СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА НАНОЧАСТИЦ, СОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЯ ЖЕЛЕЗА (III), С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНОГО БЕЛКА DPS Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 B82B3/00 C01G49/00 C12N15/09 C12P21/00 C07K14/195 

Изобретение относится к области нанотехнологий, к способам получения наночастиц металлов и может применяться в медицине, химической промышленности, микро- и наноэлектронике, приборостроении, а именно к способу получения раствора наночастиц соединений железа (III) с использованием бактериального белка Dps и водных растворов солей металлов с переходной валентность (II) - (III). Изобретение может быть востребовано в широком ряду современных научных и прикладных областей для улучшения таких параметров, как быстродействие, миниатюризация и энергопотребление для структур и приборов на их основе за счет тонкого управления составом и структурой, приводящего к подстройке функциональных свойств.

Существуют различные методы синтеза наночастиц: по способу их получения и стабилизации (физический, химический, механический) и по типу формирования наноструктур (метод «сверху-вниз», основанный на сборке наночастиц из отдельных атомов, и метод «снизу-вверх», заключающийся в дроблении частиц до наноразмеров). Из уровня техники известен способ получения полупроводниковых квантовых точек на основе халькогенидов металлов II или IV группы, включающий синтез нанокристаллов из прекурсора, содержащего халькоген, и прекурсора, содержащего металл II или IV группы, в присутствии растворителя, с возможностью дополнительного облучения УФ-светом с различной длинной волны и мощностью излучения, и возможностью использования воздействия ультразвука с различной мощностью и частотой, отличающийся тем, что синтез наночастиц осуществляют при комнатной температуре, в качестве растворителя используют ионную жидкость или смесь ионных жидкостей в сочетании с низкокипящим органическим растворителем или несколькими органическими растворителями (Патент RU 2607405, заявка 2015107852, приоритет от 06.03.2015, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тверской государственный университет»).

Недостатком способа является высокая трудоемкость и необходимость строгого соблюдения внешних параметров, а также необходимость использования большого числа высокоочищенных химических реактивов.

Описан способ синтеза наночастиц типа ядро-оболочка, включающий следующие стадии: синтез полимерной затравки в растворителе путем «живой» анионной дисперсионной полимеризации, при этом затравка включает моновиниловый мономер, поперечно-сшитый при помощи сшивающего агента для формирования ядра наночастицы, при этом ядро имеет средний диаметр от 5 нанометров до 10000 нанометров и содержит полимерные цепи с «живыми» концевыми группами; добавление стабилизатора для стабилизации затравки и предотвращения осаждения затравки из раствора; и прививка и/или полимеризация частиц оболочки на «живые» концы ядра для формирования оболочки наночастицы; при этом затравка образована полимеризацией моновинилового мономера с использованием инициатора и поперечного сшивания полученного полимера со сшивающим мультивиниловым мономер агентом (Патент RU 2560722, заявка 2011126888/04, приоритет от 20.08.2015, патентообладатель БРИДЖСТОУН КОРПОРЕЙШН).

Одним из существенных недостатков является высокая технологичность процесса, при этом конечный продукт имеет крайне широкие размерные приделы, а именно, в ходе реализации такого способа формируются наночастицы размером от 5 нм до 10000 нм, что значительно сужает сектор их использования.

Известен способ, предложенный в (Kamitake et. al., Nanotechnology, 2015, V. 26 (19)), синтеза наночастиц кобальта. Способ заключается в получении генетически модифицированных рекомбинантных белков на основе ферритина селезенки лошади и бактериального ферритинпдобного белка Dps, содержащих на N-конце полипептидной цепи пептид для взаимодействия с оксидом кремния, а полость белка использовалась как резервуар для накопления наночастиц оксида кобальта. Для синтеза наночастиц готовили раствор апо-белка (белка, не содержащего неорганической части) с концентрацией 0.5 мг/мл (1 мМ) и доводили его рН до 7.3-8.8 с помощью 100 мМ буферного агента. Также добавляли 37.5 мМ раствор Na₂SO₄. Раствор перемешивали магнитной мешалкой и добавляли раствор аммонийного сульфата кобальта для создания конечной концентрации от 2 до 5 мМ, после чего добавляли раствор перекиси водорода в концентрации ½ от концентрации раствора аммонийного сульфата кобальта. Раствор перемешивали около 20 мин и затем оставляли на ночь при 50°С. Раствор после синтеза наночастиц оксида кобальта центрифугировали на низкой скорости для удаления осадка. Концентрацию белка в супернатанте измеряли методом анализа белка Брэдфорда. Средние диаметры наночастиц сформированных в полости ферритина селезенки лошади и бактериального ферритинподобного белка Dps составляли 6,0 нм и 3,2 нм, соответственно, а их соответствующие максимальные диаметры составляли примерно 7 и 4,5 нм.

Недостатком способа является зависимость формирования кобальтовых ядер от структуры белка, а размеры наночастиц не достигают величины, равной величине белковой полости, которые для ферритина селезенки лошади составляет 10 нм, а бактериального ферритинподбного белка Dps - 6 нм. Таким образом, в указанном способе не рассматривается оптимизация процесса синтеза наночастиц.

Наиболее близким является способ, предложенный в (Покусаева и др. 2012. Сорбционные и хроматографические процессы). Способ заключается в следующем. Для получения рекомбинантного белка Dps использовали клетки Е. coli BL21* (DE3), трансформированные плазмидой pGEM-dps. Клетки выращивали на стерильной твердой среде Лауриа-Бертони (LB), содержащей в водном растворе перед автоклавированием 1 объемн. % триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты, 0.5 об.% хлорида натрия, 1.5 об.% агара и 0.1 об.% ампициллина (рН 7,4) и жидкой питательной среде Лауриа-Бертони (LB), содержащую в водном растворе 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты, 0.5 об.% хлорида натрия и 0.1 об.% ампициллина (рН 7,4) при температуре 37°С. Индукцию белка проводили при величине оптической плотности при длине волны 600 нм, равной 0.4, путем добавления в клеточную культуру изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 0.02 мМ, после чего клетки растили 12 часов при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 10 000g, отмывали два раза от среды холодным 0,01 М трис-HCl буфером, рН 8,0 и хранили при -4°С. Уровень индукции рекомбинантного белка Dps оценивали с помощью электрофореза в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) по модифицированному методу Дэвиса. Для выделения и очистки замороженную биомассу белка размораживали на ледяной бане, добавляя 3 мл охлажденного буфера для лизиса, содержащего 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0); 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА); 0,1М NaCl. Клеточную массу разрушали, добавляя лизоцим (4х10^-3 мг/мл), фенилметан сульфонил фторид (PMSF) (4 мкМ) с дальнейшей инкубацией на ледяной бане в течение 20 мин. Далее суспензию клеток подвергали воздействию ультразвука с частотой 22 кГц в течение 1 минуты. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 13000g в течение 10 мин. Полученный лизат наносили на ионообменную колонку ДЕАЕ-Сефадекс-А25, предварительно уравновешенную элюирующим буфером, содержащим 50 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl (рН 8,0); 10^-4М ЭДТА; 10^-4М дитиотреитола (ДТТ) и разделяли хроматографически. Для очистки белка использовали градиент концентраций NaCl (от 50 до 700 мМ). Скорость элюции составляла 20 мл/ч. Фракции собирали объемом 2.0 мл, присутствие белка в них определяли с помощью электрофореза в 12,5% денатурирующем ПААГ. Перед гель-фильтрацией фракции, содержащие целевой белок и минимальное количество примесей, объединяли и подвергали высаливанию сульфатом аммония в течение 30 мин при 0°С. Преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 13000g и растворяли в буфере, содержащем 500 мM NaCl, 50мM Tris-HCl (pH 8,0); 10^-4М ЭДТА. Полученный раствор белка подвергали гель фильтрации на Сефадексе-G200. Элюцию белковой фракции осуществляли буфером, содержащим 500 мM NaCl, 50MM Tris-HCl (pH 8,0); 10^-4М ЭДТА, со скоростью 20мл/ч. Затем полученный препарат белка диализовали против буфера, содержащего 50мM NaCl, 50мM Tris-HCl (pH 8,0); 10^-4М ЭДТА. Концентрацию очищенного белка определяли спектрально при длине волны 280 нм.

Недостатками данного способа являются следующие. В питательную среду, в которой культивировали бактериальные клетки, не добавляли ионы двухвалентного железа, которые являются естественным субстратом белка Dps, которые он окисляет до трехвалентного и в таком состоянии накапливает в своей внутренней полости в виде различных соединений. Помимо этого, в прототипе отсутствует стадия контроля как качественных, так и количественных характеристик наночастиц, сформированных во внутренней полости белка. При этом средний диаметр наночастиц, получаемых при использовании белка Dps, достаточно мал и составляет 2.5 нм.

Наиболее близким является способ, предложенный в (ANTIPOV S. et al., The oligomeric form of the Escherichia coli Dps protein depends on the availability of iron ions, Molecules 2017, 22, 1904; doi:10.3390/molecules22111904). Работа посвящена исследованию зависимости олигомеризации бактериального белка Dps в зависимости от присутствия ионов железа в бесклеточной системе. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофоретического фракционирования в нативных условиях было установлено, что именно ионы железа стабилизируют додекамерную (нативную) форму белка Dps; методом просвечивающей электронной микроскопии был установлен размер неорганических наночастиц внутри полости белка Dps, а C использованием метода Мёссбауэровской спектроскопии был установлен их состав; в модельных экспериментах с использованием метода последовательного молекулярного докинга были выявлены сайты нуклеации для ионов железа. В статье указано, что в исследованиях была использована апо-форма белка Dps (очищенная от ионов железа), которая использовалась для насыщения раствором соли Мора. В этом же разделе подробно описана процедура получения апо-формы, в частности для получения апо-формы очищенный Dps сначала диализовали против буфера, содержащего 10 мМ Трис-НСl (рН 8,0), 50 MM NaCl и 5% глицерина. Затем ионы железа из белковой глобулы удаляли диализом в градиенте рН 8,0 → 7,0 → 6,0 → 5,0 → 3,8 и восстанавливали структуру додекамера дальнейшим диализом: 3,8 → 5,0 → 6,0 → 7,0 → 8,0. Каждый этап занимал 1-2 часа. Одним из недостатков прототипа является использование апо-формы белка Dps (очищенная от ионов железа) для насыщения раствором соли Мора, следовательно количество формируемых наночастиц будет ограничено концентрацией белка используемом растворе. Другим недостатком прототипа является отсутствие систем генерации активных форм кислорода, в частности перекиси водорода, необходимой для эффективного окисления двухвалентного железа до трехвалентного в фероксидазном центре белка Dps. В целом кислород тоже может быть использован для этих целей, но эффективность этого процесса будет ниже 3-4 раза.

Задачей настоящего изобретения является создание универсального способа синтеза унифицированных по размеру наночастиц, содержащих трехвалентное железо, которые могут быть востребованы в области улучшения быстродействия, миниатюризации и снижения энергопотребления структур и приборов на их основе за счет тонкого управления составом и структурой наночастиц.

Технический результат состоит в увеличении среднего диаметра синтезируемых наночастиц до 3.3 нм при использовании нативного, рекомбинантного ферритинподобного бактериального белка Dps бактериальных клеток Escherichia coli BL21* (DE3), трансформированных плазмидой pGEM-dps, несущей полноразмерную копию гена dps, при количественном выходе унифицированных по размеру наночастиц, составляющем 434 наночастицы при использовании 10⁶ клеток, содержащих соединения железа (III), за счет присутствия дополнительного и не токсичного источника целевого субстрата водорастворимой соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O для белка Dps с исключением гибели бактериальных клеток, культивируемых в присутствии ионов двухвалентного железа.

Технический результат достигается тем, что в способе получения раствора наночастиц, содержащих соединения железа (III), с использованием бактериального белка Dps, включающем посев одной колонии клеток Escherichia coli BL21* (DE3), выращенных на твердой питательной среде Лауриа-Бертони (LB), содержащей в водном растворе перед автоклавированием 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты и 0.5 об.% хлорида натрия, 1.5 об.% агара и 0.1 об.% ампициллина в течение 12 часов при 37°С, содержащей плазмиду pGEM-dps, несущую полноразмерную копию гена dps, путем переноса одной колонии в 500 мкл жидкой питательной среды Лауриа-Бертони (LB), содержащей 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта и 0.5 об.% хлорида натрия и 0.1 об.% ампициллина в водном растворе, с последующем культивированием в течение 3 часов при 37°С и постоянном перемешивании, до достижения суспензией клеток 0.3-0.4 оптических единицы при длине волны 600 нм, переносом сформированной суспензии клеток в свежеприготовленную жидкую питательную среду LB, содержащую 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта и 0.5 об.% хлорида натрия и 0.1 об.% ампициллина в водном растворе, при объемном соотношении суспензия клеток : раствор питательной среды, равном 1:1000, соответственно, культивированием при 37°С с регистрацией кривой роста путем измерения оптической плотности при длине волны 600 нм каждые 60 минут до достижения стационарной фазы, то есть достижения значения оптической плотности 1.0, добавление водного раствора соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂⋅6H₂O, выделение и очистку рекомбинантного белка Dps, несущего наночастицы железа из клеток Escherichia coli BL21* (DE3), согласно изобретению, перед посевом клеток в жидкую питательную среду добавляют водный 1М раствор соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂•6H₂O, при объемном соотношении суспензия клеток: раствор соли Мора, равном 10:7, соответственно.

При этом внесение 1М раствора соли Мора может быть осуществлено, поэтапно, каждый час с момента достижения значения 0.2 единицы оптической плотности суспензии бактериальных клеток при культивировании при 37°С с регистрацией кривой роста при длине волны 600 нм, из расчета, что объемное соотношение одной порции раствора соли Мора и суспензии клеток равно 7:50, соответственно, при этом внесение повторяют 5 раз, до достижения концентрации ионов железа 0.5 мМ, после чего проводят культивирование при 37°С с регистрацией кривой роста до достижения 1.0 оптической плотности бактериальных клеток при длине волны 600 нм.

Также внесение 1М раствора соли Мора может быть осуществлено единовременно B объемном соотношении суспензия клеток: раствор соли Мора, равном 10:7, соответственно при культивировании при 37°С с регистрацией кривой роста с достижением оптической плотности растущей бактериальной культурой значения 0.6 оптических единиц при длине волны 600 нм так, чтобы концентрация ионов железа составила 0.5 мМ, после чего бактерии продолжают растить в тех же условиях до достижения значения оптической плотности 1.0 при длине волны 600 нм.

Поставленная задача и технический результат достигаются за счет использования нативного, рекомбинантного ферритинподобного бактериального белка Dps, насыщаемого в процессе биосинтеза в клетках ионами железа (II) из растворов водорастворимых солей. Качество технического результата достигается за счет оптимизации условий насыщения раствора белка солями-донорами ионов двухвалентного железа с учетом возможных вариантов транслокации ионов металлов через белковую пору к ферроксидазному центру белка. Белок Dps содержит в своей глобуле 2 типа каналов для транслокации железа. Длина каналов типа I составляет около 2 нм, а сами они содержат в большинстве случаев отрицательно заряженные остатки аспартатов и глутаматов, которые участвуют в процессе транслокации гексааквакомплексов [Fe(H₂O)₆²⁺] железа (Grant et. al., Nature structural biology, 1998, V. 5(4); Zeth, The Biochemical Journal, 2012, V.445(3)). Такая модель транслокации характерна для большей части белков семейства Dps, выделенных из различных групп бактерий, хотя на данный момент не понятно, как изменяется конфигурация и расположение гексааквакомплексов по мере их продвижения по каналу. Каналы типа II экспериментально обнаружены на данный момент только у Dps из H.salinarum. Данные типы каналов, аналогично каналам типа I, образованы на стыке трёх субъединиц, однако, они выстланы преимущественно остатками аргинина, из-за чего имеют меньшее сродство к ионам железа, что обусловлено их меньшим зарядом. Тем не менее, за счет увеличенного числа каналов второго типа в молекуле белка, а также за счет высокой разности потенциалов между внутренней и внешней поверхностью белка, эффективность их работы может быть сопоставима, а иногда и даже превышать эффективность работы каналов I типа. Кроме того, каналы типа II обладают меньшим сродством к ионам металлов и меньшим расстоянием от входа до ферроксидазного центра (0,8 против 2 нм, соответственно). После прохождения центров транслокации и высвобождения ионов металлов из состава гексааквакомплексов, они попадают в так называемые ферроксидазные центры (ФОЦ), расположенные между спиралями мономеров, в которых происходит окисление ионов железа Fe²⁺ с использованием перекиси водорода до Fе³*, после чего продукты окисления транспортируются внутрь полости белка. Строго говоря, для окисления могут быть использованы и другие вещества, например, кислород или гипохлорная кислота, но скорость этих реакций на порядок ниже. Структура ФОЦ белков Dps и других ферритинов, в целом, похожа.

В настоящем изобретении к бактериальным клеткам Escherichia coli BL21* (DE3) трансформированным плазмидой, несущей полноразмерную копию гена dps, как описано в (Покусаева и др., Сорбционные и хроматографические процессы, 2012, Т.12, No6), добавляли раствор водорастворимой соли металла с переходной валентностью в степени окисления (II), так что бы концентрация ионов металла достигала 0.5мМ. Такой подход позволяет увеличить содержание целевого субстрата для белка Dps, при этом не вызывая гибели бактериальных клеток (Фиг. 1). Выделение и очистку рекомбинантного белка Dps, несущего наночастицы металлов с переходной валентностью из клеток Escherichia coli BL21* (DE3) проводили согласно методике, описанной в (Покусаева и др., Сорбционные и хроматографические процессы, 2012, Т.12, No6). Размер молекул белка контролировали методом Динамического светорассеивания, а размер наночастиц определяли C использованием просвечивающей электронной микроспории, согласно методике, описанной в (Antipov et al., Molecules, 2017, V. 22(11)).

Способ получения раствора наночастиц соединений железа с использованием бактериального белка Dps осуществляется следующим образом. Способ включает посев одной колонии клеток Escherichia coli BL21* (DE3), выращенных на твердой питательной среде Лауриа-Бертони (LB), содержащей 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты, и 0.5 об.% хлорида натрия, 1.5 об.% агара и 0.1 об.% ампициллина в течение 12 часов при 37°С, содержащей плазмиду pGEM-dps, несущую полноразмерную копию гена dps, в 500 мкл жидкой питательной среды Лауриа-Бертони (LB), содержащей 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты, и 0.5 об.% хлорида натрия, и 0.1 об.% ампициллина в водном растворе, с последующем культивированием в течение 3 часов при 37°С и постоянном перемешивании, до достижения оптической плотности 0.3-0.4 оптических единицы при длине волны 600 нм. Полученную в результате этого шага суспензию клеток в объеме 100 мкл переносят в 100 мл свежеприготовленной жидкой питательной среды LB, содержащей 0.1 об.% ампициллина с использованием автоматического дозатора и стерильного, одноразового наконечника, в которую добавляют 1М раствор соли Мора в объеме 70 мкл таким же способом перед посевом бактериальных клеток. После чего проводят культивирование при 37°С с регистрацией кривой роста каждые 60 минут путем стерильного отбора проб автоматическим дозатором и стерильным наконечником с последующим измерением оптической плотности пробы, которое проводят при длине волны 600 нм до достижения стационарной фазы, то есть до достижения суспензией клеток 1.0 единицы оптической плотности.

Пример 1 реализации способа.

Способ включает посев одной колонии клеток Escherichia coli BL21*(DE3), выращенных в течение 12 часов при 37°С в чашке Петри диаметром 87 мм на твердой питательной среде Лауриа-Бертони (LB), содержащей в водном растворе перед автоклавированием 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты и 0.5 об.% хлорида натрия, 1.5 об.% агара и 0.1 об.% ампициллина, содержащих плазмиду pGEM-dps, несущую полноразмерную копию гена dps, путем переноса с использованием автоматического дозатора и стерильного, одноразового наконечника в 500 мкл жидкой питательной среды Лауриа-Бертони (LB), содержащей 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты и 0.5 об.% хлорида натрия и 0.1 об.% ампициллина в водном растворе, с последующем культивированием в течение 3 часов при 37°С и постоянном перемешивании, до достижения оптической плотности 0.3-0.4 оптических единицы при длине волны 600 нм в стеклянной кювете с толщиной поглощающего слоя, равной 1 см. Полученную в результате этого шага суспензию клеток в объеме 100 мкл переносят в 100 мл свежеприготовленной жидкой питательной среды LB, содержащей 1 об.% триптона, 0.5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты и 0.5 об.% хлорида натрия и 0.1 об.% ампициллина B водном растворе, с использованием автоматического дозатора и стерильного, одноразового наконечника, в которую добавляют с использованием автоматического дозатора и стерильного, одноразового наконечника свежеприготовленный 1М раствор соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂•6H₂O в количестве 70 мкл, так, чтобы концентрация ионов железа составляла 0.5 мМ, непосредственно перед посевом бактериальных клеток. После чего проводят культивирование при 37°С с регистрацией кривой роста каждые 60 минут путем стерильного отбора проб автоматическим дозатором и стерильным наконечником. Измерения оптической плотности пробы проводят при длине волны 600 нм до достижения стационарной фазы, то есть достижения значения оптической плотности 1.0. Выделение и очистку рекомбинантного белка Dps несущего наночастицы железа из клеток Escherichia coli BL21* (DE3) проводят согласно методике, описанной в (Покусаева и др., Сорбционные и хроматографические процессы, 2012, Т.12, No6). Размер молекул белка контролировали методом динамического светорассеивания по стандартному протоколу, а размер наночастиц определяли с использованием просвечивающей электронной микроскопии, согласно методике, описанной в (Antipov et al., Molecules, 2017, V. 22(11)).

Средний диаметр синтезированных таким образом наночастиц составляет 3.3 нм.

Пример 2 реализации способа.

Способ аналогичен примеру 1. За исключением следующего. После переноса суспензии клеток в свежеприготовленную жидкую питательную среду LB, содержащую 0.1 об.% ампициллина, вносят пятикратно 1 М раствор соли Мора при культивировании при 37°С с регистрацией кривой роста, поэтапно, по 14 мкл каждый час с момента достижения значения 0.2 единицы оптической плотности при длине волны 600 нм суспензии бактериальных клеток до достижения концентрации ионов железа 0.5 мМ.

Средний диаметр синтезированных таким образом наночастиц составляет 3.3 нм.

Пример 3 реализации способа.

Способ аналогичен примеру 1. За исключением следующего. Внесение свежеприготовленного 1М раствора соли Мора осуществляется единовременно объемом 70 мкл в жидкую питательную среду LB, содержащую 0.1 об.% ампициллина, после переноса суспензии клеток, при достижении оптической плотности, растущей бактериальной культуры, в ходе культивирования при 37°С с регистрацией кривой роста, значения 0.6 оптических единиц при длине волны 600 нм так, чтобы концентрация ионов железа составила 0.5 мМ, после чего бактерии продолжают растить в тех же условиях до достижения значения 1.0 оптических единиц суспензии клеток при длине волны 600 нм. Средний диаметр синтезированных таким образом наночастиц составляет 3.3 нм. Заявленное изобретение на практике показало свою эффективность в достижении технического результата (фиг. 1,2).

На фиг. 1 приведены результаты спектральной регистрации кривой роста при длине волны 600 нм через каждые 60 минут до достижения стационарной фазы (зависимость оптической плотности А, % от времени t, ч), регистрацию кривой роста осуществляли до достижении значения оптической плотности 1.0; (a) Данные, полученные при культивировании бактериальных клеток в нормальных условиях (богатая источниками питания жидкая питательная среда LB, pH 7.4, температура 37°С) и в отсутствии ионов двухвалентного железа. Бактериальная культура достигает стационарного состояния через 480 минут; (б) - данные полученные в условиях аналогичных (а), но в присутствии в питательной среде 0.1 мм ионов двухвалентного железа; (в) Данные полученные в условиях аналогичных (а), но в присутствии в питательной среде 0.5 мМ ионов двухвалентного железа.

В присутствии 1 мМ ионов двухвалентного железа бактериальные клетки были нежизнеспособны.

На фиг. 2 приведены данные просвечивающей электронной микроскопии и результатов расчета размеров наночастиц. ПЭМ-изображения, полученные для нативного белка Dps (А), насыщенного 0.5 мМ соли Мора (В), его апо-формы, полученной с использованием ступенчатого гидролиза раствора белка, его диализа против буферного раствора, содержащего 50мM NaCl, 50мM Tris-HCl (pH 8,0); 104М ЭДТА. Такой раствор белка был очищен от ионов железа и был использован в качестве контроля (С), раствора, содержащего 1мм соли Мора (D). (Е) Оценка распределения частиц по размерам (пунктир нативный Dps, сплошная - Dps, насыщенный железом. N - количество частиц, d-средний диаметр, σ - стандартное отклонение).

Предложенный способ может быть реализован в условиях промышленного производства с использованием стандартного оборудования, общеизвестных технологий и материалов. Специалисту в данной области техники очевидно множество других вариантов осуществления изобретения, представленного в приведенном выше описании. Поэтому, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретным раскрытием воплощения и другие варианты выполнения могут быть включенными в объем предлагаемой формулы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения раствора наночастиц размером 3,3 нм, содержащих соединения железа (III), с использованием бактериального белка Dps и водных растворов солей железа (II). Изобретение эффективно для получения наночастиц, содержащих соединения железа (III). 2 ил., 3 пр.

Способ получения раствора наночастиц, содержащих соединения железа (III), с использованием бактериального белка Dps, включающий посев одной колонии клеток Escherichia coli BL21* (DE3), выращенных на твердой питательной среде Лауриа-Бертони (LB), содержащей в водном растворе перед автоклавированием 1 об.% триптона, 0,5 об.% дрожжевого экстракта, содержащего свободные пептиды и аминокислоты и 0,5 об.% хлорида натрия, 1,5 об.% агара и 0,1 об.% ампициллина в течение 12 часов при 37°С, содержащей плазмиду pGEM-dps, несущую полноразмерную копию гена dps, путем переноса одной колонии в 500 мкл жидкой питательной среды Лауриа-Бертони (LB), содержащей 1 об.% триптона, 0,5 об.% дрожжевого экстракта и 0,5 об.% хлорида натрия и 0,1 об.% ампициллина в водном растворе, с последующим культивированием в течение 3 часов при 37°С и постоянном перемешивании, до достижения суспензией клеток 0,3-0,4 оптических единицы при длине волны 600 нм, переносом сформированной суспензии клеток в свежеприготовленную жидкую питательную среду LB, содержащую 1 об.% триптона, 0,5 об.% дрожжевого экстракта и 0,5 об.% хлорида натрия и 0,1 об.% ампициллина в водном растворе, при объемном соотношении суспензия клеток : раствор питательной среды, равном 1:1000, соответственно, культивированием при 37°С с регистрацией кривой роста путем измерения оптической плотности при длине волны 600 нм каждые 60 минут до достижения стационарной фазы, то есть достижения значения оптической плотности 1,0, добавление водного раствора соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂⋅6Н₂О, выделение и очистку рекомбинантного белка Dps, несущего наночастицы железа из клеток Escherichia coli BL21* (DE3), отличающийся тем, что перед посевом клеток после переноса сформированной суспензии клеток в свежеприготовленную жидкую питательную среду LB, содержащую 1 об.% триптона, 0,5 об.% дрожжевого экстракта и 0,5 об.% хлорида натрия и 0,1 об.% ампициллина в водном растворе при объемном соотношении суспензия клеток : раствор питательной среды, равном 1:1000, соответственно, в свежеприготовленную жидкую питательную среду LB добавляют водный 1М раствор соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O, при объемном соотношении суспензия клеток : раствор соли Мора, равном 10:7, соответственно, до достижения концентрации ионов железа 0,5 мМ.