Производные ванилина с противоопухолевой активностью Российский патент 2017 года по МПК C07D491/56 A61K31/436 A61P35/00 

Изобретение относится к синтетическим биологически активным веществам гетероциклического ряда, обладающим высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и низкой токсичностью (высокой безопасностью) и представляющим собой производные ванилина общей формулы I:

,

где R=H, CH₃.

Соединения формулы I обладают высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и высокой безопасностью и могут найти применение в медицине в области лечения социально-значимых заболеваний, а именно онкологических заболеваний молочной железы.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2012 году зафиксировано 8.2 миллиона случаев смерти, связанных с раком, а в частности от рака молочной железы - 521 тыс. случаев смерти. По данным независимого провайдера статистических данных http://www.worldometers.info/ в 2016 году, на дату предоставления заявочных материалов от рака уже умерло 6.5 миллиона человек.

Основываясь на изложенном, задача по повышению эффективности химической терапии опухолей является одной из самых важных практических задач современной клинической онкологии. Высокая токсичность применяемых в медицинской практике противоопухолевых препаратов обусловливает необходимость введения корректировок в схемы химиотерапии, а именно регуляции вводимых доз препаратов и увеличения интервалов между курсами терапии. Как следствие, формируется фенотип адаптивной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), и опухолевые клетки вырабатывают резистентность к лекарственным препаратам, зачастую отличным по структуре от использованных при клинической терапии, поэтому проблема повышения эффективности действия противоопухолевых препаратов в отношении резистентных к химиотерапии опухолевых клеток не является разрешенной на дату представления заявочных материалов.

Для лечения рака молочной железы применяется широкий ряд лекарственных средств, таких как алкилирующие средства, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, природные вещества, противоопухолевые антибиотики, гормоны, антагонисты гормонов и родственные средства, иммуностимуляторы и другие противоопухолевые препараты.

Представленные выше лекарственные средства характеризуются в целом недостаточно высокой эффективностью и высокой токсичностью.

Заявителем проведен анализ российских и зарубежных патентных баз данных, научной литературы, интернет-ресурсов и не выявлены аналоги к заявленному техническому решению по химической структуре и составу, но при этом выявлены соединения, которые являются аналогами заявленного технического решения по назначению, которые обладают указанными выше недостатками, а именно недостаточно высокой эффективностью и высокой токсичностью.

Задачей заявленного технического решения является создание принципиально новых соединений, обладающих высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и низкой токсичностью, которые расширяют арсенал известных средств указанного назначения и обеспечивают возможность вывода на рынок новых противоопухолевых средств, не имеющих аналогов в мире.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание соединений, проявляющих сопоставимую с известными в мире цитостатиками противоопухолевую активность по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и характеризующихся значительно большей безопасностью по отношению к нормальным клеткам человека.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что получают производные ванилина общей формулы I, обладающие высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и низкой токсичностью:

,

где R=H, CH₃.

Заявленные соединения общей формулы I относятся к производным ванилина, обладающим высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7), и их применение, ввиду высокой противоопухолевой активности и низкой токсичности, может значительно улучшить качество терапии опухолевых заболеваний.

Поставленная цель решается путем получения веществ общей формулы I:

,

где R=H, CH₃.

Заявленные соединения формулы I получают взаимодействием 5,6-бис(метилентрифенилфосфоний)-2,2,8-триметил-4H-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридин дихлорида 1 с 4-гидрокси-3-метоксибензальдегидом (ванилин, R=H) или 3,4-диметоксибензальдегидом (производное ванилина, R=CH₃) 2 в присутствии основания - гидрида натрия, в хлористом метилене при температуре 80°C согласно нижеприведенной схеме:

Характеристики новых соединений приведены в примерах конкретного выполнения. Структуры полученных соединений подтверждены методами масс-спектрометрии, 1D и 2D ЯМР спектроскопии (¹H, ¹³C, COSY, HSQC, NOESY).

Спектры ЯМР ¹H зарегистрированы на приборе «Bruker» AVANCE 400 (400 МГц). Химический сдвиг определяют относительно сигналов остаточных протонов дейтерированного растворителя.

HRMS-эксперимент проведен с использованием масс-спектрометра TripleTOF 5600, AB Sciex (Германия) из раствора в метаноле методом ионизации - турбоионный спрей (TIS) - при энергии столкновения с молекулами азота 10 eB.

Температуру плавления веществ определяют на приборе OptiMelt MPA100 (Stanford Research Systems).

Контроль за ходом реакций проводят методом ТСХ на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А-УФ. Препаративную хроматографию соединений проводят на силикагеле КСКГ фр. 0.10-0.16 (Экофарм).

Примеры конкретного выполнения заявленного технического решения

Пример 1. Получение (E)-6-(4-гидрокси-3-метоксистерил)-2,2,5,8-тетраметил-4H-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридина (I-1).

К раствору 1.2 г (1.50 ммоля) четвертичной фосфониевой соли 1 [Фосфониевые соли на основе производных пиридоксина / Н.В. Штырлин, М.В.Пугачев, Ю.Г.Штырлин / Патент РФ, №2466728, опубл. 20.11.2012] в 30 мл хлористого метилена последовательно прибавляют 0.22 г (9.00 ммоля) гидрида натрия и 0.46 г (3.00 ммоля) 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида, после чего реакционную смесь перемешивают в течение 30 часов при 80°C. Затем растворитель удаляют в вакууме, сухой остаток растворяют в 30 мл этилацетата, осадок отфильтровывают. Далее фильтрат концентрируют и очищают с помощью колоночной хроматографии (элюент - этилацетат-петролейный эфир, 1:15). Получают заявленное соединение I-1. Выход 0.06 г (11%), желтое кристаллическое вещество, т.пл. 99-101°C. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ, м.д.: 1.54 с (6H, C(CH₃)₂), 2.17 с (3H, CH₃), 2.42 с (3H, CH₃), 3.91 с (3H, CH₃O), 4.76 с (2H, CH₂O), 6.89, 7.10 (AB-часть от ABX-системы, ³J_HH=8.0 Гц, ⁴J_HH=1.6 Гц, C₆H₃), 7.04 (X-часть от ABX-системы, ⁴J_HH=1.6 Гц, C₆H₃), 7.13, 7.52 (AB-система, ³J_HH=15.6 Гц, -CH=CH-). Спектр ЯМР ¹³C {H} (100 МГц, CDCl₃) 8, м.д.: 12.72 (CH₃), 18.69 (CH₃), 24.78 (C(CH₃)₂), 56.03 (CH₃O), 59.81 (CH₂O), 99.34 (C(CH₃)₂), 109.44 (CH_Ar), 114.74 (CH_Ar), 120.46 (CH_Ar), 122.02 (-CH=CH-), 123.46 (C_Ar), 125.36 (C_Ar), 130.41 (C_Ar), 131.72 (-CH=CH-), 144.30 (C_Ar), 144.87 (C_Ar), 145.08 (C_Ar), 145.81 (C_Ar), 146.77 (C_Ar). Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [M+H]⁺ 342.1700. C₂₀H₂₄NO₄. Вычислено [M+H] 342.1700.

Пример 2. Получение (E)-6-(3,4-диметоксистирил)-2,2,5,8-тетраметил-4H-[1,3]диоксино[4,5-с]пиридина (I-2).

Синтезируют и разрабатывают аналогично соединению (I-1) из 1.2 г (1.50 ммоль) четвертичной фосфониевой соли 1 [Фосфониевые соли на основе производных пиридоксина / Н.В. Штырлин, М.В.Пугачев, Ю.Г. Штырлин / Патент РФ, №2466728, опубл. 20.11.2012], 0.22 г (9.20 ммоля) гидрида натрия и 0.50 г (3.00 ммоля) 3,4-диметоксибензальдегида в 30 мл хлористого метилена. Элюент для колоночной хроматографии - этилацетат-петролейный эфир, 1:5. Получают заявленное соединение I-2. Выход 0.11 г (21%), желтое кристаллическое вещество, т.пл. 116-118°C. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, CDCl₃) δ, м.д.: 1.55 с (6H, C(CH₃)₂), 2.19 с (3H, CH₃), 2.44 с (3H, CH₃), 3.90 с (3H, CH₃O), 3.94 с (3H, CH₃O), 4.78 с (2H, CH₂O), 6.86, 7.14 (AB-часть от ABX-системы, ³J_HH=8.0 Гц, ⁴J_HH=1.7 Гц, C₆H₃), 7.10 (X-часть от ABX-системы, ⁴J_HH=1.7 Гц, C₆H₃), 7.17, 7.57 (AB-система, ³J_HH=15.6 Гц, -CH=CH-). Спектр ЯМР ¹³C {H} (100 МГц, CDCl₃) δ, м.д.: 12.68 (CH₃), 18.68 (CH₃), 24.72 (C(CH₃)₂), 55.94 (CH₃O), 55.96 (CH₃O), 59.75 (CH₂O), 99.30 (C(CH₃)₂), 109.59 (CH_Ar), 111.20 (CH_Ar), 120.08 (CH_Ar), 122.26 (-CH=CH-), 123.50 (C_Ar), 125.33 (C_Ar), 130.85 (C_Ar), 131.49 (-CH=CH-), 144.15 (C_Ar), 144.86 (C_Ar), 145.04 (C_Ar), 148.99 (C_Ar). Масс-спектр (HRMS-ESI): Найдено [M+H]⁺ 356.1856. C₂₁H₂₆NO₄. Вычислено [M+H] 356.1856.

Пример 3. Исследование противоопухолевой активности и безопасности in vitro производных ванилина

Исследование противоопухолевой активности проводили на опухолевых клетках человека (NCI-60):

- рака молочной железы MCF-7 (ATCC® HTB-22™);

- аденокарциномы простаты PC-3 (GSM136316);

- карциномы почки A-498 (GSM136294);

- глиобластомы SNB-19 (GSM136283);

- меланомы M-14 (GSM136320);

- аденокарциномы яичников OVCAR-4 (GSM136312);

- немелкоклеточной карциномы легкого NCI-H322M (GSM136307);

- колоректальной аденокарциномы HCT-15 (GSM136289);

- колоректальной карциномы HCT-116 (GSM136288).

Исследование безопасности проводили на условно-нормальных клетках фибробластов кожи человека (HSF).

Стоковый раствор (заранее приготовленный раствор, из которого отбирают необходимое количество вещества для проведения эксперимента) 1 получают добавлением 6.8 мг (0.02 ммоля) соединения I-1 и 2.1 мкл 30%-го раствора соляной кислоты (HCl) к 197.9 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).

Стоковый раствор 2 получают добавлением 7.1 мг (0.02 ммоля) соединения 1-2 и 2.1 мкл 30%-го раствора HCl к 197.9 мкл ДМСО.

Линии клеток культивируют в среде α-MEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (PAA, Австралия), L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5% CO₂ при 37°C до образования монослоя. Для получения клеточной суспензии монослой клеток трипсинизируют с последующей инактивацией трипсина добавлением среды α-MEM с сывороткой. Далее клетки осаждают центрифугированием при 500 g в течение 5 минут. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере пипетированием.

Оценку жизнеспособности клеток и подсчет их концентрации производят после окраски аликвоты клеток 0.4% раствором трипанового синего в соотношении 1:1 в камере гемоцитометра Нейбауэра. В эксперименте используют суспензии с количеством жизнеспособных клеток не менее 90%.

Чувствительность исследуемых клеток в отношении синтезированных соединений оценивают с использованием пролиферативного MTT-теста (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) (Promega, США) по описанной ниже методике. В качестве препарата сравнения используют доксорубицин.

Клетки (2 тыс. клеток в лунке) культивируют в 180 мкл питательной среды в стандартных условиях в 96-луночном планшете в течение суток. Далее добавляют 20 мкл стокового раствора и инкубируют в стандартных условиях в течение 72 часов. Далее среду с препаратами заменяют на питательную среду (80 мкл) и добавляют по 20 мкл MTT-реагента (5 мг/мл), инкубируют в течение 3.5 часов, затем убирают среду и добавляют 100 мкл ДМСО. По истечении 10 минут измеряют оптическую плотность клеточных растворов при 555 нм (референтная длина волны - 650 нм) на планшетном ридере TECAN (Швейцария).

Результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения OriginPro 8. Рассчитывают процент жизнеспособных клеток в каждой опытной лунке относительно лунок контроля, не подвергавшемуся действию препаратов, жизнеспособность которых принимают за 100%. Далее строят графики зависимости жизнеспособности клеток, выражаемые в процентах, относительно десятичного логарифма концентраций добавленных соединений. Полученную кривую подвергают анализу "Fit Sigmoidal - DoseResp" в программном обеспечении OriginPro 8, находят логарифм концентрации в точке 50% жизнеспособности клеток. По обратному логарифму находят концентрации полумаксимального ингибирования роста IC₅₀ (Р<0.05), указанные в таблице.

Как видно из представленных в таблице данных, протестированные соединения I-1 и I-2 обладают ярко выраженной селективностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и сопоставимой противоопухолевой активностью с доксорубицином, но при этом являются значительно более безопасными по отношению к нормальным клеткам человека (HSF). Так, терапевтический индекс in vitro, представляющий собой отношение величины IC50 на условно-нормальных клетках (HSF) к величине IC50 на опухолевых клетках (MCF-7), соединения I-1 по сравнению с доксорубицином, в 4 раза больше, а терапевтический индекс in vitro соединения I-2 по сравнению с доксорубицином - в 80 раз больше. Таким образом, заявленное техническое решение на основе производных ванилина, содержащих пиридоксиновый фрагмент, являются новыми высокоактивными и безопасными противоопухолевыми средствами для лечения рака молочной железы.

Техническим результатом заявленного технического решения являются заявленные соединения - производные ванилина, проявляющие сопоставимую с доксорубицином противоопухолевую активность по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7), но при этом обладающие высокой безопасностью - терапевтический индекс in vitro соединений I-1 и I-2 по сравнению с применяемым в химиотерапии опухолевых заболеваний доксорубицином в 4 и 80 раз больше соответственно.

Таким образом, заявленное техническое решение позволяет создать новые высокоэффективные и безопасные лекарственные средства для лечения рака молочной железы, тем самым улучшив качество жизни пациентов. Заявленные препараты обладают высоким экспортным потенциалом.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью отличительных признаков, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалиста в данной области науки и техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. может быть реализовано на любом специализированном предприятии с использованием стандартного оборудования, известных отечественных материалов и технологий.

Изобретение относится к новым противоопухолевым средствам на основе производных ванилина общей формулы I, где R=H, CH₃, обладающим высокой противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и низкой токсичностью. 1табл., 3 пр.

Производные ванилина общей формулы I:

,

где R=H, СН₃, обладающие противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака молочной железы (MCF-7) и высокой безопасностью.