделях. А68 (67 по Кабату) представляет собой остаток Вернье (Vernier).

Для того чтобы исследовать роль остатка в положении Abnum 70 (положение 69 по Кабату), осуществляли обратную мутацию этого остатка, тем самым сохраняя лейцин, присутствующий в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность TLT по сравнению с TIT антитела H0L0. L70 и 170 (L69 и 169 по Кабату) участвуют в сложной гидрофобной сети.

Для того чтобы исследовать роль остатка в положении 72 (71 по Кабату), осуществляли обратную мутацию этого остатка, тем самым сохраняя серии, присутствующий в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность TVD по сравнению с TRD антитела H0L0. V72 и R72 (V71 и R71 по Кабату) занимают важные положения непосредственно под CDR_H2. Отдаленная гидрофильная боковая цепь остатка V72 выступает на поверхность молекулы и образует водородную связь с N55 (N54 по Кабату). N55 занимает одинаковое положение в обеих моделях. Однако водородная связь с R72 (R71 по Кабату) может снижать гибкость соответствующей петли. Следовательно, влияние замены исходного валина на аргинин в H0L0 на связывание антигена предсказать невозможно.

Для того чтобы исследовать, влияет ли остаток в положении 74 (73 по Кабату) на связывание с антигеном, осуществляли обратную мутацию этого остатка, тем самым сохраняя серии, присутствующий в исходном антителе. Исходное антитело содержит последовательность DKS по сравнению с DTS в антителе H0L0. K74 и Т74 (K73 и Т73 по Кабату) выставлены на поверхность молекулы вблизи паратопа и могут участвовать в связывании антигена.

Первый вариант тяжелой цепи (Н1) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 29, содержит замены V2I и T73K. Второй вариант тяжелой цепи (Н2) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 30, содержит замены V2I, Т28А, R71V и T73K. Третий вариант тяжелой цепи (Н3) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 31, содержит замены V2I, Т28А, M48I, R66K, V67A, R71V и T73K. Четвертый вариант тяжелой цепи (Н4) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 32, содержит замены V2I, Т28А, Т30А, M48I, R66K, V67A, I69L, R71V и T73K. Нумерация замен указана в соответствии с нумерацией по Кабату.

Дизайн легкой цепи

Исходное антитело содержит последовательность DWM по сравнению с DIQM антитела H0L0. Остаток V2 образует гидрофобную связь с А25. Остаток 12 может быть выставлен на поверхность паратопа, но влияние на организацию паратопа предсказать невозможно. 12 не образует гидрофобной связи с А25, и это может незначительно изменить положение CDR-L1. Таким образом, изолейцин в остатке 2 был заменен на валин.

Исходное антитело содержит последовательность PDR по сравнению с PSR в антителе H0L0. Остаток R61 занимает ротамерные положения. Петли, по-видимому, ориентированы одинаково, но не перекрываются (боковое смещение, соответствующее общему смещению всего домена). В исходном антителе D60 образует солевой мостик и водородную связь с CDR-L2-R54. В антителе H0L0 остаток S60 не контактирует с R54. R54 занимает ротамерные положения. Контакт с D60 может иметь важное значение для того, чтобы остатки CDR-L2 заняли определенное и подходящее положение. Поэтому остаток аспарагиновой кислоты в положении 60 в антителе H0L0 заменили на серии.

Исходное антитело содержит последовательность GYG по сравнению с GSG в антителе H0L0. Для того чтобы исследовать, вносит ли остаток Y67 вклад в паратоп, серии в антителе H0L0 был заменен на тирозин.

Исходное антитело содержит последовательность YFC по сравнению с YYC в антителе H0L0. Хотя Y87, по-видимому, не образует водородную связь со смежными остатками, роль этого остатка предстоит изучить, и тирозин в положении 87 в H0L0 заменили на фенилаланин.

Первый вариант легкой цепи (L1) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 33, содержит замену S67Y. Второй вариант легкой цепи (L2) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 34, содержит замены S60D и S67Y. Третий вариант легкой цепи (L3) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 35, содержит замены I2V, S60D и S67Y. Четвертый вариант легкой цепи (L4) с последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 36, содержит замены I2V, S60D, S67Y и Y87F.

Последовательности аминокислот соответствующих вариабельных областей тяжелой (цепи "Н" в Таблице 1) и легкой (цепи "L" в Таблице 1) цепей представлены в Таблице 1 ниже.

Получали антитела, содержащие комбинации тяжелой и легкой цепей, представленные в таблице 2 ниже.

Пример 2. Связывание с растворимым белком CD73/ исследованное с помощью ППР

Исследовали связывание антител, представленных в Таблице 2 Примера 1, с растворимыми димерными белками CD73 человека, и клонировали, продуцировали и очищали их. Константы аффинности и ассоциации и диссоциации гуманизированных вариантов оценивали с помощью анализа ППР. В Таблице 3 обобщены все рассчитанные константы.

Для антитела H0L0 с полностью человеческой каркасной областью тяжелой цепи IGHV1-3*01 и IGHJ4*01 и полностью человеческой каркасной областью легкой цепи IGKV1-33*01 и IGKJ2*01 выявили KD 65 нМ. В Таблице 3 показано, что для гуманизированных вариантов HxL0 (H1L0, H2L0, H3L0 и H4L0) продемонстрировали константу ассоциации, эквивалентную другим вариантам, но более быстрый профиль диссоциации. KD вариантов HxL0, соответственно, были выше, чем таковые, наблюдаемые для всех остальных вариантов (Таблица 3). Следовательно, введение полностью человеческих последовательностей аминокислот легкой цепи IGKV1-33*01 и IGKJ2*01 в гуманизированные варианты, по-видимому, неблагоприятно сказывается на аффинности гуманизированного AT против CD73.

Тем не менее, для всех остальных гуманизированных вариантов выявили аффинность к CD73, сходную с таковой для химерного исходного антитела 3С12 (0,68 нМ). Примечательно, что все тяжелые цепи, содержащие полностью человеческие немодифицированные каркасные области тяжелой цепи IGHV1-3*01 и IGHJ4*01, обеспечивали высокоаффинное связывание c CD73.

Пример 3. Связывание с клетками, экспрессирующими CD73 человека, измеренное с помощью проточной цитометрии

Исследовали связывание гуманизированных антител, представленных в Таблице 2, с клетками, экспрессирующими CD73, с помощью проточной цитометрии. На Фигуре 1 показано, что все протестированные AT распознавали белки CD73 человека. Эффективность связывания huCD73 была сходной среди гуманизированных вариантов и химерного формата, за исключением H0L0, H2L0 и H3L0, которые оказались менее эффективными, чем исходное антитело. Эти наблюдения соответствуют данным ППР, которые выявили более низкую аффинность у вариантов HxL0 (H1L0, H2L0, H3L0 и H4L0). Следовательно, все тяжелые цепи, содержащие немодифицированные полностью человеческие каркасные области тяжелой цепи IGHV1-3*01 и IGHJ4*01, обеспечивали превосходное связывание с экспрессирующими CD73 клетками, сравнимое с таковым для исходного антитела.

Пример 4. Ферментативный анализ in vitro с рекомбинантным растворимым белком CD73 человека

Эффективность ингибирования ферментативной активности рекомбинантного белка CD73 гуманизированными вариантами сравнивали с таковой у исходного антитела (Фигура 2).

На фигуре 2 (панель А) показано, что измеренные уровни люминесценции были высокими при смешивании субстратов АТФ и CTG. При добавлении АМФ в реакционную смесь реакция CTG ингибировалась, что приводило к уменьшению люминесценции. В присутствии белка rhCD73, который осуществляет гидролиз АМФ, уровень люминесценции восстанавливался. Блокирование ферментативной активности CD73 гуманизированными вариантами показана на Фигуре 2.

Результаты показали, что за исключением вариантов с L0 (H0L0, H1L0, H2L0, H3L0 и H4L0), у которых была снижена активность по сравнению с исходным антителом, для всех гуманизированных вариантов продемонстрировали сильное ингибирование ферментативной активности растворимого белка CD73. Тем не менее, неожиданно, у большинства антител активность была несколько ниже, чем у исходного антитела. Только H1L4 и все варианты Н4 блокировали ферментативную активность с эффективностью, сходной с таковой у исходного антитела.

Данные эксперименты показали, что независимо от количества обратных мутаций в тяжелой цепи, отсутствие мутации в легкой цепи при использовании последовательностей IGKV1-33*01 и IGKJ2*01 в качестве акцепторной каркасной области приводило к значительному снижению способности ингибировать активность растворимого белка CD73.

Наилучшей эффективности блокирования активности белка CD73 добились с помощью вариантов H1L4 и H4Lx, отличных от H4L0 (т.е. H4L1, H4L2, H4L3 и H4L4).

Пример 5. Анализ пролиферации Т-клеток.

Концентрацию АМФ, способную ингибировать пролиферацию Т-клеток, исследовали в двух сериях экспериментов с целью установления концентрации АМФ, которая вызывает сильный эффект супрессии и которая позволяет восстановить пролиферацию в присутствии исходного антитела 3С12. Обогащенную фракцию лимфоцитов инкубировали в течение 3 дней в присутствии гранул против CD3/против CD28 и диапазона доз АМФ (от 1,6 мМ до 50 мкМ). Наилучший процент восстановления CD4+ и CD8+ Т-клеток наблюдался с 0,2-0,8 мМ и 0,2-1 мМ АМФ, соответственно, в двух сериях экспериментов.

Гуманизированные варианты и исходное антитело оценивали в двух сериях экспериментов для сравнения их способности восстанавливать пролиферацию Т-клеток, ингибированную 0,8 мМ АМФ.

На Фигуре 3 показано, что, за исключением вариантов HxL0, химерные и гуманизированные AT были способны восстанавливать пролиферацию Т-клеток (в обеих субпопуляциях CD4+ и CD8+). Несмотря на их способность восстанавливать пролиферацию, эффективность большинства гуманизированных вариантов была ниже по сравнению с таковой у исходного антитела. Для вариантов H0L4, H1L4 и H4L4 продемонстрировали уровень активности, аналогичный таковому у исходного антитела, хотя они и не достигли полной активности исходного антитела.

Второй эксперимент проводили при тех же условиях эксперимента, за исключением того, что варианты L0 заменяли на изотипический контроль. Результаты представлены на Фигуре 4.

Аналогично продемонстрированному на фигуре 3, за исключением вариантов HxL0, химерные и гуманизированные AT были способны восстанавливать пролиферацию Т-клеток (в обеих субпопуляциях CD4+ и CD8+). Тем не менее, несмотря на их способность восстанавливать пролиферацию, активность большинства гуманизированных вариантов снова была несколько ниже по сравнению с таковой у исходного антитела. Эффективность вариантов H0L4, H1L4 и H4L4 наиболее близко приближалась к эффективности исходного антитела.

Пример 6. Дизайн новых вариантов каркасной области и CDR

В предыдущих примерах показали, неожиданно, что не было прямой корреляции между титрованием в анализе методом проточной цитометрии и эффективностью ингибирования ферментативной активности CD73. Интересно, что в то время как варианты Н1, Н2, Н3 и Н4 по существу невозможно было различить на основании аффинности связывания с рекомбинантным белком CD73 в анализах ППР и с клетками, экспрессирующими CD73, в анализе методом проточной цитометрии, варианты Н2 и Н3 оказались менее эффективными, чем варианты Н4, в функциональном анализе способности восстанавливать пролиферацию Т-клеток, описанном в примере 5. Одной из вероятных причин является то, что мутации, введенные в каркасные области Н2 и Н3, которые отрицательно влияли на эффективность ингибирования CD73 (но не оказывали отрицательного влияния на аффинность связывания с CD73), были компенсированы мутациями, введенными в каркасные области варианта Н4. Следовательно, были разработаны новые варианты с заменами в каркасной области и/или остатках CDR тяжелой цепи. Основываясь на этих наблюдениях, замены, введенные в цепи Н2, Н3 и Н4, были классифицированы либо как остатки, которые, как полагают, необходимы для функции, остатки, которые, вероятно, не будут влиять на функцию, остатки, которые отрицательно влияют на функцию, и остатки, которые восстанавливают функцию.

Разработали новый вариант тяжелой цепи, названный "Н4+", с последовательностью аминокислот, представленной ниже (SEQ ID NO: 37; замены аминокислот выделены жирным шрифтом, CDR по Кабату подчеркнуты), и комбинировали с легкими цепями L1, L2, L3 и L4 (SEQ ID NO: 33, 34, 35 и 36, соответственно) с получением четырех новых антител, H4+L1, H4+L2, H4+L3 и H4+L4.

Н4+VH:

Последовательность аминокислот полноразмерной тяжелой цепи Н4+, содержащей домен Fc IgG1 человека с заменами L234A/L235E/G237A/A330S/P331S, представлена ниже:

Антитело H4+L1 содержало легкую цепь L1, содержащую домен С-каппа человека, полноразмерная последовательность которой представлена ниже:

Для того чтобы исследовать, как одни и те же замены в каркасной области будут влиять на антитело с различиями в CDR его тяжелой и легкой цепей, получили еще одну серию из четырех антител, содержащих общую тяжелую цепь и одну из четырех различных легких цепей. Общая тяжелая цепь, обозначенная "2Н4+", содержала глутамин в положении 59 по Кабату (Q59) в HCDR2 (т.е., замену L59Q по сравнению с цепью Н4+), лизин в остатке 60 по Кабату (K60) в HCDR2 (т.е. замену T60K по сравнению с цепью Н4+) и аспарагин в положении 97 по Кабату (N97) в HCDR3 (т.е. замену G97N по сравнению с цепью Н4+). Четыре легкие цепи, обозначенные 2L1, 2L2, 2L3 и 2L4, содержали те же каркасные остатки, что и цепи L1, L2, L3 и L4, соответственно, но их CDR отличались от таковых в цепях L1-L4 наличием треонина в положении 30 по Кабату (Т30) в LCDR1 (т.е., заменой S30T по сравнению с цепями L1-L4) и аспарагина в остатке 53 по Кабату (N53) в LCDR2 (т.е., заменой T53N по сравнению с цепями L1-L4). Полученные четыре новых антитела обозначили 2H4+2L1, 2H4+2L2, 2H4+2L3 и 2H4+2L4 (см. ниже Таблицу 4). Исходное антитело с такими же CDR в каркасных областях мыши получали с вариабельными областями тяжелой и легкой цепи, обозначенными 2НР и 2LP (последовательности аминокислот представлены ниже в Таблице 5).

Как и в примере 1, все антитела получали в виде изотипа IgG1 человека с заменами L234A/L235E/G237A/A330S/P331S для снижения связывания с Fc-рецептором.

Последовательность аминокислот полноразмерной тяжелой цепи 2Н4+, содержащей домен Fc IgG1 человека с заменами L234A/L235E/G237A/A330S/P331S, представлена ниже:

Последовательность аминокислот полноразмерной легкой цепи 2L1 антитела, содержащего домен С-каппа человека, представлена ниже:

Пример 7. Исследование новых вариантов в ферментативном анализе in vitro с рекомбинантным белком CD73

Эффективность ингибирования ферментативной активности рекомбинантного белка CD73 гуманизированными вариантами сравнивали с таковой для исходного антитела, применяя способы, описанные в Примере 4. Все новые гуманизированные варианты, полученные, как описано в Примере 6, эффективно ингибировали активность белка CD73.

Антитела Н4+Lx были такими же эффективными, как и исходный их аналог. Кроме того, для всех вариантов 2H4+2Lx (2H4+L1, 2H4+L2, 2H4+L3 и 2H4+L4) продемонстрировали повышение эффективности ингибирования CD73 по сравнению с вариантами H4+Lx. Варианты 2H4+2Lx ингибировали активность CD73 с эффективностью, аналогичной эффективности исходного антитела 2HP2LP.

Проводили дополнительный эксперимент с различными концентрациями белка CD73 (50, 100, 200, 400 нг/мл). Цель данного эксперимента заключалась в изучении способности гуманизированных антител блокировать активность больших количеств белка CD73. Снова, варианты 2H4+2Lx были такими же эффективными, как и исходное антитело 2HP2LP.

Пример 8. Исследование эффективности новых вариантов с использованием белка CD73 яванского макака

Эксперимент на рекомбинантном белке рек.cyCD73 проводили с вариантами 2H1Lx и 2H4+2Lx. Условия эксперимента были такими же, как и в экспериментах с человеческим белком, за исключением используемой концентрации белка cyCD73 (400 нг/мл).

Эффективность блокирования гуманизированными вариантами ферментативной активности белка cyCD73 была такой же, как и у исходного (химерного) антитела.

Пример 9. Исследование новых вариантов в анализе пролиферации Т-клеток.

Исследовали способность гуманизированных вариантов различных антител восстанавливать пролиферацию Т-клеток, ингибированную АМФ.

На Фигуре 5А показано ингибиторное действие АМФ на пролиферацию Т-клеток. Все гуманизированные варианты эффективно блокировали ингибиторное действие АМФ на пролиферацию Т-клеток (Фигуры 5В и С). В то время как большинство гуманизированных вариантов, как правило, оказывались такими же эффективными, как и их химерный исходный аналог в отношении обращения опосредованной АМФ супрессии Т-клеток, варианты 2H4+2Lx были наиболее эффективными среди всех вариантов, и, неожиданно, они еще более эффективно блокировали супрессорное действие АМФ, чем исходное антитело 2HP2LP.

Пример 10. Сравнительное исследование новых вариантов в анализе пролиферации Т-клеток от двух доноров-людей.

В соответствии с полученными ранее результатами, гуманизированные варианты 2H4+2Lx дополнительно исследовали в дополнительной серии экспериментов по пролиферации Т-клеток.

На Фиг. 6А и 6В показаны результаты, полученные в анализе пролиферации Т-клеток с использованием клеток двух здоровых доноров, соответственно. Как наблюдали ранее, каждый из вариантов 2H4+2Lx более эффективно восстанавливал пролиферацию Т-клеток, чем исходное 2HP2LP (Фиг. 6А и В, правые панели). Не наблюдали явных различий между различными вариантами 2H4+2Lx. Следовательно, опять же, варианты 2H4+2Lx более эффективно блокировали супрессорное действие АМФ, чем исходное антитело 2HP2LP.

В совокупности, результаты, полученные при анализе пролиферации Т-клеток, свидетельствуют о том, что гуманизированные варианты, содержащие каркасные области Н4+ и цепи Н4+, являются наиболее эффективными вариантами антител, и что варианты 2H4+2Lx в целом являются наиболее эффективными среди всех антител.

Пример 11. Исследование новых вариантов в анализе аллогенной реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ)

Вариант антитела 2H4+2Lx тестировали в аллогенной РСКЛ, чтобы подтвердить результаты, полученные ранее в анализе пролиферации Т-клеток. Пролиферацию Т-клеток ингибировали путем добавления 100 мкМ АТФ (который расщеплялся на АДФ и АМФ под действием CD39), как показано на Фигуре 7 для образцов из двух доноров-людей.

На Фигуре 7 на левой панели показано, что пролиферацию Т-клеток ингибировали добавлением АТФ. Пролиферация Т-клеток восстанавливалась в присутствии антител против CD73 (средняя и правая панели). Все гуманизированные варианты 2H4+2Lx были способны восстанавливать пролиферацию Т-клеток с эффективностью, сопоставимой с таковой или лучшей, чем у исходного антитела 2HP2LP. Все варианты 2H4+2Lx более эффективно, чем исходное 2HP2LP, восстанавливали пролиферацию Т-клеток в этих условиях. Эти результаты соответствовали результатам, полученным в анализе пролиферации Т-клеток с использованием АМФ в качестве ингибитора.

В заключение, замены, введенные в вариабельные области Н4+ и 2Н4+, вместе с заменами, введенными в цепи L1 и 2L1 (и цепи L2, L3, L4, 2L2, 2L3, 2L4), по-видимому, восстанавливают (и даже улучшают) важные функциональные свойства исходных мышиных антител, которые при этом содержат каркасные области человека и, следовательно, имеют пониженный риск иммуногенности у человека. Антитела 2H4+2Lx являются наиболее эффективными из всех.

Одно из возможных объяснений неожиданного открытия, что аффинность связывания с CD73 напрямую не коррелирует с эффективностью функционального ингибирования активности CD73, может быть связано с тем, что эти антитела, связывающиеся с CD73, действуют как аллостерические ингибиторы. Антитела связываются с CD73 способом внутридимерного связывания в стехиометрии 1:1 между интактным полноразмерным антителом и димером CD73. Предшествующие структурные исследования CD73 показали, что для его ферментативной активности требуется значительное вращение N-концевого домена, определяющего открытое (неактивное) и закрытое (активное, связанное с субстратом) состояния фермента (Knapp и др., 2012 Structure 20(12):2161-73). На основании кристаллической структуры исходного F(ab) против CD73 в комплексе с эктодоменом CD73 и принимая во внимание стехиометрию 1:1 между интактным антителом и димером CD73, предполагают, что в результате стерического затруднения маловероятно, чтобы интактное антитело могло связаться с открытыми конформационными изомерами CD73. Вместо этого, интактное антитело связывает CD73 в промежуточном состоянии, в котором АМФ не может быть гидролизован. Поскольку антитела связывают CD73, таким образом, при нахождении в энергетически нестабильной конформации, небольшие изменения, которые изменяют жесткость структуры антитела, описанные здесь, могут влиять на способность антитела приспосабливаться к изменяющейся конформации димера CD73. Следовательно, эти изменения могут влиять на способность антитела ингибировать активность CD73 в присутствии субстрата. Однако эти небольшие изменения в структуре антитела не будут наблюдаться в анализе методом ППР или в других способах анализа связывания, которые, кроме того, проводятся в отсутствие субстрата. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей, описанные в настоящем документе, по-видимому, способны сохранять (и даже улучшать) полную динамику взаимодействия с CD73 исходных антител, и при этом содержат человеческие каркасные области.

Все ссылочные материалы, включая публикации, заявки на патент и патенты, цитированные в данной заявке, настоящим полностью включены посредством ссылки и в той же степени, как если бы каждый ссылочный материал был отдельно и конкретно указан как включенный посредством ссылки, и были полностью изложены в данной заявке (в максимальный объеме, дозволенном законом), независимо от любого отдельно приведенного включения конкретных документов, сделанного в других местах в данной заявке.

Использование формы единственного числа следует толковать как включающее как единственное, так и множественное число, если в данном документе не указано иное, или если это явно не противоречит контексту.

Если не указано иное, все точные значения, приведенные в данной заявке, являются примером соответствующих приблизительных значений (например, все точные примеры значений, предложенные в отношении конкретного показателя или меры, можно считать также включающими соответствующую приблизительную меру, измененную термином «приблизительно», когда это целесообразно).

В данной заявке предполагается, что описание любого аспекта или варианта реализации в настоящем документе с использованием таких терминов как «включающий», «имеющий», «заключающий в себе» или «содержащий» в отношении некоторого элемента или элементов включает аналогичный аспект или вариант реализации в данной заявке, который «состоит из», «состоит по существу из» или «по существу включает» данный конкретный элемент или элементы, если не указано иное или нет явных противоречий с контекстом (например, упоминание композиции, описанной в данном документе как содержащей конкретный элемент, следует понимать как также описывающее композицию, состоящую из такого элемента, если не указано иное или нет явных противоречий с контекстом).

Использование любого и всех примеров или языка примеров (например, «такой как»), предложенных в данной заявке, предназначено только для лучшего освещения настоящего изобретения и не устанавливает ограничения на объем настоящего изобретения, если не утверждается иное. Ни одна формулировка в настоящем описании не должна рассматриваться как указывающая, что какой-либо незаявленный элемент незаменим для осуществления настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INNATE PHARMA

<120> АНТИТЕЛА, БЛОКИРУЮЩИЕ CD73

<130> CD73-6

<150> US 62/837,214

<151> 2019-04-23

<160> 48

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 1

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu

545 550 555 560

Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln

565 570

<210> 2

<211> 5

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 2

Ser Tyr Asn Met Tyr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> Белок

<213> mus musculus

<220>

<221> X

<222> (13)..(13)

<223> X может представлять собой Gln или Leu

<220>

<221> X

<222> (14)..(14)

<223> X может представлять собой Lys или Thr

<400> 3

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Xaa Xaa Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<221> X

<222> (3)..(3)

<223> X может представлять собой Asp или Gly

<400> 4

Gly Tyr Xaa Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> Белок

<213> mus musculus

<220>

<221> X

<222> (7)..(7)

<223> X может представлять собой Thr или Ser

<400> 5

Lys Ala Ser Gln Ser Val Xaa Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> Белок

<213> mus musculus

<220>

<221> X

<222> (4)..(4)

<223> X может представлять собой Thr или Asn

<400> 6

Tyr Ala Ser Xaa Arg Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 7

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 8

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 11

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 9

Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 10

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 11

Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 12

<211> 17

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 12

Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 11

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 13

Gly Tyr Asn Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 14

Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> Белок

<213> mus musculus

<400> 15

Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 17

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 18

<211> 330

<212> Белок

<213> Синтетическая

<400> 18

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 19

<211> 330

<212> Белок

<213> Синтетическая

<400> 19

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 20

<211> 45

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 20

tacgactcac aagcttgccg ccaccatgtg tccccgagcc gcgcg 45

<210> 21

<211> 57

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 21

ccgccccgac tctagatcag tgatggtgat gatggtgctt gatccgacct tcaactg 57

<210> 22

<211> 553

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu

20 25 30

His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser

35 40 45

Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu

50 55 60

Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu

65 70 75 80

Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr

85 90 95

Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala

100 105 110

Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile

115 120 125

Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile

130 135 140

Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro

145 150 155 160

Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val

180 185 190

Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys

195 200 205

Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu

210 215 220

Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val

225 230 235 240

Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys

245 250 255

Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly

260 265 270

Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly

275 280 285

Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His

290 295 300

Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile

305 310 315 320

Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr

325 330 335

Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser

340 345 350

Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met

355 360 365

Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val

370 375 380

Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu

385 390 395 400

Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro

405 410 415

Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu

435 440 445

Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys

450 455 460

Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg

465 470 475 480

Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile

485 490 495

Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys

500 505 510

Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val

515 520 525

Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly

530 535 540

Arg Ile Lys His His His His His His

545 550

<210> 23

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215

<210> 24

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

210 215

<210> 26

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 27

Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 28

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 29

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 31

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 32

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 35

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 35

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 36

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 36

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 37

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Leu Thr Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 39

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 40

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 40

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Asn Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asn Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 41

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 41

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Met Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 42

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 42

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asn Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 106

<212> Белок

<213> Синтетическая

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 450

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asn Asn Tyr Lys Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 48

<211> 213

<212> Белок

<213> Искусственная

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела и их фрагменты, которые связывают и ингибируют CD73 человека. Кроме того, предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела, содержащие антитела фармацевтические композиции, применение указанных антител для изготовления лекарственного средства для лечения рака. Изобретение обеспечивает более эффективное ингибирование ферментативной активности CD73. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 табл., 11 пр.

1. Антитело или фрагмент антитела, способные специфически связываться с полипептидом CD73 человека, причем указанные антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44, 45 и 46.

2. Антитело или фрагмент антитела по п. 1, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 43.

3. Антитело или фрагмент антитела по п. 1, отличающиеся тем, что указанные антитело или фрагмент антитела содержат тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 48.

4. Антитело или фрагмент антитела по любому из пунктов выше, отличающиеся тем, что антитело или фрагмент антитела способны нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность полипептида CD73.

5. Антитело или фрагмент антитела, способные специфически связывать полипептид CD73 человека на поверхности клетки и нейтрализовать 5'-эктонуклеотидазную активность полипептида CD73 на поверхности клетки, причем антитело или фрагмент антитела содержат тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности аминокислот SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, где указанные антитело или фрагмент антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность аминокислот SEQ ID NO: 43.

6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая антитело или фрагмент антитела по любому из пунктов выше и фармацевтически приемлемый носитель.

7. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 1-5.

8. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 1-5 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что рак представляет собой лейкоз, рак мочевого пузыря, глиому, глиобластому, рак яичников, меланому, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак желудка, рак пищевода, рак поджелудочной железы или рак молочной железы.