ПРОИЗВОДНОЕ 7-ГИДРОКСИКУМАРИНА ДЛЯ ИНДУКЦИИ МИТОФАГИИ В КЛЕТКАХ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/37 C07D311/16 A61P1/00 A61P3/10 A61P9/00 A61P19/00 A61P25/00 A61P27/00 A61P35/00 

Область техники

Группа изобретений относится к области фармакологии и медицины, а именно к новому производному кумарина с выраженной протонофорной активностью и являющимся субстратом митохондриального фермента альдегиддегидрогеназы II. Настоящее изобретение может быть использовано для производства лекарственных препаратов, механизм действия которых связан со снижением мембранного потенциала митохондрий для стимуляции митофагии в клетке, предусматривающим обработку клеток производным кумарина формулы (I), к способам стимуляции митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией.

Уровень техники

В последние годы возрос интерес к поиску новых протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования, т.к. было показано, что подобные соединения обладают широким спектром терапевтической активности [Shrestha R, Johnson E, Byrne FL. Exploring the therapeutic potential of mitochondrial uncouplers in cancer. Mol Metab. 2021 Sep;51:101222. Goedeke L, Shulman GI.; Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Mol Metab. 2021 Apr;46:101178. doi: 10.1016/j.molmet.2021.101178. Epub 2021 Feb 3. PMID: 33545391; PMCID: PMC8085597.]. Основным направлением исследований в этой области является поиск соединений со сбалансированным потенциалом разобщения и токсичности для клеток и организма в целом. Один из перспективных вариантов снижения системной токсичности разобщителей - создание соединения, проявляющего свою разобщающую активность ограниченное время. Одним из возможных путей достижения этого является создание разобщителей, метаболизируемых ферментами, локализованными в митохондриях. Эта особенность позволяет соединениям достичь митохондрий без изменений в своей структуре, проявить свою разобщающую активность, снизив мембранный потенциал митохондрий, после чего метаболизироваться в безопасную для клетки молекулу.

Другим перспективным вариантом является создание тканеспецифичного разобщителя, проявляющего свою активность в конкретных тканях или органах. Это свойство соединений также может быть связано с разницей в концентрациях ряда ферментов, способных модифицировать эти соединения.

Хорошо известно, что потеря мембранного потенциала митохондрий (например, в результате действия протонофорных разобщителей) приводит к избирательной аутофагии митохондрий (т.е. митофагии) через PTEN-индуцированный белок-киназу 1 (PINK1) и Паркин-зависимый путь (Eiyama A, Okamoto K. PINK1/Parkin-mediated mitophagy in mammalian cells. Curr Opin Cell Biol. 2015 Apr;33:95-101). Использование разобщителей, действие которых ограничено по времени, может выявить митохондрии, функции которых нарушены, т.к. такие органеллы не способны к быстрому восстановлению мембранного потенциала после прекращения разобщающего действия соединений. В свою очередь, клетка имеет систему для отслеживания митохондрий с низким мембранным потенциалом и в результате действия разобщителей происходит очищение митохондриальной популяции от дефектных органелл, что повышает устойчивость клеток к различного вида стрессам. Сбалансированный биогенез митохондрий и митофагия необходимы для поддержания клеточного гомеостаза и оптимального функционирования тканей, особенно важным это становится в условиях окислительного стресса, возникающего в тканях при ишемии/реперфузии или при действии химиопрепаратов, прямо стимулирующих окислительный стресс в митохондриях (к примеру, химиотерапия доксорубицином, действие гербицидов и тд). Кроме того, митофагия играет ключевую роль в развитии дегенеративных заболеваний, связанных со старением. По этой причине значительные усилия исследователей сосредоточены на поисках способа активировать митофагию для предотвращения развития таких заболеваний как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, застойная сердечная недостаточность, саркопения, диабет 2-го типа, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, заболевания печени и поджелудочной железы, глазные заболевания, артрит, катаракта, остеопороз, гипертония.

Существует уникальный пример эффективного разобщителя, проявляющего ограниченную по времени активность в изолированных митохондриях млекопитающих - флуазинам (формула 1) [L.S. Khailova, A.M. Firsov, E.A. Kotova, Y.N. Antonenko, Interaction of potent mitochondrial uncouplers with thiol-containing antioxidants, Antioxidants 8 (2019) 194].

1

Этот эффективный пестицид обладающий протонофорной активностью, является специфическим субстратом глутатион-S-трансферазы, что проявляется в быстром снижении разобщающей активности соединения после ферментативной модификации молекулы. Однако, кроме высокой протонофорной активности флуазинам ингибирует активность комплекса I дыхательной цепи и может оказывать нейротоксичное действие с высокой вероятностью развития болезни Паркинсона [Lee JE, et al. Fluazinam targets mitochondrial complex I to induce reactive oxygen species-dependent cytotoxicity in SH-SY5Y cells. Neurochem Int. 2012 Jun;60(8):773-81. doi: 10.1016/j.neuint.2012.03.007. Epub 2012 Mar 21. PMID: 22465686.].

Другим подходом, снижающим общую токсичность разобщителей, является создание тканеспецифичных соединений. Наиболее ярким примером подобного рода является создание производного метилового эфира 2,4-Динитрофенола (DNP, формула 2).

С начала двадцатого века было предпринято несколько попыток разработать фармакологические соединения, усиливающие разобщение митохондрий. Самый известный из них, DNP, первоначально использовался для синтеза взрывчатых веществ во время Первой мировой войны, а затем рассматривался как перспективный препарат против ожирения.

К началу 1930-х годов DNP широко применялся в США как безрецептурный препарат для быстрого снижения веса, однако сообщения о токсичных побочных эффектах, включая гипертермию, образование катаракты и смерть, привели к его изъятию из продажи Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в 1938 году.

Гипертермия, вызванная системным разобщением митохондрий, является основным фактором, способствующим низкому терапевтическому индексу DNP и других соединений способных к разобщению окислительного фосфорилирования. Для снижения системного воздействия DNP на организм и снижения общей токсичности в 2013 году Перри и др. разработали производное DNP, а именно метиловый эфир (DNPME, формула 3), которое преимущественно метаболизируется печеночной системой цитохрома P450 до активного протонофора DNP (Perry, R.J., Kim, T., Zhang, X.M., Lee, H.Y., Pesta, D., Popov, V.B., et al., 2013. Reversal of hypertriglyceridemia, fatty liver disease, and insulin resistance by a liver-targeted mitochondrial uncoupler. Cell Metabolism 18(5):740e748.).

Т.е. таким способом был получен тканеспецифический разобщитель, проявляющий свою активность в основном в клетках печени и не влияющий на уровень метаболизма других тканей. Данный подход привел к увеличению терапевтического окна по сравнению с обычным DNP в 50 - 200 раз. Примечательно, что внутрибрюшинная инъекция DNPME (5 мг/кг) смогла предотвратить и обратить вспять печеночный стеатоз, гипергликемию и резистентность к инсулину в крысиных моделях MAFLD и T2D, вызванных диетой, независимо от изменения массы тела или системной токсичности. Интересно, что, хотя низкие уровни DNP (<3 мМ) накапливались во внепеченочных тканях (скелетная мышца, сердце и мозг) после введения DNPME, эти уровни были недостаточными для увеличения митохондриального дыхания in vitro, что позволяет предположить, что благоприятные эффекты DNPME в основном связаны с разобщением в печени. Однако, DNPME активируется после ферментативной реакции с системой цитохрома P450, после чего происходит неконтролируемое разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий печени, но не других тканей организма.

Для дальнейшего повышения безопасности DNP Перри и др. разработали препарат с пролонгированным высвобождением (митохондриальный протонофор с контролируемым высвобождением, CRMP), который более чем в 200 раз снизил токсичность DNP [Perry, R.J., Zhang, D., Zhang, X.M., Boyer, J.L., Shulman, G.I., 2015. Controlled-release mitochondrial protonophore reverses diabetes and steatohepatitis in rats. Science 347(6227):1253e1256]. Подобно DNPME, CRMP смог значительно снизить инсулинорезистентность организма, подавить печеночное воспаление и печеночный фиброз в крысиных моделях инсулинорезистентности, T2D и NASH. Основным действующим веществом CRMP является не модифицированный DNP, контроль высвобождения DNP производится за счет особого состава таблетированной формы (EP3038611A1). Таким образом достигается снижение токсичности терапии, но не придает ей тканеспецифичность в отличие от заявляемого в патенте протонофорного разобщителя UB3.

Наиболее близким по свойствам и структуре к заявляемому в патенте соединению является производное 7-гидроксикумарина - умбеллиферон-4-уксусной кислоты (UB-4 эфиры, формула 4) [Krasnov VS, et al. Alkyl esters of umbelliferone-4-acetic acid as protonophores in bilayer lipid membranes and ALDH2-dependent soft uncouplers in rat liver mitochondria. Bioelectrochemistry. 2022 Jun;145:108081. doi: 10.1016/j.bioelechem.2022.108081. Epub 2022 Feb 2. PMID: 35131667.].

Данное соединение структурно отличается от производного кумарина формулы (I), также является субстратом для митохондриальной альдегиддегидрогеназы II, однако данное соединение проявляет в 10 раз более низкую протонофорную активность, вследствие чего оно не способно эффективно стимулировать избирательную деградацию митохондрий (С_1/2 разобщающей активности UB3-C₁₀=0.4 μM, UB4-C₁₀=4 μM, см. пример 1).

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет создания низкотоксичного соединения на основе 7-гидроксикумарина, обладающего свойствами протонофорного разобщителя.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемой группы изобретений является новое производное 7-гидроксикумарина, протонофорная активность которого проявляется в клетках почек, сердца и мозга. Протонофорная активность соединений стимулирует падение мембранного потенциала митохондрий в клетках более чем на 50 %, что приводит к стимуляции избирательной деградации не менее 10% популяции митохондрий через 24 часа после воздействия. Протонофорная активность соединений лимитируется активностью митохондриального фермента альдегиддегидрогиназы II, что ограничивает время проявления протонофорной активности и снижает токсичность соединений для клеток, расширяя терапевтическое окно, в котором возможно применение патентуемых соединений.

Производное 7-гидроксикумарина, обладающее протонофорной активностью за счет которой происходит разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий и снижение их мембранного потенциала. Протонофорная активность патентуемых соединений лимитируется ферментом альдегиддегидрогеназой II, локализованной в матриксе митохондрий, благодаря чему разобщение окислительного фосфорилирования митохондрий носит временный характер и не приводит к значительным изменениям в уровне метаболизма клеток, что делает патентуемые соединении низкотоксичными. За счет различий в содержании альдегиддегидрогеназы II в тканях организма, время протонофорной активности патентуемых соединений в разных тканях и органах значительно отличается. Учитывая известные уровни альдегиддегидрогеназы II в различных органах человека, максимальная протонофорная активность соединений проявляется в тканях почек, сердца и мозга. Временное снижение мембранного потенциала митохондрий в этих тканях приводит к стимуляции избирательной деградации митохондрий и отбору наиболее качественных органелл, что повышает устойчивость клеток к разнообразным стрессовым воздействиям, патологический механизм которых связан с функционированием митохондрий.

Технический результат достигается производным 7-гидроксикумарина общей формулы (I), обладающим протонофорной активностью

,

где R представляет собой алкил, линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный, содержащий 6-15 атомов углерода.

Технический также достигается применением производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) для стимуляции избирательной деградации митохондрий в клетках (митофагии).

Также технический результат достигается применением производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) для использования в комплексной терапии заболеваний, вызванных митохондриальной дисфункцией включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, деменция, застойная сердечная недостаточность, саркопения, диабет 2-го типа, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, колит, заболевания печени и поджелудочной железы, глазные заболевания, артрит, катаракта, остеопороз, гипертония.

Технический результат также достигается способом стимуляции избирательной деградации митохондрий в клетках (митофагии), включающий как обработку клеточных культур посредством введения в организм производного 7-гидроксикумарина формулы I.

Также технический результат достигается применением производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) для изготовления фармацевтической композиция, включающей терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемые добавки.

Также технический результат достигается применением производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) по п. 1 для изготовления фармацевтической композиция, включающей терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемые добавки. При этом фармацевтическая композиция представлена в виде единичной дозированной формы или в виде двух или более отдельных готовых фармацевтических форм для последовательного или одновременного введения.

Также технический результат достигается фармацевтической композицией для лечения патологий ассоциированных с митохондриальной дисфункцией, включающая (а) производное 7-гидроксикумарина общей формулы (I) по п. 1 и (b) фармацевтически приемлемые добавки.

Технический результат от использования предлагаемого в изобретении решения состоит в повышении устойчивости клеток к разнообразным стрессовым воздействиям, патологический механизм которых связан с функционированием митохондрий, за счет стимуляции устранения дисфункциональных митохондрий путем митофагии, приводящий к купированию и лечению состояний, ассоциированных с митохондриальной дисфункцией.

Указанный технический результат достигается благодаря тому, что соединения формулы I проявляют протонофорную активность как на выделенных митохондриях, так и на клеточных культурах.

Протонофорная активность данных соединений определяется наличием линкера R соединённого с молекулой 7-гидроксикумарина сложноэфирной связью.

Соединения формулы I являются субстратами альдегиддегидрогеназы II проявляющим эстеразную активность и локализованной в матриксе митохондрий. Благодаря активности данного фермента, происходит отщепление липофильного остатка молекулы по сложноэфирной связи с образованием 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и R-OH.

Продукты реакции не проявляют протонофорной активности и безопасны для клеточного метаболизма. Данное свойство определяет низкую токсичность соединений и ограниченность по времени их протонофорной активности.

Протонофорная активность соединений формулы I зависит от концентрации альдегиддегидрогеназы II в митохондриях. Распределение данного фермента по тканям организма неравномерно. Максимальное его количество определяется в тканях печени, в тоже время в тканях сердца, почек и мозга содержание альдегиддегидрогеназы II значительно ниже. Данное свойство определяет тканеспецифичность соединений формулы I.

Указанный технический результат достигается также благодаря применению соединения формулы (I) для стимуляции митофагии в клетках. Указанное применение включает в себя обработку клеток индуктором на основе соединения формулы (I). В одном из предпочтительных вариантов индуктор на основе соединения формулы (I) используют в концентрации от 0,5 до 70 мкг/мл, предпочтительно от 7 до 70 мкг/мл.

В еще одном предпочтительном варианте длительность обработки клеток индуктором на основе соединения формулы (I) составляет от 5 до 48 ч, предпочтительно 17 ч.

Указанный технический результат достигается также благодаря тому, что при осуществлении способа стимуляции митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией, в качестве индуктора митофагии используют соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые композиции. Состояние, ассоциированное с митохондриальной дисфункцией, включают мутации и/или эпигенетические нарушения митохондриального или ядерного генома, приводящие к нарушению митофагии, дефектам морфологии митохондрий и нарушениям мембранного потенциала митохондрий, и состояния, включающие окислительные повреждения клеток в условиях ишемии/реперфузии или при действии химиопрепаратов влияющих на функциональное состояние митохондрий. В одном из предпочтительных вариантов, соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая композиция вводится в организм в дозе от 0.1 до 50 мг/кг веса тела. Введение индуктора митофагии можно

осуществлять различными путями, например путем внутривенного, перорально, ректально, чрезкожно, подкожно, внутримышечного введения, местного применения.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 A. Стимуляция дыхания митохондрий сердца крысы с помощью UB-3-COOC₈ и UB-4-COOC₈. Серая кривая показывает контрольную линию без добавления эфиров UB. В качестве субстрата окисления использовали сукцинат.Для повышения работы дыхательной цепи на субстратах комплекса II, работу комплекса I блокировали 2 мкМ ротенона. Б. Стимуляция окисления сукцината под действием UB-3-COOCn или UB-4COOCn добавленных в различных концентрациях.

На фиг. 2 Доказательство что UB3 является субстратом альдегиддегидроеназы II и более активно проявляет протонофорную активность в митохондриях сердца. А. Доз зависимость влияния UB-3-COOC 8 (1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 3,5 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ) на мембранный потенциал митохондрий печени. Б. Доз зависимость влияния UB-3-COOC 8 (0 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ) на мембранный потенциал митохондрий сердца. В. Влияние ингибитора ALDH2 дисульфирама (DSF, три добавления по 20 мкМ, красная кривая) на разобщающую активность UB-3-COOC 8 (4 мкМ, черная и красная кривые) в митохондриях печени. Для сравнения показан эффект 100 нМ CCCP (синяя кривая). Субстратом окисления служил сукцинат (5 мМ), в качестве ингибитора комплекса I использовали ротенон (5 мкМ).

На фиг. 3 Доказательство низкой токсичность UB3 на клетках HEK293 (А) и MRC5SV40 (Б). Цитотоксическое действие UB3 с линкером COOC длинной 6, 8, 10, 12 звеньев. Клетки рассаживали на 96 луночные планшеты (5*10³ клеток в каждой лунке), через 24 часа к клеткам добавляли производные кумарина UB3 с линкером COOC длинной 6, 8, 10, 12 звеньев в концентрациях 200, 66.7, 22.2, 4.4, 2.5, 0.8 мкМ. После инкубации клеток в течении 24 часов с производными UB3 анализировали процент выживших клеток. Для флуориметрического определения клеточной гибели использовали реагент CellTiterBlue® (Promega), который содержит краситель резазурин, проникающий внутрь клеток и восстанавливающийся внутри живых, метаболически активных клеток, в флуоресцентный резоруфин. К клеткам добавляли 700 мкМ CellTiterBlue® на 3 часа и инкубировали в CO2-инкубаторе при 37С.Количество живых фибробластов определяли по изменению флуоресцентного сигнала резазурина (возбуждение при 560 нм, испускание при 590 нм).

На фиг. 4 Доказательство различий в протонофорном действии UB3 на кардиомиоциты и фибробласты. Клеточные культуры инкубировались с 2, 10, 50 мкМ UB3-C₁₀ в течении 1 и 5 часов. Митохондриальный потенциал оценивали с помощью рациометрического красителя JC1 на проточном цитометре с возможностью визуализации Amnis Flowsight. На графиках показано распределение клеток по уровню в них мембранного потенциала, который зависит от отношения интенсивности флуоресценции в каналах Ch3 (J-агрегаты JC1, красная флуоресценция) и Ch2 (мономерная форма JC1, зеленая флуоресценция).

На фиг. 5 Способность UB3 стимулировать митофагию в клетках MRC5SV40. Клетки MRC5SV40 инкубировались с UB3-C₁₀ (25 мкМ) в течении 24 часов, после чего митохондрии и лизосомы визуализировались с помощью красителей MitoTracker Red (100 нМ/30 минут) и LysoTracker Green (200 нМ/30 минут), соответстсвенно.

Осуществление изобретения

Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных средств, средств доставки, консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного начала, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, растительные масла (такие, как оливковое масло) и инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Примерами наполнителей являются лактоза, молочный сахар, цитрат натрия, карбонат кальция, фосфат кальция и им подобные. Примерами измельчителей и распределяющих средств являются крахмал, алгиновая кислота и ее соли, силикаты. Примерами лубрикантов являются стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк, а также полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом. Фармацевтическая композиция для перорального, сублингвального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают пероральные формы, такие как таблетки, желатиновые капсулы, пилюли, порошки, гранулы, пероральные растворы или суспензии, сублингвальные и трансбуккальные формы введения, аэрозоли, имплантаты, местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные формы введения.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество действующего вещества, которое (1) лечит или предупреждает конкретное заболевание, состояние или расстройство, (2) ослабляет, улучшает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, или (3) предупреждает или задерживает наступление одного или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, изложенного в данном описании. Термин «терапевтически эффективное количество» означает такое количество соединения формулы (I), которое достаточно для того чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. При этом суточная доза у взрослых обычно составляет 10 ~ 500 мг, предпочтительно - 50 ~ 300 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции лекарственного средства по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единичная дозировка препарата должна содержать 1 ~ 500 мг средства общей формулы I предпочтительно - 10 ~ 300 мг. В предпочтительном варианте, терапевтически эффективное количество составляет от 0,01 до 1 мг/кг веса тела субъекта. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз). При этом, дозировка средства, содержащего соединение общей формулы (I), у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности активного ингредиента в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента.

Лекарственные средства могут вводиться перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или местно).

Кумарины представляют собой огромный класс природных и синтетических соединений многие из которых известны своими лекарственными свойствами. Однако очень мало работ посвящено изучению протонофорных свойств производных кумаринов [L. Du, F. Mahdi, M.B. Jekabsons, D.G. Nagle, Y.-D. Zhou, Mammea E/BB, an isoprenylated dihydroxycoumarin protonophore that potently uncouples mitochondrial electron transport, disrupts hypoxic signaling in tumor cells, J. Nat. Prod. 73 (11) (2010) 1868-1872.]. Хорошо известно, что определенный уровень липофильности и значение pKa, близкое к физиологическому, необходимы для того, чтобы соединение обладало протонофорной активностью, т.е. способностью переносить протоны через липидные мембраны, тем самым рассеивая протон-движущую силу, которая связывает дыхательный перенос электронов и синтез АТФ в митохондриях. На основании данных значений pK производных гидроксикумарина, отличающихся положением депротонируемой группы, для синтеза был использован умбеллиферон (7-гидроксикумарин, UB). Умбеллиферон (pKa 7,5) широко распространен в семействах Apiaceae (Umbelliferae) и Rutaceae. Известно, что он обладает различными терапевтическими свойствами, включая нейропротекцию [L.F. Cruz, G.F. de Figueiredo, L.P. Pedro, Y.M. Amorin, J.T. Andrade, T.F. Passos, F. F. Rodrigues, I.L.A. Souza, T.P.R. Goncalves, L.A.R. Lima, J.M.S. Ferreira, M.G.F. Araujo, Umbelliferone (7-hydroxycoumarin): a non-toxic antidiarrheal and antiulcerogenic coumarin, Biomed. Pharmacother. 129 (2020) 110432]. Для повышения способности UB проникать через мембраны и проявлять протонофорную активность была увеличена липофильность молекулы с помощью алкильной цепи, присоединенной к UB через сложноэфирную связь. Таким способом было получено несколько вариантов эфиров умбеллиферон-3-уксусной кислоты (эфиры UB-3) с различной длиной алкильной цепи. Сложноэфирная связь в структуре данного соединения играет важную роль, так как именно она определяет чувствительность молекулы к митохондриальной альдегиддегидрогеназе 2 (ALDH2), которая проявляет эстеразную активность [R.I. Feldman, H. Weiner, Horse liver aldehyde dehydrogenase. II. Kinetics and mechanistic implications of the dehydrogenase and esterase activity, J. Biol. Chem. 247 (1) (1972) 267-272.]. Количество ALDH2 в митохондриях определяет скорость гидролиза сложноэфирной связи, что лишает UB-3 разобщающей активности. Разобщение митохондрий стимулирует их избирательную деградацию (митофагию). Ограниченное по времени разобщение митохондрий приводит к отбору наиболее качественных органелл, способных быстро восстанавливать мембранный потенциал. Данное свойство должно способствовать повышению качества митохондрий в клетке и повышать её устойчивость к окислительному стрессу. Распределение ALDH2 в тканях неравномерно. Наибольшее его количество обнаруживается в печени, в других органах, к примеру, в сердце, почках и мозге его значительно меньше. Таким образом, разобщающая активность UB-3 должна быть минимальна в печени и максимальна в клетках сердца, почек и мозга, что делает его перспективным средством для борьбы с патологиями этих органов, связанных с дисфункцией митохондрий.

В основу настоящего изобретения была положена задача предложить способ стимуляции митофагии в клетках путём воздействия на клетки индуктором, активность которого реализуется за счет его протонофорных свойств. Данный индуктор должен обладать низкой цитотоксичностью и проявлять свою активность в тканях сердца, почек и мозга. Другая задача настоящего изобретения состояла в разработке способов стимуляции митофагии для лечения состояния, ассоциированного с митохондриальной дисфункцией, с использованием указанного индуктора.

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Серная кислота может быть заменена на толуолсульфоновую кислоту, метансульфоновую кислоту или любую другую нелетучую термически стабильную сильную кислоту; могут быть изменено время предварительного кипячения серной кислоты с толуолом в интервале 0-4 часа; толуол может быть заменен на другой подходящий растворитель, образующий азеотроп с водой, кипящий в интервале 60-100°С, например, бензол. Время проведения реакции может варьироваться в зависимости от того, какая кислота и какой растворитель используется. При проведении очистки методом колоночной хроматографии можно использовать силикагель с другой зернистостью или использовать другую смесь растворителей, например, гексан можно заменить на пентан, петролейный эфир или тетрахлорид углерода.

Заявляемые соединения могут быть синтезированы из соответствующего карбинола по общей схеме (II),

в которой на первой стадии карбинол ROH ацилируется коммерчески доступным малонил хлоридом в присутствии третичного амина или в условиях реакции Шоттена-Баумана. Полученный эфир малоновой кислоты конденсируется с коммерчески доступным 2,4-дигидроксибензальдегидом в присутствии подходящего основания.

Соединения, в которых R является линейным С8-С12 алкилом, предпочтительно децилом, предпочтительно синтезируют этерификацией известной 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты соответствующими спиртами по схеме (III):

Смесь толуола и концентрированной серной кислоты в объемном соотношении 106 к 1 кипятят в аппарате Дина-Старка в течение 1- 4 часов. Добавляют 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и деканола в мольном соотношении 1 к 4 в реакционную смесь и кипятят еще 6-24 часа. Затем толуол удаляют на роторном вакуум-испарителе, остаток растворяют в этилацетате и промывают водой (2 раза) и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 раза). Экстракт высушивают над безводным сульфатом магния, фильтруют и концентрируют на роторном вакуум-испарителе. Очистку вещества производят методом колоночной хроматографии, используя силикагель в качестве неподвижной фазы и смесь этилацетат-гексан (2:1 по объему) в качестве элюента. Фракции чистые по ТСХ объединяют и концентрируют на роторном вакуум-испарителе. Остаток перекристаллизовывают из метанола. В результате получают дециловый эфир 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты в виде белого кристаллического вещества.

Получение децилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты.

Смесь 8 мл толуола и 75 мкл концентрированной серной кислоты кипятили в аппарате Дина-Старка в течение 3 часов. Добавили 200 мг (0,97 ммоль) 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и 600 мг (3,8 ммоль) деканола и реакционную смесь кипятили еще 24 часа. Затем толуол удалили на роторном вакуум-испарителе, остаток растворили в 20 мл этилацетата и промыли водой (2 раза по 5 мл) и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 раза по 5 мл). Экстракт высушили над безводным сульфатом магния, профильтровали и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Очистку вещества провели методом колоночной хроматографии, используя Силикагель 60 (0.063-0.200 мм) в качестве неподвижной фазы и смесь этилацетат-гексан (2:1) в качестве элюента. Фракции чистые по ТСХ объединили и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Остаток перекристаллизовали из метанола. В результате получили 108 мг (32%) децилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты в виде белого кристаллического вещества.

¹Н-ЯМР (500.13 МГц, CDCl₃): δ 8.56 (с, 1H), 7.52 (д, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 7.05 (д, ⁴J_HH=2.2 Гц, 1H), 6.96-6.94 (дд, ⁴J_HH=2.2 Гц, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 4.35 (т, ³J_HH=6.8 Гц, 2H), 1.82-1.76 (м, 2H), 1.47-1.41 (м, 2H), 1.38-1.28 (м, 12H), 0.89 (т, ³J_HH=7.0 Гц, 3H); ¹³C-ЯМР (125.78 МГц, CDCl₃): δ 163.59, 163.43, 158.44, 157.36, 149.77, 131.33, 114.86, 112.95, 111.39, 103.11, 66.00 (-OCH₂-), 31.89, 29.55, 29.52, 29.31, 29.27, 28.61, 25.94, 22.68, 14.12 (-CH₃). ВЭЖХ-МС: найдено [M+H]⁺ 347.34, [M+Na+CH₃CN]⁺ 410.32, [2M+Na]⁺ 715.72; рассчитано [M+H]⁺ 347.19 (C₂₀H₂₇O₅), [M+Na+CH₃CN]⁺ 410.19 (C₂₂H₂₉NNaO₅), [2M+Na]⁺ 715.35 (C₄₀H₅₂NaO₁₀).

Получение октилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты.

Смесь 8 мл толуола и 75 мкл концентрированной серной кислоты кипятили в аппарате Дина-Старка в течение 3 часов. Добавили 200 мг (0,97 ммоль) 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и 600 мг (4,6 ммоль) октанола и реакционную смесь кипятили еще 24 часа. Затем толуол удалили на роторном вакуум-испарителе, остаток растворили в 20 мл этилацетата и промыли водой (2 раза по 5 мл) и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 раза по 5 мл). Экстракт высушили над безводным сульфатом магния, профильтровали и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Очистку вещества провели методом колоночной хроматографии, используя Силикагель 60 (0.063-0.200 мм) в качестве неподвижной фазы и смесь этилацетат-гексан (2:1) в качестве элюента. Фракции чистые по ТСХ объединили и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Остаток перекристаллизовали из метанола. В результате получили 105 мг (34%) октилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты в виде белого кристаллического вещества.

¹Н-ЯМР (500.13 МГц, CDCl₃): δ 8.56 (с, 1H), 7.52 (д, ³J_HH=8.7 Гц, 1H), 7.05 (д, ⁴J_HH=1.8 Гц, 1H), 6.97-6.95 (дд, ⁴J_HH=1.8 Гц, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 4.35 (т, ³J_HH=6.8 Гц, 2H), 1.81-1.76 (м, 2H), 1.47-1.41 (м, 2H), 1.38-1.29 (м, 8H), 0.90 (т, ³J_HH=6.6 Гц, 3H); ¹³C-ЯМР (125.78 МГц, CDCl₃): δ 163.66, 163.61, 158.59, 157.35, 149.89, 131.34, 114.98, 112.73, 111.31, 103.12, 66.02 (-OCH₂-), 31.80, 29.23, 29.18, 28.61, 25.94, 22.65, 14.10 (-CH₃). ВЭЖХ-МС: найдено [M+H]⁺ 319.39, [M+Na]⁺ 341.41, [M+Na+CH₃CN]⁺ 382.44, [2M+Na]⁺ 659.69; рассчитано [M+H]⁺ 319.15 (C₁₈H₂₃O₅), [M+Na]⁺ 341.14 (C₁₈H₂₂NaO₅), [M+Na+CH₃CN]⁺ 382.37 (C₂₀H₂₅NNaO₅), [2M+Na]⁺ 659.28 (C₃₆H₄₄NaO₁₀).

Получение додецилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты.

Смесь 8 мл толуола и 75 мкл концентрированной серной кислоты кипятили в аппарате Дина-Старка в течение 3 часов. Добавили 200 мг (0,97 ммоль) 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и 600 мг (3,2 ммоль) додеканола и реакционную смесь кипятили еще 24 часа. Затем толуол удалили на роторном вакуум-испарителе, остаток растворили в 20 мл этилацетата и промыли водой (2 раза по 5 мл) и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 раза по 5 мл). Экстракт высушили над безводным сульфатом магния, профильтровали и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Очистку вещества провели методом колоночной хроматографии, используя Силикагель 60 (0.063-0.200 мм) в качестве неподвижной фазы и смесь этилацетат-гексан (2:1) в качестве элюента. Фракции чистые по ТСХ объединили и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Остаток перекристаллизовали из метанола. В результате получили 98 мг (27%) додецилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты в виде белого кристаллического вещества.

¹Н-ЯМР (500.13 MHz, CDCl₃): δ 8.55 (с, 1H), 7.52 (д, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 7.04 (д, ⁴J_HH=2.2 Гц, 1H), 6.95-6.93 (дд, ⁴J_HH=2.2 Гц, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 4.35 (т, ³J_HH=6.8 Гц, 2H), 1.82-1.76 (м, 2H), 1.47-1.41 (м, 2H), 1.37-1.28 (м, 16H), 0.90 (т, ³J_HH=6.9 Гц, 3H); ¹³C-ЯМР (125.78 МГц, CDCl₃): δ 163.56, 163.24, 158.32, 157.35, 149.69, 131.32, 114.77, 113.10, 111.45, 103.12, 66.00 (-OCH₂-), 31.92, 29.66, 29.64, 29.60, 29.53, 29.36, 29.28, 28.62, 25.94, 22.70, 14.13 (-CH₃). ВЭЖХ-МС: найдено [M+H]⁺ 375.48, [M+Na+CH₃CN]⁺ 438.53, [2M+Na]⁺ 771.82; рассчитано [M+H]⁺ 375.22 (C₂₂H₃₁O₅), [M+Na+CH₃CN]⁺ 438.23 (C₂₄H₃₃NNaO₅), [2M+Na]⁺ 771.41 (C₄₄H₆₀NaO₁₀).

Получение гексилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты.

Смесь 8 мл толуола и 75 мкл концентрированной серной кислоты кипятили в аппарате Дина-Старка в течение 3 часов. Добавили 200 мг (0,97 ммоль) 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты и 600 мг (5,9 ммоль) гексанола и реакционную смесь кипятили еще 24 часа. Затем толуол удалили на роторном вакуум-испарителе, остаток растворили в 20 мл этилацетата и промыли водой (2 раза по 5 мл) и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (3 раза по 5 мл). Экстракт высушили над безводным сульфатом магния, профильтровали и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Очистку вещества провели методом колоночной хроматографии, используя Силикагель 60 (0.063-0.200 мм) в качестве неподвижной фазы и смесь этилацетат-гексан (2:1) в качестве элюента. Фракции чистые по ТСХ объединили и сконцентрировали на роторном вакуум-испарителе. Остаток перекристаллизовали из метанола. В результате получили 175 мг (62%) гексилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты в виде белого кристаллического вещества.

¹Н-ЯМР (400.13 МГц, CDCl₃): δ 8.54 (с, 1H), 7.49 (д, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 7.03 (д, ⁴J_HH=1.6 Гц, 1H), 6.94-6.96 (дд, ⁴J_HH=1.6 Гц, ³J_HH=8.6 Гц, 1H), 4.31 (т, ³J_HH=6.8 Гц, 2H), 1.74 (м, 2H), 1.40 (м, 2H), 1.3 (м, 4H), 0.87 (т, 3H); ¹³C-ЯМР (100.60 МГц, CDCl₃): δ 163.67, 163.62, 158.64, 157.31, 149.95, 131.30, 115.00, 112.60, 111.30, 103.18, 66.01 (-OCH₂-), 31.39, 28.52, 25.55, 22.48, 13.96 (-CH₃). ВЭЖХ-МС: найдено [M+H]⁺ 291.37, [M+Na]⁺ 313.40, [M+Na+CH₃CN]⁺ 354.42, [2M+Na]⁺ 603.60; рассчитано [M+H]⁺ 291.12 (C₁₆H₁₉O₅), [M+Na]⁺ 313.11 (C₁₆H₁₈NaO₅), [M+Na+CH₃CN]⁺ 354.13 (C₁₈H₂₁NNaO₅), [2M+Na]⁺ 603.22 (C₃₂H₃₆NaO₁₀).

Оценка влияния октилового эфира 7-гидроксикумарин-3-карбоновой кислоты (UB-3-COOC₈) и октилового эфира 7-гидроксикумарин-4-уксусной кислоты (UB-4-COOC₈) на дыхание митохондрий выделенных из сердца крысы.

Дыхание изолированных митохондрий измеряли с помощью стандартного полярографического метода с кислородным электродом типа Кларка (Strathkelvin Instruments, Великобритания) при 25°C с использованием программного обеспечения системы 782. Инкубационная среда содержала 250 мМ сахарозы, 5 мМ MOPS, 1 мМ KH2PO4, 1 мМ EGTA, pH 7,4. Дыхание измеряли в присутствии олигомицина (1 мкг/мл) и бычьего сывороточного альбумина (БСА, 1,25 мг/мл). Концентрация митохондриального белка составляла 0,5 мг/мл. Поглощение кислорода выражалось в нмоль/мин-мг белка.

Оценка цитотоксического действия UB3-С_n

Клетки линий эмбриональной почки человека (HEK293) и первичных фибробластов человека высевали в 96-луночный планшет по 5000 клеток на лунку, культивировали в 100 мкл среды DMEM с 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) при 37°С и инкубировали в течение 24 ч. Производные кумарина UB3 с линкером COOC длинной 6, 8, 10, 12 звеньев добавляли в лунки в концентрациях 200, 66.7, 22.2, 4.4, 2.5, 0.8 мкМ после чего клетки инкубировали 24 часа. Выживаемость клеток измеряли методом флуорометрического анализа с помощью прибора Fluoroskan Ascent FL Microplate Reader (Thermo Labsystems, Waltham, MA, США) с использованием реагента CellTiterBlue® (Promega, США) в соответствии с протоколом производителя. Для каждого типа клеток проводилось не менее трех повторов для каждого измерения.

Оценка влияния UB-3-COOC₈ на мембранный потенциал митохондрий полученных из тканей сердца и печени. Влияние ингибитора альдегиддегидрогеназы II на протонофорную активность UB-3-COOC_8.

Митохондриальный мембранный потенциал (Δψ) оценивали с помощью красителя сафранина О. Разницу в поглощении при 555 и 523 нм (ΔA) регистрировали на спектрофотометре Aminco DW-2000 (Aminco, США) в режиме двойной длины волны. Использовалась следующая инкубационная среда: 250 мМ сахарозы, 5 мМ MOPS, 2 мМ KH2PO4, 1 мМ EGTA, 2 мкМ ротенона, 5 мМ сукцината (pH 7,4), 1 мкг/мл олигомицина, 15 мкМ сафранина O. Для ингибирования альдегиддегидрогеназы II использовали дисульфирам в концентрации 20 мкМ.

Оценка влияния UB-3-COOC₁₀ на мембранный потенциал митохондрий кардиомиоцитов H9C2 и легочных фибробластов MRC5SV40.

Клетки линий кардиомиоцитов H9C2 и MRC5SV40 высевали в 12-луночный планшет по 20 000 клеток на лунку, культивировали в 1 мл среды DMEM с 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) при 37°С и инкубировали в течение 24 ч. Клеточные культуры инкубировались с 2, 10, 50 мкМ UB3-C₁₀ в течении 1 и 5 часов. Митохондриальный потенциал оценивали с помощью рациометрического красителя JC1 на проточном цитометре с возможностью визуализации Amnis Flowsight (Luminex, США).

Оценка способности UB-3-COOC₁₀ стимулировать митофагию в клетках MRC5SV40.

Клетки линии MRC5SV40 высевали в чашки Петри со стеклянным дном (Nest, Китай) по 50 000 клеток на чашку, культивировали в 2 мл среды DMEM с 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) при 37°С и инкубировали в течение 24 ч. Клетки MRC5SV40 инкубировались с UB3-C₁₀ (25 мкМ) в течении 24 часов, после чего митохондрии и лизосомы визуализировались с помощью красителей MitoTracker Red (100 нМ/30 минут) и LysoTracker Green (200 нМ/30 минут), соответственно. Для получения изображений использовали микроскоп Axiovert 200 (фирма Carl Zeiss).

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к применению производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I), обладающего протонофорной активностью. R в формуле (I) представляет собой линейный алкил, содержащий 6-15 атомов углерода. Технический результат – стимуляция избирательной деградации митохондрий в клетках (митофагии) посредством производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I). 3 н.п. ф-лы, 5 ил.

1. Применение производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I), обладающего протонофорной активностью,

,

где R представляет собой линейный алкил, содержащий 6-15 атомов углерода,

для стимуляции избирательной деградации митохондрий в клетках (митофагии).

2. Применение производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) по п. 1 для стимуляции избирательной деградации митохондрий в клетках (митофагии), включающее обработку клеточных культур посредством введения эффективного количества производного 7-гидроксикумарина формулы I.

3. Применение производного 7-гидроксикумарина общей формулы (I) по п. 1 для изготовления фармацевтической композиция для стимуляции избирательной деградации митохондрий в клетках, включающей эффективное количество соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемые добавки.